KR20220169488A

KR20220169488A - 신규한 항원 결합 도메인 및 이를 포함하는 합성 항원 수용체

Info

Publication number: KR20220169488A
Application number: KR1020227034277A
Authority: KR
Inventors: 프리트 엠 차우더리
Original assignee: 유니버시티 오브 써던 캘리포니아
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-12-27
Also published as: BR112022018359A2; US20230212319A1; CN116194130A; CA3171906A1; JP2023518049A; MX2022011417A; WO2021188599A1; IL296411A; EP4121079A1; AU2021237570A1

Abstract

본 개시 내용은 하나 이상의 신규 항원 결합 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체 또는 SAR(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, ab-TCR, AABD-TCR, TFP, TAC 등) 및 항체(예를 들어, 이중특이성 항체, DART 등)에 관한 것이다. 기재된 바와 같은 SAR은 단일 사슬 면역 수용체(예를 들어, 1세대, 2세대 및 3세대 키메라 항원 수용체, TFP, Tri-TAC 등) 및 다중 사슬 면역 수용체(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γdTFP, 재조합 TCR 등)을 포함한다. SAR은 항원 결합 도메인 특성을 이용하는 하나 이상의 선택된 표적에 대해 면역 세포 특이성과 반응성을 재지시할 수 있다.

Description

신규한 항원 결합 도메인 및 이를 포함하는 합성 항원 수용체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2020년 3월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/990,396호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원의 개시 내용은 본원에 참고로 포함되어 있다.

발명의 분야

본 개시 내용은 하나 이상의 신규 항원 결합 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체 또는 SAR(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, ab-TCR, AABD-TCR, TFP, TAC 등) 및 항체(예를 들어, 이중특이성 항체, DART 등)에 관한 것이다. 기재된 바와 같은 SAR은 단일 사슬 면역 수용체(예를 들어, 1세대, 2세대 및 3세대 키메라 항원 수용체, TFP, Tri-TAC 등) 및 다중 사슬 면역 수용체(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γdTFP, 재조합 TCR 등)를 포함한다. SAR은 항원 결합 도메인 특성을 이용하는 하나 이상의 선택된 표적에 대해 면역 세포 특이성과 반응성을 재지시할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 SAR은 면역 세포에서 발현될 때 MHC 의존성 또는 MHC 비의존성 방식으로 표적 항원을 인식하는 이러한 능력을 부여한다. 본 개시 내용은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 갖는 SAR의 유용한 구성을 기재한다. 본 개시 내용은 유용한 항원 결합 도메인, 이러한 항원 결합 도메인의 유용한 구성 및 단일특이성, 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR의 구축을 위한 벡터 구축물을 기재한다. 본 개시 내용은 또한 SAR로의 혼입을 위한 최적의 항원 결합 도메인의 선택을 위한 신규 방법을 기재한다. 본 개시 내용은 또한 SMAC 모방체 및/또는 NIK 아고니스트의 존재하에 SAR 발현 T 세포를 증식함으로써 SAR 발현 T 세포의 품질을 개선하는 것에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 정상 산소 및 저산소 조건하에서 기체 투과성 막을 포함하는 장치 또는 용기를 사용하여 SAR을 제조하는 방법을 기재하였다. 기체 투과성 막을 가진 예시적인 장치는 GRex 플라스크이다. 본 개시 내용은 또한 SAR 구축물에 추가될 수 있고 SAR 발현 세포를 식별, 단리 및 제거하는데 사용될 수 있는 신규 태그를 기재한다. 본 개시 내용은 또한 생체 내 생물발광 영상화 적용을 위한 열 안정성 루시퍼라제(예를 들어, 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)(lucPpy) 및 포투리스 페니실바니카(Photuris pennsylvanica)(lucPpe) 루시퍼라제)의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 신규 항원 결합 도메인 및 이들을 포함하는 SAR을 제공한다.

서열 목록의 참고 인용

본 출원과 함께 "Sequence-Listing_ST25.txt"라는 명칭의 서열 목록이 첨부되며, 이는 2021년 3월 16일에 생성되었으며 101,792,917바이트의 데이터가 IBM-PC, MS-Windows 운영 체제에서 기계 포맷되어 있다. 서열 목록은 이로써 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

CAR은 종양 세포를 선택적으로 사멸시키도록 T 세포를 재지시할 수 있는 합성 면역 수용체이다. HLA-펩티드 복합체와 결합하는 생리학적 T 세포 수용체(TCR)와 달리 CAR은 인식되기 위해 펩티드 처리 또는 HLA 발현이 필요하지 않은 분자와 결합한다. 초기 1세대 CAR은 scFv(단일 사슬 가변 단편) 기반 항원 결합 도메인을 CD3-ζ 또는 Fc 수용체 γ 사슬로부터 유래된 세포질 신호전달 도메인에 연결된 불활성 CD8 경막 도메인에 융합하여 구축되었다. T 세포 공동자극의 결여를 극복하기 위해 T 세포 공동자극 수용체의 세포질 신호전달 도메인을 혼입하여 1세대 CAR을 추가로 변형하였다.

CAR-T 세포의 성공에도 불구하고, "사이토카인 방출 증후군"(CRS)과 같은 독성 및 신경 독성을 포함하여 이 접근 방식에는 몇 가지 제한 사항이 있다. CAR 구축물에 공동자극 도메인을 포함하면 수용체를 통한 비생리학적 강장성 신호전달이 일어나며, 이는 차례로 이들의 독성 및 지속성 결여의 원인이 될 수 있다. 항원 결합 도메인으로 scFv를 갖는 CAR-T는 또한 상이한 SAR-T의 중쇄 및 경쇄의 가교로 인해 막에 클러스터를 형성하여 강장성 신호를 생성할 수 있다. 또한, CAR-T에 사용되는 scFv는 일반적으로 마우스 mAb로부터 유래되므로 잠재적인 면역원성 문제가 있다. 이론에 얽매이지 않고, scFv가 이중특이성, 다중특이성, 이가 또는 이중파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 CAR-T를 설계하는 데 사용되는 경우 이러한 문제가 악화될 가능성이 있다.

종래의 2세대 CAR의 설계 한계의 일부를 극복하기 위해서, Ab-TCR(본원에 참고로 포함된 WO 2017/070608 A1), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP(본원에 참고로 포함된 WO 2016/187349 A1), 합성 면역 수용체(SIR)(본원에 참고로 포함된 WO 2018/102795 A1 참조), 삼작용성 T 세포 항원 커플러(Tri-TAC)(본원에 참고로 포함된 WO 2015/117229 A1 참조) 및 zSIR(본원에 참고로 포함된 WO2019232503 참조)를 포함하여 총체적으로 차세대 CAR이라고 하는 여러 대체 설계가 설명되었다. AABD-TCR 플랫폼이 본 개시 내용에 기재된다. 이러한 대체 CAR 설계는 일반적으로 공동자극 도메인이 결여된다. 이러한 대체 CAR 설계는 단일 사슬(예를 들어, 단일 사슬 SIR, 또는 εTFP, γTFP 및 δTFP) 또는 하나 초과의 사슬(예를 들어, 이중 사슬 SIR, cTCR, zSIR, αβTFP 및 γδTFP)로 구성될 수 있다. 그러나 scFv 사슬의 비특이적 응집 및 결과적인 강장성 신호전달의 문제는 항원 결합을 위한 scFv 사슬(들)로 구성된 차세대 CAR 설계에도 영향을 미친다. 이 문제는 scFv 단편이 이중특이성, 이가, 이중 파라토프, 다중특이성, 다가 또는 다중 파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 SIR, cTCR, Ab-TCR과 같은 다중 사슬 합성 항원 수용체를 설계하는 데 사용되는 경우 더욱 악화된다.

본 개시 내용은 합성 항원 수용체(SAR: Synthetic Antigen Receptor)의 설계를 통해 상기 문제에 대한 해결책을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이 용어 합성 항원 수용체(SAR)는 단일 사슬 면역 수용체의 백본을 가진 수용체(예를 들어, 1세대, 2세대 및 3세대 키메라 항원 수용체, TFP, Tri-TAC 등) 및 다중 사슬 면역 수용체(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γdTFP, 재조합 TCR 및 HLA 비의존성 TCR 등)를 포함한다.

본 개시 내용은 합성 항원 수용체(SAR)를 제조하기 위한 조성 및 구성을 기재한다. 한 실시 양태에서, SAR은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, SAR은 2개 이상의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, SAR은 하나 이상의 항원의 2개 이상의 에피토프에 결합-하는 폴리펩티드를 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합에 프레임 내에서 연결된 자율 항원 결합 도메인(AABD: autonomous antigen binding domain) 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 SAR 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, AABD는 자율적 방식으로, 즉 또 다른 도메인의 부재하에 항원에 결합할 수 있는 임의의 도메인이다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 도메인이다. 한 실시 양태에서, AABD는 Fv 도메인을 형성하는 vL 및 vH 단편을 포함하지 않는다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 vHH, 단일 가변 도메인 항체, FHVH(완전 인간 vH 도메인), SVH(단일 vH 도메인), SVL(단일 vL 도메인), 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드(예를 들어, 센티린, 아피바디, DARPIN, D 도메인 등), 수용체의 리간드 결합 도메인, 리간드의 수용체 결합 도메인, 자가항원, 어댑터 결합 도메인, 에피토프, 미모토프, T 세포 수용체의 단일 가변 도메인(svd-TCR) 또는 이들의 단편이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합에 프레임 내에서 연결된 적어도 하나의 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 SAR 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 선택적 링커를 통해 프레임 내에서 연결된 하나 초과의 자율 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택적 도메인을 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, 또는 Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는 제1 모듈에 프레임 내에서 연결된 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하며, 여기서 제1 모듈은 경막 도메인을 포함하는 제2 모듈에 선택적 링커를 통해 연결된다. 한 실시 양태에서, 선택적 도메인은 링커 도메인이다. 한 실시 양태에서, 제2 모듈은 연결 펩티드, 경막 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 제2 모듈은 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 제2 모듈은 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, 또는 pre-TCRα의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.

실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 선택적 도메인을 통해 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 프레임 내에서 연결된 자율 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시 양태에서, 선택적 도메인은 연결 펩티드이다. 한 실시 양태에서, 경막 도메인은 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, pre-TCRα 등의 불변 사슬)에 속한다. 한 실시 양태에서, 연결 펩티드는 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, pre-TCRα 등의 연결 펩티드)에 속한다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 연결 펩티드 및 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 프레임 내에서 연결된 자율 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시 양태에서, 경막 도메인은 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, pre-TCRα 등의 불변 사슬)에 속한다. 한 실시 양태에서, 연결 펩티드는 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, pre-TCRα 등의 연결 펩티드)에 속한다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택적 도메인을 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 프레임 내에서 연결된 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시 양태에서, 선택적 도메인은 링커 도메인이다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택적 도메인을 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는 모듈의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 프레임 내에서 연결된 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시 양태에서, 선택적 도메인은 링커 도메인이다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택적 도메인을 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, 또는 Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는 제1 모듈의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 프레임 내에서 연결된 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하고 여기서 제1 모듈은 경막 도메인을 포함하는 제2 모듈에 선택적 링커를 통해 연결된다. 한 실시 양태에서, 선택적 도메인은 링커 도메인이다. 한 실시 양태에서, 제2 모듈은 연결 펩티드, 경막 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 제2 모듈은 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 제2 모듈은 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, 또는 pre-TCRα의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 각각의 사슬이 하나 이상의 선택적 도메인을 통해 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Ig 도메인, 또는 Ig 유사 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는 제1 모듈의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 프레임 내에서 연결된 0, 1, 2개 이상의 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 코딩하고 여기서 제1 모듈은 연결 펩티드, 경막 도메인 및 선택적 세포내 도메인을 포함하는 제2 모듈에 선택적 링커를 통해 연결되고 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 T 세포에서 발현될 때 적어도 하나의 TCR 연관 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM: T cell receptor module)을 형성한다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 힌지 도메인 및 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 프레임 내에서 연결된 자율 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.

한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 힌지 도메인, 경막 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 프레임 내에서 연결된 자율 항원 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 활성화 도메인 및 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 활성화 도메인이 결여되어 있다. 한 실시 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 함유하는 활성화 도메인을 포함한다.

본 개시 내용은 또한 임의의 보조 모듈과 함께 본 개시 내용의 임의의 SAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. SAR을 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 (표 25-36 및 41- 50)에 제공되어 있다. 일부 실시 양태에서, SAR 성분 및 임의의 보조 모듈(예를 들어, 치료 컨트롤)은 단일 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, 2개 이상의 SAR 성분(예를 들어, 이중 사슬 SAR의 2개 사슬) 및 보조 모듈은 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

다양한 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자(들)는 하나 이상의 항원 특이적 도메인을 코딩하는 하나 이상의 항원 특이적 코딩 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 V_L(또는 vL) 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 V_H(또는 vH) 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 예를 들어, 암세포와 같은 표적 세포 상의 항원에 특이적인 하나 이상의 scFV(또는 scFv)를 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 Fv 단편을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 코딩 도메인은 하나 이상의 Fab 단편을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 (Fab')2 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인은 자율 항원 결합 도메인(AABD)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 단일 도메인 항체(SDAB) 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 vH 도메인(SVH) 또는 단일 vL 도메인(SVL)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 기원이 완전 인간인 단일 vH 도메인(즉, FHVH)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인은 하나 이상의 낙타과 V_HH(vHH) 도메인을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 인간화된 vHH 도메인을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 T 세포 수용체로부터 유래된 가변 도메인(예를 들어, Va/Vα, Vb/Vβ, Vg/Vγ 및 Vd/Vδ)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 단일 사슬 TCR(scTCR)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 단일 가변 도메인 TCR(svd-TCR)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 수용체의 하나 이상의 리간드 결합 도메인을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 코딩 도메인은 예를 들어 DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 또는 D 도메인(α3D 도메인) 등과 같은 하나 이상의 비-면역글로불린 스캐폴드를 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-AF, NKG2D-YA 등)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 Fc 결합 도메인(예를 들어, CD16, CD32, 또는 CD64 등의 Fc 결합 영역)을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 자가항원을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 하나 이상의 에피토프 태그 또는 미모토프를 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 수용체 하나 이상의 리간드 결합 도메인을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드의 항원 특이적 코딩 도메인(들)은 리간드의 하나 이상의 수용체 결합 도메인을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 코딩 도메인은 적어도 하나의 Fv(예를 들어, vL 및 vH 단편) 및 하나 이상의 AABD(예를 들어, SVH, SVL, vHH, svd-TCR, DARPIN, 아피바디, 센티린, D 도메인, 에피토프, 미모토프, EZIP, RZIP, E4, K4 등)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 코딩 도메인은 적어도 하나의 TCR 가변 도메인(예를 들어, TCR의 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편) 및 하나 이상의 AABD(예를 들어, SVH, SVL, FHVH, vHH, svd-TCR, DARPIN, 아피바디, 센티린, D 도메인, 에피토프, 미모토프, EZIP, RZIP, E4, K4 등)을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 코딩 도메인은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 이상)의 AABD(예를 들어, SVH, SVL, vHH, FHVH, svd-TCR, DARPIN, 아피바디, 센티린, D 도메인, 에피토프, 미모토프, EZIP, RZIP, E4, K4 등)을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 동일한 유형(예를 들어, 2개의 vHH, 3개의 DARPIN, 2개의 센티린 등)인 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)는 상이한 유형(예를 들어, 하나의 vHH 및 하나의 DARPIN; 하나의 DARPIN, 하나의 vHH 도메인 및 하나의 센티린 등)인 AABD를 코딩한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)은 기원이 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간인 AABD를 코딩한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)은 하나 이상의 펩티드 링커를 코딩한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)는 하나 이상의 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser 링커)를 코딩한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)은 하나 이상의 프로테아제 절단성 링커(예를 들어, 세포 프로테아제, 예를 들어, MMP14에 의해 절단되는 링커, 예를 들어, 서열 번호 1218에 의해 코딩되는 링커)를 코딩한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)는 하나 이상의 Ig 링커 또는 Ig 유사 링커를 코딩한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 SAR 사슬을 코딩한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 SAR 사슬은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 SAR 사슬은 선택적으로 퓨린 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열이 선행하는 절단성 링커(예를 들어, P2A, T2A, F2A 등)에 의해 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드(들)는 부분적으로 또는 완전히 코돈 최적화된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 선행 섹션에 기재된 임의의 SAR 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 SAR 폴리펩티드를 제공한다.

일부 실시 양태에서, 임의의 보조 모듈과 함께 본 개시 내용의 임의의 SAR을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 예시적인 SAR 폴리펩티드의 아미노산 서열은 표 25-36 및 41-50에 제공되어 있다. 일부 실시 양태에서, 2개 이상의 SAR 성분 및 임의의 보조 모듈(예를 들어, 치료 컨트롤)은 단일 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 2개 이상의 SAR 성분(예를 들어, 이중 사슬 SAR의 2개 사슬) 및 보조 모듈은 별개의 폴리펩티드를 포함한다. 다양한 실시 양태에서, SAR 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 항원 특이적 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 V_L(또는 vL) 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 V_H(또는 vH) 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 도메인(들)은 예를 들어, 암 세포와 같은 표적 세포 상의 항원에 특이적인 하나 이상의 scFV(또는 scFv)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 Fv 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 Fab 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 (Fab')2 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인은 자율 항원 결합 도메인(AABD)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 단일 도메인 항체(SDAB) 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 vH 도메인(SVH) 또는 단일 vL 도메인(SVL)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 기원이 완전 인간인 단일 vH 도메인(즉, FHVH)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 낙타과 VHH(vHH) 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 인간화된 vHH 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 T 세포 수용체로부터 유래된 가변 도메인(예를 들어, Va/Vα, Vb/Vβ, Vg/Vγ 및 Vd/Vδ)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 단일 사슬 TCR(scTCR)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 단일 가변 도메인 TCR(svd-TCR)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 수용체의 하나 이상의 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 특이적 도메인은 DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 또는 D 도메인(α3D 도메인) 등과 같은 하나 이상의 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-AF, NKG2D-YA 등)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 Fc 결합 도메인(예를 들어, CD16, CD32, 또는 CD64 등의 Fc 결합 영역)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 자가항원을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 하나 이상의 에피토프 태그 또는 미모토프를 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 수용체 하나 이상의 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 항원 특이적 도메인(들)은 리간드의 하나 이상의 수용체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인은 적어도 하나의 Fv(예를 들어, vL 및 vH 단편) 및 하나 이상의 AABD(예를 들어, SVH, SVL, vHH, svd-TCR, DARPIN, 아피바디, 센티린, D 도메인, 에피토프, 미모토프, EZIP, RZIP, E4, K4 등)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인은 적어도 하나의 TCR 가변 도메인(예를 들어, TCR의 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편) 및 하나 이상의 AABD(예를 들어, SVH, SVL, FHVH, vHH, svd-TCR, DARPIN, 아피바디, 센티린, D 도메인, 에피토프, 미모토프, EZIP, RZIP, E4, K4 등)을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 이상)의 AABD(예를 들어, SVH, SVL, vHH, FHVH, svd-TCR, DARPIN, 아피바디, 센티린, D 도메인, 에피토프, 미모토프, EZIP, RZIP, E4, K4 등)을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 동일한 유형(예를 들어, 2개의 vHH, 3개의 DARPIN, 2개의 센티린 등)인 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 상이한 유형(예를 들어, 하나의 vHH 및 하나의 DARPIN; 하나의 DARPIN, 하나의 vHH 도메인 및 하나의 센티린 등)인 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드(들)는 기원이 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간인 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드(들)은 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드는 하나 이상의 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser 링커)를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드는 하나 이상의 프로테아제 절단성 링커(예를 들어, 세포 프로테아제, 예를 들어, MMP14에 의해 절단되는 링커, 예를 들어, 서열 번호 1218에 의해 코딩되는 링커)를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드는 하나 이상의 Ig 링커 또는 Ig 유사 링커를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 하나 이상의 사슬을 포함한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 사슬의 SAR은 하나 초과의 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 사슬의 SAR은 선택적으로 퓨린 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열이 선행하는 절단성 링커(예를 들어, P2A, T2A, F2A 등)에 의해 분리된 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시 내용은 표 25-36 및 41-50에 제공된 예시적인 SAR의 조성을 갖는 SAR 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. SAR은 설계상 모듈식이므로, 신규 조성을 갖는 추가 SAR은 상이한 모듈을 대체함으로써 당업자에 의해 생성될 수 있고 본 개시 내용에 제공된 분석을 사용하여 테스트될 수 있다. SAR의 예시적인 성분 모듈은 표 2-24에 제공되어 있다.

본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 SAR을 제조하기 위한 유용한 구성을 제공한다. 본 개시 내용은 표 25-36 및 41-50에 제공된 예시적인 SAR의 모듈식 도메인 구조 및 아키텍처를 갖는 SAR 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 a) 제1 T 세포 수용체 서브유닛의 제1 경막 도메인을 포함하는 제1 TCR 불변 사슬 단편에 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 vH, Va, Vg 또는 Ig 링커 도메인 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 제2 T 세포 수용체 서브유닛의 제2 경막 도메인을 포함하는 제2 TCR 불변 사슬 단편에 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 vL, Vb, Vd 또는 Ig 링커 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 적어도 하나의 합성 항원 수용체(SAR)를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 선택적 링커를 통해 vH, vL, Va, Vb, Vg, Vd 또는 Ig 링커 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 단일 vH 도메인(SVH); 단일 vL 도메인(SVL); vHH 도메인; 단일 도메인 항체; svd-TCR, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 및 D 도메인; 수용체의 리간드 결합 도메인; 리간드의 수용체 결합 도메인; 자가항원; 어댑터 결합 도메인, Fc 결합 도메인, 에피토프 태그, 미모토프, 또는 등가물의 군으로부터 선택된 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인(AABD)을 포함하고 제1 TCR 불변 사슬 단편 및 제2 TCR 불변 사슬 단편은 T 세포에서 발현될 때 적어도 하나의 TCR 연관 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 CAR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 CAR의 scFv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 선택적 링커를 통해 단일 사슬 CAR(예를 들어, 2세대 CAR, 3세대 CAR), 단일 사슬 TFP(예를 들어, TFPε, TFPγ, TFPδ), SIR, cTCR, Ab-TCR, αβTFP, γδ TFP 또는 TCR을 포함하는 vL, vH, scFv, vHH, FHVH, Va, Vb, Vd, Vg 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)에 대한 유용한 구성을 제공한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 개재 Ig 링커 도메인을 통해 TCR 신호전달 모듈에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 AABD를 포함하는 AABD-TCR의 백본을 갖는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제조하기 위해 유용한 구성을 제공한다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 SIR, Ab-TCR, TFPαβ, TFPγδ 또는 TCR을 제조하기 위해 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 SIR의 Fv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다.

본 개시 내용은 선행 섹션에 기재된 임의의 SAR 폴리펩티드 및 보조 모듈을 코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 추가로 제공한다. 본 개시 내용의 SAR은 단일 벡터 또는 하나 초과의 벡터에 의해 코딩될 수 있다.

본 개시 내용은 본 개시 내용의 SAR 및 보조 모듈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 추가로 제공한다.

본 개시 내용은 본 개시 내용의 SAR 및 보조 모듈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 사용하는 치료 방법을 추가로 제공한다.

본 개시 내용은 또한 상이한 항원에 결합할 수 있는 신규 항체, 항체 단편, vHH, 및 단일 인간 vH 도메인(예를 들어, FHVH 및 chVH)을 제공한다. 표적 항원, 이들 신규 항원 결합 도메인의 명칭 및 서열 번호는 이들의 CDR1-CDR3의 서열 번호와 함께 표 39에 제시되어 있다. 이들 신규 항원 결합 도메인은 본 개시 내용의 SAR 및/또는 SAR 어댑터의 구축에 사용될 수 있다. 또한, 이들 신규 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 방법을 사용하고 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 항체(예를 들어, 이중특이성 및 삼중특이성 항체, 항체 약물 접합체, 방사성 표지 항체, 형광색소 표지 항체, scFv, 이중특이성 및 삼중특이성 T/NK 세포 인게이저 등)를 포함하는 기타 치료 및 진단 생물학적 제제 및 세포 기반 요법에 사용될 수 있다. 본 개시 내용은 본 개시 내용의 신규 항원 결합 도메인을 포함하고/거나 발현하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 약학 조성물, 세포 및 키트를 제공한다.

본 개시 내용은 추가로 본 개시 내용의 SAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, SAR 폴리펩티드, SAR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 SAR을 발현하는 단리된 세포에 관한 것이다. 본 개시 내용의 SAR은 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 등) 또는 면역 세포를 생성할 수 있는 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포(iPSC))에서 발현될 수 있다. SAR은 자가 또는 동종이계 줄기세포에서 발현될 수 있다. SAR을 발현하는 세포는 TCR/CD3 신호전달 복합체의 하나 이상의 성분 또는 이들의 하류 신호전달 매개체의 발현을 감소시키거나 제거할 수 있다. SAR을 발현하는 세포는 예컨대 베타2 마크로글로불린의 하향조절 또는 녹아웃을 통해, HLA 분자의 발현을 감소시키거나 제거할 수 있다. 본 개시 내용의 SAR의 발현을 위한 세포는 자가 또는 동종이계 공여자로부터 얻을 수 있다. 본 개시 내용의 SAR의 발현을 위한 세포는 동원제(예를 들어, CXCR4 길항제, G-CSF, GM-CSF 등)를 투여받은 자가 또는 동종이계 공여자로부터 얻을 수 있다. 본 개시 내용의 세포는 하나의 SAR 또는 하나 초과의 SAR을 발현할 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, SAR 중 하나는 면역 세포 이펙터 기능(예를 들어, 세포독성)을 초래할 수 있는 반면, 다른 SAR은 공동자극을 제공할 수 있다. SAR 발현 세포는 단일 항원 또는 하나 초과의 항원을 표적화할 수 있다. SAR 발현 세포는 단일 항원의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프를 표적화할 수 있다. 한 측면에서, SAR 발현 세포는 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 항원을 인식할 수 있다. 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 예시적인 항원은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD30, CD33, MPL, CD138, CD38, CD79b, BAFF-R, CD123 등이다. 한 측면에서, SAR 발현 세포는 비-조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 항원을 인식할 수 있다. 비-조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 예시적인 항원은 메소텔린(MSLN), Her2, EGFR, EGFRviii, Muc16, PSMA, IL13Ra2 등이다. 한 측면에서, SAR 발현 세포는 항원 중 적어도 하나가 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되고 항원 중 적어도 하나가 비-조혈 계통 세포 상에서 발현되는 2개 이상의 신규 항원을 인식한다. 본 개시 내용의 SAR 발현 세포는 요법, 특히 암의 치료를 위한 요법에 사용될 수 있다. 질환, 예를 들어 암을 치료하는 방법도 본 발명의 범위 내에 있다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, BCMA를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 7409-8374에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, BCMA를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 18099-19064(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, BCMA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 235-248, 477-490 및 서열 번호 719-732에 각각 제시되어 있다. BCMA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 10925-10938, 10978-11180, 및 11220-11422에 각각 기재되어 있다. 일부 실시 양태에서, BCMA를 표적화하는 SVH 및 vHH 단편은 표 4에 기재되어 있고 서열 번호 852-858, 888-891, 893, 895, 901-902에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, BCMA를 표적화하는 센티린은 표 7에 기재되어 있고 서열 번호 983에 제시되어 있다. SVH, vHH 및 센티린을 포함하는 AABD를 포함하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 25-36에 제공되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 코딩하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대 T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA를 표적화한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 PSMA(전립선 특이적 막 항원)를 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, PSMA를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 9686-10030에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, PSMA를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 20376-20720(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, PSMA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 268-272, 510-514 및 서열 번호 752-756에 각각 제시되어 있다. PSMA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 10958-10962, 11200-11204, 및 11442-11446에 각각 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, PSMA를 표적화하는 SVH 단편은 표 4에 기재되어 있고 서열 830-833에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, PSMA를 표적화하는 센티린은 표 7에 기재되어 있고 서열 번호 977-979에 제시되어 있다. SVH, vHH 및 센티린을 포함하는 AABD를 포함하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 25-36에 제공되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 PSMA를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대 T 세포, NK 세포)가 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 PSMA를 표적화한다. 또한, 높은 수준의 PSMA(예를 들어, 정상 세포보다 1.5배 더 높음)를 발현하는 암세포를 표적화하고 낮거나 중간 수준의 PSMA를 발현하는 정상의 건강한 세포를 보존하기 위해 최적화된 발현 및 친화도로 PSMA를 표적화하는 SAR이 제공된다. 예시적인 실시 양태에서, 정상의 건강한 전립선 상피 또는 정상 전립선 상피 세포로부터 유래된 불멸화 세포주에서 관찰되는 PSMA 수준보다 적어도 1.5배 더 높은 수준으로 PSMA를 발현하는 암세포에 반응하는 SAR이 제공된다. PSMA의 발현 수준은 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯 및 정량적 PCR 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 높은 수준의 PSMA를 발현하는 세포를 표적화하고 낮은 수준의 PSMA를 발현하는 세포를 표적화하지 않는 신규 SAR을 제공한다. 높은 수준의 PSMA를 발현하는 참조 세포는 LNCaP 세포주이고 낮은 수준의 PSMA를 발현하는 세포는 PC3 및/또는 Huh-7 세포주이다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 PC3 또는 Huh-7 세포주와 공동 배양될 때 관찰된 GFP 유도와 비교하여 JNG 세포에서 발현되고 LNCaP와 공동 배양되는 경우 Jurkat NFAT-GFP 분석에서 2배 이상(예를 들어, 3배, 4배, 5배, 10배 등) GFP 유도를 나타내는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 PC3 또는 Huh-7 세포주와 공동 배양될 때 관찰된 GFP 유도와 비교하여 JNG 세포에서 발현되고 LNCaP와 공동 배양되는 경우 Jurkat NFAT-GFP 분석에서 10% 초과(예를 들어, 20%, 30%, 40% 또는 50% 등) GFP 유도를 나타내는 SAR을 제공한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 메소텔린(MSLN)을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, MSLN을 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 10307-10720에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, MSLN을 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 20997-21410(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, MSLN을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 277-282, 519-524 및 서열 번호 761-766에 각각 제시되어 있다. MSLN을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 10967-10972, 11209-11214, 및 11451-11456에 각각 기재되어 있다. 일부 실시 양태에서, MSLN을 표적화하는 vHH 단편은 표 4에 기재되어 있고 서열 876-877에 제시되어 있다. MSLN을 표적화는 vL, vH, scFv, vHH를 포함하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 25-36에 제공되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 MSLN을 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대 T 세포, NK 세포)가 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 MSLN을 표적화한다. 또한, 높은 수준의 MSLN(예를 들어, 정상 세포보다 1.5배 더 높음)를 발현하는 암세포를 표적화하고 낮거나 중간 수준의 MSLN을 발현하는 정상의 건강한 세포를 보존하기 위해 최적화된 발현 및 친화도로 MSLN을 표적화하는 SAR이 제공된다. 예시적인 실시 양태에서, 정상의 건강한 복막 상피 세포 또는 정상의 건강한 복막 상피 세포로부터 유래된 불멸화 세포주에서 관찰되는 MSLN 수준보다 적어도 1.5배 더 높은 수준으로 MSLN을 발현하는 암세포에 반응하는 SAR이 제공된다. MSLN의 발현 수준은 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯 및 정량적 PCR 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 높은 수준의 MSLN을 발현하는 세포를 표적화하고 낮은 수준의 MSLN을 발현하는 세포를 표적화하지 않는 신규 SAR을 제공한다. 높은 수준의 MSLN을 발현하는 참조 세포는 SKOV-3 세포주이고 낮은 수준의 MSLN을 발현하는 세포는 MCF-7 또는 LNCaP 세포주이다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 MCF-7 또는 LNCaP 세포주와 공동 배양될 때 관찰된 GFP 유도와 비교하여 JNG 세포에서 발현되고 SKOV-3과 공동 배양되는 경우 Jurkat NFAT-GFP 분석에서 2배 이상(예를 들어, 3배, 4배, 5배, 10배 등) GFP 유도를 나타내는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 MCF-7 또는 LNCaP 세포주와 공동 배양될 때 관찰된 GFP 유도와 비교하여 JNG 세포에서 발현되고 SKOV-3과 공동 배양되는 경우 Jurkat NFAT-GFP 분석에서 10% 초과(예를 들어, 20%, 30%, 40% 또는 50% 등) GFP 유도를 나타내는 SAR을 제공한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 Her 2를 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, Her2를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 8858-8995에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, Her2를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 19548-19616(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, Her2를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 256-257, 498-499 및 서열 번호 740-741에 각각 제시되어 있다. Her2를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 10946-10947, 11188-11189, 및 11430-11431에 각각 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, Her2를 표적화하는 vHH 단편은 표 4에 기재되어 있고 서열 번호 864-866에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, Her2를 표적화하는 DARPINS 단편은 표 4에 기재되어 있고 서열 972-973에 제시되어 있다. Her2를 표적화하는 vL, vH, scFv, vHH 및 DARPINS를 포함하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 25-36에 제공되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 Her2를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대 T 세포, NK 세포)가 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 Her2를 표적화한다. 또한, 높은 수준의 Her2(예를 들어, 정상 세포보다 1.5배 더 높음)를 발현하는 암세포를 표적화하고 낮거나 중간 수준의 Her2를 발현하는 정상의 건강한 세포를 보존하기 위해 최적화된 발현 및 친화도로 Her2를 표적화하는 SAR이 제공된다. 예시적인 실시 양태에서, 정상의 건강한 유방 상피 세포 또는 정상의 건강한 유방 상피로부터 유래된 불멸화 세포주에서 관찰되는 Her2 수준보다 적어도 1.5배 더 높은 수준으로 Her2를 발현하는 암세포에 반응하는 SAR이 제공된다. Her2의 발현 수준은 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯 및 정량적 PCR 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 높은 수준의 Her2를 발현하는 세포를 표적화하고 낮은 수준의 Her2를 발현하는 세포를 표적화하지 않는 신규 SAR을 제공한다. 높은 수준의 Her2를 발현하는 참조 세포는 SKOV-3 세포주이고 낮은 수준의 Her2를 발현하는 세포는 MBA-MD-231 세포주이다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 MBA-MD-231 세포주와 공동 배양될 때 관찰된 GFP 유도와 비교하여 JNG 세포에서 발현되고 SKOV-3과 공동 배양되는 경우 Jurkat NFAT-GFP 분석에서 2배 이상(예를 들어, 3배, 4배, 5배, 10배 등) GFP 유도를 나타내는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 MBA-MD-231 세포주와 공동 배양될 때 관찰된 GFP 유도와 비교하여 JNG 세포에서 발현되고 SKOV-3과 공동 배양되는 경우 Jurkat NFAT-GFP 분석에서 10% 초과(예를 들어, 20%, 30%, 40% 또는 50% 등) GFP 유도를 나타내는 SAR을 제공한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 CD229를 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, CD229를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 9134-9409에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, CD229를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 19824-20099(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, CD229를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 260-263, 502-505 및 744-747에 각각 제시되어 있다. CD229를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 10950-10953, 11192-11195, 및 11434-11437에 각각 제시되어 있다. CD229를 표적화하는 vL, vH, 및 scFv를 포함하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 25-36에 제공되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 CD229를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 CD229를 표적화한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 ROR1을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, ROR1을 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 8375-8581에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, ROR1을 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 19065-19133(표 36)에 제시되어 있다. CD229를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 ROR1을 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 ROR1을 표적화한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 CEA를 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, CEA를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 8720-8857에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, CEA를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 19410-19547(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, CEA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 나열되어 있다. CEA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 CEA를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 CEA를 표적화한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 Toso를 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, Toso를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 8996-9064에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, Toso를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 19686-19747(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, Toso를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 나열되어 있다. Toso를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 Toso를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 Toso를 표적화한다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 EBV 코딩된 gp350 단백질을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, EBV gp350을 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 9410-9547에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, EBV gp350을 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 20169-20237(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, EBV gp350을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편이 표 3에 나열되어 있다. EBV gp350을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호가 또한 표 3에 기재되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 EBV gp350을 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 EBV gp350을 표적화한다. 이러한 SAR은 EBV 감염과 관련된 장애의 치료에 유용하다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 EBV 코딩된 LMP1 단백질을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, EBV LMP1을 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 9617-9685에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, EBV LMP1을 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 20307-20375(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, EBV LMP1을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편이 표 3에 나열되어 있다. EBV LMP1을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호가 또한 표 3에 기재되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 EBV LMP1을 표적화한다. 또한 SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 EBV LMP1을 표적화한다. 이러한 SAR은 EBV 감염과 관련된 장애의 치료에 유용하다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 인플루엔자 A 뉴라미다제(NA) 단백질을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, 인플루엔자 A NA를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 (표 36)에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, 인플루엔자 A NA를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 (표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, 인플루엔자 A NA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편이 표 3에 나열되어 있다. 인플루엔자 A NA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호가 또한 표 3에 기재되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 인플루엔자 A NA를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 인플루엔자 A NA를 표적화한다. 이러한 SAR은 A형 인플루엔자 감염과 관련된 장애의 치료에 유용하다.

한 실시 양태에서, SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 SARS-CoV2 스파이크 당단백질(S-RBD)의 수용체 결합 도메인을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, S-RBD를 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 25-26에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, S-RBD를 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 23318-19에 제시되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 S-RBD를 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 S-RBD를 표적화한다. 이러한 SAR은 S-RBD 감염과 관련된 장애의 치료에 유용하다.

한 실시 양태에서, 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인은 표 25-36에 열거된 항원을 표적화한다. 예시적인 실시 양태에서, 항원을 표적화하는 단리된 핵산 단편의 서열은 서열 번호 1330-1332, 1848-10720에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, 다양한 항원을 표적화하는 단리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 12020-12022, 12539-21410(표 36)에 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, 다양한 항원을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편은 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 46-282, 288-524 및 530-766에 각각 제시되어 있다. 다양한 항원을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 아미노산 서열 번호는 또한 표 3에 기재되어 있고 서열 번호 10736-10972, 10978-11214, 및 11220-11456에 각각 제시되어 있다. 일부 실시 양태에서, 다양한 항원을 표적화하는 예시적인 AABD(예를 들어, vHH, SVH, DARPIN, 센티린, 아피바디, 리간드, 수용체, Zip 도메인, 단백질 태그 등)는 표 5, 7-9에 기재되어 있고 서열 번호 830-902, 972-1023에 제시되어 있다. vL, vH, scFv 및 AABD를 포함하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 25-36 및 41-50에 제공되어 있다. SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인(들)은 다양한 항원을 표적화한다. 또한, SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 조작된 세포(예컨대, T 세포, NK 세포)가 제공되며, 여기서 SAR의 항원 특이적 도메인(들)은 다양한 항원을 표적화한다.

본 개시 내용은 또한 SMAC 모방체의 존재하에 SAR 발현 T 세포를 증식함으로써 SAR 발현 T 세포의 품질을 개선하는 것에 관한 것이다.

본 개시 내용은 추가로 NIK(NF-κB 유도 키나아제) 아고니스트의 존재하에 SAR 발현 T 세포를 증식함으로써 T 세포 발현 SAR의 품질을 개선하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 SAR은 개방형, 반폐쇄형 또는 폐쇄형 제조 시스템을 사용하여 제조될 수 있다.

본 개시 내용의 SAR은 기체 투과성 막을 포함하는 장치 또는 용기를 사용하여 제조될 수 있다. 기체 투과성 막이 있는 예시적인 장치는 GRex 플라스크이다.

본 개시 내용은 저산소 조건하에서 SAR을 제조하는 방법을 추가로 교시한다.

개시 내용은 기체 투과성 막을 포함하는 장치 또는 용기를 사용하여 저산소 조건에서 SAR을 제조하는 방법을 추가로 교시한다. 기체 투과성 막이 있는 예시적인 장치는 GRex 플라스크이다.

본 개시 내용은 또한 프로테아제 절단성 링커를 통해 알부민에 결합하는 적어도 하나의 모듈을 SAR에 혼입함으로써 SAR의 활성을 제어하는 방법을 교시한다. 알부민에 결합하는 예시적인 모듈은 MMP9 표적 서열(서열 번호 11911-11912 및 11921)을 통해 SAR에 연결될 수 있는 vH 또는 vH 도메인 표적화 알부민(예를 들어, 서열 번호(DNA) 878 및 서열 번호(PRT) 11568)이다.

본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 SVH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 벡터, SVH를 발현하는 단리된 세포 및 본 개시 내용의 SVH를 코딩하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 세포 및 폴리펩티드는 특히 암, 자가면역 및 감염성 질환의 치료를 위한 요법에 사용될 수 있다. 질환, 예를 들어 암을 치료하는 방법도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 2개 이상의 항원 결합 도메인, 및 2개의 경막 도메인을 포함하는 단리된 SAR에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 결합 도메인은 하나 이상, 예를 들어 적어도 2개의 인간 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하고 경쇄가 결여된다.

일부 실시 양태에서, SAR은 2개 이상의 폴리펩티드의 2개 이상의 세트를 포함한다. 각 세트의 SAR의 폴리펩티드는 서로 인접하지만(기능적 폴리펩티드 단위 1) 다른 세트의 폴리펩티드(기능적 폴리펩티드 단위 2)와 인접하지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 적응 면역요법에 사용하기 위한 세포 또는 세포 집단을 생성하기 위한 방법, 예를 들어 생체 외 방법으로서, 본 개시 내용의 SAR로 상기 세포 또는 세포 집단을 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 또는 SIR-T 또는 TCR-T 또는 ab-TCR-T, AABD-TCR-T, 또는 TFP-T, TCR-T 세포 등)를 생성하는 방법으로서, 이들을 SMAC 모방체의 존재하에 증식하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 SMAC 모방체의 존재하에 2 내지 50일 동안 생체 외에서 증식된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 또는 SIR-T 또는 TCR-T 또는 ab-TCR-T, AABD-TCR-T, 또는 TFP-T, TCR-T 세포 등)의 효능을 개선하는 방법으로서, 이들을 SMAC 모방체의 존재하에 증식하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 SMAC 모방체의 존재하에 2 내지 50일 동안 생체 외에서 증식된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 또는 SIR-T 또는 TCR-T 또는 ab-TCR-T, AABD-TCR-T, 또는 TFP-T, TCR-T 세포 등)의 세포독성을 개선하는 방법으로서, 이들을 SMAC 모방체의 존재하에 증식하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 SMAC 모방체의 존재하에 2 내지 50일 동안 생체 외에서 증식된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 또는 SIR-T 또는 TCR-T 또는 ab-TCR-T, AABD-TCR-T, 또는 TFP-T, TCR-T 세포 등)를 생성하는 방법으로서, 이들을 NIK 아고니스트의 존재하에 증식하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 NIK 아고니스트의 존재하에 2 내지 50일 동안 생체 외에서 증식된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 또는 SIR-T 또는 TCR-T 또는 ab-TCR-T, AABD-TCR-T, 또는 TFP-T, TCR-T 세포 등)의 효능을 개선하는 방법으로서, 이들을 NIK 아고니스트의 존재하에 증식하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 NIK 아고니스트의 존재하에 2 내지 50일 동안 생체 외에서 증식된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 T 세포(예를 들어, CAR-T 또는 SIR-T 또는 TCR-T 또는 ab-TCR-T, AABD-TCR-T, 또는 TFP-T, TCR-T 세포 등)의 세포독성을 개선하는 방법으로서, 이들을 NIK 아고니스트의 존재하에 증식하는 단계에 의한 방법에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 NIK 아고니스트의 존재하에 2 내지 50일 동안 생체 외에서 증식된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 세포 또는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

생물 발광 영상화는 세포 요법 생성물의 생체 내 활성을 모니터링하는 데 빈번하게 사용된다. 본 개시 내용은 생체 내 발광 영상화를 위한 열안정성 루시퍼라제(예를 들어, LucPPE 및 이의 조작된 변이체, 예컨대 LucPPe-146-1H2(서열 번호(DNA) 17 및 서열 번호(PRT) 11997), LucPPe-133-1B2(서열 번호(DNA) 18), LucPPe-78-0B10(서열 번호 19), LucPPe49-7C6A(서열 번호 20), LucPpL-81-6G1(서열 번호 21)의 용도를 기재한다.

본 개시 내용은 또한 2세대 CAR, 단일 및 이중 사슬 SIR, 단일 및 이중 사슬 cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP, TAC 등을 포함하는 단일 및 이중 사슬 SAR의 구축에 사용될 수 있는 신규 vL, vH 및 scFv 단편을 제공한다. 예시적인 vL, vH 및 scFv 단편 및 이들의 표적 항원이 표 3에 나열되어 있다. hu-mROO5-1의 vL, vH 및 scFv 단편을 기반으로 하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR이 표 35에 제공되어 있다. SAR이 모듈식이므로, hu-mROO5-1의 vL, vH 및 scFv 단편을 다른 항원을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편으로 대체하여 해당 항원을 표적화하는 SAR을 개발할 수 있다. 표 36은 hu-mROO5-1의 vL, vH 및 scFv 단편이 다른 vL, vH 및 scFv 단편으로 대체된 시리즈의 첫 번째 구축물의 명칭 및 다른 구축물의 서열 번호를 제공한다. 각 시리즈의 구축물의 순서는 표 35에 나열된 hu-mROO5-1 시리즈의 구축물의 순서와 동일하므로 특정 시리즈의 구축물의 명칭 및 서열 번호는 표 35 및 36을 참조하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 표 35는 hu-mROO5-1 시리즈(시리즈 1)의 마지막 구축물이 CD8SP-CD38-USC1-FHVH-32184-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-Bst-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이며 7408 및 18098의 핵산 및 아미노산 서열을 가짐을 보여준다. 표 36은 시리즈 5에서 hu-mROO5-1-vL이 BCMA-huUSC76-vL로 대체되고 hu-mROO5-1-vH가 BCMA-huUSC76-I58S-vH로 대체됨을 보여준다. 이 시리즈의 상이한 구축물의 핵산 서열 번호는 7616-7684의 범위이고 이 시리즈의 구축물의 아미노산 서열 번호는 18306-18374의 범위이다. 시리즈 5의 상이한 구축물의 순서는 표 35에 나타낸 시리즈 1의 구축물의 순서와 동일하므로, 구축물 CD8SP-CD38-USC1-FHVH-32184-G4Sx3-R1-BCMA-huUSC76-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-Bst-BCMA-huUSC76-I58S-vH-[hTCRa-T48C]의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 각각 7684 및 18374로 결정하였다. 동일한 방법을 사용하여 표 36에 나열된 시리즈의 모든 SAR의 서열 번호를 결정할 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 (A) 단일 vH 도메인(SVH) 또는 이의 단편; 단일 vL 도메인(SVL) 또는 이의 단편; vHH 도메인 또는 이의 단편; 단일 도메인 항체 또는 이의 단편; TCR의 단일 가변 도메인(svd-TCR) 또는 이의 단편; DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 및 D 도메인, 또는 이들 중 어느 하나의 단편으로부터 선택된 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 이의 단편; 리간드의 수용체 결합 도메인; 자가항원 또는 이의 단편; 어댑터 결합 도메인 또는 이의 단편; 및 Fc 결합 도메인 또는 이의 단편의 군으로부터 선택된 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인(AABD) 또는 이의 단편을 포함하는 제1 모듈; 및 (B) vL(V_L), vH(V_H), Va/Vα, Vb1(Vβ1), Vb2(Vβ2), Vg(Vγ), Vd(Vδ), scFv, scTCR, Ig 링커 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는 제2 모듈; (C) 세포외 도메인, 연결 펩티드 또는 힌지 도메인을 포함하는 선택적 제3 모듈; (D) 경막 도메인을 포함하는 제4 모듈; 및 (E) 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 선택적 제5 모듈을 포함하며; 여기서 제1 모듈, 제2 모듈, 선택적 제3 모듈, 제4 모듈, 및 선택적 제5 모듈은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된다.

본 개시 내용은 또한 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 하나 이상의 AABD는 A) 제1 T 세포 수용체 서브유닛의 제1 경막 도메인에 작동 가능하게 연결된 제1 연결 펩티드를 포함하는 제1 TCR 불변 사슬 단편에 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 vH, Va, Vg 또는 Ig 링커 도메인 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 (B) 제2 T 세포 수용체 서브유닛의 제2 경막 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 연결 펩티드를 포함하는 제2 TCR 불변 사슬 단편에 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 vL, Vb, Vd 또는 Ig 링커 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 선택적 링커를 통해 부착되며, 여기서 제1 TCR 불변 사슬 단편 및 제2 TCR 불변 사슬 단편은 T 세포에서 발현될 때 적어도 하나의 TCR 연관 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 코딩된 vH, Va, 또는 Vg 및 제2 항원 결합 도메인의 vL, Vb 또는 Vd는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모듈을 형성한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 AABD, vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd 및/또는 Ig 링커 도메인은 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간 도메인이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 Ig 링커 도메인은 서열 번호 11832-11865를 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 11832-11865의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 선택적 링커 도메인은 서열 번호 11832-11865, 11714-11730을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 11832-11865, 11714-11730의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 그의 단편 또는 변이체, 또는 25 내지 500 개 아미노산 길이인 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 T 세포 수용체 모듈(TCRM)에 동원될 수 있는 폴리펩티드의 부분적 또는 전체적 세포외, 경막 및 세포내 도메인을 포함하는 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 CD3δ, CD3ε, CD3γ 및 CD3ζ의 군으로부터 선택된 폴리펩티드의 세포외, 경막 및 세포내 도메인, 또는 서열 번호 11903 내지 11906 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 그의 단편을 포함하는 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 T 세포 수용체 불변 사슬 단편은 서열 번호 11732-11830 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 T 세포 수용체 불변 사슬은 서열 번호 11867-11875 중 어느 하나의 서열을 갖는 연결 펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 연결 펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 11877-11881 또는 23332-23334 중 어느 하나의 서열을 갖는 경막 도메인에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 경막 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 세포내 도메인은 서열 번호 111883-11886, 11785, 또는 23335-23337 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 시토졸 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, 단일 사슬 SIR, 1.5 사슬 SIR, 이중 사슬 SIR, zSIR, 단일 사슬 cTCR, 1.5 사슬 cTCR, 이중 사슬 cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFPε, TFPγ, TFPδ, TFPαβ, TFPγδ, Tri-TAC, 단일 사슬 TCR, 이중 사슬 TCR 또는 HLA 비의존성 TCR의 백본을 갖는 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 SAR은 적어도 하나의 항원; 및/또는 하나 이상의 항원(들)의 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 개시 내용의 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 2개 이상의 AABD는 적어도 하나의 항원; 및/또는 하나 이상의 항원(들)의 적어도 하나의 에피토프에 결합한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 표 B에 열거된 항원으로부터 선택된 적어도 하나의 항원에 결합한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 코딩된 SAR 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다: (i) 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 및 23148-23161 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 및 23148-23161 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 및 23148-23161 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 중쇄 가변 영역(vH); (ii) 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 경쇄 가변 영역(vL); (iii) 서열 번호 11220-11456 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 사슬 가변 단편(scFv); (iv) 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열 번호 11520-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 낙타과 VHH 도메인; (v) 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열에 의해 코딩되는 비-면역글로불린 스캐폴드; (vi) 서열 번호 11674-11691 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 수용체의 리간드 결합 도메인; (vii) 서열 번호 11692-11702, 22391-22392, 22402-22404 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 리간드의 수용체 결합 도메인; (viii) 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 vH 도메인; (ix) 서열 번호 11704 내지 11712, 또는 22383 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 어댑터에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 어댑터 결합 도메인; (x) 서열 번호 11687, 22406-22407 내지 11712, 또는 22383 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 자가항체 및 자가항체 생산 세포에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 자가항원; (xi) 서열 번호 22396-2239 및 11653-11660 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 TCR 가변 영역(Va, Vb, Vg 또는 Vd); 및 (xii) 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 가변 TCR 도메인(svd-TCR).

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 표적 항원 중 적어도 하나는 혈액 계통 세포 상에 발현되지만 표적 항원 중 적어도 하나는 고형 종양 세포 상에 발현된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 치료 컨트롤과 공동발현되는 본 개시 내용의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템을 제공하며, 여기서 치료 컨트롤은 절단된(truncated) 표피 성장 인자 수용체(tEGFR), 절단된 표피 성장 인자 수용체 viii(tEGFRviii), 절단된 CD30(tCD30), 절단된 BCMA(tBCMA), 절단된 CD19(tCD19), CD34, 티미딘 키나아제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9(icaspase9), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코오스 옥시다제, 데옥시리보뉴클레오시드 키나아제, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)/인돌-3-아세트산(IAA), 감마-글루타밀시스테인 신테타아제, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나아제 키메라, dox 의존성 카스파제-2, 돌연변이 티미딘 키나아제(HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체(CCR), 41BBL, CD40L, K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 돌연변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-이필리무맙-scFv, CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, CD3z, CD3z-GGGS-41BB, CD3-BBz, CD3-CD28z, CD3-CD28-Lck 융합 단백질, Brd4를 표적화하는 shRNA, 키메라 항원 수용체 (CAR), hTERT, 헤파리나제, CAR, 억제성 CAR 및 이들의 조합 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 제공하며, 여기서 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존 벡터, 및 피기백(piggybac) 트랜스포존 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR을 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 SAR을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR을 발현하는 세포 또는 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포는 면역 이펙터 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 유도 만능 줄기세포(iPSC)이다. 세포 또는 세포 집단은 자가 세포 또는 동종이계 세포일 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 내인성 TCR의 기능적 발현이 손상되거나 제거되고 SAR 폴리펩티드의 기능적 발현이 있는 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 SAR mRNA 및 번역된 폴리펩티드가 내인성 T 세포 유전자의 유전자좌에 배치된 발현 카세트로부터 발현되는 것인 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 내인성 T 세포 유전자에 대한 프로모터 및/또는 조절 요소의 제어하에 있는 것인 세포 집단을 제공한다. 본 개시 내용은 내인성 T 세포 유전자의 유전자좌가 TRAC 유전자좌, TRBC 유전자좌, TRGC 유전자좌 및/또는 TRDC 유전자좌인 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR 폴리뉴클레오티드의 배치가 T 세포에서 내인성 TCRα 사슬 및/또는 내인성 TCRβ 사슬, 또는 내인성 TCRγ 사슬 및/또는 내인성 TCRδ 사슬을 포함하는 TCR의 내인성 발현을 방해하거나 제거하는 것인 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 내인성 TCR의 방해 또는 제거된 발현이 야생형 내인성 TCR을 가진 T 세포에서의 그의 발현 및/또는 활성과 비교하여 비-자연 발생 면역 수용체의 향상된 발현 및/또는 활성을 유도하고 SAR은 SIR, cTCR 및/또는 Ab-TCR 중 하나 이상의 백본을 갖는 것인 세포 또는 세포 집단을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR 폴리펩티드가 TFP의 백본을 갖고, 내인성 TCR의 방해 또는 제거된 발현이 야생형 내인성 TCR을 가진 T 세포에서의 그의 발현 및/또는 활성과 비교하여 SAR의 손상된 발현 및/또는 활성을 초래하는 세포 또는 세포 집단을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR 폴리펩티드가 TFP의 백본을 갖고, 세포 또는 세포 집단이 TCR 불변 사슬을 코딩하는 서열을 추가로 발현하는 세포 또는 세포 집단을 제공하고, 여기서 TCR 불변 사슬은 i) TCR 알파 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는 ii) TCR 베타 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는 iii) TCR 감마 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는 iv) TCR 델타 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는 i) 및 ii) 또는 iii) 및 iv)의 조합이고, 여기서 TCR 불변 사슬을 코딩하는 서열의 발현은 SAR 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 회복시킨다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 면역 이펙터 세포의 제조 방법으로서, SAR을 포함하는 적어도 하나의 벡터 또는 SAR을 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를, SAR 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건하에서 면역 이펙터 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 조혈 줄기세포 또는 전구 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 정상 산소 또는 저산소 조건하에 기체 투과성 플라스크에서 SAR 발현 면역 이펙터 세포를 증식하는 방법을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR 발현 면역 이펙터 세포가 SMAC 모방체 또는 NIK 아고니스트 화합물의 존재하에 증식되는 것인 방법을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 대상체에서 항-질환 면역을 제공하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 면역 이펙터 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 투여하는 것을 포함하며, 세포는 자가 T 세포 또는 동종이계 T 세포, 또는 자가 NKT 세포 또는 동종이계 NKT 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 자가 또는 동종이계 조혈 줄기세포 또는 자가 또는 동종이계 iPSC인 방법을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 대상체에서 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 대상체에게 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, SAR 폴리펩티드는 표 B에 열거된 항원으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 관련 항원에 결합하고, 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환은 질환 관련 항원의 발현과 관련된 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 및 비암 관련 적응증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1849-10720, 21609-21625, 21626-21659, 21662-21792. 21808, 21813-21840, 21843-21879, 21882-21892, 21894-21899, 21901-21947, 21949-21963, 21967-21972, 21985-22085, 22087-22099, 22104-22207, 22209-22250, 22252-22254, 22256-22262, 22264-22273, 22275-22284, 22286-22296 및 22307-22312로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 상기의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 서열 번호 12539-21410, 22445-22460, 22462-22495, 22498-22614, 22624, 22626-22655, 22658-22685, 22687-22694, 22697-22707, 22709-22714, 22716-22762, 22764-22778, 22782-22787, 22800-22900, 22902-22914, 22919-23022, 23024-23065, 23067-23069, 23071-23077, 23090-23099, 23101-23111 및 23122-23127로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열, 또는 상기의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리뉴클레오티드, SAR 폴리펩티드 분자, SAR 벡터 또는 SAR 발현 세포 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 SAR 폴리뉴클레오티드, SAR 폴리펩티드 분자, SAR 벡터 또는 SAR 발현 세포를 포함하는 키트를 제공한다.

본 개시 내용은 다음의 비제한적인 도면에서 추가로 설명된다.
[도 1]은 다양한 이중 사슬 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 개략도를 보여준다.
[도 2]는 다양한 형태의 AABD(예를 들어, vHH, SVH, aVH, 아피바디, 센티린 등)를 포함하는 다양한 이중 사슬 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 개략도를 보여준다.

본 발명은 이제 추가로 설명될 것이다. 다음 단락에서, 본 발명의 다양한 측면이 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각 측면은 명백하게 반대되는 표시되지 않는 한 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.

달리 언급되지 않거나 문맥에서 암시되지 않는 한, 다음 용어 및 문구에는 아래 제공된 의미가 포함된다. 달리 명시적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 아래의 용어 및 문구는 해당 용어 또는 문구가 관련된 기술 분야에서 획득한 의미를 배제하지 않는다. 정의는 특정 실시 양태를 설명하는 데 도움을 주기 위해 제공되며, 본 발명의 범위가 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 청구된 발명을 제한하도록 의도되지는 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 실시 양태에 유용하지만, 유용하든 유용하지 않든 불특정 요소의 포함에 개방적인 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다. 일반적으로, 본원에 사용되는 용어는 "개방된" 용어로 대개 의도된다는 것을 당업자는 이해할 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"는 "최소한 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함한다"는 "포함하지만 이에 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 함).

일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 병리학, 종양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화의 기술 및 이들과 관련하여 사용되는 명명법은 당 업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 개시 내용의 방법 및 기술은 일반적으로 당 업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2013))]을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당 업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기재된 면역학, 분자 생물학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학의 실험실 절차 및 기술 및 이들과 관련하여 사용되는 명명법은 당 업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형, 및 전달, 환자 치료에 사용된다.

양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 편차는 개시된 방법을 수행하거나 본원의 조성물을 설명하는 데 적절하기 때문이다. 또한, 모든 값 또는 범위(예를 들어, 20 미만 또는 유사한 용어)에는 이러한 값 사이 또는 그 값까지의 모든 정수가 명시적으로 포함된다. 따라서, 예를 들어 "1 내지 5개의 돌연변이"는 1, 2, 3, 4, 및/또는 5개의 돌연변이를 명시적으로 포함한다. "적어도"라는 용어는 범위의 최소값을 나타낸다. "적어도"가 백분율 앞에 오는 경우, 범위에서 고려되는 증분 값은 예를 들어 100%(동일성/상동성의 경우)까지 0.1%이다.

"항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 모듈" 또는 "항원 결합 세그먼트" 또는 "항원 특이적 도메인"(ASD: antigen specific domain)은 1차, 2차 또는 3차 서열, 번역 후 변형 및/또는 전하로 인해 항원에 높은 수준의 특이성으로 결합하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 다양한 공급원, 예를 들어 항체(전장 중쇄, Fab 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, 2가 단일 사슬 항체 또는 디아바디), 비-면역글로불린 결합 단백질, 리간드 또는 수용체로부터 유래될 수 있다. 그러나 연결된 사이토카인(사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식으로 이어짐), 아피바디, 자연 발생 수용체의 리간드 결합 도메인, 수용체에 대한 가용성 단백질/펩티드 리간드(예를 들어, 종양 세포 상에서), 펩티드, 및 면역 반응을 촉진하는 백신과 같은 수많은 대안이 있으며, 이는 본 개시 내용의 다양한 실시 양태에서 각각 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 주어진 동족 또는 항원에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 분자가 ASD로서 사용될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 일부를 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, 표적 항원 및 다양한 항원 결합 도메인의 서열 번호가 본원의 표 3-7에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, 표적 항원 및 vL, vH, scFV, 및 이들의 CDR 영역의 서열 번호는 특허 출원 PCT/US18/53247의 표 6A-C 및 특허 출원 PCT/US19/035096의 표 3-4에 제시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 개시 내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 vL, vH 및 scFv는 기원이 "완전 인간", "인간화된", "키메라" 또는 비인간일 수 있다. 예시적인 완전 인간 vL, vH 및 scFv는 각각 서열 번호 10854, 11096 및 11338로 표시된다. 예시적인 인간화 vL, vH 및 scFv는 각각 서열 번호 10839, 11082 및 11323으로 표시된다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "자율 항원 결합 도메인" 또는 "AABD"는 항원에 자율적으로, 즉, 또 다른 항원 결합 도메인의 부재 하에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 지칭한다. 예시적인 AABD는 단일 vH 도메인 또는 자율 vH 도메인(aVH), 일반적으로 vL 도메인의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 단일 인간 vH 도메인(SVH)이다. 예시적인 AABD는 단일 vL 도메인 또는 자율 vL 도메인, 일반적으로 vH 도메인의 부재하에 항원에 결합할 수 있는 단일 인간 vL 도메인(SVL)이다. 또 다른 예시적인 AABD는 완전 인간 vH 도메인(FHVH)이다. AABD는 또한 항원에 자율적으로 결합할 수 있는 다른 항원 결합 도메인을 지칭한다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 도메인이다. 예시적인 비-scFV 기반 자율 항원 결합 도메인은 vHH 도메인, 인간화 vHH 도메인, svd-TCR, 및 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 예컨대 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 또는 이의 단편; 수용체(예를 들어, CD16-V158A, NKG2D)의 리간드 결합 도메인 또는 이의 단편, 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴 등)의 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편, 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-YA, NKG2D-AF 등) 또는 이의 단편, 어댑터 결합 단백질(예를 들어 ULBP2R, ULBP2-S3 등) 또는 이의 단편, 에피토프 또는 태그(예를 들어, Streptag, FLAG 태그 등), 자가항원 또는 이의 단편 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 개시 내용은 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 인간 VH 도메인, 일반적으로 다중 인간 VH 도메인과 같은 AABD의 용도를 기재하였다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 CAR, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP 및 재조합 TCR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 인간 VH 도메인, 일반적으로 다중 인간 VH 도메인과 같은 AABD의 용도를 기재한다.

본원에 기재된 바와 같이 용어 "ABR(Antibody Binding Receptor" 또는 "항원 결합 수용체"는 항원 결합 도메인을 갖는 임의의 수용체를 지칭한다. ABR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, VHH, 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab), 항체 유사 모이어티, Vα, Vβ, 사이토카인, 수용체 등을 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, ABR은 세포 표면상에서 발현될 수 있도록 하는 경막 또는 막 고정 도메인을 갖는다. 예시적인 ABR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, TFP, TRI-TAC 또는 TAC 등을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 항원 차폐 수용체가 또한 ABR의 예이다.

용어 "Ab-TCR" 또는 "AbTCR"은 본원에 참고로 포함되는 WO 2017/070608 A1에 기재된 바와 같은 차세대 CAR 플랫폼을 지칭한다. 한 실시 양태에서, Ab-TCR은 적어도 하나의 TCR 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 TCR 모듈에 융합된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. Ab-TCR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 모듈은 서열 번호 6009-6014(표 6) 및 본원에 참고로 포함된 WO 2017/070608 A1에 제공되어 있다. 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD를 포함하는 Ab-TCR의 백본을 갖는 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR을 제공한다. Ab-TCR의 백본을 갖는 본 개시 내용의 SAR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 Ab-TCR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 Ab-TCR을 제공한다.

용어 "AABD-TCR"은 하나 이상의 AABD가 개재 vL, vH, Va, Vb, Vg 및/또는 Vd 사슬의 존재 없이 가능한 TCR 모듈에 프레임 내에서 작동 가능하게 연결된 본 개시 내용에 기재된 신규 이중 사슬 SAR 플랫폼을 지칭한다. 본 개시 내용의 바람직한 실시 양태에서, AABD-TCR은 AABD와 TCR 모듈 사이에 존재하는 Ig 유사 링커 도메인을 포함한다. AABD-TCR의 TCR 모듈은 적어도 하나의 TCR 신호전달 모듈을 동원할 수 있다. 예시적인 AABD-TCR은 서열 번호(DNA) 6521 및 6530으로 표시된다. 추가 AABD-TCR은 표 33 및 34에 제시되어 있다. AABD-TCR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 AABD-TCR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 AABD-TCR을 제공한다.

용어 "보조 모듈"은 면역 세포의 활성을 감소, 조절 또는 변형하기 위해 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예를 들어 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포)에서 발현되는 PDL1, PDL2, CD80, CD86, crmA, p35, hNEMO-K277A (또는 NEMO-K277A), hNEMO-K277A-델타-V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E (또는 IKK2-SS/EE), IKK1-S176E-S180E (또는 IKK1-SS/EE), MyD88-L265P, TCL-1a, MTCP-1, CMV-141, 41BBL, CD40L, vFLIP-K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 돌연변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-이필리무맙-scFv, CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, Brd4를 표적화하는 shRNA, IgSP-[hTRAC-opt2], IgSP-[hTRBC-opt2] 및 이들의 조합 중 어느 하나 이상을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 보조 모듈은 CAR 또는 TCR 또는 CAR-발현 또는 TCR-발현 세포의 발현 또는 활성을 증가, 감소, 조절 또는 변형하기 위해 CAR 또는 TCR과 같은 면역 수용체와 공동발현된다. 보조 모듈은 단일 벡터를 사용하거나 2개 이상의 상이한 벡터를 사용하여 CAR 또는 TCR과 공동발현될 수 있다. 추가 실시 양태에서, 보조 모듈은 이량체화 분자의 투여에 의해 활성이 제어될 수 있는 FKBPx2-NEMO와 같은 FKBP(FK506 결합 단백질)-융합 단백질을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조 모듈은 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포에서 발현된다.

여기서 사용되는 바와 같이 용어 "아피바디"는 알파 나선으로 구성되고 이황화 결합이 없는 항체 모방 분자를 지칭한다. Her3을 표적화하는 예시적인 아피바디는 서열 번호 11664로 표시된다. 다른 예시적인 아피바디는 당 업계에 공지되어 있다.

본원에 사용되는 바와 같이 "친화도"는 결합 강도의 척도를 기술하고자 한다. 일부 경우에 친화도는 결합제와 그의 표적 사이의 입체화학적 적합성의 근접성(예를 들어, 결합 도메인에 특이적인 에피토프를 포함하는 항원과 항체 사이), 이들 사이의 접촉 면적의 크기 및 하전된 기와 소수성 기의 분포에 따라 결정된다. 친화도는 일반적으로 표적에 결합하는 결합제의 "능력"을 나타낸다. "친화도"를 측정하기 위해 당 업계에서 사용되는 수많은 방법이 있다. 예를 들어, 친화도를 계산하기 위한 결합 실험의 사용을 포함하여 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 결합 친화도는 당 업계에 공지된 다양한 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭계, 이중 편광 간섭계, 정적 광산란, 동적 광산란, 등온 적정 열량계, ELISA, 분석 초원심분리, 및 유세포 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 결합 친화도를 결정하는 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용한다. 표면 플라즈몬 공명은 예를 들어 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내 단백질 농도의 변화를 감지하여 실시간 생물특이적 상호작용을 분석할 수 있는 광학 현상이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 적어도 10^-6M의 결합 친화도를 갖는 항체와 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 측면에서, 항체는 적어도 약 10^-7M, 일반적으로 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M, 10^-11M 또는 10^-12M의 친화도로 결합한다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 단클론, 다클론, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있으며 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 항체는 사량체의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 "완전 인간", '인간화', '키메라' 또는 비인간일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "인간화" 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원 결합 부분서열)인 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/거나 당업자에게 공지되어 있거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 적어도 하나의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.

용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래된 항체를 지칭하도록 의도된다.

용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화 결합 Fv(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 vL 또는 vH, 낙타과 vHH 도메인, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 기타 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 혼입될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 III형(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술하는 미국 특허 제6,703,199호 참조).

"항체 중쇄"라는 용어는 자연 발생 형태로 항체 분자에 존재하고 일반적으로 항체가 속하는 부류를 결정하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.

"항체 경쇄"라는 용어는 자연 발생 형태로 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 두 가지 주요 항체 경쇄 아이소형을 나타낸다.

"항암제"는 비정상적인 세포 분열 및 성장을 억제하거나, 신생물 세포의 이동을 억제하거나, 침습성을 억제하거나, 암 성장 및 전이를 예방하는 작용제를 지칭한다. 이 용어는 화학요법제, 생물학적 작용제(예를 들어, siRNA, 세포독성 유전자를 전달하는 조작된 MLV, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스 벡터), 항체 등을 포함한다.

"항암 효과"라는 용어는 종양 부피의 감소, 암세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암세포 증식의 감소, 암세포 생존의 감소, 또는 암 상태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 처음에 암의 발생을 예방하는 SAR의 능력에 의해 나타날 수 있다.

"항원" 또는 "Ag"라는 용어는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산이나 특정 면역학적으로 적합한 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 모든 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 숙련된 기술자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모든 DNA가 따라서 그 용어가 본원에서 사용되는 "항원"을 코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 개시 내용은 하나 초과의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용 및 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 코딩하기 위한 이들 뉴클레오티드 서열의 다양한 조합의 배열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 숙련된 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있다는 것은 너무 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분이 있는 유체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC(antigen presenting cell)"는 표면상 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체가 형성되는 외래 항원을 표시하는 보조 세포(예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)와 같은 면역계 세포를 지칭한다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 처리하여 T 세포에 제공한다.

"항감염 효과"라는 용어는 예를 들어 감염원의 역가 감소, 감염원 집락 수의 감소, 감염 상태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항감염 효과"는 또한 처음에 감염의 발생을 예방하는 데에 있어 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.

용어 "항종양 효과" 또는 "항암 효과"는 예를 들어, 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 전이 억제, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.

"결합 상수(Ka)"라는 용어는 수용체와 리간드의 결합의 평형 상수로 정의된다.

"자가항체"는 자가항원에 대해 특이적인 B 세포에 의해 생성되는 항체를 지칭한다.

용어 "자가항원"은 자가항체의 생성과 같은 자가면역 반응의 생성을 자극하는 내인성 항원을 지칭한다. 자가항원은 또한 자가면역 질환의 발병을 초래할 수 있는 세포 매개 또는 항체 매개 면역 반응의 표적인 자가 항원 또는 정상 조직으로부터의 항원을 포함한다. 자가항원의 예에는 데스모글레인 1, 데스모글레인 3, 및 이의 단편이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

"결합력"은 결합제와 그의 표적 사이의 상호작용의 강도(예를 들어, 항체와 그의 항원 표적, 수용체 및 그의 동족체 사이 등의 상호작용의 강도)를 지칭한다. 결합력은 약하거나 강할 수 있다. 친화도를 계산하기 위한 결합 실험의 사용을 포함하여 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법은 당 업계에 알려져 있다. 기능적 분석(예를 들어, 유세포 분석 또는 Malibu-Glo 분석)에서 항체 활성은 또한 항체 친화도를 반영한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "백본" 또는 "아키텍처"는 다양한 SAR(예를 들어, CAR, SIR, cTCR, Ab-TCR, TFP 등) 및/또는 일반적으로 선택적인 모든 보조 모듈의 구성을 지칭한다. 예시적인 실시 양태에서, SAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 이중 사슬 SIR, 1.5 사슬 SIR, 이중 사슬 cTCR, 1.5 사슬 cTCR, zSIR, Ab-TCR, AABD-TCR, εTFP, γTFP, δTFP, αβTFP, γδTFP, TCR 등의 백본을 가질 수 있다. 특정 백본을 갖는 SAR은 각각 상이한 백본을 나타내는 추가 하위 유형을 가질 수 있다. 따라서, 이중 사슬 SIR의 백본을 갖는 SAR은 그의 항원 결합 도메인의 수(단일특이성, 이중특이성, 다중특이성 등) 및 특성(예를 들어, vL, vH, scFv, vHH, FHVH, DARPIN 등)에 따라 추가 하위 유형을 가질 수 있다. 상기 각 하위 유형은 별도의 백본으로 간주될 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, 임의의 백본 상의 SAR은 보조 모듈(예를 들어, PAC, K13-opt, MC159, icaspase 9 등)을 추가로 공동발현할 수 있다. 따라서, 이중 사슬 SIR의 백본을 갖는 SAR은 K13-opt와 공동발현될 수 있다. 한 실시 양태에서, SAR 및 보조 모듈은 단일 핵산 분자에 의해 코딩된다. 또 다른 실시 양태에서, SAR은 제1 핵산 분자에 의해 코딩되고 보조 모듈은 제2 핵산 분자에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, 보조 모듈은 보조 모듈 내의 성분 수에 따라 하나 초과의 핵산 분자에 의해 코딩된다. SAR의 2개 이상의 성분은 2A 리보솜 스킵 서열(예를 들어, P2A, T2A, F2A 등)과 같은 절단성 링커에 의해 분리될 수 있다.

표 A1-1: SAR 아키텍처/백본. 1세대 종래의 CAR(종래의 CAR I)에는 활성화 도메인(AD) 도메인(예를 들어, CD3z)이 있고 공동자극 도메인(CD)이 없다. TCR 융합 단백질(TFP)은 종래의 CAR 1의 또 다른 예이다. 2세대 종래의 CAR(종래의 CAR 2 또는 CAR II)에는 하나의 공동자극 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28)과 세포내 활성화 도메인(AD) 도메인(예를 들어, CD3z)이 있다. 3세대 종래의 CAR(종래의 CAR 3 또는 CAR III)에는 2개의 공동자극 도메인(예를 들어, 4-1BB 및 CD28)과 세포내 활성화 도메인(예를 들어, CD3z)이 있다. Ab-TCR은 vL-IgCL-링커-TCR 도메인(TCRD 및 vH-Ig-CH1-링커-TCR 도메인(TCRD))을 포함하는 이중 사슬 수용체이며 PCT/US2016/058305에 기재되었다. AABD-TCR은 본 개시 내용에 기재된 이중 사슬 수용체이며 일반적으로 AABD-IgCL-TCRD 모듈 및 IgCH1-TCRD 모듈 또는 IgCL-TCRD 모듈 및 AABD-IgCH1-TCRD 모듈을 포함하며, 여기서 TCRD는 본질적으로 상보적이다(즉, TCRα 및 TCRβ 또는 TCRγ 및 TCRδ). 이중특이성 및 다중특이성 AABD-TCR은 또한 본 개시 내용에 기재되어 있으며 일반적으로 (AABD)n-IgCL-TCRD 모듈 및 (AABD)n-IgCH1-TCRD 모듈을 포함하며, 여기서 TCRD는 본질적으로 상보적이다(즉, TCRα 및 TCRβ 또는 TCRγ 및 TCRδ). cTCR은 이들의 야생형 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 TCR 불변 사슬(TCR-C)에 융합되고 T 세포 신호전달의 활성화를 초래하는 vL 및 vH로부터 유래된 항원 결합 도메인으로 이루어진 단일 사슬, 1.5, 또는 이중 사슬 수용체이다. cTCR의 다양한 구성은 PCT/US2017/064379, WO 2018/102795 A1 및 문헌[Gross et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1989) 86:10024-26]에 기재되어 있다. 합성 면역 수용체는 차세대 CAR이며 PCT/US2017/064379 또는 WO 2018/102795 A1에 기재되어 있다. zSIR은 선택적 링커와 함께 2개의 CD3z 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 이중 사슬 수용체이며 PCT/US2019/035096에 기재되어 있다.

[표 A1-1]

표 A1-1 내지 A1-9는 본 개시 내용의 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 예시적인 아키텍처를 제공한다. 사용된 약어는 다음과 같다: SP(신호 펩티드); AADB(자율 항원 결합 도메인); L(선택적 링커); LL(긴 링커), (AABD-L)n(선택적 링커가 있는 AABD의 n개 사본, 여기서 n = 0, 1, 2, 3, 4 이상), AABD1-4(하나 이상의 항원을 표적화하는 다양한 AABD), V1(vL, vH, Va, Vb, Vg 또는 Vd 사슬), Ig(Ig 링커), ConP(연결 펩티드), TM(경막 도메인), IC(세포내 도메인), Ca(TCRα의 불변 사슬), Cb(불변 TCRβ의 사슬), Cg(TCRγ의 불변 사슬), Cd(TCRδ의 불변 사슬), scFv(단일 사슬 가변 단편), scTFv(TCR의 2개의 가변 단편, 예를 들어 Va 및 Vb를 포함하는 단일 사슬 단편), dCa/dCb/dCg/dCd(Ig 링커 도메인이 없는 TCRα, β, γ 또는 δ의 N-말단 결실된 불변 사슬), TCR-ConP(TCRα, β, γ 또는 δ 불변 사슬의 연결 펩티드), Ca-ConP(TCRα 불변 사슬의 연결 펩티드), IgCL(면역글로불린 경쇄의 Ig 링커), IgCH1(면역글로불린 중쇄의 Ig 유사체), CD3εγδ ECD(CD3ε, γ 또는 δ 사슬의 세포외 도메인), CD(공동자극 도메인), 4-1BB(4-1BB의 공동자극 도메인), CD28(CD28의 공동자극 도메인), CD3z(CD3z의 활성화 도메인).

[표 A1-2]

[표 A1-3]

[표 A1-4]

[표 A1-5]

[표 A1-6]

[표 A1-7]

[표 A1-8]

[표 A1-9]

본원에 사용되는 바와 같이, "유익한 결과"는 질환 상태의 중증도 감소 또는 완화, 질환 상태 악화 예방, 질환 상태 치유, 질환 상태 발병 예방, 환자가 질환 상태를 발병할 가능성 감소, 및 환자의 수명 또는 기대 수명 연장을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시 양태에서, 항체 분자는 다중특이성 항체 분자이고, 예를 들어, 이는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 결합 특이성을 갖고 복수 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, 다중특이성 항체 분자는 이중특이성 항체 분자이다. 이중특이성 항체는 2개의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 이중특이성 분자는 제1 항원 결합 도메인이 T 세포 상에서 발현되는 항원(예를 들어, CD3ε)에 결합하고 제2 항원 결합 도메인이 질환 유발 또는 질환 관련 세포(예를 들어, 암세포) 상에서 발현되는 항원에 결합하는 이중특이성 T 세포 인게이징 항체일 수 있다. 이중특이성 항체는 그들의 제2 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 표적 항원을 발현하는 세포에 대해 T 세포 매개된 세포독성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시 내용에 기재된 신규 항원 결합 도메인은 이중특이성 T 세포 인게이저를 구축하는데 사용될 수 있다.

