BR112021000397A2 - Fragmentos de ligação fc que compreendem um sítio de ligação a antígeno cd137 - Google Patents

Fragmentos de ligação fc que compreendem um sítio de ligação a antígeno cd137 Download PDF

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Abstract

fragmentos de ligação fc que compreendem um sítio de ligação a antígeno cd137. a invenção se refere a membros de ligação específicos que se ligam a cd137. os membros de ligação específicos compreendem um sítio de ligação a antígeno cd137 localizado em um domínio constante do membro de ligação específico e tem aplicação no tratamento de câncer e doenças infecciosas, por exemplo.

Description

“FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO FC QUE COMPREENDEM UM SÍTIO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO CD137” Campo da Invenção
[0001] A invenção se refere a membros de ligação específicos que se ligam a CD137. Os membros de ligação específicos compreendem um sítio de ligação a antígeno CD137 localizado em um domínio constante do membro de ligação específico e tem aplicação no tratamento de câncer e doenças infecciosas, por exemplo. Antecedentes da Invenção
[0002] A sinalização celular é uma parte essencial da vida de todos os organismos e normalmente envolve os receptores de superfície celular que interagem com ligantes solúveis ou expressos em superfície. Essa interação resulta em alterações no receptor, no ligante ou em ambos. Por exemplo, ligação de ligante pode induzir alterações de conformação nos receptores fazendo com que os mesmos se agrupem em dímeros ou oligômeros. Esse efeito de agrupamento, então, resulta em ativação de trajetórias de sinalização intracelular. Há diversos receptores que são ativados dessa forma, incluindo membros da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFRSF), como CD137.
[0003] CD137 (4-1BB; TNFRSF9) é uma molécula coestimulatória da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFRSF). CD137 é amplamente conhecido por se regular de modo ascendente em células T CD8+ após a ativação, e também pode ser expresso em células T auxiliadoras CD4+ ativadas, células B, células T regulatórias, células exterminadoras naturais (NK), células
T exterminadoras naturais (NKT) e células dendríticas (DCs) (Bartkowiak & Curran, 2015). O papel funcional principal de CD137 em intensificar a citotoxicidade de célula T foi primeiro descrita em 1997 (Shuford et al., 1997), e logo após isso os mAbs anti-mAbs CD137 propostos como terapias anticâncer.
[0004] CD137 é uma proteína transmembrana com quatro domínios enriquecidos por cisteína extracelular, denominada CRD1-4, e uma região citoplásmica responsável pela sinalização de CD137. O ligante para CD137 é CD137L. Embora nenhuma estrutura de cristal exista para o complexo de CD137/CD137L, é previsto que CD137 forme um complexo de trímero/trímero com CD137L (Won et al., 2010). O engate de CD137L resulta em formação de trímero receptor e agrupamento subsequente de múltiplos trímeros receptores, e resulta na ativação da cascata de sinalização de CD137. Essa cascata de sinalização fornece um sinal de sobrevivência para células T contra morte celular induzida por ativação (Hurtado et al., 1997), dessa forma, desempenhando um papel crítico em sustentar as respostas imunológicas de célula T eficazes e gerando memória imunológica (Bartkowiak & Curran, 2015).
[0005] O papel de CD137 na biologia de leucócito é, de modo geral, bem entendido com uma fundamentação biológica clara por trás de seu papel em imunologia tumoral. CD137 é expresso por células T ativadas e foi usado como um marcador para identificar células T CD4+ e CD8+ específicas de antígeno. Tipicamente, a expressão de CD137 é maior em células T CD8+ que em células T CD4+ (Wen et al., 2002). No caso de células T CD8+, a proliferação, a sobrevivência e a função efetora de citotoxicidade por meio da produção de interferon gama e interleucina-2 foram atribuídas ao agrupamento de CD137. O agrupamento de CD137 também contribui com a diferenciação e a manutenção de células T CD8+ de memória. Em alguns subconjuntos de células T CD4+, o agrupamento de CD137 resulta de modo similar na proliferação e na ativação e resulta na liberação de citocinas como interleucina-2 (Makkouk et al., 2016).
[0006] Demonstrou-se que a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediada por exterminador natural (NK) por meio de mAbs que alveja tumor melhorou como uma consequência do estímulo de CD137 por meio de anticorpos monoclonais anti-CD137 agonísticos in vitro e in vivo (Bartkowiak & Curran, 2015). As células NK ligam anticorpos por meio de seus receptores Fc e, dependendo do isotipo de anticorpo, isso pode resultar em ativação de célula NK, que elicita a liberação de grânulo citotóxico e a lise de células-alvo (Kohrt et al., 2012). Kohrt e colegas demostraram que um anticorpo agonístico anti-CD137 melhorou a atividade antitumoral de anticorpos terapêuticos rituximabe, trastuzumabe e cetuximabe melhorando-se ADCC quando dosado em combinação com o mesmo (Kohrt et al., 2014; Kohrt et al., 2011). Além disso, células NK humanas regulam de modo ascendente a expressão de CD137 após o encontro com anticorpos ligados à célula por meio de seus FcγR. Mostrou-se que o estímulo subsequente dessas células NK com um anticorpo anti-CD137 melhora seu ADCC contra células tumorais (Chester et al., 2015; Chester et al., 2016).
[0007] Os linfócitos B também expressam CD137 mediante a ativação. A ligação de ligante de CD137 ao CD137 melhora a proliferação celular, sobrevivência e produção de citocina. A expressão de CD137 também é induzida em células B humanas normais e malignas após a ligação de CD40 ao seu ligante CD154 (CD40 ligante), resultando em sobrevivência de célula B melhorada se CD137 for subsequentemente ativado. (Vinay e Kwon, 2011).
[0008] Demonstrou-se também que CD137 foi expresso nos subconjuntos reativos a tumor de linfócitos de infiltração de tumor (TILs). Mostrou-se que a monoterapia de CD137 foi eficaz em diversos modelos de tumor imunogênicos pré- clínicos como linfomas de MC38, CT26 e célula B. Demonstrou-se que a combinação de engate de CD137 com outros agentes anticâncer como reguladores de quimioterapia, citocinas e outros reguladores de ponto de checagem resulta em redução de crescimento melhorada de tumores estabelecidos. Especificamente, mostrou-se que a combinação de anticorpos anti-CD137 com anticorpos anti- CD20, anti-EGFR e anti-HER-2 resulta em um efeito sinergístico na redução de crescimento tumoral em vários modelos de xenoenxerto pré-clínicos (Kohrt et al., 2014; Kohrt et al., 2012; Kohrt et al., 2011).
[0009] Mostrou-se que o acoplamento de uma terapia de anticorpo monoclonal de tumor-alvo com tratamento com um anticorpo agonista anti-CD137 promete resultados em modelos pré-clínicos para linfoma (Kohrt et al., 2011), câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal (Kohrt et al., 2014) e câncer de mama (Kohrt et al., 2012). Uma variedade de anticorpos monoclonais que alvejam tumor também foi testada em combinação com anticorpos agonistas de CD137 na clínica,
incluindo o rituximabe de mAb anti-CD20 (NCT01307267, NCT02951156), cetuximabe de mAb anti-EGFR (NCT02110082) e elotuzumabe de mAb anti-CS1 (NCT02252263). No entanto, o desenvolvimento clínico foi desacelerado devido à inflamação de fígado de alto grau dose-limitante associada ao tratamento de anticorpo agonista CD137. Urelumabe (BMS- 663513), um anticorpo isotipo IgG4 humano de bloqueio de não ligante (Chester et al., 2018), foi o primeiro anticorpo anti-CD137 a entrar em testes clínicos, mas esses foram interrompidos após a toxicidade de fígado dependente de dose, no alvo e significativa ter sido observada (Chester et al., 2018). Mais recentemente, os testes clínicos de urelumabe no tratamento de cânceres sólidos foram recomeçados, em que o tratamento com urelumabe foi combinado com radioterapia (NCT03431948) ou com outros anticorpos terapêuticos, como rituximabe (NCT01775631), cetuximabe (NCT02110082), anticorpo anti-PD-1 nivolumabe (NCT02253992, NCT02534506, NCT02845323), e uma combinação de nivolumabe e o anticorpo anti-LAG-3 BMS986016 (NCT02658981). No entanto, para reduzir toxicidade de fígado associada ao tratamento com urelumabe, a dosagem de urelumabe nesses testes teve que ser limitada e os resultados de eficácia foram desapontadores (Chester et al., 2018).