"동일한 에피토프에 결합한다"는 항체, scFv, 또는 다른 항원 결합 도메인이 표적 항원에 결합하고 예시된 항체, scFv, 또는 다른 항원 결합 도메인과 동일한 에피토프를 갖는 능력을 의미한다. 예로서, 예시된 항체, scFv, 또는 다른 결합제 및 다른 항체의 에피토프는 표준 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 당 업계에 잘 알려진 에피토프 맵핑 기술은 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 포함한다. 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어, 고체 지지체 상의 다수의 펩티드, 단백질 분자의 일부분에 상응하는 펩티드를 동시에 합성하고, 펩티드가 지지체에 여전히 작동 가능하게 연결되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,708,871호; 문헌[Geysen et al, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al, (1986) Mol. lmmunol. 23: 709-715]에 설명되어 있다. CAR의 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프는 또한 에피토프 비닝(Binning) 분석에 의해 결정될 수 있다. 에피토프 비닝은 표적 단백질에 대한 단클론 항체 라이브러리를 특성화한 후 분류하는 데 사용되는 경쟁 면역 분석법이다. 유사한 표적에 대한 항체는 항체가 항원의 에피토프에 대한 서로의 결합을 차단하는지 확인하기 위해 쌍대 방식으로 라이브러리의 다른 모든 항체에 대해 테스트된다. 각 항체가 라이브러리의 다른 모든 항체에 대해 프로파일이 생성되고 나면 라이브러리의 다른 것에 대한 각 항체에 대해 경쟁 차단 프로파일이 생성된다. 밀접하게 관련된 비닝 프로파일은 항체가 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프를 갖고 함께 "비닝"된다는 것을 나타낸다. 유사하게, 입체구조적 에피토프는 예를 들어 수소/중수소 교환, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해서와 같이 아미노산의 공간적 입체구조를 결정함으로써 쉽게 식별된다. 예를 들어, 상기 문헌(Epitope Mapping Protocols)을 참조한다. 단백질의 항원성 영역은 또한 예를 들어 Oxford Molecular Group에서 입수할 수 있는 Omiga 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것과 같은 표준 항원성 및 소수성 플롯(hydropathy plot)을 사용하여 식별될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일 결정을 위해 Hopp/Woods 방법(Hopp et al, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828), 및 소수성 플롯에 대해 Kyte-Doolittle 기술(Kyte et al, (1982) J.Mol. Bioi. 157: 1 05-132)을 사용한다. 표적(예를 들어, CD19)에 대한 선택된 단클론 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 각 항체는 상업적으로 이용 가능한 시약(Pierce, 미국 일리노이주 록퍼드 소재)을 사용하여 비오티닐화될 수 있다. 표지되지 않은 단클론 항체 및 비오티닐화된 단클론 항체를 사용하는 경쟁 연구가 CD19-세포외 도메인 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오티닐화된 mAb 결합이 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다. 본 개시 내용의 scFv, SAR, 항체 및 기타 면역치료제에 의해 결합된 인간 CD20 항원의 예시적인 에피토프는 특허 출원 PCT/US18/53247의 서열 번호 15149-15154에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 개시 내용의 scFv, SAR, 항체 및 기타 면역치료제에 의해 결합된 인간 BCMA의 예시적인 에피토프는 특허 출원 PCT/US18/53247의 서열 번호 15155-15159에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 개시 내용의 scFv, SAR 및 항체에 의해 결합된 인간 MPL 항원의 예시적인 에피토프는 특허 출원 PCT/US18/53247의 서열 번호 15160에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이의 생물학적 등가물" 또는 "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 참조 단백질, 항체 또는 이의 단편, 폴리펩티드 또는 핵산을 언급할 때 "이의 등가물"과 동의어로 의도되며, 원하는 구조 또는 기능성을 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도된다. 본원에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 상기 중 임의의 것이 또한 이의 등가물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 등가물은 적어도 약 70%의 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80%의 상동성 또는 동일성, 대안적으로는, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로는 적어도 약 90%, 또는 대안적으로는 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 적어도 98%의 상동성 또는 동일성을 의도하고 참조 단백질, 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편 또는 핵산과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 언급할 때, 이의 등가물은 엄격한 조건하에 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이다. 대안적으로, 폴리펩티드 또는 단백질을 언급할 때, 이의 등가물은 엄격한 조건하에 참조 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 폴리펩티드 또는 단백질이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이성"은 2개의 항원에 결합할 수 있는 작용제(예를 들어, 항체, 항체 단편, SAR, CAR 등)를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중파라토프"는 항원의 2개의 에피토프에 결합할 수 있는 작용제(예를 들어, 항체, 항체 단편, SAR, CAR 등)를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "다중특이성"은 2개 초과의 항원에 결합할 수 있는 작용제(예를 들어, 항체, 항체 단편, SAR, CAR 등)를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원 결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Bioi. Chern. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Bioi. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Bioi. 25 262:732-745 (1996)]에 설명되었으며, 여기서 정의는 서로에 대해 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 이식된 항체의 CDR 또는 이의 변이체를 언급하는 데에 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 항체의 상이한 CDR은 또한 상이한 정의의 조합에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, VHCDR1은 Kabat를 기반으로 정의할 수 있고 VHCDR2는 Chothia를 기반으로 정의할 수 있다. 상기 인용된 참고 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 다음과 같다:

CDR 정의

Kabat Chothia MacCallum

VHCDR1 31-35 26-32 30-35

VHCDR2 50-65 53-55 47-58

VHCDR3 95-102 96-10 193-101

VLCDR1 24-34 26-32 30-36

VLCDR2 50-56 50-52 46-55

VLCDR3 89-97 91-96 89-96

(잔기 번호는 식별된 참고 문헌에 해당함).

본 개시 내용의 scFv, CAR, AMR, 항체 및 다른 면역치료제의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있는 다양한 vL 및 vH 세그먼트의 CDR의 서열 번호는 각각 PCT/US18/53247의 서열 번호 13204-14121 및 14122-15039(표 6A, B) 및 PCT/US2017/064379의 표 5-6에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.

일부 실시 양태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모듈(예컨대 Fab 유사 또는 Fv 유사 항원 결합 모듈)에 대한 언급은 항원 결합 모듈이 (a) 다른 분자에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배(예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 이상)인 친화도; 또는 (b) 다른 분자와의 결합에 대한 K_d의 약 1/10배 이하(예를 들어, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 이하) K_d로 표적 항원에 결합함을 의미한다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, Malibu-Glo 분석, Topanga 분석 또는 방사성 면역침전 분석(RIA)과 같은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. K_d는 예를 들어 Biacore 기기를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 또는 예를 들어 Sapidyne 기기를 사용하는 동역학 배제 분석(KinExA)과 같은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

"암" 및 "암성"은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예에는 B 세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), T 세포 림프종, 골수종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 장애(예를 들어, 진성 적혈구증가증, 골수섬유증, 본태성 혈소판증가증 등), 피부암, 뇌종양, 유방암, 결장암, 직장암, 식도암, 항문암, 원발 부위 불명암, 내분비암, 고환암, 폐암, 간세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 생식 기관 암, 갑상선암, 신장암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암(예를 들어, 다형성 교모세포종), 전립선암(안드로겐 의존성 전립선암 및 안드로겐 비의존성 전립선암을 포함하지만 이에 제한되지는 않음), 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 암 및 세포 증식성 장애는 당 업계에서 용이하게 인식될 것이다. 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 두 용어 모두 고체 및 액체, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "암" 또는 "종양"은 전악성, 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다. 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침습 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의도된다.

"세포 요법" 또는 "세포 기반 요법" 또는 "면역 세포 요법" 또는 면역 이펙터 세포 요법" 또는 "입양 세포 요법"은 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포의 사용을 포함하는 요법을 지칭한다. 세포 요법의 비제한적 예는 CAR-T 세포 요법, NK-세포 요법, 재조합 TCR-T 세포 요법, TIL(종양 침윤 림프구)을 포함한다. 면역 세포(예를 들어, T 세포 및 NK 세포)에 결합하고/거나 그를 활성화함으로써 효과를 매개하는 항체(예를 들어, 이중특이성 T 세포 인게이저 및 DART 등)와 같은 생물학적 작용제는 세포 요법의 다른 예이다. 자가 및 동종이계 혈액 및 골수 이식을 포함한 줄기세포 및 장기 이식도 세포 요법의 예이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "센티린"은 높은 친화성과 특이성으로 관심 항원에 결합할 수 있는 인간 단백질 테나신 C로부터 유래된 소형의 조작된 단백질을 지칭한다. 센티린은 매우 안정적인 피브리넥트 III형(FN3) 도메인을 가지고 있다. 예시적인 센티린이 표 7에 제공되어 있다.

"화학요법제"는 암에 대한 화학요법에 사용되는 것으로 알려진 화합물이다. 화학요법제의 비제한적 예는 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴과 같은 니트로우레아; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1(예를 들어, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994) 참조))와 같은 항생제; 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트;에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색 단백 엔다이인 항생물질 발색단), 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, 미국 오리건주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재), 파클리탁셀의 발색단 무함유, 알부민 조작 나노입자 제제 ABRAXANE®(American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샴버그 소재), 및 TAXOTERE® 도세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 엉또니 소재); 클로란부실; GEMZAR® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 네이블빈; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴, 라파티닙(Tykerb); 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR(예를 들어, 에를로티닙(Tarceva®)) 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. .

"키메라 항원 수용체"(CAR)는 입양 세포 전달이라고 하는 기술을 사용하여 암 치료법으로 사용하기 위해 고려되는 인공(비-자연 발생) 면역 세포(예를 들어, T 세포) 수용체이다. CAR은 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역 수용체로도 알려져 있다. CAR은 CAR이 결합하는 특정 항원에 반응하여 T 세포 활성화 및 증식을 자극하도록 특이적으로 구축된다. 일반적으로, CAR은 면역 이펙터 세포에서 발현될 때 세포에 표적 세포, 전형적으로 암세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 제공하는 폴리펩티드 세트, 전형적으로 가장 단순한 실시 양태에서 2개의 폴리펩티드 세트를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, CAR은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 세포질 신호전달 도메인(본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 세트는 서로 인접한다. 한 측면에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 사슬이다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시 양태에서, 공동자극 분자는 본원에 기재된 공동자극 분자, 예를 들어 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단(N-ter)에 선택적 리더 서열을 포함한다. 한 실시 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 CAR의 세포 프로세싱 및 세포막으로의 국소화 동안 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다. 다양한 실시 양태에서, CAR은 항원 특이적 도메인(ASD), 힌지 영역(HR), 경막 도메인(TMD), 선택적 공동자극 도메인(CSD) 및 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함하는 재조합 폴리펩티드이다. 선택적 공동자극 도메인은 일반적으로 1세대 CAR 구축물에 존재하지 않는다. 상이한 항원 결합 도메인(예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고 41BB 공동자극 도메인을 포함하는 몇 가지 예시적인 2세대 CAR의 핵산 서열이 PCT/US2020/014237의 서열 번호 1455-1703(표 8)에 제시되어 있다. 상응하는 아미노산 서열은 PCT/US2020/014237의 서열 번호 7341-7589에 제공되어 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 CAR을 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 SAR은 CAR을 포함하고, 또한 항체-TCR 키메라 분자 또는 Ab-TCR(본원에 참고로 포함된 WO 2017/070608 A1), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP(본원에 참고로 포함된 WO 2016/187349 A1), 합성 면역 수용체(SIR)(본원에 참고로 포함된 WO 2018/102795 A1 참조), 삼작용성 T 세포 항원 커플러(Tri-TAC 또는 TAC)(본원에 참고로 포함된 WO 2015/117229 A1 참조) 및 zSIR(본원에 참고로 포함된 PCT/US2019/035096 참조)과 같이, 세포에 항원 특이성을 부여하기 위한 더 새로운 접근법을 포함한다. 다양한 항원 결합 도메인(예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고 CD3ε, CD3δ, CD3γ 및 CD3ζ 사슬을 기반으로 하고 선택적 보조 모듈 NEMO-K277A를 공동발현하는 여러 예시적인 TFP의 핵산 서열이 PCT/US18/53247(그 전체가 본원에 참고로 포함됨)의 서열 번호 1900-2205, 2206-2511, 2512-2817, 2818-3123(표 13)에 각각 제시되어 있다. PCT/US18/53247(그 전체가 본원에 참고로 포함됨)의 표 13에 열거된 다양한 CAR 아키텍처 및 BiTE의 구축물에 함유된 항원 결합 도메인의 순서는 PCT/US18/53247(그 전체가 본원에 참고로 포함됨)의 표 12에 제시된 zCAR-K277A 아키텍처에 있는 구축물의 순서와 동일하다. 일반적으로, "SAR-T 세포"라는 용어는 합성 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포를 지칭하는 데 사용된다. 따라서, 그러한 SAR을 보유하는 T 림프구는 일반적으로 SAR-T 림프구로 지칭된다. SAR이 CAR이면 T 세포를 CAR-T 세포라고 지칭한다. SAR은 조혈 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPSC), NK 세포 및 대식세포와 같은 T 세포 이외의 세포에서도 발현될 수 있다. 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD를 포함하는 CAR, SIR, zSIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP, 및 TCR 등의 백본을 갖는 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR을 제공한다. 상기 백본 중 어느 하나에 있는 SAR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 임의의 상기 백본 상의 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 임의의 상기 백본 상의 SAR을 제공한다.

"코돈 최적화" 또는 "종 코돈 편향에 대한 제어"는 특정 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 숙주에서 발현을 향상시키기 위해 코딩 서열을 변형시키는 것이 유리할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "공동발현"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현을 지칭한다. 유전자는 예를 들어, 단일 폴리펩티드 사슬로서 단일 단백질 또는 키메라 단백질을 코딩하는 핵산일 수 있다. 본원에 기재된 SAR 또는 TCR은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 코딩되고 단일 폴리펩티드 사슬로 발현될 수 있으며, 이는 후속적으로 각각 별개의 기능 단위를 나타내는 상이한 폴리펩티드로 절단된다. 일부 실시 양태에서, SAR 또는 TCR이 2개 이상의 기능적 폴리펩티드 단위로 이루어지는 경우, 상이한 기능적 단위는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 사슬을 사용하여 공동발현된다. 한 실시 양태에서, 공동자극은 SAR 또는 TCR과 공동발현되지만 SAR 또는 TCR 폴리펩티드의 통합 부분이 아닌 보조 모듈에 의해 제공된다. 또 다른 실시 양태에서, 상이한 폴리뉴클레오티드 사슬은 절단성 링커(예를 들어, T2A, F2A, P2A, E2A 등)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 연결된다(표 20). 또 다른 실시 양태에서, Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG) 모티프(서열 번호 1239 및 11929)는 또한 절단 효율을 향상시키기 위해 절단성 링커 서열의 상류에 첨가된다. SAR 또는 TCR의 상이한 단위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRES(Internal Ribosomal Entry Site: 내부 리보솜 진입 부위) 서열에 의해 연결될 수 있다. 대안적으로, SAR 또는 TCR의 상이한 기능 단위는 링커를 통해 연결되는 것이 아니라 대신 예를 들어 2개의 상이한 벡터에 의해 코딩되는 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 예시적인 절단성 링커 및 퓨린 절단 부위의 핵산 및 아미노산 서열이 표 20에 제공되어 있다.

"보존적 치환" 또는 "보존적 서열 변형"은 코딩된 단백질의 결합 특성 또는 기능을 유의하게 변경하거나 그에 유의한 영향을 미치지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 예를 들어, "보존적 서열 변형"은 본 개시 내용의 SAR 구축물의 결합 특성 또는 기능을 유의하게 변경하거나 그에 유의한 영향을 미치지 않는 아미노산 변형(예를 들어, 불변 사슬, 항체, 항체 단편, 또는 비-면역글로불린 결합 도메인 내에서 보전적 변화)를 지칭한다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 첨가 및 결실이 포함된다. 변형은 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발과 같은 당 업계에 공지된 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당 업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산이 포함된다. 따라서, 본 개시 내용의 SAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 SAR은 본원에 기재된 결합 및/또는 기능 분석을 사용하여 테스트될 수 있다.

용어 "TCR 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체의 불변 영역"은 TCRα/TCRa, TCRβ1/TCRb1, TCRβ2/TCRb2, TCRγ/TCRd, TCRδ/TCRd 및 pre-TCRα의 불변 사슬로 정의된다. 예시적인 TCR 불변 사슬은 표 12에 나열되어 있다. TCR 불변 사슬은 Ig 유사 C1 도메인(예를 들어, 서열 번호 11848-11865; 표 13), 연결 펩티드(예를 들어, 서열 번호 11867-11875; 표 14), 경막 도메인(서열 번호 11877-11880; 표 15), 및 시토졸 도메인(예를 들어, 서열 번호 11883-11885; 표 16)과 같은 여러 부분 도메인으로 나뉠 수 있다. TCRα, TCRβ1/β2, TCRγ 및 TCRδ 사슬의 시토졸 도메인은 짧고 일반적으로 신호전달 활성에서 중요한 역할을 하지 않는 것으로 여겨진다. 본 개시 내용은 또한 상보적 TCR 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체를 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 TCR 사슬의 기능적 및 생물학적 특성 중 하나 이상을 보유하는 한 표 12에 열거된 TCR 사슬의 결실 돌연변이체 및 변이체를 제공한다.

"T 세포 수용체-알파의 불변 영역" 또는 "T 세포 수용체-알파의 불변 사슬" 또는 "TCRα" 또는 "Cα"라는 용어는 서열 번호 11735 또는 11733으로 제공된 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기(즉, 상동체 또는 변이체)로 정의된다. 이 용어는 또한 상보적 TCRβ 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 TCRα의 기능적 및 생물학적 특성을 보유하는 한 TCRα의 임의의 결실 또는 점 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 SIR 및 Ab-TCR의 구축에 사용될 수 있는 TCRα 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다(표 12). 예를 들어, 증가된 발현 및 감소된 미스페어링(mispairing)을 나타내는 Cα의 돌연변이 부위는 서열 번호 11735의 위치 91, 92, 93 및 94에 위치한다. Cα의 Thr 48 Cys(T48C) 돌연변이 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬의 Ser-57-Cys(S57C) 돌연변이(본원의 다른 곳에서 더 자세히 설명됨)가 있는 TCR 폴리펩티드는 2개의 TCR 불변 사슬(α 및 β) 사이에 추가적인 이황화 결합을 초래한다. 이는 차례로 면역 세포의 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링을 줄이고 기능성을 향상시킨다. 유사하게, Cα의 Ser 61 Arg(S61R) 돌연변이 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬의 Arg 79 Gly(R79G) 돌연변이가 있는 SIR(본원의 다른 곳에서 더 자세히 설명됨)은 쌍을 이루기 위한 "놉 앤 홀(knob and hole)" 설계로 인해 내인성 TCR과의 미스페어링을 감소시키고 기능성을 향상시킨다. 본 개시 내용은 SIR 및 Ab-TCR의 구축에 사용될 수 있는 하기 표 A-8 및 표 12에 따른 돌연변이 중 하나 이상 또는 전부를 갖는 Cα 폴리펩티드를 제공한다.

[표 A-8]

인간 게놈은 2개의 고도로 상동성인 TCR 베타 불변 사슬 TCR 베타1(TCRβ1 또는 TCRb1 또는 cβ1) 및 TCR 베타 2(TCRβ2 또는 TCRb2 또는 cβ2)를 코딩한다. 본 개시 내용의 SAR(예를 들어, SIR, Ab-TCR 또는 TFP)은 이들 2개의 사슬 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 유사하게, 다른 포유동물 종의 TCR 베타1 또는 TCR 베타2 사슬이 본 개시 내용의 방법에 사용될 수 있다.

"T 세포 수용체-베타 1의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타 1의 불변 영역"(TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-베타1 또는 Cβ1)이라는 용어는 서열 번호 11746으로 제공된 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기(즉, 상동체)로 정의된다. 이 용어는 또한 상보적 TCRα 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 TCR β1의 생물학적 및 기능적 특성을 보유하는 TCR β1의 임의의 결실 또는 점 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 SAR(예를 들어, SIR 및 Ab-TCR)의 구축에 사용될 수 있는 TCRβ1 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다(표 12). 본 개시 내용은 또한 SAR의 구축에 사용될 수 있는 TCRβ1의 여러 결실 돌연변이체를 제공한다(표 12).

"T 세포 수용체-베타 2의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타 2의 불변 영역"(TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2)이라는 용어는 서열 번호 11747로 제공된 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기(즉, 상동체)로 정의된다. 이 용어는 또한 상보적 TCRα 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 TCRβ2의 생물학적 및 기능적 특성을 보유하는 TCRβ2의 임의의 결실 또는 점 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 SAR(예를 들어, SIR 및 Ab-TCR)의 구축에 사용될 수 있는 TCRβ2 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다(표 12). 본 개시 내용은 또한 SAR의 구축에 사용될 수 있는 TCRβ2의 여러 결실 돌연변이체를 제공한다(표 12).

Cβ1(서열 번호 11746) 및 Cβ2(서열 번호 11747) 둘 다에 대한 단백질 서열은 알려져 있다(표 6). Cβ2 및 Cβ1의 서열 간의 차이는 당해 분야의 일반적이고 통상적인 기술을 사용하는 서열의 정렬에 의해 용이하게 식별된다. 일반적으로, Cβ1 및 Cβ2 사슬은 고도로 상동성이다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, TCRβ, TCR-베타 또는 TCRb의 불변 사슬이라는 용어는 TCRβ1 또는 TCRβ2의 불변 사슬을 지칭한다. 마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, Cβ라는 용어는 Cβ1 또는 Cβ2에 적용된다. 본 개시 내용은 또한 SIR 및 Ab-TCR의 구축에 사용될 수 있는 TCRβ 사슬에 대한 특정 돌연변이를 제공한다. 예를 들어, 증가된 발현 및 내인성 TCRα 사슬과의 감소된 미스페어링을 나타내는 Cβ의 돌연변이 부위가 본원에 제공된다. Cβ1 및 Cβ2의 이러한 돌연변이 부위는 서열 번호 11746 및 11747의 위치 18, 22, 57, 79, 133, 136 및 139에 위치하고 있으며 아래 표 A-9 및 A10에 요약되어 있다. Cβ1과 Cβ2의 돌연변이 부위는 위치가 동일하다. 두 서열의 유일한 차이는 위치 136에서의 돌연변이다. 이 위치에서, Cβ2에는 글루탐산(E)이 존재하는 반면 Cβ1에는 발린이 존재한다.

[표 A-9]

[표 A-10]

"TCR-감마의 불변 사슬" 또는 "TCR-감마의 불변 영역"(TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 TCR-감마1 또는 TCRγ1 또는 TCRg1 또는 Cγ)이라는 용어는 서열 번호 11741로 제공된 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기(즉, 상동체)로 정의된다. 이 용어는 또한 상보적 TCR(예를 들어, TCRδ) 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 TCRγ의 생물학적 및 기능적 특성을 보유하는 TCRγ의 임의의 결실 또는 점 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 SAR(예를 들어, SIR 및 Ab-TCR)의 구축에 사용될 수 있는 TCRγ 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다(표 12). 본 개시 내용은 또한 SAR의 구축에 사용될 수 있는 TCRγ의 여러 결실 돌연변이체를 제공한다(표 12).

"TCR-델타의 불변 사슬" 또는 "TCR-델타의 불변 영역"(TCR-델타 또는 TCRδ 또는 Cδ)이라는 용어는 서열 번호 5982로 제공된 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기(즉, 상동체)로 정의된다. 이 용어는 또한 상보적 TCR(예를 들어, TCRγ) 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 TCRδ의 생물학적 및 기능적 특성을 보유하는 TCRδ의 임의의 결실 또는 점 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 SAR(예를 들어, SIR 및 Ab-TCR)의 구축에 사용될 수 있는 TCRδ 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다(표 12). 본 개시 내용은 또한 SAR의 구축에 사용될 수 있는 TCRδ의 여러 결실 돌연변이체를 제공한다(표 12).

"pre-TCRα의 불변 사슬" 또는 "preTCRα의 불변 영역"(preTCRα 또는 pre-TCRα 또는 preCδ)이라는 용어는 서열 번호 11769로 제공된 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기(즉, 상동체)로 정의된다. 이 용어는 또한 상보적 TCR(예를 들어, TCRβ) 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 표적 항원 발현 세포에 의해 인게이징될 때 T 세포 신호를 전달하는(예를 들어, NFAT 경로를 활성화하는) 능력과 같은 preTCRα의 생물학적 및 기능적 특성을 보유하는 preTCRα의 임의의 결실 또는 점 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 SAR(예를 들어, SIR 및 Ab-TCR)의 구축에 사용될 수 있는 preTCRα 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다(표 12). 본 개시 내용은 또한 SAR의 구축에 사용될 수 있는 preTCRα의 여러 결실 돌연변이체를 제공한다(표 12).

단백질은 서로 동일성 또는 상동성을 가질 수 있고 유사하거나 동일한 기능을 보유할 수 있음이 인식될 것이다. 본 개시 내용은 생물학적 활성을 유지하면서 본원에 기재된 임의의 서열에 대해 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 TCR 불변 영역을 포함한다.

따라서, 본 개시 내용은 (a) 서열 번호 11733-11742, 11744, 11745, 11793-11803 중 임의의 것과 적어도 70% 동일하고 선택적으로 위치 61, 91, 92, 93, 94, 120, 127 및/또는 129에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있는 아미노산 서열; (b) 서열 번호 11746-11766, 11804-11817 중 임의의 것과 적어도 75% 동일하고 선택적으로 위치 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있는 아미노산 서열; c) 서열 번호 11818-11823 중 임의의 것과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열; (d) 서열 번호 11824-11830 중 임의의 것과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열; 및 (e) 서열 번호 11769-11770 중 임의의 것과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 T 세포 수용체 불변 사슬을 갖는 SAR(예를 들어, SIR, cTCR, zSIR, Ab-TCR, TFP 등)을 제공하고 (a)-(d) 중 임의의 것의 T 세포 수용체 불변 사슬은 동일성 또는 상동성을 갖는 야생형 T 세포 수용체 불변 사슬의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 야생형 TCR, 고친화성 TCR, 및 키메라 TCR로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 TCR을 제공한다. 또 다른 실시 양태에서, 변형된 TCR은 적어도 하나의 추가 이황화 결합을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 변형된 TCR은 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬을 포함한다.

"구성적으로 활성인"이라는 용어는 자극의 필요 없이 신호전달 활성을 갖는 분자, 예를 들어 단백질을 지칭한다. 예시적인 구성적 활성 단백질은 NEMO-K277A 및 vFLIP K13인데, 이는 추가 자극의 필요 없이 적합한 세포에서 발현될 때 NF-κB 신호전달을 활성화할 수 있기 때문이다.

"공동자극 분자" 또는 "공동자극 수용체"라는 용어는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 세포외 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자에는 MHC I형 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD28, 2B4 및 4-1BB(CD137)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 공동자극 수용체는 NK 세포 또는 대식세포와 같은 T 세포 이외의 세포에서 발현될 수 있다.

"공동자극 세포내 신호전달 도메인" 또는 "공동자극 도메인"(CSD)은 공동자극 수용체의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 다음 단백질 패밀리로 대표될 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, 2B4, CD40, ICOS 등을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.

용어 "cTCR"은 TCR로부터 유래되지 않은 항원 결합 도메인에 연결된 야생형 TCR 핵산 코딩 서열 및 상응하는 야생형 TCR 단백질을 지칭한다. cTCR의 TCR 사슬은 코돈 최적화되지 않으며 발현을 향상시키거나 내인성 TCR 사슬과의 짝짓기를 감소시킬 수 있는 돌연변이가 없다. 예시적인 실시 양태에서, cTCR의 항원 결합 도메인은 vL, vH 또는 scFv 단편을 포함할 수 있다. cTCR은 문헌(Gross, Waks & Eshhar, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989)에 설명되었다. cTCR은 일부 실시 양태에서 참조 대조군으로서 사용된다. 예를 들어, CD19 결합 도메인을 갖는 cTCR 및 CD19-SIR(돌연변이 TCR 사슬 또는 코돈 최적화된 TCR 사슬 및 CD19 결합 도메인 포함)은 표적 항원에 대해 상이한 발현 및/또는 상이한 결합 친화도를 가질 것이다. 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD를 포함하는 cTCR의 백본을 갖는 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR을 제공한다. cTCR의 백본을 갖는 본 개시 내용의 SAR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 cTCR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 cTCR을 제공한다.

용어 "시토졸" 또는 "세포질"은 성숙한 형태로 세포의 세포질에 위치하는 작용제, 예를 들어 단백질을 지칭한다. 시토졸 단백질은 핵으로 이동할 수 있지만 경막 단백질이 아니며 세포외부로 분비되지 않는다. 예시적인 시토졸 단백질은 MC159 및 K13이다.

사이토카인 방출 증후군(CRS)은 열, 저혈압, 숨가쁨, 신장 기능 장애, 폐 기능 장애 및/또는 모세관 누출 증후군과 같은 징후 및 증상의 집합으로 나타나는 세포 요법의 합병증이다.

DARPIN 또는 DARPin(Designed ankyrin repeat protein: 설계된 안키린 반복 단백질)은 일반적으로 고도로 특이적이고 높은 친화성의 표적 단백질 결합을 나타내는 유전적으로 조작된 항체 모방 단백질이다. 예시적인 DARPIN이 표 7에 제시되어 있다.

"퇴행성 장애"라는 용어는 퇴행성 세포 변화를 기반으로 한 지속적인 과정의 결과로 조직이나 기관에 영향을 미치며 정상적인 신체 마모 또는 운동이나 섭식 습관과 같은 생활 방식 선택으로 인해서든 아니든 시간이 지남에 따라 점점 악화되는 질환을 말한다. 예시적인 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 진성 당뇨병(II형) 및 죽상동맥경화증을 포함한다.

"~로부터 유래된"은 해당 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 말하며 제2 분자로부터 유래된 제1 분자에 대한 공정 또는 공급원 제한을 암시하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, 항체 분자로부터 유래된 항원 결합 도메인의 경우, 항원 결합 도메인은 필요한 기능, 즉 항원에 결합하는 능력을 갖도록 충분한 항체 구조를 유지한다. 이는 항체를 생산하는 구체적인 공정에 대한 제한을 암시하거나 포함하지 않으며, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 제공하기 위해, 항체 서열로 시작하여 원치 않는 서열을 결실시키거나, 돌연변이를 부여하여, 항원 결합 도메인에 도달해야 한다는 것을 의미하지 않는다.

"이량체화 분자"는 해당 용어가 본원에 사용되는 바와 같이 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 결합을 촉진하는 분자를 지칭한다.

"표적 항원의 발현과 관련된 질환" 또는 "본원에 기재된 바와 같은 질환 관련 항원"이라는 문구는 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원의 발현과 관련된 질환 또는 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 관련된 병태를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 예를 들어 암 또는 악성종양과 같은 증식성 질환 또는 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 골수증식성 장애 또는 전백혈병과 같은 전암성 병태, 또는 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 관련된 비암 관련 적응증을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 고형암이다. 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 추가 질환은 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 적응증은 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 표적 항원 발현 세포는 표적 항원을 코딩하는 mRNA를 발현하거나, 또는 임의의 시점에 발현하였다. 또 다른 실시 양태에서, 표적 항원 발현 세포는 표적 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 표적 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 표적 항원 발현 세포는 한 지점에서 표적 항원 단백질의 검출 가능한 수준을 생성하였고, 후속적으로 검출 가능한 표적 항원 단백질을 실질적으로 생성하지 않았다.

본원에 사용되는 바와 같이 "유전적으로 변형된 세포에 의해 표적화되는 질환"은 치료적으로 유익한 결과를 유발하기 위해서 유전적으로 변형된 세포가 질환 세포를 표적화하거나 건강한 세포를 표적화하는 것과 상관없이, 본 개시 내용의 유전적으로 변형된 세포에 의해 임의의 질환에서 임의의 방식으로 관련된 임의의 세포를 표적화하는 것을 포함한다. 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 T 세포, NK 세포, 조혈 줄기세포, 만능 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPSC) 또는 배아 줄기세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유전적으로 변형된 세포는 SAR이 표적 세포의 표면상에 발현된 임의의 항원을 표적화할 수 있는 본 개시 내용의 보조 모듈과 함께 종래의 SAR 및 종래의 SAR을 함유하는 신규 백본을 발현한다. 표적화될 수 있는 항원의 예는 B 세포 상에서 발현되는 항원; 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양 및 모세포종 상에서 발현되는 항원; 다양한 면역 세포 상에서 발현되는 항원; 및 다양한 혈액 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증 질환과 관련된 세포 상에서 발현되는 항원을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 표적화될 수 있는 다른 항원은 당 업자에게 명백할 것이고, 그의 대안적 실시 양태와 관련하여 본 개시 내용의 SAR에 의해 표적화될 수 있다.

"해리 상수(Kd)"라는 용어는 수용체-리간드(예를 들어, 결합 도메인-동족체) 상호작용의 해리의 평형 상수로 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "다양한 세트의 비-자연 발생 면역 수용체" 또는 "다양한 세트의 SAR" 또는 "다양한 세트의 SAR"은 다양한 세트의 신호전달 사슬 또는 "백본"에 연결된 동일하거나 상이한 결합 도메인을 갖는 복수의 비-자연 발생 면역 수용체를 지칭하며, 여기서 결합 도메인 및 다양한 신호전달 사슬 또는 "백본"을 포함하는 각각의 구축물은 표적 항원 및/또는 다양한 발현 수준에 대한 다양한 범위의 결합을 제공한다. 예를 들어, 불변 도메인의 돌연변이 구성(예를 들어, 돌연변이 TCRa+TCRb)에 따라 표적에 대한 결합 도메인의 결합 친화도가 다르다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SIR, Ab-TCR 또는 TFP의 백본을 갖는 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR은 2세대 CAR보다 낮지만 동일한 결합 도메인을 가진 야생형 TCR(예를 들어, cTCR)보다 큰 결합 친화도를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 면역 반응을 유발할 수 있는 항원의 부분, 또는 항체 또는 항체 단편에 결합하는 항원의 부분으로 정의된다. 에피토프는 단백질 서열 또는 부분 서열일 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드이거나 리포솜에 함유됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하여 당 업계에 공지된 모든 것을 포함한다.

당 업계에서 사용되는 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 일부 실시 양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다.

SAR과 관련하여 사용될 때 "기능적 부분"이라는 용어는 SAR의 임의의 부분 또는 단편으로, 그 부분 또는 단편이 그가 일부가 되는 SAR(모 SAR)의 생물학적 활성을 보유하는 것을 지칭한다. 기능적 부분은 예를 들어, 모 SAR과 유사한 정도로, 동일한 정도로 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하거나 질환을 감지, 치료 또는 예방하는 능력을 보유하는 SAR의 부분을 포함한다. 모 SAR과 관련하여, 기능적 부분은 예를 들어, 모 SAR의 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "유전적으로 변형된 세포", "재지시된 세포", "유전적으로 조작된 세포" 또는 "변형된 세포"는 본 개시 내용의 SAR을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 SAR을 코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 SAR 및 하나 이상의 보조 분자(예를 들어, PDL1, PDL2, crmA, MC159 등)를 코딩하는 벡터를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이 "힌지 영역"(HR)은 SAR의 항원 결합 도메인과 경막 도메인 사이에 있는 친수성 영역을 지칭한다. 힌지 영역은 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 Fc 단편, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 힌지 영역의 예는 예를 들어 IgG(예컨대 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인 또는 Gly3만큼 작을 수 있는 폴리펩티드로 만들어진 인공 스페이서, 및 CD8a 힌지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 HR은 표 17(서열 번호 1198-1204)에 제공되어 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "면역 세포"는 항원 제시 세포, B 세포, 호염기구, 세포독성 T 세포, 수지상 세포, 호산구, 과립구, 헬퍼 T 세포, 백혈구, 림프구, 대식세포, 비만 세포, 기억 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 호중구, 식세포, 형질 세포 및 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 면역계의 세포를 지칭한다.

"면역 장애"라는 용어는 면역계의 기능 장애를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 자가면역 질환은 정상적인 신체 부위에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 병태이다. 80가지 이상의 자가 면역 질환이 존재한다.

"면역 이펙터 세포"는 해당 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 면역 반응에, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수 유래 식세포를 포함한다.

"면역 이펙터 기능" 또는 "면역 이펙터 반응", "이펙터 기능"은 분화된 세포의 특수 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성 또는 세포용해 활성일 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공동자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다. 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포)의 경우 항원 제시 및 사이토카인 분비가 이펙터 기능의 예이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "면역 반응"은 선천성 면역, 체액성 면역, 세포성 면역, 면역, 염증 반응, 후천적(적응) 면역, 자가면역 및/또는 과민성 면역을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역을 지칭한다.

"세포내 신호전달 도메인"(ISD) 또는 "세포질 도메인" 또는 "1차 세포내 신호전달 도메인" 또는 "활성화 도메인"은 용어가 본원에 사용되는 바와 같이 분자의 세포내 신호전달 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 면역 이펙터 기능의 예로는 사이토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성 및 세포용해 활성이 있다. 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 공통 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다. 한 측면에서, 용어 "단리된"은 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관, 각각으로부터 분리된 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 이의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관을 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없는 핵산 또는 펩티드, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 없는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생적이지 않고 자연 상태에서 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 배양된 및 조작된 세포 또는 조직 둘 다를 포함하는 것을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"(또한 "링커 도메인" 또는 "링커 영역")는 각각 본원에 개시된 SAR 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 2개 이상의 도메인 또는 영역을 함께 연결하는 올리고 또는 폴리펩티드(또는 폴리펩티드를 코딩하는 올리고)를 지칭한다. 링커는 1 내지 500 개 아미노산 길이 또는 3 내지 1500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 한 실시 양태에서, 링커는 1개 이상의 아미노산 (예를 들어,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500개 및 그 사이의 임의의 개수) 길이이다. 한 실시 양태에서, 링커는 1 내지 100, 1 내지 125, 1 내지 150, 1 내지 200, 1 내지 250, 1 내지 300, 1 내지 350, 1 내지 400, 1 내지 450, 3 내지 500개 사이의 아미노산 길이이다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 링커(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)를 포함할 수 있다.

"긴 링커" 또는 "긴 링커 도메인"은 25 내지 500 개 아미노산 길이인 링커이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500 개 아미노산 및 그 사이의 임의의 개수 길이이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 25 내지 125 개 아미노산 길이이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 50 내지 150 개 아미노산 길이이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 75 내지 175 개 아미노산 길이이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 100 내지 200 개 아미노산 길이이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 120 내지 220 개 아미노산 길이이다. 한 실시 양태에서, 긴 링커는 100 내지 300 개 아미노산 길이이다.

한 실시 양태에서, 링커는 면역글로불린(Ig) 도메인 또는 Ig 유사 도메인 또는 이의 단편을 코딩하거나 이를 포함한다. 용어 "Ig 도메인", "Ig 링커 도메인", "Ig 유사 도메인" 또는 "Ig 유사 링커 도메인"은 본 개시 내용에서 상호교환적으로 사용된다. 면역글로불린 도메인은 약 125개의 아미노산으로 이루어진 그리스 열쇠 토폴로지를 갖는 2개의 β-시트에 배열된 7-9개의 역평행 β-가닥의 2층 샌드위치로 이루어진 단백질 도메인 유형이다. Ig 도메인은 IgV, IgC1, IgC2, 또는 IgI로 분류될 수 있다. 9개의 베타 가닥이 있는 IgV 도메인은 일반적으로 7개의 베타 가닥이 있는 IgC 도메인보다 더 길다. 한 실시 양태에서, 링커는 IgV 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 링커는 IgC 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. Ig 도메인은 면역글로불린, T 세포 수용체 사슬, MHC I형, MHC II형, β2 마이크로글로불린, 공동수용체(예를 들어, CD4, CD8, CD19 등), 항원 수용체 보조 분자(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD79a, CD79b), 공동자극 억제 분자(예를 들어, CD28, CD80, CD86), NK 세포 수용체(예를 들어, KIR), 백혈구 면역글로불린 유사 수용체(LILR), IgSF CAM(예를 들어, NCAM, ICAM, CD2 등), 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-1R, CSF-1R 등), 성장 인자 수용체(예를 들어, PDGFR), 수용체 티로신 키나아제 및 포스파타제, Ig 결합 수용체, 세포 골격 단백질(예를 들어, 티틴, 팔라딘 등) 및 기타 단백질(예를 들어, CD147, CD90 등)에서 발견된다. 예시적인 Ig 링커 도메인은 IgCL(서열 번호 1142) 및 IgG1-CH1(서열 번호 1143)이다. 추가의 예시적인 Ig 링커는 표 13(서열 번호(PRT) 11832-11865)에 제시되어 있다. 한 실시 양태에서, 링커는 E 세트 도메인을 보유한다. E 세트 도메인은 면역글로불린 및/또는 피브로넥틴 III형 슈퍼패밀리와 관련이 있을 수 있는 "초기" Ig 유사 폴드 패밀리이다. 한 실시 양태에서, 링커는 피브로넥틴 III형 도메인을 보유한다.

링커는 가요성 링커일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "가요성 폴리펩티드 링커"는 폴리펩티드 사슬을 함께(예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께) 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어지거나 대부분 이루어지는 펩티드 링커를 지칭한다. 한 실시 양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n(예를 들어, 서열 번호 11715)을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10. 한 실시 양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly₄Ser)₄ 또는 (Gly₄Ser)₃을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시 양태에서 "링커"는 절단성 또는 비절단성이다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "링커"는 비절단성 링커를 의미한다. 상기 비절단성 링커는 서로에 대해 인접한 단백질 도메인의 자유로운 움직임을 허용하는 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 이러한 잔기의 비제한적 예는 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 비가요성 잔기를 포함한다. 절단성 링커의 예는 2A 링커(예를 들어, T2A), 2A 유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 피코르나바이러스 2A 유사 링커, 돼지 테스코바이러스(P2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(T2A)의 CHYSEL 서열들, 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 등가물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커 서열은 2A 글리신과 2B 프롤린 사이의 절단을 초래하는 모티프를 포함할 수 있다(예를 들어, T2A 서열 참조). 몇 가지 예시적인 절단성 링커의 핵산 서열은 서열 번호 1233 내지 서열 번호 1238에 제공되어 있고 몇 가지 예시적인 링커의 아미노산 서열은 서열 번호 11923 내지 서열 번호 11928에 제공되어 있다. 본원에서 사용될 수 있는 기타 절단성 링커는 당업자에 의해 용이하게 인식된다.

한 실시 양태에서, Ser-Gly-Ser-Gly(SGSG) 모티프(서열 번호 11929)는 또한 절단 효율을 향상시키기 위해 절단성 링커 서열의 상류에 첨가된다. 절단성 링커의 잠재적인 결점은 N-말단 단백질의 끝에 남겨진 작은 2A 태그가 단백질 기능에 영향을 미치거나 단백질의 항원성에 기여할 수 있다는 가능성이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 일부 실시 양태에서, 퓨린 절단 부위(RAKR)(서열 번호 11931)가 SGSG 모티프의 상류에 첨가되어 번역 후 잔류 2A 펩티드의 절단을 촉진한다.

링커는 프로테아제 절단성 링커일 수 있다. 예시적인 프로테아제 절단성 링커가 표 19에 제시되어 있다.

"렌티바이러스"라는 용어는 레트로비리데(Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 고유하다. 이들은 숙주 세포의 DNA에 상당한 양의 유전 정보를 전달할 수 있으므로 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티 바이러스의 예이다.

용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공되는 바와 같은 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 클리닉에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 예를 들어 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용 가능하고 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 pLENTI-EF1α(서열 번호 1), pLENTI-EF1α-DWPRE(서열 번호 2), pCCLc-MNDU3-WPRE(서열 번호 4) 및 pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE(서열 번호 5)이다. 예시적인 실시 양태에서, SAR, 또는 SAR + 보조 모듈(들), 또는 보조 모듈(들)을 코딩하는 핵산 단편은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 pLENTI-EF1α 및 pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE 벡터에 존재하는 Nhe I 및 Sal I 부위 사이에 클로닝될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이 "포유류"는 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 애완 포유동물; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물 등을 제한 없이 포함하는 마말리아(Mammalia) 강(class)의 임의의 일원을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이 "천연" 또는 "자연 발생" 또는 "내인성"은 세포에 천연이거나 세포에서 자연적으로 발현되는 유전자, 단백질, 핵산(예를 들어, DNA, RNA 등) 또는 이의 단편을 지칭한다. 따라서, T 세포의 천연 또는 내인성 TCRα 사슬 폴리펩티드는 TCRα 불변 사슬에 연결된 가변 도메인(Vα)으로 이루어진다. 천연 또는 내인성 TCRα 사슬 전구체 폴리펩티드는 또한 성숙한 폴리펩티드로부터 절단되는 아미노-말단 신호 펩티드로 이루어진다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "NIK 아고니스트"는 NF-κB 유도 키나아제의 활성을 활성화하는 작용제를 지칭한다. 한 실시 양태에서, NIK 아고니스트는 SMAC 모방체이다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "SMAC 모방체"는 SMAC/DIABLO 단백질의 활성을 모방하는 작용제를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "N-말단 근처"는 N-말단 30 개 아미노산 이내를 의미한다. 예를 들어, "vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD"라는 용어는 vL 또는 vH 단편의 N-말단에서 작동 가능하게 연결되거나 vL 또는 vH 도메인을 포함하는 N-말단 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25 또는 30개의 아미노산에 작동 가능하게 연결된 AABD를 의미한다. 유사하게, 용어 "Va 및/또는 Vb 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD"는 Va 또는 Vb 단편의 N-말단에서 작동 가능하게 연결되거나 Va 또는 Vb 도메인을 포함하는 N-말단 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 30개의 아미노산에 작동 가능하게 연결된 AABD를 의미한다. 본 개시 내용의 AABD는 직접적으로 또는 개재 링커 서열을 통해 또 다른 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "비-자연 발생 작용제" 또는 "비-천연" 또는 "외인성"은 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 작용제를 지칭한다. 달리 말하면, 비-자연 발생 작용제는 세포에서 발현되도록 "조작"된다. 비-자연 발생 작용제는 자연 발생 작용제의 클로닝된 버전일 수 있다. 예시적인 비-자연 발생 작용제는 SAR(예를 들어, CAR, SIR, Ab-TCR, TFP, 재조합 TCR, NEMO-K277A, vFLIP-K13 및 K13-opt)을 포함한다. 비-자연 발생 작용제는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 매개 유전자 전달과 같은 당 업계에 공지된 유전자 전달 기술을 사용하여 세포내로 발현될 수 있다. 비-자연 발생 작용제는 외인성 프로모터(예를 들어, EF1α 프로모터) 또는 내인성 프로모터(예를 들어, TCRα 프로모터)를 사용하여 면역 세포에서 발현될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "비-자연 발생 면역 수용체" 또는 "외인성 면역 수용체"는 면역 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 면역 수용체를 지칭한다. 달리 말하면, 비-자연 발생 면역 수용체는 면역 세포에서 발현되도록 "조작"된다. 비-자연 발생 면역 수용체는 자연 발생 면역 수용체의 클로닝된 버전일 수 있다. 대안적으로, 비-자연 발생 면역 수용체는 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 생성된 키메라 수용체일 수 있다. 예시적인 비-자연 발생 면역 수용체는 SAR, SIR, Ab-TCR, TFP 및 재조합 TCR을 포함한다. 비-자연 발생 면역 수용체는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 매개 유전자 전달과 같은 당 업계에 공지된 유전자 전달 기술을 사용하여 면역 세포에 도입될 수 있다. 비-자연 발생 면역 수용체는 외인성 프로모터(예를 들어, EF1α 프로모터) 또는 내인성 프로모터(예를 들어, TCRα 프로모터)를 사용하여 면역 세포에서 발현될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "비-scFv 항원 결합 도메인" 또는 "비-scFv 기반 항원 결합 도메인"은 단일 사슬 가변 단편(즉, vL-링커-vH 또는 vH-링커-vL)으로 구성되지 않은 항원 결합 도메인을 지칭한다. 예시적인 비-scFv 기반 항원 결합 도메인은 vHH, FHVH, SVL, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드(예를 들어, DARPIN, 센티린, 아피바디 등), 수용체의 리간드 결합 도메인, 리간드의 수용체 결합 도메인, 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인, NKG2D-YA, NKG2D-AF, CD16A-V158, CD32 또는 CD64 등) 및 자가-항원을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. AABD는 비-scFv 기반 항원 결합 도메인이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "비-자연 발생 TCR 항원 결합 도메인" 또는 "외인성 TCR 항원 결합 도메인"은 자연에 존재하는 TCR과 관련하여 키메라이고 비-자연 발생인 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 결합 도메인을 지칭한다. 달리 말하면, 비-자연 발생 TCR 항원 결합 도메인은 TCR에 작동 가능하게 연결되도록 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 "조작"되며, 더욱이 자연에서 발견되는 TCR과 구별되는 분자로부터 얻거나 유래된다. 자연에서 TCR과 구별되는 항원 결합 도메인은 항체 vH 및 vL 단편, 인간화 항체 단편, 키메라 항체 단편, 수용체 리간드 등을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "NKT 세포"는 αβ T-세포 수용체를 공동발현하지만 NK1.1과 같은 NK 세포와 일반적으로 관련된 다양한 분자 마커도 발현하는 T 세포의 하위 집합을 지칭한다. 가장 잘 알려진 NKT 세포는 그의 T 세포 수용체가 다양성에 있어 훨씬 더 제한적이라는 점에서 통상적인 αβ T 세포와 다르다('불변' 또는 '유형 1' NKT). 이들 및 다른 CD1d-제한 T 세포('유형 2' NKT)는 펩티드-주요 조직 적합성 복합체(MHC)보다는 항원 제시 분자의 CD1 패밀리의 구성원인 CD1d 분자가 제시하는 지질 및 당지질을 인식한다.

"작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 결합된" 또는 "작동 가능하게 부착된"이라는 용어는 각 성분이 기능적일 수 있도록 제1 성분과 제2 성분 사이의 기능적 연결 또는 결합을 지칭한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 것은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 결합을 포함하여 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 분자의 두 개의 상이한 모듈의 맥락에서, 제1 모듈은 뉴클레오티드 서열이 프레임 내에서 연결될 때 제2 모듈에 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 2개의 폴리펩티드의 맥락에서, 제1 폴리펩티드는 임의의 연결과 독립적인 방식으로 기능을 하고, 제2 폴리펩티드는 둘 사이의 연결이 부재할 때 기능을 한다. "작동 가능하게 연결된" 또는 "작동 가능하게 부착된"이라는 용어는 "연결된", "부착된" 또는 "결합된"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 "퍼센트 동일성"은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 비교 창, 또는 지정된 영역에 대해 최대 일치를 위해 비교 및 정렬될 때 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 지정된 백분율(지정된 영역에 대해, 또는 지정되지 않을 경우 전체 서열에 대해 예를 들어, 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성)을 갖는 경우 2개의 서열은 "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드(또는 10 개 아미노산) 길이, 또는 보다 일반적으로 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산) 길이인 영역에 대해 존재한다.

서열 비교의 경우, 일반적으로 하나의 서열이 테스트 서열이 비교되는 참조 서열 역할을 한다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 알고리즘의 두 가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-410]에 설명되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 제공된다.

용어 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터의 예는 Addgene 또는 Clontech에서 입수 가능한 MSCVneo, MSCV-pac(또는 MSCV-puro), MSCV-hygro를 포함한다.

"슬리핑 뷰티 트랜스포존" 또는 "슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터"라는 용어는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다.

용어 "단일 사슬 가변 영역" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고 단일 사슬 폴리펩티드로 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그가 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이 scFv는 vL 및 vH 가변 영역을 어느 순서로든 가질 수 있으며, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 끝과 관련하여 scFv는 vL-링커-vH를 포함할 수 있거나 vH-링커-vL을 포함할 수 있다. 본 개시 내용에서, scFv는 또한 vL-Gly-Ser-링커-vH로 기재된다. 대안적으로, scFv는 또한 (vL+vH) 또는 (vH+vL)로 기재된다.

"신호전달 도메인"이라는 용어는 2차 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능을 함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포내 정보를 전달하는 단백질의 기능적 영역을 의미한다.

용어 "합성 항원 수용체" 또는 "SAR"은 이펙터 세포에서 발현될 때 표적 세포, 전형적으로 암세포에 대한 특이성을 세포에 제공하는 비천연 폴리펩티드를 지칭한다. SAR은 항원 특이성을 세포(예컨대, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구/대식세포, B 림프구 또는 이들의 조합) 상에 이식하여 항원 결합 도메인의 항원 결합 특성을 세포의 이펙터 기능과 결합하는 조작된 수용체이다. T 및 NK 세포에 대한 예시적인 이펙터 기능은 표적-세포 용해, 사이토카인 생산 및 자가 재생을 포함할 수 있다. 단핵구/대식세포의 경우, 이펙터 기능에는 표적 세포의 식균 작용이 포함될 수 있다. 용어가 본원에 정의된 바와 같이 SAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, 및 차세대 CAR, 예컨대 합성 면역 수용체(SIR), cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP(예를 들어, TFPε, TFPγ, TFPδ), TAC, 재조합 TCR 등을 포함한다. SAR은 단일 사슬, 이중 사슬 또는 1.5 사슬일 수 있다. SAR은 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다. SAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. SAR은 CAR(예를 들어, 2세대 CAR), SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP, TAC 또는 TCR의 백본을 가질 수 있다. 본원에 언급되는 바와 같이 SAR은 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 포함한다. 그러나 SAR이라는 용어는 T 세포 수용체 또는 면역 수용체에 제한되지 않는다. SAR은 자체 신호전달 도메인이 있을 수도 없을 수도 있다. 자체의 신호전달 도메인이 결여된 예시적인 SAR은 신호전달 도메인을 보유하는 다른 신호전달 단백질의 동원을 통해 신호를 전송하는 SIR 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR이다. SAR은 임의의 비천연 항원 결합 수용체(ABR)일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "항원 결합 도메인 또는 "항원 특이적 표적화 도메인"은 특정 항원을 표적화하고 이에 결합하는 SAR의 영역을 지칭한다. SAR의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편(예를 들어, vL, vH, Fv, Fab, scFv, vHH, 단일 도메인 항체 등), T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR의 단편(예를 들어, Va, Vb, Vg, Vd 또는 단일 가변 도메인 TCR 등)을 포함할 수 있다. SAR의 항원 결합 도메인(들)은 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인(AABD) 예컨대 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드(예를 들어, DARPIN, 센티린, 아피바디, D 도메인 등), 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 자가항원, 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-AF 등), 수용체의 Fc 결합 도메인(예를 들어, CD16A-V158, CD32, CD64 등의 Fc 결합 영역), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. SAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. SAR의 상이한 모듈 및 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 연결될 수 있다. SAR은 또한 SAR의 발현을 검출하고, SAR 발현 세포를 단리 및 정제하고, SAR 발현 세포의 지속성을 모니터링하고, SAR 발현 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 에피토프 태그 또는 미모토프를 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, 에피토프 및/또는 미모토프는 독성의 경우 SAR 발현 세포를 감소시키거나 제거하기 위한 "자살 스위치"로서 작용하는 항체, 항체 단편, 항체 유도체(예를 들어, 항체 약물 접합체)에 의해 표적화된다. SAR이 숙주 세포에서 발현될 때, 이 도메인은 세포외 도메인(엑토도메인)을 형성한다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 SVH 도메인은 단일 인간 V_H 도메인 항체(V_H sdAb)를 지칭한다. 따라서 이러한 용어는 상호 교환적으로 사용된다. SVH라는 용어는 또한 독립적인 vH 도메인과 상호교환적으로 사용된다. SVH는 자율 항원 결합 도메인(AABD)의 예이다. 예시적인 SVH는 서열 번호(DNA) 827-828 및 서열 번호(PRT) 11517-11518에 제시된 완전 인간 vH 도메인(FHVH)이다. 또 다른 예시적인 SVH는 서열 번호(DNA) 830-831 및 서열 번호(PRT) 11520-11521에 제시된 chVH 도메인이다. 또 다른 예시적인 SVH는 서열 번호(DNA) 850-851 및 서열 번호(PRT) 11540-11541에 제시된 aVH 도메인이다. 다른 예시적인 SVH 도메인의 서열 번호가 표 5에 제시되어 있다. 본 개시 내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 SVH 도메인은 WO2016062988, WO2016113556, WO2017191476, WO2018039180, WO2019006072, WO2018237037, WO2018119215, WO2019126756, WO2019055689 및 WO2020018922에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 SVL 도메인은 단일 인간 vL 도메인 항체(vL sdAb)를 지칭한다. 따라서 이러한 용어는 상호교환적으로 사용된다. SVL이라는 용어는 또한 독립적인 vL 도메인과 상호교환적으로 사용된다. SVL은 자율 항원 결합 도메인(AABD)의 예이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "단일 가변 도메인 T 세포 수용체" 또는 "svd-TCR"은 제2 TCR 가변 도메인의 부재 하에 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 수용체의 가변 도메인을 지칭한다. 예를 들어, Vb 가변 도메인을 포함하는 svd-TCR은 Va 가변 도메인과 독립적으로 및/또는 그의 부재하에 에피토프에 결합할 수 있고, Va 가변 도메인을 포함하는 svd-TCR은 nb 가변 도메인과 독립적으로 및/또는 그의 부재하에 에피토프에 결합할 수 있다. svd-TCR에 의해 인식되는 예시적인 에피토프에는 펩티드:MHC 복합체(pMHC 복합체)가 포함된다.

용어 "합성 면역 수용체" 또는 대안적으로 "SIR"은 이펙터 세포에서 발현될 때 표적 세포, 전형적으로 암세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 폴리펩티드 세트, 일부 실시 양태에서 전형적으로 2개의 폴리펩티드 세트를 지칭한다. SIR은 본원에 참고로 포함되는 WO 2018/102795 A1에 기술된 차세대 CAR 플랫폼을 대표한다. 전형적인 실시 양태에서, SIR은 본원에 기재된 바와 같은 항원에 결합하고 선택적 링커를 통해 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 영역에 결합된 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리펩티드 세트는 서로 인접한다. 일부 실시 양태에서, SIR은 2개 이상의 폴리펩티드의 2개 이상의 세트를 포함한다. 각 세트의 SIR의 폴리펩티드(기능적 폴리펩티드 단위 1)는 서로 인접하지만 다른 세트의 폴리펩티드(기능적 폴리펩티드 단위 2)와 인접하지 않는다. 일부 실시 양태에서, SIR의 T 세포 수용체 불변 사슬(또는 영역)은 인간 T 세포 수용체-알파(TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCR-알파 또는 hTCRα 또는 hTCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1(TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-베타1 또는 hTCRβ1 또는 hTCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2(TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 hTCR-베타2 또는 hTCRβ2 또는 hTCRb2 또는 Cβ2, TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ로도 지칭됨), 인간 Pre-T 세포 수용체 알파((preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마(TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 hTCR-감마 또는 hTCRγ 또는 hTCRg 또는 hTCRγ1 또는 hTCR감마1, 또는 Cγ), 또는 인간 T 세포 수용체-델타(TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 hTCR-델타 또는 hTCRd 또는 hTCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 그의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 반면, 다른 측면에서 SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형이 아닌 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 코돈 최적화된 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시 양태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형 폴리펩티드 서열을 코딩하는 반면, 다른 실시 양태에서 SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 폴리펩티드를 코딩하였다. 일부 실시 양태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 그의 코돈 최적화된 서열에 의해 코딩된다. 본 개시 내용은 또한 상응하는 전장 TCR 사슬의 생물학적 및 기능적 특성 중 적어도 하나를 유지하는 TCR 불변 사슬의 결실 돌연변이체를 포함한다. 본원에 기재된 것과 같은 특정 종양 생성자 "X"를 표적화하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv 또는 vHH)을 포함하는 SIR은 또한 X-SIR 또는 XSIR로 지칭된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR은 CD19-SIR 또는 CD19SIR로 지칭된다. SIR의 TCR 불변 사슬/도메인은 SIR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬이 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래하거나 인간 TCR 불변 사슬로 구성되는 것이 유리할 수 있다. 그러나 일부 경우에는 TCR 불변 사슬이 SIR이 궁극적으로 사용되는 동일한 종으로부터 유래하지만 TCR 불변 사슬의 발현을 향상시키는 아미노산 치환을 보유하도록 변형되는 것이 유리하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬이 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래하거나 인간 TCR 불변 사슬로 구성되지만 특정 아미노산이 뮤린 TCR 불변 사슬로부터의 상응하는 아미노산으로 대체된 것이 유리할 수 있다. 이러한 뮤린화된 TCR 불변 사슬은 SIR의 증가된 발현을 제공한다. SIR 또는 이의 기능적 부분은 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양쪽 말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있으며, 이러한 추가 아미노산은 SIR을 구성하는 TCR 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열에서 발견되지 않는다. 바람직하게는, 추가 아미노산은 SIR 또는 기능적 부분의 생물학적 기능, 예를 들어 표적 세포 인식, 암 검출, 암 치료 또는 예방 등을 방해하지 않는다. 보다 바람직하게는, 추가 아미노산은 모 SIR의 생물학적 활성과 비교할 때 생물학적 활성을 향상시킨다. 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD를 포함하는 SIR의 백본을 갖는 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR을 제공한다. SIR의 백본을 갖는 본 개시 내용의 SAR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 SIR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 Ab-TCR을 제공한다.

"자극"이라는 용어는 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 그의 동족 리간드(또는 표적 항원)가 결합함으로써 TCR/CD3를 통한 신호 전달과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 신호 전달 이벤트를 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.

"자극 분자"라는 용어는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면을 위한 자극 방식으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다.

"대상체"라는 용어는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 임의의 길들여진 포유동물 또는 인간)를 포함하도록 의도된다. 용어 "대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자"는 본 개시 내용의 조성물 또는 약학 조성물의 투여가 바람직한 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 포유동물 대상체는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 축우, 소 등을 포함하며, 인간이 바람직하다.

본원에 사용되는 바와 같이 "스위치 도메인" 또는 "이량체화 도메인"은 일반적으로 이량체화 분자의 존재하에 또 다른 스위치 도메인과 결합하는 폴리펩티드 기반 엔티티를 지칭한다. 결합은 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 융합된 제1 엔티티 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 융합된 제2 엔티티의 기능적 커플링을 초래한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 집합적으로 이량체화 스위치로 지칭된다.

용어 "표적 항원"은 항원 결합제(예를 들어, 항체, 항체 단편, SAR-T 세포, SAR 어댑터 등)에 의해 결합되는 항원을 지칭한다. 용어 "표적 항원 발현 세포"는 항원 결합제에 의해 결합되는 항원을 발현하는 세포, 즉 표적 세포를 지칭한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR을 발현하는 세포는 그가 SAR 어댑터를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 그의 표적 항원 발현 세포에 결합할 때 활성화, 증식을 거치며 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인 생산, 세포독성 등)을 유도한다. 표적 항원의 비제한적인 예는 표 B에 나열되어 있다. 본 개시 내용의 SAR은 표 B에 나열된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)의 표적 항원에 직접적으로 또는 본원에 기재된 SAR 어댑터를 통해 결합할 수 있다.

[표 B]

용어 "T-세포" 및 "T-림프구"는 상호교환적으로 본원에서 동의어로 사용된다. 예에는 나이브(

) T 세포("림프구 전구 세포"), 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 기억 T 세포(Tscm), iPSC 유래 T 세포, 합성 T 세포 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "T/NK 세포 활성화 항체 요법"은 T 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 항체 요법을 지칭한다. T/NK 세포 활성화 항체 요법의 예에는 이중특이성 T 세포 인게이징 항체(예를 들어, 블리나투노맙) 또는 이중특이성 NK 세포 인게이징 항체가 포함된다.

TCR은 IMGT(International Immunogenetics) TCR 명명법 및 TCR 서열의 IMGT 공개 데이터베이스에 대한 링크를 사용하여 기재된다. 천연 알파-베타 이종이량체 TCR에는 알파 사슬(TCRα 또는 TCRa)과 베타 사슬(TCRβ 또는 TCRb)이 있다. 감마-델타 이종이량체 TCR에는 감마(TCRg)와 TCR-델타(TCRd) 사슬이 있다. 대체로, 각 사슬은 가변, 연결 및 불변 영역을 포함하며 베타 사슬은 또한 일반적으로 가변 영역과 연결 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 포함하지만 이 다양성 영역은 종종 연결 영역의 일부로 간주된다. 각 가변 영역은 프레임워크 서열에 내장된 3개의 CDR(상보성 결정 영역)을 포함하며, 그 중 하나는 CDR3으로 명명된 초가변 영역이다. 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열, 그리고 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별되는 여러 유형의 알파 사슬 가변(Vα 또는 Va) 영역과 여러 유형의 베타 사슬 가변(Vβ 또는 Vb) 영역이 있다. Vα/Va 유형은 IMGT 명명법에서 고유한 TRAV 번호로 지칭된다. 따라서 "TRAV21"은 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열, 및 TCR에서 TCR로 보존되지만 TCR에서 TCR로 다른 아미노산 서열도 포함하는 아미노산 서열에 의해 부분적으로 정의되는 CDR3 서열을 갖는 TCR Vα/Va 영역을 정의한다. 동일한 방식으로, "TRBV5-1"은 고유한 프레임워크와 CDR1 및 CDR2 서열을 갖지만 부분적으로만 정의된 CDR3 서열을 갖는 TCR Vβ/Vb 영역을 정의한다. TCRγ(TCRg) 및 TCRδ(TCRd)의 가변 영역을 각각 Vg 및 Vd라고 한다. TCR의 가변 영역(예를 들어, Vα, Vβ, Vγ, Vδ)은 MHC(또는 HLA) 의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있다. TCR의 가변 영역(예를 들어, Vα, Vβ, Vγ, Vδ)은 MHC(또는 HLA) 비의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, TCR의 가변 영역(예를 들어, Vα, Vβ, Vγ, Vδ)은 MHC(또는 HLA) 비의존성 방식으로 세포외 항원(예를 들어, CD19, CD20, CD22, 메소텔린 등)에 결합할 수 있다. 이러한 TCR은 HLA 비의존성 TCR로 지칭된다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 HLA 의존성 및/또는 HLA 비의존성 TCR 가변 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 TCR의 하나의 가변 영역 및 항체의 하나의 가변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 이중 사슬 SAR은 TCRα 불변 사슬에 부착된 Va 단편 및 TCRβ 불변 사슬에 부착된 vH(또는 vL) 단편을 포함할 수 있다. AABD는 하나 또는 2개의 사슬에 부착될 수 있다.

αβ TCR의 α 및 β 사슬은 일반적으로 각각 가변 및 불변 도메인이라는 2개의 "도메인"을 갖는 것으로 간주된다. 가변 영역은 가변 영역과 연결 영역의 연속으로 구성된다. 따라서, 본 명세서 및 청구범위에서 용어 "TCR 알파 가변 도메인 또는 Va 또는 Vα"는 TRAV 및 TRAJ 영역의 연속을 의미하고, 용어 TCR 알파 불변 도메인(Cα)은 세포외 TRAC 영역 또는 C-말단 절단된 TRAC 서열을 지칭한다. 유사하게, 용어 "TCR 베타 가변 도메인 또는 Vβ 또는 Vb"는 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역의 연속을 지칭하고, 용어 TCR 베타 불변 도메인(Cβ)은 세포외 TRBC 영역 또는 C-말단 절단된 TRBC 서열을 지칭한다.

본 개시 내용의 TCR은 비-자연 발생일 수 있고/거나 정제 및/또는 조작될 수 있다. 본 개시 내용의 TCR은 모 TCR에 비해 알파 사슬 가변 도메인 및/또는 베타 사슬 가변 도메인에 존재하는 하나 초과의 돌연변이를 가질 수 있다. "조작된 TCR" 및 "돌연변이 TCR"은 본원에서 동의어로 사용되며 일반적으로 모 TCR에 비해 특히 그의 Va 및/또는 Vb 또는 Vg 및/또는 Vd 도메인에 도입된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TCR을 의미한다. 조작된 TCR은 HLA 의존성 또는 HLA 비의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있다.

본원에 정의된 바와 같이 "HLA 비의존성 TCR" 또는 "MHC 비의존성 TCR"은 MHC 제한과 무관하게 항원을 인식할 수 있는 TCR이다. 예시적인 실시 양태에서, HLA 비의존성 TCR은 MHC 복합체에 의해 제시되지 않는 세포 표면상의 항원에 결합할 수 있다. 한 실시 양태에서, HLA 비의존성 TCR은 MHC 복합체에 의한 제시와 무관하게 세포 표면상에서 발현되는 항원에 결합할 수 있다. HLA 비의존성 TCR은 자연 발생 TCR일 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, HLA 비의존성 TCR은 편재적으로 발현되는 단일형태 항원 제시 분자인 MR1을 인식하는 MC.7.G5(MC7G5)이다. HLA 비의존성 TCR은 조작된 또는 재조합 TCR일 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, HLA 비의존성 TCR은 CD19, CD20, 메소텔린, PSMS 또는 BCMA와 같은 세포 표면상에서 발현되는 단백질에 결합할 수 있는 조작된 TCR이다. TCR의 가변 도메인을 조작하는 방법(예를 들어, CDR 이식 등)은 당 업계에 공지되어 있으며 단백질(예를 들어, CD19, MSLN, PSMA 등) 또는 MHC 복합체와 무관하게 세포외에서 발현되는 단백질 에피토프에 결합할 수 있는 HLA 비의존성 TCR을 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD를 포함하는 HLA 비의존성 TCR을 포함하는 TCR의 백본을 갖는 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR을 제공한다. TCR(예를 들어, HLA 비의존성 TCR)의 백본을 갖는 본 개시 내용의 SAR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 TCR(예를 들어, HLA 비의존성 TCR)을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 TCR(예를 들어, HLA 비의존성 TCR)을 제공한다.

본원에 정의된 바와 같이 "HLA 비의존성 TCR 가변 도메인"은 HLA 비의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 TCR의 가변 도메인이다. HLA 비의존성 가변 도메인은 HLA 비의존성 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 가변 도메인일 수 있다. HLA 비의존성 TCR 가변 도메인은 단일 가변 도메인 TCR(즉, svd-TCR)일 수 있다. HLA 비의존성 TCR 가변 도메인은 자연 발생 HLA 비의존성 가변 도메인 또는 조작된 HLA 비의존성 가변 도메인일 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, 조작된 HLA 비의존성 가변 도메인은 당 업계에 공지된 기술(예를 들어, CDR 이식, 스크리닝 파지 디스플레이 라이브러리 등)을 사용하여 단백질(예를 들어, CD19, CD22, BCMA, MSLN, PSMA)의 세포외 도메인에 대해 생성될 수 있다.

용어 "T 세포 수용체 모듈" 또는 "TCRM"은 T 세포 수용체로부터 유래된 서열을 포함하는 이종이량체를 지칭한다. TCRM은 T 세포 수용체 경막 도메인을 포함하고 T 세포 수용체 연결 펩티드 및/또는 세포내 도메인의 전부 또는 일부를 추가로 포함할 수 있다.

용어 "TCR 연관 신호전달 모듈"은 TCR-CD3 복합체의 일부인 세포질 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 분자를 지칭한다. TCR 연관 신호전달 모듈에는 CDγε, CDδε 및 CD3ζζ가 포함된다.

본원에 사용되는 바와 같이 "치료제"는 예를 들어, 질환의 치료, 억제, 예방, 질환의 효과 완화, 질환의 중증도 감소, 발병 가능성 감소, 질환의 진행 지연 및/또는 치유에 사용되는 작용제를 지칭한다. 치료제에 의해 표적화되는 질환은 감염성 질환, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양, 모세포종, 다양한 면역 세포상에서 발현되는 항원, 및 다양한 혈액 질환과 관련된 세포 상에서 발현되는 항원, 및/또는 염증성 질환을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이 "치료 컨트롤"은 SAR(차세대 CAR 포함) 발현 세포의 활성을 제어하기 위해 사용되는 요소를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR 발현 세포의 활성을 제어하기 위한 치료 컨트롤은 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR), 절단된 표피 성장 인자 수용체 viii(tEGFRviii), 절단된 CD30(tCD30), 절단된 BCMA(tBCMA), 절단된 CD19(tCD19), 티미딘 키나아제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코오스 옥시다제, 데옥시리보뉴클레오시드 키나아제, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)/인돌-3-아세트산(IAA), 감마-글루타밀시스테인 신테타아제, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나아제 키메라, dox 의존성 카스파제-2, 돌연변이 티미딘 키나아제(HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체(CCR), 선별 마커, 및 이들의 조합 중 어느 하나 이상을 포함한다.

"치료 효과"라는 용어는 예를 들어 종양 부피의 감소, 암세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암세포 증식의 감소, 암세포 생존의 감소, 감염원의 역가 감소, 감염원 집락 수의 감소, 질환 상태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "치료 효과"는 또한 먼저 질환의 발생을 예방하거나 질환의 재발을 예방하는 데에 있어 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "치료 유효량"은 질환 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 감소시키기 위한 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 약학 조성물의 양을 지칭하며, 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양의 약리학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이 "치료 유효량"이라는 문구는 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비율로 장애를 치료하기에 충분한 양의 조성물을 의미한다.

증상의 치료적 또는 예방적으로 유의한 감소는 예를 들어, 대조군 또는 비치료 대상체 또는 본원에 기재된 올리고펩티드를 투여하기 전의 대상체의 상태와 비교하여 측정된 매개변수에서 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150% 이상이다.

용어 "TCR 수용체 융합 단백질" 또는 "TFP"는 본원에 참고로 포함되는 WO 2016/187349 A1에 기재된 바와 같은 차세대 SAR 플랫폼을 지칭한다. 한 실시 양태에서, TFP는 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα 또는 TCRβ와 같은 TCR 사슬에 융합된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. TFP의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 사슬은 본 개시 내용의 서열 번호 11903-11906으로 표시되고 본원에 참고로 포함된 WO 2017/070608 A1에 제공되어 있다. CD3ε 사슬을 포함하는 TFP는 CD3ε TFP 또는 TFPε이라고 지칭된다. CD3γ 사슬을 포함하는 TFP는 CD3γ TFP 또는 TFPγ로 지칭된다. CD3δ 사슬을 포함하는 TFP는 CD3δ TFP 또는 TFPδ로 지칭된다. CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ 사슬을 포함하는 TFP는 집합적으로 CD3ε/γ/δ TFP 또는 TFPε/γ/δ로 지칭된다. 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD를 포함하는 TFP(예를 들어, TFPε)의 백본을 갖는 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR을 제공한다. TFP의 백본을 갖는 본 개시 내용의 SAR의 AABD 도메인은 완전 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 TFP를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 TFP를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드(예를 들어, 센티린 또는 DARPIN)를 포함하는 TFP를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 어댑터 결합 도메인(예를 들어, 류신 지퍼 도메인, 예를 들어, RZip, Ezip, E4, K4 등)을 포함하는 TFP를 제공한다.

용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이 "경막 도메인"(TMD)은 원형질막을 가로지르는 SAR의 영역을 지칭한다. 본 개시 내용의 SAR의 경막 도메인은 경막 단백질(예를 들어, 유형 I 경막 단백질)의 경막 영역, 인공 소수성 서열 또는 이들의 조합이다. 다른 경막 도메인은 당업자에게 명백할 것이고 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, TMD 코딩된 SAR은 T 세포 수용체의 TCRα, TCRβ. TCRγ, TCRδ 사슬, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 경막 도메인으로부터 선택된 경막 도메인을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "삼기능성 T 세포 항원 커플러" 또는 "Tri-TAC" 또는 "TAC"는 본원에 참고로 포함된 WO 2015/117229 A1에 기재된 차세대 SAR 플랫폼을 지칭한다. 다양한 항원을 표적화하는 Tri-TAC이 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 본 개시 내용에 기재된 항원 결합 도메인(예를 들어, vL 및 vH 단편, scFv, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 사용하여 구축될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "개선"은 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 목적은 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 경감, 개선, 억제, 지연 또는 정지시키는 것이다..

본원에 사용되는 바와 같이, "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포내로 도입되어 숙주를 형질전환하고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터에는 플라스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다.

용어 "바이러스 벡터"는 바이러스로부터 수득되거나 유래된 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 바이러스는 렌티바이러스 및 감마 레트로바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스이다. 본 개시 내용의 바이러스 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 본 개시 내용의 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

"제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"라는 용어는 GenBank 등록 번호 BAG36664.1로 제공된 단백질 또는 비인간 종으로부터의 등가 잔기로 정의된다.

SAR의 결합 도메인은 원하는 에피토프 또는 항원에 결합한다. 예를 들어, SAR에 의해 인식되는 에피토프는 SAR의 결합 도메인으로 사용되는 scFv에 의해 인식되는 에피토프로부터 결정된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 SAR CD8SP-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-CD8TM-BBz-T2A-PAC의 항원 특이적 도메인(서열 번호 7340)이 인간화 scFv(서열 번호 11323)로 구성되는 경우, SAR은 scFv 및/또는 scFv가 유래된 모 항체와 동일한 에피토프를 표적화할 것으로 예상된다. 본 개시 내용의 SAR 및 백본의 구축에 사용된 몇몇 scFv 및/또는 그의 모 항체에 의해 인식되는 에피토프는 당 업계에 공지되어 있다. 대안적으로, AMR 또는 SAR에 의해 표적화된 에피토프는 그의 표적 항원의 일련의 돌연변이체를 생성하고, 당 업계에 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어 Topanga 분석을 사용하여 돌연변이체가 SAR 발현 세포에 결합하는 능력을 테스트함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 SAR CD8SP-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-CD8TM-BBz-T2A-PAC(서열 번호 7340)에 의해 인식된 에피토프는 CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis-T2A-Pac (DNA 서열 번호 1282 및 PRT 서열 번호 11972)의 결실 및 점 돌연변이체의 패널을 생성함으로써 결정될 수 있다. 돌연변이 구축물을 적합한 세포주(예를 들어, 293FT 세포)로 형질감염시키고 융합 단백질을 함유하는 상청액을 수집하고 NLuc 활성에 대해 분석하여 상이한 돌연변이 CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis 융합 단백질이 상청액에 분비됨을 확인한다. 후속적으로, 융합 단백질은 SAR(서열 번호 7340) 구축물을 발현하는 세포(예를 들어, Jurkat 세포 또는 T 세포)에 결합하는 능력에 대해 테스트될 것이다. SAR 발현 세포에 결합하지 못하는 돌연변이체는 CD19 특이적 SAR에 의해 표적화된 에피토프를 함유하기 위한 후보이다. 특정 SAR에 의해 인식되는 에피토프를 결정하기 위한 대안적인 접근 방식에는 다양한 테스트 항체를 사용한 기능적 경쟁 분석이 포함될 수 있다. 예를 들어, SAR(서열 번호 7340)을 발현하는 T 세포는 증가하는 농도의 상이한 테스트 CD19 항체의 존재 및 부재 하에 CD19를 발현하는 세포주(예를 들어, RAJI 세포)와 공동 배양될 수 있다. 테스트 CD19 항체에 의해 인식되는 에피토프가 SAR에 의해 인식되는 에피토프(서열 번호 7340)와 중첩되는 경우, 테스트 항체는 SAR(서열 번호 7340)을 발현하는 T 세포에 의해 유도된 표적 세포 사멸 및 사이토카인 생성을 용량 의존적 방식으로 차단할 것으로 예상된다. 테스트 항체와 동일한 아이소형의 비특이적 항체가 대조군으로 포함될 것이며 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 유도되는 표적 세포 사멸 및 사이토카인 생성에 영향을 미치지 않을 것으로 예상될 것이다. 유사하게, 특정 SAR은 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 발현될 수 있으며, 표적 세포주와의 공동 배양 시 SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포에 의한 EGFP 유도를 차단하는 테스트 항체의 능력을 사용하여 테스트 항체에 의해 인식되는 에피토프가 상기 SAR에 의해 인식되는 에피토프와 중첩되는지 여부를 결정할 수 있다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

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[표 6]

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[표 18]

[표 19]

[표 20]

[표 21]

[표 22]

[표 23]

[표 24]

[표 25]

[표 26] 상이한 항원을 표적화하는 상이한 백본 상의 이중특이성 및 삼중특이성 구축물. 이들 구축물은 표 25에 있는 구축물의 [hTCRb-S57C-opt] 및 [hTCRa-T48C-opt] 모듈을 아래 표의 각 시리즈의 첫 번째 구축물에 표시된 모듈로 변경하여 생성하였다. 표 26에서 각 시리즈의 구축물의 vL/vH 단편의 순서는 세부 사항이 표 25에 제공된 시리즈 1의 구축물의 vL/vH 사슬의 순서와 동일하다.