[0010] A toxicidade dose-limitada foi observada com anticorpo anti-CD137 utomilumabe da Pfizer (PF-05082566), um anticorpo isotipo IgG2 humano, na faixa de dose 0,03 mg/kg até 10 mg/kg na Fase I de testes clínicos de câncer avançado (Chester et al. 2016; Segal et al., 2018). No entanto, a taxa de resposta objetiva geral com esse anticorpo foi de apenas 3,8 % em pacientes com tumores sólidos, que indica potencialmente que utomilumabe tem um potencial e eficácia clínica mais fracos que urelumabe, enquanto tem um perfil de segurança mais favorável (Chester et al., 2018; Segal et al., 2018). Utomilumabe foi testado em combinação com radioterapia (NCT03217747) ou quimioterapia, bem como em combinação com outras terapias de anticorpo, incluindo anticorpo anti-PD-L1 avelumabe (NCT02554812), e anticorpo anti-PD-1 pembrolizumabe (NCT02179918), para avaliar a segurança, tolerabilidade, toxicidades dose-limitadas (DLTs), dose máxima tolerada (MTD) e eficácia das combinações de tratamento diferentes. Esses testes estão em andamento em que resultados anteriores mostram nenhum DLTs para doses de até 5 mg/kg e uma taxa de resposta de pacientes de 26 % para uma combinação de utomilumabe e pembrolizumabe. As combinações triplas de utomilumabe com avelumabe e outras terapias imuno-oncológicas também são testadas (NCT02554812, NCT03217747).
[0011] Uma diversidade de moléculas biespecíficas que alvejam CD137 também está em desenvolvimento de estágio inicial, muitas das quais são derivadas de arcabouço com base em não anticorpo ou tecnologia de proteína de fusão. O desenvolvimento de uma molécula biespecífica que alveja CD137 e FAPalpha que usa tecnologia com base em proteína de arcabouço DARPin foi reportado (Link et al., 2018; Reichen et al., 2018). A ativação de célula T por meio de alvejamento de tumor de agonismo de CD137 com o uso de moléculas de DART de HER2 e EphA2 alvejados também foi mostrada (Liu et al., 2017). As proteínas de fusão CD137L que alvejam tumores por meio de FAPalpha ou CD19 em tumores sólidos e linfomas também são desenvolvidas. O CD137 biespecífico mais clinicamente avançado (e o único que contém um anticorpo de comprimento total) é PRS-343, uma molécula biespecífica de CD137/HER2. Nessa molécula, CD137 é ligado por meio de uma proteína de ligação artificial (anticalina) ficada à porção Fc do trastuzumabe de anticorpo que alveja HER2 no formato de IgG4. Relatou-se que PRS-343 fornece ativação dependente de alvo de tumor de CD137 em linfócitos em sítios em que HER2 é superexpresso em um modelo de camundongo humanizado, mas nenhum aprimoramento em inibição de crescimento tumoral ao através do tratamento com trastuzumabe por si só foi observado (Hinner et al., 2016 e documento WO 2016/177802 A1). PRS- 343 recentemente entrou na Fase I de testes clínicos para tratamento de uma faixa de tumores sólidos para avaliar sua segurança, tolerabilidade e eficácia (NCT03330561). Declarações da invenção
[0012] Como explicado na seção de antecedentes acima, o desenvolvimento clínico de moléculas de agonista de CD137 foi mantido devido ao tratamento ser associada à inflamação de fígado de grau alto dose-limitada (urelumabe) ou baixa eficácia clínica (utomilumabe).
[0013] Os presentes inventores reconheceram que há uma necessidade na técnica por moléculas de agonista CD137 que exibem alta atividade, mas não são associadas à inflamação de fígado dose-limitante. Tais moléculas podem ser administradas aos indivíduos em doses que otimizam a potência e, portanto, a eficácia da molécula, e podem ser empregadas no tratamento de câncer como agentes imunoterápicos, por exemplo, ou no tratamento de doenças infecciosas.
[0014] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que as células T presentes no fígado possam ter o potencial para serem ativadas por moléculas agonistas anti-CD137, que resulta em inflamação de fígado. Mostrou-se que as células T CD8+ promovem a inflamação de fígado e a apoptose após sepse/infecção viral (Wesche-Soldato et al., 2007). Mostrou-se que a terapia de anticorpo agonista anti-CD137 em camundongos resultou em infiltração de célula T dependente de CD137 no fígado (Dubrot J et al., 2010). Os resultados desses estudos, quando considerados juntos, indicam que os anticorpos agonistas anti-CD137 com alta atividade, como urelumabe, podem causar infiltração de células T CD8+ ativadas no fígado, portanto, resultando em inflamação de fígado. Alternativamente, a toxicidade de fígado dose-limitante observada com o tratamento com urelumabe pode ser devido à ligação de epítopo particular por esse anticorpo.
[0015] Os presentes inventores realizaram um programa de seleção e maturação por afinidade extensivo para isolar um painel de fragmentos Fc de ligação a antígeno (também chamados “Fcabs” no presente documento) que compreendem um sítio de ligação a CD137 em seus domínios CH3 e se ligam a CD137 dimérico com uma afinidade maior que a CD137 monomérico.
[0016] “Afinidade”, como denominado no presente documento, pode se referir à força da interação de ligação entre uma molécula de anticorpo e seu antígeno cognato, como medido por KD. Como seria prontamente aparente ao elemento versado na técnica, em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para formar múltiplas interações de ligação com um antígeno (por exemplo, em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para se ligar o antígeno de modo bivalente e, opcionalmente, o antígeno é dimérico) a afinidade, como medida por KD, também pode ser influenciada por avidez, em que avidez se refere à força geral de um complexo de anticorpo-antígeno.
[0017] A expressão de CD137 pelas células T é regulada de modo ascendente na ativação. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que devido à alta expressão de CD137 em células T ativadas, CD137 estará na forma de dímeros, trímeros e multímeros de ordem superior na superfície de tais células. Por outro lado, células imunológicas naïve, como células T naïve, expressam níveis baixos ou dispensáveis de CD137 em suas superfícies celulares e qualquer CD137 presente é, portanto, propenso a estar na forma monomérica. Espera-se, portanto, que os Fcabs que se ligam a CD137 dimérico com maior afinidade que a CD137 monomérico, se ligarão preferencialmente a células imunológicas ativadas, como células T ativadas, em oposição a células imunológicas naïve, por exemplo.
[0018] Os Fcabs da invenção também tiveram a capacidade para se ligar a CD137 de cinomolgo dimérico. Isso é benéfico visto que permite que o teste de toxicologia e eficácia seja realizado em macacos cinomolgos durante o desenvolvimento pré-clínico. Isso tem vantagem particular no contexto de moléculas de anticorpo que se ligam a CD137, dado a inflamação de fígado observada com alguns anticorpos anti-CD137. Dois dentre os Fcabs isolados, FS22-053-014 e
FS22-053-017 também se ligaram a CD137 de camundongo. Isso é vantajoso visto que permite que o mesmo Fcab seja testado em camundongos antes da administração a macacos cinomolgos ou humanos. Sob circunstâncias normais um Fcab que se liga a CD137 de camundongo é necessário para esse propósito.
[0019] Os presentes inventores constataram surpreendentemente que as moléculas de Fcab anti-CD137 que se ligaram preferencialmente a CD137 dimérico em vez de monomérico e tiveram a capacidade para serem maturados por afinidade compreenderam o motivo PPY, bem como uma inserção de 5 aminoácidos, na alça AB de seu domínio CH3. Outra linhagem de Fcabs anti-CD137 isolados após a triagem de biblioteca inicial não tinha esses recursos e não teve a capacidade para ser maturada por afinidade e, desse modo, não foi adicionalmente buscada. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a presença do motivo PPY pode promover a formação de uma região de ligação a antígeno estendida formando-se uma estrutura de alça mais rígida ou exposta como resultado da flexibilidade limitada de resíduos de prolina. Alternativamente, a sequência de PPY pode representar um motivo conservado específico envolvido na ligação a CD137, visto que foi demonstrado que sequências ricas em prolina se ligam a sequências aromáticas em proteínas de domínio SH3, por exemplo. Ademais, visto que a sequência de PPY conservado foi selecionada para, independentemente, em duas linhagens separadas de Fcabs, pode ser importante para o epítopo se ligar a CD137. Adicionalmente, uma sequência de LE ou LD conservada estava presente nas alças EF do domínio CH3 da maioria dos Fcabs isolados, sugerindo que essa sequência de aminoácidos também pode ser importante para ligação a CD137.
[0020] Como descrito na seção de fundo acima, a ligação inicial de um ligante CD137 a seu receptor, CD137, inicia uma cadeia de eventos que resultam em trimerização de CD137, seguida por agrupamento de receptores, ativação da trajetória de sinalização intracelular de NFkB e ativação de célula imunológica subsequente. Para um agente terapêutico ativar de modo eficaz CD137, diversos monômeros de CD137 precisam ser ligados de forma a imitar a ligação pelo ligante trimérico.
[0021] Utomilumabe é uma molécula IgG2 e é dependente da reticulação por receptores Fcγ para sua atividade agonista. Urelumabe é uma molécula IgG4 com atividade constitutiva e, assim, não exige reticulação por receptores Fcγ para atividade, embora sua atividade agonista seja intensificada na reticulação por alguns receptores Fcγ. Os receptores Fcγ são encontrados ao longo de todo o corpo humano. A atividade de ativação de célula imunológica de utomilumabe e urelumabe não é, portanto, limitada a sítios particulares no corpo e, desse modo, pode ocorrer no fígado ou outra parte no corpo.
[0022] Os presentes inventores mostraram que os Fcabs da invenção exigem reticulação a fim de agrupar e ativar CD137. No entanto, deve-se observar que esse não é um recurso intrínseco de Fcabs que se ligam a CD137. Em vez disso, diversos dos Fcabs isolados durante o programa de triagem ligados a CD137, mas não exigiu a reticulação para o agrupamento e ativação de CD137 ou induziu agrupamento e ativação de CD137 limitados na ausência de reticulação.
[0023] Como mencionado acima, a reticulação mediada por receptor Fcγ tem a desvantagem de que os receptores Fcγ são encontrados ao longo de todo o corpo humano e, desse modo, a ativação de CD137 não é limitada a um sítio particular. Os presentes inventores, portanto, introduziram mutações no domínio CH2 dos Fcabs para reduzir ou anular a ligação de receptor Fcγ. Desse modo, na ausência de reticulação através de um agente diferente dos receptores Fcγ, os Fcabs da invenção não exibem atividade agonista de CD137 e, desse modo, não é esperado que induzam inflamação de fígado.
[0024] Os presentes inventores reconheceram que os Fcabs anti-CD137 da invenção podem ser usados para preparar moléculas multiespecíficas, por exemplo, biespecíficas, que se ligam a um segundo antígeno além de CD137, como um antígeno tumoral. Preferencialmente, a molécula multiespecífica se liga ao segundo antígeno de modo bivalente, embora seja esperado que quando o segundo antígeno for um antígeno tumoral ligado a célula, a ligação monovalente do antígeno será suficiente para reticular o membro de ligação específico/molécula de anticorpo e induzir o agrupamento e a ativação de CD137. Especificamente, os presentes inventores preparam moléculas de anticorpo que compreendem os Fcabs anti-CD137 da invenção que se ligam a um segundo antígeno de modo bivalente por meio de suas regiões Fab. Os presentes inventores mostraram que tais moléculas de anticorpo biespecíficas têm a capacidade para ativar CD137 condicionalmente na presença do dito segundo antígeno sem a necessidade, por exemplo, por reticulação mediada por receptor Fcγ, como exigido por moléculas de anticorpo convencionais. Acredita-se que a ligação das moléculas de anticorpo ao segundo antígeno causa a reticulação das moléculas de anticorpo no sítio do dito antígeno, que por sua vez resulta no agrupamento e na ativação de CD137 na superfície de célula T. A atividade agonística das moléculas de anticorpo é, portanto, dependente tanto do segundo antígeno quanto do CD137 estarem presentes. Em outras palavras, a atividade agonística é condicional a ambos antígenos que estão presentes. Além disso, acredita- se que a reticulação dos anticorpos na presença do segundo antígeno auxilia no agrupamento de CD137 ligados por meio de sítio de ligação a antígeno de domínio constante da molécula de anticorpo. Quando o segundo antígeno é um antígeno de doença, como um antígeno tumoral, espera-se que as moléculas de anticorpo tenham, portanto, a capacidade para ativar células imunológicas de uma maneira dependente de doença, por exemplo, em um microambiente tumoral. Espera-se que essa ativação de células imunológicas alvejada seja benéfica em evitar a inflamação de fígado observada no tratamento com urelumabe, por exemplo.
[0025] Os presentes inventores também mostraram que moléculas de anticorpo biespecíficas que compreendem um Fcab anti-CD137 da invenção têm a capacidade para suprimir o crescimento tumoral in vivo quando o segundo antígeno ligado pela molécula de anticorpo foi um antígeno de célula imunológica, um antígeno tumoral, ou um antígeno expresso tanto em células tumorais quanto células imunológicas. Adicionalmente, a supressão de crescimento tumoral mais eficaz foi observada com as moléculas de anticorpo biespecífico como em comparação com uma combinação de duas moléculas de anticorpo monoespecífico em que uma das moléculas de anticorpo compreendeu o mesmo domínio constante e a outra molécula de anticorpo o mesmo sítio de ligação de domínio variável que a molécula biespecífica, que demonstra que o agrupamento e sinalização melhorados de CD137, e, desse modo, a ativação de célula T e efeitos antitumorais correspondentes, são observados quando os dois sítios de ligação estão presentes na mesma molécula.
[0026] As moléculas de anticorpo que compreendem um Fcab anti-CD137 da invenção e uma região Fab específica para um segundo antígeno, que preferencialmente se ligam tanto a CD137 quanto ao segundo antígeno de modo bivalente. Isso é vantajoso, visto que se espera que a ligação bivalente de ambos os alvos crie uma ponte entre a célula T que expressa CD137 e o segundo antígeno mais estável e, portanto, estenda o tempo durante o qual a célula T está localizada em um sítio particular, como um microambiente tumoral, e pode atuar na doença, por exemplo, no tumor. Isso é diferente da grande maioria de formatos de anticorpo biespecífico convencionais que são heterodiméricos e que ligam cada antígeno-alvo de modo monovalente por meio de um braço de Fab. Espera-se que tal interação monovalente não seja apenas menos estável, mas em muitos casos seja insuficiente para induzir o agrupamento de receptores TNF como CD137 no primeiro momento.
[0027] Em uma modalidade preferencial alternativa, a molécula de anticorpo compreende Fcabs anti-CD137 da invenção com a capacidade para se ligarem a CD137 de modo bivalente e um sítio de ligação monovalente específico para um segundo antígeno, como um domínio Fab simples. O sítio de ligação monovalente pode se ligar a um antígeno associado a tumor, por exemplo. No contexto de tais moléculas, espera-se que a ligação monovalente do segundo antígeno permita a embalagem mais espessa das moléculas de anticorpo na superfície celular, que resulta em agrupamento melhorado de CD137 e, desse modo, ativação de célula T.
[0028] Um recurso adicional das moléculas de anticorpo que compreendem um Fcab anti-CD137 da invenção é que os dois sítios de ligação a antígeno para CD137 e o segundo antígeno são ambos contidos na própria estrutura de anticorpo. Em particular, as moléculas de anticorpo não exigem que outras proteínas sejam fusionadas à molécula de anticorpo por meio de ligantes ou outros meios para resultar na molécula que se ligam de modo bivalente a ambos os seus alvos. Isso tem uma diversidade de vantagens. Especificamente, as moléculas de anticorpo podem ser produzidas com o uso de métodos similares àqueles empregados para a produção de anticorpos padrão, visto que os mesmos não compreendem quaisquer porções fusionadas. Espera-se também que a estrutura resulte em estabilidade de anticorpo aprimorada, visto que os ligantes podem se degradar com o tempo, o que resulta em uma população heterogênea de moléculas de anticorpo. Tais anticorpos na população que tem apenas uma proteína fusionada podem não ter a capacidade para induzir o agonismo condicional de receptores TNF como CD137 de modo tão eficaz quanto aqueles que têm duas proteínas fusionadas. A clivagem/degradação do ligante pode ocorrer antes da administração ou após a administração do produto terapêutico ao paciente (por exemplo, através de clivagem enzimática ou do pH in vivo do paciente), portanto, que resulta em uma redução de sua eficácia enquanto circula no paciente. Visto que não há ligantes nas moléculas de anticorpo, espera-se que as moléculas de anticorpo retenham o mesmo número de sítios de ligação tanto antes quanto após a administração. Adicionalmente, a estrutura das moléculas de anticorpo também é preferencial a partir da perspectiva de imunogenicidade das moléculas, como a introdução de proteínas fusionadas ou ligantes ou ambos podem induzir a imunogenicidade quando as moléculas são administradas a um paciente, que resulta em eficácia reduzida da terapia.
[0029] Os presentes inventores mostraram adicionalmente que a posição rígida e/ou próxima do CD137 sítios de ligação a antígeno, que resulta da estrutura rígida das moléculas de Fcab da invenção, é vantajosa para induzir agrupamento de CD137 em comparação com as moléculas em que o sítio de ligação a CD137 não é integral à estrutura de anticorpo, mas fornecida, por exemplo, por frações de ligação fixadas, por exemplo, a uma molécula de anticorpo, ou parte da mesma, por meio de ligantes flexíveis.