[표 27]

[표 28] 상이한 항원을 표적화하는 상이한 백본 상의 이중특이성 및 삼중특이성 구축물. 이들 구축물은 표 27의 구축물의 CD20-vHH-2HCD25 모듈을 아래 표의 각 시리즈의 첫 번째 구축물에 나타낸 모듈로 변경하여 생성하였다. 표 28에서 각 시리즈의 구축물의 vL/vH 단편의 순서는 세부 사항이 표 27에 제공된 시리즈 1의 구축물의 vL/vH 사슬의 순서와 동일하다.

[표 29]

[표 29]

[표 31]

[표 32] 상이한 항원을 표적화하는 상이한 백본 상의 이중특이성 및 삼중특이성 구축물. 이들 구축물은 표 31의 구축물의 AABD 모듈을 아래 표의 각 시리즈의 첫 번째 구축물에 나타낸 모듈로 변경하여 생성하였다. 표 32에서 각 시리즈의 구축물의 TCR 불변 사슬 단편의 순서는 세부 사항이 표 31에 제공된 시리즈 1의 구축물의 TCR 불변 사슬 단편의 순서와 동일하다.

[표 33]

[표 34] 상이한 항원을 표적화하는 상이한 백본 상의 이중특이성 및 삼중특이성 구축물. 이들 구축물은 표 33의 구축물의 AABD 모듈을 아래 표의 각 시리즈의 첫 번째 구축물에 표시된 모듈로 변경하여 생성하였다. 표 34에서 각 시리즈의 구축물의 백본(예를 들어 TCR 불변 사슬 단편)의 순서는 세부 사항이 표 33에 제공된 시리즈 1의 구축물의 백본(예를 들어, TCR 불변 사슬 단편)의 순서와 동일하다.

[표 35]

[표 36] 상이한 항원을 표적화하는 상이한 백본 상의 단일특이성, 이중특이성 및 삼중특이성 구축물. 이들 구축물은 표 35의 구축물의 vL/vH 모듈을 아래 표의 각 시리즈의 첫 번째 구축물에 나타낸 vL/vH로 변경하여 생성하였다. 표 36에서 각 시리즈의 구축물의 TCR 불변 사슬 단편의 순서는 세부사항이 표 35에 제공된 시리즈 1의 구축물의 TCR 불변 사슬 단편의 순서와 동일하다.

[표 37]

[표 38]

[표 39]

[표 40]

한 측면에서, 본 개시 내용은 합성 항원 수용체(SAR)의 신규 조성을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR의 신규 구성/아키텍처를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 유용한 생물학적 특성(예를 들어, 발현, 결합 친화도, 이펙터 기능 등)을 갖는 SAR을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 항원에 결합할 수 있는 SAR을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 SAR을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 하나 초과(즉, 2, 3, 4, 5개 이상)의 항원 결합 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체(SAR)를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 하나 초과의 항원 또는 항원의 하나 초과의 에피토프에 결합하고/거나 이에 반응할 수 있는 SAR을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 하나 초과의 항원 또는 항원의 하나 초과의 에피토프에 결합하고/거나 이에 반응할 수 있는 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR의 구축을 위한 유용한 항원 결합 도메인을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR에 대한 유용한 구성(즉, 상이한 도메인의 위치)을 제공한다. 본 개시 내용의 이중특이성 및 다중특이성 SAR은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NKT 세포 또는 NK 세포 등)에서 발현될 때 동일한 항원 또는 해당 항원의 동일한 에피토프를 표적화하는 둘 이상의 단일특이성 SAR과 비교하여 거의 동일한 효능 또는 더 큰 효능으로 하나 초과의 항원 또는 항원의 하나 초과의 에피토프에 결합하고/거나 이에 반응하는 능력을 부여한다.

이중특이성 또는 다중특이성 SAR에 2개 이상의 항원 결합 도메인이 존재하면 입체 장애, 비특이적 응집, 불량한 발현, 단백질 풀림 및/또는 항원 결합의 간섭이 발생할 수 있다. 또한, 생성된 수용체에 의한 신호 전달을 최적화하기 위해 SAR의 경막 도메인에 대한 항원 결합 도메인(들)의 위치를 최적화할 필요가 있다. 2개 이상의 scFv를 포함하는 이중특이성 및 다중특이성 CAR이 당 업계에 기술되었다. 그러나 본 개시 내용은 SAR(예를 들어, 2세대 CAR, SIR, Ab-TCR, zSIR, TFP 또는 rTCR 등)에서 하나 초과의 scFv(즉, 2, 3, 4개 이상)가 존재하면 종종 입체 장애, 비특이적 응집, 강장성 신호전달, 불량한 발현, 단백질 풀림, 및/또는 불량한 신호전달 및 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인 생성, 세포독성 등)을 초래하는 항원 결합의 간섭이 발생한다는 것을 확인한다. 따라서, 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 생성에서 주요 과제는 입체 장애, 비특이적 응집, 강장성 신호전달, 불량한 발현, 단백질 풀림, 및/또는 불량한 신호전달 및 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인 생성, 세포 독성)을 유발할 수 있는 항원 결합의 간섭을 줄이기 위해 이러한 SAR에 포함되어야 하는 유용한 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, Fv, Fab, vHH, FHVH, 센티린, 아피바디, 사이토카인, 수용체, svd-TCR, 등)을 결정하는 것이다.

두 번째 과제는 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 포함하는 다양한 항원 결합 도메인의 유용한 구성을 결정하는 것이다. 예를 들어, 비특이적 응집, 강장성 신호전달, 불량한 발현, 단백질 풀림, 및/또는 불량한 신호전달 및 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인 생성, 세포 독성)을 초래하는 항원 결합의 간섭을 줄이기 위해 서로에 대한 그리고 SAR의 다른 성분(예를 들어, 힌지 도메인, 경막 도메인 등)에 대한 다양한 항원 결합 도메인의 최적 순서가 결정될 필요가 있다. 이는 모든 SAR 및 특히 다중 사슬 SAR, 예컨대 항원 결합 도메인이 2개의 상이한 단편(예를 들어, vL 및 vH, Va 및 Vb 또는 Vg 및 Vd 등)으로 구성된 SIR, Ab-TCR, zSIR, αβTFP 또는 γδTFP에 중요한 과제이다. 예를 들어, 2개의 개별 TCR 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되지만 결합하여 CD19에 결합하는 Fv를 형성하는 vL 및 vH 단편을 통해 CD19에 결합하는 이중 사슬 SIR(예를 들어, CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]; 서열 번호 7348)에 대한 제2 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv 또는 vHH 도메인)의 부착은 잠재적으로 vL 및 vH 단편 사이의 상호작용을 방해하여 상호작용을 방해하여 CD19에 결합할 수 있는 기능적 Fv를 형성할 수 없는 결과를 초래할 수 있다.

항원 결합 도메인과 세포막 사이의 거리를 결정하는 힌지 도메인의 길이는 키메라 항원 수용체를 통한 신호전달에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이 분야의 또 다른 과제는 다중 항원 결합 도메인의 부착이 표적 항원과 세포막 사이의 거리를 증가시켜 효과적인 면역학적 시냅스의 형성 및 SAR을 통한 신호전달에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 지의 여부가 현재 알려져 있지 않다는 것이다.

SAR에서 다중 항원 결합 도메인의 융합은 입체 장애 및 부적절한 접힘을 초래할 수 있다. 이 분야의 또 다른 과제는 이중특이성/다중특이성 SAR의 상이한 항원 결합 도메인 사이에 링커 도메인이 필요한지의 여부가 현재 알려져 있지 않다는 것이다. 링커 도메인의 길이와 특성도 알려져 있지 않는다. 이는 이중 사슬 SAR(예를: 들어, 이중 사슬 SIR, 이중 사슬 zSIR, Ab-TCR, αβTFP 또는 γδ TFP 등)의 경우 부적절한 링커의 추가가 잠재적으로 두 사슬 간의 상호작용 및 기능적 Fv의 형성을 방해할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 추가로, 링커(들)는 표적 항원과 세포막 사이의 거리를 증가시켜 효과적인 면역학적 시냅스의 형성 및 SAR을 통한 신호전달에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 상기 문제에 대한 해결책을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 하나 이상의 경막 도메인을 갖는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 구축을 위한 유용한 항원 결합 도메인을 제공한다.

본 개시 내용은 다양한 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 링커 도메인, 연결 펩티드, 경막 도메인, 활성화 도메인, 공동자극 도메인, 보조 모듈 및 치료 컨트롤 등을 포함하는 몇 가지 예시적인 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 성분의 명칭 및 서열 번호(DNA) 및 서열 번호(PRT)는 표 1 내지 20 및 24에 제공되어 있다. 예시적인 SAR의 명칭 및 서열 번호(DNA) 및 서열 번호(PRT)는 표 25-36 및 41-50에 제공되어 있다. SAR의 표적 항원(들), 구성 및 조성은 BLAST와 같은 프로그램을 사용하여 성분 모듈에 대한 서열 상동성 검색을 수행함으로써 본 개시 내용에 제공된 핵산 서열 및 아미노산 서열로부터 추론될 수 있다. 대안적으로, ApE(https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)와 같은 소프트웨어를 사용하여 핵산 서열이 본 개시 내용에서 제공되는 다양한 SAR 구축물의 조성을 결정할 수 있다. 마지막으로, 본 개시 내용의 상이한 SAR의 구성 및 조성은 당업자에 의해 이들의 명칭으로부터 추론될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 표 25-36 및 41-50에 제공된 임의의 예시적인 SAR에 의해 표시되는 아키텍처 및/또는 구성을 갖는 신규 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 표 25-36 및 41-50에 제공된 임의의 예시적인 SAR 또는 이의 기능적 변이체의 조성을 갖는 신규 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 표 25-36 및 41-50에 제공된 임의의 예시적인 SAR의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 상동성(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 상동성)을 갖는 신규 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 선택적 보조 모듈을 제외한 표 25-36 및 41-50에 제공된 임의의 예시적인 SAR의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 상동성(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 상동성)을 갖는 신규 SAR을 제공한다. 표 25-36 및 41-50에서 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 신호 펩티드를 포함한다. 그러나 신호 펩티드가 성숙한 SAR 폴리펩티드 사슬로부터 제거되기 때문에 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 상동성을 결정하기 위해서는 제외된다. 유사하게, 보조 모듈 및/또는 임의의 절단 링커(예를 들어, P2A, F2A 등) 또는 퓨린 절단 부위를 코딩하는 서열은 서열 상동성을 결정하기 위해서는 제외된다. 따라서, 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 항원 결합 도메인(들) 및 신호전달 사슬(들)(예를 들어, TCR 불변 사슬)을 포함하는 영역에서 표 25-36 및 41-50에 제공된 임의의 예시적인 SAR의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 상동성(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 상동성)을 갖는 신규 SAR을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 유리한 항원 결합 도메인을 갖는 SAR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 인간 V_H 도메인, 전형적으로 다중 인간 V_H 도메인을 포함하는 자율 항원 결합 도메인(AABD)의 용도에 관한 것이다.

본 개시 내용은 한 측면에서 자율 항원 결합 도메인(AABD), 이를 생성하는 방법 및 합성 항원 수용체 및 잠재적으로 항체 치료제의 구축을 위한 이러한 도메인의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시 양태에서, AABD 도메인은 개선된 안정성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, AABD 도메인은 개선된 열 안정성을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, AABD 도메인은 개선된 용해도를 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, AABD 도메인은 자가-응집에 대한 더 낮은 경향을 갖는다. 또 다른 실시 양태에서, AABD 도메인은 N-말단 신호 펩티드를 갖는 포유동물 세포에서 발현될 때 세포외 공간에서 분비되는 개선된 능력을 갖는다.

한 측면에서 AABD는 단일 도메인 항체 또는 항체 단편이다. 한 측면에서, AABD는 가변 경쇄(VL 또는 vL) 도메인의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 중쇄(VH 또는 vH) 도메인(SVH 도메인) 또는 이의 단편이다. 또 다른 측면에서, AABD는 vL 도메인의 부재 하에 가용성 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 중쇄(VH) 도메인(또는 SVH 도메인) 또는 이의 단편이다. 또 다른 측면에서, AABD는 N-말단 분비 신호에 연결될 때 vL 도메인의 부재 하에 분비 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 중쇄(VH) 도메인(또는 SVH 도메인) 또는 이의 단편이다. 본 개시 내용의 특정 실시 양태는 제1 AABD를 포함하는 SAR에 관한 것으로, 제1 AABD는 제2 도메인의 부재 하에 항원에 특이적으로 결합한다.

한 측면에서 AABD는 가변 중쇄(VH 또는 vH) 도메인의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 경쇄(VL 또는 vL) 도메인 또는 SVL 도메인 또는 이의 단편이다. 또 다른 측면에서, AABD는 vH 도메인의 부재 하에 가용성 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 경쇄(VL) 도메인(또는 SVL 도메인) 또는 이의 단편이다. 또 다른 측면에서, AABD는 N-말단 분비 신호에 연결될 때 vH 도메인의 부재 하에 분비 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 경쇄(VL) 도메인(또는 SVL 도메인) 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 기반 항원 결합 도메인 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 낙타과 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 사이토카인 또는 이의 리간드 또는 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 단일 가변 도메인 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 자가항원 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, AABD는 어댑터도메인, 어댑터 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 예시적인 어댑터 및 어댑터 결합 도메인은 RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-YA, NKG2D-AF, D 도메인 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

용어 "단일 도메인 항체, 가변 단일 도메인 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)"은 모두 당 업계에 널리 공지되어 있으며 표적 항원에 결합하는 항체의 단일 가변 단편을 기재한다. 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 하기에 설명된 바와 같이, 본 개시 내용의 다양한 측면의 바람직한 실시 양태는 경쇄 부재 하에 CCD19, CD20, CD22, BCMA, CD38, MPL, CD123, CD33, 메소텔린, Her2, CS1/SLAMF7, CD30, GD2, GD3, FLT3, ROR1, CD79b, Lym1, Lym2, PSCA, PSMA, ALK, CD138, CEA, FAP, TAJ, CD229, IL13Ra2, CD32b, GPC3, Muc16 및 KIR3DL2와 같은 다양한 항원에 결합하는 SVH 도메인으로 지칭되는 단일 중쇄 가변 도메인 항체/면역글로불린 중쇄 단일 가변 도메인을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 이들은 다양한 항원에 결합한다. 인간 중쇄 단일 가변 도메인 항체가 특히 바람직하다.

따라서, 일부 바람직한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 단일 도메인 항체를 포함하거나 이로 이루어진 결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 단일 인간 중쇄 가변 도메인(SVH)이다. 따라서, 바람직한 측면에서, 본 개시 내용의 SAR은 VL 도메인이 없는 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.

따라서, 일부 바람직한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 단일 도메인 항체를 포함하거나 이로 이루어진 결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 낙타과 vHH(또는 VHH) 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.

본원에 사용되는 바와 같이, V_H 도메인은 인간 V_H 도메인 또는 비인간 V_H 도메인이다. 용어 "인간 V_H 도메인"은 인간 V_H 도메인 아미노산 또는 핵산 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 하는 V_H 도메인을 포함한다. 따라서, 이 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 인간 V_H 도메인은 특히 예를 들어 WO 2016/062990에 기재된 바와 같이 관심 항원을 사용한 면역화에 반응하여 인간 면역글로불린 V 유전자를 발현하는 형질전환 마우스로부터 단리된 V_H 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 일반적으로 완전 인간이다. 한 실시 양태에서, 인간 V_H 도메인은 또한 인간 V_H 도메인 아미노산 또는 이러한 V_H 도메인을 코딩하는 핵산 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 하는 V_H 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 이 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 그에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 인간 V_H 도메인으로부터 유래되거나 이를 기반으로 하는 V_H 도메인 또는 실질적으로 인간 V_H 도메인은 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 예를 들어, 시험관 내 도입된 돌연변이, 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 따라서 용어 "인간 V_H 도메인"은 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 실질적으로 인간 V_H 도메인을 포함한다. 예를 들어, 실질적인 인간 V_H 도메인은 완전 인간 서열과 비교하여 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 VH, V_H 또는 "가변 도메인"은 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5^th　ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)]에 의해 정의된 면역글로불린 가변 도메인을 지칭한다. 가변 도메인 내의 CDR 아미노산 잔기의 넘버링 및 위치는 널리 공지된 Kabat 넘버링 규칙에 따른다.

한 측면에서, SAR의 신규 AABD는 단일 중쇄 가변(VH) 도메인 또는 SVH 도메인이다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 SVH 도메인은 단일 인간 VH 도메인 항체(VH sdAb)를 지칭한다. 따라서 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. SVH라는 용어는 또한 독립 vH 도메인 또는 자율 vH 도메인과 상호교환적으로 사용된다. 본 개시 내용은 SAR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 인간, 일반적으로 다중 인간 SVH 도메인의 용도에 관한 것이다.

SVH 도메인은 SAR의 다가 또는 다중특이성 항원 결합 도메인을 제공하기 위해 다양한 형식으로 결합될 수 있는 12-14 kDa의 소분자이다. SVH 도메인은 강력하고 혈청에서 높은 친화성과 안정성을 특징으로 한다. SVH 도메인은 또한 혈청에서의 높은 용해성 및 응집 없음을 특징으로 한다.

각각의 단일 V_H 도메인(SVH) 항체는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 실시 양태에서, 도메인은 하기 식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 갖는 인간 중쇄 가변(V_H) 도메인이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Kabat 시스템에 따른 W103R 치환을 갖는 SVH 도메인을 사용하여 구축될 수 있는 단일 사슬 및 다중 사슬 SAR(예를 들어, SIR, cTCR Ab-TCR, TCR, αβTFP, 또는 γδTFP 등)을 제공한다. W103R 치환을 갖는 CD19를 표적화하는 예시적인 SVH는 CD19-FHVH-354이고 서열 번호(DNA) 836 및 서열 번호(PRT) 11526(표 5)으로 표시된다. W103R 치환을 갖는 SVH를 포함하는 추가의 예시적인 AABD가 표 5에 나열되어 있다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Kabat 시스템에 따른 W103R 치환을 갖는 SVH 도메인을 포함하는 이중특이성, 2가 또는 이중파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 다중 사슬 SAR(예를 들어, SIR, cTCR Ab-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 재조합 TCR 등)을 제공한다. SIR 백본을 기반으로 하고 항원 결합 도메인 중 하나로서 CD19-FHVH-354를 포함하는 다양한 항원을 표적화하는 예시적인 SAR이 표 25에 제시되어 있다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Kabat 시스템에 따른 W103R 치환을 갖는 SVH 도메인을 포함하는 다중특이성, 다가 또는 다중파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 다중 사슬 SAR(예를 들어, SIR, cTCR Ab-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 재조합 TCR 등)을 제공한다. SIR, zSIR 및 Ab-TCR 백본을 기반으로 하고 항원 결합 도메인 중 하나로서 CD19-FHVH-354를 포함하는 다양한 항원을 표적화하는 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR이 표 26에 제시되어 있다. AABD는 본질적으로 모듈식이므로, CD19-FHVH-354를 상이한 항원을 표적화하는 다른 AABD로 대체하여 해당 항원을 표적화하는 SAR을 개발할 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Kabat 시스템에 따른 W103R 치환을 갖는 SVH를 포함하는 이중특이성, 2가 또는 이중파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 단일 사슬 SAR(예를 들어, CAR, TFP 등)을 제공한다. 항원 결합 도메인 중 하나로서 CD22-FHVH-24를 포함하는 CD22 및 CD19를 표적화하는 예시적인 단일 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD22-FHVH-24-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-28z(서열 번호(DNA) 4118 및 서열 번호(PRT) 14808)이다. 이 SAR 구축물에서, CD22-FHVH-24는 글리신-세린(G4Sx3) 링커를 통해 hu-mROO5-1 scFV의 N-말단에 작동 가능하게 연결된다. scFV는 Myc 링커를 통해 인간 CD28 힌지 및 경막 도메인에 프레임 내에서 융합된다. SAR은 또한 C-말단에 CD3z 활성화 도메인을 보유한다. 유사한 모듈식 아키텍처를 갖는 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Kabat 시스템에 따른 W103R 치환을 갖는 SVH를 포함하는 다중특이성, 다가 또는 다중파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 단일 사슬 SAR(예를 들어, CAR, TFP 등)을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 단일 사슬 및 다중 사슬 SAR이 적합한 조건 하에 이황화 결합을 형성할 수 있고/거나 이황화 가교를 형성하는 비표준 시스테인의 도입에 의해 안정화된 SVH를 사용하여 구축될 수 있음을 제공한다. 비표준 시스테인을 포함하는 예시적인 SVH는 CEA-300-aVH이고 서열 번호(DNA) 954 및 서열 번호(PRT) 11644에 제공되어 있다. 추가의 예시적인 이러한 SVH는 WO2019149715에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. CEA-300-aVH를 포함하는 예시적인 SAR은 서열 번호 21956으로 표시되어 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SVH 도메인이 Kabat 넘버링에 따른 위치 (i) 52a 및 71 또는 (ii) 33 및 52에서 치환 시스테인을 함유하는 SVH를 포함하는 단일 사슬 SAR(예를 들어, CAR, TFP 등)을 제공함으로써 기존의 입양 세포 요법의 단점을 완화하는 것을 목표로 하며, 여기서 상기 시스테인은 적합한 조건 하에 이황화 결합을 형성할 수 있고/거나 이황화 결합을 형성한다.

본 개시 내용의 실시 양태에서, SAR을 제조하기 위해 사용되는 SVH 도메인은 Kabat 넘버링에 따라 44E, 45E, 45 R, (101-1)Y 및 101D로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함한다. 특히, SVH는 Kabat 넘버링에 따른 치환 44E, 45E 또는 45R, (101-1)Y 및 101D를 포함한다. 한 실시 양태에서, SVH 도메인은 Kabat 넘버링에 따른 G44E, T45E, T45 R, F(101-1)Y 및 A101D로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함한다. 한 실시 양태에서, SVH 도메인은 Kabat 넘버링에 따른 치환 G44E, T45E, T45 R, F(101-1)Y 및 A101D를 포함한다.

본 개시 내용의 실시 양태에서, SAR은 Kabat 넘버링에 따른 44E, 45E 및 (101-1)Y로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 갖는 SVH를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 Kabat 넘버링에 따른 치환 44E, 45E, 및 (101-1)Y를 갖는 SVH 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, SVH 도메인은 SVH 도메인에 존재하는 경우 Kabat 넘버링에 따른 G44E, T45E 및 F(101-1)Y로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 Kabat 넘버링에 따른 치환 G44E, T45E, 및 F(101-1)Y를 포함하는 SVH 도메인을 포함한다

한 실시 양태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열 번호 21411, 21412, 21413 및 21414의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열 번호 21415, 21416, 21417, 및 21418의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열 번호 21419, 21420, 21421, 및 21422의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

본 개시 내용의 한 실시 양태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열 번호 21423, 21424, 21425, 및 21426의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

본 개시 내용의 한 실시 양태에서, SVH 도메인은 각각 서열 번호 21427, 21428, 21429, 및 21430의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

본 개시 내용의 실시 양태에서, SVH 도메인은 각각 서열 번호 21431, 21432, 21433, 및 21434의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

한 실시 양태에서, SVH 도메인은 각각 서열 번호 21435, 21436, 21437, 및 21438의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

한 실시 양태에서, SVH 도메인은 각각 서열 번호 21439, 21440, 21441, 및 21442의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.

SVH 도메인은 서열 번호 21411-21442에 따른 FR1-4가 인간에서 면역원성이 아니기 때문에 SAR의 구축에 특히 유용하다.

본 개시 내용은 또한 SAR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 인간, 일반적으로 다중 인간 SVH 도메인의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 SVH 도메인은 단일 인간 VH 도메인 항체(VH sdAb)를 지칭한다. 따라서 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. SVH라는 용어는 또한 독립 vH 도메인 또는 자율 vH 도메인과 상호교환적으로 사용된다. SVH는 AABD의 한 유형이다.

일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR 구축물은 관심 표적 단백질, 예를 들어, 항원과 같은 종양 세포 상에서 발현되는 단백질을 인식하는 인간 SVH 도메인(전형적으로 다중 인간 SVH 도메인)을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR 구축물은 관심 표적 단백질, 예를 들어, 항원과 같은 종양 세포 상에서 발현되는 단백질을 인식하는 인간 SVL 도메인 (전형적으로 다중 인간 SVL 도메인)을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 SVL 도메인은 단일 인간 VL 도메인 항체(VL sdAb)를 지칭한다. 따라서 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. SVL이라는 용어는 독립 vL 도메인 또는 자율 vL 도메인과 상호교환적으로 사용되기도 한다. SVL은 AABD의 한 유형이다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 낙타과 vHH 도메인이다. 본 개시 내용은 또한 다중의 vHH 도메인을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 인간화 vHH 도메인을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 본 개시 내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 vHH 도메인 및 그의 표적 항원은 표 5에 제시되어 있다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, D 도메인, 또는 이의 단편이다. 본 개시 내용은 또한 다중 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 포함하는 SAR에 관한 것이다. 본 개시 내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 및 그의 표적 항원은 표 7-9에 제시되어 있다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-AF, NKG2D-YA, 또는 D 도메인 등)이다. 본 개시 내용은 또한 다수의 어댑터에 결합하는 SAR을 포함한다. 한 실시 양태에서, 어댑터 결합 도메인은 류신 지퍼 도메인이다. 한 측면에서, SAR의 AABD는 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인, Streptag, FITC, 비오틴, ULBP2R, ULBP2-S3 등)에 결합한다. 어댑터 및 어댑터 결합 단백질은 서로 대체될 수 있음은 당업자에 의해 이해된다. 따라서, SAR은 EZIP 모듈을 포함하는 SAR 어댑터에 결합하는 RZIP 모듈을 포함할 수 있다. 대안적으로, SAR은 EZIP 모듈을 포함할 수 있는 반면 SAR 어댑터는 RZIP 모듈을 포함할 수 있다. 본 개시 내용은 또한 다수의 어댑터에 결합하는 SAR을 포함한다. 예시적인 어댑터 및 어댑터 결합 단백질은 표 10에 제시되어 있다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 본 개시 내용은 또한 수용체의 다중의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 SAR을 포함한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 수용체의 예시적인 세포외 리간드 결합 도메인은 표 8에 제공된다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 리간드 또는 사이토카인의 세포외 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 본 개시 내용은 또한 리간드 또는 사이토카인의 다중의 세포외 수용체 결합 도메인을 포함하는 SAR을 포함한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 리간드 또는 사이토카인의 예시적인 세포외 수용체 결합 도메인은 표 9에 제공되어 있다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 자가항원이다. 본 개시 내용은 또한 다중의 자가-항원을 포함하는 SAR을 포함한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 자가-항원은 Dsg3(서열 번호 11687) 또는 이의 단편이다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 T 세포 수용체의 단일 가변 도메인(svd-TCR)이다. 본 개시 내용은 또한 T 세포 수용체의 다중의 단일 가변 도메인을 포함하는 SAR을 포함한다. svd-TCR 도메인을 포함하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 번호(DNA) 21563-21564 및 WO2021030182에 제공되며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

한 측면에서, SAR의 AABD는 세포 표면상에 발현된 항원에 결합할 수 있는 임의의 단백질이다.

SAR에서 다수의 AABD가 다양한 조합으로 존재할 수 있다(예를 들어, 2개의 센티린, 1개의 센티린 및 1개의 vHH 도메인, vHH 도메인 및 SVH 도메인 및 센티린 등).

한 측면에서, SAR의 AABD는 센티린이다. 본 개시 내용은 또한 다중의 센티린을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 한 측면에서, SAR의 AABD는 DARPIN이다. 본 개시 내용은 또한 다중의 DARPIN을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 유사하게, 본 개시 내용은 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질과 같은 다중의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인을 함유하는 SAR에 관한 것이다.

일부 실시 양태에서, SAR은 다중의 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, 제1 AABD는 제2 AABD에 연결되며, 여기서 제1 및 제2 AABD는 항원에 특이적으로 결합한다. 한 실시 양태에서, SAR에 의해 인식되는 항원은 MHC 복합체에 결합된 펩티드 항원이다. 일부 실시 양태에서, SAR의 2개 이상의 AABD는 동일한 항원을 인식한다. 다른 실시 양태에서, SAR의 2개 이상의 AABD는 상이한 항원을 인식한다.

2세대 CAR과 같은 SAR에 일반적으로 사용되는 scFv는 원치 않는 응집, 클러스터 형성 및 면역원성의 가능성이 있는 반면, 자율 항원 결합 도메인(AABD)의 사용은 면역원성, 비특이적 응집 또는 풀림에 대한 가능성이 상당히 감소된 안정적인 형식을 제공한다. 이는 이중특이성, 이가 또는 이중파라토프 항원 결합 모이어티를 갖는 SAR을 설계할 때 특히 유용하다. 본원의 발명자들에 의해 입증된 바와 같이, 다중 AABD 도메인은 이러한 다량체 형식으로 용이하게 사용될 수 있어서, 하나 초과의 표적 항원 또는 항원의 하나 초과의 에피토프의 동시 표적화를 가능하게 하는 다중특이성 SAR의 생성을 용이하게 한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 항원(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 항원)을 표적화할 수 있는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 에피토프(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 에피토프)를 표적화할 수 있는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 항원 결합 도메인)을 포함하는 SAR을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 각각의 사슬이 경막 도메인, 선택적 활성화 도메인 및 선택적 공동자극 도메인에 작동 가능하게 연결된 0개, 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 사슬을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 코딩한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 경막 도메인, 활성화 도메인 및 선택적 공동자극 도메인에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 단일 사슬 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 코딩한다. 이러한 SAR의 예는 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, 또는 εTFP, γTFP, δTFP 또는 ζTFP의 백본을 갖는 것으로 표시된 SAR이다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(DNA) 4087, 4110-4113, 4118-4120, 서열 번호(PRT) 14777, 14800-14803 및 14808-14810으로 표시된다.

본 개시 내용은 또한 2세대 CAR, K13-CAR 및 TFP(예를 들어, TFPε, TFPγ, TFPδ) 백본을 기반으로 하는 단일 사슬 SAR을 제공한다(표 33 및 34). 본 개시 내용은 CD8SP-BCMA-FHVH-93-SG4S-CD19-FHVH-354-Myc-28z(서열 번호 17667)로 표시되는 BCMA 및 CD19를 표적화하는 2세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR의 모듈식 도메인 구조 및 아키텍처를 갖는 단일 사슬 SAR을 제공한다. BCMA 및 CD19를 표적화하는 2세대 CAR의 백본 상의 또 다른 예시적인 SAR은 CD8SP-CD19-FHVH-354-SG4S-BCMA-FHVH-93-Myc-CD8TM-BBz(서열 번호 17669)이다. BCMA 및 CD19를 표적화하는 TFP의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-93-SG4S-CD19-FHVH-354-CD3e-ECDTMCP-opt2(서열 번호 17696), CD8SP-BCMA-FHVH-93-SG4S-CD19-FHVH-354-CD3d-ECDTMCP-opt2(서열 번호 17697), 및 CD8SP-BCMA-FHVH-93-SG4S-CD19-FHVH-354-CD3g-ECDTMCP-opt2(서열 번호 17698)이다. 본 개시 내용은 서열 번호 17700-17703으로 표시되는 BCMA 및 CD19를 표적화하는 TFP의 백본 상의 추가의 예시적인 SAR의 모듈식 도메인 구조 및 아키텍처를 갖는 단일 사슬 SAR을 제공한다.

본 개시 내용은 서열 번호 17813 및 17815로 표시되는 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-SG4S-CD22-USC1-FHVH-160-Myc-28z 및 CD8SP-CD22-USC1-FHVH-160-SG4S--CD20-vHH-USC1-2HC2D6-Myc-CD8TM-BBz로 표시되는 CD20 및 CD22를 표적화하는 2세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR의 모듈식 도메인 구조 및 아키텍처를 갖는 단일 사슬 SAR을 제공한다. 본 개시 내용은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-SG4S-CD22-USC1-FHVH-160-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-PAC(서열 번호 17816)로 표시되는 K13을 공동발현하고 CD20 및 CD22를 표적화하는 1세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR의 모듈식 도메인 구조 및 아키텍처를 갖는 SAR을 제공한다. 본 개시 내용은 서열 번호 17842-17849로 표시되는 CD20 및 CD22를 표적화하는 TFP의 백본 상의 예시적인 SAR의 모듈식 도메인 구조 및 아키텍처를 갖는 SAR을 제공한다.

BCMA 및 CD38을 표적화하는 2세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-74-SG4S-CD38-FHVH-USC1-32184-Myc-28z 및 CD8SP-CD38-FHVH-USC1-32184-SG4S-BCMA-FHVH-74-Myc-CD8TM-BBz이며 서열 번호 17886 및 17888로 표시된다. K13을 공동발현하고 BCMA 및 CD38을 표적화하는 1세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-74-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-CD38-FHVH-USC1-32184-[hTCRa-T48C]-F-F2A-K13-opt(서열 번호 17893)이다. BCMA 및 CD38을 표적화하는 TFP의 백본 상의 예시적인 SAR은 서열 번호 17915-17922로 표시된다.

CD20 및 CD19를 표적화하는 2세대 CAR의 백본에 대한 예시적인 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-SG4S-CD19-FHVH-354-Myc-28z 및 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-SG4S-CD19-FHVH-354-Myc-CD8TM-BBz이며 서열 번호 17959-17960으로 표시된다. K13을 공동발현하고 CD20 및 CD19를 표적화하는 1세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-SG4S-CD19-FHVH-354-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-PAC(서열 번호 17962)이다. BCMA 및 CD38을 표적화하는 TFP의 백본 상의 예시적인 SAR은 서열 번호 17988-17995로 표시된다.

CD22 및 CEA를 표적화하는 2세대 CAR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-CD22-FHVH-24-SG4S-CEA-aVH-3001-Myc-28z 및 CD8SP-CD22-FHVH-24-SG4S-CEA-aVH-3001-Myc-CD8TM-BBz이며 서열 번호 17521-17522로 표시된다. K13 및 선택적 PAC 모듈을 공동발현하고 CD22 및 CEA를 표적화하는 예시적인 1세대 CAR은 CD8SP-CD22-FHVH-24-SG4S-CEA-aVH-3001-Myc-CD8TM-z-P2A-K13-FLAG-T2A-PAC(서열 번호 17524)이다. CD22 및 CEA를 표적화하는 TFP의 백본 상의 예시적인 SAR은 서열 번호 17550-17557로 표시된다.

CD20 및 CD22를 표적화하는 AABD-TCR의 백본 상의 예시적인 이중 사슬 SAR은CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-IgG1-힌지-[TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD22-USC1-FHVH-160-IgG1-힌지-v2-[TCRd-6MD]이며 서열 번호 17883으로 표시된다. CD20 및 CD22를 표적화하는 AABD-TCR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-CD22-USC1-FHVH-160-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD](서열 번호 17868) 및 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD22-USC1-FHVH-160-[IgG1-CH1-TCRd-6MD](서열 번호 17877)이다. BCMA 및 CD38을 표적화하는 AABD-TCR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-74-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD38-FHVH-USC1-32184-[IgG1-CH1-TCRd-6MD] 및 CD8SP-BCMA-FHVH-74-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-CD38-FHVH-USC1-32184-[IgG1-CH1-TCRa-wt-op2-6MD]이며 서열 번호 17912 및 17914로 표시된다. CD20 및 CD19를 표적화하는 AABD-TCR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-CD19-FHVH-354-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD] 및 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD19-FHVH-354-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]이며 각각 서열 번호 18016 및 18023으로 표시된다. SAR은 본질적으로 모듈식이므로 상기 SAR의 AABD를 상이한 항원을 표적화하는 AABD로 대체하여 해당 항원을 표적화하는 SAR을 개발할 수 있다. 표 33은 CD22 및 PSMA를 표적화하는 SAR의 명칭, 모듈 조성 및 서열 번호를 제공한다. 표 34는 CD22(즉, CD22-FHVH-24) 및 PSMA(즉, PSMA-chVH-71v2)를 표적화하는 AABD를 상이한 항원을 표적화하는 AABD로 대체함으로써 표 33에 열거된 SAR로부터 생성된 SAR의 서열 번호를 제공한다. 그 외에는 표 34에서 구축물의 순서는 표 33의 구축물의 순서와 동일하다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 하나 이상의 항원 특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 경막 도메인, (d) 선택적 공동자극 도메인 및 (e) 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 하나의 항원 특이적 표적화 영역은 항원 특이적 단일 사슬 Fv(scFv) 단편을 포함하고, 제2 항원 특이적 표적화 도메인은 AABD를 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 적어도 2개의 항원 특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 경막 도메인, (d) 선택적 공동자극 도메인 및 (e) 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 하나의 항원 특이적 표적화 영역은 항원 특이적 단일 사슬 Fv(scFv) 단편을 포함하고, 제2 항원 특이적 표적화 도메인은 AABD를 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 다음 일반식을 갖는 이중특이성 또는 다중특이성 합성 항원 수용체를 제공한다: (AABD)n-선택적 링커 도메인-scFv-힌지 도메인-경막 도메인-선택적 하나 이상의 공동자극 도메인-활성화 도메인; 여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 포함할 수 있다. 이러한 SAR의 예는 IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-Gly-Ser-링커-vL-Myc-CD8TM-BBz 및 서열 번호(DNA) 4087로 표시된다. 이 SAR은 CD19를 표적화하는 인간화 hu-mROO5-1 scFv로 표시되는 하나의 항원 결합 도메인과 CD20을 표적화하는 CD20-vHH-2HCD25로 표시되는 제2 항원 결합 도메인을 가지고 있다. 2개의 항원 결합 도메인은 Gly-Ser(G4Sx3v2) 가요성 링커를 통해 연결된다. 이 SAR 구축물은 또한 Myc 태그, 인간 CD8 힌지 및 경막 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 포함한다. 이러한 구축물의 다른 예는 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, 또는 εTFP, γTFP, δTFP 또는 ζTFP의 백본을 갖는 SAR로 표시된다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(DNA) 4087, 4110-4113, 4118-4120, 서열 번호(PRT) 14777, 14800-14803 및 14808-14810으로 표시된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 각각의 사슬이 경막 도메인에 작동 가능하게 연결된 0, 1, 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하고 활성화 도메인이 결여된 하나 이상의 사슬을 포함하는 SAR을 제공한다. 이러한 SAR은 그 자체의 활성화 도메인이 결여되어 있지만, 활성화 도메인을 코딩하는 단백질(들)을 포함하는 신호전달 모듈의 동원에 의해 신호 전달이 가능하다. 이러한 SAR의 예는 SIR, cTCR, Ab-TCR, TCR, αβTFP 또는 γδTFP의 백본을 기반으로 하는 SAR이다. 예시적인 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD가 SIR, cTCR, Ab-TCR, TCR, αβTFP 또는 γδTFP의 사슬 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 부착된 SAR을 제공한다. 예시적인 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD가 SIR, cTCR, Ab-TCR, αβTFP 또는 γδTFP의 사슬 하나 또는 둘 모두를 포함하는 vL 또는 vH 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 부착된 SAR을 제공한다. 예시적인 실시 양태에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 AABD가 TCR의 사슬 하나 또는 둘 모두를 포함하는 Va, Vb, Vg 또는 Vd 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 부착된 SAR을 제공한다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(DNA) 4088-4098, 4107-4109, 4166, 및 3500-3510 및 서열 번호(PRT) 14778-14788, 14797-14799, 14856 및 14190-14200으로 표시된다. 이러한 SAR의 추가 예는 표 25-32에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 다음 일반식을 갖는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 1.5 사슬 또는 이중 사슬 SAR을 제공한다: (AABD)n-선택적 링커 도메인-scFv-선택적 링커-TCR 불변 사슬; 여기서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, pre-TCRα의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(DNA) 4127 및 4128 및 서열 번호(PRT) 14817-14818로 표시된다. 한 실시양태에서, scFv는 가요성 링커에 의해 연결된 αβTCR의 Va 및 Vb 단편 또는 가요성 링커에 의해 연결된 γδTCR로부터 유래된 Vg 및 Vd 단편을 포함하는 단일 사슬 가용성 TCR로 대체된다.

한 실시양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-scFv-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 하나의 사슬; 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-TCR 불변 사슬을 갖는 제2 사슬을 포함하는 1.5 사슬 또는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα(Cα), TCRβ1(Cβ1), TCRβ2(Cβ2), TCRγ(Cγ), TCRδ(Cδ) 또는 pre-TCRα(pre-Cα)의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 한 실시양태에서, SAR의 2개의 사슬은 상보적인 TCR 불변 사슬, 즉, Cα 및 Cβ, preTCRα 및 Cβ, 또는 Cγ 및 Cδ을 포함한다. Cβ 사슬은 Cβ1 또는 Cβ2를 나타낼 수 있다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(DNA) 4127 및 4128 및 서열 번호(PRT) 14817-14818로 표시된다. 한 실시양태에서, scFv는 단일 사슬 가용성 TCR로 대체된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 2개의 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 1.5 사슬 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편에 차례로 연결된 항원 특이적 단일 사슬 Fv(scFv) 단편에 선택적 링커를 통해 연결된 AABD을 포함하고, 제2 사슬은 상보적 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈 (예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다. 이러한 SAR의 예는 CD8SP-MYC-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-SP-CD22-FHVH-24-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-PAC로 표시되고 서열 번호(DNA) 4128 및 서열 번호(PRT) 14818을 갖는다. 이 SAR은 1.5 사슬 SIR(WO2018102795 참조)의 백본을 갖고 돌연변이된 인간 TCRα 불변 사슬(hTCRa-T48C-opt1; 서열 번호 11738)에 프레임 내에서 연결된 MYC 태그를 코딩하는 하나의 사슬을 포함한다. 이 SAR의 제2 사슬은 CD19를 표적화하는 hu-mROO5-1 scFv(서열 번호(DNA) 633 및 서열 번호(PRT) 11323)로 표시되는 하나의 항원 결합 도메인 및 CD22를 표적화하는 완전 인간 vH 도메인 CD22-FHVH-24(서열 번호(DNA) 843 및 서열 번호(PRT) 11533)로 표시되는 제2 AABD를 포함한다. 2개의 항원 결합 도메인은 Gly-Ser(G4Sx3) 가요성 링커를 통해 연결된다. hu-mROO5-1 scFv는 V5 태그를 통해 S57C 돌연변이(hTCRb-S57C-opt1; 서열 번호(PRT) 11749) 모듈을 보유하는 돌연변이된 인간 TCRβ 불변 사슬에 프레임 내에서 연결된다. 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고 P2A 절단성 링커에 의해 분리된다. SAR은 또한 선택적인 퓨로마이신 내성 유전자(PAC)를 코딩한다. 또 다른 이러한 예시적인 SAR 구축물은 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD22-FHVH-24-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC로 표시되고 서열 번호(DNA) 4127 및 서열 번호(PRT) 14817로 표시된다. 이 SAR은 또한 1.5 사슬 SIR(WO2018102795 참조)의 백본을 갖고 돌연변이된 인간 TCRβ 불변 사슬(hTCRb-KACIAH; 서열 번호 11750)에 프레임 내에서 연결된 V5 태그를 코딩하는 하나의 사슬을 포함한다. 이 SAR의 제2 사슬은 CD19를 표적화하는 hu-mROO5-1 scFv로 표시되는 하나의 항원 결합 도메인 및 CD22를 표적화하는 CD22-FHVH-24로 표시되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 2개의 항원 결합 도메인은 Gly-Ser(G4Sx3) 가요성 링커를 통해 연결된다. 인간화 hu-mROO5-1 scFv는 Myc 에피토프 태그를 통해 돌연변이된 인간 TCRα 불변 사슬(hTCRa-CSDVP; 서열 번호 11734) 모듈에 프레임 내에서 연결된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 적어도 2개의 항원 특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 경막 도메인, (d) 선택적 공동자극 도메인 및 (e) 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 항원 특이적 표적화 도메인은 AABD를 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, AABD 둘 모두는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, 및 D 도메인 등)이다. 이러한 SAR의 예는 CD8SP-CD22-FHVH-24-SG4S-PSMA-chVH-71v2-Myc-CD8TM-BBz-T2A-PAC(서열 번호 6464)이고 CD8 신호 펩티드, CD22 표적화 완전 인간 vH 도메인(FVHV), Ser-Glyx4-Ser 링커, PSMA 표적화 단일 vH 도메인, Myc 태그, CD8 힌지 및 막 관통 영역, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 활성화 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-vL 또는 vH 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 단일 사슬, 1.5 사슬 또는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-vL 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 하나의 사슬; 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-vH 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 제2 사슬을 포함하는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 여기서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα(Cα), TCRβ1(Cβ1), TCRβ2(Cβ2), TCRγ(Cγ), TCRδ(Cδ) 또는 pre-TCR(pre-Cα)의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 한 실시 양태에서, SAR의 2개의 사슬은 상보적인 TCR 불변 사슬, 즉, Cα 및 Cβ, preTCRα 및 Cβ, 또는 Cγ 및 Cδ를 포함한다. Cβ 사슬은 Cβ1 또는 Cβ2를 나타낼 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 각각의 사슬이 (a) 하나 이상의 항원 특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 경막 도메인, (d) 선택적 공동자극 도메인 및 (e) 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 2개의 사슬을 포함하는 이중 사슬 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 하나의 항원 특이적 표적화 영역은 제2 사슬에 존재하는 vH 및/또는 vL 단편과 결합하여 가변 단편(Fv)을 생성할 수 있는 vL 및/또는 vH 단편을 포함하고, 제2 항원 특이적 표적화 도메인은 AABD(예를 들어, vHH, SVH, 센티린, 아피바디 등)를 포함한다. 한 실시 양태에서, Fv는 항원에 결합한다. 또 다른 실시 양태에서, Fv는 항원에 결합하지 않는다. 한 실시 양태에서, Fv는 AABD를 포함하는 제2 항원 특이적 표적화 도메인의 부착을 위한 스캐폴드로서 작용한다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 도메인이다.

2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이며 서열 번호 (DNA) 7406 및 서열 번호 (PRT) 18096로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 가지며, 이는 WO2018102795에 기술되었으며 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. SAR 구축물의 한 사슬은 S57C 돌연변이를 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬(hTCRb-S57C)에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vL 단편을 포함하고 SAR의 다른 사슬은 T48C 돌연변이를 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬(hTCRa-T48C)에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vH 단편을 포함한다. SAR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 함께 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-USC1-vHH-2HCD26; 서열 번호 841)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD20-USC1-vHH-2HCD26을 통해 CD20을 표적화한다. SAR은 형식이 모듈식이라는 점에 유의해야 한다. 따라서, SAR의 한 모듈을 다른 모듈로 대체할 수 있다. 예를 들어, hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 상이한 항원을 표적화하는 vL/vH 단편으로 대체될 수 있다. 표 25는 상이한 항원을 표적화하는 vL/vH 단편을 포함하고 CD19를 표적화하는 SVH(CD19-FHVH-354)도 포함하는 SIR 백본 상의 여러 예시적인 이중특이성 SAR의 표적화 항원, 명칭, 핵산 서열 번호 및 아미노산 서열을 제공한다. 표 25에 열거된 SAR에서, vL 단편은 hTCRb-S57C 사슬에 작동 가능하게 연결되고 vH 단편은 hTCRa-T48C 사슬에 작동 가능하게 연결된다. vL 단편이 hTCRa-T48C 사슬 hTCRb-S57C 사슬에 작동 가능하게 연결되고 vH 단편이 hTCRb-S57C 사슬에 작동 가능하게 연결된 SAR을 구축할 수 있다. 상이한 항원을 표적화하는 이러한 SAR 구축물의 예는 서열 번호(DNA) 2014-2177 및 서열 번호(PRT) 12704-12868로 표시된다. 이들 구축물의 vL/vH 단편의 순서는 표 25에 나타낸 구축물의 vL/vH 단편의 순서와 동일하다. 따라서, BCMA-J6M0 vL/vH 단편을 갖는 SAR 구축물은 표 25의 8번째 구축물이다. 따라서, BCMA-J6M0 vL/vH 단편을 갖는 SAR 구축물 CD8SP-CD19-FHVH-354-G4S3-BCMA-J6M0-vL-[hTCRa-T48C]-F-F2A-SP-BCMA-J6M0-vH-[hTCRb-S57C]의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 각각 2021(즉, 2014+8) 및 12711(즉, 12704+8)로 계산될 수 있다. SAR은 형식이 모듈식이기 때문에 hTCRb-S57C 사슬은 생물학적 활성(예를 들어, TCRa 사슬 및/또는 TCR/CD3 복합체와 결합하고/거나 항원 의존성 T 세포 신호전달을 유도하는 능력)을 유지하기만 한다면 결실 돌연변이체 및/또는 변이체로 대체될 수 있다. TCRb 사슬의 예시적인 결실 돌연변이체 및 변이체의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 표 12에 나열되어 있다(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1056-1076 및 서열 번호(DNA) 1114-1127). 유사하게, hTCRa-T48C 사슬은 생물학적 활성(예를 들어, TCRb 사슬 및/또는 TCR/CD3 복합체와 결합하고/거나 항원 의존성 T 세포 신호전달을 유도하는 능력)을 유지하기만 한다면 결실 돌연변이체 및/또는 변이체로 대체될 수 있다. TCRa 사슬의 예시적인 결실 돌연변이체 및 변이체의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 표 12에 나열되어 있다(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1042-1052 및 서열 번호(DNA) 1103-1113).

본 개시 내용은 또한 SIR 및 이중특이성/다중특이성 SAR의 구축에 사용될 수 있는 TCRa 및 TCRb 사슬의 신규 결실 돌연변이체를 기재한다. TCRa 및 TCRb 불변 사슬의 결실 돌연변이를 포함하는 예시적인 SIR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C-opt-d17]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C-opt-d17]이며 핵산 서열 번호 1331 및 아미노산 서열 번호 12021로 표시된다. TCRa 및 TCRb 사슬의 결실 돌연변이를 갖는 SIR/SAR 구축물은 크기가 더 작아서 이들을 코딩하는 렌티바이러스/레트로바이러스 벡터의 역가를 증가시키는 이점을 갖는데, 그 이유는 렌티바이러스/레트로바이러스 벡터의 역가가 삽입체 크기에 반비례하기 때문이다.

본 개시 내용은 다양한 백본(즉, 다양한 TCR 불변 사슬을 가짐) 상에 있고 표 26의 다양한 항원을 표적화하는 vL/vH 단편을 포함하는 몇몇 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR의 표적화 항원, SAR 명칭, 모듈 조성, DNA 서열 번호 및 아미노산 서열 번호를 제공한다. 이들 SAR 구축물은 CD19를 표적화하는 완전 인간 단일 vH 도메인(CD19-FHVH-354) 및/또는 CD22를 표적화하는 완전 인간 단일 vH 도메인(CD22-FHVH-24)을 포함한다. 각 시리즈의 첫 번째 구축물의 명칭과 조성은 표 26에 나와 있으며, 이를 사용하여 해당 시리즈에 존재하는 TCR 불변 사슬 모듈을 결정할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열 번호 2178-2343으로 표시되는 구축물에서 vL 단편이 [hTCRbECD-CD3zECDTMCP-opt] 모듈에 작동 가능하게 연결된 반면 vH 단편이 [hTCRaECD-CD3zECDTMCP-opt2] 모듈에 작동 가능하게 연결됨은 표 26으로부터 결정할 수 있다. 이 시리즈의 상이한 구축물의 순서는 표 25에 나타낸 시리즈의 구축물의 순서와 동일하므로 이 시리즈의 상이한 구축물의 vL/vH 단편은 표 25의 동일한 vL/vH 단편을 갖는 구축물로부터 결정할 수 있다. 유사한 접근법을 사용하여 표 25를 참조하여 표 26에 나열된 시리즈의 상이한 vL/vH 단편을 보유하는 다른 구축물의 서열 번호를 결정할 수 있다. 표 25-26에 기재된 SAR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

FMC63 scFv로부터 유래된 vL 및 vH 단편을 기반으로 하고 상이한 TCR 불변 사슬을 보유하는 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR의 핵산 및 아미노산 서열 번호가 표 26에 제공되어 있다. 다른 scFv 단편으로부터 유래된 vL 및 vH 단편을 기반으로 하는 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 FMC63 scFv의 vL 및 vH 단편을 표 25에 열거된 SAR을 포함하는 vL 및 vH 단편으로 대체함으로써 유도될 수 있다. 표 26의 상이한 vL/vH 단편을 포함하는 SAR 구축물의 순서는 표 25에 나타낸 SAR의 순서와 동일하다.

2개의 사슬을 포함하는 또 다른 예시적인 이중 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]이며 서열 번호(DNA) 5037 및 서열 번호(PRT) 15727로 표시된다. 이 SAR 구축물에서 SAR의 한 사슬은 IgCL 링커를 통해 인간 TCRg(TCRg-6MD)의 절단된 불변 사슬에 융합된 hu-mROO5-1 vL 단편을 포함하고 SAR의 다른 사슬은 IgG1-CH1 링커를 통해 인간 TCRd(TCRd-6MD)의 절단된 불변 사슬에 융합된 hu-mROO5-1 vH 단편을 포함한다. SAR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 집합적으로 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-vHH-2HCD25)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD20-USC1-vHH-2HCD25를 통해 CD20을 표적화한다. 표 26은 vL 단편이 [IgCL-TCRg-6MD] 모듈에 작동 가능하게 연결되고 vH 단편이 [IgG1-CH1-TCRd-6MD] 모듈에 작동 가능하게 연결되고 상이한 항원을 표적화하는 vL/vH 단편을 포함하는 몇몇 예시적인 이중특이성 SAR의 핵산 서열 번호(2839-3003) 및 아미노산 서열 번호(13529-13693)를 제공한다. 이들 SAR 구축물은 또한 CD19를 표적화하는 SVH(CD19-FHVH-354)를 포함한다. 이 시리즈의 상이한 구축물의 순서는 표 25에 나타낸 시리즈의 구축물의 순서와 동일하므로, 이 시리즈의 상이한 구축물의 vL/vH 단편은 표 25에 나열된 동일한 vL/vH 단편을 갖는 구축물로부터 결정될 수 있다. SAR은 형식이 모듈식이므로, SAR의 기능적 활성(즉, 표적 항원에 결합하는 능력, 항원 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력, TCR/CD3 복합체로 조립하는 능력 등)이 유지되는 한 하나의 모듈을 다른 모듈 또는 이의 변이체로 대체하는 것이 가능하다. 따라서, 예시적인 실시 양태에서, SAR의 vL 단편은 [IgG1-CH1-TCRd-6MD] 모듈 또는 이의 변이체에 작동 가능하게 연결되고, vH 단편은 [IgCL-TCRg-6MD] 모듈 또는 이의 변이체에 작동 가능하게 연결된다. IgCL 및 IgG1-CH1 링커는 SAR의 기능적 활성(즉, 표적 항원에 결합하는 능력, 항원 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력, TCR/CD3 복합체로 조립하는 능력 등)이 유지되는 한 다른 링커로 대체될 수 있다. 예시적인 이러한 링커는 표 13에 제공되어 있다. 바람직한 실시 양태에서, 이중특이성 SAR의 한 사슬은 IgCL(서열 번호 11832) 또는 이의 변이체를 포함하는 반면 상보적 사슬은 서열 번호 11833-11847로 표시되는 링커를 포함한다. 표 13은 또한 SAR의 구축에 링커 역할을 할 수 있는 TCR 불변 사슬의 성분을 나열한다. TCRa/TCRα 불변 사슬을 기반으로 하는 예시적인 링커는 서열 번호 11848-11849, 11857-11859로 표시된다. TCRb/TCRβ 불변 사슬을 기반으로 하는 예시적인 링커는 서열 번호 11850-11851, 11856, 11860-11861로 표시된다. TCRg/TCRγ 불변 사슬을 기반으로 하는 예시적인 링커는 서열 번호 11852-11853, 11862, 11863으로 표시된다. TCRd/TCRδ 불변 사슬을 기반으로 하는 예시적인 링커는 서열 번호 11854-11855, 11862, 11864-11865로 표시된다. 한 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 한 사슬은 TCRa 사슬을 기반으로 하는 링커를 포함하는 반면 다른 사슬은 TCRb 사슬을 기반으로 하는 링커를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 한 사슬은 TCRg/TCRγ 사슬을 기반으로 하는 링커를 포함하는 반면, 다른 사슬은 TCRd/TCRδ 사슬을 기반으로 하는 링커를 포함한다. 한 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 한 사슬은 TCRa 사슬을 기반으로 하는 링커를 포함하는 반면 다른 사슬은 IgCL(서열 번호 11832)을 기반으로 하는 링커를 포함한다. 면역글로불린 유사 모듈을 기반으로 하는 다른 링커는 당 업계에 공지되어 있으며 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태에서 사용될 수 있다. 마지막으로, TCR 사슬 및 모듈 외에도, CD20-vHH-2HCD25 단편은 CD20의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프를 표적화하는 또 다른 AABD로 대체될 수 있다. 예시적인 AABD는 표 5, 7-10에 제공되어 있다. 상이한 항원을 표적화하는 추가적인 AABD(예를 들어, vHH, SVH, 센티린 등)는 당 업계에 공지되어 있다.

2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[IgG1-CH1-TCRa-wt-op2-6MD]이며 DNA 서열 번호 5039 및 PRT 서열 번호 15729로 표시된다. 이 SAR은 TCRg-MD 및 TCRd-MD 모듈이 (TCRb-wt-opt2-6MD; 서열 번호 1126) 및 (TCRa-wt-op2-6MD; 서열 번호 1112) 모듈로 각각 대체된 것을 제외하고는 서열 번호(DNA) 5037 및 서열 번호(PRT) 15727로 표시된 SAR 구축물 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]와 유사하다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD20-USC1-vHH-2HCD25를 통해 CD20을 표적화한다. 표 26은 vL 단편이 [TCRb-wt-opt2-6MD] 모듈에 작동 가능하게 연결되고 vH가 [TCRa-wt-op2-6MD] 모듈에 작동 가능하게 연결되고 상이한 항원을 표적화하는 vL/vH 단편을 포함하는 몇몇 예시적인 이중특이성 SAR의 DNA 서열 번호(3169-3333) 및 아미노산 서열 번호(13859-14023)를 제공한다. 이들 SAR은 또한 CD19를 표적화하는 SVH(CD19-FHVH-354; 서열 번호 836)를 포함한다. 이 시리즈에서 상이한 구축물의 순서는 표 25에 나타낸 시리즈의 구축물의 순서와 동일하므로 이 시리즈의 상이한 구축물의 vL/vH 단편은 표 25에 나열된 동일한 vL/vH 단편을 갖는 구축물로부터 결정될 수 있다. SAR은 형식이 모듈식이므로, SAR의 기능적 활성이 유지되는 한 한 모듈을 또 다른 모듈 또는 이의 변이체로 대체하는 것이 가능하다. 따라서, 예시적인 실시 양태에서, SAR의 vL 단편은 [TCRa-wt-op2-6MD] 모듈 또는 이의 변이체에 작동 가능하게 연결되고 vH 단편은 [TCRb-wt-opt2-6MD] 모듈 또는 이의 변이체에 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, CD20-vHH-2HCD25 단편은 CD20의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프를 표적화하는 또 다른 AABD로 대체될 수 있다. 예시적인 AABD는 표 5, 7-10에 제공되어 있다. 상이한 항원을 표적화하는 추가적인 AABD(예를 들어, vHH, SVH, 센티린 등)는 당 업계에 공지되어 있다.

2개의 사슬을 포함하는 또 다른 예시적인 이중 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD38-USC1-FHVH-32184-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이고 DNA 서열 번호 7405 및 PRT 서열 번호 18095로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 갖는다. SAR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 이량체화되어 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD38(CD38-USC1-FHVH-32184)을 표적화하는 SVH 단편은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vL 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD38-USC1-FHVH-32184를 통해 CD38을 표적화한다.

2개의 사슬을 포함하는 또 다른 예시적인 이중 사슬 삼중특이성 SAR은 CD8SP-CD38-USC1-FHVH-32184-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이고 DNA 서열 번호 7408 및 PRT 서열 번호 18098로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 갖는다. SIR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 이량체화되어 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD38을 표적화하는 SVH 단편(CD38-USC1-FHVH-32184)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vL 단편의 N-말단에 융합된다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-USC1-vHH-2HCD26)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD38-USC1-FHVH-32184를 통해 CD38을 표적화하고 CD20-USC1-vHH-2HCD26을 통해 CD20을 표적화한다. 유사한 형식을 갖는 또 다른 예시적인 삼중특이성 SAR 구축물은 CD8SP-CD19-FHVH-354-G4S3-FMC63-vL-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-CD22-FHVH-24-FMC63-vH-[hTCRa-T48C-opt]이고 각각 서열 번호 (DNA) 2344 및 서열 번호 (PRT) 13034로 표시된다. FMC63의 vL/vH가 다른 scFv로부터 유래되고 상이한 항원을 표적화하는 vL/vH 단편으로 대체된 이 형식의 추가 SAR은 표 26(서열 번호 2344-2508 및 13034-13198)에 제공되어 있다. 이들 구축물의 vL/vH 단편의 순서가 표 25에서 구축물의 vL/vH 단편의 순서와 동일하기 때문에 이들 구축물의 vL/vH 단편은 표 25를 조사하여 이들의 서열 번호로부터 결정될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 이들 구축물의 TCR 불변 사슬은 SAR의 기능적 활성(즉, 표적 항원에 결합하는 능력, 항원 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력, TCR/CD3 복합체로 조립하는 능력 등)이 유지되는 한 표 12에 기재된 다른 TCR 불변 사슬 및 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체로 대체될 수 있다. TCRa 및 TCRb 불변 사슬의 결실 돌연변이를 함유하는 예시적인 SAR은 CD8SP-CD38-USC1-FHVH-32184-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C-opt-del17]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C-opt-del17]이고 핵산 서열 1332 및 아미노산 서열 12022로 표시된다. TCRa 및 TCRb 사슬의 결실 돌연변이를 갖는 SIR/SAR 구축물은 크기가 더 작아서 이들을 코딩하는 렌티바이러스/레트로바이러스 벡터의 역가를 증가시키는 이점을 갖는데, 이는 렌티바이러스/레트로바이러스 벡터의 역가가 삽입체 크기에 반비례하기 때문이다. 마지막으로, TCR 사슬 및 모듈 외에도, CD38-USC1-FHVH-32184 및 CD20-USC1-vHH-2HCD26 단편은 상이한 항원 또는 에피토프를 표적화하는 다른 AABD로 대체될 수 있다. 예시적인 AABD는 표 5, 7-10에 제공되어 있다. 상이한 항원을 표적화하는 추가적인 AABD(예를 들어, vHH, SVH, 센티린 등)는 당 업계에 공지되어 있다.

2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중 사슬 삼중특이성 SAR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-CD22-USC1-FHVH-160-G4Sx2-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이고 DNA 서열 번호 7407 및 PRT 서열 번호 18097로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 갖는다. SIR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 이량체화되어 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-USC1-vHH-2HCD26)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 또한, CD22를 표적화하는 SVH 단편(CD22-USC1-FHVH-160)은 또 다른 글리신-세린 링커를 통해 CD20 vHH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고, CD22-USC1-FHVH-160을 통해 CD20을 표적화하고, CD20-USC1-vHH-2HCD26을 통해 CD20을 표적화한다. SAR은 형식이 모듈식이므로, TCR 사슬은 다른 TCR 사슬 또는 이의 변이체로 대체될 수 있으며 AABD는 다른 AABD 또는 이의 변이체로 대체될 수 있으며 vL/vH 단편은 다른 vL/vH 단편 또는 이의 변이체로 대체될 수 있다.

2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중 사슬 4중특이성 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD38-FHVH-309021-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이며 DNA 서열 번호 5362 및 PRT 서열 번호 16052로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 갖는다. SIR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 이량체화되어 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-vHH-2HCD25; 서열 번호 835)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. CD38을 표적화하는 SVH 단편(CD38-FHVH-309021; 서열 번호 846)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1-vL 단편의 N-말단에 융합된다. BCMA를 표적화하는 SVH(BCMA-FHVH-33; 서열 번호 856)는 또 다른 글리신-세린 링커를 통해 CD38-FHVH-309021 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고, CD20-vHH-2HCD25를 통해 CD20을 표적으로 하며, CD38-FHVH-309021을 통해 CD38을 표적화하고 BCMA-FHVH-33을 통해 BCMA를 표적화한다. SAR은 형식이 모듈식이므로, TCR 사슬은 다른 TCR 사슬 또는 이의 변이체로 대체될 수 있으며, AABD는 다른 AABD 또는 이의 변이체로 대체될 수 있으며 vL/vH 단편은 다른 vL/vH 단편 또는 이의 변이체로 대체될 수 있다.

2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중 사슬 5중특이성 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD38-FHVH-309021-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-CD22-FHVH-158-G4Sx2-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]이며 DNA 서열 번호 5437 및 PRT 서열 번호 16127로 표시된다. 이 SAR 구축물은 DNA 서열 번호 5362 및 PRT 서열 번호 16052로 표시되는 구축물과 유사하지만 CD22를 표적화하는 SVH 단편(CD22-FHVH-158; 서열 번호 848)이 추가로 글리신-세린 링커를 통해 CD20-vHH-2HCD25 단편의 N-말단에 융합되어 있다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고, CD20-vHH-2HCD25를 통해 CD20을 표적화하고, CD38-FHVH-309021을 통해 CD38을 표적화하고 BCMA-FHVH-33을 통해 BCMA를 표적화한다. SAR은 형식이 모듈식이므로, TCR 사슬은 다른 TCR 사슬 또는 이의 변이체로 대체될 수 있으며, AABD는 다른 AABD 또는 이의 변이체로 대체될 수 있으며 vL/vH 단편은 다른 vL/vH 단편 또는 이의 변이체로 대체될 수 있다. SAR을 포함하는 vL/vH 단편은 기원이 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간일 수 있다.

선행하는 예에서, 이중특이성 및 다중특이성 SAR 백본은 하나 이상의 AABD가 작동 가능하게 연결된 vL 및 vH 단편으로 구성된다. 본 개시 내용은 또한 백본이 TCR로부터 유래된 가변 단편(Va/Vb 또는 Vg/Vd)으로 구성된 SAR을 기재한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-TCR 가변 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 단일 사슬, 1.5 사슬 또는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 가변 단편은 Va, Vb, Vg 또는 Vd를 나타내고, TCR 불변 사슬은 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-Va 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 하나의 사슬; 및 (AABD)n-선택적 링커 도메인-Vb 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 제2 사슬을 포함하는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα(Cα), TCRβ1(Cβ1), TCRβ2(Cβ2), TCRγ(Cγ), TCRδ(Cδ) 또는 pre-TCRα(pre-Cα)의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 한 실시 양태에서, SAR의 2개의 사슬은 상보적인 TCR 불변 사슬, 즉, Cα 및 Cβ, preTCRα 및 Cβ, 또는 Cγ 및 Cδ를 포함한다. Cβ 사슬은 Cβ1 또는 Cβ2를 나타낼 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-Vg 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 하나의 사슬; 및 (AABD)n-선택적 링커 도메인-Vg 단편-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 제2 사슬을 포함하는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα(Cα), TCRβ1(Cβ1), TCRβ2(Cβ2), TCRγ(Cγ), TCRδ(Cδ) 또는 pre-TCRα(pre-Cα)의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 한 실시 양태에서, SAR의 2개의 사슬은 상보적인 TCR 불변 사슬, 즉, Cα 및 Cβ, preTCRα 및 Cβ, 또는 Cγ 및 Cδ를 포함한다. Cβ 사슬은 Cβ1 또는 Cβ2를 나타낼 수 있다.

AABD가 Va 및/또는 Vb 사슬에 작동 가능하게 연결된 예시적인 SAR은 CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]-F-F2A-PAC이며 핵산 서열 번호 3502 및 아미노산 서열 번호 14192로 표시된다. 이 SAR 구축물은 S57C 돌연변이를 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬(hTCRb-S57C)에 융합된 MC7G5-Vb 단편 및 T48C 돌연변이를 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬(hTCRa-T48C)에 융합된 MC7G5-Va 단편을 갖는다. SAR의 MC7G5-Va 및 MC7G5-Vb 단편은 MR1에 결합한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-vHH-2HCD25)은 글리신-세린 링커(G4Sx3v2)를 통해 MC7G5-Va 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 MC7G5 Va/Vb 단편을 통해 MR1을 표적화하고 CD20-vHH-2HCD25를 통해 CD20을 표적화한다.

γδ TCR의 백본을 기반으로 하는 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-TCR-Vg9-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-TCR-Vd2-F-F2A-PAC(서열 번호 22201)이다. 이 SAR은 Vγ9/Vδ2 TCR의 백본을 갖는다. Vγ9/Vδ2 T 세포는 말초혈액에서 백혈구 집단의 소량의 비통상적인 성분을 나타내지만(0.5-5%), 침입하는 병원체에 의한 '위험'을 감지하데 있어 초기에 필수적인 역할을 하는 것으로 가정된다. 이들은 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP) 생합성의 비-메발로네이트 경로의 천연 중간체인 동일한 작은 미생물 화합물 (E)-4-히드록시-3-메틸-부트-2-에닐 피로포스페이트(HMB-PP)를 인식한다. Vγ9/Vδ2 백본 상의 상기 SAR은 또한 G4S 링커를 통해 Vg9 가변 도메인의 N-말단에 부착된 BCMA-FHVH-93을 통해 BCMA를 인식하고 Vd2 가변 도메인의 N-말단에 부착된 CD20-vHH2-HCD25를 통해 CD20을 인식할 수 있다. BCMA-FHVH-93 및 CD20-vHH2-HCD25를 다른 항원에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, AABD)으로 대체하여 Vγ9/Vδ2를 기반으로 하는 추가 SAR을 구축할 수 있다. 또한 서열 번호 3500-3595을 갖는 SAR의 MC.7.G5(MC7G5) Va 및 Vb 도메인을 Vγ9/Vδ2 가변 도메인으로 대체함으로써 Vγ9/Vδ2를 기반으로 하는 예시적인 SAR을 구축할 수 있다.

본 개시 내용은 또한 선행하는 섹션에 기재된 SAR의 vL 및/또는 vH 단편이 T 세포 수용체(TCR)로부터 유래된 Va 및/또는 Vb 단편으로 대체된 SAR을 기재한다. 백본으로서 단일형 MHC I형 관련 단백질(MR1)인 MIR1에 대해 지시되고 CD19 및/또는 CD20을 표적화하는 AABD를 보유하는 TCR(MC7G5)의 Va 및 Vb 단편을 기반으로 하는 몇 가지 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR이 표 27에 제공되어 있다. 이들 SAR의 조성은 그의 명칭으로부터 결정될 수 있다. TCR을 기반으로 하는 추가 SAR이 표 28에 나열되어 있다. 표 27-28에 기재된 SAR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

본 개시 내용은 또한 하나 이상의 AABD가 TCR로부터 유래된 가변 단편(예를 들어, Va, Vb, Vg 또는 Vd)의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 예시적인 SAR을 제공한다. 이러한 SAR 구축물의 예시는 CD8SP-Sph-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]이며 핵산 서열 번호 3535 및 아미노산 서열 번호 14225로 표시된다. MC7G5 백본을 기반으로 하는 예시적인 삼중특이성 SAR은 CD8SP-Sph-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]이며 핵산 서열 3578 및 아미노산 서열 14268로 표시된다.

백본으로서 단일형 MHC I형 관련 단백질(MR1)인 MIR1에 대해 지시되고 CD19 및/또는 CD20을 표적화하는 AABD를 보유하는 TCR(MC7G5)의 Va 및 Vb 단편을 기반으로 하는 몇 가지 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR이 표 27에 제공되어 있다. 이들 SAR의 조성은 그의 명칭으로부터 결정될 수 있다. 이들 SAR의 한 모듈을 다른 모듈로 대체하는 것이 가능하다. 대체될 수 있는 모듈에는 Va/Vb 단편, TCR 불변 사슬(즉, hTCRb-S57C 및 hTCRa-T48C) 및 AABD(즉, CD20-vHH-2HCD25)가 포함된다. 상이한 TCR 가변 도메인, TCR 불변 사슬 및 AABD를 기반으로 하는 추가 SAR이 표 28에 나열되어 있다. 표 27에 나열된 MC7G5 기반 SAR의 Va/Vb 단편이 HLA-A2와 복합체를 이루는 CMV-pp65 유래 펩티드(서열 번호 21452)를 표적화하는 TCR로부터 유래된 Va/Vb로 대체된 SAR은 핵산 서열 번호 3891-3988 및 아미노산 서열 번호 14581-14678으로 각각 표시된다(표 28). 유사하게, 표 27에 나열된 MC7G5 기반 SAR의 Va/Vb 단편이 HLA-A2와 복합체를 이루는 NYESO-1 유래 펩티드(서열 번호 21461)를 표적화하는 TCR에서 유래된 Va/Vb로 대체된 예시적인 SAR은 핵산 서열 번호 3989-4086 및 아미노산 서열 번호 14679-14776으로 각각 표시된다(표 28). 이들 구축물의 순서는 표 27에 열거된 MC7G5 기반 구축물의 순서와 유사하다.

본 개시 내용은 또한 하나의 사슬이 항체(예를 들어, vL 또는 vH)로부터 유래된 가변 단편을 포함하고 제2 사슬이 TCR(예를 들어, Va, Vb, Vg 또는 a Vd)로부터 유래된 가변 단편을 포함하는 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 SAR을 제공한다. 이러한 SAR 폴리펩티드의 예는 서열 번호(PRT) 23020 및 23021로 표시된다. 이러한 SAR에서 항체 및 TCR로부터 유래된 가변 단편은 하나 이상의 AABD의 부착을 위한 스캐폴드 역할을 할 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 단일 사슬, 1.5 사슬 또는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 한 실시 양태에서, 링커는 Ig 링커 도메인(예를 들어, IgCL, IgG1-CH1 등)이다. 예시적인 Ig(또는 Ig 유사) 링커 도메인이 표 13에 제시되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 어댑터 결합 도메인이다.

한 실시 양태에서, 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 일반식 (AABD)n-Ig 링커 도메인-TCR 불변 사슬을 갖는 하나의 사슬; 및 일반식 (AABD)n-Ig 링커 도메인-TCR 불변 사슬을 갖는 제2 사슬을 포함하는 이중 SAR을 제공하며, 식에서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이고 TCR 불변 사슬은 TCRα(Cα), TCRβ1(Cβ1), TCRβ2( Cβ2), TCRγ(Cγ), TCRδ(Cδ) 또는 pre-TCRα(pre-Cα)의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 나타낸다. 한 실시 양태에서, SAR의 2개의 사슬은 상보적인 TCR 불변 사슬, 예를 들어 Cα 및 Cβ, preTCRα 및 Cβ, 또는 Cγ 및 Cδ을 포함한다. Cβ 사슬은 Cβ1 또는 Cβ2를 나타낼 수 있다. 한 실시 양태에서, SAR의 2개의 사슬은 상보적인 Ig 링커 도메인 예를 들어, IgCL 및 IgG1-CH1, IgCL 및 IgG2-0C-CH1, 또는 IgCL(서열 번호 11832) 및 IgG4-CH1(서열 번호 11842) 등을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR에 대한 하나의 사슬은 IgCL 링커 도메인(서열 번호(DNA) 1142 및 서열 번호(PRT) 11832)을 포함하고 SAR의 제2 사슬은 IgG1-CH1 링커 도메인(서열 번호 (DNA) 1143 및 서열 번호 (PRT) 11833)을 포함한다. 추가의 Ig 링커 도메인은 서열 번호(DNA) 1149-1157 및 서열 번호(PRT) 11839-11847(표 13)에 제시되어 있으며 IgG1-CHI 링커 도메인을 대체할 수 있다. 마지막으로, 다른 Ig 또는 Ig 유사 링커 도메인이 당 업계에 공지되어 있고 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태에서 사용될 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, 센티린, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 어댑터 결합 도메인이다.

CD20-vHH-2HCD25 도메인이 NKG2D(NKG2D-G4Sx3-NKG2D)의 리간드 결합 도메인으로 대체된 MC7G5 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-NKG2D-G4Sx3-NKG2D-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]로 표시되고 핵산 서열 번호3601 및 아미노산 서열 번호 14291을 갖는다. 표 27에 열거된 SAR의 CD20-vHH-2HCD25 도메인이 NKG2D의 리간드 결합 도메인으로 대체된 다른 예시적인 SAR은 핵산 서열 번호 3597-3694 및 아미노산 서열 번호 14287-14384(표 28)로 표시된다. 이들 구축물의 순서는 표 27에 열거된 CD20-vHH-2HCD25 함유 구축물의 순서와 유사하다. NKG2D의 리간드 결합 도메인을 포함하는 SAR 구축물은 MICA 및 MICB와 같은 NKG2D 리간드를 발현하는 세포에 결합할 수 있고 이에 반응할 수 있다.

여러 세포 신호전달 경로의 조합, 시간적 및 논리적 제어를 위한 보편적인 접근법을 제공함으로써 SAR 세포(예를 들어, SAR-T, SAR-NK, SAR-단핵구/대식세포 등)의 개선된 안전성 및 효능을 제공하는 방법 및 조성물이 본원에 기재된다.

한 실시 양태에서, 특이성은 2개 이상의 항원을 검출할 수 있는 SAR을 사용함으로써 향상된다. 2개 초과의 항원을 감지하는 능력은 종양 특이성을 더욱 향상시킬 수 있다. 또한, SAR T 세포가 표적에 있는 경우에도 T 세포의 과활성화로 인해 사이토카인 방출 증후군이 발생하면 부작용이 계속 발생할 수 있다. 본 개시 내용은 이러한 부작용 중 일부를 완화하기 위해 Kill 및 ON 스위치를 발현하는 SAR을 구축하기 위한 유용한 설계 및 구성을 제공한다. 그러나 이러한 스위치는 대부분 마스터 스위치 역할을 하므로 결과적으로 미세 제어가 부족하다. 자연 면역 세포 활성화의 제어는 여러 공동자극 및 공동 억제 신호전달 경로의 균형을 통해 달성되기 때문에, 이러한 신호전달 경로에 대한 조정 가능하고 시간적인 제어를 제공하는 전략은 SAR 발현 세포(또는 SAR 세포) 성능을 최적화하는 데 중요하다. 이러한 과제는 SAR 세포 반응의 지능적인 제어가 필요함을 보여준다.

표적 항원을 직접 인식하지 않지만 대신에 어댑터 분자(CAR-어댑터)와 접촉하고 차례로 표적 항원에 결합하는 단일 사슬 키메라 수용체(예를 들어, 2세대 CAR)를 포함하는 범용 CAR 구축물이 설명되었다. 이러한 범용 CAR 또는 모듈식 CAR은 종양 이질성 및 항원 탈출, 독성, 고갈로 이어지는 강장성 신호 및 면역원성과 같은 종래의 CAR이 직면한 문제에 대한 잠재적인 해결책으로 제안되었다. 따라서, 범용 CAR-T 세포의 활성은 면역학적 시냅스의 형성을 가능하게 하는 CAR-어댑터의 존재에 엄격하게 의존한다. 결과적으로, 시냅스의 형성은 CAR-어댑터의 각각의 특성에 의존하며, 종양 항원에 대한 CAR-어댑터의 친화도, 범용 CAR의 선택된 세포외 도메인(ECD)에 대한 친화도, CAR의 발현 수준, 반감기 및 생체 분포가 모두 중요하다. 차세대 CAR 구축물(예를 들어, SIR, cTCR, Ab-TCR, TFP 및/또는 TCR 등)은 발현 수준 및 표적에 대한 친화도에 있어 2세대 CAR과 상이하기 때문에, 차세대 CAR 구축물에 어댑터를 혼입하기 위한 적절한 조성 및 구성이 현재 알려져 있지 않다. 유사하게, 어댑터를 다중 사슬 구축물(예를 들어, 이중 사슬 SIR, cTCR, Ab-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 TCR)에 혼입하기 위한 적절한 조성 및 구성이 알려져 있지 않다. 마지막으로, 이중특이성, 이중파라토프, 다중특이성 및 다중파라토프 특성을 가진 차세대 CAR 구축물(예를 들어, SIR, cTCR, Ab-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 TCR 등)에 어댑터를 혼입하기 위한 적절한 조성 및 구성이 현재 알려져 있지 않다.

(a) ON/OFF 스위치 역할을 하고, (b) 다중 항원을 감지하고 논리 계산을 수행하고, (c) 다중 신호전달 경로를 독립적으로 조절하는 능력을 가지며 SAR 세포 요법을 최적화하는 데 필요한 제어를 제공할 범용 SAR 플랫폼의 새로운 조성, 설계 및 구성이 본원에 기재된다. 이러한 목적을 위해 본원에 기재된 분할, 범용, 프로그래밍 가능 및 재구성 가능한 UNI-SAR 플랫폼이 사용된다. 중요하게는, UNI-SAR 플랫폼이 환자의 면역 세포에 대한 추가 조작 없이 새로운 표적을 수용할 수 있다는 것이다. 한 실시 양태에서, UNI-SAR 플랫폼은 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구 등) 상에서 발현되는 범용 수용체 및 종양-표적화 항원 결합 어댑터(SAR-어댑터)로 구성된 2성분 수용체 시스템이다. 한 실시 양태에서, 범용 수용체는 세포 신호를 개시할 수 있거나 세포 신호를 개시할 수 있는 하나 이상의 신호전달 사슬을 동원하는 신호전달 사슬에 대한 어댑터 결합 도메인을 포함하는 AABD, scFv 또는 Fv의 융합체로부터 생성된다. SAR-어댑터 분자는 어댑터(예를 들어, 류신 지퍼 도메인, 예를 들어, RZIP, EZIP 등)와 항원 결합 모이어티(예를 들어, scFv, vHH, FHVH, 센티린 등)의 융합체로부터 생성된다. SAR 어댑터의 항원 결합 모이어티는 항원에 결합하고 어댑터(예를 들어 류신 지퍼 도메인, 예를 들어 RZIP)는 면역 세포 상의 UNI-SAR에 결합하여 이를 활성화한다. 이 시스템은 또한 적정 가능한 유도원으로서 SAR 어댑터를 가진 조정 가능한 스위치로서 기능을 한다. 그러나 기존의 다른 분할 CAR 시스템과 달리 독립적으로 다중 신호전달 경로를 제어하고 논리 연산을 수행하는 직교 UNI-SAR/SAR 어댑터 쌍이 본원에 기재된다.

당 업계에 기술된 분할 및 범용 CAR의 한 가지 제한은 CAR 발현 세포를 활성화하기 위해 SAR 어댑터의 반복 및/또는 연속 투여에 대한 필요성이며, 이는 불편함, 비용 증가, 감염성 및 알레르기 합병증을 유발한다. 따라서. 일부 상황에서는 구성적 단일특이성, 이중특이성 및/또는 다중특이성 표적화 모듈이 내장된 세포에 결합하고 이를 표적화할 수 있지만 해당 항원에 대한 항원 결합 도메인(들)을 포함하는 적절한 SAR 어댑터와 함께 사용될 때 추가 항원을 표적화하는 추가된 유연성(즉, 보편적 표적화 능력)을 갖는 SAR 구축물을 갖는 것이 바람직할 것이다.

본 개시 내용은 구성적(또는 내장) 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 표적화 모듈을 갖지만 추가로 적절한 SAR 어댑터와 함께 사용할 때 보편적인 표적화 속성을 또한 부여하는 하나 이상의 어댑터 결합 도메인을 갖는 UNICON-SAR로 지칭되는 SAR에 대한 신규한 조성, 구성 및 설계를 제공한다. 예시적인 실시 양태에서, CD19, CD19 및 CD20, CD19, CD20 및 BCMA, 또는 CD19, CD20 및 PSMA를 발현하는 세포에 구성적으로 결합하고 이를 표적화할 수 있지만 또한 Her2 항체(예를 들어, 허셉틴) 또는 Her2 결합 도메인을 포함하는 또 다른 SAR 어댑터의 존재하에 Her2 발현 세포에 대해 재지시될 수 있게 하는 하나 이상의 어댑터 결합 도메인을 포함하는 SAR이 제공된다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, CD19, CD19 및 CD22, CD19, CD22 및 BCMA, 또는 CD19, CD22 및 Her2를 발현하는 세포에 구성적으로 결합하고 이를 표적화할 수 있지만 또한 CD20 항체(예를 들어, 리툭시맙) 또는 CD20 결합 도메인을 포함하는 또 다른 SAR 어댑터의 존재하에 CD20 발현 세포에 대해 재지시될 수 있게 하는 하나 이상의 어댑터 결합 도메인을 포함하는 SAR이 제공된다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호 22173 및 22176에 제공된다. 이러한 UNICON-SAR 발현 세포의 이점은 내장된 표적화 모듈을 통해 구성적으로 표적 항원 발현 세포(예를 들어 암세포)에 대해 활성적이지만 또한 필요한 경우 SAR 어댑터를 사용하여 추가 항원에 대해 재지시될 수 있는 유연성을 갖는다는 것이다. 따라서, UNICON-SAR 설계는 향상된 효율성, 다중 표적화, 정밀도, 유연성, 안전성, 편의성 및 경제성을 제공한다. UNISAR 및 UNICON-SAR 플랫폼은 류신 지퍼(예를 들어, RZIP 및 EZIP), E4, K4, D 도메인, 비천연 NKG2D 기반 수용체-리간드 쌍(예를 들어, NKG2D-YA) 및 Fc 결합 모듈을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 개시 내용에 기재된 임의의 어댑터를 기반으로 할 수 있다.

한 실시 양태에서, UNI-SAR 플랫폼은 SAR 및 다양한 신호전달 사슬의 세포외 부분으로 류신 지퍼를 사용한다. 동족 류신 지퍼는 항원 결합 모이어티(예를 들어, 특정 scFv)에 융합된다. 항체/지퍼 융합체의 투여는 T 세포를 활성화하여, 용량 의존적 방식으로 ON 스위치로 작용한다. 류신 지퍼는 전하 상호작용을 통해 이종체 구조를 형성할 수 있는 단백질 도메인 부류이다. 류신 지퍼는 많은 직교 쌍의 류신 지퍼를 사용할 수 있기 때문에 UNI-SAR 플랫폼에 유용하며, 따라서 설계 노력을 위한 많은 후보 풀을 제공한다. 류신 지퍼 도메인은 또한 동일한 결합 파트너에 대해 서로 경쟁하도록 조작되어 억제 및 "NOT" 기능을 허용한다. 더욱이, 본 발명자들은 OR, NEVIPLY, AND, 및 XOR과 같은 당 업계에 기술된 복잡한 기능을 조작하기 위해 류신 지퍼 쌍 사이의 상이한 친화도를 활용할 수 있다.

각각의 개별 SAR은 상이한 항원을 표적화하는 scFv와 쉽게 쌍을 이룰 수 있으므로 조합 및 논리적 항원 감지가 가능하다. 시험관 내 특성화는 UNI-SAR 및 UNICON-SAR 플랫폼 반응(예를 들어, 세포독성, 사이토카인 생산, 및 기억 T 세포 형성)을 설계 매개변수(예를 들어, zipSAR 발현 수준, zipFv 농도, scFv 친화도 및 지퍼 친화도)에 맵핑할 수 있다. 본원에 기재된 기능은 또한 마우스 이종이식 종양 모델에서 생체 내 테스트될 수 있다.

현재 CAR 설계는 제어 및 컴퓨팅 기능이 제한되어 있다. 이러한 결핍은 현재의 CAR을 위험한 과활성화에 취약하게 만들고 종양 세포를 건강한 조직과 구별하는 CAR의 능력을 감소시킨다. T 세포에서 다중 신호전달 경로를 독립적으로 조절하기 위해 예를 들어 UNI-SAR 및 UNICON-SAR 플랫폼을 사용하여 제어 및 컴퓨팅 능력을 처리하기 위한 조성 및 설계가 본원에 기재되며, 이는 논리 및 신호전달 믹서 기능을 부여한다.

방법 및 조성은 예를 들어 이들이 ON/OFF 스위치, 논리적 감지 및 통합, 2개 초과의 항원 처리, 및 다양한 신호전달 경로의 독립적인 조절을 특징으로 하는 최초의 기능이 풍부한 범용 SAR 플랫폼을 제공한다는 이점을 제공한다. 이러한 특징은 단일 시스템, 특히 SIR, Ab-TCR 및 TFP와 같은 차세대 CAR 설계의 맥락에서 함께 입증된 적이 없다. 또한, 이러한 특징은 이중 사슬 SIR, 이중 사슬 cTCR, 이중 사슬 TCR, 이중 사슬 Ab-TCR, 이중 사슬 TCR 및 이중 사슬 AABD-TCR 등과 같은 이중 사슬 차세대 CAR에 대해서 설명되지 않았다. 특히, SAR을 사용하여 T 세포에서 다중 신호 경로의 최초의 독립적인 조정이 본원에서 제공된다. 다양한 매개변수가 분할된 범용 SAR 시스템에 영향을 줄 수 있으며, 이는 적정 가능한 ON/OFF SAR 스위치를 설계하는 데 유용하다. 본원에 기재된 UNISAR 및 UNICON-SAR 설계를 사용하여 OR, NDVIPLY, AND 및 XOR 논리 게이트를 포함하여 SAR이 있는 2-입력 부울 논리 게이트를 생성할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "다성분 SAR"은 적어도 2개의 별개의 폴리펩티드를 포함하는 SAR을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 다성분 SAR은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 별개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 다성분 SAR의 적어도 2개의 별개의 폴리펩티드는 각각 상호작용, 예를 들어 별개의 폴리펩티드의 결합을 허용하는 단백질 상호작용 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 다성분 SAR의 적어도 하나의 폴리펩티드는 항원 결합 도메인은 있지만 경막 도메인이 결여되어 있는, SAR 어댑터로도 공지된 세포외 폴리펩티드이며, 적어도 하나의 폴리펩티드는 신호를 전달할 수 있는 경막 폴리펩티드이다. 한 실시 양태에서, 다성분 SAR의 적어도 하나의 경막 폴리펩티드는 세포내 신호전달 도메인을 보유하거나 세포내 신호전달 도메인을 보유하는 하나 이상의 단백질을 동원할 수 있다. 다성분 SAR의 경막 폴리펩티드는 하나 이상의 항원 인식 도메인을 가질 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 항원 결합 도메인을 갖지만 경막 도메인이 없는 세포외 SAR 어댑터에 결합한다.

실시 양태의 한 측면에서, 다성분 키메라 항원 수용체(SAR)가 본원에 기재되며, 다성분 SAR은 a) 1) 제1 표적 항원에 특이적인 항체 시약 및 2) 단백질 상호작용 도메인을 포함하는 제1 인식 폴리펩티드(또는 SAR 어댑터); 및 b) 1) 제1 인식 폴리펩티드 또는 SAR 어댑터의 단백질 상호작용 도메인과 특이적으로 결합할 수 있는 세포외 단백질 상호작용 도메인 및 2) 세포내 신호전달 도메인을 포함하거나 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 단백질을 동원할 수 있는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 적어도 하나의 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 활성화 도메인이다.

본원에 사용되는 바와 같이, "인식 폴리펩티드" 또는 "SAR 어댑터" 또는 "어댑터"는 항원 결합 도메인을 갖는 세포외 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 항체 시약(예를 들어, 단클론 항체, scFv, 낙타과 vHH 도메인, 단일 도메인 항체 등) 또는 비-면역글로불린 항체 결합 스캐폴드일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 인식 폴리펩티드는 단백질 상호작용 도메인 또는 어댑터를 추가로 포함할 수 있다. 어댑터의 비제한적 예에는 RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인, NKG2D-YA, NKG2D-AF 등이 포함된다. 한 실시 양태에서, 항체(예를 들어, 리툭시맙)는 Fc 결합 도메인(예를 들어, CD16A, CD16-V158, CD32 또는 CD64 등)을 발현하는 SAR과 조합하여 사용될 때 SAR 어댑터로서 작용할 수 있다..

본원에 사용되는 바와 같이, "신호전달 폴리펩티드"는 세포내 신호전달 도메인을 포함하거나 세포내 신호전달 도메인을 갖는 하나 이상의 단백질을 동원할 수 있는 경막 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 신호전달 폴리펩티드는 단백질 상호작용 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 신호전달 폴리펩티드는 SAR 어댑터에 결합하는 세포외 단백질 상호작용 도메인(또는 어댑터 결합 도메인)을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "단백질 상호작용 도메인"은 서로에 대한 2개의 별개의 폴리펩티드의 특이적 결합을 허용하는 도메인을 지칭한다. 다수의 예시적인 단백질 상호작용 도메인뿐만 아니라 단백질 상호작용 도메인의 쌍이 본원의 다른 곳에서 제공된다. 일부 실시 양태에서, 다성분 SAR의 폴리펩티드의 단백질 상호작용 도메인, 예를 들어 단백질 상호작용 도메인 중 하나는 다성분 SAR의 제2 단백질 상호작용 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 2개의 별개의 단백질 상호작용 도메인이 존재할 때 특이적 결합이 발생할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 3개 이상의 별개의 단백질 상호작용 도메인이 존재할 때 특이적 결합이 발생할 수 있다. 예시적인 단백질 상호작용 도메인은 당 업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 측면의 실시 양태에서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 측면의 일부 실시 양태에서, 단백질 상호작용 도메인은 류신 지퍼 도메인일 수 있다. 류신 지퍼 도메인은 α-나선을 통해 균일하게 이격된 류신 잔기를 특징으로 하는 전사 인자에서 일반적으로 발견되는 단백질-단백질 상호작용 도메인의 한 유형이다. 류신 지퍼는 이종이량체 또는 동종이량체를 형성할 수 있다. 다수의 류신 지퍼 도메인뿐만 아니라 서로 결합하는 능력은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Reinke et al. JACS 2010 132:6025-31, Thomposon et al. ACS Synth Biol 2012 1: 118-129 및 WO2017091546A1; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에서 추가로 논의된다. 일부 실시 양태에서, 하나의 류신 지퍼 도메인은 RZIP이고 제2 류신 지퍼 도메인은 EZIP이다.

일부 실시 양태에서, 세포외 단백질 상에 존재하는 단백질 상호작용 도메인은 어댑터로 지칭되는 반면, SAR 상에 존재하는 단백질 상호작용 도메인은 어댑터 결합 도메인으로 지칭된다. 그러나, 두 도메인은 전환될 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 세포외 폴리펩티드(즉, SAR 어댑터)는 SAR의 신호전달 사슬을 포함하는 경막 도메인 상에 존재하는 RZIP 도메인(즉, 어댑터 결합 도메인)과 상호작용하는 EZIP 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 세포외 폴리펩티드(즉, SAR 어댑터)는 SAR의 신호전달 사슬을 포함하는 경막 도메인 상에 존재하는 EZIP 도메인(즉, 어댑터 결합 도메인)과 상호작용하는 RZIP 도메인을 포함할 수 있다.

추가의 예시적인 류신 지퍼 도메인은 문헌[Reinke et al. JACS 2010 132:6025-31]에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 적합한 류신 지퍼 도메인은 SYNZIP 1 내지 SYNZIP 48, 및 BATF, FOS, ATF4, ATF3, BACHl, JUND, NFE2L3, 및 HEPTAD를 포함할 수 있다. 이들 도메인의 다양한 조합의 결합 친화도는 예를 들어 문헌[Reinke et al.]의 [도 1]에 설명되어 있다. 일부 실시 양태에서, 류신 지퍼 도메인의 적합한 쌍은 1000 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 류신 지퍼 도메인의 적합한 쌍은 100 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 류신 지퍼 도메인의 적합한 쌍은 10 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 류신 지퍼 도메인의 적합한 쌍은 1 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다.

추가의 예시적인 단백질 상호작용 도메인 쌍은 a) PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ) 도메인; b) 스트렙타비딘 도메인 및 스트렙타비딘 결합 단백질(SBP) 도메인; 및 c) PYL 도메인 및 ABI 도메인을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 측면의 일부 실시 양태에서, 단백질 상호작용 도메인은 화학적으로 유도된 단백질 상호작용 도메인, 예를 들어 제3 분자, 예를 들어, 소분자 또는 약물의 존재 하에서만 특이적으로 결합할 도메인일 수 있다. 화학적으로 유도된 단백질 상호작용 도메인의 예시적인 쌍은 다음을 포함할 수 있다: mTOR의 FKBP 결합 도메인(FRB) 및 FK506 결합 단백질(FKBP)(이의 결합은 타크롤리무스, 에베롤리무스, 또는 라팔로그에 의해 활성화됨); 사이클로필린-Fas 융합 단백질(CyP-Fas) 및 FK506 결합 단백질(FKBP)(이의 결합은 FKCsA에 의해 활성화됨); 칼시뉴린A(CNA) 및 FK506 결합 단백질(FKBP)(이의 결합은 FK506에 의해 활성화됨); 지베렐린 둔감성(GIA) 및 지베렐린 둔감성 dwarfl(GID1)(이의 결합은 지베렐린에 의해 활성화됨); Snap-태그 및 Halo 태그(이의 결합은 HaXS에 의해 활성화됨); 및 T14-3-3-c델타C 및 PMA2(CT52)의 C-말단 펩티드(이의 결합은 푸시코신에 의해 활성화됨). 화학적으로 유도된 단백질 상호작용 도메인에 대한 추가 설명은 예를 들어, 문헌[Miyamoto et al. Nat Chem Biol. 2012 Mar 25; 8(5): 465-470 및 Belshaw et al. PNAS 1996 93 :4604-4607]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에 기재된 임의의 측면의 일부 실시 양태에서, 단백질 상호작용 도메인은 적어도 하나의 뉴클레오티드 태그 및 적어도 하나의 아연 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 아연 핑거 도메인은 3차 구조를 안정화하기 위해 아연 이온의 배위를 특징으로 한다. 아연 핑거에 나타나는 특정 접힘은 다양할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 아연 핑거 도메인은 뉴클레오티드 결합 아연 핑거 도메인일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 아연 핑거 도메인은 DNA 결합 아연 핑거 도메인일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 인식 폴리펩티드의 단백질 상호작용 도메인은 뉴클레오티드 태그이고 신호전달 폴리펩티드의 세포외 단백질 상호작용 도메인은 아연 핑거 도메인이다. 일부 실시 양태에서, 뉴클레오티드 태그는 DNA 태그일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 뉴클레오티드 태그는 사용되는 아연 핑거 도메인에 대한 전체 인식 서열을 포함하는 dsDNA 태그일 수 있다. 예시적인 아연 핑거 도메인 및 이의 동족 뉴클레오티드 태그는 당 업계, 예를 들어 문헌[Mali et al. Nature Methods 2013 10:403-406]에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시 양태에서, 아연 핑거 도메인은 문헌[Mali et al. Nature Methods 2013 10:403-406]에 기술된 바와 같이 xZF15일 수 있다.

일부 측면에서, 본 개시 내용의 SAR은 세포외 폴리펩티드 또는 SAR 어댑터에 결합할 수 있게 하는 어댑터 결합 도메인(예를 들어, 류신 지퍼 도메인, 예를 들어, RZIP 또는 EZIP 등)을 포함한다. 이러한 SAR 구축물을 발현하는 면역 세포는 상이한 SAR 어댑터(즉, 어댑터에 융합된 상이한 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체, 항체 단편, vHH, FHVH 등))의 사용을 통해 상이한 표적 세포에 대해 재지시될 수 있다. 예시적인 어댑터 및 어댑터 결합 도메인이 표 10에 제공되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, RZIP 코딩 SAR은 CD19-발현 세포를 표적화하기 위해 CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 함유하는 EZIP 코딩 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다.

유사하게, Streptag(서열 번호 1192) 또는 FITC(예를 들어, 서열 번호 1978-1979)를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR은 Streptag-표지 또는 FITC-표지 항체/항체 단편과 조합하여 사용하여 해당 항체/항체 단편에 의해 결합된 항원을 표적화할 수 있다. 다른 어댑터가 당 업계에 공지되어 있으며(예를 들어, WO2019099440, WO2016154621, WO2016168766, WO2016168773, WO2018075807 및 Darowski et al, MABS, 2019, 11, 4, 621-631) 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태에 사용될 수 있다.

본 개시 내용은 SAR에서 류신 지퍼 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP 등)을 포함하는 어댑터의 혼입을 위한 유용한 구성 및 위치를 제공한다. 본 개시 내용은 다중 어댑터의 혼입을 위한 유용한 구성 및 위치를 제공한다. 본 개시 내용은 1, 2, 3개 이상의 어댑터, 예를 들어, 류신 지퍼 도메인 또는 본원에 기재된 다른 단백질 상호작용 도메인을 포함하는 어댑터를 포함하는 SAR 구축물을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 동일한 유형의 2개 이상의 어댑터(예를 들어, 2개의 RZIP 도메인 또는 2개의 E4 도메인)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, SAR은 상이한 유형의 2개 이상의 어댑터(예를 들어, 1개의 RZIP 및 1개의 E4, 또는 1개의 EZIP 및 1개의 D 도메인 등)를 포함한다.

본 개시 내용은 하나 이상의 어댑터 결합 도메인을 포함하는 AABD를 갖는 SAR의 구축을 위한 여러 구성 및 아키텍처를 제공한다. 다수의 이러한 구성은 선행하는 섹션에서 다양한 AABD를 혼입하는 SAR을 설계하기 위한 유용한 구성의 설명에서 설명되었다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, K4, E4, NKG2D-YA, NKG2D-AF, D 도메인 등)의 부착을 위한 유용한 위치가 선택적 링커를 통해 항원 결합 도메인(예를 들어, vL, vH, scFv, AABD, vHH, FHVH, SVH, SVL, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, Va, Vb, Vg, Vd, svd-TCR 등)을 포함하는 하나 이상의 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 단일 사슬 SAR이다. 또 다른 실시 양태에서, SAR은 다중 사슬 SAR이다. 한 실시 양태에서, 선택적 링커는 SAR의 어댑터 결합 도메인과 그의 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 단편 사이에 존재한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에 어댑터 결합 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, K4, E4, NKG2D-YA, NKG2D-AF, D 도메인 등)의 부착을 위한 유용한 위치가 결국 신호전달 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 등의 연결 펩티드)에 부착되는 Ig 링커, Ig 유사 링커 또는 긴 링커(예를 들어, 25개 초과의 아미노산 길이인 링커)의 N-말단 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 본 개시 내용은 SAR에서 류신 지퍼 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP 등)을 포함하는 어댑터의 혼입을 위한 유용한 구성 및 위치를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 다중 어댑터 결합 도메인의 혼입을 위한 유용한 구성 및 위치를 제공한다. 본 개시 내용은 1, 2, 3개 이상의 어댑터 결합 도메인, 예를 들어, 류신 지퍼 도메인, D 도메인 또는 본원에 기재된 다른 단백질 상호작용 도메인을 포함하는 어댑터 결합 도메인을 포함하는 SAR 구축물을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 동일한 유형의 2개 이상의 어댑터(예를 들어, 2개의 RZIP 도메인 또는 2개의 E4 도메인)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, SAR은 상이한 유형의 2개 이상의 어댑터(예를 들어, 1개의 RZIP 및 1개의 E4, 또는 1개의 EZIP 및 1개의 D 도메인 등)를 포함한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 어댑터 결합 도메인은 SAR의 동일한 폴리펩티드 사슬에 위치한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 어댑터 결합 도메인은 SAR의 동일한 폴리펩티드 사슬에 위치하며 링커에 의해 서로 분리된다. 예시적인 실시 양태에서, 링커는 가요성 링커(예를 들어, 서열 번호 1024-1028) 또는 프로테아제 절단성 링커(표 19 참조)일 수 있다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 어댑터 결합 도메인은 다중 사슬 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR)의 상이한 폴리펩티드 사슬에 위치한다.

EZIP 및 CD19를 표적화하는 예시적인 SAR은 서열 번호(DNA) 4341-4367로 표시된다. EZIP, CD22 및 CD19를 표적화하는 예시적인 SAR은 서열 번호(DNA) 4417-4463으로 표시된다. 이들 SAR 구축물은 RZIP 도메인(서열 번호(DNA) 1014 및 서열 번호(PRT) 11704)을 통해 EZIP 도메인에 결합한다. 이러한 SAR을 발현하는 면역 세포는 CD19 및/또는 CD22 발현 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있지만 EZIP 도메인을 포함하는 적합한 항체, 항체 단편 및 AABD(예를 들어, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드)와 조합하여 다른 항원을 표적화하도록 재지시될 수 있다.

SAR은 또한 서열 번호 4341-4367 또는 4417-4463에 있는 SAR의 RZIP 도메인(서열 번호(DNA) 1014 및 서열 번호(PRT) 11704)을 EZIP 도메인(서열 번호(DNA) 1015 및 서열 번호(PRT) 11705)로 대체하여 구축될 수 있다. 이러한 SAR을 발현하는 면역 세포는 CD19 및/또는 CD22 발현 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있지만 RZIP 도메인을 포함하는 적합한 항체, 항체 단편 및 AABD(예를 들어, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드)와 조합하여 다른 항원을 표적화하도록 재지시될 수 있다.

CD20-vHH-2HCD25 도메인이 어댑터 결합 모듈 RZIP에 의해 대체된 MC7G5 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-RZIP-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]로 표시되고 핵산 서열 3699 및 아미노산 서열 14389를 갖는다. 표 27에 열거된 SAR의 CD20-vHH-2HCD25 도메인이 RZIP으로 대체된 다른 예시적인 SAR은 핵산 서열 번호 3695-3792 및 아미노산 서열 번호 14385-14482로 표시된다(표 28). 이들 구축물의 순서는 표 27에 열거된 CD20-vHH-2HCD25 함유 구축물의 순서와 유사하다. RZIP 함유 구축물은 범용 SAR을 사용하여 SAR에 존재하는 RZIP 모듈에 결합할 수 있는 EZIP 모듈을 포함하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, FHVH , vHH, 센티린 등)과 조합될 때 상이한 항원을 표적화할 수 있다. 상이한 항원을 표적화하는 예시적인 scFV-EZIP 융합 단백질은 핵산 서열 번호 1333-1521 및 아미노산 서열 번호 12023-12111로 표시된다. 이러한 예시적인 scFv-EZIP 융합 단백질은 핵산 서열 번호 530-766 및 아미노산 서열 번호 11220-11456(표 3)로 표시된 scFv 단편을 기반으로 하고 그의 표적 항원은 표 3에 나타낸 바와 같이 그의 scFv의 표적 항원으로부터 결정할 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, SAR CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-RZIP-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]을 발현하는 T 세포는 핵산 서열 1336 및 아미노산 서열 12026으로 표시되는 BCMA-J6M0-scFv-G4S-EZIP 융합 단백질을 대상체에게 투여함으로써 BCMA 발현 골수종 세포로 지시될 수 있다. 한편, SAR D8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-RZIP-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]를 발현하는 T 세포는 핵산 서열 번호 1341 및 아미노산 서열 번호 12031로 표시되는 FMC63-scFv-G4S-EZIP 융합 단백질을 대상체에 투여함으로써 CD19 발현 림프종으로 지시될 수 있다. 따라서, RZIP 모듈을 함유하는 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 해당 항원을 표적화하는 상이한 scFv-EZIP 융합 단백질과 조합될 때 상이한 표적 항원에 대해 지시될 수 있는 범용 SAR-T 세포로서 작용할 수 있다.

RZIP 함유 SAR은 비-scFv 기반 EZip 융합 단백질과 함께 사용할 수도 있다. 상이한 항원을 표적화하는 예시적인 비-scFv 기반 EZip 융합 단백질은 핵산 서열 1522-1590 및 아미노산 서열 12212-12280에 제공된다. 이들 EZip 융합 단백질의 항원 결합 도메인(예를 들어, VHH, SVH, 센티린 등)은 표 5에 나타낸 바와 같이 서열 번호 834-902 및 아미노산 서열 번호 11524-11592로 표시되는 항원 결합 도메인을 기반으로 한다. 추가의 EZIP 및 RZIP 포함 융합 단백질 및 EZIP 포함 구축물을 발현하는 면역 세포를 재지시하기 위한 이들의 사용 방법은 문헌[Cho et al, Cell 173, 1426-1438, 2018]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

다수의 추가 어댑터 및 어댑터 결합 모듈이 당 업계에 공지되어 있다. 예시적인 어댑터 및 어댑터 결합 모듈이 표 10에 나열되어 있다. 본 개시 내용은 SAR 구축물이 선행하는 예에 기재된 SAR의 RZIP 모듈을 E4(서열 번호 1016), NKG2D-AF(서열 번호 1018), NKG2D-YA(서열 번호 1019), NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF(서열 번호 1020), NKG2D-YA-G4Sx3-or NKG2D-YA(서열 번호 1021)로 대체함으로써 구축될 수 있음을 제공한다. 유사하게, 선행하는 예에 기재된 EZip 융합 단백질의 EZIP 모듈은 K4(서열 번호 1017), ULBP2R(서열 번호 1022) 및 ULBP2-S3(서열 번호 1023)으로 대체될 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, E4 모듈을 포함하는 SAR 구축물은 SAR 어댑터의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, vHH, FHVH 등)에 의해 표적화되는 항원을 발현하는 표적 세포에 대해 K4 함유 SAR 어댑터와 조합하여 사용될 수 있다. E4 모듈을 포함하는 예시적인 SAR은 서열 번호 4468-4490 및 4544-4590에 제시되어 있다. K4 도메인에 부착된 scFv 및 vHH/FHVH를 포함하는 예시적인 SAR 어댑터는 각각 서열 번호(PRT) 12281-12469 및 12470-12538에 제시되어 있으며, 이들의 표적 항원은 각각 표 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이 이들의 scFv 및 vHH/ FHVH로부터 결정될 수 있다.

SAR 어댑터가 RZIP을 포함할 수 있으면서 SAR의 어댑터 결합 도메인이 EZIP 도메인을 포함할 수 있도록 RZIP 및 EZIP 모듈의 위치가 전환될 수 있다. 유사하게, K4 및 E4 도메인의 위치가 SAR과 SAR 어댑터 사이에서 전환될 수 있다.

출원 WO2020159941(전체가 본원에 참고로 포함됨)은 조작된 포유동물 세포 상의 변형된 비천연 NKG2D 수용체(예를 들어, NKG2D-AF 및 NKG2D-YA)로 구성된 CAR에 선택적으로 전달될 수 있는 특정 표적 결합 특성을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어항체 또는 항체의 단편이 부착된 NKG2D 리간드(예를 들어, ULBP2R 및 ULBP2-S3)의 변형된 비천연 α1-α2 도메인에 대해 기술한다. 그러나 비천연 NKG2D 수용체를 차세대 CAR 구축물(예를 들어, SIR, cTCR, Ab-TCR, TFP 및/또는 TCR 등)에 혼입하기 위한 적절한 조성 및 구성은 알려져 있지 않다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 비천연 NKG2D 수용체(예를 들어, NKG2D-AF 및 NKG2D-YA 등)를 포함하는 SAR에 대한 유용한 조성 및 구성을 제공한다. 예시적인 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에서 비천연 NKG2D 수용체의 혼입을 위한 적절한 위치가 선택적 링커를 통해 그의 항원 결합 도메인(예를 들어, vL, vH, scFv, vHH, FHVH, SVH, SVL, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, Va, Vb, Vg, Vd, svd-TCR 등)의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 단일 사슬 또는 하나 초과의 사슬을 갖는다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에서 비천연 NKG2D 수용체(NKG2D-YA, NKG2D-AF 등)의 혼입을 위한 유용한 위치가 결국 신호전달 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 등의 연결 펩티드)에 부착되는 Ig 링커, Ig 유사 링커 또는 긴 링커(예를 들어, 25개 초과의 아미노산 길이의 링커)의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 다수의 비천연 NKG2D 수용체의 혼입을 위한 유용한 구성 및 위치를 제공한다. 본 개시 내용은 1, 2, 3개 이상의 비천연 NKG2D 수용체를 포함하는 SAR 구축물을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 동일한 유형의 2개 이상의 비천연 NKG2D 수용체(예를 들어, 2개의 NKG2D-YA 도메인 또는 2개의 NKG2D-AF 도메인)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, SAR은 상이한 유형의 2개 이상의 비천연 NKG2D 수용체(예를 들어, 1개의 NKG2D-AF 및 1개의 NKG2D-AF 등)를 포함한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 비천연 NKG2D 수용체는 SAR의 동일한 폴리펩티드 사슬에 위치한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 비-천연 NKG2D 수용체는 SAR의 동일한 폴리펩티드 사슬에 위치하며 링커에 의해 분리된다. 예시적인 실시 양태에서, 링커는 가요성 링커(예를 들어, 서열 번호 1024-1028) 및/또는 프로테아제 절단성 링커(표 19 참조)일 수 있다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 비-천연 NKG2D 수용체는 다중 사슬 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR)의 상이한 폴리펩티드 사슬에 위치한다.

예시적인 실시 양태에서, NKG2D-AF 또는 NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF 모듈을 포함하는 SAR 구축물은 후자의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, vHH, FHVH 등)에 의해 표적화되는 항원을 발현하는 표적 세포에 ULBP2R 융합 단백질과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 ULBP2R 융합 단백질을 표적화하는 CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2R은 서열 번호(DNA) 1013 및 서열 번호(PRT) 11703으로 표시되며, NKG2D-AF 또는 NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF 모듈을 포함하는 SAR을 BCMA 발현 세포에 대해 재지시하는 데 사용될 수 있다.

또 다른 예시적인 실시 양태에서, NKG2D-YA 또는 NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA 모듈을 포함하는 SAR 구축물은 후자의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, vHH, FHVH 등)에 의해 표적화되는 항원을 발현하는 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 ULBP2-S3 융합 단백질을 표적화하는 CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2-S3은 서열 번호(DNA) 1041 및 서열 번호(PRT) 11731로 표시되며, NKG2D-YA 또는 a NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA 모듈을 포함하는 SAR을 BCMA 발현 세포에 대해 재지시하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, NKG2D-YA를 포함하는 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH93-G4S-EcoR1-humROO5-vL-IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD-F-P2A-IgH-SP-NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD-F-F2A-PAC(서열 번호 23102)이다. 이 SAR을 발현하는 T 세포는 BCMA 및 CD19를 표적화하지만, ULBP2와 융합된 PSMA 표적화 단일 사슬 vH를 포함하는 구축물 CD8SP-PSMA-USC76-chVH-G4S-ULBP2-S3-G2S2-streptagII-F-P3A-EcoR1-hGlul-nonopt-T2A-eGFPter(서열 번호 23114)을 발현하는 세포로부터의 상청액에 노출시킴으로써 PSMA 발현 세포를 표적화하도록 지시될 수 있다. 대안적 실시 양태에서, 본 개시 내용은 BCMA 발현 세포를 표적화하는 데 ULBP2-S3 코딩 폴리펩티드(예를 들어, CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2-S3, 서열 번호 11731)와 조합하여 사용될 수 있다. 이종 단백질에 작동 가능하게 연결된 비천연 NKG2D 리간드(예를 들어, ULBP2R 및 ULBP2-S3)와 조합하여 NKG2D-AF, NKG2D-YA, 및 NKG2D의 기타 비천연 변이체를 사용하는 방법은 WO2019191243 및 WO2020159941에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 새로이 설계된 α-나선 번들, α3D로부터 유래된 D 도메인을 포함하는 SAR을 위해 유용한 조성 및 구성을 제공한다. D 도메인은 이황화 결합 및 N-연결 글리코실화가 결여된 상대적으로 작은(scFv의 약 1/3 크기) 단일 도메인 구조이며 면역원성을 최소화하도록 조작될 수 있다(Qin et al, Molecular Therapy 27, 7, 2019). 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에 D 도메인의 부착을 위한 유용한 위치가 선택적 링커를 통해 SAR을 포함하는 하나 이상의 vL, vH, scFv, vHH, AABD, FHVH, SVH, SVL, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, Va, Vb, Vg, Vd, svd-TCR 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 예시적인 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에서 D 도메인의 혼입을 위한 적절한 위치가 선택적 링커를 통해 그의 항원 결합 도메인(예를 들어, vL, vH, scFv, vHH, FHVH, SVH, SVL, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, Va, Vb, Vg, Vd, svd-TCR 등)을 포함하는 하나 이상의 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 단일 사슬 또는 하나 초과의 사슬을 갖는다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 SAR에서 선택적 링커가 뒤따르는 D 도메인의 부착에 유용한 위치가 결국 신호전달 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 등의 연결 펩티드)에 부착되는 Ig 링커, Ig 유사 링커 또는 긴 링커(예를 들어, 25개 초과의 아미노산 길이의 링커)의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 있음을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 다수의 D 도메인의 혼입을 위한 유용한 구성 및 위치를 제공한다. 본 개시 내용은 1, 2, 3개 이상의 D 도메인을 포함하는 SAR 구축물을 제공한다. 한 실시 양태에서, SAR은 D 도메인을 포함하는 2개 이상의 어댑터 결합 도메인을 포함한다. 다른 실시 양태에서, SAR은 상이한 유형의 2개 이상의 어댑터 결합 도메인(예를 들어, 1개의 D 도메인 및 1개의 RZIP 등)을 포함한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 D 도메인은 SAR의 동일한 폴리펩티드 사슬에 위치한다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 D 도메인은 SAR의 동일한 폴리펩티드 사슬에 위치하며 링커에 의해 분리된다. 예시적인 실시 양태에서, 링커는 가요성 링커(예를 들어, 서열 번호 1024-1028) 및/또는 프로테아제 절단성 링커(표 19 참조)일 수 있다. 한 실시 양태에서, 2개 이상의 D 도메인은 다중 사슬 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR)의 상이한 폴리펩티드 사슬에 위치한다.

예시적인 실시 양태에서, p26 단백질을 표적화하는 D 도메인을 포함하는 SAR은 CD8SP-Af03-G4S-EcoR1-hu-mROO5-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-CD19-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC(서열 번호 23107)이다. 이 SAR을 발현하는 T 세포는 CD123을 표적화하는, D 도메인과 융합하여 p26을 발현하는 SAR 어댑터 CD8SP-bc40-p26-CD123-cg06-GGS-Nluc-FlagX4-Streptag-GGS-8XHis-T2A-PAC(서열 번호 23120)에 대한 노출에 의해 표적 CD123 발현 세포에 의해 지시될 수 있다. 종래의 CAR-T 세포를 표적화하기 위해 D 도메인 함유 단백질을 사용하는 방법은 WO2019099440에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

선행하는 섹션에서 기재된 어댑터 결합 도메인을 포함하는 SAR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

대안적인 실시 양태에서, SAR의 어댑터 결합 도메인은 Fv를 형성하기 위해 결합되는 vL 및 vH 단편을 포함할 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, Streptag를 표적화하는 SAR은 CD8SP-CD19-FHVH-354-G4S3-Streptag-vL-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-Streptag-vH-[hTCRa-T48C-opt](서열 번호(DNA) 1992 및 서열 번호(PRT) 12682)로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 갖고 각각 [hTCRb-S57C-opt] 및 [hTCRa-T48C-opt] 모듈에 부착된 Streptag를 표적화하는 vL 및 vH 단편을 포함한다. 이 SAR 구축물은 또한 G4S3 가요성 링커를 통해 Streptag vL 단편의 N-말단에 부착된 CD19를 표적화하는 AABD(CD19-FHVH-354)를 포함한다. 따라서 이 SAR은 CD19-FHVH-354 도메인을 통해 CD19를 표적화할 수 있고, 추가로 상기 항원을 표적화하고 Streptag를 포함하는 항원 결합 모이어티(예를 들어, 항체, 항체 단편, vHH, FHVH, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 등)를 포함하는 SAR 어댑터와 조합하여 사용될 때 상이한 항원에 대해 재지시될 수 있다. 상이한 항원을 표적화하고 Streptag를 포함하는 예시적인 SAR 어댑터(예를 들어, scFv, vHH 등)는 표 21 및 22에 제공되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, 이 SAR 구축물은 또한 BCMA를 표적화하고 하나 이상의 Streptag를 보유하는 SAR 어댑터와 조합하여 BCMA 발현 표적 세포를 표적화할 수 있다. 예를 들어, BCMA를 표적화하는 SAR 어댑터는 서열 번호 1247, 1248, 1276 또는 1277로 표시되는 구축물의 발현에 의해 포유동물 세포에서 발현될 수 있고 상청액으로부터 정제될 수 있다.

FITC 및 CD19를 표적화하는 예시적인 SAR은 서열 번호 1978-1979로 표시된다(표 25). 이러한 SAR을 발현하는 면역 세포는 CD19 발현 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있지만, 추가로 적절한 FITC-표지된 항체, 항체 단편 및 AABD(예를 들어, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드)에 의해 다른 항원을 표적화하도록 지시될 수 있다.

GCN4를 표적화하는 SAR 구축물은 WO2018075807에 기재된 바와 같이 이 단백질을 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편을 사용하여 구축될 수 있다. 예시적인 SAR 구축물은 서열 번호 22603-22614에 제공된다. 이러한 SAR을 발현하는 면역 세포는 GCN4 태그를 보유하는 적절한 항체 또는 항체 단편과 조합하여 다른 항원을 표적화하도록 지시될 수 있다. 예시적인 GCN4 태그는 서열 번호(PRT) 21467-21470에 제공된다. SAR 발현 세포를 BCMA, PSMA, CD19, MUC16, IL13Ra2, CD19, CD123, MSLN, CD22, MPL(TPO-R), CD30, FLT3, CD33 및 Her2로 지시하기 위해 GCN4-표적화 SAR과 함께 사용될 수 있는 N-말단 GCN4 태그를 포함하는 항원 결합 모이어티(예를 들어, scFv, vHH, FHVH 등)를 포함하는 예시적인 SAR 어댑터는 각각 서열 번호(PRT) 21471-21484에 제공되어 있다. GCN4 태그를 포함하는 추가의 예시적인 항원 결합 모이어티 및 그의 사용 방법은 WO2018075807에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

Streptag, FITC, GCN4 또는 임의의 다른 태그 또는 표지를 표적화하고 선행하는 섹션에 기재된 SAR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

본 개시 내용은 또한 항체에 결합할 수 있는 Fc 결합 모듈을 포함하는 SAR에 대한 조성 및 유용한 구성을 제공한다. CD20-vHH-2HCD25 도메인이 저친화성 Fc 수용체(CD16A-F158V 또는 CD16A-V158)의 Fc 결합 영역으로 대체된 MC7G5 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD16-V158-v2-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]로 표시되며 핵산 서열 3797 및 아미노산 서열 14487을 갖는다. 표 27에 열거된 SAR의 CD20-vHH-2HCD25 도메인이 CD16A 또는 이의 돌연변이체(예를 들어, CD16-V158-v2)의 Fc 결합 부분으로 대체된 다른 예시적인 SAR은 핵산 서열 번호 3793-3890 및 아미노산 서열 번호 14483-14580(표 28)로 표시된다. 이들 구축물의 순서는 표 27에 열거된 CD20-vHH-2HCD25 함유 구축물의 순서와 유사하다. CD16A 또는 CD16A-F158V(CD16A-V158) 함유 구축물은 SAR에 존재하는 CD16-V158 모듈에 결합할 수 있는 Fc 모듈을 포함하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체, 항체 단편, 이중특이성 항체 등)과 조합될 때 상이한 항원을 표적화하는 범용 SAR로서 사용될 수 있다. 따라서, SAR CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD16-V158-v2-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]를 발현하는 T 세포는 대상체에게 CD20 단클론 항체 리툭시맙을 투여함으로써 CD20 발현 림프종 세포에 대해 지시될 수 있다. 한편, SAR CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD16-V158-v2-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C]를 발현하는 T 세포는 대상체에게 허셉틴을 투여함으로써 Her2 발현 암 세포에 대해 지시될 수 있다. 따라서, CD16-V158 모듈을 함유하는 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 해당 항원을 표적화하는 상이한 항체 또는 항체 단편을 함유하는 Fc 모듈과 조합될 때 상이한 표적 항원에 대해 지시될 수 있는 범용 SAR-T 세포로 작용할 수 있다. 한 실시 양태에서, SAR은 1개 또는 2개의 Fc 결합 모듈, 예를 들어 CD16의 1개 또는 2개의 Fc 결합 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 각 사슬은 CD16-V158 모듈을 포함한다. CD16의 Fc 결합 도메인을 포함하고 선행하는 섹션에 기재된 SAR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

본 개시 내용은 또한 CD32 및 CD64로부터 유래된 하나 이상의 세포외 Fc 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 따라서, 서열 번호 3797을 갖는 구축물의 CD16A 모듈을 CD32로부터 유래된 Fc 결합 모듈로 대체하여 이중특이성 및 다중특이성 항체를 포함하는 항체, 항체 단편의 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 SAR을 생성할 수 있다. CD32 또는 CD64의 Fc 결합 도메인을 포함하고 선행하는 섹션에서 기재된 SAR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 개재 Ig 링커를 통해 TCR 불변 사슬에 작동 가능하게 부착된 하나 이상의 어댑터 결합 도메인을 포함하는 AABD-TCR의 백본을 갖는 단일 사슬, 1.5 사슬 및 이중 사슬 SAR을 제공한다. 예시적인 이러한 구축물은 IgCL 링커를 통해 절단된 TCRb 사슬에 작동 가능하게 부착된 RZIP 도메인 및 IgG1-CH1 링커를 통해 절단된 TCRa 사슬에 작동 가능하게 부착된 PSMA-표적화 단일 vH 도메인(PSMA-chVH-71v2)을 포함하는 CD8SP-RZIP-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-PSMA-chVH-71v2-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD](서열 번호 21609)이다. 예시적인 실시 양태에서, 이 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 PSMA-chVH-71v2를 통해 PSMA 발현 세포를 표적화할 수 있지만, 핵산 서열 번호 1336 및 아미노산 서열 번호 12026으로 표시되는 BCMA-J6M0-scFv-G4S-EZIP 융합 단백질에 노출될 때 BCMA 발현 세포도 표적화하도록 재지시될 수 있다. 구축물 CD8SP-RZIP-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-RZIP-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD](서열 번호 21610)에서, PSMA-chVH-71v2 모듈은 두 번째 RZIP 모듈로 대체된다. 서열 번호 21611 및 21622을 갖는 구축물은 RZIP 모듈(들)이 E4 모듈(들)로 대체된다는 점을 제외하고 서열 번호 21609 및 21610의 구축물과 유사하다. 이들 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 K4 융합 폴리펩티드에 노출 시 상이한 항원 에 대해 재지시될 수 있다. 유사하게, 서열 번호 21613 및 21614를 갖는 구축물은 RZIP 모듈(들)이 NKG2D-AF 모듈로 대체된다는 점을 제외하고는 서열 번호 21609 및 21610을 갖는 구축물과 유사하다. 서열 번호 21615 및 21616을 갖는 구축물은 RZIP 모듈(들)이 CD16-V158 모듈로 대체된다는 점을 제외하고 서열 번호 21609 및 21610을 갖는 구축물과 유사하다. 서열 번호 21609 내지 21616을 갖는 SAR 구축물은 [IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD] 및 [IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD] 모듈이 [IgCL-TCRg-6MD] 및 [IgCL-TCRd-6MD] 모듈로 대체된다는 점을 제외하고는 서열 번호 21617 내지 216124를 갖는 SAR 구축물과 유사하다. 선행하는 섹션에서 기재된 AABD-TCR의 모듈식 아키텍처를 기반으로 하는 다른 SAR도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 적어도 2개의 항원 특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 경막 도메인, (d) 선택적 공동자극 도메인 및 (e) 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중 사슬 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 하나의 항원 특이적 표적화 영역은 제2 사슬에 존재하는 Vb 및/또는 Va 단편과 이량체화할 수 있는 T 세포 수용체로부터 유래된 Va 및/또는 Vb 단편을 포함하고 제2 항원 특이적 표적화 도메인은 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 도메인이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 2개의 사슬 각각이 (a) 적어도 2개의 항원 특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 경막 도메인, (d) 선택적 공동자극 도메인 및 (e) 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중 사슬 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 하나의 항원 특이적 표적화 영역은 제2 사슬에 존재하는 Vg 및/또는 Vd 단편과 이량체화할 수 있는 T 세포 수용체로부터 유래된 Vg 및/또는 Vd 단편을 포함하고 제2 항원 특이적 표적화 도메인은 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 도메인이다.

본 개시 내용은 또한 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SIR)을 제조하기 위한 유용한 구성을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Va 및/또는 Vb 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Vg 및/또는 Vd 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 선택적 링커를 통해 CAR(예를 들어, 2세대 CAR, 예를 들어, BBz CAR), SIR, cTCR, Ab-TCR, αβTFP, γδ TFP 또는 TCR)을 포함하는 vL, vH, Va, Vb, Vd, Vg 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제공한다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 CAR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 CAR의 scFv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다. CAR 백본을 기반으로 하는 예시적인 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-28z(서열 번호 4976)이다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 SIR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 SIR의 Fv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다. SIR 백본을 기반으로 하는 예시적인 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 4981)이다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 cTCR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 cTCR의 Fv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 Ab-TCR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 Ab-TCR의 Fv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 TFPε/TFPγ/TFPδ/TFPζ을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 TFP의 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다.

본 개시 내용은 또한 하나 초과(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)의 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제조하기 위한 유용한 구성을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 선택적 링커를 통해 또 다른 AABD의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD를 포함하는 SAR(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 SAR)을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 단일 사슬(예를 들어, 1세대 CAR, 2세대 CAR, vFLIP-CAR, TFPε, TFPγ, TFPδ 또는 TFPζ 등), 이중 사슬(예를 들어, 이중 사슬 SIR, 이중 사슬 cTCR, 이중 사슬 zSIR, 이중 사슬 Ab-TCR, 이중 사슬 TFP, 이중 사슬 TCR 등) 또는 1.5 사슬(예를 들어, 1.5 사슬 cTCR 또는 1.5 사슬 SIR)을 갖는 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제조하기 위한 유용한 구성을 제공한다. 다양한 백본 상에 있고 hu-mROO5-1 vL 및 vH 단편, BCMA-FHVH-33, CD22-FHVH-158, 및/또는 CD19-vHH-048을 포함하는 예시적인 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 명칭 및 서열 번호는 표 31에 제공된다. 표 31에서 구축물의 BCMA-FHVH-33, CD22-FHVH-158, 및/또는 CD19-vHH-048 모듈이 다른 AABD 모듈로 대체된 예시적인 SAR 구축물은 표 32에 제공된다. 표 32의 구축물에 사용된 백본은 표 31의 구축물에 사용된 백본의 순서와 동일하다. 한 실시 양태에서, SAR은 CAR, 예를 들어 2세대 CAR의 백본을 갖는다. 2세대 CAR의 백본을 갖는 이러한 단일 사슬 SAR의 예는 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-28z(서열 번호 5070)이다. 한 실시 양태에서, SAR은 SIR의 백본, 예를 들어 이중 사슬 SIR 또는 1.5 사슬의 백본을 갖는다. 이중 사슬 SIR의 백본을 가진 이러한 SAR 예는 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-T48C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-S57C](서열 번호 5077)로 표시된다. 1.5 사슬 SIR의 백본 상의 이러한 SAR의 예는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC(서열 번호 5079)이다. 한 실시 양태에서, SAR은 cTCR의 백본을 갖는다. 한 실시 양태에서, SAR은 Ab-TCR의 백본을 갖는다. Ab-TCR의 백본을 갖는 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD](서열 번호 5095) 및 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD](서열 번호 5097)이다. 한 실시 양태에서, SAR은 TFP의 백본을 갖는다. TFP의 백본을 갖는 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2(서열 번호 5098), CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-(vL-vH)-CD3d-ECDTMCP-opt2(서열 번호 5099), 및 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-(vL-vH)-CD3g-ECDTMCP-opt2(서열 번호 5100)로 표시된다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFV 기반 항원 결합 도메인이다. 예시적인 실시 양태에서, 선택적 링커는 프로테아제 절단성 링커이다. 예시적인 프로테아제 절단성 링커가 표 19에 제공되어 있다. 예시적인 AABD는 SVH 도메인, vHH 도메인, 및 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 또는 이의 단편; 수용체(예를 들어, CD16-V158A, NKG2D), 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 실시 양태에서, SIR로의 혼입을 위한 AABD는 가용성 도메인이고, 즉, 포유동물 세포에서 발현 시 응집되지 않는다. 예시적인 실시 양태에서, SIR로의 혼입을 위한 AABD는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 포유동물 세포에서 발현될 때 상청액에 효율적으로 분비된다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 zSIR(WO2019232503 참조, 본원에 참고로 포함됨)을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 zSIR의 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단 또는 N-말단 부근에 AABD의 부착을 포함함을 기재한다. 한 실시 양태에서, AABD는 비-scFV 기반 항원 결합 도메인이다. zSIR 백본을 기반으로 하는 예시적인 SAR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-IgCL-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC이며 핵산 서열 번호 5029 및 아미노산 서열 번호 15719로 표시된다. zSIR 백본을 기반으로 하는 예시적인 다중특이성 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-33-G3Sx2-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-IgCL-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC이고 BCMA, CD19 및 CD20을 표적화한다. 이 SAR은 핵산 서열 번호 5122 및 아미노산 서열 번호 15812로 표시된다. SAR은 본질적으로 모듈식이므로 이 SAR의 상이한 모듈은 다른 항원(들)을 표적화하도록 대체될 수 있다. 따라서, zSIR 백본을 기반으로 하고 다양한 항원을 표적화하는 상이한 vL/vH 단편을 함유하는 SAR이 구축될 수 있다. 유사하게, CD20-vHH-2HCD25 모듈이 다른 AABD로 대체된 zSIR 백본을 기반으로 하는 SAR은 상이한 항원을 표적화하도록 구축될 수 있다. 마지막으로, 링커 도메인(즉, IgCL 및 IgG1-CH1)은 선택적이며 생성된 SAR이 기능적 특성(즉, 항원 결합, T 세포 신호전달 등)을 유지하는 한 표 13에 나열된 상이한 링커로 대체될 수 있다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 cTCR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 cTCR의 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다. 예시적인 실시 양태에서, 선택적 링커는 프로테아제 절단성 링커이다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 Ab-TCR을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 Ab-TCR의 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다. 예시적인 실시 양태에서, 선택적 링커는 프로테아제 절단성 링커이다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 αβTFP 또는 γδ-TFP를 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 αβTFP 또는 γδ-TFP의 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 단일 사슬 SAR(예를 들어, 1세대 CAR, 2세대 CAR, TAC, ζTFP, εTFP, δTFP, γTFP, 단일 사슬 SIR, 단일 사슬 cTCR, 또는 단일 사슬 cTCR 등)를 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 단일 사슬 CAR의 vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 AABD(예를 들어, 비-scFV 기반 항원 결합 도메인)의 부착을 포함함을 기재한다.

본 개시 내용은 이중특이성 또는 다중특이성 rTCR(재조합 TCR)을 제조하기 위한 유용한 구성이 선택적 링커를 통해 이러한 rTCR의 Va 및/또는 Vb 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 AABD의 부착을 포함함을 기재한다. 예시적인 실시 양태에서, 선택적 링커는 프로테아제 절단성 링커이다.

본 개시 내용은 또한 단일형 MHC I형 관련 단백질(MR1)-제한된 TCR인 MC.7.G5(또는 MC7G5)를 기반으로 하는 예시적인 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제공한다.

본 개시 내용은 또한 HLA-A2와 복합체를 이루는 NY-ESO1 펩티드 SLLMWITQC(서열 번호 21461)를 표적화하는 IG4, NY-ESO-1 제한된 TCR를 기반으로 하는 예시적인 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제공한다.

본 개시 내용은 또한 HLA-A2와 복합체를 이루는 CMV pp65 펩티드 NLVPMVATV(서열 번호 21452)를 표적화하는 CMV pp65-제한된 TCR을 기반으로 하는 예시적인 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제공한다.

SIR, cTCR, Ab-TCR, zSIR, αβTFP, γδTFP 또는 TCR을 포함하는 vL, vH, Va, Vb, Vg 또는 Vd 사슬의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD로 구성된 선행하는 예에 기재된 예시적인 SAR. 본 개시 내용은 또한 하나 이상의 AABD가 개재 vL, vH, Va, Vb, Vg 및/또는 Vd 사슬의 존재 없이 TCR 모듈에 프레임 내에서 작동 가능하게 연결되어 있는 AABD-TCR로 명명된 SAR의 신규 플랫폼을 제공한다. 예시적인 AABD-TCR에서, 하나의 AABD 모듈은 제1 개재 링커 도메인을 통해 제1 TCR 모듈의 연결 펩티드에 작동 가능하게 연결되고, 제2 AABD는 제2 개재 링커를 통해 제2 TCR 모듈의 연결 펩티드에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 실시 양태에서, 링커는 가요성 링커(예를 들어, Gly-Ser 링커)이다. 바람직한 실시 양태에서, 링커는 면역글로불린(Ig) 도메인을 포함한다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL(서열 번호(DNA) 1142 및 서열 번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인(서열 번호(DNA) 1143-1157 및 서열 번호(PRT) 3537-3551)은 AABD와 TCR 사슬 사이에 유용한 링커 역할을 한다. 추가의 Ig-도메인 및/또는 Ig 유사 도메인은 당 업계에 공지되어 있으며(예를 들어, 표 13; 서열 번호(DNA) 1168-1175 및 서열 번호(PRT) 3562-3569) 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태에서 유용한 링커로서 작용할 수 있다. 본 개시 내용은 또한 SAR(서열 번호 11848-11865)의 구축에서 링커로서 작용할 수 있는 TCR 불변 사슬(예를 들어, Cα, Cβ, Cγ, Cδ)의 세포외 Ig 도메인의 신규한 결실 돌연변이체를 제공한다(표 13). TCR 불변 사슬(예를 들어, Cα, Cβ, Cγ 또는 Cδ)의 세포외 Ig 도메인은 AABD-TCR, SIR 또는 cTCR의 백본을 갖는 SAR의 구축에서 항원 결합 도메인(예를 들어, vL, vH, vHH, DARPIN, FHVH 등)과 TCR 모듈의 TCR 연결 펩티드(서열 번호 11867-11875)(표 14) 사이에서 링커로서 작용할 수 있다. 한 실시 양태에서, 예시적인 TCR 모듈은 TCRa-wt2-opt-6MD(서열 번호 1112), TCRb-wt2-opt-6MD(서열 번호 1126), TCRg-6MD(서열 번호 1132) 및 TCRd-6MD(서열 번호 1139) 또는 이의 기능적 변이체(표 12)로 표시된다. 한 실시 양태에서, TCR 모듈은 적어도 하나의 TCR 신호전달 모듈을 동원할 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 사슬이 (a) 하나 이상의 항원 특이적 표적화 도메인, (b) 서열 번호 11832-11865로부터 선택된 적어도 하나의 링커 도메인, 또는 서열 번호 11832-11865(표 13)에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체, (c) 서열 번호 11888-11894로부터 선택된 선택적 힌지 도메인, 또는 서열 번호 11832-11865(표 13)에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체; d) 서열 번호 11867-11875(표 14)로부터 선택된 적어도 하나의 연결 펩티드 또는 서열 번호 11867-11875에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체, (e) 서열 번호 11877-11881로부터 선택된 적어도 하나의 경막 도메인, 또는 서열 번호 11867-11875에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체, (f) 서열 번호 11883-11886으로부터 선택된 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중 사슬 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 항원 특이적 표적화 영역은 AABD를 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, 센티린, svd-TCR 등)이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 각각의 사슬이 (a) 하나 이상의 항원 특이적 표적화 도메인, (b) 서열 번호 11832-11865로부터 선택된 적어도 하나의 링커 도메인, 또는 서열 번호 11832-11865(표 13)에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체, (c) 서열 번호 11888-11894로부터 선택된 선택적 힌지 도메인, 또는 서열 번호 11832-11865(표 13)에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체; d) 서열 번호 11867-11875(표 14)로부터 선택된 적어도 하나의 연결 펩티드 또는 서열 번호 11867-11875에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체, (e) 서열 번호 11877-11881로부터 선택된 적어도 하나의 경막 도메인, 또는 서열 번호 11867-11875에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 도메인 또는 이의 결실 돌연변이체 및 기능적 변이체, (f) 서열 번호 11883-11886으로부터 선택된 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중 사슬 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 여기서 항원 특이적 표적화 영역은 AABD를 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈(예를 들어, SVH, vHH, 센티린 등)이다.

CD22 및 PSMA를 표적화하는 예시적인 이중 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD22-FHVH-24-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-PSMA-chVH-71v2-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]이며 핵산 서열 번호 6492 및 아미노산 서열 번호 17182으로 표시된다. 이 구축물의 사슬 중 하나는 IgCL 링커(11832)를 통해 인간 TCRg/TCRγ의 연결 펩티드, 경막 및 시토졸 도메인을 포함하는 TCRg-6MD 모듈(서열 번호 11822)에 융합된 CD22 표적화 SVH(CD22-FHVH-24)를 포함한다. 이 구축물의 제2 사슬은 IgG1-CH1 링커(11833)를 통해 인간 TCRd/TCRd의 연결 펩티드, 경막 및 시토졸 도메인을 포함하는 TCRd-6MD 모듈(서열 번호 11829)에 융합된 PSMA를 표적화하는 SVH(PSMA-chVH-71v2)를 포함한다. 이 SAR의 2개의 사슬은 퓨린 부위(서열 번호 11931) 및 P2A(서열 번호(DNA) 1236 및 서열 번호(PRT) 11926) 자가 절단성 링커를 통해 분리된다.

CD22 및 PSMA를 표적화하는 또 다른 예시적인 이중 사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD22-FHVH-24-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-PSMA-chVH-71v2-[IgG1-CH1-TCRa-wt-op2-6MD](서열 번호 6521)이다. 이 SAR은 TCRg-6MD 모듈이 TCRb-wt-opt2-6MD 모듈(서열 번호(DNA) 1126 및 서열 번호(PRT) 11816)로 대체되고 TCRd-6MD는 TCRa-wt-opt2-6MD 모듈(서열 번호(DNA) 1112 및 서열 번호(PRT) 11802)로 대체된 것을 제외하고는 선행하는 섹션에 기재된 SAR과 유사하다.

CD20 및 CD22를 표적화하는 AABD-TCR의 백본 상의 예시적인 이중 사슬 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-IgG1-힌지-[TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD22-USC1-FHVH-160-IgG1-힌지-v2-[TCRd-6MD]이며 서열 번호 17883으로 표시된다. CD20 및 CD22를 표적화하는 AABD-TCR의 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-CD22-USC1-FHVH-160-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD](서열 번호 17868) 및 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD22-USC1-FHVH-160-[IgG1-CH1-TCRd-6MD](서열 번호 17877)이다. BCMA 및 CD38을 표적화하는 AABD-TCR의 백본에 대한 예시적인 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-74-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD38-FHVH-USC1-32184-[IgG1-CH1-TCRd-6MD] 및 CD8SP-BCMA-FHVH-74-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-CD38-FHVH-USC1-32184-[IgG1-CH1-TCRa-wt-op2-6MD]이며 서열 번호 17912 및 17914로 표시된다. CD20 및 CD19를 표적화하는 백본 상의 예시적인 SAR은 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-CD19-FHVH-354-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD] 및 CD8SP-CD20-vHH-USC1-2HC2D6-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD19-FHVH-354-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]이고 각각 서열 번호 18016 및 18023으로 표시된다. SAR은 본질적으로 모듈식이므로 상기 SAR의 AABD는 상이한 항원을 표적화하는 AABD로 대체되어 해당 항원을 표적화하는 SAR을 개발할 수 있다. 예시적인 AABD는 표 5, 7-10에 제공된다. 유사하게, AABD-TCR에서 IgCL 및 IgG1-CH1 링커는 다른 링커로 대체될 수 있다. 예시적인 Ig 유사 링커가 표 13에 제공된다. 추가적인 Ig 유사 링커 도메인은 당 업계에 공지되어 있고 본 개시 내용의 대안적 실시 양태에서 사용될 수 있다. 마지막으로, TCRa-wt-op2-6MD, TCRb-wt-op2-6MD, TCRg-6MD, 및 TCRd-6MD 모듈은 아미노산 수준에서 TCRa-wt-op2-6MD, TCRb-wt-op2-6MD, TCRg-6MD 및 TCRd-6MD의 서열에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 돌연변이 및 단백질 도메인을 포함하는 기능적 변이체로 대체될 수 있다.

표 33은 CD22 및/또는 PSMA를 표적화하는 AABD-TCR 백본 상의 여러 단일 및 이중 사슬 이중특이성 SAR 구축물의 명칭 및 서열 번호를 제공한다. 표 34는 표 13에 열거된 구축물로부터 CD22 및/또는 PSMA를 표적화하는 SVH를 상이한 항원을 표적화하는 SVH로 대체함으로써 유도된 상이한 항원을 표적화하는 여러 단일 및 이중 사슬 이중특이성 SAR 구축물의 명칭 및 서열 번호를 제공한다. 표 34의 구축물의 백본(즉, 항원 결합 도메인을 뺀 프레임워크)은 표 33에 나열된 구축물의 백본과 동일하다. 따라서, 표 34에 나열된 특정 백본을 갖는 구조물의 서열 번호는 표 33을 참조하여 결정될 수 있다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 2개 이상의 항원을 표적화하기 위한 SAR의 유용한 구성을 기재한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 항원의 둘 이상의 에피토프를 표적화하기 위한 SAR의 유용한 구성을 기재한다.

일부 실시 양태에서, SAR은 단일 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 단일 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 단일 사슬 SAR은 상보적인 내인성 TCR 사슬과 쌍을 이루어 SAR의 항원 결합 도메인에 의해 표적화되는 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있는 TCR/CD3 복합체를 조립할 수 있다. 일부 실시 양태에서, SAR은 링커를 통해 연결되고 차례로 단일 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결되는 1개 초과의 항원 결합 단편(예를 들어, SVH, vHH, 센티린 등)을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, SAR은 별개의 T 세포 수용체 불변 사슬에 프레임 내에서 각각 연결된 2개의 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 예를 들어, 항원 결합 도메인 1은 TCRα(Cα)의 불변 사슬에 결합되어 기능 단위 1을 구성하고, 항원 결합 도메인 2는 TCRβ(Cβ)의 불변 사슬에 결합되어 기능 단위 2를 구성한다. 이러한 SAR은 기능적으로 활성이 되기 위해 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, SAR의 2개의 기능 단위는 단일 벡터를 사용하여 공동발현되는 반면, 다른 실시 양태에서 2개의 기능 단위는 상이한 벡터를 사용하여 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, SAR의 2개의 기능 단위는 두 기능 단위를 코딩하는 단일 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동발현되는 반면, 다른 실시 양태에서 2개의 기능 단위는 각각 하나의 기능 단위를 코딩하는 2개의 상이한 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동발현된다.

또 다른 실시 양태에서, SAR은 하나의 T 세포 수용체 불변 사슬(기능 단위 1)에 연결되지만 제2 T 세포 수용체 불변 사슬과 공동발현되는 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 SAR에서 제2 T 세포 수용체 불변 사슬의 목적은 기능 단위 1(예를 들어, T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인 1)의 세포 표면 발현을 촉진하는 것이다. 이와 같이, 제2 T 세포 수용체 불변 사슬은 그 자체로 발현되거나 에피토프 태그(예를 들어, MYC, V5, AcV5, G4Sx2, StrepTagII 등)를 보유하는 융합 단백질로 발현되거나 기능 단위 1의 조립 및 기능을 방해하지 않는 전혀 관련 없는 임의의 단백질 단편(예를 들어, vL 또는 vH 단편)을 보유하는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 예를 들어, SAR은 Cα(TCRα의 불변 사슬)에 연결된 항원 결합 도메인 1 및 비어 있는(즉, 항원 결합 도메인이 없는) Cβ(TCRβ의 불변 사슬)을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이러한 SAR의 2개의 기능 단위는 동일한 세포에서 공동발현되어 기능적으로 활성화된다. 일부 실시 양태에서, SAR의 2개의 기능 단위는 단일 벡터를 사용하여 공동발현되는 반면, 다른 실시 양태에서 2개의 기능 단위는 상이한 벡터를 사용하여 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, SAR의 2개의 기능 단위는 2개의 기능 단위 모두를 코딩하는 단일 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동발현되는 반면, 다른 실시 양태에서 2개의 기능 단위는 각각이 하나의 기능 단위를 코딩하는 2개의 상이한 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동발현된다.

AABD 외에도, 단일 사슬 SAR(예를 들어, 1세대, 2세대 및 3세대 키메라 항원 수용체, ε/γ/δ/TFP, TAC 등) 및 다중 사슬 SAR(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, ab-TCR, αβTFP 또는 γdTFP 등)의 항원 결합 도메인(들)은 항체 또는 항체 단편(vL, vH, Fv, Fab 또는 scFv 등)으로 구성될 수 있다. 일부 SAR(예를 들어, SIR, zSIR, cTCR, Ab-TCR 등)에서, vL 및 vH 단편은 선택적 링커를 통해 그들의 C-말단에서 상이한 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편에 연결되지만 함께 연결되어 vL 및 vH 단편이 유래된 모 항체의 항원 결합 특이성을 유지하는 Fv를 형성한다. 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 경우, 하나 이상의 AABD는 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단에 또는 N-말단에 근처에서 작동 가능하게 연결된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 항원 결합 도메인(들)은 Fv(예를 들어, 상이한 TCR 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되고 단일 사슬 단편 가변 형식 또는 scFv 형식에 존재하지 않는 vL 단편 및 vH 단편) 및 Fv에 의해 결합된 것과 동일한 항원에 특이적인 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하여 2가 결합 분자를 제공한다. 한 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 Fv 및 Fv와 동일한 항원에 특이적이지만 상기 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 다시 말해서, 항원 결합 도메인은 제1 에피토프에 결합하는 Fv 및 제2 에피토프에 결합하는 제2 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 에피토프는 중첩될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인은 이중파라토프이고 본 개시 내용의 범위는 이중파라토프 SAR을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 특이적이고 상기 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 Fv 및 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 Fv 및 하나 이상의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하며, 여기서 Fv 단편은 유의한 친화도로 임의의 어떠한 특정 항원에도 결합하지 않거나 유의하지 않은 친화도로 결합하고 하나 이상의 AABD 부착을 위한 스캐폴드로만 사용된다.

vH 및 SVH 이외에, SAR의 항원 결합 도메인을 포함하는 AABD는 다른 도메인, 예를 들어 vHH 도메인, 및 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예를 들어 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 또는 이들의 단편; 수용체(예를 들어, CD16-V158A, NKG2D), 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴) 등(그러나 이에 제한되지 않음)을 포함할 수 있다.

SAR의 예시적인 구성은 [도 1-2] 및 표 A1-A7에 개략적으로 제시되어 있다.

일부 측면에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL 및 vH 도메인 및 하나 이상의 AABD을 포함한다.

따라서 일부 측면에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나, 전형적으로 하나 초과의 V_H 도메인, 즉, 하나 이상의 V_H 단일 도메인 항체를 포함하고, 경쇄가 없다. 바람직한 실시 양태에서, AABD는 2개 이상의 V_H 단일 도메인(SVH) 항체를 포함한다.

따라서 일부 측면에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나, 전형적으로 하나 초과의 VHH 도메인, 즉, 하나 이상의 VHH 단일 도메인 항체를 포함하고, 경쇄가 없다. 바람직한 실시 양태에서, AABD는 2개 이상의 VHH 단일 도메인을 포함한다.

따라서 일부 측면에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나, 전형적으로 하나 초과의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 즉 sDARPIN, 아피바디, ZIP 도메인(예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 또는 이들의 단편으로부터 선택된 하나 이상의 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 2개의 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 Fv(즉, 결합하여 Fv를 형성하는 vL/vH 단편) 및 적어도 하나의 AABD를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 항원을 표적화하는 적어도 2개의 AABD(예를 들어, 2개의 SVH 도메인 또는 2개의 VHH 도메인 또는 1개의 SVH 및 1개의 VHH 도메인 등)를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 전형적으로 하나 이상의 항원을 표적화하는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 특이적인 2개 또는 2개 이상의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하여 2가 결합 분자를 제공한다. 한 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 특이적이지만 상기 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 2개 또는 2개 이상의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 다시 말해, 항원 결합 도메인은 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등) 및 제2 에피토프에 결합하는 제2 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 에피토프는 중첩될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인은 이중파라토프이고 본 개시 내용의 범위는 이중파라토프 SAR을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 특이적이고 상기 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 2개의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 항원 결합 도메인은 TCR Fv(예를 들어, 상이한 TCR 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되고 단일 사슬 TCR 형식 또는 scTCR 형식에 존재하지 않는 Va/Vb 단편 또는 Vg/Vd 단편) 및 TCR Fv에 의해 결합된 것과 동일한 항원에 특이적인 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하여 2가 결합 분자를 제공한다. 한 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 TCR Fv(예를 들어, Va/Vb 또는 Vg/Vd) 및 TCR Fv와 동일한 항원에 특이적이지만 상기 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 다시 말해서, 항원 결합 도메인은 제1 에피토프에 결합하는 TCR Fv 및 제2 에피토프에 결합하는 제2 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 에피토프는 중첩될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인은 이중파라토프이고 본 개시 내용의 범위는 이중파라토프 SAR을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 특이적이고 상기 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 TCR Fv 및 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 TCR Fv 및 적어도 하나의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하며, 여기서 TCR Fv 단편은 유의한 친화도로 어떠한 특정 항원에도 결합하지 않거나 유의하지 않은 친화도로 결합하고 하나 이상의 AABD 부착을 위한 스캐폴드로만 사용된다. 한 실시 양태에서, 가변 단편(즉, Va, Vb, Vd/Vg)은 HLA 비의존성 TCR, 즉, HLA 분자와 무관하게 항원에 결합할 수 있는 TCR로부터 유래된다. 예시적인 HLA 비의존성 TCR은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질 항원(예를 들어, CD19, CD20, CD22, PSMA, Her2, 메소텔린 등)에 결합할 수 있는 가변 단편을 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 2개의 상이한 항원에 특이적인 2개의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하여 이중특이성 항원 결합 도메인을 제공한다. 다시 말해서, 항원 결합 도메인은 제1 표적에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등) 및 제2 표적에 결합하는 제2 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 이중특이성 SAR에 관한 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이성 SAR" 또는 "이중특이성 항원 결합 도메인"은 따라서 제1 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 결합 분자, 및 제2 항원 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 제2 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 즉 이중특이성 결합 분자는 2개의 표적에 대한 특이성을 갖는다. 제1 표적과 제2 표적은 동일하지 않다. 즉, 상이한 표적, 예를 들어 단백질이다. 둘 다 세포 표면 상에 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 이중특이성 결합 분자는 제1 표적 및 제2 표적을 발현(또는 그의 세포 표면 상에 표시)하는 세포에 선택적으로 및 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 결합 분자는 다중특이성 결합 분자를 제공하는 2개 초과의 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 다중특이성 항원 결합 도메인은 제1 표적에 결합하는 것 외에 하나 이상의 추가 표적에 결합할 수 있다. 즉 다중특이성 폴리펩티드는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 그 이상의 표적에 결합할 수 있으며, 여기서 다중특이성 폴리펩티드 작용제는 각각 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 그 이상의 표적 결합 부위를 갖는다.

따라서 3개 이상의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하는 항원 결합 도메인도 본 발명의 범위 내에 있다.

2개 이상의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)는 링커, 예를 들어 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 또한 Fv를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인과 AABD 사이에 존재할 수 있다. 적합한 링커는 (Gly₄Ser)_n과 같은 GS 잔기를 포함하는 링커를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 10, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 예시적인 링커는 서열 번호(DNA) 1025-1028 및 서열 번호(PRT) 11715-11718에 제공된다(표 8).

링커는 또한 SAR의 Fv를 포함하는 vL 및 vH 도메인과 vL 및 vH 도메인이 작동 가능하게 연결된 TCR 불변 사슬 연결 펩티드 사이에 존재할 수 있다. 이러한 링커의 예는 표 13에 제공된다. 바람직한 실시 양태에서, SAR의 vL 단편은 링커 IgCL(서열 번호 11832)에 작동 가능하게 연결되고 vH 단편은 링커 IgG1-CH1에 작동 가능하게 연결된다. 예시적인 이러한 SAR는 D8SP-CD19-FHVH-354-G4S3-CD19-hu-mROO5-1-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-CD22-FHVH-24-CD19-hu-mROO5-1-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]이며 서열 번호 18093으로 표시된다(표 35). 또 다른 바람직한 실시 양태에서, SAR의 vL 단편은 링커 TCRa-wt-opt-6ECD(서열 번호 11848) 또는 링커 TCRa-Ig-Like-C1-도메인(서열 번호 11859) 또는 이들의 결실 돌연변이체 또는 변이체에 작동 가능하게 연결되고 상보적 vH 단편은 링커 TCRb-wt-opt-6ECD(서열 번호 11850) 또는 링커 TCRb-Ig-Like-C1-도메인(서열 번호 11861) 또는 이들의 결실 돌연변이체 또는 변이체에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 SAR의 예는 CD8SP-CD19-FHVH-354-G4S3-CD19-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-T48C]-F-F2A-SP-CD22-FHVH-24-CD19-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-S57C]이며 서열 번호 18091로 표시된다. 또 다른 바람직한 실시 양태에서, SAR의 vL 단편은 TCRg-opt-6ECD((서열 번호 11852) 또는 TCRg-Ig-유사-C1-도메인(서열 번호 11863) 또는 이들의 결실 돌연변이체 또는 변이체에 작동 가능하게 연결되고 상보적 vH 단편은 링커 TCRd-opt-6ECD(서열 번호 11854) 또는 TCRd-Ig-Like-C1-도메인(서열 번호 11864) 또는 이들의 결실 돌연변이체 또는 변이체에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 SAR의 예는 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRd-opt]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRg1-opt]이며 서열 번호 14788로 표시된다. 일부 실시 양태에서, 잠재적으로 임의의 도메인은 vL/vH 단편이 결합하여 Fv를 형성하는 능력을 방해하지 않는, vL/vH 단편과 TCR 불변 사슬 사이의 링커로서 작용할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 TCR 불변 사슬은 TCRb-wt-opt-6ECD 또는 TCR Ig 유사 C1 도메인, TCR 연결 펩티드, TCR 경막 도메인 및 TCR 시토졸 도메인을 포함한다는 것을 알아야 한다. 다양한 TCR 불변 사슬 및 이들 결실 및 점 돌연변이체가 표 12에 제시되어 있다. 따라서, TCRb-wt-opt-6ECD 및 TCRb-Ig-유사-C1 도메인은 TCRb 불변 사슬의 N-말단 부분을 나타낸다. 유사하게, TCRa-wt-opt-6ECD(서열 번호 11848) 또는 링커 TCRa-Ig-유사-C1-도메인(서열 번호 11859) 도메인은 TCRa 불변 사슬의 N-말단 부분을 나타낸다. 따라서, 다른 방식으로 말하면, 일부 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR 및 이러한 SIR을 포함하는 이중특이성 SAR)에서 vL 단편은 TCRb 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되는 반면 vH 단편은 TCRa 불변 사슬에 작동 가능하게 연결된다. 대안적으로, 일부 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR 또는 이러한 SIR을 포함하는 이중특이성 SAR)에서 vL 단편은 TCRa 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되는 반면 vH 단편은 TCRb 불변 사슬에 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, 일부 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR 또는 이러한 SIR을 포함하는 SAR)에서 vL 단편은 TCRγ 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되는 반면 vH 단편은 TCRδ 불변 사슬에 작동 가능하게 연결된다. 마지막으로, 일부 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR 또는 이러한 SIR을 포함하는 SAR)에서 vL 단편은 TCRδ 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되는 반면 vH 단편은 TCRγ 불변 사슬에 작동 가능하게 연결된다.