[0030] Desse modo, a presente invenção fornece:
[1] Um membro de ligação específico que se liga a CD137 e compreende um sítio de ligação a antígeno CD137 localizado em um domínio CH3 do membro de ligação específico, em que o sítio de ligação a antígeno CD137 compreende uma primeira sequência localizada na alça estrutural AB do domínio CH3, em que a dita primeira sequência compreende a sequência de PPY (SEQ ID NO: 10).
[2] O membro de ligação específico, de acordo com [1], em que o membro de ligação específico compreende uma inserção na alça estrutural AB.
[3] O membro de ligação específico, de acordo com [2], em que a dita inserção está entre 1 e 10 aminoácidos em comprimento.
[4] O membro de ligação específico, de acordo com [3], em que a dita inserção está entre 4 e 6 aminoácidos em comprimento.
[5] O membro de ligação específico, de acordo com [4], em que a dita inserção é de 5 aminoácidos de comprimento.
[6] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [2] a [5], em que a inserção está localizada entre as posições 10 e 19 do domínio CH3 do membro de ligação específico, em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT).
[7] O membro de ligação específico, de acordo com [6], em que a inserção está localizada entre as posições 14 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[8] O membro de ligação específico, de acordo com [7], em que a inserção está localizada entre as posições 16 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[9] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [2] a [8], em que a inserção está localizada nas posições 16.5 a 16.1 do domínio CH3 do membro de ligação específico, em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT)
[10] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [9], em que a sequência de PPY está localizada entre as posições 15 e 17 do domínio CH3, e em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[11] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [10], em que a sequência de PPY está localizada entre as posições 16 e 17 do domínio CH3, e em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[12] O membro de ligação específico, de acordo com [11], em que a sequência de PPY está localizada nas posições 16.3,
16.2 e 16.1 do domínio CH3.
[13] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [12], em que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 138; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 129; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 147; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 120; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 156; (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 110; ou (vii) FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 110.
[14] O membro de ligação específico, de acordo com [13], em que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 138; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 129; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 147; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 120; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 156; ou (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 110.
[15] O membro de ligação específico, de acordo com [14], em que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 138; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 129; ou (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 147.
[16] O membro de ligação específico, de acordo com [15], em que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 138.
[17] O membro de ligação específico, de acordo com [10], em que a sequência de PPY está localizada nas posições 16,
16.5 e 16.4 do domínio CH3.
[18] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [10] ou [17], em que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico FS22- 053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22- 053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22- 053-015, FS22-053-016, ou FS22-053, preferencialmente, membro de ligação específico FS22-053-008, apresentado em SEQ ID NO: 19.
[19] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [13] a [16] ou [18], em que a primeira sequência está localizada entre as posições 14 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico, em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[20] O membro de ligação específico, de acordo com [19], em que a primeira sequência está localizada nas posições 15, 16, 16.5, 16.4, 16.3, 16.2 e 16.1 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[21] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [20], em que o membro de ligação específico compreende adicionalmente a segunda sequência localizada na alça estrutural EF do domínio CH3.
[22] O membro de ligação específico, de acordo com [21], em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172- 004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, preferencialmente, membro de ligação específico FS22-172- 003, apresentado em SEQ ID NO: 111.
[23] O membro de ligação específico, de acordo com [21], em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 20; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 29; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 47; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 101; (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 74; (vi) FS22-053-010 apresentado em SEQ ID NO: 38; (vii) FS22-053-012 apresentado em SEQ ID NO: 56; (viii) FS22-053-013 apresentado em SEQ ID NO: 65; (ix) FS22-053-015 apresentado em SEQ ID NO: 83; (x) FS22-053-016 apresentado em SEQ ID NO: 92; ou (xi) FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 174.
[24] O membro de ligação específico, de acordo com [23], em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 20; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 29; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 47;
(iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 101; ou (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 74.
[25] O membro de ligação específico, de acordo com [24], em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 20; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 29; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 47; ou (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 101.
[26] O membro de ligação específico, de acordo com [25], em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO:
20.
[27] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [21] a [26], em que a segunda sequência está localizada nas posições 92 to 98 do domínio CH3 do membro de ligação específico, em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[28] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [27], em que o membro de ligação específico compreende adicionalmente uma terceira sequência localizada na alça CD estrutural do domínio CH3.
[29] O membro de ligação específico, de acordo com [28], em que a terceira sequência está localizada nas posições 43 a 78 do membro de ligação específico, em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[30] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [28] a [29], em que a terceira sequência tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2.
[31] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [30], em que o domínio CH3 é um domínio CH3 de IgG1 humano.
[32] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [16], [19] a [22] e [27] a [31], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 139; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 130; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 148; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 121; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 157; (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 165; ou (vii) FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 112.
[33] O membro de ligação específico, de acordo com [32], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 139; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 130; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 148; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 121; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 157; ou (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 165.
[34] O membro de ligação específico, de acordo com [33], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 139; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 130; ou (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 148.
[35] O membro de ligação específico, de acordo com [34], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 139.
[36] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [10], [17] a [18], [19] a [21] e [23] a
[31] em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 21; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 30; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 48; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 102; (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 75; (vi) FS22-053-010 apresentado em SEQ ID NO: 39; (vii) FS22-053-012 apresentado em SEQ ID NO: 57; (viii) FS22-053-013 apresentado em SEQ ID NO: 66; (ix) FS22-053-015 apresentado em SEQ ID NO: 84; (x) FS22-053-016 apresentado em SEQ ID NO: 93; ou (xi) FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 175.
[37] O membro de ligação específico, de acordo com [36], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 21; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 30; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 48; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 102; ou (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 75.
[38] O membro de ligação específico, de acordo com [37], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 21;
(ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 30; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 48; ou (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 102.
[39] O membro de ligação específico, de acordo com [38], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 21.
[40] O membro de ligação específico, de acordo com [37], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 102.
[41] O membro de ligação específico, de acordo com [37], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 75.
[42] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [41], em que o membro de ligação específico compreende adicionalmente um domínio CH2, preferencialmente, o domínio CH2 de IgG1 humano.
[43] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [42], em que o membro de ligação específico é um dímero de duas cadeias de polipeptídeo idênticas, em que cada uma compreende um domínio CH2 e um domínio CH3.
[44] O membro de ligação específico, de acordo com [42] ou
[43], em que o domínio CH2 tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 6 ou 5.
[45] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [42] a [44], que compreende adicionalmente uma região de dobradiça de imunoglobulina, ou parte da mesma, na terminação N do domínio CH2, preferencialmente, uma região de dobradiça de IgG1 humano, ou parte da mesma.
[46] O membro de ligação específico, de acordo com [45], em que a região de dobradiça tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 179 ou um fragmento da mesma
[47] O membro de ligação específico, de acordo com [46], em que a região de dobradiça tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 7.
[48] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [16], [19] a [22], [27] a [35], e [42] a
[47], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 141, 132, 150, 123, 159, 167 e 114, respectivamente.
[49] O membro de ligação específico, de acordo com [48], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, ou FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 141, 132, 150, 123, 159 e 167, respectivamente.
[50] O membro de ligação específico, de acordo com [49], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, ou FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 141, 132 e 150, respectivamente.
[51] O membro de ligação específico, de acordo com [50], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 141.
[52] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [10], [17] a [18], [19] a [21], [23] a
[31], e [36] a [47], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 23, 32, 50, 104, 77, 41, 59, 68, 86, 95 e 175, respectivamente.
[53] O membro de ligação específico, de acordo com [52], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, ou FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 23, 32, 50, 104 e 77, respectivamente.
[54] O membro de ligação específico, de acordo com [53], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, ou FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 23, 32, 50 e 103, respectivamente.
[55] O membro de ligação específico, de acordo com [54], em que o membro de ligação específico compreende a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 23.
[56] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [55], em que o membro de ligação específico se liga a CD137 humano.
[57] O membro de ligação específico, de acordo com [56], em que o CD137 humano tem, compreende ou consiste na sequência estabelecida em SEQ ID NO: 181.
[58] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [55], em que o membro de ligação específico se liga a CD137 dimérico com maior afinidade que a CD137 monomérico.
[59] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [58], em que o membro de ligação específico se liga a CD137 de cinomolgo.
[60] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com [59], em que o CD137 de cinomolgo tem, compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 183.
[61] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [1] a [60], em que o membro de ligação específico compreende adicionalmente um segundo sítio de ligação a antígeno.
[62] O membro de ligação específico, de acordo com [61], em que membro de ligação específico é uma molécula multiespecífica.
[63] O membro de ligação específico, de acordo com [62], em que membro de ligação específico é uma molécula biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.
[64] O membro de ligação específico, de acordo com [63], em que membro de ligação específico é uma molécula biespecífica.
[65] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [61] a [64], em que o segundo sítio de ligação a antígeno é um sítio de ligação a antígeno com base em CDR.
[66] O membro de ligação específico, de acordo com [65], em que o segundo sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3, e a domínio variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3.