일부 실시 양태에서, SAR의 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 AABD는 개재 vL/vH, Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 없이 TCR 불변 사슬 연결 펩티드(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1177-1185; 표 14)에 작동 가능하게 연결된다. AABD-TCR로 지칭되는 이러한 SAR 구축물에서, 링커는 선택적으로 그리고 전형적으로 SAR의 AABD와 AABD가 작동 가능하게 연결된 TCR 불변 사슬 연결 펩티드 사이에 존재한다. 이러한 링커의 예가 표 13에 제공되어 있다. 바람직한 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 AABD 중 하나는 링커 IgCL(서열 번호 11832)에 작동 가능하게 연결되고 다른 AABD는 링커 IgG1-CH1(서열 번호 11833)에 작동 가능하게 연결된다. AABD-TCR의 백본을 갖는 이러한 SAR의 예는 CD8SP-CD22-FHVH-24-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-PSMA-chVH-71v2-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD](서열 번호 6521)이다. AABD-TCR의 백본을 갖는 이러한 SAR 예는 CD8SP-CD22-FHVH-24-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-PSMA-chVH-71v2-[IgG1-CH1-TCRd-6MD](서열 번호 6530)이다. 대안적인 Ig-CH1 링커는 서열 번호 11839-11847(표 13)에 제공되며 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태에서 사용될 수 있다.

본 발명의 SAR의 항원 결합 단위를 형성하는 하나 이상의 AABD(예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)는 SAR이 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 요법에 유용하도록 충분한 친화도로 관심 항원, 즉 표적 항원에 "결합"하거나 "결합할 수" 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "표적"은 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인이 선택적으로 결합할 수 있는 생물학적 분자(예를 들어, 항원, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물)를 지칭한다. 표적은 예를 들어, 세포내 표적(예를 들어, 세포내 단백질 표적) 또는 세포-표면 표적(예를 들어, 막 단백질, 예를 들어, 수용체 단백질)일 수 있다. 바람직하게는, 표적은 세포 표면 단백질과 같은 세포 표면 표적이다.

한 실시 양태에서, SAR의 항원 결합 도메인의 표적은 종양 항원이다. 한 실시 양태에서, 종양 항원은 혈액 악성종양과 연관된다. 또 다른 실시 양태에서, 종양 항원은 고형 종양과 연관된다. 또 다른 실시 양태에서, SAR에 의해 표적화되는 하나 이상의 항원은 항원 표 B에 열거된 항원으로부터 선택된다. 그러나 숙련가는 다른 종양 항원도 본 발명의 범위 내에서 표적임을 이해할 것이다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 HLA-A2와 결합하여 항원에 결합한다. HLA-A2와 결합하여 인식되는 항원의 비제한적 예에는 TARP, WT1, hTERT, gp100, 티로시나제, MART1, NY-ESO1, CMV pp65, EBV EBNA3c, HIV1 gag, HTLV1-Tax, PR1, CMV pp65, EBV-EBNA3c, Ras G12V 돌연변이체, 및 GAD가 포함된다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 자가항체에 결합하는 자가항원 또는 이의 단편을 포함한다. 자가항원의 비제한적인 예는 Dsg1 및 Dsg3을 포함한다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체(SDAB), vH 또는 vL 도메인, 낙타과 vHH 도메인, 또는 비-면역글로불린 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 자가항원, 수용체 또는 리간드의 야생형 또는 비야생형 서열로부터 유래되거나 이들을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 코딩된 SAR 폴리펩티드는 하나 초과의 항원 결합 도메인을 함유한다. 한 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 TCR 도메인(즉, TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬)의 NH2-말단 끝에 직접적으로 또는 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된다. 몇 가지 예시적인 링커의 핵산 및 아미노산 서열이 표 11 및 13에 제공되어 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 특정 항원에 결합하는 가변 단편(Fv)을 공동으로 구성하는 T 세포 수용체의 2개의 불변 사슬(즉, 본원에 기재된 바와 같은 TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마, 또는 TCR-델타의 불변 사슬, 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체)의 NH2 말단에 별도로 작동 가능하게 연결된 항체의 vL 및 vH 도메인으로부터 유래하거나 그로 구성된다. CD19를 표적화하는 이러한 SAR의 예는 D8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](DNA 서열 번호 7348 및 아미노산 서열 번호 18038)에 제공되어 있다. 이 SAR에서, CD19 단클론 항체인 인간화 mROO5-1로부터 유래한 vL 단편은 돌연변이 인간 TCRb 사슬 [hTCRb-S57C]의 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는 반면 인간화 mROO5-1 단클론 항체로부터 유래한 vH 단편은 돌연변이 인간 TCRα 사슬 [hTCRa-T48C]의 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다. SIR의 백본을 갖는 이 SAR은 상이한 AABD를 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 부착함으로써 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제조하는 데 사용할 수 있다. 표 29는 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](DNA 서열 번호 7348 및 아미노산 서열 번호18038)을 기반으로 하는 여러 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR의 서열 번호를 포함한다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드는 단일 사슬 가변 단편(scFv)으로 발현되고 T 세포 수용체의 불변 사슬(즉, TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마, 또는 TCR-델타의 불변 사슬, 이들의 변이체 또는 돌연변이체) 중 하나의 NH2-말단에 연결된 항원 결합 도메인을 갖는다. 이러한 SAR(SIR)의 예는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (DNA 서열 번호 7352 및 PRT 서열 번호 18042)이다. SIR의 백본을 갖는 이 SAR은 scFv의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 상이한 AABD를 부착함으로써 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제조하는 데 사용할 수 있다. 표 29는 SAR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC(DNA 서열 번호 7352 및 PRT 서열 번호 18042)을 기반으로 한 몇몇 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR의 서열 번호를 포함한다. CD19 및 CD22를 표적화하는 이러한 이중특이성 SAR의 예는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD22-FHVH-24-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-Gly-Ser-링커-hu-mROO5-1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC(DNA 서열 번호 4127 및 아미노산 서열 번호 14817)이다.

특정 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 2개의 폴리펩티드 사슬의 AABD는 구조가 유사하다(예를 들어, AABD 둘 모두가 SVH 또는 낙타과 VHH 도메인 또는 아피바디 또는 센티린임). 한 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 2개의 폴리펩티드 사슬의 AABD는 구조가 유사하지 않다(예를 들어, 제1 항원 결합 도메인은 SVH이고 제2 항원 결합 도메인은 낙타과 VHH이다).

일부 실시 양태에서, 코딩된 SAR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 상응하는 야생형 서열 또는 비-야생형 서열 항체, 단일 도메인 항체(SDAB), VH 도메인, VL 도메인, 낙타과 VHH 도메인, 또는 비-면역글로불린 스캐폴드 예컨대 DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, 자가항원, 수용체 또는 리간드의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 10736 내지 10972의 경쇄 가변 도메인(vL 또는 VL) 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10736 내지 10972의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736 내지 10972의 상보성 결정 영역(CDR)에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열, 또는 10736 내지 10972의 3개의 상보성 결정 영역 각각에 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 3은 본 개시 내용에서 사용된 예시적인 vL 도메인의 표적 항원, 명칭, 서열 번호(DNA), 서열 번호(PRT), scFv의 서열 번호(PRT)를 나타낸다. 한 실시 양태에서, vL 도메인은 기원이 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간일 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 10978 내지 11214의 중쇄 가변 도메인(vH 또는 VH) 아미노산 서열, 또는 서열 번호의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 10978 내지 11214의 중쇄 가변 도메인(vH 또는 VH) 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10978 내지 11214의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978 내지 11214의 상보성 결정 영역(CDR)에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열, 또는 10978 내지 11214의 3개의 상보성 결정 영역 중 임의의 것에 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 3은 본 개시 내용에서 사용된 예시적인 vH 도메인의 표적 항원, 명칭, 서열 번호(DNA), 서열 번호(PRT), scFv의 서열 번호(PRT)를 나타낸다. 한 실시 양태에서, vH 도메인은 기원이 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간일 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 11517-11592의 낙타과 단일 도메인 항체(vHH 또는 VHH) 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11517-11592의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11517-11592의 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 중 임의의 것에 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 5는 본 개시 내용에서 사용된 예시적인 vHH 도메인의 표적 항원, 명칭, 서열 번호(DNA), 및 서열 번호(PRT)를 나타낸다. 한 실시 양태에서, vHH 도메인은 인간화, 키메라 또는 비인간일 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 11662-11673의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11662-11673의 아미노산 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 7은 본 개시 내용에서 사용된 예시적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드의 표적 항원, 명칭, 서열 번호(DNA), 서열 번호(PRT), 명칭을 나타낸다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 11674-11691의 수용체 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11674-11691의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 8은 SAR의 구축에 사용될 수 있는 수용체의 서열 번호(DNA), 서열 번호(PRT), 및 명칭을 나타낸다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 19개의 아미노산 잔기 그러나 20개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 11687의 자가항원 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11687의 아미노산 서열에 대해 70-1009% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 표 8은 예시적인 자가항원의 서열 번호(DNA), 서열 번호(PRT), 및 명칭을 나타낸다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 11692 내지 11702의 리간드 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11692 내지 1170의 아미노산 서열에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 9는 다양한 예시적인 리간드의 서열 번호(DNA), 서열 번호(PRT), 및 명칭을 나타낸다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 40개의 아미노산 잔기 그러나 41개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 서열 번호 11220-11456의 scFv 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11220-11456의 아미노산 서열에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11220-11456 각각에 6개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70-100% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11220-11456 각각에 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 중 임의의 것에서 3개 이하의 치환을 갖는 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 3은 본 개시 내용에서 사용된 예시적인 scFv의 표적 항원, 명칭, 서열 번호(DNA), 서열 번호 (PRT), 명칭 및 아미노산 서열을 나타낸다. 한 실시 양태에서, scFv는 기원이 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간일 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 해당 항원을 표적화하는 vL 및 vH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR 또는 표 3에 나열된 vL 및 vH 단편의 임의의 CDR에 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는 도메인 중 어느 하나 이상을 포함한다. 표 3에 나열된 vL 및 vH 단편의 CDR1-3의 서열은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 해당 항원을 표적화하는 vHH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR 중 어느 하나 이상을 포함한다. 다양한 항원을 표적화하는 vHH 단편의 서열 번호는 표 5에 열거되어 있고, 그의 상응하는 CDR1-3의 서열은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

한 실시 양태에서, SAR의 항원 결합 도메인은 해당 표적 항원에 결합하는 것으로 알려진 수용체의 항원 결합 부분이다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SAR 폴리펩티드를 포함하는 수용체의 항원 결합 영역 중 어느 하나 이상을 포함한다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SAR 폴리펩티드를 포함하는 리간드의 항원 결합 영역 중 어느 하나 이상을 포함한다.

일부 실시 양태에서, SAR 폴리펩티드의 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SAR 폴리펩티드를 포함하는 비-면역글로불린 스캐폴드의 항원 결합 영역 중 어느 하나 이상을 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 임의의 SAR로서 표 25-36에 기재된 상이한 표적 상의 동일한 에피토프에 결합하는 SAR(즉, 본 개시 내용의 임의의 SAR과 상이한 표적에 대한 결합에 대해 교차 경쟁하는 능력을 갖는 SAR)을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이들 SAR의 항원 특이적 도메인은 SAR의 성분으로서 사용된 항체의 vL 단편, vH 단편 및/또는 scFv 단편으로부터 결정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표 25-36에 기재된 개시 내용의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 항체는 표 3-9에 나타낸 바와 같은 서열 번호를 갖는 vL, vH, scFv, SVH, vHH, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인이다. 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 11323으로 표시되는 참조 scFv hu-mROO5-1은 표 25-36에 기재된 개시 내용의 hu-mROO5-1-기반 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구에서 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 표 25-36에 기재된 개시 내용의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 AABD 단편은 표 5에 나타낸 바와 같은 서열 번호를 갖는 AABD 단편이다. 일부 실시 양태에서, 표 25-36에 기재된 개시 내용의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 표 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 기반 AABD이다. 일부 실시 양태에서, 표 25-36에 기재된 개시 내용의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 리간드는 표 9에 기재된 서열 번호를 갖는 리간드이다. 일부 실시 양태에서, 상이한 표적을 표적화하는 SAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 SAR은 표 25-36에 나열된 서열 번호를 갖는 SAR이다.

본원에 기재된 SAR은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 코딩되고 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. SAR을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열(신호 펩티드로도 알려짐)을 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, SAR의 각각의 기능 단위(예를 들어, T 세포 수용체 불변 사슬 + 퓨린-SGSG-절단성 링커 또는 T 세포 수용체 불변 사슬 + 퓨린-SGSG-절단성 링커에 결합된 항원 결합 도메인)에 I형 막 관통 단백질로서 SAR을 세포 표면으로 지시하는 신호 펩티드를 코딩하는 리더 서열이 선행될 수 있다. 한 실시 양태에서, SAR의 항원 결합 도메인은 세포외를 향하고 있다. 일부 실시 양태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열(3-9개의 핵산)은 SAR의 상이한 서브유닛 사이, 예를 들어 신호 서열과 SAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합 및 TCR 사슬 사이에 위치한다,

한 실시 양태에서, 상이한 TCR 불변 사슬을 갖는 SAR이 생성될 수 있다. TCR 불변 사슬은 그들의 야생형 서열, 비야생형 서열 또는 코돈 최적화된 서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, TCR 불변 사슬은 특이적 돌연변이를 보유할 수 있다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 서로의 페어링(pairing)을 향상시키고 내인성 TCR 사슬과의 페어링을 감소시키기 위해 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TCRβ 불변 사슬). SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 사슬은 표 12에 제공된다. SAR의 TCR 도메인의 돌연변이는 각각 표적 또는 세포에 대한 SAR의 결합 친화도 및/또는 발현을 변형한다. 예를 들어, 본 개시 내용은 페어링 또는 발현을 촉진시키기 위한 TCR 사슬에서의 핵산 서열 코돈 최적화 및/또는 돌연변이 및/또는 결합 도메인과 TCR 도메인 사이에 링커의 사용을 기초로 하여 설계 및 스크리닝될 수 있는 특정 항원 표적에 대한 다양한 집단의 SAR을 고려한다. 일부 실시 양태에서, 풀로부터 SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 유사한 조건에서 분석될 때 동일한 도메인(예를 들어, 테스트 SAR에 존재하는 것과 동일한 scFv로부터 유래된 결합 도메인)을 포함하는 풀로부터 또 다른 SAR을 발현하는 비슷한 면역 이펙터 세포와 비교하여 항원 결합 친화도, 세포 표면 발현, 세포 신호전달, NFAT 리포터 활성, 세포독성, 사이토카인 분비, 증식, 생체 내 지속성, 고갈 마커의 발현, 및 생체 내 활성의 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성에서 2배 초과, 5배 초과, 10배 초과, 심지어 100배 초과의 차이를 나타낸다. 본 개시 내용은 라이브러리 또는 "풀"이 다양한 결합 친화도, 발현 수준 및 기능적 특징(예를 들어, 세포독성, 사이토카인 생산 및 장기간 지속성)을 갖는 SAR을 제공하도록 X가 항원 결합 도메인 표적인 X-SAR 분자의 라이브러리를 고려한다. 일부 실시 양태에서, 풀의 SAR은 유사한 조건에서 분석될 때 동일한 도메인(예를 들어, 테스트 SAR에 존재하는 것과 동일한 scFv로부터 유래된 결합 도메인)을 포함하는 풀의 또 다른 SAR와 비교하여 면역 이펙터 세포에서 발현될 때 항원 결합 친화도, 세포 표면 발현, 세포독성, 사이토카인 분비, T 세포 증식, T 세포 지속성, T 세포 고갈, 및 생체 내 활성의 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성에서 2배 초과, 일반적으로 5배 초과, 더욱더 바람직하게는 10배 초과, 더욱더 일반적으로 100배 초과의 차이를 갖는다. 풀의 상이한 SAR은 차세대 시퀀싱 또는 당 업계에 공지된 다른 기술에 의한 식별을 허용하기 위해 상이한 DNA 바코드로 태깅될 수 있다. 예시적인 바코드는 서열 번호 25 내지 30으로 제시된다. 바코드는 SAR의 발현을 방해하지 않도록 편리한 위치에서 SAR을 코딩하는 벡터에 삽입될 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, 바코드는 SAR의 정지 코돈의 바로 하류에 삽입된다. 당업자는 본원에 기재된 분석 중 어느 하나 이상을 사용하여 원하는 결합 친화도, 발현 수준 또는 기능적 특징을 갖는 X-SIR을 식별하기 위해 이러한 풀을 스크리닝할 수 있다. 상이한 SAR 또는 상이한 SAR 풀은 상이한 질환 및 질환 상태에 적합할 수 있고 다양하고 다클론성 면역 반응을 생성하기 위해 조합될 수 있다. 따라서, 표적에 대해 더 높은 친화도를 갖는 SAR을 발현하는 T 세포는 단기간에 종양 세포를 사멸시키는 데 더 효과적일 수 있지만 빠르게 소진될 수 있고/거나 생체 내에서 단기간 지속성을 가질 수 있다. 고친화도 SAR을 발현하는 이러한 T 세포는 저친화성 SAR을 발현하는 T 세포와 조합될 수 있으며, 이는 단기간에 종양 세포를 사멸시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만 생체 내에서 빠르게 소진되지 않고/거나 더 오래 지속할 수 있다. 상이한 SAR 풀을 포함하는 본 개시 내용의 SAR은 또한 다양한 면역 반응을 생성하기 위해 SAR-NK 세포와 같은 다른 유전적으로 조작된 T 세포와 조합될 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 X-SAR의 라이브러리를 제공한다.

한 실시 양태, 실시 양태 중 하나, 하나의 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRα의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태, 실시 양태 중 하나, 하나의 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRγ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRδ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 하나의 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 preTCRα의 불변 사슬을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬을 포함한다. 한 실시 양태에서, 폴리펩티드 중 하나의 링커 도메인은 서열 번호 11832로 열거된 링커를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 링커 도메인은 서열 번호 11833-11847로부터 선택된 링커 중 하나를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 사슬 중 하나는 일반식

AABD(n)―선택적 링커1-vL-선택적 링커2-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)

(여기서 n은 1 이상임)을 갖고; 제2 사슬은 일반식

AABD(n)―선택적 링커3-vH-선택적 링커4-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 0 이상이고; 한 실시 양태에서, n은 1 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5임)을 갖는다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드의 vL은 다른 폴리펩티드의 vH와 결합하여 항원에 결합하는 가변 단편(Fv)를 형성한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드의 vL은 다른 폴리펩티드의 vH와 결합하여 항원에 결합하지 않고 AABD 부착을 위한 백본 또는 스캐폴드로서만 작용하는 가변 단편(Fv)을 형성한다. AABD는 또한 항원 결합 도메인을 형성하고 세포에서 발현될 때 세포외 측에 위치한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRα의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRγ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRδ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 preTCRα의 불변 사슬을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬을 포함한다. 한 실시 양태에서, 폴리펩티드 중 하나의 링커2 도메인은 서열 번호 11832로 나열된 링커를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 링커4 도메인은 서열 번호 11833-11847로부터 선택된 링커 중 하나를 포함한다. 한 실시 양태에서 링커2 및 링커4는 선택적이다. 한 실시 양태에서, 링커1 및 링커3은 서열 번호 11715-11717을 갖는 링커를 포함한다. 한 실시 양태에서, 링커1 및 링커3은 선택적이다. 예시적인 SAR은 [도 1-2] 및 표 A1-A7에 개략적으로 제시되어 있다.

AABD　(n)―선택적 링커1-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 1 이상임)을 갖고 제2 사슬은 일반식

AABD　(n)―선택적 링커3-scFv-선택적 링커4-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 0 이상이고; 한 실시 양태에서, n은 1 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5임)을 갖는다. 한 실시 양태에서, scFv는 항원에 결합한다. AABD는 또한 항원 결합 도메인을 형성하고 세포에서 발현될 때 세포외 측에 위치한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRα의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRγ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRδ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 preTCRα의 불변 사슬을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬을 포함한다. 한 실시 양태에서, 폴리펩티드 중 하나의 링커2 도메인은 서열 번호 11832로 나열된 링커를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 링커4 도메인은 서열 번호 11833-11847로부터 선택된 링커 중 하나를 포함한다. 한 실시 양태에서 링커2 및 링커4는 선택적이다. 한 실시 양태에서, 링커1 및 링커3은 서열 번호 11715-11717을 갖는 링커를 포함한다. 한 실시 양태에서, 링커1 및 링커3은 선택적이다.

예시적인 SAR은 표 A1-A7 및 [도 1- 2]에 개략적으로 제시되어 있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 사슬 중 하나는 일반식 AABD(n)―선택적 링커1-Va-선택적 링커2-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 0 이상임)을 갖고; 제2 사슬은 일반식 AABD(n)―선택적 링커3-Vb-선택적 링커4-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 0 이상이고, 한 실시 양태에서 n은 1 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5임)을 갖는다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드의 Va는 다른 폴리펩티드의 Vb와 결합하여 항원에 결합하는 TCR 가변 단편(TCR-Fv)를 형성한다. AABD는 또한 항원 결합 도메인을 형성하고 세포에서 발현될 때 세포외 측에 위치한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRα의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRβ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 사슬 중 하나는 일반식 AABD(n)―선택적 링커1-Vg-선택적 링커2-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 0 이상임)을 갖고; 제2 사슬은 일반식 AABD(n)―선택적 링커3-Vd-선택적 링커4-세포외 도메인-경막 도메인-선택적 세포내 신호전달 도메인(n)(여기서 n은 0 이상이고, 한 실시 양태에서 n은 1 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5임)을 갖는다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드의 Vg는 다른 폴리펩티드의 Vd와 결합하여 항원에 결합하는 TCR 가변 단편(TCR-Fv)를 형성한다. AABD는 또한 항원 결합 도메인을 형성하고 세포에서 발현될 때 세포외 측에 위치한다. 한 실시 양태에서, 한 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRγ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드 사슬의 세포외 및 경막 도메인은 TCRδ의 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 이중 사슬 SIR, 1.5 사슬 SIR, 이중 사슬 cTCR, 1.5 사슬 cTCR, 이중 사슬 ab-TCR, 1.5 사슬 ab-TCR, AABD-TCR, 단일 사슬 TFP, 이중 사슬 TFP, 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, TAC, TCR 등의 백본을 갖는다.

2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 백본을 갖는 이중특이성 및 다중특이성 단일 사슬 키메라 항원 수용체(CAR)는 당 업계에서 설명되었다. 이러한 CAR 구축물은 일반적으로 힌지, 경막, 공동자극, 및 활성화 도메인에 직렬로 부착되는 2개 이상의 scFv로 구성된다. 이러한 이중특이성 및 다중특이성 구축물의 주요 문제는 scFv 도메인의 비특이적 응집이며, 이는 발현 불량, 하나 이상의 표적 항원에 대한 결합 감소, 신호전달 감소, 이펙터 기능 감소, 강장성 신호전달, 조기 소진 및 생체 내 효능 감소를 초래한다. 따라서, 임상 시험에서 CD19 및 CD20을 모두 표적화하는 이중특이성 2세대 CAR 구축물이 단일특이성 CD19 CAR 구축물과 비교하여 더 낮은 효능을 나타냈다는 것이 최근 보고되었다. SIR의 백본 상의 이중특이성 및 다중특이성 구축물은 WO2018102795에 기술되었다. 이들 이중특이성 및 다중특이성 이중 사슬 SIR 구축물은 2개의 상이한 TCR 불변 사슬에 부착된 표적화 2개의 scFv 또는 2개의 vHH 단편으로 구성된다. 제1 TCR 불변 사슬에 부착된 하나의 scFv 및 제2 TCR 불변 사슬에 부착된 비-scFV 항원 결합 도메인(예를 들어, vHH 또는 DARPIN 또는 아피바디)과 같은 대안적인 구성도 기술되었다. 그러나 단일 사슬 이중특이성/다중특이성 CAR 구축물과 유사하게, 이들 이중특이성 및 다중특이성 SIR 구축물은 발현 불량, 하나 이상의 표적 항원에 대한 결합 감소, 신호전달 감소 및 이펙터 기능 감소의 문제를 겪었다. 본 개시 내용은 결합 도메인의 신규 조성, 상이한 도메인 사이의 최적 링커 및 신규 구성을 제공함으로써 이중특이성 및 다중특이성 구축물을 생성하는 오랜 문제에 대한 해결책을 제공한다. 본 개시 내용은 당 업계에 기술된 구축물에 비해 우수한 발현, 결합 활성, 신호전달, 지속성, 이펙터 기능(예를 들어, 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생산 및 세포독성 등) 및 시험관 내 특성을 갖는 최적화된 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제공한다.

본원에 기재된 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성 또는 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 친화도와 비교하여 각각의 표적 항원에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 친화도를 나타낸다. 결합 친화도는 Topanga 분석과 같은 당업계에 알려진 분석을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 신호전달 활성과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 신호전달 활성을 나타낸다. 신호전달 활성은 Jurkat-NFAT-GFP 세포 분석과 같은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 사이토카인 생산과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 사이토카인(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등) 생산을 나타낸다. 사이토카인 생산(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등)은 ELISA와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 세포독성 활성과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등)의 세포독성 활성을 나타낸다. 세포독성 활성은 Matador 또는 방사성 크롬 방출 분석과 같은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 생체 내 활성과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 생체 내 활성을 나타낸다. 한 실시 양태에서, 생체 내 활성은 면역결핍 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 측정한다.

본원에 기재된 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 친화도와 비교하여 하나 이상의 표적 항원에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등)의 친화도를 나타낸다. 본원에 기재된 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 2개 이상의 scFv 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 상응하는 구축물의 친화도와 비교하여 하나 이상의 표적 항원에 대해 적어도 10% 더 큰 친화도(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)를 나타낸다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 단일특이성 SAR과 비교하여 하나 초과의 항원에 대해 우수한 결합 친화도를 나타낸다. 결합 친화도는 Topanga 분석과 같은 당 업계에 알려진 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, SAR CD8SP-CD22-FHVH-24-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 4163) 또는 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-Apa-CD16-V158-v2-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 4723)을 발현하는 T 세포는 CD19-ECD-GGS-NLuc 시약(서열 번호 11971)을 사용한 Topanga 분석에 의해 측정된 바와 같이 단일특이성 SAR CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 7346)를 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19에 대해 적어도 30% 결합 친화도를 나타낸다. 또한, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 7346을 갖는 단일특이성 CD19 SAR을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD22 및 CD20에 대한 더 큰 결합을 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 CD22-FHVH-24 결합 도메인이 개재 vL 영역 또는 Ig 링커 없이 TCRα 사슬(hTCRa-CSDVP)에 직접 부착되고 CD20-vHH-2HCD25 결합 도메인이 개재 vH 또는 Ig 링커 없이 TCRb 사슬(hTCRb-KACIAH)에 직접 부착된 CD22xCD20 이중특이성 구축물 CD8SP-CD22-FHVH-24-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 21626)를 발현하는 T 세포와 비교하여 CD22 및 CD20에 대한 더 큰 결합을 나타낸다.

본원에 기재된 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성/다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 2개 이상의 scFv 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 상응하는 이중특이성/다중특이성 구축물의 친화도와 비교하여 하나 이상의 표적 항원에 대해 적어도 10% 더 큰 친화도(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)를 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 4088을 갖는 이중특이성 CD19xCD20 SAR CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC를 발현하는 T 세포는 구축물 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-CD20-7D8-scFv-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 21627)를 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19 및/또는 CD20에 대한 적어도 10% 더 큰 결합 친화도를 나타낸다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 신호전달 활성과 비교하여 하나 이상의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 신호전달 활성을 나타낸다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 단일특이성 SAR과 비교하여 하나 초과의 항원 발현 세포에 대해 우수한 신호전달 활성을 나타낸다. 신호전달 활성은 Jurkat-NFAT-GFP(JNG) 세포 분석과 같은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163 또는 서열 번호 4723을 갖는 SAR을 발현하는 JNG 세포는 CD19 항원을 발현하는 RAJI 세포와 유사한 조건하에서 배양될 때 서열 번호 7346을 갖는 SAR을 발현하는 JNG 세포에서 관찰된 바와 같이 적어도 30% GFP 유도를 나타낸다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 JNG 세포는 서열 번호 7346을 갖는 CD19 단일특이성 SAR을 발현하는 JNG 세포와 비교하여 CD19-null(예를 들어, CD19-KO), 그러나 CD22+ 및 CD20+ RAJI 세포와 공동 배양될 때 더 큰 GFP 유도를 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 JNG 세포는 CD22xCD20 이중특이성 구축물을 발현하는 JNG 세포와 비교하여 CD22 및 CD20에 대한 더 큰 결합을 나타낸다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성/다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 2개 이상의 scFv 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 상응하는 이중특이성/다중특이성 구축물의 신호전달 활성과 비교하여 하나 이상의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 10% 더 큰 신호전달 활성(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)를 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 4088을 갖는 이중특이성 CD19xCD20 SAR을 발현하는 JNG 세포는 구축물 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-CD20-7D8-scFv-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 21627)를 발현하는 JNG 세포와 비교하여 RAJI(CD19+/CD20+) 및/또는 RAJI-CD19-KO(CD19-/CD20+) 세포와 24시간 공동 배양될 때 적어도 10% 더 큰 GFP 유도를 나타낸다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 세포독성 활성과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 세포독성 활성을 나타낸다. 세포독성 활성은 Matador 또는 방사성 크롬 방출 분석과 같은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 4163 또는 서열 번호 4723을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포는 유사한 조건하에 분석될 때 서열 번호 7346을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포에서 관찰된 바와 같이 RAJI 세포에 대한 적어도 30%의 세포독성을 나타낸다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 7346을 갖는 CD19 단일특이성 SAR을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19-null(예를 들어, CD19-KO), 그러나 CD22+ 및 CD20+ RAJI 세포와 공동 배양될 때 더 세포독성을 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 21626을 갖는 CD22xCD20 이중특이성 구축물을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19-/CD22+/CD20+에 대한 더 큰 세포독성을 나타낸다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성/다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 2개 이상의 scFv 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 상응하는 이중특이성/다중특이성 구축물의 세포독성과 비교하여 하나 이상의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 10% 더 큰 세포독성(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)를 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 4088을 갖는 이중특이성 CD19xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 구축물 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-CD20-7D8-scFv-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC를 발현하는 T 세포와 비교하여 RAJI(CD19+/CD20+) 및/또는 RAJI-CD19-KO(CD19-/CD20+) 세포와 24시간 공동 배양될 때 적어도 10% 큰 세포독성을 나타낸다.

본원에 기재된 한 실시 양태에서, vL/vH 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 부착된 어댑터 결합 도메인을 포함하는 개시 내용의 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 별도의 TCR 불변 사슬에 개별적으로 부착된 하나의 scFV 및 하나의 어댑터 결합 도메인을 포함하는 상응하는 이중특이성/다중특이성 구축물의 세포독성과 비교하여 하나 이상의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 10% 더 큰 세포독성(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 4342를 갖는 SAR CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-Apa-RZip-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC를 발현하는 T 세포는 구축물 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-IgSP-RZIP-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC(서열 번호 21628)를 발현하는 T 세포와 비교하여 EZip-태깅된 허셉틴 또는 Her2-huMab4D5-D98W-scFv-G4S-EZIP(서열 번호 12182)의 존재하에 SKOV3 세포(Her2+/CD19-)와 24시간 동안 공동 배양될 때 적어도 10% 더 큰 세포독성을 나타낸다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 사이토카인 생산과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 초과 등) 사이토카인(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등) 생산을 나타낸다. 사이토카인 생산(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등)은 ELISA와 같은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 4163 또는 서열 번호 4723을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포는 유사한 조건하에서 RAJI 세포와 공동 배양될 때 서열 번호 7346을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포에서 관찰된 바와 같이 적어도 30% TNFα, IFNγ 및/또는 IL2 생산을 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 7346을 갖는 CD19 단일특이성 SAR을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19-null(예를 들어, CD19-KO), 그러나 CD22+ 및 CD20+ RAJI 세포와 공동 배양될 때 더 큰 TNFα, IFNγ 및 IL2 생산을 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 21626을 갖는 CD22xCD20 이중특이성 구축물을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19-/CD22+/CD20+와 공동 배양될 때 더 큰 TNFα, IFNγ 및 IL2 생산을 나타낸다.

본원에 기재된 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성/다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 2개 이상의 scFv 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 상응하는 이중특이성/다중특이성 구축물의 사이토카인 생산과 비교하여 하나 이상의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 10% 더 큰 사이토카인 생산(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)를 나타낸다.

본원에 기재된 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 생체 내 활성과 비교하여 각각의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 생체 내 활성을 나타낸다. 한 실시 양태에서, 생체 내 활성은 면역결핍 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 4163 또는 서열 번호 4723을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포는 NSG 면역결핍 마우스에서 RAJI 이종이식 모델을 사용하여 분석될 때 서열 번호 7346을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포에서 관찰된 바와 같이 적어도 30% 종양 감소를 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 7346을 갖는 CD19 단일특이성 SAR을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19-null(예를 들어, CD19-KO), 그러나 CD22+ 및 CD20+ RAJI 세포에 대해 더 큰 생체 내 활성을 나타낸다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 서열 번호 4163을 갖는 다중특이성 CD19xCD22xCD20 SAR을 발현하는 T 세포는 서열 번호 21626을 갖는 CD22xCD20 이중특이성 구축물을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19-/CD22+/CD20+ RAJI 세포에 대한 더 큰 생체 내 활성을 나타낸다.

본원에 기재된 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 이중특이성/다중특이성 SAR은 이펙터 세포에서 발현되고 유사한 조건하에 비교될 때 2개 이상의 scFv 기반 항원 결합 도메인을 포함하는 상응하는 이중특이성/다중특이성 구축물의 생체 내 항-종양 활성과 비교하여 하나 이상의 표적 항원 발현 세포에 대해 적어도 10% 더 큰 생체 내 항-종양 활성(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% 또는 200% 더 큰 친화도 등)를 나타낸다.

일부 실시 양태에서, 세포의 표면상에서 발현될 때, 이중특이성 SAR의 Fv(즉, vL/vH 단편)에 포함된 항원 결합 도메인의 동족 항원에 대한 결합은 상기 SAR의 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단 영역에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 AABD에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 세포의 표면상에서 발현될 때, SAR의 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단 영역에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 AABD를 포함하는 이중특이성/다중특이성 SAR의 Fv(즉, vL/vH 단편)에 포함된 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합은 AABD가 없는 상응하는 단일특이성 SAR의 결합 친화도의 적어도 30%(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등)이다. 한 실시 양태에서, SAR은 단일 사슬 SAR(예를 들어, 2세대 CAR 또는 단일 사슬 TFP 또는 TAC)이다. 한 실시 양태에서, SAR은 이중 사슬 SAR(예를 들어, 이중 사슬 SIR, 이중 사슬 cTCR, 이중 사슬 Ab-TCR, 이중 사슬 TFP, 이중 사슬 zSIR 등)이다. 예시적인 실시 양태에서, AABD는 SVH, SVL, FHVH, vHH, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인, 어댑터 결합 도메인, 에피토프 태그, 미모토프, 자가-항원, 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 리간드의 수용체 결합 도메인, Fc 결합 수용체 등이다.

일부 실시 양태에서, 세포의 표면상에서 발현될 때, SAR의 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단 영역에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 AABD를 포함하는 이중특이성 SAR의 Fv(즉, vL/vH 단편)에 포함된 항원 결합 도메인의 항원 결합 친화도는 하나 이상의 AABD가 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단 영역에 작동 가능하게 연결되지 않은 상응하는 단일특이성 SAR의 항원 결합 도메인의 항원 결합 친화도의 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.

일부 실시 양태에서, SAR(또는 CAR)의 상기 제2 사슬의 존재하에 그의 동족 항원에 대한 SAR의 상기 제1 사슬의 항원 결합 도메인의 결합은 SAR(또는 CAR)의 제2 사슬의 부재 하에 그의 동족 항원에 대한 SAR의 상기 제1 사슬의 항원 결합 도메인의 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 예를 들어, 제1 사슬이 TCRα에 연결된 CD19를 표적화하는 scFV로 구성되고 제2 사슬이 TCRβ2에 연결된 CD123을 표적화하는 낙타과 vHH 단편으로 구성된 이중 사슬 SAR을 세포가 발현하는 경우, SAR의 상기 제2 사슬의 존재하에 SAR의 상기 제1 사슬의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원(즉, CD19)에 대한 결합은 동족 항원(즉, CD123)에 대한 SAR의 상기 제2 사슬의 부재하에 SAR의 제1 사슬의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원(즉, CD19)에 대한 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 또 다른 예에서, 제1 사슬이 TCRα에 작동 가능하게 연결된 CD19를 표적화하는 FMC63 항체의 vL 단편으로 구성되고 제2 사슬이 TCRβ2에 작동 가능하게 연결된 CD19를 표적화하는 FMC63 항체의 vH 단편으로 구성된 이중 사슬 SAR을 CD123을 표적화하는 vHH를 포함하는 CAR과 함께 세포가 발현하는 경우, 상기 CAR의 존재하에 이중 사슬 SAR의 상기 제1 및 제2 사슬의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원(즉, CD19)에 대한 결합은 동족 항원(즉, CD123)에 대한 CAR의 부재하에 이중 사슬 SAR의 제1 사슬 및 제2 사슬의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원(즉, CD19)에 대한 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.

일부 실시 양태에서, 세포의 표면상에 존재할 때, 이중 사슬 SAR의 상기 제1 사슬 및 상기 제2 사슬의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 적게 결합한다. 일부 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR의 상기 제1 사슬 및 상기 제2 사슬의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 99% 적게 결합한다.

일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 vL 단편을 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, 하나 이상의 vL 단편은 표 3에 기재되어 있다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 vL 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 46-282 중 어느 하나 이상에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 vL 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나 이상에 제시된 서열 또는 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, SAR의 항원 특이적 도메인은 하나 이상의 vH 단편을 포함한다. 예시적인 실시 양태에서, 하나 이상의 vH 단편은 표 3에 기재되어 있다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 vH 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 288-524 중 어느 하나 이상에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 vH 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나 이상에 제시된 서열 또는 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.

예시적인 실시 양태에서, 하나 이상의 AABD(예를 들어, VHH(또는 vHH) 또는 SVH) 단편은 표 4에 기재되어 있다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 AABD(예를 들어, VHH(또는 vHH) 또는 SVH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 830-902 중 어느 하나 이상에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 AABD(예를 들어, VHH(또는 vHH) 또는 SVH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 11520-11592 중 어느 하나 이상에 제시된 서열 또는 서열 번호 11520-11592 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11520-11592 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11520-11592 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11520-11592 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11520-11592 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.

예시적인 실시 양태에서, 하나 이상의 AABD는 표 7에 기재된 바와 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드이다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 972-983 중 어느 하나 이상에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열 또는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.

예시적인 실시 양태에서, 하나 이상의 AABD는 수용체의 리간드 결합 도메인이다. 수용체의 이러한 리간드 결합 도메인의 예는 표 8에 기재되어 있다. 예시적인 실시 양태에서, 하나 이상의 AABD는 서열 번호 11674 내지 11691 또는 서열 번호 11674 내지 11691 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 수용체의 리간드 결합 도메인이다.

한 실시 양태에서, V_H　도메인은 서열 번호 11517-11592와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 기타 변형을 갖고, 단일 도메인 항체의 생물학적 기능을 유지하는 서열 번호 11517-11592로부터 선택된다.

한 실시 양태에서, 변형은 보존적 서열 변형이다. 따라서, 본 개시 내용의 단일 도메인 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 항체는 본원에 기재된 기능 분석을 사용하여 유지된 기능(즉, 상기 (c) 내지 (I)에 제시된 기능)에 대해 테스트될 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, vH(또는 V_H) 도메인은 서열 번호 11517-11592 중 하나로부터 선택되지만, 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 1 내지 20개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 프레임워크 영역에 있다. 또 다른 실시 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 CDR에 있다. 한 실시 양태에서, 아미노산 치환은 프레임워크 및 CDR 서열에 있다.

한 실시 양태에서, V_H 단일 도메인 항체는 하나 이상의 서열 변형을 포함하고 비변형된 단일 도메인 항체와 비교하여 결합 친화도, 특이성, 열안정성, 발현 수준, 이펙터 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성, 또는 용해도와 같은 특성 중 하나 이상이 개선된 서열 번호 11517-11592를 갖는 것들로부터 선택된 단일 도메인 항체의 변이체이다.

당업자는 시험관 내 및 생체 내 발현 라이브러리를 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 분자를 확인, 획득 및 최적화하는 다양한 방법이 있음을 알 것이다. 이는 실시예에서 추가로 설명된다. 디스플레이(예를 들어, 리보솜 및/또는 파지 디스플레이) 및/또는 돌연변이유발(예를 들어, 오류가 발생하기 쉬운 돌연변이유발)과 같은 당 업계에 공지된 최적화 기술이 사용될 수 있다. 따라서 본 개시 내용은 또한 본원에 기재된 단일 도메인 항체의 서열 최적화된 변이체를 포함한다.

본 개시 내용은 또한 SAR 구축물에서 다중 인간 V_H 도메인의 사용에 관한 것이다. 한 실시 양태에서, 하나 초과, 예를 들어 2개 또는 3개의 V_H 도메인이 표 5에 제시된 서열 번호 또는 그에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 V_H 도메인으로부터 선택된다(해당 핵산 서열 번호는 표 5에 제시됨).

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 표 B에 열거된 항원 중 어느 하나 이상에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 표 B에 열거된 하나 이상의 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 해당 항원의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 BCMA에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 BCMA의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 BCMA의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H　단일 도메인 항체), Fv, 또는 scFv를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 CD19에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD19의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 CD19의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 MSLN에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 MSLN의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 MSLN의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 CD20에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD20의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 CD20의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 BCMA에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 BCMA의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 BCMA의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 CD22에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD22의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 CD22의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 PSMA에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 PSMA의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 PSMA의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 CD123에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD123의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 CD123의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 Her2에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 Her2의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체) 및 Her2의 제2 에피토프에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체), Fv 또는 scF를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 CD123에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD123의 제1 에피토프에 결합하는 제1 vH 단일 도메인 항체 및 CD123의 제2 에피토프에 결합하는 제2 vH 단일 도메인 항체를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 Muc16에 대한 이중파라토프 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 Muc16의 제1 에피토프에 결합하는 제1 vH 단일 도메인 항체 및 Muc16의 제2 에피토프에 결합하는 제2 vH 단일 도메인 항체를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 이중특이성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 vH 단일 도메인 항체 또는 vHH 도메인 및 제2 표적을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. BCMA에 결합하는 vH 단일 도메인 항체는 예를 들어 서열 번호 11543-11548, 11579-11580, 11585-11586, 또는 그에 대해 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 제2 결합 모이어티는 항체 단편, 전형적으로 V_H 단일 도메인 항체, 센티린, 아피바디 또는 vHH 도메인일 수 있다. 제2 표적은 CD19, CD20, CD22, BCMA, PSCA, CS1, GPC3, CSPG4, EGFR, 5T4, L1 CAM, MUC16, ROR1, cKit, ROR, 1메소텔린, IL3Ra, c-Met, EGFRvlll, GD-2, NY-ESO-1 TCR 또는 MAGE A3 TCR, HER2, 윌름스 종양 유전자 1(WT1), 암배아 항원(CEA), 뮤신 16, MUC1, 면역 관문 표적 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 그러나 당 업자는 다른 종양 항원도 본 발명의 범위 내에서 잠재적인 조합 표적임을 이해할 것이다. 단일 사슬 SAR의 경우, 2개의 결합 도메인이 어느 순서로든 존재할 수 있다. 예를 들어, BCMA 및 CD38을 표적화하는 이중특이성 단일 사슬 SAR의 경우, vH 도메인의 순서는 BCMA-vH-링커-CD38-vH 또는 CD38-vH-링커-BCMA-vH일 수 있다. 유사하게, 이중 사슬 SAR의 경우, 2개의 결합 도메인은 2개의 불변 사슬 중 하나에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, BCMA 및 CD38을 표적화하는 이중 사슬 SAR의 경우, 구성은 BCMA-vH-TCRα-2A-CD38-vH-TCRβ 또는 CD38-vH-TCRα-2A-BCMA-TCRβ 또는 BCMA-vH-TCRβ-2A-CD38-vH-TCRα 또는 CD38-vH-TCRβ-2A-BCMA-TCRα일 수 있으며, 여기서 2A는 P2A, T2A, F2A 등과 같은 절단성 링커를 나타낸다. 또 다른 실시 양태에서, BCMA 및 CD38을 표적화하는 이중 사슬 SAR의 경우, 구성은 BCMA-vH-TCRγ-2A-CD38-vH-TCRδ 또는 CD38-vH-TCRγ-2A-BCMA-TCRδ 또는 BCMA-vH-TCRδ-2A-CD38-vH-TCRγ 또는 CD38-vH-TCRδ-2A-BCMA-TCRγ일 수 있으며, 여기서 2A는 P2A, T2A, F2A 등과 같은 절단성 링커를 나타낸다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등) 및 CD38을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. BCMA에 결합하는 AABD(예를 들어, SVH 또는 vHH 또는 센티린 등)는 예를 들어 서열 번호 11543-11548, 11579-11580, 11585-11586, 11673, 23167 또는 그에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 98% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD38에 결합하는 AABD(예를 들어, SVH, VHH 또는 센티린)는 예를 들어 서열 번호 11535-11539, 11582, 11586, 23168 및 23169 또는 그에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 98% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다.

한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 추가의 예시적인 vL/vH 단편, 이의 LC-CDR1-3, HC-CDR1-3 및 이의 표적 항원은 표 39에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 한 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등) 및 CD19를 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. BCMA에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H　단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등)는 예를 들어 서열 번호 11543-11548, 11579-11580, 11585-11586, 11673 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD19에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11524, 11526-11529, 11588 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등) 및 CD22를 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. BCMA에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11543-11548, 11579-11580, 11585-11586, 11673 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD22에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11532-11534 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 AABD(예를 들어, V_H 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등) 및 CD20을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. BCMA에 결합하는 V_H 단일 도메인 항체는 예를 들어 서열 번호 11543-11548, 11579-11580, 11585-11586, 11673 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD20에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11530-31, 11589 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD22에 결합하는 AABD 및 CD20을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. CD22에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11532-11534 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD20에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11530-31, 11589 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD22에 결합하는 AABD 및 CD19를 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. CD22에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11532-11534 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD19에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11524, 11526-11529, 11588 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD20를 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. CD19에 결합하는 AABD는 서열 번호 11524, 11526-11529, 11588 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD20에 결합하는 V_H 단일 도메인 항체는 서열 번호 11530-31, 11589 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD38을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. CD19에 결합하는 V_H 단일 도메인 항체는 예를 들어 서열 번호 11524, 11526-11529, 11588 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD38에 결합하는 AABD는 서열 번호 11535-11539, 11582 및 11586 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD123을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. CD19에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 1524, 11526-11529, 11588 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. CD123에 결합하는 AABD는 서열 번호 11569-70 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 BAFF-R을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, SAR의 적어도 하나의 결합 도메인은 바이러스의 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, 바이러스는 코로나바이러스이다. 한 실시 양태에서, SAR의 적어도 하나의 결합 도메인은 COVID-19 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR의 적어도 하나의 결합 도메인은 SARS 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD를 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR의 적어도 하나의 결합 도메인은 MERS 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD를 포함한다. COVID-19 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD는 예를 들어 ACE2(안지오텐신 전환 효소 2; Genbank: AY623811)의 세포외 도메인 또는 이의 단편이다. COVID-19 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD는 예를 들어 SVH, VHH, 센티린, 아피바디, vL, vH, Fv, scFv 또는 이의 단편이다. SARS 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD는 예를 들어 ACE2 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편이다. SARS 스파이크 당단백질에 결합하는 AABD는 예를 들어 SVH, VHH, 센티린, 아피바디, vL, vH, Fv, scFv 또는 이의 단편이다.

한 실시 양태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD79b를 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. CD19에 결합하는 V_H 단일 도메인 항체는 예를 들어 서열 번호 111524, 11526-11529, 11588 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 특정 항원을 표적화하는 Fv를 형성하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시 양태에서, SAR은 결합하여 상이한 항원을 표적화하는 TCR-Fv를 형성하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 결합 도메인은 이중특이성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 PSMA에 결합하는 AABD 및 제2 표적을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. PSMA에 결합하는 AABD는 예를 들어 서열 번호 11520-11523, 11667-11669 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90% 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 제2 결합 모이어티는 항체 단편, 전형적으로 V_H 단일 도메인 항체일 수 있다. 제2 표적은 CD19, CD20, CD22, BCMA, PSCA, CS1, GPC3, CSPG4, EGFR, 5T4, L1 CAM, MUC16, ROR1, cKit, 메소텔린, IL3Ra, c-Met, EGFRvlll, GD-2, NY-ESO-1 TCR 또는 MAGE A3 TCR, HER2, 윌름스 종양 유전자 1(WT1), 암배아 항원(CEA), 뮤신 16, MUC1, 면역 관문 표적 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 그러나 당업자는 다른 종양 항원도 본 발명의 범위 내에서 잠재적인 조합 표적임을 이해할 것이다.

한 측면에서 SAR의 신규 항원 결합 도메인은 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 항원에 결합한다. 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 예시적인 항원은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD33, MPL, CD138, CD38 및 CD123이다. 한 측면에서 SAR의 신규 항원 결합 도메인은 비-조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 항원에 결합한다. 비-조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 예시적인 항원은 메소텔린(MSLN), Her2, EGFR, PSMA, IL13Ra2 등이다. 한 측면에서, SAR은 2개 이상의 신규 항원 결합 도메인을 발현하며, 여기서 신규 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 항원에 결합하고 신규 항원 도메인 중 적어도 하나는 비-조혈 계통 세포 상에서 발현되는 항원에 결합한다.

바람직한 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 SAR에 사용하기 위한 vH 단일 도메인 항체는 인간 중쇄 유전자좌를 발현하는 형질전환 설치류에서 생성된 인간 중쇄 단독 항체로부터 생성된다.

기능적으로 침묵화된 내인성 람다 및 카파 L-사슬 유전자좌를 갖는 마우스는 예를 들어, WO 2003/000737에 개시된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이는 이로써 그 전체가 참고로 포함된다.

내인성 마우스 또는 래트 면역글로불린 유전자를 결실 또는 불활성화하고 C_H1 도메인, 마우스 인핸서 및 조절 영역이 결여된 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자와 조합된 인간 V_H, D 및 J 유전자를 도입하기 위해 당 업계에 공지된 대안적 방법이 사용될 수 있다.

상기 기재된 형질전환 설치류는 예를 들어 WO 2016/062990 또는 WO 2016/113557에 기재된 바와 같이 본 발명의 SAR에 사용하기 위한 인간 V_H 도메인의 생성을 위해 단리 및 사용될 수 있는 인간 가변 중쇄를 생성한다.

따라서, 본 개시 내용은 또한 인간 중쇄 유전자좌를 발현하는 TKO 마우스에서 생성된 인간 가변 중쇄로부터 생성된 단일 V_H 도메인 항체를 포함하는 SAR에 관한 것이다.

한 실시 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 SAR에 사용하기 위한 vL 단일 도메인 항체는 인간 경쇄 유전자좌를 발현하는 형질전환 설치류에서 생성된 인간 중쇄 단독 항체로부터 생성된다

상기에 상세히 기재된 바와 같은 결합 도메인에 추가하여, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편 및 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 TCR 불변 사슬은 표 12에 제공된다. TCR Ig-유사-C1-도메인(서열 번호 11848-11865), TCR 연결 펩티드(서열 번호 11867-11875), 경막 도메인(서열 번호 11877-11881), 및 TCR 시토졸 도메인(서열 번호 11883-11886)을 포함하는 TCR 불변 사슬의 성분은 표 13-16에 제공된다. SAR의 구축을 위한 TCR 불변 사슬 및 단편은 예를 들어 서열 번호 11848-11865, 11867-11875, 11877-11881, 11883-11886 또는 이에 대해 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 상동성을 갖는 서열 또는 이의 기능적 변이체로부터 선택된다.

SAR을 코딩하는 벡터는 일반적으로 SAR을 코딩하는 능력이 제한되어 있다. 예를 들어, SAR 폴리뉴클레오티드의 크기는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터의 역가에 영향을 미친다. 따라서 크기가 작은 SAR이 바람직하다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 2개의 신호 펩티드 및 개재 2A 링커를 포함하고 1765 뉴클레오티드 미만, 1770 뉴클레오티드 미만, 1780 뉴클레오티드 미만, 1790 뉴클레오티드 미만, 1800 뉴클레오티드 미만, 1820 뉴클레오티드 미만 크기인 단일특이성 이중 사슬 SAR을 기재한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 신호 서열이 없는 하나의 사슬은 815 뉴클레오티드, 820 뉴클레오티드, 825 뉴클레오티드 또는 850 뉴클레오티드 이하이고 신호 서열이 없는 제2 사슬은 790 뉴클레오티드, 800 뉴클레오티드, 810 뉴클레오티드, 815 뉴클레오티드, 820 뉴클레오티드, 825 뉴클레오티드 또는 850 뉴클레오티드 이하인 단일 특이성 이중 사슬 SAR을 기재한다. 한 측면에서, SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, εTFP, γTFP, δTFP, αβTFP, γδTFP 또는 TCR의 백본을 갖는다. 한 측면에서 SAR은 SIR의 백본을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 TCRα와 TCRβ 불변 사슬을 갖는 TCR의 백본을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 TCRγ와 TCRδ 불변 사슬을 갖는 TCR의 백본을 갖는다.

본 개시 내용은 또한 SIR 백본 기반 SAR 및 SIR 구축에 사용될 수 있는 TCRα(서열 번호 11793-11803), TCRβ(서열 번호 11805-11817), TCRγ(서열 번호 11819-11823) 및 TCRδ(서열 번호 11825-11830)(표 12)의 불변 사슬의 신규 결실 돌연변이체를 제공한다. TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ의 불변 사슬의 결실 돌연변이체의 사용은 SIR/SAR 구축물의 크기를 줄이고 바이러스 벡터로의 패키징을 개선하여 바이러스 벡터 역가 및 형질도입 효율을 개선하는 데 도움이 된다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 TCRα 불변 사슬 단편이 370, 380, 390, 400, 410 또는 421 뉴클레오티드 미만 길이이고 TCRβ 불변 사슬 단편이 490 뉴클레오티드 미만, 500 뉴클레오티드 미만, 510 뉴클레오티드 미만, 520 뉴클레오티드 미만, 530 뉴클레오티드 미만 또는 540 뉴클레오티드 미만 길이인 이중 사슬 SAR을 기재한다. 한 측면에서, SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는다. 한 측면에서 SAR은 SIR의 백본을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 또는 TCRγ 및 TCRδ 불변 사슬을 갖는 SIR의 백본을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 또는 TCRγ 및 TCRδ 불변 사슬을 갖는 cTCR의 백본을 갖는다. 한 측면에서, TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 단편은 이들의 사슬 페어링을 향상시키고 내인성 TCRαβ 사슬과의 사슬 페어링을 감소시키는 돌연변이를 보유한다. 한 측면에서, TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 단편은 2개의 사슬 사이에 추가의 시스테인 결합(이중 결합)을 초래하는 돌연변이를 보유한다. 본 개시 내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬은 hTCRa-T48C-opt-d17(서열 번호 11797) 및 hTCRb-S57C-opt1-d17(서열 번호 11810) 또는 상기를 포함하는 TCRα 및 TCRβ 사슬 변이체이다. 예시적인 TCRα 및 TCRβ 사슬 변이체가 표 12에 제공된다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRa-T48C-opt-d17(서열 번호 11797)을 포함하는 TCRα 불변 사슬 단편 또는 hTCRa-T48C-opt-d17(서열 번호 11797)로 표시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRa-T48C-opt-d17(서열 번호 11797)을 포함하는 TCRα 불변 사슬 단편 또는 상보적 TCRβ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRa-T48C-opt-d17(서열 번호 11797)을 포함하는 TCRα 불변 사슬 단편 또는 TCR/CD3 복합체 내로 통합되고, TCR 신호전달 모듈을 동원하고/거나 표적 항원의 인게이징 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRα 불변 사슬 및 결실 돌연변이체는 표 12에 제공된다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRb-S57C-opt1-d17(서열 번호 11810)를 포함하는 TCRβ 불변 사슬 단편 또는 hTCRb-S57C-opt1-d17(서열 번호 11810)로 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRb-S57C-opt1-d17(서열 번호 11810)를 포함하는 TCRβ 불변 사슬 단편 또는 상보적 TCRα 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRb-S57C-opt1-d17(서열 번호 11810)을 포함하는 TCRβ 불변 사슬 단편 또는 TCR/CD3 복합체 내로 통합되고, TCR 신호전달 모듈을 동원하고/거나 표적 항원의 인게이징 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRα 불변 사슬 및 결실 돌연변이체는 표 12에 제공된다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d12(서열 번호 11821)를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편 또는 hTCRg-Opt-d12(서열 번호 11821)로 표시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d12(서열 번호 11821)를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편 또는 상보적 TCRδ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d12(서열 번호 11821)을 포함하는 TCRg 불변 사슬 단편 또는 TCR/CD3 복합체 내로 통합되고, TCR 신호전달 모듈을 동원하고/거나 표적 항원의 인게이징 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d5(서열 번호(PRT) 11819)를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편 또는 hTCRg-Opt-d5(서열 번호(PRT) 11819)로 표시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d5(서열 번호(PRT) 11819)를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편 또는 상보적 TCRδ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d5(서열 번호(PRT) 11819)를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편 또는 TCR/CD3 복합체 내로 통합되고, TCR 신호전달 모듈을 동원하고/거나 표적 항원의 인게이징 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRγ 불변 사슬 및 결실 돌연변이체는 표 12에 제공된다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRd-opt-d13(서열 번호 11828)을 포함하는 TCRδ 불변 사슬 단편 또는 hTCRd-opt-d13(서열 번호 11828)로 표시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRg-Opt-d12 hTCRd-opt-d13(서열 번호 11828)을 포함하는 TCRδ 불변 사슬 단편 또는 상보적 TCRγ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hhTCRd-opt-d13(서열 번호 11828)을 포함하는 TCRδ 불변 사슬 단편 또는 TCR/CD3 복합체 내로 통합되고, TCR 신호전달 모듈을 동원하고/거나 표적 항원의 인게이징 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRd-opt-d2(서열 번호 11825)를 포함하는 TCRδ 불변 사슬 단편 또는 hTCRd-opt-d5(서열 번호 11828)로 표시된 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRd-opt-d5(서열 번호 11825)를 포함하는 TCRδ 불변 사슬 단편 또는 상보적 TCRγ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 hTCRd-opt-d5(서열 번호 11825)을 포함하는 TCRδ 불변 사슬 단편 또는 TCR/CD3 복합체 내로 통합되고, TCR 신호전달 모듈을 동원하고/거나 표적 항원의 인게이징 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지하는 이의 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용할 수 있는 추가 TCRδ 불변 사슬 및 결실 돌연변이체는 표 12에 제공된다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 SAR에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 적어도 2개의 인간 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하고 경쇄가 없다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 연결 펩티드를 포함한다. 예시적인 연결 펩티드는 서열 번호 11867-11875(표 14)로 표시된다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 TCR 시토졸 도메인을 포함한다. 예시적인 TCR 시토졸 도메인은 서열 번호 11833-11886(표 16)으로 표시된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 보조 모듈과 공동발현된다. 예시적인 보조 모듈은 K13, Synth-K13, MC159, hNEMO-K277A, tBCMA 등을 포함한다(표 24).

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 세포외 항원 결합 도메인 및 경막 도메인을 연결하는 힌지 또는 스페이서 영역을 추가로 포함한다. 이 힌지 또는 스페이서 영역을 사용하여 생성되는 SAR의 다양한 길이와 유연성을 달성할 수 있다. 본 개시 내용에 따라 사용될 수 있는 힌지 또는 스페이서 영역의 예는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 Fc 단편, 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체의 힌지 영역, 항체의 C_H2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열, 예를 들어 펩티드 서열, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 한 실시 양태에서, 힌지는 IgG4 힌지 또는 CD8A 힌지이다. 구체적으로, 표 17 및 18에 나타낸 힌지 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

상기에 상세히 기재된 바와 같은 결합 도메인에 추가하여, 본 개시 내용의 SAR은 1개 또는 2개의 경막 도메인을 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 "경막 도메인"(TMD)은 원형질막을 가로지르고 소포체 신호전달 도메인 및 항원 결합 도메인을 연결하는 (후자의 경우, 선택적으로 힌지를 통해) SAR의 영역을 지칭한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR의 경막 도메인은 경막 단백질(예를 들어, 유형 I 경막 단백질), 인공 소수성 서열 또는 이들의 조합의 경막 영역이다. 한 실시 양태에서, 경막 도메인은 CD3제타 도메인 또는 CD28 경막 도메인을 포함한다. 다른 경막 도메인은 당업자에게 명백할 것이고 본 발명의 대안적인 실시 양태와 관련하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 표 15 및 18에 나타낸 TMD 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

본 개시 내용의 SAR은 선택적으로 활성화 신호를 T 세포에 전달하고 세포가 그의 특수 기능을 수행하도록 지시하는 세포내 "활성화 도메인"을 추가로 포함할 수 있다. 이펙터 기능 신호를 전달하고 본 개시 내용에 따라 사용될 수 있는 도메인의 예는 T 세포 수용체 복합체의 ζ 사슬 또는 이들 임의의 상동체(예를 들어, η 사슬, FCER1G 및 β 사슬s, MB 1(Iga) 사슬, B29(Ig) 사슬 등), 인간 CD3제타 사슬, CD3 폴리펩티드(γ, δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나아제(Syk, ZAP 70 등), src 패밀리 티로신 키나아제(Lck, Fyn, Lyn 등)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 활성화 도메인이 당업자에게 명백할 것이며 본 발명의 대안적인 실시 양태와 관련하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 서열 번호 11896 및 11783에 제시된 세포내 활성화 도메인 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 항원 특이적 인게이징 후 SAR 세포 활성을 향상시키기 위해 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함한다. 본 개시 내용의 SAR에 이 도메인을 포함하면 기억 세포의 증식, 생존 및/또는 발달이 향상된다. 구체적으로, 표 18에 나타낸 바와 같이 서열 번호 11898 및 11781-82를 갖는 공동자극 도메인 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 SAR의 상이한 도메인을 연결하는 "링커 도메인" 또는 "링커 영역"을 추가로 포함한다. 이 도메인은 약 1 내지 500 개 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 포함한다. 적합한 링커는 당업자에게 명백할 것이며 본 발명의 대안적인 실시 양태와 관련하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 표 11 및 13에 나타낸 링커 도메인 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다. 한 실시 양태에서, 링커는 긴 링커이고 25 내지 500 개 아미노산 길이의 서열을 포함한다. 특히, 긴 링커는 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd 또는 Ig 링커 도메인이 없는 TCR 연결 펩티드에 AABD를 연결하는 데 사용된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 하나 이상의 "리더 서열" 또는 신호 펩티드(SP)를 추가로 포함한다. 한 실시 양태에서, 리더 서열은 CD8A 신호 펩티드(서열 번호 31) 또는 IgH 신호 펩티드(서열 번호 33)이다. 구체적으로, 표 2에 제시된 리더 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다. 한 실시 양태에서, 이중 사슬 SAR 또는 1.5 사슬 SAR의 각 사슬은 리더 서열 또는 신호 펩티드를 포함한다. 신호 펩티드는 성숙한 SAR 폴리펩티드로부터 절단된다. 따라서, SAR 폴리펩티드의 서열이 신호 펩티드(SP)와 함께 표시되지만, 신호 펩티드가 성숙한 SAR 폴리펩티드에 존재하지 않을 것이라는 것은 당업자에 의해 이해된다.

일부 측면에서, 본 개시 내용의 SAR은 억제 신호를 전달하는 항원 결합 도메인을 포함한다.

SAR은 표지, 예를 들어 형광 표지 또는 기타 태그와 같이 영상화를 용이하게 하는 표지를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어 종양 결합을 영상화하는 방법에 사용될 수 있다. 표지는 항원 결합 도메인에 접합될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 SAR 중 어느 하나의 세포외 도메인은 항원 결합제, 예를 들어 단클론 항체에 특이적인 (예를 들어, 이에 의해 특이적으로 인식되는) 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 이들 에피토프는 또한 본원에서 mAb-특이적 에피토프로 지칭된다. 예시적인 mAb-특이적 에피토프는 국제 특허 공개 번호 WO 2016/120126에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다. 본 개시 내용은 SAR에 에피토프의 혼입을 위한 새로운 조성 및 위치를 제공한다. 이들 실시 양태에서, 세포외 도메인은 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 하나 이상의 항체(예를 들어, 단클론 항체, 이중특이성 항체, 항체 단편, vHH, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 등)에 결합하는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 에피토프를 포함하는 SAR은 단일 사슬 또는 다중 사슬일 수 있다.

본원에 기재된 SAR의 세포외 도메인에 단클론 항체 및 기타 항원 결합제(예를 들어, vHH, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 등)에 특이적인 에피토프를 포함하면 SAR을 발현하는 조작된 면역 세포의 분류 및 고갈이 허용된다. 일부 실시 양태에서, 이 특징은 또한 SAR을 발현하는 조작된 면역 세포의 투여에 의해 고갈된 내인성 항원 발현 세포의 회복을 촉진한다.

따라서, 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 항원 결합제(예를 들어, mAb)-특이적 에피토프를 포함하는 SAR이 부여된 조작된 면역 세포를 분류 및/또는 고갈시키는 방법 및 골수 전구 세포와 같은 내인성 항원 발현 세포(즉, SAR 세포에 의해 표적화되는 항원을 발현하는 정상의 건강한 세포)의 회복을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

여러 에피토프-단클론 항체 커플을 사용하여 단클론 항체 특이적 에피토프를 포함하는 CAR, 특히, 비제한적인 예로서 CD20 에피토프/리툭시맙과 같이 이미 의료용으로 승인된 것들을 생성할 수 있다.

본 개시 내용은 또한 mAb-특이적 에피토프(들)를 발현하는 항원 특이적 SAR이 부여된 조작된 면역 세포를 분류하는 방법 및 이러한 SAR이 부여된 조작된 면역 세포의 활성화가 상기 CAR의 외부 리간드 결합 도메인을 표적화하는 항체를 사용하여 세포를 고갈시킴으로써 조절되는 치료 방법을 포함한다.

일부 실시 양태에서, SAR-T 세포는 예를 들어 RQR8과 같은 자살 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, WO2013153391 A를 참조하며, 이는 이로써 전체가 참고로 포함된다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SAR-T 또는 SAR-NK 세포에서, 자살 폴리펩티드는 SAR-T 세포 또는 SAR-NK 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시 양태에서, 자살 폴리펩티드는 서열 번호 22419에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

자살 폴리펩티드는 또한 아미노 말단에 신호 펩티드, 예를 들어 CD8 신호 펩티드(서열 번호 10721)를 포함할 수 있다.

자살 폴리펩티드가 CAR-T 세포의 표면에서 발현될 때, 폴리펩티드의 R 에피토프에 대한 리툭시맙의 결합은 세포의 용해를 야기한다. 하나 초과의 리툭시맙 분자가 세포 표면에서 발현되는 폴리펩티드에 대하여 결합할 수 있다. 폴리펩티드의 각 R 에피토프는 리툭시맙의 별도 분자에 결합할 수 있다. 항원 특이적 SAR-T 세포의 소거는 예를 들어 환자에게 리툭시맙을 투여함으로써 생체 내에서 발생할 수 있다. 전달된 세포를 소거하는 결정은 예를 들어 허용할 수 없는 수준의 독성이 감지되는 경우와 같이, 전달된 세포에 기인하는 바람직하지 않은 효과가 환자에서 감지되어 발생할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 환자에게 투여 시, 본원에 기재된 항원 특이적 SAR 중 어느 하나를 세포 표면에서 발현하는 조작된 면역 세포는 환자의 내인성 항원 발현 세포를 감소, 사멸 또는 용해시킬 수 있다. 한 실시 양태에서, 본원에 기재된 항원 X-특이적 SAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의한 항원 X를 발현하는 내인성 세포 또는 세포주의 세포의 감소 또는 용해 백분율은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그보다 크다. 한 실시 양태에서, 본원에 기재된 항원 X-특이적 SAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의한 항원 X-발현 내인성 세포 또는 세포주의 세포의 감소 또는 용해 백분율은 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%이다. 한 실시 양태에서, 내인성 항원 X-발현 세포는 내인성 항원 X-발현 골수 세포이다. 예시적인 실시 양태에서, 내인성 항원 X는 D19, CD33, CD34, CD123, MPL, CD70, CD20, CD22, CD30, BCMA, SLAMF7, CD138, CLL1, CD38 또는 이들의 조합의 군으로부터 선택되지만, 이에 제한되지는 않는다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항원 X-특이적 SAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포에 의한 표적 세포, 예를 들어 항원 X를 발현하는 세포주의 퍼센트 감소 또는 용해는 본원에 개시된 분석(예를 들어, 유세포 분석)을 사용하여 측정될 수 있다.

한 측면에서, 면역 세포 집단의 시험관 내 분류 방법이 제공되며, 여기서 면역 세포 집단의 서브세트는 본원에 기재된 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체, 다클론 항체, vHH, DARPIN, 센티린 등)에 특이적인 에피토프를 포함하는 항원 X-특이적 SAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포를 포함한다. 상기 방법은 면역 세포의 집단을 에피토프에 특이적인 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)와 접촉시키는 단계 및 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)에 결합하는 면역 세포를 선별하여 항원 X-특이적 SAR을 발현하는 조작된 면역 세포에 농축된 세포 집단을 획득하는 단계를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 상기 에피토프에 특이적인 상기 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)는 선택적으로 형광단에 접합된다. 이 실시 양태에서, 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)에 결합하는 세포를 선별하는 단계는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 에피토프에 특이적인 상기 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)는 선택적으로 자성 입자에 접합된다. 이 실시 양태에서, 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)에 결합하는 세포를 선별하는 단계는 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의해 수행될 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR의 세포외 결합 도메인은 서열 번호 22411-22432 중 하나 이상의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다.

본 개시 내용에 따르면, 수여자에게 투여될 세포는 공급원 집단으로부터 시험관 내 농축될 수 있다. 공급원 집단을 증식하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 당업자에게 공지된 밀도 원심분리, 면역-자기 비드 정제, 친화성 크로마토그래피 및 형광 활성화된 세포 분류의 조합을 사용하여 CD34 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR을 발현하는 면역 세포를 분류하는 데 사용되는 방법은 자기 활성화 세포 분류(MACS)이다.

일부 실시 양태에서, SAR을 발현하는 면역 세포를 분류하기 위한 방법에 사용되는 mAb는 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 무로모나브-CD3, 토시투모맙, 압식시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세르톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 젬투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10 및/또는 우스테키누맙으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 상기 mAb는 리툭시맙이다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 mAb는 QBEND-10이다.

일부 실시 양태에서, SAR-T 또는 SAR-NK 세포는 특이적 항체에 의해 인식되는 특이성을 갖는 scFv 내에 선택된 에피토프를 포함한다. 예를 들어, W02016/120216을 참조하고, 이는 이로써 그 전체가 참고로 포함된다. 이러한 에피토프는 SAR-T 또는 SAR-NK 세포의 분류 및/또는 고갈을 촉진한다. 에피토프는 당 업계에 공지된 많은 에피토프로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 에피토프는 예를 들어 제한 없이 리툭시맙에 의해 인식되는 CD20 에피토프와 같은 의료용으로 승인된 단클론 항체의 표적일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 에피토프는 SAR 내에 위치한다. 한 실시 양태에서, 에피토프는 SAR(예를 들어, 1세대 CAR, 2세대 CAR, SIR, cTCR, Ab-TCR, zSIR, TFPε, TFPγ, TFPδ, αβTFP, γδTFP, TCR, HLA 비의존성 TCR 등)의 항원 결합 도메인을 포함하는 vL 및/또는 vH 단편의 N-말단 근처에 또는 N-말단에 부착된다. 한 실시 양태에서, 에피토프는 SAR(예를 들어, 1세대 CAR, 2세대 CAR, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, zSIR, TFPε, TFPγ, TFPδ, αβTFP, γδTFP, TCR, HLA 비의존성 TCR 등)의 항원 결합 도메인을 포함하는 AABD 단편의 N-말단 근처에 또는 N-말단에 부착된다. 한 실시 양태에서, 에피토프는 링커를 통해 SAR의 항원 결합 영역으로부터 분리된다. 일부 실시 양태에서, 링커에 의해 분리된 동일한 에피토프의 2가지 경우가 SAR에서 사용될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 에피토프 특이적 항체는 세포독성 약물과 접합될 수 있다. 또한, 보체 시스템의 성분(들)이 이식된 조작된 항체를 사용하여 CDC 세포독성을 촉진할 수 있다. 일부 실시 양태에서, CAR-T 세포의 활성화는 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 세포를 고갈시킴으로써 조절될 수 있다.

본원에 기재된 SAR은 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성될 수 있다. 이 실시 양태에서, 항원 특이적 표적화 영역은 N-말단에 있고, 직렬로 배열되고 링커 펩티드에 의해 분리된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 바와 같은 항원에 결합하고 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬에 결합되는 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함하는 단리된 SAR 폴리펩티드 분자를 제공한다.

일부 실시 양태에서, SAR은 단일 T 세포 수용체 불변 사슬의 NH2-말단에 결합된 단일 항원 결합 도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(부류 1).

일부 실시 양태에서, SAR은 기능적 SAR을 만들기 위해 조립되는 2개의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다(부류 2). 이러한 이중 사슬 부류 2 SAR의 각각의 폴리펩티드는 T 세포 수용체 불변 사슬을 함유하고 하나 이상의 항원 결합 도메인을 (부류 2A에서와 같이) 함유하거나 (부류 2B에서와 같이) 함유하지 않는다. 부류 2A SAR에서, 각각의 항원 결합 도메인은 별도의 T 세포 수용체 불변 사슬의 N-말단에 결합된다. 예를 들어, 항원 결합 도메인 1(예를 들어, 항체의 vL 단편)은 T 세포 수용체 베타(TCRβ)의 불변 사슬에 결합되어 기능적 폴리펩티드 단위 1을 구성하고 항원 결합 도메인 2(항체의 vH 단편)는 T 세포 수용체 알파(TCRα)의 불변 사슬에 결합되어 기능적 폴리펩티드 단위 2를 구성한다. 이러한 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 동일한 세포에서 공동발현되고 서로 쌍을 이루어 기능적으로 활성적이 된다. 각각의 항원 결합 도메인은 결국 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있으므로 부류 2 SAR이 2개 초과의 항원을 표적화할 수 있다는 점을 알아야 한다.

일부 실시 양태에서, 이중 폴리펩티드 사슬 SAR은 단 하나의 T 세포 수용체 불변 사슬(기능적 폴리펩티드 단위 1)의 NH2-말단에 결합되지만 제2 T 세포 수용체 불변 사슬과 공동발현되는 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 SAR은 부류 2B로 지칭된다. 이러한 부류 2B SAR에서 제2 T 세포 수용체 불변 사슬의 목적은 기능적 폴리펩티드 단위 1(즉, T 세포 수용체 불변 사슬에 결합된 항원 결합 도메인 1)의 세포 표면 발현을 촉진하는 것이다. 이와 같이 부류 2B SAR에서 제2 T 세포 수용체 불변 사슬은 자체적으로 발현되거나 에피토프 태그(예를 들어, MYC, V5, AcV5, G4Sx2, StrepTagII 등)를 보유하는 융합 단백질로 발현되거나 관련 없는 단백질이 기능 단위 1의 조립 및 기능을 방해하지 않는 한 임의의 무관한 단백질 단편(예를 들어, vL 또는 vH 단편)을 보유하는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 예를 들어, 부류 2B SAR은 T 세포 수용체 알파(TCRα)의 불변 사슬에 결합되어 기능적 폴리펩티드 단위 1을 구성하는 항원 결합 도메인 1 및 기능적 폴리펩티드 단위 2를 구성하는 T 세포 수용체 β(TCRβ)의 비어 있는(즉, 항원 결합 도메인이 없는) 불변 사슬을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

일부 실시 양태에서, 부류 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 상이한 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, 부류 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 2개의 별개의 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 사용하여 부류 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위를 코딩하는 2개의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, 부류 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 SAR의 2개의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 단편을 분리하는 IRES 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단일 프로모터를 사용하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, 부류 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 절단성 링커(예를 들어, F2A, T2A, E2A, P2A, 퓨린-SGSG-F2A, 퓨린-SGSG-T2A, 퓨린-SGSG-E2A, 퓨린-SGSG-P2A 등)를 함유하는 단일 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단일 프로모터를 사용하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 생성된 mRNA는 후속적으로 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위를 생성하는 단일 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 부류 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 두 기능적 폴리펩티드 단위를 모두 코딩하는 단일 mRNA 서열의 형질감염을 사용하여 공동발현되는 반면, 다른 실시 양태에서 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 각각이 하나의 기능적 폴리펩티드 단위를 코딩하는 2개의 상이한 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동발현된다. 일부 실시 양태에서, SAR을 코딩하는 벡터 또는 mRNA는 IRES 또는 절단성 링커 또는 이들의 조합에 의해 SAR 코딩 서열로부터 분리될 수 있는 추가의 유전자/단백질(치료 컨트롤, 억제 분자, 보조 모듈 등)을 코딩할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 치료 컨트롤 또는 보조 모듈 또는 둘 모두는 별도의 벡터 또는 mRNA를 사용하여 SAR이 발현되는 세포에서 발현될 수 있다. 치료 컨트롤 또는 보조 모듈은 SAR의 기능에 필수적이지 않으며, 실시 양태의 SAR 중 어느 것이든 치료 컨트롤 또는 보조 모듈 없이 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, PAC(퓨로마이신 내성 유전자)와 같은 항생제 내성 카세트는 SAR의 기능을 손상시키지 않으면서 본 개시 내용의 SAR-코딩 벡터로부터 제거될 수 있다.

또한, 본원에 기재된 SAR의 기능적 변이체가 제공되며, 이는 모 SAR과 실질적 또는 유의한 서열 동일성 또는 유사성을 갖고, 이 기능적 변이체는 그가 변이체가 되는 SAR의 생물학적 활성을 유지한다. 기능적 변이체는 예를 들어, 모 SAR과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 유지하는 본원에 기재된 SAR(모 SAR)의 변이체를 포함한다. 모 SAR과 관련하여, 기능적 변이체는 모 SAR에 대해 아미노산 서열이 적어도 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상 동일할 수 있다.

기능적 변이체는 예를 들어 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 SAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나 의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 모 SAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, 비보존적 아미노산 치환이 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 저해하지 않는 것이 바람직하다. 비보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성이 모 CAR과 비교하여 증가되도록 기능적 변이체의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.

SAR(기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)은 임의의 길이일 수 있다. 즉, SAR(또는 이의 기능적 부분 또는 기능적 변이체)이 생물학적 활성, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하거나, 포유동물에서 질환 세포를 검출하거나, 포유동물에서 질환을 치료 또는 예방하는 능력 등을 유지하기만 한다면 임의의 개수의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, SAR은 약 300 내지 약 5000 개 아미노산 길이, 예를 들어 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상의 아미노산 길이일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 상기 정의된 바와 같은 SAR을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산 구축물에 관한 것이다. 한 실시 양태에서, 핵산은 표 B에 열거된 표적 중 하나 이상을 표적화하는 단백질을 코딩한다.

본 개시 내용의 범위 내에서 적합한 SAR 서열의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 표 25-36 및 41-50에 나열되어 있다. 또한, 이에 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 상동성을 갖는 서열이 본 개시 내용의 범위 내에 있다.

"핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"라는 용어는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 또는 DNA 또는 RNA의 조합을 지칭한다. RNA는 본원에 기재된 바와 같은 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA, mRNA 서열을 포함한다. 핵산은 자살 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 kill-스위치를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 치료 컨트롤 또는 보조 모듈을 추가로 포함할 수 있다. 구축물은 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태일 수 있다.