[67] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [61] a [66], em que o segundo sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
[68] O membro de ligação específico, de acordo com qualquer um dentre [61] a [67], em que o membro de ligação específico é uma molécula de anticorpo.
[69] Uma molécula de anticorpo, de acordo com [68], em que a molécula de anticorpo é uma molécula de IgG1 humano.
[70] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [65] a [69], em que o sítio de ligação a antígeno com base em CDR da molécula de anticorpo se liga a um segundo antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em: um antígeno de célula imunológica e um antígeno de doença.
[71] A molécula de anticorpo, de acordo com [70], em que o antígeno de doença é um antígeno tumoral ou um antígeno patogênico.
[72] A molécula de anticorpo, de acordo com [70], em que o antígeno de célula imunológica é uma molécula regulatória imunológica, como PD-L1.
[73] A molécula de anticorpo, de acordo com [70], em que o antígeno de célula imunológica é um membro da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFRSF).
[74] A molécula de anticorpo, de acordo com [71], em que o antígeno tumoral é um antígeno associado a tumor (TAA).
[75] A molécula de anticorpo, de acordo com [71] ou [74], em que o antígeno tumoral é um antígeno de superfície celular em uma célula cancerígena.
[76] A molécula de anticorpo, de acordo com [71], em que o antígeno tumoral é um multímero solúvel.
[77] A molécula de anticorpo, de acordo com [76], em que o multímero solúvel é pelo menos um dímero.
[78] A molécula de anticorpo, de acordo com [77], em que o multímero solúvel é pelo menos um trímero.
[79] A molécula de anticorpo, de acordo com [71], em que o antígeno patogênico é um antígeno bacteriano ou viral.
[80] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [70] a [79], em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para ativar CD137 presente em uma célula imunológica na presença do segundo antígeno.
[81] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [70] a [80], em que a ligação da molécula de anticorpo a CD137 e ao segundo antígeno causa o agrupamento de CD137 na célula imunológica.
[82] A molécula de anticorpo, de acordo com [80] ou [81], em que a célula imunológica é uma célula T.
[83] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [82], em que o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo foi modificado para reduzir ou anular a ou ligação do domínio CH2 do membro de ligação específico ou molécula de anticorpo a um ou mais receptores Fcγ.
[84] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [83] em que o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo não ativa os receptores Fcγ.
[85] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com [83] ou [84], em que o receptor Fcγ é selecionado a partir do grupo que consiste em: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb e FcγRIII.
[86] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [85], em que o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo é conjugado para uma molécula bioativa.
[87] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [85], em que o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo é conjugado para um marcador detectável.
[88] A molécula de ácido nucleico que codifica o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [85].
[89] A molécula de ácido nucleico, de acordo com [88], em que a molécula de ácido nucleico (ou moléculas de ácidos nucleicos) compreende: (i) a sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053- 009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22- 053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 22, 31, 49, 103, 76, 40, 58, 67, 85, 94 e 176, respectivamente; ou (ii) a sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172- 002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22- 172-006, ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 140, 131, 149, 122, 158, 166 e 113, respectivamente.
[90] A molécula de ácido nucleico, de acordo com [88] ou
[89], em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de: membro de ligação específico:
(i) FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22- 053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016 ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 24, 33, 51, 105, 78, 42, 60, 69, 87, 96 e 177, respectivamente; ou (ii) FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22- 172-001, FS22-172-005, FS22-172-006 ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 142, 133, 151, 124, 160, 168 e 115, respectivamente.
[91] A molécula de ácido nucleico, de acordo com [89] ou
[90], em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3, ou a sequência de ácidos nucleicos, de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003; ou (ii) FS22-053-008.
[92] Um vetor que compreende o ácido nucleico, de acordo com qualquer um dentre [88] a [91].
[93] A célula hospedeira recombinante que compreende o ácido nucleico, de acordo com qualquer um dentre [88] a
[91], ou o vetor de [92].
[94] Um método de produção de um membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [85], que compreende cultivar a célula hospedeira recombinante de [93] sob condições para produção do membro de ligação específico ou molécula de anticorpo.
[95] O método de [94] que compreende adicionalmente isolar e/ou purificar o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo.
[96] Uma composição farmacêutica que compreende um membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [87] e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[97] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [87] para uso em um método para o tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
[98] Um método de tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um dentre [1] a [87].
[99] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo para uso, de acordo com [97], ou o método, de acordo com [98] em que o tratamento é o tratamento de câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo.
[10] O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo para uso, de acordo com [97] ou [99], ou o método, de acordo com [98] ou [99], em que o método de tratamento compreende administrar o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo ao indivíduo em combinação com uma segunda terapia. Breve Descrição das Figuras
[0031] Figura 1: As Figuras 1A, B e C mostram um alinhamento das sequências dos domínios CH3 de Fcabs de FS22-053, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-010, FS22- 053-011, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-014, FS22- 053-015, FS22-053-016, FS22-053-017, FS22-172, FS22-172- 001, FS22-172-002, FS22-172-003, FS22-172-004, FS22-172-005 e FS22-172-006, bem como o Fcab do tipo selvagem (WT). Os números dos resíduos, de acordo com os sistemas de numeração IMGT, éxon IMGT (numeração consecutiva), EU e Kabat são indicados. A Figura 1D mostra a porcentagem de identidade de sequência do domínio CH3 de clones FS22-053- 008 a FS22-053-016 e FS22-053-017 (consultar o Exemplo
10.1) em comparação com o domínio CH3 de FS22-053 parental. A Figura 1E mostra a porcentagem de identidade de sequência do domínio CH3 de clones FS22-172-001 a FS22-172-006 em comparação com o domínio CH3 de FS22-053 parental.
[0032] A Figura 2 mostra a sinalização de NF-kB determinada por valores de luminescência como uma medição de produção de luciferase causada por agrupamento e ativação de CD137. Os Fcabs parentais humano anti-CD137 FS22-053 e FS22-172 em formato de mAb2 simulado HelD1.3 acionam agrupamento de CD137 e sinalização de NF-kB limitados quando reticulados com Proteína L em um ensaio de repórter NF-kB de hCD137 de HEK (círculos abertos e preenchidos). Os Fcabs anti-CD137 humano maturados por afinidade FS22-053-008, -009, -011 (quadrados, triângulos e diamantes abertos) e FS22-172-002, -003, -004 (quadrados, triângulos e diamantes preenchidos) em formato de mAb2 simulado HelD1.3 acionam agrupamento de CD137 e sinalização de NF-kB mais fortes quando reticulados com Proteína L em um ensaio de repórter NF-kB de hCD137 de HEK em comparação com os clones parentais. O mAb anti-CD137 humano de controle positivo, 20H4.9, mostrou um aumento em luminescência quando reticulado com Proteína L (linha pontilhada), com um valor de EC50 menor em comparação com os Fcabs anti-CD137 humano maturados por afinidade.
[0033] A Figura 3 mostra a liberação de IL-2 em um ensaio de ativação de célula T na presença de Fcabs anti- CD137 humano. FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011 e FS22-172-002, FS22-172-003, FS22-172-004 em formato de mAb2 PD-L1 (S70 LALA) acionam o agrupamento e a ativação de CD137 apenas quando reticulados com células HEK que superexpressam PD-L1 (símbolos pretos abertos e preenchidos) que resultam em uma liberação de interleucina- 2 de camundongo (mIL-2) em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10. Em concentrações crescentes, o mAb anti-CD137 humano de controle positivo, 20H4.9, mostrou um aumento em liberação de mIL-2 (linha pontilhada), no entanto, a liberação máxima foi significativamente menor que aquela dos Fcabs anti-CD137 humano. Todos os Fcabs anti-CD137 humano em formato de mAb2 modelo PD-L1 sem células HEK que superexpressam PD-L1 para reticulação (símbolos cinza preenchidos) mostram liberação de mIL-2 significativamente menor em comparação com quando reticulados (símbolos pretos abertos e preenchidos).
[0034] A Figura 4 mostra a liberação de IL-2 humano (hIL-2) em um ensaio de ativação de célula T CD8+ primário humano. Os Fcabs anti-CD137 humano maturados por afinidade FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-172-002, FS22-172-003 e FS22-172-004 em formato de mAb2 PD-L1 acionaram a ativação de CD137 de células T CD8+ quando os mAb2 foram reticulados por células HEK que superexpressam PD-L1 que resulta na liberação de IL-2 humano. A atividade dos Fcabs maturados por afinidade foi melhor que a atividade dos Fcabs parentais, FS22-053 (círculos abertos) e FS22-172 (círculos preenchidos). O mAb anti-CD137 humano de controle positivo, 20H4.9 (linha pontilhada), mostrou um aumento em liberação de hIL-2 e houve uma liberação de IL-2 maior que com os Fcabs, no entanto, o valor de EC50 foi maior que aquele de alguns Fcabs anti-CD137 humano, indicando que a melhor atividade foi obtida com alguns Fcabs anti-CD137 humano.