한 실시 양태에서, 벡터는 시험관 내 전사되는 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013]에 설명되어 있다. 포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스가 사용된다. 한 실시 양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 이것은 실시예에서 설명된다. 본 개시 내용은 또한 상기 기재된 SAR을 포함하는 바이러스에 관한 것이다.

본 개시 내용은 또한 세포내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은, 3' 및 5' 비번역 서열("UTR")(예를 들어, 본원에 기재된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡(예를 들어, 본원에 기재된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(예를 들어, 본원에 기재된 IRES), 발현될 핵산, 및 전형적으로 50-2000개 염기 길이인 폴리 A 꼬리(서열 번호 13-16)을 함유하는 구축물을 생성하기 위해서 특별히 설계된 프라이머, 이어서 폴리 A 첨가를 가진 주형의 시험관 내 전사(IVT)를 포함한다. 이렇게 생산된 RNA는 다양한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 실시 양태에서, 주형은 SAR에 대한 서열을 포함한다. 한 실시 양태에서, RNA SAR 벡터는 전기천공에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포내로 형질도입된다. 또 다른 실시 양태에서, RNA SAR 벡터는 미세유체 장치를 사용하여 세포막에서 일시적 섭동을 유발함으로써 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포내로 형질도입된다. SAR의 상이한 사슬(또는 기능적 폴리펩티드 단위)은 또한 하나 이상의 벡터, 다양한 벡터 또는 기술의 조합을 사용하여 세포에 도입될 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, SAR의 하나의 사슬 또는 기능적 폴리펩티드 단위는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입될 수 있는 반면 다른 기능적 폴리펩티드 단위는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입될 수 있다. 또 다른 측면에서, 하나의 기능적 폴리펩티드 단위는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입되는 반면, 다른 기능적 폴리펩티드 단위는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하여 도입된다. 또 다른 측면에서, 하나의 기능적 폴리펩티드 단위는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입되는 반면, 다른 기능적 폴리펩티드 단위는 RNA 형질감염을 사용하여 도입된다. 또 다른 측면에서, 하나의 기능적 폴리펩티드 단위는 당 업계에 공지된 유전자 표적화 기술을 사용하여 내인성 TCR 사슬 유전자좌에서 유전자 재조합에 의해 세포에서 생산되는 반면, 다른 기능적 폴리펩티드 단위는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입된다.

RNA는 전기천공법, 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 폴리머 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염 또는 "유전자 총"(예를 들어, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001) 참조)과 같은 바이올리스틱 입자 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 상이한 방법 중 임의의 방법을 사용하여 또는 미세유체 장치를 사용하여 세포막에 일시적인 섭동을 유발함으로써(예를 들어, 특허 출원 WO 2013/059343 A1 및 PCT/US2012/060646 참조) 표적 세포내로 도입될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 비바이러스 방법은 트랜스포존(전위 가능한 요소로도 지칭됨)의 사용을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 트랜스포존은 게놈의 한 위치에 자신을 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자가 복제하고 게놈 내로 복제물을 삽입할 수 있는 DNA 조각, 또는 더 긴 핵산에서 스플라이싱되어 게놈의 또 다른 위치에 삽입될 수 있는 조각이다. 예를 들어, 트랜스포존은 전위를 위한 유전자 측면에 있는 역 반복체로 구성된 DNA 서열을 포함한다. 트랜스포존을 사용한 핵산 전달의 예시적인 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템(SBTS) 및 피기백(PB) 트랜스포존 시스템을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T 또는 NKT 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포는 SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 귀소 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집의 조합을 사용하여 생성된다.

일부 실시 양태에서, 비-바이러스 전달 방법의 사용은 세포, 예를 들어 T 또는 NKT 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포의 재프로그래밍, 및 대상체로의 세포의 직접 주입을 허용한다. 비-바이러스 벡터의 장점은 환자 집단, 저장 중 안정성, 및 면역원성의 부족을 충족시키기 위해 필요한 충분한 양을 생산하는 용이성과 상대적으로 저렴한 비용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

추가 측면에서, 본 개시 내용은 또한 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 구축물을 포함하는 단리된 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다. 따라서 세포는 본 발명의 SAR 핵산 구축물을 발현하도록 유전적으로 변형되었다. 따라서, 본 개시 내용은 본 발명의 SAR 핵산 구축물을 포함하고 안정하게 발현하는 유전자 조작된 세포를 제공한다. 한 실시 양태에서, 세포는 T 세포, NKT 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 조혈 줄기세포 및/또는 만능 배아/유도 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. T 세포는 본 발명의 SAR 핵산 구축물로 형질감염시키기 위해 환자로부터 단리될 수 있다.

본원에 기재된 각각의 개별 실시 양태가 예를 들어 단일 세포에서 조합될 수 있음이 본원에서 구체적으로 고려된다. 비제한적인 예로서, 단일 세포는 제1의 완전한 다성분 SAR 및 제2의 부분적인 다성분 SAR을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 다성분 SAR은 본원에 기재된 임의의 실시 양태에 따를 수 있다.

예를 들어, 세포는 생체 외에서 본 개시 내용의 핵산으로 형질감염될 수 있다. 다양한 방법은 본 발명의 SAR을 발현하는 안정한 형질감염체를 생성한다. 한 실시 양태에서, 세포를 안정적으로 형질감염시키고 재지시하는 방법은 네이키드 DNA를 사용한 전기천공법에 의한다. 본 개시 내용의 SAR을 코딩하는 네이키드 DNA를 사용하여 세포를 유전적으로 조작하는 추가 방법은 화학적 형질전환 방법(예를 들어, 인산칼슘, 덴드리머, 리포솜 및/또는 양이온성 중합체 사용), 비화학적 형질전환 방법(예를 들어, 전기천공법, 광학 변환, 유전자 전기이동 및/또는 유체역학적 전달) 및/또는 입자 기반 방법(예를 들어, 마그네토펙션 및/또는 유전자 총을 사용한 임페일펙션)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 통합된 재배열되지 않은 벡터의 존재 및 SAR의 발현을 나타내는 형질감염된 세포는 생체 외에서 증식될 수 있다. 바이러스 형질도입 방법도 본 발명의 SAR을 발현하는 재지시된 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 벡터는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예는 예를 들어 EF1α 프로모터, EF1α 프로모터 변이체(서열 번호 7), CMV IE 유전자 프로모터, MNDU3 프로모터(서열 번호 24), 유비퀴틴 C 프로모터, 코어-프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 RNA 핵산이다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 예를 들어, 약 150개의 아데노신 염기를 포함하는 폴리(A) 꼬리(서열 번호 13-16)가 본원에서 고려된다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 3'UTR을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR은 합성 노치(SynNotch) 조합 항원 회로의 제어 하에 발현된다(Dannenfelser et al., 2020, Cell Systems 11, 215-228).

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 SAR, 예를 들어, 본원에 기재된 SAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터; 또는 SAR 분자, 예를 들어, 본원에 기재된 SAR을 코딩하는 핵산을 세포, 예를 들어 본원에 기재된 T 세포, NKT 세포 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포내로 도입(예를 들어, 형질도입)하는 단계를 포함하는 세포(예를 들어 면역 이펙터 세포 또는 세포 집단)을 제조하는 방법을 제공한다.

세포는 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NKT 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포 또는 이들의 조합) 또는 면역 이펙터 세포 또는 합성 T 세포를 생성할 수 있는 줄기/전구 세포일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 방법에서의 세포는 디아글리세롤 키나아제(DGK) 및/또는 이카로스가 결핍되어 있다. 일부 실시 양태에서, 방법에서의 세포는 내인성 T 세포 수용체 α, β1, β2, pre-TCRα, γ 또는 δ 또는 이들의 조합의 불변 사슬이 결핍되어 있다. 일부 실시 양태에서, 방법에서의 세포는 HLA 항원이 결핍되어 있다. 일부 실시 양태에서, 방법에서의 세포는 β2 마이크로글로불린이 결핍되어 있다. 일부 실시 양태에서, 방법에서의 세포는 SAR의 표적 항원의 발현이 결핍되어 있다. 예를 들어, SAR 발현 T 세포는 SAR이 CD5에 대해 지시되는 경우 내인성 CD5가 결핍되거나, SAR이 TCR-베타1 불변 사슬에 대해 지시되는 경우 TCR-베타1 불변 사슬이 결핍되거나, SAR이 TCR-베타2 불변 사슬에 대해 지시되는 경우 TCR-베타2 불변 사슬이 결핍되거나, SAR이 CS1에 대해 지시되는 경우 CS1이 결핍된다.

일부 실시 양태에서, SAR을 코딩하는 핵산 분자를 도입하는 단계는 SAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 형질도입하는 단계, 또는 SAR을 코딩하는 핵산 분자를 형질감염시키는 단계를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 시험관 내 전사된 RNA이다. 일부 실시 양태에서, 핵산 분자는 SAR의 2개 이상의 성분을 코딩하는 핵산 분자는 1개 초과의 벡터로 세포를 형질도입시키거나 SAR의 상이한 서브유닛을 코딩하는 2개 이상의 핵산 분자로 형질감염시킴으로써 도입된다. 예를 들어, 세포는 각각이 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위 중 하나를 코딩하는 2개의 별개의 벡터로 형질도입될 수 있다. 유사하게, 세포는 각각이 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위 중 하나를 코딩하는 2개의 별개의 시험관 내 전사된 RNA로 형질도입될 수 있다. SAR의 기능적 폴리펩티드 단위에 더하여, 각각의 RNA는 RNA 둘 다로 형질도입되어서 SAR의 기능적 폴리펩티드 단위를 모두 발현하는 세포를 선별하기 위해 사용될 수 있는 상이한 선별 마커 또는 리포터(예를 들어, tEGFR 또는 CD34 또는 CNB30 또는 돌연변이 DHFR)를 보유할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 방법은 a) 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 b) 집단으로부터 T 조절 세포를 제거하여 T 조절 고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 a) 및 b)는 SAR을 코딩하는 핵산을 집단에 도입하기 전에 수행된다. 방법의 실시 양태에서, T 조절 세포는 CD25⁺ T 세포를 포함하고, CD25 항체 또는 이의 단편을 사용하여 세포 집단으로부터 제거된다. CD25 항체 또는 이의 단편은 기질, 예를 들어 비드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 단계 (b)로부터 제공된 T 조절 세포가 고갈된 면역 이펙터 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25⁺ 세포를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 방법은 SAR을 코딩하는 핵산을 집단에 도입하기 전에 CD25를 포함하지 않는 질환 관련 항원을 발현하는 집단으로부터 세포를 제거하여 T 조절 고갈되고 질환 관련 항원 고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 질환 관련 항원은 CD19, CD30, CD123, CD20, CD22, CD33, CD138, BCMA, Lym1, Lym2, CD79b, CD170, CD179b, CD14 또는 CD11b, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

다른 실시 양태에서, 방법은 SAR을 코딩하는 핵산을 집단에 도입하기 전에 T 조절-고갈되고 억제 분자 고갈된 세포 집단을 제공하기 위해 관문 억제제를 발현하는 집단으로부터 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 관문 억제제는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, B7-H1, CD160, P1H, 2B4, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), TIGIT, BTLA, 및 LAIRl로부터 선택될 수 있다.

본 개시 내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, SAR 폴리펩티드 분자, 또는 벡터를 포함하는 재조합 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포(예를 들어, 세포의 집단, 예를 들어, 면역 이펙터 세포의 집단) 및/또는 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포, 말초 혈액 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 면역 줄기세포, 유도 만능 줄기세포 또는 iPSC)를 제공한다.

일부 실시 양태에서, 세포는 면역 세포이다. 면역 세포의 비제한적인 예는 T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 단핵구/대식세포를 포함한다. 추가로, T 세포의 비제한적인 예는 Treg, CD8+ T 세포, 및 CD4+ T 세포를 포함한다. 한 실시 양태에서, 세포는 인간 T 세포이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시 양태에서, 세포는 개 세포이다.

한 실시 양태에서, 인간 세포는 P-당단백질(P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)을 발현하는 T 세포, NKT 세포 또는 NK 세포이다. 한 실시 양태에서, 인간 세포는 P-당단백질 매개 유출의 기질인 염료로 흐릿하게 염색되는 T 세포, NKT 세포 또는 NK 세포이다. 한 실시 양태에서, 인간 세포는 P-gp에 의해 수송되는 약물에 내성인 T 세포, NKT 세포 또는 NK 세포이다. 한 실시 양태에서, 세포는 출원 번호 PCT/US2017/042248(이는 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 T 세포이다. 일부 실시 양태에서, P-gp 또는 P-gp 활성의 발현이 결여된 세포는 집단으로부터 제거된다.

본 개시 내용의 단일 사슬 및 이중 사슬 SAR은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 TCRα(TRAC), TCRβ(TRBC), TCRγ(TRGC) 및/또는 TCRδ(TRDC) 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포에서 발현될 수 있다. 내인성 기능적 TRAC, TRBC, TRGC 및/또는 TRDC 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 이러한 T 세포는 동종이계 세포 요법의 목적에 사용될 수 있다.

한 실시 양태에서, 세포는 T 세포이고 T 세포는 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 사슬이 결핍되어 있다. 본 개시 내용에 따른 기능적 TCR의 발현이 안정적으로 결여된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 사슬을 표적화하는 Zn 핑거 뉴클레아제(ZFN), CRISP/Cas9 및 shRNA의 사용과 같은 다양한 접근법을 사용하여 생성될 수 있다. shRNA에 관한 비제한적인 예시적인 방법은 US 2012/0321667A1에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. TCR의 α 및 β 사슬의 불변 영역을 표적화하는 ZFN을 사용하여 내인성 TCR 발현을 제거하는 것과 관련된 또 다른 비제한적인 예시 방법은 문헌[Torikai H et al (Blood, 119(24), June, 14 2012]에 설명되어 있다. CRISP/Cas9를 사용하여 하나 이상의 TCR 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포를 생성하는 방법이 또한 당 업계에 공지되어 있다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 코돈 최적화되거나 내인성 TCR 불변 사슬과 뉴클레오티드 서열이 상이하여 내인성 TCR 불변 사슬을 표적화하는 CRISP/Cas9, ZFN 및/또는 shRNA에 의한 표적화를 회피하도록 설계된 TCR의 불변 사슬을 포함한다는 점에 유의해야 한다.

기능적 내인성 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어 표면에 기능적 내인성 TCR을 전혀 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 내인성 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛(예를 들어, 내인성 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬)을 발현하지 않도록 조작되거나, 표면에 기능적 내인성 TCR을 거의 생성하지 않도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 하나 이상의 서브유닛의 돌연변이된 또는 절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 내인성 TCR을 발현할 수 있다. "실질적으로 손상된 TCR"이라는 용어는 이 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 변형되지 않은 TCR은 일반적으로 이소성으로 발현될 때(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여) 1차 인간 T 세포에서 제대로 발현되지 않으며, 이는 이들이 세포 표면 발현에 대해 내인성 TCR 사슬과 비효율적으로 경쟁함을 시사한다. 그러나 인간 세포에서 효율적인 번역을 위한 TCR 사슬의 최적화는 도입된 TCR의 더 우수한 발현을 초래한다. 더 중요하게는, 이러한 우세한 TCR의 이소성 발현은 인간 T 세포에서 많은 부분의 내인성 TCR 레퍼토리의 표면 발현을 방지하였다.

CD3ε, CD3γ 및 CD3δ 사슬(CD3ε/γ/δ TFP로 지칭됨)을 포함하는 TFP의 백본을 가진 SAR은 표면 상에 기능적 내인성 또는 천연 TCRα 또는 TCRβ 사슬 폴리펩티드가 없거나 손상된 αβ T 세포에서 발현될 때 발현 및 활성이 불량하다. 예를 들어, 서열 번호 4110-4112로 표시되는 SAR은 내인성 TRAC 게놈 유전자좌가 파괴된 αβ T 세포에서 손상된 발현 및 활성(예를 들어, T 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생산 및 세포독성 등)을 갖는다. 본 개시 내용은 WO2019067805(이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 천연 전장 TCRα 사슬 폴리펩티드의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포에서 TCRα 불변 사슬(TRAC 사슬) 폴리펩티드 또는 이의 단편을 재발현함으로써 이 문제에 대한 해결책을 제공한다. 예시적인 실시 양태에서, CD3ε/γ/δ 백본에 기반한 SAR의 발현 및 신호전달 활성은 천연 TCRα 사슬의 발현이 감소되거나 제거되는 αβ T 세포에서 이러한 T 세포내로 외인성 TCRα 불변 사슬(TRAC 사슬)(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1045 및 서열 번호(PRT) 11735) 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 구축물을 발현함으로써 회복될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, CD3ε/γ/δ 백본에 기반한 SAR의 발현 및 신호전달 활성은 천연 TCRβ 사슬의 발현이 감소되거나 제거되는 αβ T 세포에서 이러한 T 세포내로 외인성 TCRβ 불변 사슬(TRBC 사슬)(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1061 및 서열 번호(PRT) 11751) 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 구축물을 발현함으로써 회복될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, CD3ε/γ/δ 백본에 기반한 SAR의 발현 및 신호전달 활성은 천연 TCRγ 사슬의 발현이 감소되거나 제거되는 γδ T 세포에서 이러한 T 세포내로 외인성 TCRγ 불변 사슬(TRGC 사슬)(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1082 및 서열 번호(PRT) 11771) 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 구축물을 발현함으로써 회복될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, CD3ε/γ/δ 백본에 기반한 SAR의 발현 및 신호전달 활성은 천연 TCRδ 사슬의 발현이 감소되거나 제거되는 γδ T 세포에서 이러한 T 세포내로 외인성 TCRδ 불변 사슬(TRDC 사슬)(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1084 및 서열 번호(PRT) 11774) 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 구축물을 발현함으로써 회복될 수 있다.

또 다른 예시적인 실시 양태에서, CD3ε/γ/δ 백본에 기반한 SAR의 발현 및 신호전달 활성은 천연 TCRα 및/또는 β 사슬의 발현이 감소되거나 제거되는 αβ T 세포에서 이러한 T 세포내로 외인성 TCRγ 불변 사슬(TRGC 사슬)(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1082 및 서열 번호(PRT) 11771) 또는 이의 단편 및/또는 외인성 TCRδ 불변 사슬(TRDC 사슬)(예를 들어, 서열 번호(DNA) 1084 및 서열 번호(PRT) 11774) 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 발현함으로써 회복될 수 있다.

본 개시 내용은 CD3ε/γ/δ 기반 SAR의 발현 및 활성이 천연 TCRα/β/γ 또는 δ 불변의 발현이 손상되거나 결여된 T 세포에서 누락된 TCRα/β/γ 또는 δ 불변 사슬을 포함하는 SIR, Ab-TCR, AABD-TCR, 또는 TCR 백본 상의 SAR의 공동발현에 의해 회복될 수 있음을 추가로 제공한다. 본 개시 내용은 2개의 SAR을 포함하는 동종이계 T 세포와의 조합 요법의 경우, CD3α/γ/δ TFP 기반 SAR이 동종이계 T 세포에서 발현이 감소되거나 누락된 TCR 불변 사슬 또는 TCR 불변 사슬 단편을 포함하는 SIR, Ab-TCR, AABD-TCR 또는 TCR 백본에 기반한 SAR과 조합됨을 제공한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 단일 사슬 및 이중 사슬 SAR은 PCT/US2018/053247 및 문헌[Eyquem J et al (Nature, 543(7643):113-117, 2017](이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 T 세포에서 TRAC, TRBC, TRGC 및/또는 TRDC 유전자좌에 표적화된다. SAR의 삽입에 의해 내인성 TRAC, TRBC, TRGC 및/또는 TRDC 유전자좌가 파괴된 이러한 T 세포는 동종이계 세포 요법의 목적에 사용될 수 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR은 내인성 TCR 유전자에 의해 제공되는 생리학적 조절 기전 하에 발현된다. 한 실시 양태에서, SAR은 내인성 TCR 유전자에 의해 제공되는 프로모터 및 3' 비번역 조절 기전 하에 발현된다. 한 실시 양태에서, SAR을 코딩하는 발현 카세트는 내인성 TCRα, TCRβ1/β2, TCRγ 또는 TCRδ 유전자좌에 표적화된다.

한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRα 불변 사슬이 내인성 천연 TCRα 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현되도록 내인성 TCRα 유전자좌(TRAC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRα 불변 사슬이 내인성 TCRα 불변 사슬 유전자의 엑손 중 적어도 하나에 의해 완전히 또는 부분적으로 코딩되도록 내인성 TCRα 유전자좌(TRAC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRα 불변 사슬이 천연/내인성 TCRα 불변 사슬 유전자의 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유하도록 내인성 TCRα 유전자좌(TRAC)에 표적화된다.

한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRβ 불변 사슬이 내인성 천연 TCRβ 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현되도록 TCRβ 유전자좌(TRBC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRβ 불변 사슬이 내인성 TCRβ 불변 사슬 유전자의 엑손 중 적어도 하나에 의해 완전히 또는 부분적으로 코딩되도록 내인성 TCRβ 유전자좌(TRBC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRα 불변 사슬이 천연/내인성 TCRβ 불변 사슬 유전자의 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유하도록 내인성 TCRβ 유전자좌(TRBC)에 표적화된다.

한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, γδTFP, 또는 γδTCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRγ 불변 사슬이 내인성 천연 TCRγ 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현되도록 내인성 TCRγ 유전자좌(TRGC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, γδTFP, 또는 γδTCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRγ 불변 사슬이 내인성 TCRγ 불변 사슬 유전자의 엑손 중 적어도 하나에 의해 완전히 또는 부분적으로 코딩되도록 내인성 TCRγ 유전자좌(TRGC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, γδTFP, 또는 γδTCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRγ 불변 사슬이 천연/내인성 TCRγ 불변 사슬 유전자의 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유하도록 내인성 TCRγ 유전자좌(TRGC)에 표적화된다.

한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, γδTFP, 또는 γδTCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRδ 불변 사슬이 내인성 천연 TCRδ 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현되도록 내인성 TCRδ 유전자좌(TRDC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, γδTFP, 또는 γδTCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRδ 불변 사슬이 내인성 TCRδ 불변 사슬 유전자의 엑손 중 적어도 하나에 의해 완전히 또는 부분적으로 코딩되도록 내인성 TCRδ 유전자좌(TRDC)에 표적화된다. 한 실시 양태에서, SAR은 SAR(즉, SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, γδTFP, 또는 γδTCR의 백본을 갖는 SAR)의 TCRδ 불변 사슬이 천연/내인성 TCRδ 불변 사슬 유전자의 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유하도록 내인성 TCRδ 유전자좌(TRGC)에 표적화된다.

본 개시 내용은 또한 동종이계 SAR-T 세포를 생성할 목적으로 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 TRAC 및/또는 TRBC 유전자좌에 표적화하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

한 실시 양태에서, 세포는 줄기세포이고 줄기세포는 내인성 T 세포 수용체 사슬 중 하나 이상이 결핍되어 있다. 또 다른 실시 양태에서, 세포는 SAR의 하나 이상의 표적 항원(예를 들어, MPL, CD33, CD123, CD19 등)이 결실되거나 SAR에 의해 더 이상 인식되지 않는 형태로 돌연변이된 줄기세포이다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD19가 결핍된 줄기세포에서 발현되어 이러한 줄기세포에서 생성된 B 세포가 CD19 표적화 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 대안적으로, CD19를 표적화하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 CD19가 SAR에 의해 표적화되지 않는 형태로 돌연변이된 줄기세포에서 발현되어 이러한 줄기세포에 의해 생성된 B 세포가 CD19 표적화 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 또 다른 실시 양태에서, SAR은 SAR 표적 항원의 발현이 결여되거나 SAR에 의해 인식되지 않는 SAR 표적 항원의 돌연변이된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작된 자가 또는 동종이계 공여자로부터의 줄기세포, 또는 면역 이펙터 세포에서 발현된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD19가 결핍된 자가 또는 동종이계 조혈 줄기세포와 함께 환자에게 주입된 T 세포에서 발현되어 이러한 줄기에 의해 생성된 B 세포는 CD19 표적화 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 대안적으로, CD19를 표적화하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 CD19가 SAR에 의해 표적화되지 않는 형태로 돌연변이된 자가 또는 동종이계 조혈 줄기세포와 함께 환자에게 주입되는 T 세포에서 발현되어 이러한 줄기세포에 의해 생성된 B 세포가 CD19 표적화 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 기타 항원이 질환 관련 세포 또는 질환 유발 세포에서 발현되는 특정 질환의 치료를 위해 이 항원을 표적화하는 SAR-T 세포를 받는 대상체에서 shRNA, CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 줄기세포에서 다른 내인성 항원(예를 들어, MPL, CD33, CD123 등)을 돌연변이시키거나 제거하기 위해 유사한 접근법을 사용할 수 있다.

T 세포 또는 자연 살해(NK) 또는 줄기세포는 대상체로부터 얻을 수 있다. "대상체"라는 용어는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유동물)를 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 형질전환 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 다양한 출처에서 얻을 수 있다. T 세포는 SAR의 발현 전에 시험관 내에서 배양 및 증식될 수 있는 조직 상주 감마-델타 T 세포일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 유전적으로 변형된 세포 또는 세포 집단을 생산하는 방법으로서, 본 발명의 SAR 핵산 구축물을 상기 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 핵산(예를 들어, 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA; 본원에 기재된 바와 같은 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 서열)을 세포내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 실시 양태에서, RNA는 SAR 폴리펩티드를 일시적으로 발현한다. 한 실시 양태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포, 또는 세포 집단)이다. 이러한 방법에 의해 생성된 세포도 본 발명의 범위 내에 있다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 적응 면역요법에 사용하기 위한 세포 집단을 생성하기 위한 생체 외 방법으로서, 본 발명의 SAR로 상기 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 개시 내용의 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 많은 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집에 의해 수득된다. 한 측면에서, 세포는 작용제의 투여에 의해 T 세포가 동원된 대상체로부터 수집된다. 일부 실시 양태에서, 면역 세포는 면역 세포 수집 전에 CXCR4 길항제(예를 들어, 플레릭사포르), 사이토카인(예를 들어, G-CSF, GM-CSF 또는 사그라모스팀, 뉴라스타 또는 페그필그라스팀), 베타2 아고니스트(예를 들어, 에피네프린), 티로신 키나아제 억제제(예를 들어, 다사티닙), 화학요법 약물(예를 들어, 시클로포스파미드, 독소루비신 등)을 단독으로 또는 조합하여 투여받은 공여자로부터 수집한다. 일부 실시 양태에서, 공여자는 자가 공여자인 반면, 다른 실시 양태에서 공여자는 동종이계 공여자이다.

성분채집 산물은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 한 측면에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속 처리 단계를 위한 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치할 수 있다. 한 실시 양태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 대안적인 실시 양태에서, 세척 용액은 칼슘이 없거나 마그네슘이 없을 수 있거나 모두는 아니지만 많은 2가 양이온이 없을 수 있다.

본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들어 2% 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 이용할 수 있고, 공지된 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌[Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi: 10.1038/cti.2014.31]에 기재된 것을 이용할 수 있음을 인식할 것이다.

한 측면에서, T 세포는 예를 들어 역류 원심 세정(counterflow centrifugal elutriation) 또는 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.

또 다른 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR 발현 이펙터 세포는 SAR 발현 세포의 활성을 향상시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 것이다. 억제 분자의 비제한적인 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시 양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 41BB, CD27, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이들의 조합) 및/또는 1차 신호전달 도메인(예를 들어, CD3 제타 신호전달 도메인)과 결합된, 억제 분자에 결합하는 제1 폴리펩티드, 예를 들어 scFv 또는 VHH 또는 수용체 또는 리간드 단편을 포함한다. 한 실시 양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는 본원에 기재된 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, CRa, TCRb1, TCRb2, pre-TCRa, pre-TCRa-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬)과 결합된, 억제 분자에 결합하는 제1 폴리펩티드, 예를 들어 scFv 또는 VHH 단편 또는 수용체 또는 리간드 단편을 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR 발현 세포는 보조 모듈, 예를 들어 SAR 발현 세포의 활성을 향상시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. SAR 발현 세포의 활성을 향상시킬 수 있는 작용제를 포함하는 보조 모듈의 여러 예가 서열 번호 11998 내지 12019에 제공되어 있다(표 24). 예를 들어, 한 실시 양태에서, 작용제는 SAR 사슬(예를 들어, CD3ζ, CD3δ, CD3ε, CD3γ 또는 이들의 조합)의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 작용제일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 작용제는 SAR 발현 세포에 공동자극 신호를 제공하는 작용제(예를 들어, vFLIP K13, vFLIP MC159, cFLIP-L, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, 41BB 또는 CD28)일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 작용제는 SAR 발현 세포에 공동자극 신호를 유도성 방식으로 제공하는 작용제(예를 들어, FKBPx2-K13, FKBPx2-MC159, FKBPx2-cFLIP, FKBPx2-cFLIP-L, FKBPx2-cFLIP-p22, FKBPx2-HTLV1 Tax, FKBPx2-HTLV2 Tax, FKBPx2-41BB 또는 FKBPx2-CD28, Myr-MYD88-CD40-Fv'-Fv 등)일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 작용제는 SAR 발현 세포의 증식 또는 지속을 촉진하는 사이토카인 또는 케모카인(예를 들어, 예를 들어, CD40L, IL2, IL-7, IL-15, IL12f 또는 IL-21)일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 작용제는 SAR 발현 세포의 활성을 촉진하고/거나 SAR 발현 세포와 상승작용을 일으키는 가용성 수용체(예를 들어, sHVEM 또는 sHVEM-Alb8-vHH)일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자, 예를 들어 PD1은 일부 실시 양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 SAR 발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 작용제는 PD1 또는 CTLA4를 표적화하는 scFV일 수 있다. 한 실시 양태에서, 작용제는 예를 들어 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타와 같은 억제 분자의 제1 폴리펩티드, 또는 이들 중 임의의 것의 단편(예를 들어, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 공동자극 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시 양태에서, 작용제는 PD1 또는 이의 단편(예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인의 제2 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 면역 세포는 하나 이상의 화학요법 약물에 내성이 있도록 조작된다. 화학 요법 약물은 예를 들어 퓨린 뉴클레오티드 유사체(PNA)일 수 있으므로 면역 세포를 입양 면역 요법과 화학 요법을 결합한 암 치료에 적합하게 만든다. 예시적인 PNA는 예를 들어 클로파라빈, 플루다라빈, 시클로포스파미드 및 시타라빈을 단독으로 또는 조합하여 포함한다. PNA는 데옥시시티딘 키나아제(dCK)에 의해 일인산, 이인산, 삼인산 PNA로 대사된다. 이들의 삼인산 형태는 DNA 합성에 대해 ATP와 경쟁하고, 세포자멸사 촉진제로 작용하며, 삼뉴클레오티드 생산에 관여하는 리보뉴클레오티드 환원효소(RNR)의 강력한 억제제이다. 파괴되거나 불활성화된 dCK 유전자를 포함하는 SAR-T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시 양태에서, dCK 녹아웃 세포는 예를 들어 mRNA의 전기천공에 의해 dCK 유전자에 대해 지시된 특정 TAL-뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 T 세포의 형질감염에 의해 제조된다. dCK 녹아웃 SAR-T 세포는 예를 들어 클로로파라빈 및/또는 플루다라빈을 포함하는 PNA에 대해 내성을 가질 수 있고, SAR 항원(들)을 발현하는 세포에 대해 T 세포 세포독성 활성을 유지할 수 있다.

한 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR 발현 이펙터 세포는 동일하거나 상이한 표적에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함할 수 있는 제2 SAR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제2 SAR은 제1 SAR과 동일하거나 상이한 세포 유형을 표적화할 수 있다

한 실시 양태에서, 본원에 기재된 SAR 발현 이펙터 세포는 동일하거나 상이한 항원 결합 도메인, 선택적으로 동일하거나 상이한 표적을 갖는 제2 SAR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제2 SAR은 제1 SAR과 동일하거나 상이한 세포 유형을 표적화할 수 있다. 두 SAR은 동일한 백본 또는 상이한 백본을 가질 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, 두 SAR은 2세대 CAR의 백본을 가질 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 하나의 SAR은 SIR의 백본을 가질 수 있는 한편, 제2 SAR은 TFPε의 백본을 가질 수 있다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 하나의 SAR은 Ab-TCR의 백본을 가질 수 있는 한편, 제2 SAR은 SIR의 백본을 가질 수 있다. 상이한 백본 상의 몇몇 예시적인 SAR의 핵산 및 아미노산 서열이 표 35 및 36에 제시되어 있다. 한 실시 양태에서, SAR은 질환 관련 항원과 동일한 질환 세포 유형(예를 들어, 암) 상에서 발현되는 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, SAR 발현 세포는 제1 항원을 표적화하는 제1 SAR, 및 상이한 제2 항원을 표적화하고 1차 신호전달 도메인은 없지만 공동자극 신호전달 도메인을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 SAR을 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27 또는 OX-40을 SAR(예를 들어, 2세대 CAR)에 배치하면 두 표적 모두가 발현되는 세포에 대한 SAR 활성을 조절할 수 있다. 한 실시 양태에서, SAR 발현 세포는 i) 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 및 1 또는 2개의 TCR 불변 사슬을 포함하는 제1 질환 관련 항원 SAR(예를 들어, SIR), 및 ii) 상이한 표적 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 질환 관련(예를 들어, 암) 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 1차 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인 포함하는 2세대 CAR 또는 TFPε을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, SAR 발현 세포는 i) 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 및 1 또는 2개의 TCR 불변 사슬을 포함하는 제1 SAR(예를 들어, SIR) 및 ii) 제1 표적 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에서 발현되는 항원) 이외의 항원을 표적화하고 항원에 특이적인 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 이 CAR 구축물에는 CD3z 도메인이 없다. 또 다른 실시 양태에서, SAR 발현 세포는 i) 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인, 1 또는 2개의 TCR 불변 사슬을 포함하는 제1 질환 관련 항원 SAR(예를 들어, SIR 또는 Ab-TCR), 및 ii) 상이한 표적 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 질환 관련(예를 들어, 암) 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하지만 공동자극 영역을 포함하지 않는 CAR을 포함한다.

한 실시 양태에서, CAR은 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예컨대, 41BB, CD27, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이들의 조합으로부터의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 그러나 이에 제한되지는 않음) 및/또는 1차 신호전달 도메인(예컨대, CD3 제타 신호전달 도메인, 그러나 이에 제한되지 않음)을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR 발현 이펙터 세포는 본원에 기재된 SAR 및 억제성 CAR을 포함한다. 한 실시 양태에서, 억제성 CAR은 정상 세포 상에서 발견되지만 암 세포에서는 발견되지 않는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시 양태에서, 억제성 CAR은 억제 분자의 항원 결합 도메인, 경막 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제성 CAR의 세포내 도메인은 PDl, PD-Ll, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRl, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타 중 어느 하나의 세포내 도메인일 수 있다. 억제성 CAR을 공동발현하는 예시적인 SAR 폴리펩티드는 서열 번호 3220에 제시되어 있다. 이 폴리펩티드에서 억제성 CAR은 LAIR1의 시토졸 도메인 및 경막 도메인에 융합된 CXCR4를 표적화하는 vHH를 발현한다.

특정 실시 양태에서, 제1 SAR 분자(예를 들어, CAR)의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고 제2 SAR(예를 들어, SIR, Ab-TCR 또는 TFP) 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하지 않는다. 예를 들어, 제1 SAR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고 제2 SAR 분자의 항원 결합 도메인은 낙타과의 VHH 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR, 및 PD 1 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 inhKIR 세포질 도메인; 경막 도메인, 예를 들어 KIR 경막 도메인; 및 억제제 세포질 도메인, 예를 들어 ITIM 도메인, 예를 들어 inhKIR ITIM 도메인을 포함하는 억제 분자를 추가로 포함한다.

본 개시 내용의 SAR을 발현하는 세포는 질환의 치료에 사용된다.

따라서 본 개시 내용은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 SAR을 포함하는 세포 또는 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 약학적 활성량의 본 발명의 세포 및/또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 개시 내용은 또한 요법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 SAR, SAR을 포함하는 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 암 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 SAR 또는 SAR을 포함하는 세포에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 암 치료용 의약의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 SAR 또는 SAR을 포함하는 세포의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 대상체에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 대상체에게 본 발명의 SAR을 발현하는 세포 또는 세포 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 도메인은 표적 세포 집단 또는 조직을 특이적으로 인식하도록 선택된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법으로서, 포유동물에게 본 발명의 SAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포 또는 세포 집단의 유효량을 투여함으로써, 대상체에서 항-종양 면역을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 개시 내용은 또한 SAR 분자, SAR 분자를 발현하는 세포 또는 SAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시 양태에서, 대상체는 본원에 기재된 장애를 갖는다. 예를 들어 대상체는 본원에 기재된 표적 항원을 발현하는 암, 감염성 질환, 알레르기 질환, 퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는다. 또 하나의 실시 양태에서, 대상체는 본원에 기재된 장애의 증가된 위험을 갖는다. 예를 들어 대상체는 본원에 기재된 표적 항원을 발현하는 암, 감염성 질환, 알레르기 질환, 퇴행성 질환 또는 자가면역 질환의 증가된 위험을 갖는다. 한 실시 양태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시 양태에서, 대상체는 동물이다. 또 다른 실시 양태에서, 대상체는 개와 같은 반려 동물이다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 표적화된 X-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 질환 관련 항원을 나타내고, 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 상기 X 항원을 발현한다. 표 45는 다양한 항원 및 이들 항원을 표적화하는 SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 사용하여 예방, 억제 또는 치료될 수 있는 예시적인 질환의 목록을 제공한다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 XSAR(또는 X-SAR)을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 암 세포는 항원 표적 "X"를 발현한다. 한 실시 양태에서, X는 정상 세포 및 암 세포 둘 다에서 발현되지만, 정상 세포에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. 한 실시 양태에서, 방법은 XSAR이 X를 발현하는 암세포에 결합하여 이를 사멸시키지만 예를 들어, 본원에 기재된 분석에 의해 결정될 때, X를 발현하는 정상세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 그 이하 미만이 사멸되는 친화도로 X에 결합하는 SAR을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 Gluc 방출 세포독성 분석은 예를 들어 암세포를 표적화하는 XSAR을 식별하는 데 사용될 수 있다. 한 실시 양태에서, 선택된 SAR은 표적 항원에 대해 약 10^-4 M 내지 10^-8 M, 보다 일반적으로 약 10^-5 M 내지 10^-7 M, 및 전형적으로 약 10^-6 M 또는 10^-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 갖는다. 한 실시 양태에서, 선택된 항원 결합 도메인은 참조 항체, 예를 들어 본원에 기재되고 SAR의 결합 도메인이 유래된 항체보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 미만인 결합 친화도를 갖는다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 이중특이성 SAR(또는 AxB-SAR)을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 A 및 B는 SAR이 표적화하는 2개의 상이한 항원을 나타낸다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 CD22이고 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 CD20이며 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 BCMA이고 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 CD38이고 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 BCMA이고 항원 B는 CD38이고 질환은 형질 세포 장애 또는 원발성 삼출 림프종(PEL)이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 BCMA이고 항원 B는 CS1/SLAMF7이고 질환은 형질 세포 장애 또는 원발성 삼출 림프종(PEL)이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD123이고 항원 B는 MPL이고 질환은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 장애 또는 골수섬유증이다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD123이고 항원 B는 CD33이고 질환은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 또는 골수증식성 장애이다.

예시적인 실시 양태에서, 항원 A 및 B 둘 모두는 혈액 세포 상에서 발현된다. 한 실시 양태에서, 한 항원은 혈액 계통 세포(예를 들어, 정상 B 세포 또는 림프종 세포) 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 반면, 다른 항원은 비-혈액 세포(예를 들어, 전립선암 세포) 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현된다. 한 실시 양태에서, 한 항원은 정상 혈액 계통 세포(예를 들어, 정상 B 세포) 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현되는 반면, 다른 항원은 종양 세포(예를 들어, 전립선암 세포) 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현된다. 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 PSMA이고 질환은 전립선암이다. 이러한 구축물에서 CD19의 표적화는 정상 B 세포 상에서 발현된 CD19의 표적화에 의해 SAR 세포에 증식 신호를 제공하는 반면 PSMA의 표적화는 전립선암 세포의 사멸을 유도한다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 CD20이고 항원 B는 PSMA이고 질환은 전립선암이다. 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 항원 A는 BCMA이고 항원 B는 PSMA이고 질환은 전립선암이다. 종양 세포(예를 들어, 고형 종양 세포) 상에서 우선적으로 발현되는 항원의 다른 예는 당 업계에 공지되어 있으며, Her2, Her3, 메소텔린, CEACAM5, EGFR, EGFRviii, IL13Ra2, TAJ, ROR1, CD70, DLL3, Muc16, Muc1, GD2, GD3, CDH6, CDH17, EpCAM, LiCAM, 엽산 수용체 1, GCC, NY-ESO, AFP, MAGE 및 WT1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD19xC20 이중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 CD19 및 CD20을 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 질환이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 급성 B 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 또는 B 세포 림프종이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD19xC22 이중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 CD19 및 CD22를 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 질환이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 급성 B 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 또는 B 세포 림프종이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD19xC22xCD20 삼중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 CD19, CD22 및 CD20를 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 질환이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 급성 B 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 또는 B 세포 림프종이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 BCMAxCD38 이중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 BCMA 및 CD38를 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 질환이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 형질 세포 장애(예를 들어, 형질 세포 백혈병, 골수종)이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 TCRB1-SIR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 TCRB1(T 세포 수용체 베타1 사슬)을 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 장애이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 또는 자가면역 갑상선염이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 TCRB2-SIR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 TCRB2(T 세포 수용체 베타2 SAR)를 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 장애이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 또는 자가면역 갑상선염이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 T 세포 수용체 감마-델타-SIR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 T 세포 수용체 감마-델타를 발현한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 암 또는 면역 장애이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 또는 자가면역 갑상선염이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD4-DC-SIGN을 코딩하는 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 실시 양태에서, 치료 또는 예방될 질환은 HIV1/AIDS이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 자가항원 또는 이의 단편을 코딩하는 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 실시 양태에서, 자가면역 질환은 진성 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 부신생물성 천포창, 사구체신염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 크론병이다. 한 측면에서, 질환은 심상성 천포창이고, SAR의 항원 결합 도메인은 데스모글레인 3(Dsg3)의 세포외 도메인을 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD16 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이를 코딩하는 범용 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 SAR의 CD16 도메인 및 질환 관련 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편과 함께 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 면역글로불린 결합 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이 단편을 코딩하는 범용 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. SAR-발현 면역 이펙터 세포는 SAR 수용체의 면역글로불린 결합 도메인 및 질환 관련 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, TCRα의 불변 사슬)에 결합된 면역글로불린 결합 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이 단편을 코딩하는 범용 SAR 및 T 세포 수용체 불변 사슬(예를 들어, TCRβ의 불변 사슬)에 결합된 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, vHH, vL, vH, 또는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인) 둘 모두를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. SAR 발현 면역 이펙터 세포는 질환 관련 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원과 함께 제1 SAR 수용체의 면역글로불린 결합 도메인에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 면역글로불린 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이 단편을 코딩하는 범용 SAR을 상기 수용체 및 질환 관련 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 T 세포 수용체 불변 사슬에 결합된 CD16 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이(예를 들어, V158 돌연변이체) 단편을 코딩하는 범용 SAR 및 T 세포 수용체 불변 사슬에 결합된 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, vHH, vL, vH, 또는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인)을 코딩하는 SAR 둘 모두를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. SAR 발현 면역 이펙터 세포는 SAR의 CD16 도메인 및 질환 관련 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD16 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이 단편(예를 들어, V158 돌연변이체)을 코딩하는 범용 SAR을 SAR의 CD16 도메인 및 질환 관련 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 NKG2D 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이 단편을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD19SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD20SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 CD22SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 F질환 관련 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드 또는 ITC-표지된 항체 또는 항체 단편과 함께 FITC-SIR를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 질환 관련 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드 또는 비오틴-표지된 항체 또는 항체 단편과 함께 아비딘-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 질환 관련 세포상에서 발현되는 항원에 결합하는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드 또는 Streptag-함유 항체 또는 항체 단편과 함께 Streptag-SAR 또는를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 항원 결합 도메인이 IgE에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 IgE-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)를 제공하는 단계에 의한 방법을 제공한다. 한 측면에서 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 암성 종양의 성장이 억제되도록 PD1SAR(즉, PD1의 세포외 도메인을 이의 항원 결합 도메인으로 함유하는 SAR)을 사용하는 생체 내 대상체의 치료에 관한 것이다. PD1SAR은 암성 종양의 성장을 억제하기 위해 단독으로 사용될 수 있다.

본 개시 내용의 또 다른 측면에서, 본 개시 내용에 따른 SAR 또는 SAR을 포함하는 단리된 세포 또는 세포 집단 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 개시 내용의 유전적으로 변형된 세포 또는 약학 조성물은 비경구 투여를 포함하는 임의의 편리한 경로에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 비강 내, 직장, 방광 내, 피 내, 국소 또는 피하 투여를 포함한다. 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취할 수 있다.

본 개시 내용의 조성물은 액체, 예를 들어, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 주사, 주입(예를 들어, IV 주입)에 의한 또는 피하 전달에 유용할 수 있다. 본 발명의 액체 조성물은 용액, 현탁액 또는 기타 유사한 형태이든지 간에 다음 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 물, 식염수, 일반적으로 생리 식염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린 또는 기타 용매; 벤질알코올, 메틸파라벤 등의 항균제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제를 포함한다. 조성물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리, 플라스틱 또는 기타 재료로 만들어진 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다.

특정 장애 또는 병태의 치료에 효과적인/활성인 본 개시 내용의 약학 조성물의 양은 장애 또는 병태의 성질에 의존할 것이고 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 또는 생체 내 분석을 선택적으로 사용하여 최적의 투여량 범위를 식별할 수 있다. 조성물에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장애의 심각성에 의존할 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.

본 개시 내용의 조성물은 적합한 투여량이 얻어질 수 있도록 유효량의 본 개시 내용의 결합 분자를 포함한다. 화합물의 정확한 투여량은 구체적인 제형, 적용 방식, 및 구체적 적용 부위, 숙주 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것이다. 연령, 체중, 성별, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 숙주의 상태, 약물 조합, 반응 민감도 및 질환의 중증도와 같은 기타 요인을 고려해야 한다. 투여는 최대 허용 용량 내에서 연속적으로 또는 주기적으로 수행될 수 있다.

전형적으로, 이 양은 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 0.01%의 본 개시 내용의 결합 분자이다.

본 개시 내용의 바람직한 조성물은 비경구 투여 단위가 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량%의 본 개시 내용의 결합 분자를 함유하도록 제조된다.

정맥 내 투여의 경우, 조성물은 동물 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 바람직하게는 동물 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 보다 전형적으로 동물 체중의 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg을 포함할 수 있다.

본 조성물은 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태와 같이 적합한 담체의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약학 담체의 다른 예는 문헌[E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기술되어 있다.

약학 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 투여를 목적으로 하는 조성물은 본 개시 내용의 결합 분자를 물과 조합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 계면활성제를 첨가할 수 있다.

본 개시 내용의 약학 조성물은 다른 치료제, 예를 들어 항암제와 공동 투여될 수 있다.

한 실시 양태에서, 암은 혈액암 또는 악성종양 또는 고형 종양으로부터 선택된다. 혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 고형 종양은 일반적으로 낭종이나 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다.

한 실시 양태에서, 암은 전이성이다.

본원에 기재된 방법, 용도 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 암세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 암은 구체적으로 다음의 조직학적 유형일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 결합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종 폴립의 선암종; 선암종, 가족성 대장 폴립증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성(acidophil) 암종; 호산성(oxyphilic) 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포 선암종; 유두 및 여포 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 보조기 암종; 아포크린 선암종; 피지선암종; 이구선암종; 점막표피양 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 반지 세포 암종; 침윤성 관성 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유방; 선방 세포 암종; 선편평암종; 편평상피화생 동반 선암종; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 포막종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 및 신경모세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방 외 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관 육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재성 확산 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬러 혼합 종양; 신모세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활액 육종; 중피종, 악성; 미분화배세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소 갑상선종, 악성; 융모막암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관 주위 세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질 주위 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙 육종; 치원성 종양, 악성; 법랑모세포 치아육종; 법랑모세포종, 악성; 법랑모세포 섬유육종; 송과종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경 모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경초종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 부육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 여포; 균상 식육종; 기타 특정 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적혈구백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수 육종; 및 모세포 백혈병.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA 및 CD38을 표적화하는 데 사용되며 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA 및 CD38에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 표 34(서열 번호 17638-177810, 17884-17956)에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA 및 CD22를 표적화하는 데 사용되며 림프계 장애 및 형질 세포 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 표 34에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA 및 CD19를 표적화하는 데 사용되며 림프계 장애 및 형질 세포 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 표 34(서열 번호 17665-17737)에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA, CD38 및 CD22를 표적화하는 데 사용되며 림프계, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA, CD38 및 CD19를 표적화하는 데 사용되며 림프계, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예를 들어 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA, CD38, CD22 및 CD19를 표적화하는 데 사용되며 림프계, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예를 들어 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38, CD22 및/또는 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 표 32에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 BCMA, CD38, CD22, CD20 및 CD19를 표적화하는 데 사용되며 림프계, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예를 들어 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38, CD22, CD20 및/또는 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 표 32에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD19 및 CD22를 표적화하는 데 사용되며 림프계 및 자가면역 장애, 예를 들어 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD19 및 CD20을 표적화하는 데 사용되며 림프계 및 자가면역 장애, 예를 들어 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD19, CD22 및 CD20을 표적화하는 데 사용되며 림프계 및 자가면역 장애, 예를 들어 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19, CD20 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD19, CD22, BCMA 및/또는 CD20을 표적화하는 데 사용되며 형질 세포, 림프계 및 자가면역 장애, 예를 들어 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19, CD22, BCMA 및/또는 CD20에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 표 31에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD123 및 CD33을 표적화하는 데 사용되며 골수성 및 골수증식성 장애, 예를 들어 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성증을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD123 및 CD33에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(PRT) 22479-22484에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD123 및 FLT3을 표적화하는 데 사용되며 림프성, 골수성 및 골수증식성 장애, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 및 골수이형성증을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD123 및 FLT3에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(PRT) 22485-22487에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 CD123 및 MPL(TPO-R)을 표적화하는 데 사용되며 림프성, 골수성 및 골수증식성 장애, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 및 골수이형성증을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD123 및 MPL에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(PRT) 22488-22490에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 PSMA를 표적화하고 전립선암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.

한 실시 양태에서, SAR은 PSMA 및 CD19를 표적화하고 전립선암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. CD19 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하는 데 사용된다.

한 실시 양태에서, SAR은 PSMA 및 CD22를 표적화하고 전립선암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. CD22 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하는 데 사용된다.

한 실시 양태에서, SAR은 PSMA 및 CD20을 표적화하고 전립선암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 CD20에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. CD20 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하는 데 사용된다.

한 실시 양태에서, SAR은 PSMA 및 BCMA를 표적화하고 전립선암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 BCMA에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. BCMA 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하는 데 사용된다.

한 실시 양태에서, SAR은 Her2, IL13Ra2 및/또는 CD19를 표적화하고 유방암, 위암 또는 뇌암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 Her2, IL13Ra2 및/또는 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(PRT) 22465-22473에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, SAR은 Her2, IL13Ra2, 낮은 전도도 클로라이드 채널 및/또는 CD19를 표적화하고 유방암, 위암 또는 뇌암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 Her2, IL13Ra2, 낮은 전도도 클로라이드 채널 및/또는 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 예는 서열 번호(PRT) 22474-22478, 22491-22495에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Her2, Her3, CD22, EGFR 및/또는 CD19를 표적화하는 SAR을 제공한다. 이러한 SAR의 예는 표 32에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 Her2, IL13Ra2, CD22, 및/또는 CD19를 표적화하는 SAR을 제공한다. 이러한 SAR의 예는 표 32에 제공되어 있다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 다양한 항원을 표적화하고 어댑터 결합 도메인을 포함하는 UNICON SAR을 제공한다. 이러한 SAR의 예는 표 30에 제공되어 있다.

본 개시 내용의 약학 조성물은 치료(또는 예방)될 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양과 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이다. "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료량" 또는 "항감염성"이 표시되는 경우, 본 개시 내용의 조성물의 양은 경우에 따라 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양의 크기, 감염 또는 전이의 정도, 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본원에 기재된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 포함하는 약학 조성물은 해당 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여 10⁴ 내지 10⁹개 세포/kg 체중, 일부 경우에는 10⁵ 내지 10⁶개 세포/kg의 투여량으로 투여될 수 있다고 언급될 수 있다. T 또는 NK 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 면역요법(예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참조) 및 세포 요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다.

SAR 어댑터 및 항체를 포함한 작용제의 투여량 범위는 효력에 따라 달라지며, 원하는 효과 예를 들어, 종양 성장의 둔화 또는 종양 크기 감소를 일으키기에 충분히 큰 양을 포함한다. 투여량은 허용할 수 없는 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태 및 성별에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 합병증이 있을 경우 개별 의사에 의해 조정될 수도 있다. 일부 실시 양태에서, 투여량은 0.001 mg/kg 체중 내지 0.5 mg/kg 체중의 범위이다. 일부 실시 양태에서, 용량 범위는 5 ㎍/kg 체중 내지 100㎍/kg 체중이다. 대안적으로, 용량 범위는 1 ㎍/mL와 1000 ㎍/mL 사이의 혈청 수준을 유지하도록 적정될 수 있다. 전신 투여를 위해, 대상체는 예를 들어, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 또는 그 이상과 같은 치료량을 투여받을 수 있다.

상기 나열된 용량의 투여는 반복될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 1일 1회, 또는 1일 수회, 예를 들어 1일 3회 제공되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시 양태에서, 상기 나열된 용량은 수주 또는 수개월 동안 매일 투여된다. 치료 기간은 대상체의 임상 진행 및 치료에 대한 반응성에 따라 결정된다.

일부 실시 양태에서, 용량은 약 2 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 4 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 5 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 6 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 8 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 10 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 100 mg/m2 내지 약 700 mg/m2일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 250 mg/m2일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 375 mg/m2일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 400 mg/m2일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 500 mg/m2일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 용량은 정맥 내 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 정맥 내 투여는 약 10분 내지 약 3시간의 기간에 걸쳐 발생하는 주입일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 정맥 내 투여는 약 30분 내지 약 90분의 기간에 걸쳐 발생하는 주입일 수 있다.

일부 실시 양태에서 용량은 대략 주 1회 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 주 1회 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 약 12주 내지 약 18주 동안 주 1회 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서 용량은 대략 2주마다 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서 용량은 대략 3주마다 투여될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 대략 2주마다 투여되는 약 2 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용량은 대략 2주마다 정맥 내 투여되는 약 200 mg/m2 내지 약 400 mg/m2일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 총 약 2 내지 약 10회 용량이 투여된다. 일부 실시 양태에서, 총 4-8회 용량이 투여된다. 일부 실시 양태에서, 총 5회 용량이 투여된다. 일부 실시 양태에서, 총 6회 용량이 투여된다. 일부 실시 양태에서, 투여는 총 약 4주 내지 약 12주 동안 발생한다. 일부 실시 양태에서, 초기 용량은 후속 용량보다 약 1.5 내지 약 2.5배 더 많을 수 있다.

치료 유효량은 종양 크기, 종양 성장 등에서 통계적으로 유의하고 측정 가능한 변화를 생성하기에 충분한 작용제의 양이다(효능 측정은 본원에서 하기에 기재됨). 이러한 유효량은 임상 시험 및 동물 연구에서 측정될 수 있다.

작용제는 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적 주입에 의해 정맥 내 투여될 수 있다. 주어진 경로에 대한 적절한 제형이 주어지면, 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 작용제는 정맥 내, 비강 내, 흡입에 의해, 복강 내, 근육 내, 피하, 공동 내 투여될 수 있고, 원하는 경우 연동 수단에 의해, 또는 당업자에게 공지된 다른 수단에 의해 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 화합물은 암 환자에게 경구, 정맥 내 또는 근육 내 투여하는 것이 바람직하다. 종괴에 직접 국소 투여하는 것도 구체적으로 고려된다.

대상체에게 UNISAR 또는 UNICON-SAR이 투여되는 실시 양태에서, UNISAR/UNICON-SAR 세포 및 SAR 어댑터는 함께 또는 별도로 투여될 수 있다. 대상체에게 UNISAR/UNICON-SAR 세포 및 SAR 어댑터가 별도로 투여되는 실시 양태에서, 각각의 조성물은 본원에 기재된 임의의 투여량 및 투여 경로/루틴에 따라 별도로 투여될 수 있다.

투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 다르며 각 개인에 따라 다르다. 그러나 전신 적용을 위한 적절한 투여량 범위가 본원에 개시되어 있으며 투여 경로에 따라 다르다. 투여에 적합한 요법은 또한 가변적이지만, 초기 투여에 이어 후속 주사 또는 기타 투여에 의해 1시간 이상의 간격으로 반복 투여되는 것이 대표적이다. 대안적으로, 생체 내 요법에 대해 명시된 범위에서 혈액 내 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥 내 주입이 고려된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR 또는 SAR을 포함하는 세포는 기존 요법 또는 치료제, 예를 들어 항암 요법과 조합하여 사용된다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 SAR-T 또는 약학 조성물의 투여 및 항암 요법을 포함하는 조합 요법에 관한 것이다. 항암 요법은 치료제 또는 방사선 요법을 포함할 수 있으며, 유전자 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 골수 이식, 나노 요법, 표적 항암 요법 또는 종양 용해 약물을 포함한다. 다른 치료제의 예에는 다른 관문 억제제, 항신생물제, 면역원성 작용제, 약독화된 암세포, 종양 항원, 종양 유래 항원 또는 핵산으로 펄스된 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포, 면역 자극 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFNa2, GM-CSF), 표적화 소분자 및 생물학적 분자(예컨대 신호 전달 경로의 성분, 예를 들어 티로신 키나아제의 조절제 및 수용체 티로신 키나아제의 억제제, 및 EGFR 길항제를 포함하는 종양 특이적 항원에 결합하는 작용제), 항염증제, 세포독성제, 방사성독성제, 또는 면역억제제 및 면역 자극 사이토카인(예를 들어, GM-CSF)을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포, 화학요법이 포함된다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR-T 또는 약학 조성물은 수술과 조합하여 사용된다. 본 개시 내용의 SAR-T 또는 약학 조성물은 다른 요법과 동시에 또는 상이한 시간에, 예를 들어, 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

한 실시 양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 SAR 분자를 발현하는 세포를 SAR 발현 세포의 활성을 향상시키는 작용제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 작용제는 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-2, 7, IL-15, IL-21, 또는 이들의 조합이다.

다른 실시 양태에서, SIR 분자를 발현하는 세포는 SIR 분자를 발현하는 세포의 투여와 관련된 하나 이상의 부작용을 개선하는 작용제와 조합하여 투여된다. SIR 발현 세포와 관련된 부작용은 사이토카인 방출 증후군(CRS), 혈구포식성 림프조직구증(HLH) 또는 신경학적 합병증으로부터 선택될 수 있다. 이러한 작용제의 예로는 스테로이드(예를 들어 프레드니손, 덱사메타손), IL6R 길항제(예를 들어 토실리주맙), src 키나아제 억제제(예를 들어 다사티닙), 키나아제 억제제(예를 들어 이브루티닙), 칼시뉴린 억제제(예를 들어 타크롤리무스 또는 시클로스포린 A), 또는 화학 요법 약물(예를 들어 시이클로포스파미드, 메토트렉세이트 또는 빈크리스틴)이 포함된다.

임의의 상기 방법 또는 용도의 실시 양태에서, SIR 분자를 발현하는 세포는 표적 항원의 발현과 관련된 질환을 치료하는 작용제, 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 제2 또는 제3 요법과 조합하여 투여된다. 추가의 예시적인 조합은 다음 중 하나 이상을 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 SIR 분자를 발현하는 세포는 SAR이 지시되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 또 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SIR 발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기세포는 특정 암의 종양 미세환경에서 면역억제 경로를 파괴하는 작용제와 함께 대상체에 투여된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR 발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기세포는 이전에 줄기세포 이식, 예를 들어 자가 줄기세포 이식 또는 동종이계 줄기세포 이식을 받은 대상체에 투여된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SIR 발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기세포는 멜팔란, 플루다라빈, 에토포시드 또는 시클로포스파미드와 같은 화학요법의 사전 용량을 받은 대상체에 투여된다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 SAR 발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기세포는 SAR의 표적 항원의 표적 항원의 발현을 향상시키는 약물, 예를 들어 화합물 27, 40 및 49(Du, J et al, Blood, 2016년 10월 12일 온라인 사전출판됨) 삼산화비소 또는 ATRA의 사전 용량을 받은 대상체에 투여된다. 유사하게, BCMA 표적화 SAR은 γ-세크레타제 억제제와 조합하여 사용할 수 있다.

한 실시 양태에서, SAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 SAR 분자를 발현하는 세포는 SIR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합하여 투여된다. 한 실시 양태에서, SAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 SAR 분자를 발현하는 세포는 낮은 면역 상승 용량의 mTOR 억제제와 조합하여 투여된다.

한 실시 양태에서, SAR 발현 세포는 SAR 발현 세포의 활성을 조절하는 작용제와 조합하여 사용된다. 한 실시 양태에서, 작용제는 SAR 어댑터이다.

일부 실시 양태에서, SAR 발현 조작된 면역 세포를 투여받은 대상체로부터 상기 세포를 고갈시키는 방법이 제공된다. 고갈은 억제 또는 제거에 의해 이루어질 수 있다.

한 측면에서, 단클론 항체에 특이적인 에피토프를 포함하는 SAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법은 상기 조작된 면역 세포를 에피토프에 대해 특이적인 단클론 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 단클론 항체에 특이적인 에피토프를 포함하는 SAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 투여받은 대상체로부터 고갈시키는 방법은 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 이들 실시 양태에서, SAR의 세포외 도메인에 존재하는 에피토프에 특이적인 단클론 항체를 대상체에 투여하면 대상체로부터 조작된 SAR 발현 면역 세포의 활성이 제거되거나 억제된다. 한 측면에서, 조작된 CAR 발현 면역 세포의 고갈은 SAR 발현 세포의 내인성 집단의 회복을 허용한다.

한 측면에서, 본 개시 내용은 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체, vHH 도메인, 항체 단편, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 등)에 특이적인 에피토프를 포함하는 내인성 발현 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원을 표적화하는 SAR을 세포 표면에 발현하는 조작된 면역 세포를 투여받은 대상체에서 내인성 항원 발현 세포의 회복을 촉진하는 방법에 관한 것이며, 방법은 에피토프에 특이적인 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체, vHH 도메인, 항체 단편, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 등)를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성 항원 발현 세포"는 SAR에 의해 표적화되는 항원을 발현하는 정상의 건강한 세포를 지칭한다. 예시적인 실시 양태에서, 내인성 항원 발현 세포는 CD33-특이적 SAR-T 세포를 투여받은 대상체에서 CD33을 발현하는 정상의 골수 세포를 지칭한다. 내인성 항원 발현 세포의 다른 예는 CD34, CD123, CD70, CD19 등을 발현하는 세포를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 내인성 항원 발현 세포는 내인성 항원 발현 골수 세포이다. 한 측면에서, 용어 "회복"은 내인성 항원 발현 세포 수를 증가시키는 것을 지칭한다. 내인성 항원 발현 세포 수는 내인성 항원 발현 세포의 증식 증가 및/또는 SAR 발현 조작된 면역 세포에 의한 내인성 항원 발현 세포의 제거 감소로 인해 증가할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상체에 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)의 투여는 대상체에서 항원 발현 조작된 면역 세포를 고갈시키고 내인성 항원 발현 세포, 예를 들어, 내인성 항원 발현 골수 전구 세포의 수를 증가시킨다. 한 실시 양태에서, 대상체에게 항원 결합제(예를 들어, 단클론 항체)의 투여는 항원 결합제의 투여 전에 내인성 항원 발현 세포 수와 비교하여 내인성 항원 발현 세포 수를 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 증가시킨다.

한 측면에서, 대상체에서 항원 X-매개 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 대상체에게 하나 이상의 단클론 항체에 특이적인 하나 이상의 에피토프를 포함하는 세포 표면 X-특이적 SAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 투여하는 단계: 및 (b) 대상체에게 에피토프에 특이적인 하나 이상의 단클론 항체를 투여함으로써 대상체로부터 조작된 면역 세포를 후속적으로 고갈시키는 단계를 포함한다. 한 실시 양태에서, X-특이적 SAR은 항원 X에 이외의 항원을 표적화하는 이중특이성 또는 다중특이성 SAR일 수 있다.

일부 실시 양태에서, SAR 발현 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법에 사용되는 항원 결합제는 알렘투주맙, 이브리투모맙, 티욱세탄, 무로모나브-CD3, 토시투모맙, 압식시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세르톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 젬투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10, 우스테키누맙, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

일부 실시 양태에서, 단클론 항체에 특이적인 상기 에피토프(mAb 특이적 에피토프)는 CD20 에피토프 또는 미모토프(서열 번호 22418)이고 에피토프에 특이적인 항원 결합제는 리툭시맙이다. 일부 실시 양태에서, 단클론 항체에 특이적인 상기 에피토프(mAb-특이적 에피토프)는 CD20 에피토프(서열 번호 22412)이고 에피토프에 특이적인 항원 결합제는 오비누투주맙이다. 일부 실시 양태에서, 단클론 항체에 특이적인 상기 에피토프(mAb 특이적 에피토프)는 Her2 에피토프, 예를 들어, 서열 번호 22432이고, 에피토프에 특이적인 항원 결합제는 허셉틴(트라스투주맙), 카드실라(아도-트라스투주맙), 또는 엔허투(fam-트라스투주맙 데룩스테칸-nxki)이다. 일부 실시 양태에서, 항원 결합제에 특이적인 상기 에피토프(예를 들어, mAb-특이적 에피토프)는 EGFR 에피토프, 예를 들어 서열 번호 22421-22425이고, 에피토프에 특이적인 항원 결합제는 세툭시맙이다. 일부 실시 양태에서, 단클론 항체에 특이적인 상기 에피토프(mAb-특이적 에피토프)는 EGFR 에피토프, 예를 들어, 서열 번호 22426-22431이고, 에피토프에 특이적인 항원 결합제(예를 들어, mAb)는 파니투무맙이다.

일부 실시 양태에서, 대상체에 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에 단클론 항체를 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 투여되는 에피토프 특이적 mAb의 양은 대상체에서 CAR 발현 면역 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 제거하기에 충분하다.

일부 실시 양태에서, 대상체에 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에 375 mg/m2의 리툭시맙을 매주 1회 또는 수회 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에게 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에 6 mg/kg의 파니투무맙을 매주 또는 14일마다 1회 또는 수회 60분에 걸쳐 정맥 내 주입에 의해 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에 8 mg/kg의 허셉틴을 매주 또는 14일마다 1회 또는 수회 60분에 걸쳐 정맥 내 주입에 의해 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에 400 mg/m2의 세툭시맙을 매주 1회 또는 수회 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에 3.6 mg/kg의 카드실라를 3주마다 1회 또는 수회 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체에 단클론 항체를 투여하는 단계는 대상체에게 5.4 mg/kg의 엔허투를 3주마다 1회 또는 수회 주입하는 단계를 포함한다.

일부 실시 양태에서, mAb 특이적 에피토프를 포함하는 SAR을 발현하는 면역 세포(SAR 발현 면역 세포)가 에피토프 특이적 mAb를 사용하는 CDC 분석에서 고갈될 때, 생존 가능한 SAR 발현 면역 세포의 양은 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소한다.

일부 실시 양태에서, 세포독성 약물은 SAR 발현 면역 세포를 고갈시키기 위해 사용되는 에피토프 특이적 항원 결합제(예를 들어, mAb)에 커플링된다. 항체-약물 접합체(ADC)는 단클론 항체의 표적화 능력과 세포독성 약물의 세포 사멸 능력을 결합함으로써 약물 단독 사용과 비교할 때 건강한 조직과 병든 조직을 민감하게 구별할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 주입될 에피토프 특이적 mAb는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 촉진할 수 있는 분자와 미리 접합된다.

따라서, 보체 시스템은 유기체로부터 병원체를 제거하는 항체의 능력을 돕거나 보완한다. 여러 가지 중 하나에 의해 자극되면 세포 사멸 막 공격 복합체의 반응 및 활성화의 대규모 증폭으로 활성화 캐스케이드가 촉발된다. 글리칸과 같이 mAb를 접합하기 위해 다른 분자가 사용될 수 있다[Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, I, Bordron, A. and Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments is acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: l0.2225/voll5-issue5].

본 개시 내용은 또한 본 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 개시 내용의 키트는 SAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 기재된 바와 같은 SAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 포함하는 하나 이상의 용기, 및 본원에 기재된 개시 내용의 임의의 방법에 따른 사용 지침을 포함한다. 본 개시 내용의 SAR 및 기타 조성물 및 방법은 진단, 연구 및 개발 및 치료 적용에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 지침은 상기 기재된 치료적 조치를 위한 조작된 면역 세포의 투여에 대한 설명을 포함한다. 본 개시 내용의 SAR 및 기타 조성물 및 방법은 진단, 치료 연구 및 개발, 실험실 연구 및 치료 적용에 사용될 수 있다. 따라서, 키트 및 첨부 지침은 진단, 치료 연구 및 개발, 실험실 연구 및 치료 적용을 위한 본 개시 내용의 다양한 조성물 및 방법을 제조하고 사용하는 방법에 대한 설명을 포함할 수 있다.

키트에는 림프구 고갈 및/또는 골수 고갈을 위한 하나 이상의 작용제(예를 들어, 알렘투주맙, 시톡산, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 에토포시드 또는 테모졸로미드)가 포함될 수 있다. 키트는 본 개시 내용의 SAR과 조합하여 사용될 수 있는 하나 이상의 어댑터 또는 항체를 포함할 수 있다. 키트에는 SAR 발현 세포의 활성을 제어하기 위한 약물(예를 들어, 다사티닙 또는 토실리주맙) 또는 SAR 어댑터가 포함될 수 있다. 키트는 SAR 및 SAR 어댑터를 코딩하는 벡터 및 SAR의 맵 및 서열을 포함할 수 있다. 키트에는 SAR을 발현하는 벡터를 생성하는 방법, SAR을 면역 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포)에 도입하는 방법, SAR 발현 세포를 증식하는 방법 및 SAR 발현 세포의 활성을 테스트하는 방법에 대한 지침이 포함될 수 있다.

키트는 신규 SAR, SAR 어댑터, 본 개시 내용에 기재된 신규 항원 결합 도메인에 기반한 이중특이성 항체를 비롯한 항체를 생성하는 방법에 대한 지침 및 이러한 시약의 사용 방법에 관한 지침을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포의 사용과 관련된 지침은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 부분 단위 용량일 수 있다. 본 개시 내용의 키트에 제공된 지침은 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침이지만, 기계 판독 가능 지침(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 포함된 지침)도 허용된다. 일부 실시 양태에서, 용기는 식별 가능하고(예를 들어, 라벨, 바코드, 또는 무선 주파수 식별(RFID)에 의해), 추적 가능하거나, 기계 판독가능 용기 식별자로 각인된다.

본 개시 내용의 키트는 적합한 포장에 담겨 있다. 적합한 포장에는 바이알, 병, 단지, 연포장(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 용기(예를 들어, 플라스틱 백)는 정맥 내 주입에 적합하다. 또한, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트에는 멸균 접근 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 용액 백 또는 피하주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 용기에는 또한 멸균 접근 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 SAR이다. 용기는 제2 약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

키트는 선택적으로 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 성분을 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 용기 위 또는 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다.

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시 내용과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 상기 개시 내용은 본 발명을 제조하고 사용하는 방법 및 이의 최선의 모드를 포함하여 본 발명의 범위 내에 포함되는 주제에 대한 전반적인 설명을 제공하지만, 하기 실시예는 추가로 당업자가 본 개시 내용을 실시하는 것을 가능하게 하고 이에 대한 완전한 서면 설명을 제공하기 위해서 제공된다. 그러나 당업자는 이들 실시예의 세부사항이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 그 범위는 본 개시 내용에 첨부된 청구범위 및 그의 등가물로부터 이해되어야 함을 이해할 것이다. 본 개시 내용의 다양한 추가 측면 및 실시 양태는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.

또한, 동물 모델을 사용하여 SAR 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 1차 인간 pre-B-ALL을 치료하기 위해 본원에 기재된 인간 암 관련 항원 특이적 SAR+ T 세포를 사용하는 이종이식 모델을 사용할 수 있다. 용량 의존적 SAR 치료 반응을 평가할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(S): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 세포 증식 및 사이토카인 생산의 평가는 이전에 예를 들어 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(S): 1453-1464 (2009)]에서 설명되었다. 세포독성은 표준 ⁵¹Cr-방출 분석 또는 Matador 분석으로 평가할 수 있다. 영상화 기술을 사용하여 종양 보유 동물 모델에서 SIR의 특이적 트래피킹(trafficking) 및 증식을 평가할 수 있다.

본원에 기재된 SAR을 평가하기 위해 본원의 실시예 부분에 기술된 것뿐만 아니라 당 업계에 공지된 것을 포함하는 다른 분석이 또한 사용될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 문서 및 서열 데이터베이스 식별자는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에 사용된 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 지정된 특징 또는 성분 각각의 구체적인 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에 개별적으로 제시된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 구체적인 개시로 간주되어야 한다. 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기에 설명된 특징의 설명 및 정의는 본 개시 내용의 임의의 특정 측면 또는 실시 양태로 제한되지 않고 설명되는 모든 측면 및 실시 양태에 동일하게 적용된다.

본 개시 내용은 비제한적인 실시예에서 추가로 설명된다.

실시예

다양한 세포 표면 및 세포내 항원을 표적화하는 다양한 구축물의 세포독성을 측정하기 위해 루시페라제(예를 들어, GLuc 또는 NLuc)를 발현하도록 조작된 세포주를 표 C-1에 제공한다. 본 실험에 사용된 세포주, 세포주 상의 표적 항원 및 이들의 성장 배지는 하기 표 C-1에 나타낸다. 여러 표적 세포주에서 일반적으로 사용되는 혈액 계통 항원의 상대적 발현 수준은 표 C-2에 나타낸다. 세포는 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포주는 ATCC, NIH AIDS 시약 프로그램에서 얻었거나 실험실에서 구할 수 있었다.

[표 C-1]

[표 C-2]

NFAT 의존성 EGFP(또는 GFP) 리포터 유전자로 조작된 Jurkat 세포주(클론 E6-1)는 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 Arthur Weiss 박사로부터 기증받았으며 CAR 신호전달을 연구하기 위해 기술되었다(Wu, CY et al., Science 350:293-302,2015) Jurkat 세포는 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다.

SAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터의 생성

렌티바이러스 벡터 pLenti-EF1a 또는 pLenti-EF1α(서열 번호 1), pLenti-EF1a-DWPRE(서열 번호 2) 및 pCCLc-MNDU3 벡터(서열 번호 3)를 사용하였다. psPAX2 벡터는 Didier Trono(Addgene 플라스미드 # 12260)로부터 기증받았다. pLP/VSVG 엔벨로프 플라스미드 및 293FT 세포는 Invitrogen(ThermoFisher Scientific)에서 입수하였다.

MAtador 분석을 사용하여 세포의 세포독성을 측정하기 위한 키메라 항원 수용체(예를 들어, 2세대 CAR, SIR, Ab-TCR 및 TFP 등)의 생성, GGS-NLuc 융합 단백질(Topanga 및 Malibu-Glo 분석)의 생성 및 사용, 루시퍼라제(예를 들어, GLuc) 리포터 세포주의 생성 및 사용이 개시되었다(PCT/US2017/024843, PCT/US2017/025602, PCT/US2017/052344, PCT/US2017/064379 및 PCT/US2018/53247).

렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터

렌티바이러스는 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 293FT 세포에서 인산칼슘 또는 PI 기반 형질감염에 의해 생성하였다(Matta H et al, Cancer Biology and Therapy. 2(2):206-10. 2003). 바이러스는 표적 세포를 감염시키기 위해 새로이 사용하거나 -80℃에서 분취량으로 냉동 보관하였다.

T 세포 및 PBMC의 감염

버피 코트 세포는 로스앤젤레스 아동 병원 혈액 은행(Blood Bank at Children Hospital of Los Angeles)에서 비식별화된 건강한 성인 기증자로부터 얻었고 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하는 데 사용하였다. PBMC를 그대로 사용하거나 CD3 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotech)를 사용하여 T 세포를 단리하는 데 사용하였다. PBMC 또는 단리된 T 세포를 10 ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지(Lonza)에 재현탁하였다. 세포는 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 렌티바이러스 벡터로 감염시키기 전 1일 동안 상기 배지에서 활성화시켰다. 일반적으로 1차 세포(예를 들어, T 세포)는 아침에 스핀 감염(8 ㎍/ml의 Polybrene®(Sigma, 카탈로그 번호. H9268)의 존재하에 XVIVO 배지에 재현탁된 300 ㎕의 농축 바이러스로 37℃에서 90분 동안 1800 rpm)을 사용하여 감염시켰다. 저녁에 배지를 교체하고 총 3회의 감염을 위해 2일 더 감염을 반복하였다. 3차 감염 후, 세포를 펠릿화하고 10ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2를 함유하고 각각의 항생제(지시된 경우)가 보충된 신선한 XVIVO 배지에 재현탁하고 달리 지시되지 않는 한 선별을 위한 세포 배양 플라스크에 넣었다, 약물 선별을 사용하지 않은 경우 10-15일 동안, 약물 선택을 사용하는 경우 20-30일 동안 세포를 상기 배지에서 배양하였다. 세포를 EGFP를 발현하는 렌티바이러스로 감염시킨 경우 약물 선별 없이 증식하거나 흐름 분류하여 EGFP 발현 세포를 농축하였다. 암세포주의 감염을 위해, 약 500,000개의 세포를 Polybrene®(Sigma, 카탈로그 번호. H9268)을 포함한 총 부피 3 ml의 비농축 바이러스 상청액 2 ml로 감염시켰다. 그런 다음날 아침, 세포를 펠릿화하고 각각의 항생제가 포함된 배지에 재현탁하고 선별을 위해 세포 배양 플라스크에 넣었다.

SAR 발현 검출을 위한 FACS 분석

단백질 L 염색을 사용하여 SAR을 검출하기 위해, 1×10⁶ 세포를 수거하고 4% 소 혈청 알부민(BSA) 세척 완충액을 함유하는 빙냉의 1×PBS 3 ml로 3회 세척하였다. 세척 후, 세포를 4℃에서 1시간 동안 1 ㎍의 단백질 L을 함유하는 빙냉의 세척 완충액 0.1 ml에 재현탁하였다. 세포를 빙냉의 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 0.1 ml의 세척 완충액 중 10㎕의 APC-접합된 스트렙타비딘과 함께 30분 동안 (어두운 곳에서) 인큐베이션한 다음, 빙냉의 세척 완충액으로 2회 세척하였다. FACS는 BD Biosciences의 FACSVerse 분석기를 사용하여 수행하였다.

표적 세포 상에서 항원의 발현을 검출하고 SAR 및 BiTe의 구축에 사용되는 다양한 항원 결합 모이어티의 항원 결합 활성을 결정하기 위한 분석

표적 세포 상에서 항원의 발현은 PCT/US2017/025602(그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 항원 특이적 항체를 사용한 면역염색 또는 고감도 항원 검출 분석과 조합된 생물정보학 접근법에 의해 결정하였다. 이 분석은 항체, scFv, vHH 또는 임의의 다른 항원 결합 단편 또는 임의의 수용체 및 리간드의 항원 결합 도메인에 대한 GLuc 또는 NLuc 리포터 단편의 융합을 포함한다. Luc와 융합된 세포외 도메인을 함유하는 예시적인 가용성 형태의 몇 가지 항원의 서열 번호는 표 23에 제공한다. 이들 구축물은 또한 퓨로마이신 내성 유전자(PAC)를 보유하는데, 이는 선택적이며 가용성 단백질의 기능성에 필요하지 않다. Luc와 융합된 예시적인 scFv의 서열 번호는 표 21에 제공한다. Luc와 융합된 예시적인 SVH의 서열 번호는 표 22에 제공한다. 이들 구축물은 또한 퓨로마이신 내성 유전자(PAC)를 보유하는데, 이는 선택적이고 scFV 루시퍼라제 융합 단백질의 기능성에 필요하지 않다.

SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 기능적 SAR을 식별하기 위해 다음 분석으로 테스트한다.

(A) Topanga 분석( NLuc 결합 분석): 대조군 벡터- 및 SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 또는 T 세포를 표적 항원-Nluc 융합 단백질(상기 기재된 바와 같음)로 염색하고 Nluc 활성을 측정함으로써 표적 항원에 결합하는 능력을 분석한다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 FMC63 기반 CAR을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 대조군 벡터 발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포 또는 모 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 비교하여 CD19-NLuc 융합 단백질에 대한 증가된 결합을 보여준다.

(B) 사이토카인 생산에 대한 분석: 대조군 벡터- 및 SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 또는 T 세포를 표적 세포주와 4-96시간 동안 공동 배양하고 상층액을 ELISA를 사용한 사이토카인(예를 들어, IL2, IFNγ, TNFα 등) 발현 유도에 대해 조사한다.

(C) 시험관 내 및 생체 내 세포독성 활성에 대한 분석: 감염되지 않은 T 세포 또는 대조군 벡터 또는 SAR을 발현하는 세포를 비분비 형태의 루시퍼라제(예컨대, GLuc, NLuc, Turboluc 16 등)를 발현하는 표적 세포주와 4-96시간 동안 공동 배양하고 PCT/US17/52344에 기재된 바와 같이 루시퍼라제 활성을 측정하여 세포 용해 유도를 조사한다.

NFAT 프로모터 구동 GFP 발현의 유도. 대조군 벡터 및 SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP를 표적 항원-발현 세포주와 함께 4-24시간 동안 공동 배양하고 표적 항원에 결합하는 이들의 능력을 유세포 분석법을 사용하여 GFP 발현의 유도를 측정함으로써 분석한다. 세포 상청액을 수집하고 사이토카인(예를 들어, IL2)의 유도에 대해 분석한다.

NFAT 프로모터 구동 GFP 발현의 유도.

상이한 항원을 표적화하는 상이한 배경(예를 들어, 2세대 CAR, 이중 사슬 SIR, 1.5 사슬 SIR 등) 상의 다수의 상이한 단일 사슬 및 다중 사슬 SAR 구성물을 구축하였다. 일부 구축물은 단일 항원을 표적화하는 반면, 다른 구축물은 하나 초과의 항원 또는 단일 항원의 2개 상이한 에피토프를 표적화하였다.

대조군 벡터- 및 SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP를 표적 항원 발현 세포주(상기에 기재됨)와 함께 4-24시간 동안 공동 배양하고 표적 항원에 결합하는 이들의 능력을 유세포 분석법을 사용하여 GFP 발현의 유도를 측정함으로써 분석한다. 세포 상청액을 수집하고 사이토카인(예를 들어, IL2)의 유도에 대해 분석한다.

JNG(NFAT 프로모터 하에서 EGFP를 발현하는 JurkaT 세포)를 8 ㎍/ml의 Polybrene®(Sigma, 카탈로그 번호. H9268) 존재하에 스핀감염에 의해 다양한 단일 사슬 및 다중 사슬 SAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. Jurkat-NFAT-GFP 세포를 NFAT 결합 부위를 보유하는 IL-2 프로모터가 GFP 유전자의 상류에 클로닝되는 방식으로 조작한다. 이 세포를 TCR 및 CAR을 통한 신호전달을 연구하는 데 사용하였다. 다양한 SAR을 렌티바이러스 매개 유전자 전달에 의해 Jurkat NFAT-GFP 세포에서 안정적으로 발현하였고, 이어서 퓨로마이신 또는 블라스티시딘으로 선별하였다. 구축물에 항생제 내성 유전자가 없는 경우 약물 선별을 사용하지 않았다. SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포를 대략 1:2의 E:T 비율로 표적 세포와 대략 4시간 내지 18시간 동안 공동 배양하였다. SIR과 그의 표적 항원 사이의 상호작용으로 NFAT 경로가 활성화되면 GFP 발현이 유도된다. 따라서 SAR을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 SIR에 대한 수용체를 발현하는 표적 세포주와 상호작용할 때 증가된 수준의 GFP 발현을 나타낸다. 다양한 SIR 구축물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 다양한 표적 세포의 공동 배양에 의한 GFP 발현의 유도는 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 연구하였다(Wu, Roybal, Puchner, Onuffer, & Lim, 2015). GFP 발현은 FACS 분석에 의해 모니터링하였다. Jurkat-NFAT-GFP(모) 세포를 대조군으로 사용하였다. 다양한 SAR에 대한 결과는 다음 요약 표에 요약한다. 다양한 구축물의 구조는 그 명칭에 따라 결정할 수 있다. 예를 들어, 구축물 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC는 5'에서 3' 방향으로 다음 모듈을 갖는다: CD8 신호 펩티드(CD8SP), CD19 표적화 hu-mROO5-1 vL 단편(CD19-hu-mROO5-1), Xho1 클로닝 부위, CSDVP 돌연변이를 함유하는 인간 TCRa 불변 사슬(hTCRa-CSDVP), 퓨린 절단 부위(F), F2A 리보솜 스킵 서열(F2A), SpeI 부위, 인간 IgH 신호 펩티드 (IgHSP), Apa I 제한 효소 부위, CD20을 표적화하는 낙타과 CD20-2HCD25-VHH 모듈, BamHI 제한 효소 부위, Glycinex4-세린 링커(G4S), BstI 제한 효소 부위, CD19를 표적화하는 CD19-hu-mROO5-1-vH 단편, KACIAH 돌연변이를 포함하는 불변 사슬([hTCRb-KACIAH]), 퓨린 절단 부위(F), P2A 리보솜 스킵 서열 및 퓨로마이신 내성 유전자(PAC). 표에서 다른 구축물의 서열은 그들의 명칭으로부터 그리고 다양한 모듈의 명칭 및 서열 번호를 제공하는 본 개시 내용의 다양한 표를 참조함으로써 유사하게 결정할 수 있다. 대안적으로, 다양한 SAR 구축물의 구성 및 모듈 아키텍처는 핵산 및 아미노산 상동성 검색을 사용하는 것을 포함하는 생물정보학 도구에 의해 그들의 서열로부터 결정할 수 있다. SAR을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 모 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 비교하여 표적 세포주와 함께 배양될 때 더 큰 % GFP 양성 세포를 나타내는 경우 SAR은 분석에서 양성으로 간주한다. 세포주 명칭 뒤의 +/-, +, 2+ 등의 기호는 대조군으로 작용하는 모 Jurkat NFAT-GFP 세포에서 관찰된 % GFP 세포보다 큰 해당 세포주와 SAR 발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 배양 후 % GFP 양성 세포로 측정한 바와 같은 Jurkat-NFAT-GFP 분석에 대한 상대적인 양성 정도를 나타낸다. 일반적으로, 숫자 +/-, +, 2+, 3+, 4+, 5+는 대략 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 및 50% GFP 양성 세포를 지칭한다. 상기 분석에서 GFP 유도의 %는 SAR의 상대적인 강도뿐만 아니라 다른 요인 중에서도 JNG 세포에서 SAR의 상대적인 발현 수준과 표적 세포주에서 표적 항원의 상대적인 발현 수준에 따라 결정된다. 다양한 SAR 구축물의 유전자 형질도입 효율의 차이를 제어하기 위해, 약물 내성 유전자(예를 들어, 퓨로마이신 또는 PAC)를 공동발현하는 SAR 구축물로 형질도입된 JNG 세포로 실험을 수행한 후 약물 선별을 통해 SAR 발현 세포의 안정적인 집단을 생성하였다. SAR 구축물의 약물 내성 유전자(예를 들어, PAC)는 선택적이며 생체 내 연구는 PAC 유전자가 없는 SAR 구축물을 사용하여 수행하였음에 유의해야 한다.

2세대 CAR 백본 상의 단일특이성, 이중특이성 및 이중파라토프 단일 사슬 SAR

4-1BB(BB) 공동자극 도메인 및 CD3z(z) 활성화 도메인이 있는 2세대 CAR 백본(BBz) 상에 다수의 단일특이성, 이중특이성 및 이중파라토프 구축물을 생성하였다. 이들 구축물은 일반적으로 CD8 신호 펩티드(CD8SP) 및 CD8 힌지 및 경막 도메인(CD8TM)을 포함하였다. 그들은 또한 CD8TM 영역의 상류에 삽입된 Myc 에피토프 태그를 포함하였다. 이들 구축물의 항원 결합 도메인(들)은 FHVH, aVH, chVH 도메인을 포함하는 단일 vH 도메인(SVH)을 기반으로 하는 하나 이상의 AABD를 포함하였다. 다른 구축물의 항원 결합 도메인은 낙타과 유래 vHH 도메인을 기반으로 하는 AABD를 포함하였다. FHVH를 기반으로 하는 단일 AABD를 갖는 예시적인 구축물은 서열 번호 21907로 표시된다. vHH를 기반으로 하는 단일 AABD를 갖는 예시적인 구축물은 서열 번호21908로 표시된다. BCMA의 2개의 에피토프를 표적화하는 2개의 직렬 FHVH를 갖는 예시적인 이중파라토프 구축물은 서열 번호 21904로 표시된다. BCMA의 동일한 에피토프를 표적화하는 2개의 직렬 FHVH를 갖는 예시적인 구축물은 서열 번호 21903으로 표시된다. 2개의 상이한 항원(BCMA 및 CD22)을 표적화하는 예시적인 구축물은 서열 번호 21910으로 표시된다. chVH 백본 상의 단일 인간 vH 도메인을 포함하는 예시적인 구축물은 서열 번호 21918로 표시된다. vHH 도메인 및 FVHV 도메인을 포함하는 예시적인 이중특이성 구축물은 서열 번호 21912로 표시된다.

G4S 링커를 통해 CD19-표적화 scFv(MOR0028-scFv)의 N-말단에 부착된 BCMA-FHVH-93을 포함하는 예시적인 구축물은 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-CD19-MOR0028-scFv-hCD8TM-BBZ-T2A-PAC(서열 번호 21946)이다. 유사하게, 구축물 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-Her2-huMab-4D5-H91A-D98A-F100A-Y102V-hCD8TM-BBZ-T2A-PAC(서열 번호 21947)는 G4S 링커를 통해 Her2 표적화 scFv의 N-말단에 부착된 BCMA-FHVH-93을 포함한다.

구축물은 JNG 분석으로 테스트하였다. 표 41에 나타낸 바와 같이, 거의 모든 구축물이 그들의 표적 항원(들)을 발현하는 세포주와 공동 배양될 때 GFP 발현을 유도하였지만 자발적으로 또는 그들의 표적 항원의 발현이 결여된 세포주와의 공동 배양 시 GFP 유도를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 기능적 단일특이성, 이중특이성 및 이중파라토프 SAR 구축물이 선택적 짧은 G4S 링커를 통해 연결된 하나 이상의 AABD로 구축될 수 있음을 입증한다. 결과는 SAR 구축물을 만들기 위해 2개 이상의 AABD가 프레임 내에서 연결될 때 자가 활성화 또는 손상된 신호전달을 초래하는 강장성 신호의 결여를 추가로 입증한다. 일부 CD38 표적화 구축물은 표적 세포주에 노출되지 않고 JNG 세포에서 발현(즉, 자가 활성화) 시 GFP 유도를 나타내었다. 그러나 이것은 아마도 JNG 세포에서 CD38 항원의 발현 때문이었을 것이다. 결과는 또한 상이한 부류 또는 백본(예를 들어, vHH, FHVH, chVH, aVH 등)에 속하는 AABD가 상이한 도메인 사이에서 비특이적 응집 및/또는 입체 장애로 인한 항원 결합 능력을 손상시키지 않으면서 단일 SAR 구축물에서 결합될 수 있음을 입증한다. 더욱이, 동일한 부류 또는 상이한 부류에 속하는 2개의 AABD를 포함하는 이중특이성 구축물은 단일특이성 구축물과 비교하여 단일 항원 중 하나에 대한 반응하여 GFP를 유도하는 능력에서 유의한 감소를 나타내지 않았다. 따라서, 이중 구축물 CD8SP-CD22-FHVH-24-PSMA71v2-chVH-Myc-CD8TM-BBZ-T2A-PAC(서열 번호 21917)는 PSMA-발현 LNCaP 세포에 노출되었을 때 CD8SP-PSMA71-chVH-Myc-CD8TM-BBZ-T2A-PAC(서열 번호 21939)로 표시되는 단일특이성 SAR 구축물(+4.5)과 비교하여 GFP를 유도하는데 약간 더 효과적이었다(+5.5). 그러나 서열 번호 21917을 갖는 SAR은 PSMA가 없지만 CD22를 발현하는 RAJI 세포와의 공동 배양 시 GFP를 효과적으로 유도할 수 있었다.

또한, AABD가 scFv의 N-말단에 부착된 SAR 구축물(서열 번호 21946-21947)에서 두 항원 모두의 표적에 대한 효과적인 GFP 유도가 관찰되었다. 예를 들어, 서열 번호 21946을 갖는 구축물은 RAJI(CD19+BCMA+) 및 RAJI-CD19-KO(CD19-BCMA+) 세포 둘 모두에 노출 시 효과적인 GFP 유도를 나타내었는데 이는 BCMA-FHVH-93 도메인을 통해 후자의 세포에 반응할 수 있었기 때문이다. 이들 결과는 우수한 발현, 항원 결합 및 신호전달 능력을 나타내는 scFv 및 AABD(예를 들어, FHVH, vHH 등)를 포함하는 SAR 구축물이 생성될 수 있음을 입증하였다. 이러한 SAR 구축물의 장점은 SAR에 혼입하기 위한 scFv를 생성하는 데 사용할 수 있는 다양한 암 항원에 대한 다수의 단클론 항체를 사용할 수 있다는 것이다. 그러나 이중특이성 또는 이중파라토프 SAR을 만들기 위해 2개의 scFv를 사용하면 2개의 scFv의 vL/vH 단편의 응집에 의해 유도된 비특이적 응집 및 강장성 신호전달로 인해 낮은 발현 및 손상된 신호전달이 발생한다. 본 개시 내용은 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 단일 사슬 SAR 구축물을 생성하기 위해 하나 이상의 AABD와 조합하여 하나의 scFv를 사용함으로써 이 문제에 대한 해결책을 제공한다. 따라서, 이러한 결과는 AABD를 scFv의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 프레임 내에서 연결함으로써 종래의(예를 들어, 2세대 또는 3세대) 단일 사슬 CAR의 백본을 갖는 기능적 단일 사슬 SAR이 생성될 수 있음을 입증한다. 이러한 구축물에서 scFv의 vL 및 vH 단편의 순서는 vL-vH 또는 vH-vL일 수 있다.

선택적 링커를 통해 CD19 표적화 hu-mROO5-1 scFv의 N-말단을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 프레임 내에서 연결된 상이한 항원을 표적화하는 하나 이상의 AABD를 포함하는 추가의 예시적인 SAR 구축물은 각각 서열 번호 4087, 4118-4119, 4214(NKG2D), 4245-4246, 4341(RZip), 4595(E4), 4753-4754(CD16-V158), 4976 (CD19-vHH-048), 5070-5071(BCMA-FHVH-33 x CD19-vHH-048), 5265(CD20-vHH-2HCD25), 5472(CD123-vHH-2), 5720(Her2-vHH-2D3), 5899(CD22-FHVH-158 x Her3-Affi) 및 6009(IL13Ra2-huvHH-USC1-C1)에 제공한다. 상기 구축물에서 AABD에 대한 설명은 각각의 서열 번호 뒤 괄호 안에 제공된다. 이러한 SAR 구축물을 JNG 세포에서 발현하고 이들이 표적 항원(들) 발현 세포주와 공동 배양 시 GFP를 유도함을 보여준다. 실험은 AABD로서 어댑터 결합 도메인을 코딩하는 구축물(예를 들어, 서열 번호 4214, 4341, 4595, 4753-4754 등)에 대해 SAR 어댑터의 부재 및 존재하에 수행한다. 상기 구축물의 AABD를 대체함으로써 scFv에 융합된 상이한 AABD를 포함하는 추가 SAR 구축물을 구축할 수 있고 본원에 기재된 분석을 사용하여 테스트할 수 있다.

상기 SAR 구축물을 또한 TCRα, TCRβ 또는 둘 다의 불변 사슬의 발현이 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃에 의해 제거된 JNG 세포에서 발현시킨다. SAR 구축물은 TCRα-/-, TCRβ-/- 및 TCRα-/-β-/- 세포의 표면에서 야생형 JNG 세포와 유사한 수준으로 발현되며 그들의 표적 항원 발현 세포에 노출될 때 유사한 신호전달 능력을 갖는다. SAR 구축물을 TRAC 또는 TRBC 게놈 유전자좌에 삽입하여 TCRα 또는 TCRβ 유전자의 프로모터 및 조절 요소하에 발현할 때 본질적으로 유사한 결과를 얻는다. 이들 유전자의 동시 파괴를 초래하는 TRAC 및 TRBC 유전자좌에 SAR 구축물의 삽입은 각각 문헌[Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol 4, 2017 및 Eyquem J et al Nature, 543(7643):113-117, 2017]에 기재된 바와 같이 유전자 표적화를 사용하여 달성한다. 유사하게, 내인성 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 유전자를 αβ T 세포 또는 γδ T 세포에서 파괴한 후 통상적인 2세대 CAR 백본을 갖는 SAR을 발현시킨다. 종래의 2세대 백본 상의 SAR은 TCRα, β, γ 및/또는 δ 사슬의 제거로 세포에서 여전히 발현되고 기능적인 것이 관찰된다.

표 41은 신규 항원을 표적화하는 다수의 단일특이성 및 이중특이성 SAR 구축물을 통한 효과적인 신호전달을 입증한다. CEA, CSPG4 및 PSMA를 표적화하는 예시적인 단일특이성 구축물은 각각 서열 번호 21927, 21945 및 21939로 표시된다. 이들 SAR 구축물은 이들 항원을 발현하는 암의 치료에 사용할 수 있다. 유사하게, CD20 및 CD22, BCMA 및 CD20, BCMA 및 CD22 등을 표적화하는 이중특이성 SAR 구축물은 종양 세포 상에서 단일 항원의 손실(항원 탈출)로 인한 질환 재발을 극복하는 데 사용할 수 있다.

고형 종양 항원 및 혈액 세포 상에서 발현된 항원(예를 들어, CD20과 PSMA, PSMA 및 CD22, 또는 PSMA 및 BCMA)을 표적화하는 이중특이성 구축물은 혈액 세포 상에서 조혈 항원의 높은 수준 발현 때문 환자에게 투여 시 SAR-T 세포에 적절한 증식 신호를 제공하는 이점이 있다. 이것은 고형 종양 표적화된 단일특이성 SAR 구축물의 확장 부족 문제를 잠재적으로 극복할 수 있다.

[표 41]

TFP 백본 상의 단일특이성, 이중특이성 및 이중파라토프 단일 사슬 SAR

CD3ε, CD3γ, CD3ε 사슬에 융합된 scFv를 포함하는 단일 사슬 수용체가 설명되었으며 각각 TFPε, TFPγ 및 TFPε으로 알려져 있다. CD3ε, CD3γ, CD3ε의 세포외, 경막 및 세포질 도메인(ECDTMCP)에 융합된 AABD를 포함하는 SAR 구축물을 생성하기 위해, 다수의 이중특이성 및 이중파라토프 구축물을 구축하였다. 이들 구축물의 명칭, 성분 AABD 모듈 및 서열 번호는 표 42에 제공한다. 이들 구축물의 AABD 성분은 FHVH(예를 들어, 서열 번호 21949-21955), avH(서열 번호 21951) 및 vHH(서열 번호 21963) 프레임워크와 같이 상이한 부류에 속한다. 대표적인 이중특이성 구축물은 서열 번호 21950-21953으로 표시되고, 대표 이중파라토프 구축물은 서열 번호 21949 및 21952로 표시된다. 상기 구축물을 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 상기 기재된 바와 같이 JNG 세포에서 안정적으로 발현하였다. SAR을 발현하는 JNG 세포를 표적 항원 발현 세포주와 공동 배양 시 NFAT-GFP 분석으로 테스트하였다. 표 42는 거의 모든 SAR 구축물에 의한 GFP의 강력한 유도를 보여준다. 추가로, 특정 항원(예를 들어, CD20)에 대한 이중특이성 구축물에 의한 % GFP 유도는 해당 항원을 표적화하고 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 단일특이성 구축물을 사용하여 관찰된 %GFP와 유사함이 주목되며, 이는 하나 초과의 항원 결합 도메인의 존재에 의한 입체 장애가 없음 입증한다. 이러한 결과는 TFPε, TFPδ 및 TFPγ의 백본을 갖는 기능적 단일 사슬 SAR 구축물이 완전 인간 단일 vH 도메인을 포함하는 단일 vH 도메인 및 vHH의 프레임워크를 갖는 AABD를 사용하여 생성될 수 있음을 입증한다. 결과는 TFPε, TFPδ 및 TFPγ 백본을 갖는 기능적 단일 사슬 이중특이성 및 이중파라토프 SAR이 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 단일 vH 도메인을 포함하는 AABD를 사용하여 생성될 수 있음을 추가로 입증한다. 결과는 또한 백본 TFPε, TFPδ 및 TFPγ를 갖는 기능적 이중특이성 및 이중파라토프 SAR이 상이한 부류(예를 들어, FHVH 및 vHH 등)에 속하는 AABD의 조합을 사용하여 생성될 수 있음을 입증한다.

TFP의 백본을 갖고 하나 이상의 AABD를 포함하는 추가의 예시적인 SAR 구축물은 서열 번호 6495-6497(CD22-FHVH-24 x PSMA-chVH-71v2), 6641-6643(CD22-FHVH-24 x CD19-FHVH-354), 6714-6716(CD22-FHVH-24 x BCMA-FHVH-74), 6933-6935(CEA-aVH-300 x BCMA-FHVH-93)로 표시된다. TFP의 백본을 갖고 코딩된 CD19 표적화 인간화 hu-mROO5-1 scFv의 N-말단에 프레임 내에서 연결된 하나 이상의 AABD를 포함하는 예시적인 이중특이성, 이중파라토프 및 다중특이성 SAR 구축물은 서열 번호 5004-5006(CD19-vHH-048), 5252-5254(CD38-FHVH-309021), 5346-5348(BCMA-FHVH-33 x CD38-FHVH-309021), 5594-5596(BCMA-FHVH-33 x CD123-vHH-2), 4237-4239(NKG2D x NKG2D), 4364-4367(RZip), 4491-4493(E4), 및 4745-4747(CD16A-V158)로 각각 표시된다. AABD(들)의 명칭은 서열 번호 뒤 괄호 안에 표시된다. 이러한 SAR 구축물을 JNG 세포에서 발현할 수 있고 이들이 세포주를 발현하는 표적 항원(들)과 공동 배양 시 GFP를 유도함을 보여준다. 실험은 AABD 중 하나로서 어댑터 결합 도메인을 코딩하는 구축물(예를 들어, 서열 번호 4364, 4341, 4491, 4745 등)에 대해 SAR 어댑터의 부재 및 존재하에 수행한다. 상기 구축물의 AABD를 대체함으로써 scFv에 융합된 상이한 AABD를 포함하는 추가 SAR 구축물을 구축할 수 있고 본원에 기재된 분석을 사용하여 테스트할 수 있다. 이들 결과는 TFPε, γ 및 δ의 백본을 가진 기능적 단일 사슬 SAR이 AABD를 scFv의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 프레임 내에서 연결함으로써 생성될 수 있다는 주장을 뒷받침하는 데 사용될 수 있다. 이러한 구축물에서 scFv의 vL 및 vH 단편의 순서는 vL-vH 또는 vH-vL일 수 있다.

TFP 백본 상의 상기 SAR 구축물을 TCRα, TCRβ 또는 둘 다의 발현이 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃에 의해 제거된 JNG 세포에서 또한 발현시킨다. 종래의 2세대 CAR 백본 상의 SAR의 결과와 대조적으로 TFP 백본 상의 SAR 구축물은 야생형 JNG 세포에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 TCRα-/-, TCRβ-/- 및 TCRα-/-β-/- 세포의 표면에서 효과적으로 발현되지 않고 그의 표적 항원 발현 세포에 노출될 때 불량한 신호전달 능력을 갖는 것으로 관찰된다. TCRα의 불변 사슬의 공동발현은 내인성 TCRα 사슬의 발현이 손상되거나 제거된 세포에서 TFP 백본 상의 SAR의 발현을 구제할 수 있는 것으로 관찰된다. 외인성 TCRα 불변 사슬을 공동발현하는 예시적인 구축물이 서열 번호 23331에 제시되어 있다. 유사하게, TCRβ 불변 사슬의 공동발현은 내인성 TCRβ 사슬이 제거되거나 손상된 세포에서 TFP 백본 상의 SAR의 발현을 구제하는 것으로 관찰된다. 외인성 TCRβ 불변 사슬을 공동발현하는 예시적인 구축물이 서열 번호 23332에 제시되어 있다. 마지막으로, TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 둘 다의 공동발현은 TCRα와 TCRβ가 둘 다 녹아웃된 αβ T 세포에서 TFP 백본 상의 SAR의 발현을 구제하기에 충분한 것으로 관찰된다. 대안적으로, TCRγ 및 TCRδ 둘 다의 불변 사슬의 공동발현은 또한 내인성 TCRα 및/또는 TCRβ 불변 사슬의 발현이 제거된 αβ T 세포에서 TFP 백본 상의 SAR의 발현을 구제할 수 있는 것으로 관찰된다. TCRγ 및 TCRδ 사슬을 발현하는 예시적인 구축물은 각각 서열 번호 23333 및 23334에 제공한다. 유사하게, 불변 사슬 TCRα 및 TCRβ의 공동발현은 또한 내인성 TCRγ 및/또는 TCRδ 불변 사슬의 발현이 제거된 γδ T 세포에서 TFP 백본 상의 SAR의 발현을 구제할 수 있다.

SAR 구축물을 TRAC 또는 TRBC 게놈 유전자좌에 삽입하여 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자의 프로모터 및 조절 요소하에 발현할 때 본질적으로 유사한 결과를 얻는다. TRAC 및 TRBC 유전자의 동시 파괴를 초래하는 이들 유전자좌에 SAR 구축물의 삽입은 문헌[Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol 4, 2017 및 Eyquem J et al Nature, 543(7643):113-117, 2017] 각각에 설명된 바와 같이 유전자 표적화를 사용하여 달성한다. 예시적인 표적화 구축물은 서열 번호 23329로 표시된다. TFP 백본 상의 SAR은 T 세포 표면에서 손상된 발현을 나타내고, 이들의 발현이 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현될 때와 비교하여 이들 발현이 TRAC 유전자좌로 지시될 때 T 세포에서 활성(예를 들어, T 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생산 및 세포독성 등)이 감소하거나 없다. 다음으로, TCRα 불변 사슬(TRAC 사슬)의 발현이 내인성 TRAC 게놈 유전자좌가 SAR 발현 카세트에 의해 파괴된 T 세포에서 TFP 백본 상의 SAR의 발현 및 신호전달 활성을 회복하는 데 사용될 수 있는 지의 여부를 테스트한다. 이를 위해, 아미노 말단 신호 펩티드(IgSP)를 가진 TCRα 불변 사슬을 코딩하는 보조 모듈과 함께 TFP를 공동발현하는 표적화 구축물을 구축한다. 보조 모듈은 퓨린-SGSG-P2A 링커에 의해 SAR 코딩 서열과 분리된다. BCMA 및 CD22를 표적화하는 TFP 백본 상의 예시적인 SAR 구축물과 함께 TCRα 불변 사슬을 공동발현하는 예시적인 표적화 구축물의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 23330에 제시되어 있다. 이 구축물에서 TCRα 불변 사슬의 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되고 내인성 TCRα 불변 사슬과 뉴클레오티드 서열이 상이하다. 대안적인 실시 양태에서, TRAC 사슬은 코돈 최적화되고 인간 TCRα 불변 사슬의 발현 또는 외인성으로 발현된 TCRβ 사슬과 그의 염기쌍 형성을 향상시키는 것으로 알려진 아미노산 치환(예를 들어, 서열 번호 1044, 1047)을 보유한다. 외인성 TRAC는 그 자체(서열 번호 23331)로 T 세포에서 발현될 수 있거나, 단일 벡터를 사용하여 TFP 발현 카세트와 공동발현될 수 있다.

SAR 구축물을 발현하는 세포를 RAJI 및 L363 표적 세포에 노출시키고 상기에 기재한 바와 같이 기능적 분석으로 테스트한다. 표적화 구축물이 TCRα 불변 사슬(서열 번호 23330)을 공동발현하는 TFP 백본 상의 SAR을 포함하는 T 세포는 TFP 백본 상의 SAR 구축물(서열 번호 23329) 단독(즉, 외인성 TRAC 사슬의 공동발현 없이)이 TRAC 유전자좌로 지시되는 T 세포와 비교하여 세포 표면상의 SAR의 더 나은 발현을 나타낸다. 또한, 서열 번호 23330을 갖는 표적화 구축물로 표적화된 T 세포는 서열 번호 23329를 갖는 구축물로 표적화된 T 세포와 비교하여 표적 세포에 대해 더 큰 증식, 활성화, 사이토카인(예를 들어, IL2 및 TNFα) 생산, 세포독성, 생체 내 확장, 생체 내 항종양 활성을 나타낸다. TCRγ 및 TCRδ 둘 다의 불변 사슬의 공동발현이 내인성 TRAC 또는/및 TRBC 유전자좌에 SAR 발현 카세트를 삽입하여 내인성 TCRα 및/또는 TCRβ 불변 사슬의 발현이 제거된 αβ T 세포에서 TFP 백본 상의 SAR 발현을 또한 구제할 수 있다는 것이 또한 관찰된다. TCRγ 및 TCRδ 사슬을 발현하는 예시적인 구축물은 각각 서열 번호 23333 및 23334에 제공되어 있다.

[표 42]

1.5 및 이중 사슬 SIR 백본 상의 단일특이성, 이중특이성 및 이중파라토프 SAR의 생성

합성 면역 수용체(SIR)는 WO2018102795에 기술된 차세대 CAR 플랫폼으로 내인성 TCR 신호 전달 복합체를 인게이징하여 생리학적 T 세포 신호전달을 제공한다. 한 구성에서, 이중 사슬 SIR은 전형적으로 각각이 TCR 불변 사슬(예를 들어, Cα 및 Cβ 또는 Cγ 및 Cδ)에 부착된 항원 결합 도메인(예를 들어, vL 또는 vH 등)을 포함하는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 이중 사슬 SIR의 vL 및 vH 도메인은 연결되어 표적 항원에 결합할 수 있는 Fv를 형성한다. 1.5 사슬 SIR은 항원 결합 도메인이 결여된 상보적인 제2 TCR 불변 사슬과 공동발현되는 하나의 TCR 불변 사슬에 프레임 내에 부착된 항원 결합 도메인(예를 들어, scFV)을 포함한다. 2개의 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드가 2개의 TCR 불변 사슬에 부착된 여러 이중특이성 SIR 구축물을 생성하였다. 예를 들어, 서열 번호(DNA) 21974 및 서열 번호(PRT) 22789를 갖는 SAR 구축물에서, 인간화 CD19 지시된 단클론 항체(hCD19-Bu12)로부터 유래된 CD19를 표적화하는 코딩된 scFv가 돌연변이된 TCRβ 사슬(hTCRβ-KACIAH)에 프레임 내에서 융합되고 CD123을 표적화하는 코딩된 scFv(CD123-CSL362)가 상보적인 돌연변이된 인간 TCRα 사슬(hTCRα-CSDVP)에 부착된다. 생성된 구축물은 JNG 세포에서 발현되었지만 CD19(예를 들어, Raji) 및 CD123(Bv173)을 발현하는 표적 세포에 대해 무반응인 것으로 밝혀졌다(표 43). 유사하게, 서열 번호 21975로 표시되는 이중특이성 SIR 구축물은 결국 MYC 태그 링커를 통해 돌연변이된 인간 TCRα 사슬(hTCRα-CSDVP)에 부착되는 hCD19-Bu12 scFv에 개재 링커를 통해 프레임 내에서 부착된 MPL 표적화 scFv(MPL-175)를 코딩한다. 이 구축물에서 코딩된 TCRβ 사슬(hTCRβ-KACIAH)는 항원 결합 도메인이 없지만 V5 태그를 보유한다. 이 구축물은 또한 JNG 분석에 의해 측정된 바와 같이 CD19 발현 Raji 및 Nalm6 세포에 대해서만 약한 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이 구축물을 발현하는 JNG 세포는 또한 MPL 발현 HEL 92.1.7 세포와 공동 배양될 때 한계 GFP 유도를 나타내었다(표 43). 서열 번호 21981 및 21982로 표시되는 구축물에서, 코딩된 2개의 vL 단편은 E-코일 링커를 통해 직렬로 연결된 다음 프레임 내에서 하나의 TCR 불변 사슬에 부착되는 반면, 2개의 vH 단편은 K-코일 링커를 통해 직렬로 연결된 다음 상보적인 TCR 사슬에 부착된다. 서열 번호 21981을 갖는 구축물은 JNG 분석에서 GFP 유도 활성을 나타내지 않았던 반면, 서열 번호 21982를 갖는 구축물은 경도 내지 중등도의 활성을 나타냈다. 다양한 링커를 통해 상이한 구성으로 연결된 2개 이상의 vL, vH 또는 scFv 단편을 코딩하는 이중 사슬 또는 1.5 사슬 SIR 백본 상의 몇 가지 추가적인 이중특이성 및 이중파라토프 구축물을 생성하고 JNG 분석으로 테스트하였다. 일반적으로 이들 구축물은 구축물당 단일 vL, vH 또는 scFv를 코딩하는 상응하는 이중 사슬(DC) 또는 1.5 사슬(OAH) 단일특이성 구축물과 비교하여 JNG 세포에서 발현될 때 약하고/거나 일관성이 없는 GFP 유도를 나타내었다. 몇 가지 예시적인 구축물에 대한 결과를 표 43에 제공한다. 이들 결과는 DC 또는 OAH 사슬 SIR 백본에서 하나 초과의 vL, vH 또는 scFv의 존재가 불량하고/거나 일관되지 않은 발현 및/또는 신호전달 활성을 초래한다는 것을 입증한다.

[표 43]

AABD를 포함하는 단일특이성, 이중특이성 및 이중파라토프 이중 사슬 구축물의 생성 및 테스트

다음으로, AABD를 코딩하는 대략 100개의 이중 사슬 구축물을 생성하여 JNG 세포에서 발현하였다. 이들 구축물은 다양한 항원 결합 도메인을 코딩하였다. 서열 번호(DNA) 및 서열 번호(PRT)를 표 44에 제공한다. 서열 번호 21985-21997, 22007-22008, 22011-22016을 갖는 구축물에서, 코딩된 하나의 FVHV는 TCRβ 불변 사슬(hTCRβ-S57C)에 부착되고 코딩된 제2 FHVH는 상보적인 TCRα 불변 사슬[hTCRα-T48C-opt]에 부착된다. 예를 들어, 서열 번호 21985를 갖는 예시적인 구축물에서, 코딩된 CD22-FHVH-24는 hTCRβ-S57C에 부착되고 BCMA-FHVH-93은 hTCRα-T48C-opt에 부착된다. 이들 모든 구축물은 JNG 세포에서 발현되고 그의 표적 항원 발현 세포주와 공동 배양될 때 JNG 분석에서 유의미한 활성을 나타내지 못했다(표 44). FHVH 도메인을 다른 AABD(예를 들어, vHH 또는 aVH)로 대체해도 활성이 개선되지 않았다. 여러 단일특이성 및 이중특이성 1.5 사슬 구축물을 또한 생성하였으며 서열 번호 21999-22000, 22002-22006(표 44)으로 표시한다. 이 시리즈의 대표적인 구축물은 CD8SP-V5-[hTCRβ-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-BCMA-FHVH-74-MYC-[hTCRα-CSDVP]-F-F2A-PAC(서열 번호 22002)이다. 이 구축물에서, 코딩된 BCMA-FHVH-74는 MYC 링커를 통해 [hTCRα-CSDVP] 사슬에 부착되는 한편, V5 링커는 코딩된 상보적 [hTCRβ-KACIAH] 사슬에 부착된다. 이들 구축물은 또한 JNG 세포에서 발현될 때 단지 약하고 일관되지 않은 활성을 나타내었다. 테스트된 또 다른 설계는 2개의 TCR 불변 사슬 중 하나에 2개의 AABD의 직렬 부착을 포함하였고 서열 번호 22009 및 22010으로 표시된다. 이 설계를 갖는 구축물도 단지 약하고 일관되지 않은 활성을 나타내었다(표 44). 다음으로, TCR 불변 사슬의 하나 또는 둘 모두가 절단된 구축물을 생성하였다. 또한, AABD와 TCR 불변 사슬 도메인 사이의 다양한 링커 도메인을 테스트하였다. 예시적인 링커는 Gly-Ser 링커(GS), E Coil, PG4SP 및 Ig 힌지 도메인을 포함하였다(표 17). 예시적인 구축물은 서열 번호 22025-22085로 표시된다. 이러한 구축물을 JNG 세포에서 발현하였고 JNG 분석에서 테스트하였다. 이 설계를 갖는 구축물은 또한 일반적으로 2세대 CAR 또는 TFP 백본 상의 상응하는 단일 사슬 구축물과 비교하여 단지 약하고/거나 일관되지 않은 활성을 보였다(표 44).

[표 44]

SIR, AABD - TCR 및 TCR 백본 상의 이중특이성 및 이중파라토프 SAR

상이한 항원 결합 도메인, 링커 및 TCR 불변 사슬을 포함하는 구축물의 또 다른 패널을 생성하고 JNG 분석으로 테스트하였다(표 45). 이 그룹에서 서열 번호 22096 및 22098로 표시되는 구축물이 최고의 활성을 보였다. 이들 구축물 둘 모두는 IgCL 링커(서열 번호 1142)를 통해 절단된 TCRg 사슬(TCRg-6MD; 서열 번호 1132)에 부착된 FHVH 및 IgG1-CH1 링커(서열 번호 1143)를 통해 절단된 TCRd 사슬(TCRd-6MD; 서열 번호 1139)에 부착된 제2 FHVH를 코딩하였다. 서열 번호 22099를 갖는 구축물이 또한 양호한 활성을 나타내었다. 이 구축물은 IgCL 링커(서열 번호 1142)를 통해 절단된 TCRa 사슬(TCRa-wt2-opt-6MD; 서열 번호 1112)에 부착된 코딩된 FHVH 및 IgG1-CH1 링커(서열 번호 1143)를 통해 절단된 TCRd 사슬(TCRb-wt2-opt-6MD; 서열 번호 1126)에 부착된 제2 FHVH를 포함한다.

vHH 또는 FHVH 또는 센티린 또는 아피바디 또는 기타 비-면역글로불린 항원 결합 도메인이 vL에 작동 가능하게 연결되고, 이어서 Ig 링커(예를 들어, IgCL1 및 IgG1-CH1)를 통해 TCRα, β, γ 또는 δ(즉, TCRg-6MD, TCRd-6MD, TCRa-wt2-opt-6MD 및 TCRb-wt2-opt-6MD)에 속하는 절단된 TCR 불변 사슬에 작동 가능하게 연결되는 구축물은 2개 이상의 그들의 항원 표적에 대해 활성을 유지하였다.

코딩된 IgG1-CH1 링커가 표 13에 열거된 다른 Ig 링커로 대체된 구축물도 활성적이다. 코딩된 FHVH 도메인이 다른 AABD(예를 들어, vHH, 센티린, Rzip, E4, CD16 V158 등)로 전환되는 구축물도 활성적이다. 코딩된 다중 AABD가 짧은 선택적 링커를 통해 직렬로 연결된 다음 Ig 링커를 통해 절단된 TCR 불변 사슬(예를 들어, 서열 번호 1126, 1132, 1139, 1112)에 프레임 내에서 결합되는 구축물도 JNG 세포에서 테스트되어 양호한 신호 활동을 나타낸다. AABD와 절단된 TCR 불변 사슬 사이에 긴 링커 도메인(즉, >25 개 아미노산 잔기를 코딩함)을 갖는 구축물은 짧은 링커를 갖는 구축물과 비교하여 더 강한 신호전달을 나타낸다. 50-150개의 아미노산 길이인 긴 링커를 코딩하는 구축물은 우수한 활성을 나타낸다. AABD가 Ig 링커 또는 긴 링커를 통해 절단된 TCR 사슬(예를 들어, TCRb-wt2-opt-6MD, TCRa-wt2-opt-6MD, TCRg-6MD, TCRd-6MD 등)에 부착된 구축물은 집합적으로 AABD-TCR로 지칭한다.

상기 결과는 vL 및 vH 단편이 Ig 링커 또는 긴 링커를 통해 절단된 TCR 불변 사슬에 각각 부착될 때 AABD의 부착이 vL 단편이 그의 상보적인 vH 단편과 결합하여 표적 항원을 인식하고 세포 신호전달을 유도할 수 있는 Fv를 형성하는 능력을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 상기 결과는 vL 또는 vH 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD(예를 들어, vHH 또는 SVH)가 SAR의 일부로 발현될 때 그의 표적 항원에 결합하고 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지한다는 것을 추가로 입증한다. 종합하면, 이러한 놀라운 결과는 SAR의 vL 또는 vH 단편의 코딩된 N-말단에 대한 AABD의 부착이 표적 항원에 결합하고 T 세포 신호전달을 유도할 수 있는 기능적 Fv의 조립을 방해하지 않는다는 것을 입증한다.

[표 45]

SIR 및 Ab - TCR 백본 상의 SAR 구축물의 생성

SIR 및 ab-TCR 백본 상에 SAR 구축물의 또 다른 패널을 생성한다(표 46). 2개의 사슬을 포함하는 SIR 백본 상의 이중 사슬 이중특이성 SAR의 예는 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC이며 서열 번호(DNA) 22104 및 서열 번호(PRT) 22919로 표시된다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 가지며, WO2018102795에 기술되어 있고 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. SAR 구축물의 한 사슬은 S57C 돌연변이를 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬(hTCRb-S57C)에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vL 단편을 코딩하고 SAR의 다른 사슬은 T48C 돌연변이를 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬(hTCRa-T48C)에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vH 단편을 코딩한다. SAR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 함께 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-vHH2-HCD25)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서 SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD20-USC1-vHH-2HCD26을 통해 CD20을 표적화한다. 이 구축물은 JNG 세포에서 발현되고 JNG 분석을 사용하여 테스트될 때 RAJI(CD19+/CD20+), RAJI-CD19-KO(CD19+/CD20-), DAUDI(CD19+/CD20+) 및 RS;411(CD19+/CD20-) 세포주에 대해 강력한 활성을 나타냈다. 코딩된 하나의 AABD가 이중 사슬 SIR의 hu-mROO5-1 vL 또는 hu-mROO5-1 vH 단편에 부착되고 서열 번호 22104-22119로 표시되는 추가 이중특이성 SAR 구축물의 대형 패널을 생성하였다(표 46). 이들 구축물은 AABD 유형(예를 들어, FHVH, vHH, 센티린 등), TCR 불변 사슬 유형(예를 들어, hTCRb-S57C, hTCRb-KACIAH, hTCRa-CSDVP, hTCRa-T48C-opt, hTCRg-d5, hTCRd-d2 등), 및 AABD 및 Fv가 표적화하는 표적 항원의 성질(표 46)이 다르다. 서열 번호 22109를 갖는 예시적인 구축물은 AABD로 BCMA 표적화 센티린을 코딩하는 반면, 서열 번호 22118을 갖는 예시적인 구축물은 AABD로 CD20 vHH 도메인을 코딩한다. 이들 구축물은 이들의 표적 항원(들) 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 세포주 패널에 대해 강력한 활성을 나타내었지만, 이들의 표적 항원 둘 모두의 발현이 결여된 세포주에 대해서는 비특이적 활성이 없음 나타내었다(표 46).

상기 결과는 vL 및 vH 단편이 TCR 불변 사슬에 각각 부착될 때 AABD의 부착이 vL 단편이 그의 상보적인 vH 단편과 결합하여 표적 항원을 인식하고 세포 신호전달을 유도할 수 있는 Fv를 형성하는 능력을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 상기 결과는 vL 또는 vH 단편의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 작동 가능하게 연결된 AABD(예를 들어, vHH 또는 SVH)가 SIR의 백본을 갖는 SAR의 일부로 발현될 때 표적 항원에 결합하고 T 세포를 유도하는 능력을 유지한다는 것을 추가로 입증한다. 종합하면, 이러한 놀라운 결과는 SAR의 vL 또는 vH 단편의 코딩된 N-말단에 대한 AABD의 부착이 표적 항원에 결합하고 T 세포 신호전달을 유도할 수 있는 기능적 Fv의 조립을 방해하지 않는다는 것을 입증한다.

다음에 hu-mROO5-1 SIR 백본 상의 삼중특이성 SAR 구축물의 패널을 생성하고 서열 번호 22123-22139로 표시한다. 이들 구축물은 코딩된 AABD의 유형(예를 들어, FHVH, vHH, 센티린 등), TCR 불변 사슬 유형(예를 들어, hTCRb-S57C, hTCRb-KACIAH, hTCRa-CSDVP, hTCRa-T48C-opt, hTCRg-d5, hTCRd-d2 등), 및 AABD 및 Fv에 의해 표적화되는 표적 항원의 성질(표 46)이 다르다.

2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중 사슬 삼중특이성 SAR은 VHH-2HCD26-USC1-G4S-hu-mROO5-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC이며 DNA 서열 번호 22136 및 PRT 서열 번호 22951로 표시된다. 이러한 설계를 갖는 또 다른 예시적인 이중 사슬 삼중특이성 SAR은 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-hu-mROO5-vL-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC(서열 번호 22123)이다. 이 SAR 구축물은 SIR의 백본을 갖는다. SIR의 코딩된 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 이량체화되어 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. BCMA를 표적화하는 FHVH 단편은 글리신-세린(G4S) 링커를 통해 hu-mROO5-1 vL 단편의 N-말단에 융합된다. CD20(CD20-vHH2-HCD25)을 표적화하는 vHH 단편은 글리신-세린(GS) 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서, SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고, BCMA FHVH-93을 통해 BCMA를 표적화하고, CD20-vHH2-HCD25를 통해 CD20을 표적화한다. 이들 구축물은 이들의 표적 항원(들) 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 세포주 패널에 대해 강력한 활성을 나타내었지만, 이들의 표적 항원 둘 모두의 발현이 결여된 세포주에 대해서는 비특이적 활성이 없음을 나타내었다(표 46).

이중 사슬 Ab-TCR의 백본 상에 이중 사슬 이중특이성 및 삼중특이성 구축물의 패널도 구축하였으며, 각각 서열 번호 22120-22122 및 22140-22141로 표시한다. Ab-TCR의 백본을 갖는 대표적인 SAR은 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD-F-F2A-PAC(서열 번호 22120)이다. 이 SAR 구축물의 한 사슬은 IgCL 링커를 통해 절단된 TCRb(TCRb-wt2-opt-6MD)의 불변 사슬에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vL 단편을 코딩하고 SAR의 다른 사슬은 IgG1-CH1 링커를 통해 절단된 인간 TCRa 사슬(TCRa-wt2-opt-6MD)의 불변 사슬에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vH 단편을 코딩한다. SAR의 코딩된 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 함께 CD19를 표적화하는 Fv를 형성한다. CD20을 표적화하는 vHH 단편(CD20-vHH2-HCD25)은 글리신-세린 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N-말단에 융합된다. 따라서 SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적화하고 CD20-USC1-vHH-2HCD26을 통해 CD20을 표적화한다. 이들 구축물은 이들의 표적 항원(들) 중 하나, 둘 또는 셋을 발현하는 세포주 패널에 대해 강력한 활성을 나타내었지만, 이들의 표적 항원 중 어느 하나의 발현이 결여된 세포주에 대한 비특이적 활성이 없음을 나타내었다(표 46).

세포주 패널에서 상이한 항원의 발현은 표 C-1 및 C-2를 참조하여 결정할 수 있다.

CD22 표적화 인간화 항체 huRFB4, MPL 표적화 인간화 항체 hu-161-2, BCMA 표적화 인간화 및 최적화 항체 BCMA-hu72, 및 CD20 표적화 항체 CD20-2F2로부터 유래된 vL 및 vH 단편을 포함하는 이중 사슬 SIR 또는 이중 사슬 Ab-TCR의 백본 상에 이중특이성 및 삼중특이성 SAR 구축물의 또 다른 패널을 생성하였다. 이들 구축물은 서열 번호 22144-22147, 22148-22150, 22151-22155, 22156-22159로 표시된다. 이들 구축물은 이들의 표적 항원 중 하나, 둘 또는 셋 모두를 발현하는 세포주 패널에 대해 강력한 활성을 나타내었지만, 이들의 표적 항원 중 어느 하나의 발현이 결여된 세포주에 대해서는 비특이적 활성이 없음을 나타내었다(표 46).

혈액암(예를 들어, CD123) 및 고형 종양(예를 들어, IL13Ra2, Muc16 등)에서 발현되는 추가 항원을 표적화하는 CD19 표적화 hu-mROO5-1 기반 이중 사슬 SIR의 백본 상에 이중특이성 및 삼중특이성 SAR 구축물의 또 다른 패널을 생성하였다. 이들 구축물은 서열 번호 22164-22172로 표시되며, 이들의 표적 항원을 발현하는 세포주 패널에 대해 강력한 활성을 보인 반면, 이들의 표적 항원 중 어느 하나의 발현이 결여된 세포주에 대해서는 비특이적 활성의 결여를 나타내었다(표 46).

CD19 및 PD1(서열 번호 22162)을 표적화하는 또 다른 이중특이성 SAR 구축물을 생성하였으며 이들은 Raji, Nalm6 및 RS;411 세포주에 대해 강력한 활성을 나타내었다(표 46).

CD19 및 인간 혈청 알부민(서열 번호 22163)을 표적화하는 또 다른 이중특이성 SAR 구축물을 생성하였다. 이 구축물에서 인간 혈청 알부민(HAS) 표적화 vHH는 MMP14X3 프로테아제 절단성 링커를 통해 hu-mROO5-1의 vL 단편에 부착된다. 이 구축물은 인간 혈청 알부민의 첨가 시 활성에서 용량 의존적 감소를 나타내었다(표 4표 46).

인간 Fc 수용체인 CD16A의 고친화도 변이체의 Fc 결합 도메인을 포함하는 SAR 구축물(서열 번호 22170-22173)의 또 다른 패널을 생성하였다. 구축물을 JNG 세포에서 발현하고 표적 항원 발현 세포주와의 공동 배양 시 GFP 유도에 대해 테스트하였다. 또한, 허셉틴(Her2 항체) 및/또는 리툭시맙(CD20 항체)의 존재 및 부재 하에 실험을 반복하였다. 서열 번호 22170을 갖는 구축물은 RAJI 세포와의 공동 배양 시 강력한 GFP 유도를 나타내었고 RAJI-CD19-KO 세포와의 공동 배양 시 비특이적 GFP 유도의 결여를 나타내었다. 또한, 이 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포는 허셉틴(1㎍/ml)의 존재하에 SKOV-3(Her2+/CD19-) 세포와 공동 배양될 때 강력한 GFP 유도를 나타내었다(표 46). 서열 번호 22173-22176을 갖는 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포에서 본질적으로 유사한 결과를 얻었다. 서열 번호 22172를 갖는 SAR 구축물을 발현하는 CD19 및 CD16 V158을 발현하는 JNG 세포는 CD19-발현 Raji 세포와는 강력한 GFP 유도를 나타내었지만 RAJI-CD19-KO(CD19-ve) 세포와는 GFP 유도의 결여를 나타내었다. 그러나 이는 CD20 항원을 표적화하는 리툭시맙의 존재하에 RAJI-CD19-KO 세포와 공동 배양될 때 강력한 GFP 유도를 나타내었다(표 46). 종합하면 상기 결과는 이중특이성, 삼중특이성 및 보편적 기능을 갖는 SAR 구조의 능력을 보여준다. UNICON 구축물(예를 들어, 서열 번호 22170-22176)은 추가된 항체의 존재하에서만 일부 항원을 구성적으로, 다른 항원을 조건부로 표적화할 수 있으므로, 유연성 및 향상된 안전성 및 효율성과 함께 편리성과 비용 감소를 결합하는 입양 세포 요법을 위한 매우 유연하고 적용 가능한 플랫폼을 제공한다.

CD19 및 CD20을 표적화하고 NKG2D의 리간드 결합 도메인을 공동발현하는 예시적인 삼중특이성 SAR 구축물은 서열 번호 22177로 표시되며 CD19 발현 Raji 및 Nalm6 세포 및 NKG2D 리간드 발현 SKOV-3 세포에 대해 강력한 활성을 나타내었다(표 6).

하나 이상의 조혈 항원(예를 들어, CD19, CD20 등)과 함께 PSMA를 표적화하는 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 구축물은 서열 번호 22178-22190으로 표시되며 Raji(CD19+/CD20+/PSMA-) 및 LNCaP(CD19-/CD20-/PSMA+) 세포에 대해 강력한 GFP 유도 활성을 나타내었다.

CD19 표적화 SIR의 백본에 부착된 Cltx(클로로톡신)를 포함하는 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 SAR 구축물은 서열 번호 22191-22193으로 표시된다. Cltx는 특정 암세포에서 발현되는 작은 전도도 클로라이드 채널을 표적화한다. 이러한 구축물은 Raji, Nalm6, RS;411 및 기타 세포주와의 공동 배양 시 강력한 GFP 유도를 나타내었고 Raji-CD19-KO 또는 L363 세포에 대한 비특이적 활성 없음을 나타내었다.

CD19 및 Her2를 표적화하는 예시적인 이중특이성 SAR 구축물은 서열 번호 22195-22197로 표시되며 Raji(CD19+) 및 SKOV-3(Her2+) 세포주에 대해 강력한 GFP 유도 활성을 나타내었다(표 46). 서열 번호 22195 및 22197을 갖는 구축물은 AABD로 Her2 표적화 DARPIN을 코딩하는 반면, 서열 번호 22196을 갖는 구축물은 Her2 표적화 vHH 도메인을 코딩한다.

CD19 및 Her3을 표적화하는 예시적인 이중특이성 SAR 구축물은 서열 번호 22198로 표시되며 Raji(CD19+), MCF-7(Her3+) 및 SKOV-3(Her3+) 세포주에 대해 강력한 GFP 유도 활성을 나타내었다(표 46).

γδ TCR의 백본 상의 예시적인 이중특이성 및 삼중특이성 구축물은 서열 번호 22201 및 22202로 표시된다. 구축물 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-TCR-Vg9-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-TCR-Vd2-F-F2A-PAC(서열 번호 22201)에서, 코딩된 BCMA-FHVH는 G4S 링커를 통해 Vg9 가변 도메인의 N-말단에 프레임 내에서 융합되고, 코딩된 CD20-vHH2-HCD25 단편은 G4S 링커를 통해 Vd2 가변 도메인의 N-말단에 부착된다. 이 구축물은 Raji, Raji-CD19-KO(CD19-/BCAM+) 및 L363(BCMA+) 세포에 노출 시 GFP의 강력한 유도를 보여줌으로써 TCR의 백본 상에서 삼중특이성 SAR을 생성하는 능력을 입증하였다. CD20을 항원 중 하나로 표적화하는 서열 번호 22202로 표시되는 이중특이성 SAR에서도 유사한 결과를 얻었다.

하이브리드 사슬을 갖는 여러 SAR 구축물도 활성을 보였고 서열 번호 22203-22207로 표시된다. 서열 번호 22203을 갖는 구축물 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-hu-mROO5-vL-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-Her2-huMab4D5-D98W-vH-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC는 SIR의 백본을 갖고 CD19 표적화 hu-mROO5-1로부터의 vL 단편 및 Her2 특이적 Her2-huMab4D5-D98W로부터의 vH 단편을 코딩한다. 이 구축물을 발현하는 JNG 세포는 BCMA-FHVH-93 및 CD20-vHH2-HCD25 도메인을 통한 GFP 유도를 통해 Raji 및 L363 세포에 반응할 수 있었지만 Her2-발현 SKOV-3 세포에는 반응하지 못하였다. 이 결과는 상보적인 hu-mROO5-1 vH 및 Her2-huMab4D5-D98W-vL 사슬이 이 구축물에서 누락되어 있기 때문에 CD19 및/또는 Her2를 표적화하는 기능적 Fv 단편이 형성되고 있지 않는다는 것을 입증한다. 그럼에도, 발현된 hu-mROO5-vL 및 Her2-huMab4D5-D98W vH 단편은 BCMA-FHVH-93 및 CD20-vHH2-HCD25 도메인의 부착을 위한 스캐폴드로서 역할을 한다. 따라서, 상이한 항체로부터 유래된 vL 및 vH 단편을 갖는 이중 사슬 SIR의 백본 상의 기능적 이중특이성 및/또는 삼중특이성 SAR을 생성할 수 있다.

유사하게, SAR 구축물 MC7G5-TCRb-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC(서열 번호 22205)는 MC.7.G5 TCR로부터의 Vb 단편 및 hu-mROO5-1 항체로부터의 vH 단편을 포함하지만 JNG 세포에서 발현될 때 CD20-vHH2-HCD25 도메인에 의해 결합된 Raji 세포에 노출 시 강력한 GFP 유도 활성을 나타낼 수 있었다(표 46). 따라서, TCR로부터 유래된 하나의 가변 단편(예를 들어, Va, Vb, Vg 또는 Vd)과 항체로부터 유래된 제2 가변 단편(예를 들어, vL 또는 vH)를 갖는 이중 사슬 SIR의 백본 상의 기능적 이중특이성 및/또는 삼중특이성 SAR을 생성할 수 있다.

유사하게, SAR 구축물 CD8SP-BCMA-FHVH-93-G4S-hu-mROO5-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgHSP-CD20-VHH-USC1-2HCD26-G4S-AFP-Va-14-3-AI-[hTCRa-T48C]-F-F2A-PAC(서열 번호 22206)는 CD19-표적화 항체로부터의 hu-mROO5-vL 단편 및 TCR로부터의 AFP 표적화 가변 단편(Va)을 코딩한다. 이 구축물은 CD20-vHH2-HCD25 도메인에 의해 결합된 Raji 세포에 대한 노출 시 강력한 GFP 유도 활성을 나타내었다(표 46). 이 결과는 이중 사슬 SIR의 백본 상의 기능적 이중특이성 및/또는 삼중특이성 SAR이 TCR로부터 유래된 하나의 가변 단편 및 항체로부터 유래된 제2 가변 단편으로 구축될 수 있음을 추가로 입증한다.

구축물 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-IgCL-TCRg-6MD-F-P2A-SP-CD19-hu-mROO5-1-vH-hTCR-델타-F-F2A-PAC(서열 번호 22207)는 IgCL 링커를 통해 절단된 TCRg-6MD 단편에 부착된 hu-mROO5-1 및 개재 링커 없이 전장 hTCR-델타 불변 사슬에 부착된 hu-mROO5-1-vH 단편을 코딩한다. 이 SAR 구축물은 Raji 세포에 반응하여 강력한 GFP 유도를 보여줌으로써(표 46), 기능적 SAR의 생성을 위해 TCR Ig 도메인이 한 항체로부터 유래된 Ig 도메인(즉, IgCL, IgG1-CH1 등)을 대체할 수 있음을 입증하였다. 이 SAR 구축물은 SIR과 Ab-TCR 사이의 하이브리드를 나타낸다.

[표 46]

에피토프를 포함하는 SAR 구축물

짧은 가요성 Gly-Ser 링커 또는 프로테아제 절단성 링커(표 19)를 통해 코딩된 항원 결합 도메인(예를 들어, vL, vH, AABD 등)의 N-말단 도메인에 결합된 하나 이상의 에피토프 태그를 포함하는 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR 구축물의 패널을 생성하였다. 이들 예시적인 구축물의 서열 번호는 표 47에 제공한다. 구축물은 JNG 세포에서 발현하였고 그들의 표적 항원 발현 세포에 노출 시 유의한 활성을 나타냄으로써, 에피토프 태그의 부착이 항원 결합 도메인의 항원 결합 능력을 방해하지 않음을 입증하였다. 더 중요하게는 많은 구축물이 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 리툭시맙에 대한 결합을 나타내었고 보체의 부재 및 존재하에 리툭시맙과 함께 배양될 때 생존율이 감소하였다. 유사하게, 서열 번호 22247 및 22248을 갖는 구축물은 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 허셉틴에 대한 결합을 나타내었다. 서열 번호 22247 및 22248을 갖는 구축물을 발현하는 JNG 세포는 허셉틴(트라스투주맙), T-DM1(카드실라. 트라스투주맙 엠탄신) 및 엔허투에 노출되었을 때 세포독성을 나타내었다. Ritx2 에피토프 태깅된 SAR(서열 번호 22209)을 발현하는 면역 세포는 리툭시맙을 사용한 MACS 및/또는 유세포 분석을 사용하여 정제한다. 허셉틴 미모태그 태깅된 SAR(서열 번호 22247 및 22248)을 발현하는 면역 세포는 허셉틴을 사용한 MACS 및/또는 유세포 분석을 사용하여 정제한다. 또한, SAR(서열 번호 22247 및 22248)을 발현하는 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 이러한 SAR 발현 세포로 재구성된 대상체에게 허셉틴, T-DM1 또는 엔허투를 투여하면 고갈된다. 이들 항체의 투여량 및 투여 빈도는 당 업계에 공지되어 있다.

[표 47]

어댑터 결합 도메인을 가진 SAR

상이한 어댑터 결합 도메인을 포함하는 SIR 및 Ab-TCR 구축물의 백본 상의 이중 사슬 SAR 패널을 생성하였다. 서열 번호 22286을 갖는 예시적인 SAR 구축물은 Ab-TCR의 백본을 갖는 SAR의 코딩된 IgCL 단편의 N-말단에 부착된 조작된 NKG2D-YA 도메인을 포함하였다(표 48). 서열 번호 22287을 갖는 구축물은 G4S 링커를 통해 Ab-TCR의 코딩된 hu-mROO5-1 vH 단편에 부착된 NKG2D - YA - G4Sx3 - NKG2D-YA 도메인을 코딩한다. 구축물은 JNG 세포에서 발현되었고 CD19+ 및 BCMA+ Raji 세포에 노출 시 GFP의 강력한 유도를 보여주었다. 더 중요하게는, JNG 세포는 G4S 링커를 통해 NKG2D-YA에 특이적으로 결합하는 비천연 ULBP2-S3 리간드에 융합된 PSMA 표적화 chVH를 포함하는 SAR-어댑터 PSMA-USC76-chVH-G4S-ULBP2-S3(서열 번호 23114)의 존재 하에서만 LNCaP 세포에 노출되었을 때 GFP 유도를 나타내었다(표 48). 서열 번호 22288(표 48)을 갖는 구축물에서 본질적으로 유사한 결과를 얻었다(표 48). 그러나 Ig 링커 없이 TCRb 불변 사슬에 직접 융합된 NKG2D-YA를 코딩하는 서열 번호 22289를 갖는 구축물은 PSMA-USC76-chVH-G4S-ULBP2-S3에 반응하여 GFP 유도를 나타내지 못하였다.

서열 번호 22292로 표시되는 SAR 구축물은 hu-mROO5-1 기반 SIR의 코딩된 vL 단편의 N-말단에 부착된 p26 도메인에 결합할 수 있는 D 도메인(Afo3)을 코딩한다. 이 구축물을 발현하는 JNG 세포는 L428 세포(CD123+)에 노출되었을 때 그러나 CD123 표적화 D 도메인에 융합된 p26 도메인을 포함하는 SAR 어댑터 bc40-p26-CD123-cg06(서열 번호 23120)의 존재하에서만 강력한 GFP 유도를 나타내었다(표 48).

서열 번호 22293으로 표시되는 이중특이성 CD19xCD20 SAR 구축물은 또한 hu-mROO5-1-기반 CD19 표적화 SIR의 코딩된 vL 단편의 N-말단에 부착된 류신 지퍼 도메인 EZIP에 결합하는 RZIP 류신 지퍼 도메인을 코딩한다. 구축물은 또한 hu-mROO5-1 vH 도메인에 부착된 CD20-VHH-USC1-2HCD26 도메인을 코딩한다. 이 구축물을 발현하는 JNG 세포는 L363 세포(BCMA+)에 노출되었을 때 그러나 류신 지퍼 EZIP 도메인에 융합된 BCMA-FHVH-74 도메인을 포함하는 SAR 어댑터 BCMA-FHVH-74-EZIP(서열 번호 23119)의 존재하에서만 강력한 GFP 유도를 나타내었다(표 48). 또한, JNG 세포는 SAR 어댑터 CD8SP-PSMA-USC76-chVH-EZIP(서열 번호 23118)의 존재하에 LNCaP(PSMA+) 세포로 재지시될 수 있다(표 48). RZIP 도메인이 짧은 GS 링커가 있고 Ig 링커 또는 긴 링커가 없는 절단된 TCR 사슬[hTCRb-wt-opt2-6MD]에 직접 부착된 서열 번호 22294를 갖는 구축물로 더 약한 결과를 얻었다. 이러한 결과는 AABD가 SAR에서 TCR 불변 사슬에 작동 가능하게 연결된 경우 Ig 링커, 가변 도메인(예를 들어, vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd) 또는 긴 링커(>25 개 아미노산)에 대한 요건을 다시 입증한다.

선행 실험을 위한 SAR 어댑터는 293FT 세포에서 각각의 발현 구축물의 일시적 형질감염에 의해 생성하였고 분비된 어댑터 단백질을 함유하는 상청액을 형질감염 후 48-72시간에 수집하고 사용할 때까지 동결하였다.

이중 사슬 SAR의 2개의 별개 사슬에 부착되거나 선택적 짧은 링커(예를 들어, G4S 링커)를 통해 사슬 중 하나에 직렬로 부착되는 2개 이상의 어댑터를 포함하는 추가 SAR 구축물을 생성한다. 이들 구축물은 또한 적절한 SAR 어댑터의 존재하에 이들의 각각의 표적 항원 발현 세포에 결합하고 이에 반응함을 보여준다.

2세대 CAR, TFPε, TFPγ 또는 TFPδ의 코딩된 scFv의 N-말단에 하나 이상의 어댑터를 융합하여 추가 구축물을 생성한다. 이들 구축물은 또한 이들의 SAR 어댑터의 존재하에 이들 각각의 표적 항원 발현 세포에 결합하고 이에 반응함을 보여준다. 이러한 결과는 CAR, SIR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP 또는 TCR을 포함하는 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, scFv, 또는 AABD 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 어댑터를 융합함으로써 하나 이상의 어댑터(예를 들어, 류신 지퍼 도메인, D 도메인 등)를 코딩하는 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 생성할 수 있음을 입증한다.

[표 48]

자가항원을 포함하는 SAR

자가항원 Dsg3을 포함하는 예시적인 SAR은 CD8SP-Dsg3-EC1-EC2-L693-IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD-F-P2A-IgHSP-CD20-vHH2-HCD25-G4S-CD19-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD-F-F2A-PAC(서열 번호 22307)이다. 이 SAR 구축물을 발현하는 이 JNG는 모 Raji 세포에서 관찰된 GFP 유도와 비교하여 Dsg3을 표적화하는 막 고정 scFv를 발현하는 Raji 세포에 노출되었을 때 증가된 GFP 유도를 나타내었다. Dsg3의 상이한 도메인을 포함하는 추가의 예시적인 SAR은 서열 번호 22308-22312로 표시된다. 이러한 SAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 심상성 천포창 환자에서 Dsg3 자가항체 생성 B 세포 및 형질 세포를 고갈시킨다. 유사하게, 상기 구축물의 설계를 사용하여 Dsg1을 표적화하는 SAR을 발현하는 T 세포를 생성할 수 있고, 낙엽상 천포창(PF) 대상체에서 사용하여 Dsg1 자가항체 생성 B 및 형질 세포를 고갈시킬 수 있다.

리간드를 포함하는 SAR

CD19 표적화 SIR의 백본 상에 있으며 리간드 4-1BB(서열 번호 22252) 및 APRIL(서열 번호 22253-22254)의 수용체 결합 도메인을 포함하는 예시적인 이중특이성 SAR 을 생성하고 JNG 세포에서 발현하였다. 세포는 GFP 유도에 의해 측정된 바와 같이 공동 배양 시 Raji 세포(CD19+)에 반응하는 능력을 보유하였다.

TCR의 단일 가변 도메인( svd - TCR )을 포함하는 SAR

CD19 표적화 SIR 상에 있고 인간 NY-ESO-1 157 펩티드(서열 번호 21461) 및 MAGE-A2 펩티드(서열 번호 21464)와의 복합체를 이루어 HLA-A*02:01을 표적화하는 svd-TCR를 포함하는 예시적인 이중특이성 SAR을 생성하고 상응하는 렌티바이러스에 의한 일시적 감염에 의해 추가 약물 선별 없이 JNG 세포에서 발현하였다. 이들 구축물의 서열 번호는 각각 서열 번호 22256-22257 및 22258-22262로 표시된다. 세포는 GFP 유도에 의해 측정된 바와 같이 공동 배양 시 Raji 세포(CD19+/CD20+) 및 HepG2 세포(HLA-A*02:01/MAGE-A3+ 및 HLA-A*02:01/NY-ESO-1+)에 반응하는 능력을 보였다(표 49). 세포를 또한 NY-ESO-1 펩티드/HLA-A02:01 사량체 및 MAGE-A02:01 펩티드/HLA-A02:01 사량체에 대한 결합에 대해 유세포 분석에 의해 테스트한다.

이중 사슬 SAR의 2개의 별개 사슬에 부착되거나 선택적 짧은 링커(예를 들어, G4S 링커)를 통해 사슬 중 하나에 직렬로 부착되는 2개 이상의 svd-TCR을 포함하는 추가 SAR 구축물을 생성한다. 이들 구축물은 또한 이들의 각각의 표적 항원 발현 세포에 결합하고 이에 반응함을 나타낸다.

하나 이상의 svd-TCR을 2세대 CAR, TFPε, TFPγ 또는 TFPδ의 코딩된 scFv의 N-말단에 융합함으로써 추가 구축물을 생성한다. 이들 구축물은 또한 이들의 각각의 표적 항원 발현 세포에 결합하고 이에 반응함을 보여준다. 이러한 결과는 svd-TCR을 CAR, SIR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFP 또는 TCR을 포함하는 vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, scFv, AABD 도메인의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 융합함으로써 하나 이상의 svd-TCR을 코딩하는 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 생성할 수 있음을 입증한다.

[표 49]

TCRα 또는 TCRβ 발현이 손상된 T 세포에서 SIR, cTCR , AABD - TCR , Ab - TCR 및 TFPαβ의 백본 상의 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 발현.

CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃에 의해 TCRα, TCRβ 또는 둘 다의 발현이 제거된 JNG 세포에서 SIR, AABD-TCR 및 Ab-TCR 백본 상의 SAR 구축물을 또한 발현한다. TFP 백본 상의 SAR의 결과와 대조적으로, 상기 백본 상의 SAR 구축물은 TCRα-/-, TCRβ-/- 및 TCRα-/-β-/- 세포의 표면에서 야생형 JNG 세포에서 관찰된 것과 유사하거나 더 높은 수준으로 효과적으로 발현되며 그의 표적 항원 발현 세포에 노출되었을 때 강력한 신호 전달 능력을 갖는다. SIR, cTCR, AABD-TCR, Ab-TCR 및 TFPαβ 백본 상의 SAR 구축물을 TRAC 또는 TRBC 게놈 유전자좌에 삽입하여 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자의 프로모터 및 조절 요소하에 발현할 때 본질적으로 유사한 결과를 얻는다. TRAC 및 TRBC 유전자의 동시 파괴를 초래하는 이들 유전자좌에 SAR 구축물의 삽입은 각각 문헌[Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol 4, 2017 및 Eyquem J et al Nature, 543(7643):113-117, 2017]에 설명된 바와 같이 유전자 표적화를 사용하여 달성한다. SAR을 TRAC 유전자좌로 지시하기 위한 예시적인 표적화 구축물은 서열 번호 23으로 표시된다. 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 이 구축물에서 SAR을 코딩하는 모듈을 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFPαβ, TFPγδ 및 TCR 백본 상의 상이한 SAR를 코딩하는 모듈로 대체함으로써 추가적인 표적화 구축물을 생성할 수 있다.

이중특이성 및 다중특이성 SAR의 시험관 내 및 생체 내 분석

이중특이성 및 다중특이성 SAR 구축물(서열 번호 22098, 22104-22108, 22165)의 패널을 T 세포에서 발현하고 RAJI, RAJI-CD19-KO, NALM6 및 HL60 세포에 대한 시험관 내 세포독성에 대해 테스트한다. 서열 번호 22101-22103을 갖는 단일특이성 SAR 구축물을 대조군으로 사용한다. 이중특이성 및 다중특이성 구축물은 CD19+ RAJI 및 RAJI-CD19-KO 세포뿐 아니라 NALM6 세포 모두에 대해 강력한 세포독성을 갖는 것으로 나타난 반면, 단일특이성 구축물은 RAJI-CD19-KO 세포에 대해 비활성이다. SAR-T 세포를 NSG 마우스에 이종이식된 RAJI 및 RAJI-CD19-KO 세포의 생체 내 모델에서 테스트한다. 이중특이성 및 다중특이성 SAR-T 세포는 두 세포주 모두에 대해 강력한 항종양 활성을 나타내는 반면 단일특이성 구축물은 RAJI-CD19-KO 세포에 대해 비활성이다.

기타 SAR 구축물

vHH 또는 FHVH 또는 센티린 또는 아피바디 또는 기타 비-면역글로불린 항원 결합 도메인이 이중 사슬 SIR의 vL 또는 vH 단편의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 이중특이성 구축물은 2개 이상의 항원에 대한 활성을 보유한다. 따라서, 다음 이중특이성 구축물은 CD19를 발현하는 RAJI WT 세포 및 CD19 발현이 결여된 RAJI CD19 KO A7 세포 둘 다에 대한 JNG-GFP 유도 분석에서 양성이었다. 이들 클론은 또한 DAUDI 및 RS;411 세포에 대해 고도로 양성이었다. 대조적으로, 상응하는 단일특이성 구축물은 RAJI CD19 KO A7 세포에 대해 음성이었고, 이는 이들이 RAJI 야생형 및 RAJI CD19 KO A7 세포에서도 발현되는 CD20 항원에 반응하여 인식하고 신호를 전달할 수 없음을 시사한다. 이러한 이중특이성 구축물은 하기 서열 및 서열 번호로 표시된다. (서열 번호 4090 및 서열 번호 15711), (서열 번호 4088 및 서열 번호 15709) 및 (서열 번호 4089 및 서열 번호 15710)로 표시되는 구축물에서, CD20-vHH-2HCD25 결합 도메인은 hu-mROO5-1-vH의 N-말단에 작동 가능하게 연결되고 이는 차례로 [hTCRa-T48C], [hTCRb-KACIAH] 또는 [hTCRa-CSDVP] TCR 불변 사슬에 각각 작동 가능하게 연결된다. 이들 구축물에서 hu-mROO5-1-vL 사슬은 [hTCRb-S57C], [hTCRa-CSDVP] 또는 [hTCRb-KACIAH] 사슬에 각각 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 이러한 구축물에서 hu-mROO5-1-vL과 hu-mROO5-1-vH는 결합하여 CD19를 표적화하는 Fv를 형성하는 한편, CD20-vHH-2HCD25로 표시되는 AABD는 CD20를 표적화한다. 상기 결과는 hu-mROO5-1-vH의 N-말단에 CD20-vHH-2HCD25의 부착이 hu-mROO5-1-vH가 hu-mROO5-1-vL 사슬과 결합하여 Fv 단편을 형성하는 능력을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 상기 결과는 CD20-vHH-2HCD25가 hu-mROO5-1-vH의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 생성된 Fv 단편이 여전히 CD19를 인식하고 이에 결합하고 CD19 발현 세포에 결합 시 T 세포 신호를 유도하는 능력을 유지한다는 것을 입증한다

상기 구축물과 대조적으로, CD8SP-CD20-vHH-C07-G4S-CD19-huCD19USC3-vL-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-huCD19USC3-vH-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC(서열 번호 1330 및 서열 번호 12020)로 표시되는 이중특이성 SAR은 결합하여 CD19를 표적화하는 Fv를 형성하는 CD19-huCD19USC3-vL 및 CD19-huCD19USC3-vH 단편을 포함하는 SIR의 백본을 갖는다. 이 SAR에서, CD20을 표적화하고 CD20-vHH-C07로 표시되는 AABD는 CD19-huCD19USC3-vL 사슬의 N-말단에 작동 가능하게 연결된다. 이 SAR 구축물은 RAJI(CD19+/CD20+), RAJI CD19 KO A7(CD19-/CD20+), DAUDI(CD20+) 및 RS411(CD19+) 세포와 공동 배양할 때 T 세포 신호전달 및 GFP 발현을 유도할 수 있다. 대조적으로, 단일특이성 구축물 CD8SP-huCD19-USC3-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-huCD19-USC3-vH-[hTCRa-T48C]-F-F2A-PAC(서열 번호 1244 및 서열 번호 11934)는 RAJI CD19 KO A7(CD19-/CD20+) 세포와 공동 배양할 때 GFP 발현을 유도할 수 없다. 상기 결과는 Gly-Ser 링커를 통한 CD19-huCD19USC3-vL의 N-말단에 AABD(즉, CD20-vHH-C07)의 부착이 vL 단편이 그의 상보적인 vH 단편(즉, huCD19-USC3-vH)과 결합하여 표적 항원(즉, CD19)을 인식하고 세포 신호전달을 유도할 수 있는 Fv를 형성하는 능력을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 상기 결과는 vL 단편의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 AABD(예를 들어, vHH 또는 SVH)가 SAR의 일부로 발현될 때 그의 표적 항원에 결합하고 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 유지한다는 것을 추가로 입증한다.

서열 번호 6821 및 서열 번호 17511로 표시되는 구축물 CD8SP-CD22-FHVH-24-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-BCMA-FHVH-93-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]-F-F2A-PAC를 발현하는 JNG 세포가 RAJI (CD19+) 및d L363(BCMA+)과 공동 배양될 때 GFP 발현을 강하게 유도하였음이 관찰되었으며 이는 이들이 CD22 및 BCMA 모두를 인식하고 이들에 대해 반응할 수 있음을 시사한다. 본질적으로, 각각 서열 번호 6812 및 서열 번호 17502로 표시되는 구축물 D8SP-CD22-FHVH-24-[IgCL-TCRb-wt-opt2-6MD]-F-P2A-SP-BCMA-FHVH-93-[IgG1-CH1-TCRa-wt-opt2-6MD]-F-F2A-PAC를 발현하는 JNG 세포로 실험을 반복하였을 때 동일한 결과를 얻었다.

SAR이 설계상 모듈식이기 때문에, 본 개시 내용에서 기재된 상이한 SAR의 서열은 그들의 다양한 성분 모듈의 순서를 기재하는 명칭으로부터 결정할 수 있다.

SAR -T 세포 생성을 위한 SMAC 모방체의 사용.

T 세포를 CD19를 표적화하는 SIR의 백본을 갖는 SAR(서열 번호 7348)로 감염시킨 다음 T 세포 배양 배지(10ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간 IL-2로 대체된 XVIVO 배지)에서 SMAC 모방체 비리나판트(100nM 또는 1μM)의 두 가지 상이한 농도의 부재 및 존재하에 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 16일 동안 증식하였다. 감염되지 않은 T 세포(T-UI) 및 SIR-T 세포는 384웰 플레이트에서 E:T 비율 0.25:1 및 0.5:1에서 4시간 동안 MATADOR 분석을 사용하여 Gluc를 발현하는 RAJI 표적 세포에 대한 세포독성을 테스트하였다. Matador 분석은 인젝터를 사용한 웰 모드로 PBS 15㎕/웰 중 1:100 CTZ를 첨가하여 수행하였다. SMAC 모방체의 존재하에서 SAR-T 세포의 증식은 RAJI 세포의 세포 사멸에서 용량 의존적 증가를 초래했지만 감염되지 않은 대조군 T 세포에 의한 비특이적 사멸에는 영향을 미치지 않았다.

T 세포는 CD3/CD28 비드로 밤새 활성화한 후 CD19 표적화 2세대 CAR(서열 번호 7343) 및 CD19 표적화 SIR CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]-E02(서열 번호 7348)로 3회 감염시켰다. 세포는 7일 동안 비리나판트 1μM의 부재 또는 존재하에 IL2 및 CD3/CD28 비드의 존재하에 표준 조건하에 XVIVO 배지에서 증식하였다. 7일 후, 세포를 상이한 세포 표면 마커의 발현에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다. 비리나판트 존재하에 CAR-T 및 SIR-T 세포의 시험관 내 증식은 CD8 세포의 비율 증가, CD4 세포의 감소 및 줄기 유사 속성이 나이브 T 세포의 마커인 CD62L 세포의 증가를 초래하는 것으로 나타났다.

비리나판트의 존재하에 7일 동안 증식된 1 x 10⁵ T 세포를 96웰 플레이트에서 48시간 동안 1 x 10⁵ Nalm6 세포와 공동 배양하였다. 48시간 후, 상청액을 수집하고 ELISA에 의한 IFNγ, TNFα 및 IL-2의 측정에 사용하였다. 비리나판트로 처리한 후 IFNγ, TNFα 또는 IL2 분비가 유의하게 감소하지 않았다.

상이한 CAR-T 세포의 생체 내 효능을 테스트하기 위해 NSG 마우스에 꼬리 정맥을 통해 열 안정한 루시퍼라제 LucPPE(NALM6-LucPPE)를 안정적으로 발현하는 0.5 x 10⁶ Nalm6 세포를 주사하고 3일 후 5 x 10⁶ 대조군 T 세포 및 서열 번호 7343으로 표시되는 2세대 CAR 구축물 및 서열 번호 7348로 표시되는 SIR을 발현하는 T 세포를 주사하였다. 동물은 D-루시페린 주사 후 생물발광 영상화에 의해 매주 영상화하였다. 대조군 T 세포가 제공된 동물에서 유의한 종양 성장이 있었고 제40일까지 모두 사망하였다. 비리나판트의 존재하에 증식된 서열 번호 7343을 발현하는 T 세포가 제공된 한 마리 동물을 제외하고는 비리나판트(1μM)의 부재 또는 존재하에 7일 동안 증식된 서열 번호 7343 및 7348을 발현하는 T 세포가 제공된 동물은 질환을 제거하고 제100일까지 질환 없이 유지하였다. 전반적으로, 상기 결과는 SIR을 발현하는 T 세포가 비리나판트의 존재하에 증식될 때 시험관 내 및 생체 내 효능을 유지함을 입증한다. 결과는 LucPPE를 발현하는 세포가 생물발광 영상화를 통해 암세포의 생체 내 성장을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 추가로 입증하였다.

SIR-T 세포 증식에 가스 투과성 신속 증식 G-Rex 배양기의 사용

1차 인간 T 세포를 CD19 표적화 2세대 CAR(서열 번호 7343) 및 CD19 표적화 SIR(서열 번호 7348)로 3회 감염시켰다. 한 세트의 T-CAR 세포를 G-Rex 6웰 플레이트(카탈로그 번호 80240M, Wilson Wolf Corporation)에서 배양했으며, 여기서 125만 개 T 세포를 35ml의 T 세포 배양 배지를 함유하는 각 웰에 플레이팅하였다.

G-Rex 플레이트에서 매 5일 후, 그리고 정상 산소 조건하에 일반 배양 플라스크에서 배양되는 세포에서 3일 후에 신선한 배지를 교체하였다.

G-Rex 플레이트에서 저산소 실험에서 매 7일 후, 그리고 일반 배양 플라스크에서 배양되는 세포에서 3일 후에 신선한 배지를 교체하였다.

저산소 조건의 경우, 정상 조건의 5% CO2 가습 인큐베이터 대신 4% O2 가습 인큐베이터를 사용하였다.

3회의 감염 후, 제5일에 단백질 L을 사용하여 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였고, 대략 45%의 세포가 세포 표면상에서 SIR을 발현하는 것으로 확인되었다. 세포를 펠릿화하고 PSA, 100 IU/ml 재조합 인간 IL2 및 Dynabead 인간 T-활성화 CD3/CD28 및 5% hAB 혈청이 보충된 XVIVO-15(Lonza) T 세포 배지에 재현탁하였다. 한 세트의 SIR-T 세포를 G-Rex 6웰 플레이트(카탈로그 번호 80240M, Wilson Wolf Corporation)에서 배양하였으며, 여기서 125만 T 세포를 35 ml의 T 세포 배양 배지를 포함하는 각 웰에 플레이팅하였다. 매 5일 후 G-Rex 플레이트에서 신선한 배지를 교체하였다. 다른 세트의 SIR-T 세포는 일반 조직 배양 플라스크에서 10 ml의 배지에서 배양하였다. G-Rex 플레이트에서는 매 5일 후 그리고 일반 배양 플라스크에서 배양한 세포에서는 3일 후에 새 배지를 교체하였다. 14일 증식 후, Nalm6-Gluc 세포에 대한 세포독성에 대해 Matador 분석을 사용하여 세포를 테스트하였다. SIR-T 세포는 GRex 플라스크에서 배양되었을 때 표적 세포에 대한 세포 독성을 유지하였다.

세포는 단백질 L 염색에 의한 SIR의 발현 및 상이한 T 세포 마커의 존재에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다. G-Rex 플라스크에서 증식된 SIR-T 세포는 단백질 L 염색에 의해 결정된 바와 같이 유의하게 더 높은 SIR 발현(53.7% 대 46.53%)을 보여주었고 더 높은 비율의 CD8 세포(80.34% 대 68.37%), CCR7 세포(65.69% 대 36.34%), CD62L(62.87% 대 51.99%) 및 CD45RA(91.94% 대 45.91%)를 보여주었다. CCR7+/CD45RA+/CD62L+ 세포는 줄기 유사 T 세포의 특징을 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로, 상기 결과는 GRex 플라스크에서 SIR-T의 배양이 줄기 유사 T 세포(Tscm)의 면역 표현형을 갖는 세포의 증식을 초래하고 그들의 말단 분화를 방해한다는 것을 나타낸다. 결과는 GRex 플라스크에서 SIR-T 세포의 증식이 CD8 세포의 우선적인 증식을 초래한다는 것을 추가로 입증한다.

일반 플라스크 또는 G-Rex 6웰 플레이트에서 배양된 대조군 T 세포 또는 SIR-T 세포를 추가 성분 없이 XVIVO 배지에서 96웰 플레이트 U-바닥에서 Nalm6-hGLuc 100K/웰/100ul로 배양하였다. 48시간 공동 배양 후, 상청액을 수집하고 ELISA에 사용하였다. GRex 플레이트에서 증식된 SIR-T 세포는 일반 플라스크에서 증식된 SIR-T 세포와 비교하여 표적 항원(예를 들어, CD19)을 발현하는 NALM6 세포와 배양될 때 더 많은 IFNγ, TNFα 및 IL2를 생성하는 것으로 나타났다. 또한, IFNγ 및 TNFα의 기준선(즉, NALM6 세포의 부재 하) 생성은 GREx 플라스크에서 증식된 SIR-T 세포에서 더 낮았으며 이는 낮은 강장성 신호전달을 시사한다.

일반 플라스크와 GRex 플라스크에서 증식된 SIR-T 세포의 생체 내 비교

일반 T75 플라스크 또는 GRex 플라스크에서 증식된 선행 실험의 SIR-T 세포를 NSG 마우스에서 Nalm6-LucPPe 이종이식 모델을 사용하여 생체 내 효능에 대해 비교하였다. 이를 위해, LucPPe를 발현하는 0.5 x 10⁶ Nalm6 세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 NSG 마우스에 주사하였다. 2일 후, 동물은 동물마다 증가하는 수의 SIR-T 세포(2 x 10⁶, 4 x 10⁶, 8 x 10⁶)의 주사를 받았다. 동물은 D-루시페린 주사 후 생물발광 영상화를 사용하여 영상화하였다. GRex 플라스크에서 증식된 SIR-T 세포를 제공받은 동물은 생물발광 영상화에 의해 결정된 바와 같이 백혈병의 우수한 제어를 보여주었으며 이는 또한 생존의 개선을 가져왔다. 이 실험은 또한 LucPPe 및 기타 열안정성 딱정벌레 루시페라제가 D-루시페린 주사 후 생물발광 영상화에 의해 종양 성장의 생체 내 모니터링에 사용될 수 있음을 입증한다.

CD19를 표적화하는 Ab-TCR-T 세포, TFP-T, TAC-T 세포의 증식에 의해 실험을 반복하였다. GRex 플라스크에서 Ab-TCR-T 및 TFP-T 세포의 증식은 우수한 증식, T 줄기세포 표현형의 보유 및 생체 내 종양의 우수한 제어를 부여함이 관찰된다. 마지막으로, 이중특이성 및 다중특이성 SIR-T, Ab-TCR-T 및 TFP-T의 증식에 의해 실험을 반복하고 GRex 플라스크를 사용하여 다시 증식하면 우수한 증식뿐만 아니라 시험관 내 및 생체 내 특성에서도 우수함을 보여준다.

저산소 조건하에 G-Rex 플레이트에서의 증식

CD19 표적화 2세대 CAR(서열 번호 7343) 및 CD19 표적화 SIR(서열 번호 7348)을 사용하여 선행하는 섹션의 실험을 반복하였다. T 세포를 SIR 및 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 3회 감염시킨 다음, 각각의 SIR/CAR 구축물로 감염된 100만 개의 세포를 선행하는 섹션에 기재된 바와 같이 일반 T75 플라스크 또는 GRex 플라스크에서 배양하였다. 각 플라스크의 한 세트는 정상의 산소화 조건하에 배양하고 다른 세트는 저산소 조건하에 배양하였다. 저산소 조건의 경우 정상 조건의 5% CO2 가습 인큐베이터 대신 4% O2 가습 인큐베이터를 사용하였다.

배양 13일 후, 세포를 계수하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 정상 조직 배양 플라스크의 저산소 조건하에서 세포의 증식은 더 낮은 수준의 증식으로 이어졌다. 따라서 일반 플라스크에서 배양한 감염되지 않은 T 세포(T-UI), CAR-T 및 SIR-T는 정상산소 조건하에서 각각 100만 내지 600만, 600만 및 900만 세포로 증식되었지만 저산소 조건하에서 각각 440만, 520만 및 600만 세포로 증식되었다. 대조적으로, GRex 플라스크에서는 정상 산소 조건하에서 각각 8000만, 8500만, 8400만 세포로, 저산소 조건하에서 각각 7000만, 7000만 및 7200만 세포로 증식되었다. 따라서 GREx 플라스크에서 증식하면 CAR-T 및 SIR-T 세포가 훨씬 더 많이 증식될 뿐만 아니라 저산소 조건하에서도 상당한 증식이 발생하여 임상 투여에 충분한 세포를 생산할 수 있다. 충분한 수의 CAR-T 및 SIR-T 세포의 생산 실패가 CAR-T 및 SIR-T 분야의 제조 실패의 주요 원인이기 때문에 이 점이 중요하다.

저산소 하에 GREX 플라스크에서 CAR-T 및 SIR-T의 추가 증식은 CAR 및 SIR을 발현하는 T 세포의 더 높은 비율, CD8+ 세포의 더 높은 비율 및 줄기 유사 T 세포 (즉, CD45RA, CCR7 및 CD62L)과 관련된 마커를 발현하는 세포의 더 높은 비율을 초래하였다.

상이한 조건에서 증식된 세포를 Gluc를 발현하는 NALM6-세포에 대한 세포독성에 대해 Matador 분석을 사용하여 테스트하였다. 모든 세포 집단은 세포독성을 나타내는 것으로 나타났다. 상이한 세포 집단으로부터의 상청액을 NALM6 세포와의 공동 배양 시 사이토카인 생산에 대해 테스트하였다. 모든 세포 집단은 NALM6 세포와의 공동 배양 시 IFNγ, TNFα 및 IL2를 생성하는 것으로 나타났다.

마지막으로, NSG 마우스를 사용하는 NALM6 이종이식 모델에서 생체 내 효능에 대해 상이한 세포 집단을 비교하였다. 실험은 꼬리 정맥을 통해 50십만 NALM6-LucPPE 세포를 주사한 후 2일 후 GREX 플라스크에서 정상 산소 또는 저산소 조건하에서 배양된 2백만 CAR-T 또는 SIR-T 세포를 주사하여 선행하는 실시예에서와 같이 수행하였다. 결과는 저산소 조건하에 GREX 플라스크에서 증식된 SIR-T 세포가 정상 조건하에 증식된 것과 동등하게 잘 수행된 반면 저산소 조건하에서 증식된 CAR-T 세포는 정상 산소 조건하에서 증식된 것보다 더 열등하게 수행됨을 보였다.<

상이한 항원 결합 도메인을 갖는 메소텔린 ( MSLN ) SAR의 비교 분석

메소텔린은 여러 암에서 높게 발현되지만 정상의 건강한 조직에서도 낮은 수준으로 발현된다. MSLN을 표적화하는 조정되는 SAR의 친화도를 감소시키기 위해, MSLN 특이적 인간화 항체 MSLN-hu22A10 및 MSLN-7D9의 여러 돌연변이체를 생성하였다. vL, vH 단편 및 이들의 CDR 영역의 서열 번호는 표 39에 제공한다. 상이한 돌연변이체 및 야생형 vL 및 vH 단편을 조립하여 이중 사슬 SIR의 백본 상의 SAR 구축물을 제조하였다. 상이한 SAR 구축물의 명칭, 사슬 조성 및 서열 번호는 표 50에 제공한다. pCCLc-MNDU3-WPRE 벡터(서열 번호 4)에 클로닝된 MSLN을 표적화하는 상이한 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포를 생성하였다. PAC를 공동발현하는 구축물의 경우, 세포를 또한 퓨로마이신으로 선별하였다. 그런 다음 세포를 SKOV3(MSLN-고), MCF7(MSLN-저), PC3(MSLN-중), MDA-MB-231(MSLN 저), LNCaP(MSLN 저), Huh- 7(MSLN-저) 및 RAJI(MSLN-ve) 세포주 각각과 인큐베이션한 후 GFP 형질도입에 대해 테스트하였다. 표 50에 나타낸 바와 같이, 상이한 MSLN SAR 세포는 상이한 수준의 MSLN 발현을 갖는 표적 세포주와의 공동 배양 시 다양한 수준의 GFP 유도를 나타내었다. 서열 번호(DNA) 21873 및 서열 번호(PRT) 22688을 갖는 SAR을 발현하는 JNG 세포는 높은 수준의 MSLN을 발현하는 SKOV-3 및 MDA-MB-231 세포주에 반응하여 가장 강한 GFP 유도를 나타내었지만, 적은 양 내지 중간 양의 MSLN을 발현하는 PC3과 공동 배양될 때 중등도의 GFP 유도를 나타내었지만 낮은 수준의 MSLN을 발현하는 MCF7 세포와의 공동 배양 시 GFP 유도를 나타내지 않았다. 이 SAR은 hu22A10-N31S-vL 및 hu22A10-F27Y-vH 단편을 포함한다. 이들 단편의 서열 번호 및 이들의 CDR1-3은 표 39에 제공한다. 서열 번호 22691을 갖는 SAR은 유사하지만 약간 더 약하다. 이 SAR은 또한 중간 수준의 MSLN을 나타내는 PC3 세포와 공동 배양될 때 상당한 GFP 유도를 나타내었다. 이 SAR은 hu22A10-N31S-vL 및 야생형 hu22A10-vH 단편을 포함한다. 서열 번호(PRT) 22687, 22692를 갖는 SAR은 SKOV3와 약하지만 충분한 GFP 유도를 나타내었고 PC3 세포주와 전혀 없거나 무시할 만한 GFP 유도를 나타내었다. 서열 번호 22694를 갖는 SAR은 SKOV-3 세포에 대한 패널 중에서 가장 낮은 GFP 유도를 나타내었다. 이 SAR은 MSLN-hu22A10-Y96W-vL 및 야생형 MSLN-hu22A10-vH 단편을 포함한다.

이러한 결과는 vL 및 vH 단편에 상이한 돌연변이를 혼입하여 친화도 조정 및 감도 변형된 MSLN 표적화 SAR을 생성할 수 있음을 보여준다. 항원 탈출로 인한 질환 재발이 우려되는 경우 중등도의 MSLN 발현 세포(예를 들어, PC3)에 대한 활성을 갖는 SAR이 더 적합할 수 있다. 대조적으로, 중등도의 MSLN 발현 세포(예를 들어, PC3 세포)에 대한 활성이 무시할 수 있거나 전혀 없는 MSLN SAR은 쇠약해진 환자 또는 안전성이 주요 관심사인 경우에 더 적합할 수 있다.

이들 vL 및 vH 단편을 사용하여 서열 번호가 서열 번호 22540-22581에 제공되는 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 표적화하는 MSLN의 다양한 패널을 생성한다. MSLN-hu22A10의 추가 돌연변이체를 생성할 수 있고 본 개시 내용의 대안적 실시 양태에서 사용할 수 있다. 다른 MSLN 표적화 vL, vH, scFv 단편 기반의 서열 번호도 표 3 및 39에 제공한다. 이들 vL, vH 및 scFv 단편을 사용하여 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 표적화하는 MSLN의 다양한 패널을 생성한다.

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때, SAR을 발현하는 JNG 세포가 PC3 세포와 24시간 동안 공동 배양될 때의 GFP의 10% 미만의 유도를 야기하는 MSLN 표적화 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때, MSLN 음성 세포주와 24시간 동안 공동 배양될 때의 GFP의 유도를 10% 미만으로 야기하는 MSLN 표적화 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때, SKOV3 세포와 24시간 동안 공동 배양될 때의 GFP의 20% 초과 유도를 야기하는 MSLN 표적화 SAR을 제공한다.

MSLN을 표적화하는 상이한 SAR 구축물을 발현하는 T 세포를 생성하고 Matador 분석을 사용하여 PC3 및 SKOV3 세포에 대한 시험관 내 세포독성을 입증한다. SAR-T 세포는 또한 표적 세포에 노출될 때 사이토카인 생산(TNFα, IFNγ 및 IL2)을 유도함을 보여준다. 서열 번호 22686-22695를 갖는 SAR을 발현하는 T 세포를 NSG 면역결핍 마우스를 사용하여 SKOV-3 이종이식 모델에 대한 생체 내 항종양 활성에 대해 테스트한다. BBz 배경의 상응하는 2세대 CAR을 대조군으로 사용한다. 서열 번호 22685-22695를 갖는 SAR을 발현하는 T 세포는 생물발광 영상화에 의해 측정된 바와 같이 효과적인 종양 제어를 나타내고 개선된 동물 생존을 초래한다. 서열 번호 22685-22695의 SAR을 발현하는 T 세포는 또한 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 포함하는 2세대 CAR과 비교하여 우수한 생체 내 활성을 나타낸다.

[표 50]

상기 MSLN SAR을 발현하는 T 세포는 Matador 분석을 사용하여 MSLN 발현 SKOV3 세포에서 세포독성을 유도함을 보여주고 사이토카인 생산(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등)을 유도함을 보여준다.

다음으로, SAR-T 세포를 NSG 마우스의 SKOV3 이종이식 모델에서 테스트한다. 이를 위해 1 x 10⁶ SKOV3-Luc 세포를 피하 주사한 후 일주일 후 3 x 10⁶ SAR 발현 T 세포를 정맥 내 주사한다. SAR-T 세포가 제공된 마우스는 다양한 수준의 종양 억제 및 생존 개선을 보여준다. 서열 번호 10315, 10384, 10453,10522, 10591 및 10660을 갖는 SAR-T가 제공된 마우스는 종양 억제 및 생존의 개선을 나타낸다. 서열 번호 10311, 10380, 10449, 10518, 10587 및 10656을 갖는 SAR-T가 제공된 마우스는 약한 보호를 나타낸다.

BCMA SAR의 비교

vL 및 vH 사슬의 돌연변이 유발에 의한 추가 최적화를 위해 이중 사슬 SIR의 백본을 갖는 BCMA SAR CD8SP-BCMA-hu72-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-BCMA-hu72-vH-[hTCRa-T48C-opt](서열 번호 1473)을 선택하였다. 돌연변이 구축물을 퓨로마이신 내성 유전자가 있거나 없는 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다. 상이한 구축물의 핵산 및 아미노산 서열 번호는 각각 서열 번호(DNA) 21843-21870 및 서열 번호(PRT) 22658-22685로 표시된다. 구축물을 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 JNG 세포에서 발현하였다. 퓨로마이신 내성 유전자를 보유하는 구축물의 경우, JNG 세포를 퓨로마이신으로 선별하여 안정적으로 형질도입된 세포를 생성하였다. 상이한 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포를 BCMA를 발현하는 L363 세포와의 밤새 공동 배양 시 GFP 발현을 유도하는 능력에 대해 비교하였다. 상이한 구축물은 다양한 수준의 NFAT 구동 GFP 유도를 보여주었다. 서열 번호 21843-21853, 21861, 21862 및 21870으로 표시되는 SAR 구축물은 서열 번호 21854-21860, 21863-21869로 표시되는 구성물과 비교하여 일관되게 더 높은 GFP 유도를 나타내었다. 구축물 SP-BCMA-hu72-vL-S29G-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-BCMA-hu72-vH-G32S-[hTCRa-T48C-opt](서열 번호 21853) 및 SP-BCMA-hu72-vL-I27L-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-BCMA-hu72-vH-S64T-[hTCRa-T48C-opt](서열 번호 21852) 각각으로 최고의 GFP 유도를 보였다. 이들 구축물을 발현하는 JNG 세포는 또한 강장성 신호전달의 결여를 반영하는 배경 GFP 유도를 나타내지 않았다. 또한, 이들 구축물을 발현하는 JNG 세포는 BCMA를 발현하지 않는 HL60 및 THP-1 세포주와의 공동 배양 시 GFP 유도를 나타내지 않았다. 이들 구축물은 vL 영역에 S29G(서열 번호 10934) 및 I27L(서열 번호 10933) 돌연변이가 있고 vH 영역에 G32S(서열 번호 11179) 및 S64T(서열 번호 11173) 돌연변이가 있다. S29G 및 G32S를 포함하는 scFv는 서열 번호 11422로 표시된다.

상기 돌연변이를 포함하는 상이한 백본(예를 들어, 2세대 CAR, SIR, Ab-TCR, zSIR, TFPε, TFPγ, TFPδ 등) 상의 다수의 단일특이성 및 이중특이성 SAR 구축물은 서열 번호 7409-7753, 7892-8374로 표시되며 다양한 면역 반응을 생성하는 데 사용할 수 있다.

하기 BCMA SAR 구축물을 발현하는 세포를 생성하고 Matador 분석을 사용하여 BCMA 발현 L363 세포에서 세포독성을 유도함을 보여주고 L363과 공동 배양할 때 사이토카인 생산(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등)을 유도함을 보여준다.

다음으로, SAR-T 세포를 NSG 마우스의 L363 이종이식 모델에서 테스트한다. 이를 위해 0.5 x 10⁶ L363-Luc 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주사한 후 3일 후 2 x 10⁶ SAR 발현 T 세포를 정맥 내 주사한다. SAR-T 세포가 제공된 마우스는 다양한 수준의 종양 억제 및 생존 개선을 보여준다. 서열 번호 21852 및 21853을 갖는 SAR-T가 제공된 마우스는 대조군 T 세포가 제공된 마우스와 비교하여 우수한 질환 제어 및 생존 연장을 나타낸다.

BCMA 및 CD20을 표적화하는 이중특이성 및 이중파라토프 SAR 구축물을 서열 번호 21853을 갖는 SAR의 백본 상에 구축하였다. 이들 구축물은 서열 번호(DNA) 22151-22155 및 서열 번호(PRT) 22966-22970으로 표시된다. 이들 SAR 구축물을 JNG 세포에서 발현하고 BCMA 또는 CD20 또는 둘 다를 발현하는 세포주 패널과 밤새 공동 배양 시 GFP의 유도에 대해 테스트하였다. 서열 번호 22151-22152를 갖는 이중특이성 및 이중파라토프 구축물은 BCMA-발현 L363(BCMA+) 및 U266 세포와 공동 배양될 때 GFP 유도를 나타내었지만 BCMA가 결여되어 있지만 낮은 수준의 CD20을 발현하는 NALM6 세포와 공동 배양될 때 GFP 유도를 나타내지 않았다(표 C2). 대조적으로, 서열 번호 22153-22155를 갖는 이중특이성 SAR 구축물은 L363, U266, NALM6 및 RAJI 세포와 GFP 유도를 나타내었지만 BCMA 및 CD20 발현이 모두 결여된 RS:411 세포와 공동 배양될 때 무시할 수 있는 비특이성 GFP 유도를 나타냈다. 따라서, 서열 번호 22153-22155를 갖는 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 하나 초과의 항원을 인식할 수 있고 NFAT 신호전달 경로의 유도로 강력하게 반응할 수 있다.

이중특이성 및 다중특이성 SAR 구축물을 발현하는 T 세포를 NSG 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 상이한 항원을 발현하는 세포주 패널을 사용하여 생체 내 효능에 대해 테스트한다. 이중특이성 및 다중특이성 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 이들에 의해 표적화되는 항원 중 하나 이상을 발현하는 다양한 패널의 세포주에 대해 생체 내 활성을 보유함을 보여준다. 이중특이성 및 다중특이성 SAR 구축물을 발현하는 T 세포는 또한 SAR에 의해 표적화되는 항원 중 적어도 하나를 계속 발현하는 한 표적 항원 중 하나 이상의 발현을 하향 조절하거나 상실한 세포주에 대해 활성을 가짐을 보여준다.

Her2 SAR의 비교

pCCLc-MNDU3-WPRE 벡터(서열 번호 4)에 클로닝된 Her2를 표적화하는 상이한 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포를 생성하였다. JNG 세포를 이중 사슬 SIR의 백본을 갖는 Her2를 표적화하는 상이한 SAR 구축물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 이들 구축물의 vL 및 vH 단편은 허셉틴 또는 이의 변이체 중 하나로부터 유래하였다. PAC를 공동발현하는 구축물의 경우, 세포는 또한 퓨로마이신으로 선별하였다. 그런 다음 세포를 SKOV3(Her2-고), MCF7(Her2-중), PC3(Her2-저) 및 MDA-MB-231(Her2 저) 세포주와 함께 각각 인큐베이션한 후 GFP 형질도입에 대해 테스트하였다. 표 51에 나타낸 바와 같이, 상이한 Her2 SAR 구축물은 다양한 수준의 GFP 유도를 나타내었다. huMab4D5의 vL 단편 또는 이의 돌연변이체가 TCRb 불변 사슬 또는 이의 변이체 중 하나(KACIAH)에 부착된 서열 번호 21895 및 21897을 갖는 SAR 구축물은 Her2-고 및 Her2-저 발현 세포주와 공동 배양될 때 강력한 GFP 유도를 나타내었다. 대조적으로, 서열 번호 21894, 21896, 21898 및 21899를 갖는 SAR 구축물은 Her2 고 발현 세포주에 대해서는 중등도의 활성을 나타내었지만 Her2 저 발현 세포주에 대해서는 낮거나 무시할 수 있는 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 vL 및 vH 단편에 상이한 돌연변이를 혼입하고 이들을 상이한 TCR 불변 사슬에 부착함으로써 Her 표적화 SAR의 감도를 변형할 수 있음을 보여준다.

인간화 Her2 4D5 항체 및 이의 변이체를 기반으로 하는 예시적인 vL, vH 및 scFv 단편의 서열 번호는 표 3에 제공되어 있다. 이들 vL 및 vH 단편을 사용하여 서열 번호가 서열 번호 8858-8926 및 21683-21703에 제공된 Her2 표적화 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 다양한 패널을 생성한다. 4D5의 추가 돌연변이체는 당 업계에 공지되어 있으며 본 개시 내용의 대안적인 실시 양태에서 사용될 수 있다. Her2-USC-1516 및 Her2 FRP5 항체를 기반으로 하는 다른 Her2 표적화 vL, vH, scFv 단편의 서열 번호도 표 3에 제공되어 있다. 이들 vL, vH 및 scFv 단편을 사용하여 표 36에 제공된 Her2 표적화 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR(서열 번호 8927-8995 및 8651-8719)의 다양한 패널을 생성한다,

한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때 SAR을 발현하는 JNG 세포가 MDA-MB-231과 24시간 동안 공동 배양될 때의 10% 미만의 GFP 유도를 야기하는 Her2 표적화 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때 Her2 음성 세포주와 24시간 동안 공동 배양될 때의 10% 미만의 GFP 유도를 야기하는 Her2 표적화 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때 SKOV3 세포와 24시간 동안 공동 배양될 때의 20% 초과의 GFP 유도를 야기하는 Her2 표적화 SAR을 제공한다.

Her2를 표적화하는 상이한 SAR 구축물을 발현하는 T 세포를 생성하고 Matador 분석을 사용하여 MCF7 및 SKOV3 세포에 대한 시험관 내 세포독성을 입증한다. SAR-T 세포는 또한 표적 세포에 노출될 때 사이토카인 생산(TNFα, IFNγ 및 IL2)을 유도하는 것을 보여준다. SAR-T 세포는 또한 NSG 면역결핍 마우스를 사용하여 이종이식 모델에서 테스트할 때 생체 내 항종양 활성을 나타낸다.

[표 51]

PSMA SAR

pCCLc-MNDU3-WPRE 벡터(서열 번호 4)에 클로닝된 PSMA를 표적화하는 상이한 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포를 생성하였다. 세포를 PSMA-ECD-GGS-NLuc(서열 번호 11995)에 대한 결합에 대해 테스트하였고, 모든 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포는 PSMA-ECD-GGS-NLuc(서열 번호 11995)에 대한 결합을 나타내었다. 세포는 또한 유세포 분석에 의해 단백질 L에 대한 결합을 보여주었다. 그런 다음 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포를 LNCaP 세포와 밤새 공동 배양할 때 GFP 발현 유도에 대해 테스트하였다. 모든 구축물은 GFP 강력한 유도를 보여주었다.

렌티바이러스 매개 유전자 형질도입에 의해 하기 SAR 구축물을 발현하는 T 세포를 생성하였다. T 세포는 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 세포 표면에서 SAR 구축물의 발현을 나타내었다. LNCaP-LucPPe 표적 세포의 세포독성을 유도하는 SAR-T 세포의 능력은 Matador 분석을 사용하여 입증하였다. 이를 위해, LNCaP 세포를 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 딱정벌레 루시퍼라제의 열안정성 변이체(LucPPe-146-1H2; 서열 번호 17)로 안정적으로 형질도입하였다. NSG 마우스에서 LNCaP-LucPPE 이종이식 모델을 사용하여 T 세포를 생체 내에서 테스트하였다. 100 ㎕의 Matrigel 및 배양 배지 혼합물(1:1, v/v) 중 LNCaP-LucPPe 세포 1 x 10⁶개를 5주령 수컷 NSG 마우스(n = 6)의 오른쪽 허벅지에 피하 이식하였다. 17일 후, PSMA-SAR T 세포 3×10⁶개를 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥 주사하였다. D-루시페린 주사 후 생체 내 생물발광 영상화(BLI)에 의해 종양 성장을 측정하였다. 서열 번호 9694, 9763, 9832 및 9901을 갖는 SAR을 발현하는 T 세포는 생체 내 생물발광 영상화 및 캘리퍼를 사용한 종양 부피 측정에 의해 측정된 바와 같이 종양의 효과적인 제어를 나타내었다. 이로 인해 생존율이 향상되었다. 특히, 서열 번호 9758을 갖는 2세대 CAR-T가 제공된 동물은 종양의 최소 제어를 나타내었던 반면, 이중 사슬 SIR의 백본을 갖는 SAR(예를 들어, 서열 번호 9762, 9901 및 9970)이 제공된 T-세포가 제공된 동물은 통계적으로 유의하고 효과적인 종양 제어를 나타냈다. 서열 번호 9762, 9901 및 9970을 갖는 구축물에서 [hTCRb-S57C] 및 [hTCRa-T48C] 모듈을 각각 [hTCRb-KACIAH] 및 [hTCRa-CSDVP] 모듈에 의해 대체한 SAR-T 구축물을 사용하여 효과적인 종양 제어를 보였다. 또한, K13 모듈(서열 번호 1317)을 공동발현한 구축물 CD8SP-hu-PSMA-J591-vL-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-hu-PSMA-J591-vH-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-K13-opt(서열 번호 21485)을 발현하는 SAR-T 세포에서 효과적인 제어가 관찰되었다.

SAR-T 세포를 주사하고 약 197일 후, 생존한 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 순환하는 인간 T 세포의 존재는 인간 CD3에 대한 항체로 염색하고 유세포 분석에 의해 를 확인하였다. T 세포 상에서 SAR의 발현은 APC-접합 단백질-L로 염색하고 유세포 분석에 의해 확인하였다. 생존 동물은 이전과 같이 새로운 LNCaP 암세포의 피하 주사로 재접종하였다. SAR-T 세포를 투여한 마우스는 심지어 200일 후에 재접종하였을 때 LNCaP 세포를 거부할 수 있었으며 이는 장기 면역을 시사한다. 또한, LNCaP 세포로 재접종 시 동물에서 유세포 분석으로 측정한 SAR-T 세포의 백분율이 증가하였다. 대조적으로, SAR-T 세포를 투여하지 않은 마우스는 대조군으로 사용하였고 점진적인 종양 성장을 보였다.

PSMA는 암세포에서 발현되는 것 외에도 정상 세포에서도 낮은 수준으로 발현된다. 따라서, 다양한 수준의 PSMA를 가진 표적 세포를 인식하고 반응할 수 있는 SAR을 개발하기 위해서, 상이한 백본 상에 있고 상이한 vL 및 vH 단편을 가진 SAR 패널을 생성하고 JNG 세포에서 안정적으로 발현시킨다. 상이한 SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포를 공동 배양 분석에서 LNCaP(PSMA-고), KMH2(PSMA-저) 및 Huh-7(PSMA-저) 세포주에 대해 테스트한다. 결과는 표 52에 나타낸다. 서열 번호 21882, 21884, 21886, 21887, 및 21892를 갖는 SAR 구축물은 높은 수준의 PSMA를 발현하는 LNCaP 세포와 배양될 때 중등도의 GFP 유도를 나타내었지만 낮은 수준의 PSMA를 나타내는 KMH2 및 Huh-7 세포에서 무시할 만한 GFP 유도를 나타내었다. 서열 번호 21888-21891을 갖는 SAR 구축물은 LNCaP 세포에 대해서도 약한 활성을 나타낸다. 더 짧은 TCRγ(huTCRg-d7) 및 TCRδ(huTCRd-d2) 사슬을 갖는 서열 번호 21885를 갖는 SAR 구축물은 LNCaP 세포에 대해 높은 NFAT 구동 GFP활성을 나타내었지만 낮은 수준의 PSMA를 발현하는 KMH2 및 Huh-7 세포에 대해서도 활성적이었다. huTCRg-d12 사슬을 갖는 서열 번호 21884를 갖는 SAR 구축물은 서열 번호 21885를 갖는 SAR에 비해 더 약한 활성을 나타내었다. 결실된 TCRa(hTCRa-d17) 및 TCRb(hTCRb-d17) 불변 사슬을 가진 서열 번호 21886을 갖는 SAR 구축물은 LNCaP 세포와 공동 배양할 때 상대적으로 높은 GFP 유도를 나타내는 반면 Huh-7 및 KMH2 세포주에 대해서는 무시할 수 있는 활성을 가졌다. 따라서 환자의 암에서 PSMA 발현 수준에 따라, 상이한 백본, 불변 사슬 및 항원 결합 도메인을 가진 상이한 SAR 구축물을 선택하여 효능과 안전성을 극대화할 수 있다. 따라서, 서열 번호 21885를 갖는 SAR은 PSMA-저발현 종양에 대해 활성을 가질 수 있고, 또한 정상의 건강한 조직에 대해 종양 표적 외 독성(on-target off-tumor) 독성을 가질 수 있다. 대조적으로, 서열 번호 21886 및 21892를 갖는 SAR은 일부 낮은 PSMA 발현 종양을 놓칠 수 있지만 더 우수한 안전성 프로파일을 제공할 수 있다. 또한, TCR 불변 사슬이 더 짧은 SAR 구축물은 신호전달 활성을 유지할 뿐만 아니라 더 높은 신호전달 활성을 가질 수 있다. TCR 불변 사슬이 더 짧은 SAR 구축물은 또한 더 작은 크기의 이점을 가지며, 이는 차례로 이들 구축물을 코딩하는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)의 역가를 더 높게 만든다.

상기 실험은 퓨로마이신 내성 유전자(PAC)가 있는 SAR로 수행하지만 결과는 이 선택적 모듈이 없는 구축물에도 적용할 수 있다. 마지막으로, 단일특이성, 이중특이성, 다중특이성 및 범용 SAR 구축물의 다양한 패널을 생성하기 위해 상기 구축물의 구축에 사용된 vL 및 vH 단편을 또한 사용하여 상이한 백본 및 추가 결합 모듈(예를 들어 AABD)을 갖는 추가 SAR 구축물을 생성할 수 있다. PSMA를 표적화하는 vL, vH 및 scFv 단편의 서열 번호는 표 3에 제공되어 있다. PSMA을 단독으로 또는 다른 항원과 조합하여 표적화하는 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR 구축물의 서열 번호는 서열 번호(DNA) 9686-10030(표 36) 및 서열 번호(DNA) 21662-21682에 제공되어 있다. 이들 SAR 구축물은 본 개시 내용에 기재된 분석을 사용하여 추가로 테스트할 수 있고 PSMA 발현 암에 대한 다양한 면역 반응을 생성하는데 사용할 수 있다.

본 개시 내용은 2세대 CAR, SIR, cTCR, AbTCR, TFP의 백본 상의 SAR을 제공하며, 이는 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 등)에서 발현될 때 PSMA-저발현 정상 세포를 보존하면서 PSMA-고발현 암 세포를 선택적으로 표적화할 수 있다. 본 개시 내용은 또한 PSMA 발현 수준이 상이한 종양(예를 들어, 고 PSMA 및 고 PSMA 종양)에 대해 차등 민감성을 갖는 SAR의 스크리닝을 위한 편리한 방법을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때 SAR을 발현하는 JNG 세포가 Huh-7 세포와 24시간 동안 공동 배양될 때의 GFP의 10% 미만의 유도를 야기하는 PSMA-표적화 SAR을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때 PSMA 음성 세포주(예를 들어, PSMA 대립 유전자가 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃된 세포주)와 24시간 동안 공동 배양될 때의 GFP의 10% 미만의 유도를 야기하는 PSMA-표적화 SAR를 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용은 JNG 세포에서 발현될 때 LNCaP 세포와 24시간 동안 공동 배양될 때의 GFP의 20% 초과의 유도를 야기하는 PSMA-표적화 SAR을 제공한다.

[표 52]

TCR 사슬의 상이한 결실 돌연변이체를 갖는 SIR의 비교

JNG 세포를 TCRa 및 TCRb 사슬과 TCRg 및 TCRd 사슬의 야생형 및 상이한 결실 돌연변이체에 연결된 hu-mROO5-1 vL 및 vH 단편을 기반으로 하고 CD19를 표적화하는 다음 결실 구조를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 세포를 RAJI 세포와 함께 인큐베이션하고 GFP 발현의 유도를 유세포 분석에 의해 측정하였다(표 53). 그러나 TCRα, β, γ 및 δ 사슬의 결실 돌연변이체를 갖는 구축물은 RAJI 세포와의 공동 배양 시 유의한 GFP 유도를 나타내었다. 특히, TCRα 및 TCRβ 둘 다가 결실된 서열 번호 22641을 갖는 구축물은 상당한 GFP 유도를 나타내었다. 유사하게, 서열 번호 22651 및 22652를 갖는 TCRγ 및 TCRδ 사슬의 결실 구축물은 유의한 잔류 활성을 나타내었다. 이러한 결실 돌연변이체는 강도 및 활성 수준이 다양한 SAR을 생성하는 데 사용할 수 있다. 이러한 돌연변이체는 또한 바이러스 벡터의 더 높은 역가를 초래할 수 있다.

[표 53]

항원 결합 도메인으로서 CD16을 발현하는 범용 SAR -T 세포의 사용. 루시퍼라제를 발현하는 Daudi 세포를 NSG 마우스(Jackson Laboratory)에 복강 내(i.p.; 0.3 x 10⁶ 세포/마우스) 주사한다. 일부 마우스에는 리툭시맙(150 mg)을 복강 내 투여한다. Daudi 접종 4일 후 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD16-V158-v2-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 4725) SAR를 발현하는 인간 T 세포(1 x 10⁷)를 주사한다. 대조군 마우스에 리툭시맙 또는 T 세포 대신 조직 배양 배지를 투여한다. 리툭시맙 주사는 추가 T 림프구 주사 없이 4주 동안 매주 반복한다. 모든 마우스에 4주 동안 주 2회 1,000-2,000 IU의 IL-2를 복강 내 주사한다. 리툭시맙과 SAR-T 세포를 투여받은 마우스는 종양 성장 감소를 나타낸다.

RZiP 도메인을 함유하는 SAR의 사용

RZIP CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-RZIP-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 4345)를 함유하는 예시적인 SAR을 발현하는 T 세포(서열 번호 4345)를 생성하여 5백만 세포/Kg의 용량으로 B 세포 림프종 환자에게 투여한다. 환자는 또한 CD20 및 CD22를 표적화하는 정제된 CD8SP-CD20-2F2-vL-Gly-Ser-링커-CD20-2F2-vH-G4S-EZIP(서열 번호 12033) 및 CD8SP-CD22-5-(vH-vL)-G4S-EZIP(서열 번호12146)를 1-100 ㎍/일의 속도로 정맥 내 연속 주입에 의해 투여받는다. 용량은 1일 1 ㎍/일에서 시작한 후 내약성과 CRS 증상의 발달에 따라 조정한다.

E4 도메인을 함유하는 SAR의 사용

E4 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-E4-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 4472)를 함유하는 예시적인 SAR을 발현하는 T 세포를 생성하여 B 세포 림프종 환자에게 5백만 세포/Kg의 용량으로 투여한다. 환자는 또한 CD20 및 CD22를 표적화하는 정제된 CD8SP-CD20-2F2-vL-Gly-Ser-링커-CD20-2F2-vH-G4S-K4(서열 번호 12291) 및 CD8SP-CD22-h10F4v2-vL-Gly-Ser-링커-CD22-h10F4v2-vH-G4S-K4(서열 번호 12293)를 1-100 ㎍/일의 속도로 정맥 내 연속 주입에 의해 투여받는다. 용량은 1 ㎍/일에서 시작한 후 내약성과 CRS 증상의 발달에 따라 조정한다.

원하는 특성을 가진 SAR을 선택하기 위해 시험관 내 및 생체 내 선택의 사용. 표 35에 나열된 CD19를 표적화하는 SAR 풀을 본질적으로 문헌[Eyquem J et al, Nature, 543(7643):113-117, 2017]에 의해 기술된 바와 같이 TRAC gRNA를 사용하여 T 세포의 TRAC 유전자좌에 표적화한다. 표적화 벡터는 또한 SAR 삽입물의 정지 코돈의 하류에 위치한 DNA 바코드를 보유한다. SAR을 TRAC 유전자좌로 표적화하기 위한 예시적인 구축물은 TRAC-5-SA-F2A-CD8SP-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]-STOP-pA-Del-Exon1-TRAC-3(서열 번호 23)이다. Ab-TCR, cTCR 및 TFP 백본을 기반으로 하는 다른 SAR 구축물을 PCT/US2018/053247에 기술된 바와 같이 TRAC 유전자좌를 표적화하도록 설계할 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. TFP 백본을 기반으로 하는 SAR을 코딩하는 TRAC-표적화 구축물은 또한 PCT/US2018/053247에 기술된 바와 같이 TCRα의 불변 사슬 또는 이의 기능적 변이체를 공동발현하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. T 세포는 말초 혈액에서 유래할 수 있다. 대안적인 실시 양태에서, T 세포는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 iPSC 또는 조혈 줄기세포의 단일 클론으로부터 유래한다. SAR 풀을 발현하는 T 세포는 1-21일 동안 시험관 내에서 RAJI 세포와 공동 배양한다. SAR-T 세포 풀의 분취량을 표적 세포와의 배양 전과 공동 배양 후 서로 다른 날에 수집한다. 샘플을 표적 세포에 노출시킨 후 차세대 시퀀싱에 적용시켜 상이한 SAR의 상대 빈도를 결정한다. 생물정보학 분석을 사용하여 표적 세포와의 공동 배양 후 더 우수한 증식 반응과 관련된 SAR을 결정한다. 본질적으로 유사한 접근법을 사용하여 생체 내에서 T 세포에 더 높은 증식 가능성을 부여하고/거나 생체 내에서 장기간 지속되고/거나 종양 접종에 굴복하는 동물과 비교하여 생존하는 동물의 시작 T 세포 집단에서의 빈도에 대해 정규화할 때 더 높은 빈도로 존재하는 SAR을 결정한다. 본 개시 내용의 대안적 실시 양태에서 인간 임상 샘플에 본질적으로 유사한 접근법을 사용하여 더 우수한 장기 생존, 사이토카인 방출 증후군의 더 낮은 발병률, 더 낮은 신경독성 및/또는 더 높은 장기 지속성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 특성 및/또는 결과와 관련된 SAR을 식별한다. 이러한 SAR을 이후에 단독으로 또는 다양한 조합으로 사용하여 상이한 질환 상태 및 상이한 환자의 치료를 위한 다양한 특성을 갖는 동일하거나 상이한 항원 결합 도메인을 표적화하는 SAR을 함유하는 상이한 SAR 서브풀을 개발할 수 있다. 다른 실시 양태에서, SAR-T 세포를 표적 세포주에 노출시킨 후 유세포 분석에 의해 결정된 세포내 IFNγ의 정도에 따라 상이한 세트로 분류한다. 낮은 IFNγ 집단과 높은 IFNγ 집단에서 상이한 SAR의 빈도를 차세대 시퀀싱에 의해 결정하고 대조군 SAR-T 세포 집단, 즉 표적 세포주에 노출되지 않았거나 SAR의 표적을 발현하지 않는 세포주에 노출된 SAR-T 세포의 빈도에 대해 정규화한다. 이 분석으로부터 상이한 수준의 IFNγ 생산과 관련된 SAR을 결정할 수 있다. 유사한 접근법을 사용하여 낮은 TNFα 생산, 고갈 마커의 낮은 발현, 말단 분화 마커의 낮은 발현 및/또는 세포독성 마커의 높은 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는 원하는 특성 또는 속성 중 임의의 것 또는 이들의 조합을 가진 SAR에 대해 스크리닝하고 이를 선택한다.

입양 세포 요법을 위한 자가 SAR -T 세포의 사용. 본 개시 내용의 SAR-T 세포는 입양 세포 요법에 사용할 수 있다. 예로서, 재발성 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 고위험 중간 등급 B 세포 림프종 환자는 CD19를 표적화하는 입양 전달된 자가 SAR-T 세포로 면역요법을 받을 수 있다. 각 환자로부터 수집한 백혈구 성분채집 생성물은 Miltenyi Biotec의 CliniMACS Prodigy® 시스템을 사용하고 제조업체의 권장 사항에 따라 CD3 양성 T 림프구를 선별한다. T 림프구는 Pgp 항체로 염색한 후 흐름 분류, Pgp 항체로 염색한 후 MACS 또는 TH9402 + 빛에 노출시킨 후 광역학적 선별을 사용하여 Pgp 양성 T 세포에 대해 선택적으로 농축시킨다. 세포는 임상 등급의 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 4091)로 형질도입한 후 저산소 조건하에 GRex 플라스크에서 SAR-T 세포의 선별 및 증식을 수행한다. 생성된 세포 생성물은 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 후 동결 보존한다. 한편, 연구 참가자는 백혈구 성분채집술 후, 림프구 고갈 화학 요법(30 mg/m²/일 플루다라빈 + 500 mg/m²/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법 완료 하루 후 사전에 저장된 SAR-T 생성물을 운반, 해동하고 환자의 침대 옆에서 주입한다. 연구 참가자는 정맥 주입으로 SAR-형질도입된 림프구를 받은 후, 내약성이 생길 때까지 8시간마다 고용량(720,000 IU/kg) IL-2(Aldesleukin; Prometheus, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 받는다. SAR-T 생성물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 10⁴ SAR+ve CD3 세포/kg에서 5 x 10⁹ SAR+ve CD3 세포/kg로 변화를 줄 수 있다. SAR 생성물은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여할 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 최소 30분 전에 아세트아미노펜 15 mg/kg P.O.(최대 650 mg) 및 디펜히드라민 0.5-1 mg/kg I.V.(최대 용량 50mg)로 사전 투약받을 수 있다. 연구 참가자는 선택적으로 인간 IL-2의 주사를 매일 받을 수 있다. 그 후 의사의 재량에 따라 임상 및 실험실 상관 추적 연구를 수행할 수 있으며, 여기에는 CD19-발현 ALL/림프종 세포 및/또는 입양 전달된 T 세포의 존재에 대한 정량적 RT-PCR 연구; FDG-PET 및/또는 CT 스캔; 질환 특이적 병리학적 평가를 위한 골수 검사; 림프절 생검; 및/또는 유전자 전달 연구에 적용되는 FDA의 생물학적 반응 조절자 자문 위원회(Biologic Response Modifiers Advisory Committee)에서 정한 지침에 따른 장기 추적 조사가 포함될 수 있다. 본질적으로 유사한 접근법을 사용하여 SAR이 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원 또는 항원들을 표적화하는 본 개시 내용의 SAR을 발현하도록 조작된 자가 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 사용하여 다른 질환을 치료할 수 있다.

입양 세포 요법을 위한 다중 항원을 표적화하는 자가 SAR -T 세포의 사용. 다양한 질환 유발 항원 또는 질환 관련 항원을 표적화하는 입양 전달된 자가 SAR-T 세포를 사용한 면역 요법의 IRB 승인 I상 임상 시험에 감염성 질환(예를 들어, HIV1, EBV, CMV, HTLV1 등), 퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병), 자가면역 질환(예를 들어, 천포창), 알레르기 질환(예를 들어, 만성 특발성 두드러기) 및 여러 암을 포함한 많은 다양한 질환 환자를 등록시킨다. 질환 유발 또는 질환 관련 세포에서 SAR의 표적 항원의 공지된 발현에 기초하여 다양한 질환에 대한 SAR을 선택한다. 가능한 경우, SAR의 항원 결합 도메인이 가요성 링커를 통해 비분비 형태의 NLuc 단백질에 융합된 ABD-GGS-NLuc 융합 단백질과의 결합에 의해 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 SAR 표적의 발현을 확인한다. 대안적으로, 시판되는 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 유세포 분석을 사용하여 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 SAR 표적의 발현을 확인한다. 백혈구 성분채집술을 사용하여 대상체로부터 T 세포를 수집하고, 적절한 SAR 코딩 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, Birinapat가 있는 GRex 플라스크에서 CD3/CD28 비드를 사용하여 생체 외에서 증식시킨다. 생성된 세포 생성물은 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 후 동결 보존한다. 한편, 연구 참가자는 림프구 고갈 화학 요법(30 mg/m²/일 플루다라빈 + 500 mg/m²/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법 완료 하루 후 연구 참가자는 정맥 주입으로 형질도입된 림프구를 받은 후, 내약성이 생길 때까지 8시간마다 고용량(720,000 IU/kg) IL-2(Aldesleukin; Prometheus, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 받는다. 사전에 보관된 SAR-T 생성물을 운반, 해동하고 환자의 침대 옆에서 주입한다. SAR-T 생성물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 10⁴ SAR+ve CD3 세포/kg에서 5 x 10⁹ SAR+ve CD3 세포/kg로 변화를 줄 수 있다. SAR-T 생성물은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여할 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 최소 30분 전에 아세트아미노펜 15 mg/kg P.O.(최대 650 mg) 및 디펜히드라민 0.5-1 mg/kg I.V.(최대 용량 50mg)로 사전 투약받을 수 있다. 연구 참가자는 선택적으로 인간 IL-2의 주사를 매일 받을 수 있고 그 후 의사의 재량에 따라 임상 및 실험실 상관 추적 연구를 수행할 수 있다.

입양 세포 요법을 위한 동종이계 SAR -T 세포의 사용. 동종이계 골수 이식을 받은 재발성 급성 림프구성 백혈병 또는 고위험 중간 등급 B 세포 림프종 환자는 입양 전달된 동종이계 SAR-T 세포로 면역 요법을 받을 수 있다. 기증자(동종이계 이식에 사용된 기증자와 동일)로부터 수집된 백혈구 성분채집 생성물은 Miltenyi Biotec의 CliniMACS Prodigy® 시스템을 사용하고 제조업체의 권장 사항에 따라 CD3 양성 T 림프구의 선별을 거친다. 당 업계에 공지된 기술을 사용한 CRISP9 매개 녹아웃에 의해 TRAC 및 β2M의 발현을 제거하고 TCR/CD3 복합체 및 HLA의 세포 표면 발현이 결여된 T 세포를 선별한다. 세포를 CD3 및 CD28 자기 비드 기반 인공 항원 제시 세포를 사용하여 활성화하고 임상 등급의 CD20-SIR 바이러스(예를 들어, CD8SP-MC7G5-Vb-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-MC7G5-Va-[hTCRa-T48C](서열 번호 3503]로 형질도입한다. 폐쇄 시스템에서 9-12일 동안 세포를 증식시킨다. 생성된 세포 생성물은 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 세포 독성 테스트 포함)를 거친 후 동결 보존한다. 한편, 연구 참가자는 림프구 고갈 화학 요법(30 mg/m²/일 플루다라빈 + 500 mg/m²/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법 완료 하루 후 연구 참가자는 정맥 주입으로 형질도입된 림프구를 받은 후 내약성이 생길 때까지 8시간마다 고용량(720,000 IU/kg) IL-2(Aldesleukin; Prometheus, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 받는다. SAR-T 생성물을 운반, 해동하고 환자의 침대 옆에서 주입한다. SAR-T 생성물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 10⁴ SAR+ve CD3 세포/kg에서 5 x 10⁹ SAR+ve CD3 세포/kg로 변화를 줄 수 있다. SAR 생성물은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여할 수 있다. 연구 참가자는 SAR-T 세포 주입 최소 30분 전에 아세트아미노펜 15 mg/kg P.O.(최대 650 mg) 및 디펜히드라민 0.5-1 mg/kg I.V.(최대 용량 50 mg)로 사전 투약받을 수 있다. 그 후 의사의 재량에 따라 임상 및 실험실 상관 추적 연구를 수행할 수 있으며, 여기에는 CD20-발현 ALL/림프종 세포 및/또는 입양 전달된 T 세포의 존재에 대한 정량적 RT-PCR 연구; FDG-PET 및/또는 CT 스캔; 질환 특이적 병리학적 평가를 위한 골수 검사; 림프절 생검; 및/또는 유전자 전달 연구에 적용되는 FDA의 생물학적 반응 조절자 자문 위원회에서 정한 지침에 따른 장기 추적 조사가 포함될 수 있다. 면역억제제의 사용도 의사의 재량에 따른다. 본질적으로 유사한 접근법을 사용하여 SAR이 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원 또는 항원들을 표적화하는 본 개시 내용의 SAR을 발현하는 동종이계 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 사용하여 다른 질환을 치료할 수 있다. 본질적으로 유사한 프로토콜을 사용하여 표 25-36에 나열된 다른 SAR 구축물을 테스트한다.

SAR -T 세포 간 동맥 주입. 정맥 내 주입 외에도, SAR-T 세포를 동맥 내 주입하여 질환과 관련된 국소 부위 또는 기관에 고농도의 SAR-T 세포를 제공할 수 있다.

SAR -T 세포의 복강 내 투여. 본질적으로 문헌[Koneru M et al (Journal of Translational Medicine; 2015; 13:102)]에 기재된 바와 같이 SAR-T 세포를 또한 복강내 투여할 수 있다.

종양 내 주사를 위한 SAR -T 세포의 사용. 본질적으로 문헌[Brown CE, et al, Clin Cancer Res. 2015 September 15; 21(18): 4062-4072]에 기재된 바와 같이 SAR-T 세포를 또한 종양 내 투여할 수 있다.

이식 전 골수 또는 말초 혈액 줄기세포 제제의 생체 외 퍼징을 위한 SAR -T 세포의 사용. SAR T 세포를 사용하여 줄기세포 이식 전에 암세포의 골수 또는 말초 혈액 줄기세포 제제를 퍼징할 수 있다.

전립선암 환자의 치료를 위한 PSMA를 표적화하는 SAR의 사용.

전립선암 환자에게 Mozibil을 투여하여 림프구를 동원한 후 성분채집술을 시행한다. T 세포를 정제하고 SAR 구축물 CD8SP-hu-PSMA-J591-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-hu-PSMA-J591-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 9763)을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후 GRex 플라스크에서 SAR-T 세포 생성물을 제조하는 데 사용한다. 대상체는 림프구 고갈 화학요법을 받은 후 5백만 SAR-T 세포/Kg의 용량으로 SAR-T 세포 생성물을 주입받는다.

골수종 환자의 치료를 위한 BCMA를 표적화하는 SAR의 사용.

골수종 환자는 성분채집술을 받는다. T 세포를 정제하고 SAR 구축물 CD8SP-BCMA-hu-USC82-S29G-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-BCMA-hu-USC73-G32S-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 8314)를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후 저산소 조건하에 GRex 플라스크에서 SAR-T 세포 생성물을 제조하는 데 사용한다. 대상체는 림프구 고갈 화학요법을 받은 후 5백만 SAR-T 세포/Kg의 용량으로 SAR-T 세포 생성물을 주입받는다. 본질적으로 유사한 절차를 사용하여 BCMA를 표적화하는 다른 SAR-T 세포 생성물(예를 들어, 서열 번호 7415-7418, 7427)을 투여한다.

동종이계 SAR -T 세포 생성물의 사용

당 업계의 공지된 기술을 사용하여 SAR 구축물 TRAC-5-SA-F2A-CD8SP-CD19-vHH-048-G4Sx3-R1-hu-mROO5-1-vL-[hTCRb-S57C]-F-P2A-IgSP-Apa-CD20-vHH-2HCD25-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-vH-[hTCRa-T48C]-STOP-pA-Del-엑손1-TRAC-3(서열 번호 23)을 TRAC 유전자좌로 표적화하여 동종이계 SAR-T 생성물을 생성한다. 또한, 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 Cas9 매개 유전자 파괴를 사용하여 β2M의 발현을 제거한다. 림프구 고갈 화학 요법 후 B 세포 ALL 환자에게 동종이계 생성물을 투여한다.

난소암 환자의 치료를 위한 MSLN을 표적화하는 SAR의 사용.

난소암 환자는 성분채집술을 받는다. T 세포를 정제하고 SAR 구축물 CD8SP-MSLN-hu22A10-vL-Y96W-[hTCRb-S57C]-F-P2A-SP-MSLN-hu22A10-vH-[hTCRa-T48C](서열 번호 10660)을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후 저산소 조건하에 GRex 플라스크에서 SAR-T 세포 생성물을 제조하는 데 사용한다. 대상체는 림프구 고갈 화학요법을 받은 후 5백만 SAR-T 세포/Kg의 용량으로 SAR-T 세포 생성물을 주입받는다. 본질적으로 유사한 절차를 사용하여 MSLN(서열 번호 10591, 10453, 10384-85 등)을 표적화하는 다른 SAR-T 세포 생성물을 투여한다.

ROR1 SAR을 발현하는 T 세포는 ROR1 발현 세포에서 세포독성을 유도한다. CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포를 ROR1을 표적화하는 SAR 구축물(서열 번호 19065-19271)을 발현하는 렌티바이러스로 감염시킨다. SAR-T 세포를 10-14일 동안 시험관 내에서 증식시킨다. GLuc를 안정적으로 발현하는 A549 세포를 상이한 CAR을 발현하는 T 세포와 10:1의 E:T 비율로 4시간 동안 공동 배양한다. 표적 세포의 용해의 SAR-T 세포 매개 유도를 GLuc 활성 측정에 의한 Matador 분석을 사용하여 분석한다. SAR의 생체 내 활성은 NSG 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 입증한다.

CD229 SAR을 발현하는 T 세포는 CD229 발현 세포에서 세포독성을 유도한다. CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포를 CD229를 표적화하는 SAR 구축물(서열 번호 19883-20091)을 발현하는 렌티바이러스로 감염시킨다. SAR-T 세포를 10-14일 동안 시험관 내에서 증식시킨다. GLuc를 안정적으로 발현하는 RAJI 표적 세포를 상이한 CAR을 발현하는 T 세포와 10:1의 E:T 비율로 4시간 동안 공동 배양한다. 표적 세포의 용해의 SAR-T 세포 매개 유도를 GLuc 활성 측정에 의한 Matador 분석을 사용하여 분석한다. SAR의 생체 내 활성은 NSG 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 입증한다.

Toso SAR을 발현하는 T 세포는 Toso 발현 세포에서 세포독성을 유도한다. CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포를 Toso를 표적화하는 SAR 구축물(서열 번호 19686-19720)을 발현하는 렌티바이러스로 감염시킨다. SAR-T 세포를 10-14일 동안 시험관 내에서 증식시킨다. GLuc를 안정적으로 발현하는 표적 세포를 상이한 CAR을 발현하는 T 세포와 10:1의 E:T 비율로 4시간 동안 공동 배양한다. 표적 세포의 용해의 SAR-T 세포 매개 유도를 GLuc 활성 측정에 의한 Matador 분석을 사용하여 분석한다. SAR의 생체 내 활성은 NSG 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 입증한다.

SARS- CoV2 SAR을 발현하는 T 세포는 Toso 발현 세포에서 세포독성을 유도한다. CD3 자기 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포를 SARS-CoV2 RBD를 표적화하는 SAR 구축물을 발현하는 렌티바이러스로 감염시킨다. SAR-T 세포를 10-14일 동안 시험관 내에서 증식시킨다. GLuc 및 막 결합된 형태의 RBD를 안정적으로 발현하는 K562 세포를 상이한 CAR을 발현하는 T 세포와 10:1의 E:T 비율로 4시간 동안 공동 배양한다. 표적 세포의 용해의 SAR-T 세포 매개 유도를 GLuc 활성 측정에 의한 Matador 분석을 사용하여 분석한다.

본질적으로 유사한 절차를 사용하여 다른 항원을 표적화하는 본 개시 내용의 다른 SAR의 시험관 내 및 생체 내 활성을 입증한다.

Claims

적어도 하나의 합성 항원 수용체(SAR: synthetic antigen receptor) 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는
a) i) 단일 vH 도메인(SVH) 또는 이의 단편;
ii) 단일 vL 도메인(SVL) 또는 이의 단편;
iii) vHH 도메인 또는 이의 단편;
iv) 단일 도메인 항체 또는 이의 단편;
v) TCR의 단일 가변 도메인(svd-TCR) 또는 이의 단편;
vi) DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 리피바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 및 D 도메인, 또는 이들 중 어느 하나의 단편으로부터 선택된 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
vii) 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 이의 단편;
viii) 리간드의 수용체 결합 도메인;
xi) 자가항원 또는 이의 단편;
x) 어댑터 결합 도메인 또는 이의 단편; 및
xi) Fc 결합 도메인 또는 이의 단편
의 군으로부터 선택된 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인(AABD: autonomous antigen binding domain) 또는 이의 단편을 포함하는 제1 모듈;
b) vL(V_L), vH(V_H), Va/Vα, Vb1(Vβ1), Vb2(Vβ2), Vg(Vγ), Vd(Vδ), scFv, scTCR, Ig 링커 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는 제2 모듈;
c) 세포외 도메인, 연결 펩티드 또는 힌지 도메인을 포함하는 선택적 제3 모듈;
d) 경막 도메인을 포함하는 제4 모듈; 및
e) 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 선택적 제5 모듈
을 포함하며; 제1 모듈, 제2 모듈, 선택적 제3 모듈, 제4 모듈, 및 선택적 제5 모듈은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결되는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 하나 이상의 AABD는
1) 제1 TCR 서브유닛의 제1 경막 도메인에 작동 가능하게 연결된 제1 연결 펩티드를 포함하는 제1 T 세포 수용체 불변 사슬 단편에 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 vH, Va, Vg 또는 Ig 링커 도메인 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
(2) 제2 TCR 서브유닛의 제2 경막 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 연결 펩티드를 포함하는 제2 T 세포 수용체 불변 사슬 단편에 선택적 링커를 통해 작동 가능하게 연결된 vL, Vb, Vd 또는 Ig 링커 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬
의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 선택적 링커를 통해 부착되며,
제1 TCR 불변 사슬 단편 및 제2 TCR 불변 사슬 단편은 T 세포에서 발현될 때 적어도 하나의 TCR 연관 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM: T cell receptor module)을 형성하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인의 코딩된 vH, Va, 또는 Vg 및 제2 항원 결합 도메인의 vL, Vb 또는 Vd는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모듈을 형성하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, AABD, vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd 및/또는 Ig 링커 도메인은 완전 인간, 인간화, 키메라 또는 비인간 도메인인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩된 Ig 링커 도메인은 서열 번호 11832-11865를 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 11832-11865의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩된 선택적 링커 도메인은 서열 번호 11832-11865, 11714-11730을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 11832-11865, 11714-11730의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 그의 단편 또는 변이체, 또는 25 내지 500 개 아미노산 길이인 도메인을 포함하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, T 세포 수용체 모듈(TCRM)에 동원될 수 있는 폴리펩티드의 부분적 또는 전체적 세포외, 경막 및 세포내 도메인을 포함하는, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, CD3δ, CD3ε, CD3γ 및 CD3ζ의 군으로부터 선택된 폴리펩티드의 세포외, 경막 및 세포내 도메인, 또는 서열 번호 11903 내지 11906 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 그의 단편을 포함하는, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 코딩된 T 세포 수용체 불변 사슬 단편은 서열 번호 11732-11830 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 코딩된 T 세포 수용체 불변 사슬은 서열 번호 11867-11875 중 어느 하나의 서열을 갖는 연결 펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 연결 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 적어도 하나의 SAR을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 11877-11881 또는 23332-23334 중 어느 하나의 서열을 갖는 경막 도메인에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 경막 도메인 또는 이의 단편을 포함하는, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 세포내 도메인은 서열 번호 111883-11886, 11785, 또는 23335-23337 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 시토졸 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, 단일 사슬 SIR, 1.5 사슬 SIR, 이중 사슬 SIR, zSIR, 단일 사슬 cTCR, 1.5 사슬 cTCR, 이중 사슬 cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, TFPε, TFPγ, TFPδ, TFPαβ, TFPγδ, Tri-TAC, 단일 사슬 TCR, 이중 사슬 TCR 또는 HLA 비의존성 TCR의 백본을 갖는, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, SAR은
i) 적어도 하나의 항원; 및/또는
ii) 하나 이상의 항원(들)의 적어도 하나의 에피토프
에 결합할 수 있는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 코딩된 2개 이상의 AABD는
i) 적어도 하나의 항원; 및/또는
ii) 하나 이상의 항원(들)의 적어도 하나의 에피토프
에 결합하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 다음의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원에 결합하는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴 유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나아제 유사 고아(orphan) 수용체 1(ROR1); Fms 유사 티로신 키나아제 3(FLT3); 종양 관련 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구 세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비-조혈 암에서 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 암 배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계 특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파(FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신 단백질 키나아제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 전립선; 전립선 산 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이(ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1 수용체); 탄산 무수화효소 IX(CAlX); 프로테아솜(프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 중단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨손 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질 결합 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라마이드(GloboH)의 육당 부분; 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3(ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TARP(TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 관련 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1(멜란A 또는 MARTI); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 중단점; 흑색종 아폽토시스 억제제(ML-IAP); ERG(경막 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 페어드 박스(paired box) 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1(CYPlB 1); CCCTC 결합 인자(아연 핑거 단백질) 유사(BORIS 또는 Brother of the Regulator of lmprinted Sites), T 세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어드 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TESl); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK); A 키나아제 고정 단백질 4(AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2(SSX2); 고급 당화 최종 산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1(RUl); 신장 유비쿼터스 2(RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다 유사 폴리펩티드 1(IGLLl); MPL; 비오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1 TROP2; GFR알파4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea(CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL11Ra; IL13Ra2; CD179b-IGLl1; TCR감마-델타; NKG2D; CD32(FCGR2A); Tn ag; Tim1-/HVCR1; CSF2RA(GM-CSFR-알파); TGF베타R2; 루이스 Ag; TCR-베타1 사슬; TCR-베타2 사슬; TCR-감마 사슬; TCR-델타 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체(LHR); 난포자극 호르몬 수용체(FSHR); 성선자극 호르몬 수용체(CGHR 또는 GR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 엔벨로프 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; KSHV K8.1; KSHV-gH; 인플루엔자 A 혈구응집소(HA); GAD; PDL1; 구아닐릴 시클라제 C(GCC); 데스모글레인 3(Dsg3)에 대한 자가 항체; 데스모글레인 1(Dsg1)에 대한 자가 항체; HLA; HLA-A; HLA-A2; HLA-B; HLA-C; HLA-DP; HLA-DM; HLA-DOA; HLA-DOB; HLA-DQ; HLA-DR; HLA-G; IgE; CD99; Ras G12V; 조직 인자1(TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2); P-당단백질; STEAP1; Liv1; 넥틴-4; 크립토; gpA33; BST1/CD157; 낮은 전도도 클로라이드 채널(LCCC); TAJ/TROY; MPL(TPO-R); KIR3DL2; CD32b; CD229; Toso; GPC3; BAFF-R; MR1; CMV-pp65/MHC 복합체; 및 NYESO-1/MHC 복합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩된 SAR 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 적어도 하나의 SAR을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드:
(i) 서열 번호 10978-11214 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 및 23148-23161 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 및 23148-23161 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10978-11214 및 23148-23161 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 중쇄 가변 영역(vH);
(ii) 서열 번호 10736-10972 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 10736-10972 및 23136-23147 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 경쇄 가변 영역(vL);
(iii) 서열 번호 11220-11456 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 사슬 가변 단편(scFv);
(iv) 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열 번호 11520-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11524-11525, 11530-11531, 11549-11575, 11576-11592 및 23163-23173 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 낙타과 VHH 도메인;
(v) 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11662-11673 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열에 의해 코딩되는 비-면역글로불린 스캐폴드;
(vi) 서열 번호 11674-11691 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 수용체의 리간드 결합 도메인;
(vii) 서열 번호 11692-11702, 22391-22392, 22402-22404 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 리간드의 수용체 결합 도메인;
(viii) 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 11519-11523, 11526-11529, 11532-11548, 11644-11645 및 23174 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 vH 도메인;
(ix) 서열 번호 11704 내지 11712, 또는 22383 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 어댑터에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 어댑터 결합 도메인;
(x) 서열 번호 11687, 22406-22407 내지 11712, 또는 22383 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 자신의 자가항체 및 자가항체 생산 세포에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 자가항원;
(xi) 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22396-22397 및 11653-11660 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 TCR 가변 영역(Va, Vb, Vg 또는 Vd); 및
(xii) 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열, 또는 서열 번호 22399-22400 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고, 자신의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 가변 TCR 도메인(svd-TCR).
제1항에 있어서, 표적 항원 중 적어도 하나는 혈액 계통 세포 상에 발현되지만, 표적 항원 중 적어도 하나는 고형 종양 세포 상에 발현되는 것인, 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드.
치료 컨트롤과 공동발현되는 제1항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템으로서, 치료 컨트롤은 절단된(truncated) 표피 성장 인자 수용체(tEGFR), 절단된 표피 성장 인자 수용체 viii(tEGFRviii), 절단된 CD30(tCD30), 절단된 BCMA(tBCMA), 절단된 CD19(tCD19), CD34, 티미딘 키나아제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9(icaspase9), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코오스 옥시다제, 데옥시리보뉴클레오시드 키나아제, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)/인돌-3-아세트산(IAA), 감마-글루타밀시스테인 신테타아제, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나아제 키메라, dox 의존성 카스파제-2, 돌연변이 티미딘 키나아제(HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체(CCR), 41BBL, CD40L, K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 돌연변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-이필리무맙-scFv, CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, CD3z, CD3z-GGGS-41BB, CD3-BBz, CD3-CD28z, CD3-CD28-Lck 융합 단백질, Brd4를 표적화하는 shRNA, 키메라 항원 수용체(CAR), hTERT, 헤파리나제, CAR, 억제성 CAR 및 이들의 조합 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 발현 시스템.
제1항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터로서, DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티(sleeping beauty) 트랜스포존 벡터, 및 피기백(piggybac) 트랜스포존 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
제1항의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드.
제1항의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 세포 또는 세포 집단.
제22항에 있어서, 세포는 면역 이펙터 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)인 세포 또는 세포 집단.
제22항에 있어서, 세포는 자가 세포 또는 동종이계 세포인 세포 또는 세포집단.
제22항에 있어서, 내인성 TCR의 기능적 발현이 손상되거나 제거되고 SAR 폴리펩티드의 기능적 발현이 있는 세포 또는 세포 집단.
제22항에 있어서, SAR 폴리펩티드는 내인성 T 세포 유전자의 유전자좌에 배치된 발현 카세트로부터 발현되는 것인 세포 또는 세포 집단.
제22항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 내인성 T 세포 유전자에 대한 프로모터 및/또는 조절 요소의 제어하에 있는 것인 세포 또는 세포 집단.
제26항 또는 제27항에 있어서, 내인성 T 세포 유전자의 유전자좌는 TRAC 유전자좌, TRBC 유전자좌, TRGC 유전자좌 및/또는 TRDC 유전자좌인 세포 또는 세포 집단.
제26항 또는 제27항에 있어서, SAR 폴리뉴클레오티드의 배치는 T 세포에서 내인성 TCRα 사슬 및/또는 내인성 TCRβ 사슬, 또는 내인성 TCRγ 사슬 및/또는 내인성 TCRδ 사슬을 포함하는 TCR의 내인성 발현을 방해하거나 제거하는 것인 세포 또는 세포 집단.
제26항 또는 제27항에 있어서, 내인성 TCR의 방해 또는 제거된 발현은 야생형 내인성 TCR을 가진 T 세포에서의 그의 발현 및/또는 활성과 비교하여 비-자연 발생 면역 수용체의 향상된 발현 및/또는 활성을 유도하는 것인 세포 또는 세포 집단.
제30항에 있어서, SAR은 SIR, cTCR 및/또는 Ab-TCR 중 하나 이상의 백본을 갖는 것인 세포 또는 세포 집단.
제25항 또는 제29항에 있어서, SAR 폴리펩티드는 TFP의 백본을 갖고, 내인성 TCR의 방해 또는 제거된 발현은 야생형 내인성 TCR을 가진 T 세포에서의 그의 발현 및/또는 활성과 비교하여 SAR의 손상된 발현 및/또는 활성을 초래하는 것인 세포 또는 세포 집단.
제32항에 있어서, SAR 폴리펩티드는 TFP의 백본을 갖고, 세포 또는 세포 집단은 TCR 불변 사슬을 코딩하는 서열을 추가로 발현하며, TCR 불변 사슬은
i) TCR 알파 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는
ii) TCR 베타 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는
iii) TCR 감마 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는
iv) TCR 델타 불변 사슬 또는 이의 단편, 또는
v) i) 및 ii) 또는 iii) 및 iv)의 조합인 세포 또는 세포 집단.
제33항에 있어서, TCR 불변 사슬을 코딩하는 서열의 발현은 SAR 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 회복시키는 것인 세포 또는 세포 집단.
SAR 발현 면역 이펙터 세포의 제조 방법으로서, 제20항의 적어도 하나의 벡터 또는 제1항의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를, SAR 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건하에서 면역 이펙터 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 조혈 줄기세포 또는 전구 세포에 도입하는 것을 포함하는 제조 방법.
정상 산소 또는 저산소 조건하에 기체 투과성 플라스크에서 제22항의 SAR 발현 면역 이펙터 세포를 증식하는 방법.
제36항에 있어서, SAR 발현 면역 이펙터 세포는 SMAC 모방체 또는 NIK 아고니스트 화합물의 존재하에 증식되는 것인 방법.
대상체에서 항-질환 면역을 제공하는 방법으로서, 대상체에게 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 줄기세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 세포는 자가 T 세포 또는 동종이계 T 세포, 또는 자가 NKT 세포 또는 동종이계 NKT 세포, 또는 면역 이펙터 세포를 생성할 수 있는 자가 또는 동종이계 조혈 줄기세포 또는 자가 또는 동종이계 iPSC인 방법.
대상체에서 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 대상체에게 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, SAR 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 관련 항원에 결합하는 것인 방법: CD5; CD19; CD123; CD22; CD23; CD30; CD171; CS-1(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴 유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나아제 유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms 유사 티로신 키나아제 3(FLT3); 종양 관련 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구 세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비-조혈 암에서 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 암 배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계 특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파(FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신 단백질 키나아제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 전립선; 전립선 산 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이(ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1 수용체), 탄산 무수화효소 IX(CAlX); 프로테아솜(프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 중단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨손 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질 결합 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라마이드(GloboH)의 육당 부분; 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3(ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TARP(TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 관련 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1(멜란A 또는 MARTI); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 중단점; 흑색종 아폽토시스 억제제(ML-IAP); ERG(경막 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 페어드 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1(CYPlB 1); CCCTC 결합 인자(아연 핑거 단백질) 유사(BORIS 또는 Brother of the Regulator of lmprinted Sites), T 세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어드 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TESl); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK); A 키나아제 고정 단백질 4(AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2(SSX2); 고급 당화 최종 산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1(RUl); 신장 유비쿼터스 2(RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다 유사 폴리펩티드 1(IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 태그, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea(CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32(FCGR2A), Tim1-/HVCR1, CSF2RA(GM-CSFR-알파), TGF베타R2, 루이스 Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체(LHR), 난포자극 호르몬 수용체(FSHR), 융모성 성선자극 호르몬 수용체(CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 엔벨로프 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, 인플루엔자 A 혈구응집소(HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 시클라제 C(GCC), 데스모글레인 3(Dsg3) 및 데스모글레인 1(Dsg1)에 대한 자가 항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자1(TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, 크립토, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 클로라이드 채널, TAJ/TROY, MPL(TPO-R), KIR3DL2, CD32b, CD229, Toso, GPC3, MR1, NYESO-1/MHC 복합체, CMVpp65/MHC 복합체.
제39항에 있어서, 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환은, 질환 관련 항원의 발현과 관련된 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 및 비암 관련 적응증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
SAR 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 서열 번호 1849-10720, 21609-21625, 21626-21659, 21662-21792, 21808, 21813-21840, 21843-21879, 21882-21892, 21894-21899, 21901-21947, 21949-21963, 21967-21972, 21985-22085, 22087-22099, 22104-22207, 22209-22250, 22252-22254, 22256-22262, 22264-22273, 22275-22284, 22286-22296 및 22307-22312로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 상기의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 12539-21410, 22445-22460, 22462-22495, 22498-22614, 22624, 22626-22655, 22658-22685, 22687-22694, 22697-22707, 22709-22714, 22716-22762, 22764-22778, 22782-22787, 22800-22900, 22902-22914, 22919-23022, 23024-23065, 23067-23069, 23071-23077, 23090-23099, 23101-23111 및 23122-23127로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열, 또는 상기의 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열.
제1항 또는 제41항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 제21항 또는 제42항의 SAR 폴리펩티드 분자, 제20항의 벡터, 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
제1항 또는 제41항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 제21항 또는 제42항의 SAR 폴리펩티드, 제20항의 벡터, 또는 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 키트.