[0035] A Figura 5 mostra a sinalização de NF-kB determinada por valores de luminescência como uma medição de produção de luciferase causada por agrupamento e ativação de CD137. O Fcab CD137 anticamundongo FS22m-063 em formato de mAb2 simulado HelD1.3 acionou o agrupamento de CD137 e a sinalização de NF-kB quando reticulado com Proteína L em a ensaio de repórter NF-kB de mCD137 de HEK (círculos preenchidos). Em concentrações acima de 100 nM, e quando não estiver reticulado com Proteína L, FS22m-063 acionou algum agrupamento de CD137 e sinalização de NF-kB, mas em níveis muito menores que quando reticulado (círculos abertos). O mAb CD137 anticamundongo de controle positivo, Lob12.3, mostrou um aumento em luminescência quando reticulado com Proteína L (quadrados preenchidos), em comparação com não reticulação (quadrados abertos), no entanto, a resposta máxima obtida na concentração de anticorpo mais alta foi significativamente menor que aquela do Fcab CD137 anticamundongo. Como esperado, os controles de isotipo não mostraram atividade.
[0036] A Figura 6 mostra medições de volume tumoral do modelo tumoral singênico MC38 que cresceu subcutaneamente em camundongos C57BL6 tratados com G1-AA/4420 (controle de IgG), G1-AA/S70 (controle positivo de PD-L1), G1-AA/Lob12.3 (controle positivo de CD137), a combinação de G1-AA/S70 mais G1-AA/Lob12.3 e FS22m-063-AA/S70 (o Fcab CD137 anticamundongo FS22m-063 em um formato de mAb2 PD-L1). O volume tumoral médio [em mm3] mais ou menos o Intervalo de Confiança de 95 % é mostrado. FS22m-063-AA/S70 teve a capacidade para significativamente reduzir crescimento tumoral em um modelo tumoral singênico MC38 em comparação com os camundongos tratados com controle de IgG, camundongos tratados com mAb de controle positivo anti-PD- L1, camundongos tratados com controle positivo anti-CD137. A significância estatística mostrou pares para taxas de crescimento ao longo do tempo total do estudo com o uso da Análise de Modelo Misturado. **** valor p ≤ 0,0001
[0037] Figura 7: A mostra medições de volume tumoral do modelo tumoral singênico MC38 que cresceu subcutaneamente em camundongos C57BL/6 tratados com G1-AA/4420 (controle de IgG), G1-AA/F2 (PD-1 controle positivo), G1/Lob12.3 (controle positivo de CD137), a combinação de G1-AA/F2 mais G1-AA/Lob12.3 e FS22m-063-AA/F2 (o Fcab CD137 anticamundongo FS22m-063 em um formato de mAb2 PD-1). O volume tumoral médio [em mm3] mais ou menos o Intervalo de Confiança de 95 % é mostrado. FS22m-063-AA/F2 teve a capacidade para significativamente reduzir o crescimento tumoral em um modelo tumoral singênico MC38 em comparação com camundongos tratados com controle de IgG. A significância estatística mostrou pares para taxas de crescimento ao longo do tempo total do estudo com o uso da Análise de Modelo Misturado. **** valor p ≤ 0,0001. B mostra os mesmos dados que a Figura 7A, exceto pelo fato de que o volume tumoral em cada camundongo tratado é mostrado separadamente. Isso destaca que, exceto por um camundongo, nenhum dos camundongos tratados com FS22m-063-AA/F2 mostrou qualquer novo crescimento tumoral durante o curso do estudo. Por outro lado, o novo crescimento tumoral foi observado nos camundongos tratados com G1-AA/Lob12.3 e G1- AA/F2 para o fim do estudo.
[0038] A Figura 8 mostra medições de volume tumoral médio em um modelo tumoral singênico CT26 positivo para mesotelina subcutâneo (Balb/c). Os camundongos foram tratados com G1-AA/4420 (controle de IgG) ou o mAb² FS22m- 063-AA/FS28m-228. Os camundongos com FS22m-063-AA/FS28m-228 mostraram uma inibição de crescimento tumoral significativa em comparação com camundongos tratados com controle de IgG. O volume tumoral médio [em mm3] de mais ou menos os 95 % de Intervalo de Confiança é plotado. A significância estatística mostrada comparando taxas de crescimento ao longo do tempo total do estudo em pares com o uso da Análise de Modelo Misturado. **** valor p ≤ 0,0001
[0039] A Figura 9 mostra medições de volume tumoral individuais no modelo tumoral singênico CT26.G10 tratados com G1-AA/HelD1.3 (controle de IgG1 humano), FS22m-063- AA/HelD1.3 (Fcab CD137 anticamundongo em formato de mAb2 simulado), FS22m-063-AA/4420 (Fcab CD137 anticamundongo em formato de mAb2 simulado), G1-AA/FS28m-228-010 (mAb MSLN anticamundongo), combinação de FS22m-063-AA/HelD1.3 e G1- AA/FS28m-228-010 (Fcab CD137 anticamundongo mais mAb MSLN anticamundongo), e FS22m-063-AA/FS28m-228-010 (mAb2 anti- CD137/MSLN de camundongo). FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mostrou crescimento tumoral reduzido em comparação com o controle de isotipo, bem como outros grupos de tratamento.
[0040] A Figura 10 mostra uma curva de sobrevivência de Kaplan Meier para o modelo tumoral singênico CT26.G10 tratado com G1-AA/HelD1.3 (controle de IgG), FS22m-063- AA/HelD1.3 (Fcab em formato de mAb2 CD137 anticamundongo), FS22m-063-AA/4420 (Fcab em formato de mAb2 CD137 anticamundongo),G1-AA/FS28m-228-010 (Fab MSLN anticamundongo), combinação de FS22m-063-AA/HelD1.3 e G1- AA/FS28m-228-010 (Fcab CD137 anticamundongo mais Fab MSLN anticamundongo), e FS22m-063-AA/FS28m-228-010 (mAb2 anti- CD137/MSLN de camundongo). Os resultados mostram que o tratamento com FS22m-063-AA/FS28m-228-010 resultou em sobrevivência significativamente aprimorada em comparação com camundongos tratados com o controle de isotipo ou outros grupos de tratamento.
[0041] A Figura 11 mostra camundongo liberação de IL-2 em um ensaio de ativação de célula T CD137 humano de DO11.10 que testa os Fcabs CD137 transreativos de camundongo e humano FS22-053-014 e FS22-053-017 em formato de mAb2 simulado quando reticulado com Proteína L. Ambos os Fcabs tiveram a capacidade para ativar CD137 quando reticulados com Proteína L. O mAb anti-CD137 humano de controle positivo, 20H4.9, mostrou um aumento em liberação de mIL-2 em linha com mAb2 simulado FS22-053-017. Ambos os Fcabs anti-CD137 humano em formato de mAb2 simulado sem Proteína L para reticulação (símbolos abertos) mostraram liberação de mIL-2 insignificante em comparação com quando reticulados (símbolos preenchidos).
[0042] A Figura 12 mostra a liberação de IL-2 de camundongo em um ensaio de ativação de célula T CD137 de camundongo de DO11.10 que testa os Fcabs de CD137 reticulados de camundongo e humano FS22-053-014 e FS22-053- 017 em formato de mAb2 simulado quando reticulados com
Proteína L. Fcab de FS22-053-014 e FS22-053-017, e CD137 anticamundongo FS22m-063, todos no formato de mAb2 simulado HelD1.3, ativaram CD137 quando reticulados com a Proteína L que resulta em uma liberação de mIL-2. O mAb CD137 anticamundongo de controle positivo, Lob12.3, mostrou um aumento em liberação de mIL-2 como esperado. Todos os Fcabs anti-CD137 em formato de mAb2 simulado sem Proteína L para reticulação (linhas pontilhadas) mostraram liberação de mIL-2 amplamente reduzida em comparação com quando foram reticulados. FS22-053-017 teve menor atividade nesse ensaio (EC50 8 vezes pior em comparação com FS22-053-014), mas ainda mostraram atividade no ensaio.
[0043] A Figura 13 mostra modelos de homologia dos Fcabs de FS22 em comparação com o padrão estrutural (PDB ID 5JII) que contém o domínio CH3 de Fc de IgG1 humano do tipo selvagem. As imagens mostram 5JII Fc (A), e estruturas representativas dos Fcabs de FS22-053-008 (B) e FS-172-003 (C). Um domínio CH3 de cada estrutura foi gerado com o uso de uma representação em diagrama de faixa cinza. As alças AB, CD e EF são indicadas por sombreado preto das faixas e são consequentemente identificadas. A estrutura prevista da alça AB é destacada em linhas pontilhadas para fins de comparação, e mostra a protusão causada pelo motivo PPY que provavelmente desempenha um papel importante na ligação.
[0044] A Figura 14 mostra um sensorgrama da cinética de ligação de um Fcab homodimérico (FS22-172-003-AA) em formato de mAb² (isto é, que contém 2 domínios CH3 de ligação a CD137) em comparação com um Fcab heterodimérico em formato de mAb² (que contém 1 domínio CH3 de ligação a CD137 e um domínio CH3 do tipo selvagem). Esse sensorgrama mostra que ambas as moléculas se ligam a CD137, mesmo através de apenas uma cadeia de ligação. As taxas de separação foram diferentes, em que o Fcab homodimérico apresentou um perfil de dissociação muito mais lento, em comparação com o Fcab heterodimérico. Esses sensorgramas demonstraram que o Fcab anti-CD137 pode se ligar a CD137 de modo bivalente.
[0045] A Figura 15 mostra a ligação de anticorpo de controle positivo (G1-AA/20H4.9) e um controle de isotipo anticorpo (G1-AA/HelD1.3) de formato de mAb² simulado (FS22-172-003-AA/HelD1.3) de Fcab anti-CD137 humano a células que se expressa em uma faixa de níveis de CD137 que incluem uma linhagem celular de controle negativo (hCD137neg DO11.10) (A). A ligação foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que embora G1-AA/20H4.9 tivesse a capacidade para se ligar a todas as linhagens celulares que expressam CD137 (B-E), FS22-172-003- AA/HelD1.3 não se ligou à linhagem celular de DO11.10 que expressa baixos níveis de CD137 (B), e que a diferença de vezes na ligação em comparação com o controle positivo foi inversamente proporcional à quantidade de CD137 expresso pela linhagem celular. Descrição Detalhada
[0046] A presente invenção se refere a membros de ligação específicos que se ligam a CD137. CD137 também é conhecido como superfamília de receptor de fator de necrose tumoral membro 9 (TNFRSF9) ou 4-1BB. O membro de ligação específico, preferencialmente, se liga a CD137 humano, mais preferencialmente, CD137 humano e de cinomolgo, ainda mais preferencialmente, CD137 humano e de cinomolgo dimérico. A porção de CD137 ligada pelo membro de ligação específico é, preferencialmente, o domínio extracelular CD137. O domínio extracelular de CD137 humano e de cinomolgo pode compreender ou consistir na sequência estabelecida em SEQ ID NOs 181 e 183, respectivamente. O membro de ligação específico tem, preferencialmente, a capacidade para se ligar a CD137 expresso na superfície de uma célula. A célula é, preferencialmente, uma célula imunológica, como a célula T ou célula T regulatória (Treg) CD8+ ou CD4+, preferencialmente, uma célula T CD8+, ou uma célula B, célula exterminadora natural (NK), célula T exterminadora natural (NKT), célula dendrítica (DC) ou um linfócito de infiltração de tumor (TIL).
[0047] O membro de ligação específico, preferencialmente, se liga a CD137, especialmente. O termo "específico" pode se referir à situação em que o membro de ligação específico não mostrará qualquer ligação significativa a moléculas diferentes de sua parceira (ou suas parceiras) de ligação específica, no presente documento, CD137. O termo “específico” também é aplicável quando o membro de ligação específico é específico para epítopos particulares, como epítopos em CD137, que são portados por vários antígenos, nesse caso, o membro de ligação específico será capaz de se ligar aos vários antígenos que portam o epítopo. O membro de ligação específico, preferencialmente, não se liga, ou não mostra qualquer ligação significativa a CD40, OX40 e/ou GITR.
[0048] Como explicado na seção de antecedentes acima, o tratamento de pacientes com o anticorpo anti-CD137 urelumabe foi associada com inflamação de fígado de alto grau dose-limitante. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a inflamação de fígado observada com tratamento com urelumabe pode ter sido devido à ativação de células T presentes no fígado, ou infiltração e acúmulo de células T ativadas no fígado dos pacientes. A fim de selecionar moléculas com inflamação de fígado reduzida ou sem inflamação de fígado, os presentes inventores selecionaram Fcabs com alta avidez para CD137. Especificamente, os presentes inventores selecionaram Fcabs que se ligam à CD137 dimérico com afinidade maior que CD137 monomérico. A expressão de CD137 por células T é regulada de modo ascendente na iniciação e ativação. Acredita-se que devido à expressão superior de CD137 em células T ativadas, CD137 estará na forma de dímeros, trímeros e multímeros de ordem superior na superfície de tais células. Por outro lado, a expressão de CD137 por células T inativas expressa de forma baixa ou até mesmo indetectável. Acredita-se, portanto, que CD137, na medida em que é expresso em toda a superfície de tais células T, provavelmente está na forma monomérica. Fcabs que se ligam a CD137 com alta avidez se liguem preferencialmente a células T ativadas, em oposição a células T inativas, como células T inativas presentes no fígado, e, portanto, exibam inflamação de fígado reduzida ou sem inflamação de fígado.
[0049] O membro de ligação específico, preferencialmente, se liga a CD137 humano dimérico com uma afinidade (KD) de 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, ou 2 nM, ou com uma afinidade superior.
[0050] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico se liga a CD137 dimérico com uma afinidade maior que CD137 monomérico. Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico se liga a CD137 dimérico com uma afinidade que é pelo menos 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 110 vezes, 120 vezes, 130 vezes, 140 vezes, 150 vezes, 160 vezes, 170 vezes ou 200 vezes maior que a afinidade do membro de ligação específico para CD137 monomérico.
[0051] O CD137 humano pode, por exemplo, ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 183. A sequência é idêntica independentemente de o antígeno estar na forma monomérica ou dimérica.
[0052] Mostrou-se também que os membros de ligação específicos das linhagens de FS22-53 e FS22-172 se ligam a CD137 de cinomolgo dimérico. A ligação a CD137 de cinomolgo, bem como a CD137 humano é benéfica visto que permite testar o membro de ligação específico em macacos cinomolgos quanto a eficácia e toxicidade antes da administração a seres humanos.
[0053] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico pode se ligar a CD137 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) de 250 nM, 200 nM, 150 nM, 140 nM, 120 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, ou 2 nM ou com uma afinidade superior. Preferencialmente, o membro de ligação específico se liga a CD137 de cinomolgo, com uma afinidade (KD) de 2 nM, ou com uma afinidade superior.
[0054] O membro de ligação específico pode se ligar a CD137 humano dimérico e CD137 de cinomolgo dimérico com afinidade similar. Acredita-se que isso seja benéfico para realizar estudos de eficácia e toxicidade com o membro de ligação específico em macacos cinomolgos que podem ser preditivos da eficácia e toxicidade do membro de ligação específico em seres humanos.
[0055] Desse modo, em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico se liga a CD137 de cinomolgo dimérico com uma afinidade que é não maior que 10 vezes, preferencialmente, não maior que 5 vezes menor ou maior que a afinidade com o qual o membro de ligação específico se liga a CD137 humano dimérico.
[0056] O membro de ligação específico pode se ligar a CD137 de camundongo dimérico, CD137 de cinomolgo dimérico e CD137 humano dimérico. Acredita-se que isso seja benéfico visto que o mesmo membro de ligação específico pode ser usado para realizar estudos de eficácia inicial em camundongos, estudos de toxicidade em macacos cinomolgos e testes clínicos em ser humano, desse modo, potencialmente simplificando a trajetória para a clínica. Especificamente, constatou-se surpreendentemente que os membros de ligação específicos FS22-053-014 e FS22-053-017 se ligam a CD137 de camundongo, humano e de cinomolgo dimérico.
[0057] A afinidade de ligação de um membro de ligação específico a um antígeno cognato, como CD137 humano ou de cinomolgo pode ser determinada por ressonância de plasmon de superfície (SPR), como Biacore, por exemplo.
[0058] O termo “membro de ligação específico” descreve uma imunoglobulina, ou fragmento da mesma, que compreende um domínio constante que compreende um sítio de ligação a antígeno CD137. O termo “membro de ligação específico”, como usado no presente documento, desse modo, inclui fragmentos de ligação a antígeno, contato que os ditos fragmentos de ligação a antígeno compreendam um sítio de ligação a antígeno CD137 localizado em um domínio constante do membro de ligação específico. O domínio constante pode ser um domínio CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4, preferencialmente um domínio constante é um domínio CH1, CH2 ou CH3, mais preferencialmente, um domínio CH2 ou CH3, com máxima preferência, um domínio CH3. O membro de ligação específico pode ser produzido parcial ou totalmente de modo sintético.
[0059] De preferência, o membro de ligação específico compreende um domínio CH2 e CH3, em que o domínio CH2 e CH3, de preferência o domínio CH3, compreende um sítio de ligação de antígeno CD137. O membro de ligação específico é, preferencialmente, um dímero de duas cadeias de polipeptídeo (idênticas), em que cada uma compreende um domínio CH2 e um domínio CH3. Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende adicionalmente uma região de dobradiça de imunoglobulina, ou parte da mesma, no N-terminal do domínio CH2. Tal molécula também é chamada no presente documento um fragmento Fc de ligação a antígeno, ou FcabTM. A região de dobradiça pode consistir em ou compreender a sequência apresentada em SEQ ID NO: 179 ou um fragmento da mesma. Preferencialmente, o fragmento é um fragmento C-terminal da sequência apresentada em SEQ ID NO: 179. O fragmento pode ser de até 20, até 10, até 8 ou até 6 aminoácidos em comprimento. O fragmento pode ser pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 aminoácidos em comprimento. Em uma modalidade preferencial, a região de dobradiça tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 7.
[0060] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico é uma molécula de anticorpo, preferencialmente, um anticorpo monoclonal, ou um fragmento da mesma. A molécula de anticorpo é, preferencialmente, humana ou humanizada. A molécula de anticorpo pode ser uma molécula de imunoglobulina G, como uma molécula de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, preferencialmente, uma molécula de IgG1, IgG2 ou IgG4, mais preferencialmente, uma molécula de IgG1, ou um fragmento da mesma.
[0061] Como os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo "molécula de anticorpo" deve ser interpretado como abrangendo fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, seja natural ou total ou parcialmente sintético. Um exemplo de um fragmento de anticorpo que compreende um domínio CH3 é um domínio de Fc de um anticorpo. Um exemplo de um fragmento de anticorpo que compreende tanto sequências de CDR quanto domínio CH3 é um minicorpo, que compreende um scFv unido a um domínio CH3 (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61).
[0062] O membro de ligação específico compreende um sítio de ligação a antígeno CD137. O sítio de ligação a antígeno CD137 está localizado em um domínio constante do membro de ligação específico, preferencialmente, um domínio CH3. O sítio de ligação a antígeno CD137 compreende uma ou mais alças estruturais modificadas em um domínio constante do membro de ligação específico. A modificação genética de alças estruturais de domínio constante de anticorpo para criar sítios de ligação do antígeno para antígenos-alvo é conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Wozniak- Knopp G et al. (2010); documentos WO2006/072620 e
WO2009/132876.
[0063] Seguindo um programa de seleção e maturação por afinidade extensivo, os inventores isolaram dois painéis de Fcabs que preferencialmente se ligaram a CD137 humano dimérico em vez de monomérico. Surpreendentemente, todos os Fcabs isolados compreenderam a sequência de PPY, bem como uma inserção de cinco aminoácidos, em suas alças estruturais AB. Os dois painéis de Fcabs foram selecionados independentemente de campanhas de seleção diferentes, cada uma com o uso de uma biblioteca que compreende uma inserção de cinco aminoácidos na alça AB estrutural. A sequência de PPY foi, portanto, selecionada independentemente duas vezes, indicando a importância dessa sequência para a ligação a CD137. Fcabs anti-CD137 isolados de bibliotecas de Fcab que não compreendem uma inserção de cinco aminoácidos na alça estrutural AB não foram adicionalmente buscados, por exemplo, devido ao fato de os Fcabs selecionados não poderem ser maturados por afinidade. Isso indica que a inserção de aminoácido presente na alça estrutural AB também pode ser importante para ligação a CD137. Desse modo, a presença da sequência de PPY e da inserção de 5 aminoácidos na alça estrutural AB, em que a sequência de PPY pode opcionalmente estar presente completa ou parcialmente na inserção de 5 aminoácidos, pode ser importante para ligação a CD137.
[0064] Desse modo, o sítio de ligação a antígeno CD137 do membro de ligação específico pode compreender uma primeira e/ou segunda sequência, preferencialmente, uma primeira e segunda sequências, em que as primeira e segunda sequências são localizadas nas alças estruturais AB e EF do domínio constante, preferencialmente, o domínio CH3, do membro de ligação específico, respectivamente.
[0065] Em uma modalidade preferencial, os resíduos nas posições 95 e 96 do domínio CH3 do membro de ligação específico são do tipo selvagem, isto é, são, preferencialmente, arginina (R) e triptofano (W), respectivamente. Ambos esses resíduos estão localizados na alça estrutural EF. As posições de resíduo de aminoácido são numeradas no presente documento, de acordo com o esquema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT), salvo caso indicação contrária. O esquema de numeração IMGT é descrito em Lefranc et al., 2005.
[0066] A primeira sequência compreende preferencialmente a sequência de PPY (SEQ ID NO: 10).
[0067] A sequência de PPY pode estar localizada entre as posições 10 e 19, preferencialmente, posições 15 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico. Em uma modalidade preferencial, a sequência de PPY está localizada nas posições 16, 16,5 e 16,4 do domínio CH3. Alternativamente, a sequência de PPY pode estar localizada entre as posições 16 e 17 do domínio CH3. Em uma modalidade alternativa preferencial, a sequência de PPY está localizada nas posições 16,3, 16,2 e 16,1 do domínio CH3. No esquema de numeração IMGT, os resíduos inseridos são numerados de acordo com a direção da alça na qual os mesmos estão localizados. Se a alça for “para cima” os resíduos inseridos assumem o número do resíduo que precede imediatamente a inserção com o número do resíduo inserido na sequência que é indicada por número decimal ascendente, por exemplo, 16, 16,1, 16,2, 16,3, em que há três mutações após o resíduo 16. Se a alça for “para baixo”, os resíduos inseridos assumem o número do resíduo que precede imediatamente a inserção com o número do resíduo inserido na sequência que é indicada por número decimal decrescente, por exemplo, 16, 16,3, 16,2, 16,1, em que novamente há três mutações com resíduo 16 (LeFranc et al., 2005, e LeFranc et al. 2015).
[0068] Em uma modalidade preferencial, a alça estrutural de AB compreende uma inserção de aminoácido. A inserção pode ser de 1 a 10, 2 a 9, 3 a 7, 4 a 6 ou 5 aminoácidos em comprimento. Preferencialmente, a inserção é de 5 aminoácidos em comprimento.
[0069] A inserção pode estar localizada entre as posições 10 e 19, preferencialmente, entre as posições 14 e 17, mais preferencialmente, entre as posições 16 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico. Em uma modalidade preferencial, a inserção está localizada nas posições 16.5 a 16.1 do domínio CH3 do membro de ligação específico, como mostrado na Figura 1.
[0070] A maior parte dos membros de ligação específicos identificados após a maturação de afinidade compreendeu um resíduo de leucina (L) na posição 97 do domínio CH3. Muitos desses membros de ligação específicos também compreenderam um resíduo de ácido aspártico (D) ou resíduo de ácido glutâmico (E) nas posições 98 do domínio CH3 do membro de ligação específico. Ambas essas alterações de aminoácido estão localizadas na alça estrutural EF. Esses resultados sugerem que um ou ambos desses resíduos podem ser importantes para ligação de CD137. Desse modo, a segunda sequência preferencialmente, compreende a sequência LD ou
LE, em que a LD ou LE sequência está, preferencialmente, localizada nas posições 97 e 98 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[0071] A primeira sequência e a segunda sequência podem ser a primeira e segunda sequências do domínio CH3 de: membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, preferencialmente, membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, ou FS22-172-006, mais preferencialmente, membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, ou FS22-172-004, ainda mais preferencialmente, membro de ligação específico FS22-172-003.
[0072] Alternativamente, a primeira sequência e a segunda sequência podem ser as primeira e segunda sequências do domínio CH3 de: membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, ou FS22-053-016, ou FS22-053, preferencialmente, membro de ligação específico FS22-053- 008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, ou FS22-053- 014, mais preferencialmente, membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, ou FS22-053-017, ainda mais preferencialmente, membro de ligação específico FS22-053-008. Em uma modalidade preferencial alternativa, a primeira sequência e a segunda sequência são as primeira e segunda sequências do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-017 ou FS22-053-014, mais preferencialmente, membro de ligação específico FS22-053-
017.
[0073] A sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053- 010, FS22-053-011, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053- 014, FS22-053-015, FS22-053-016, FS22-053-017, FS22-172, FS22-172-001, FS22-172-002, FS22-172-003, FS22-172-004, FS22-172-005, e FS22-172-006 é apresentada em SEQ ID NOs: 175, 21, 30, 39, 49, 58, 66, 75, 84, 93, 102, 112, 121, 130, 139, 148, 157 e 166, respectivamente.
[0074] As primeira e segunda sequências de membro de ligação específico FS22-053, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-010, FS22-053-011, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-014, FS22-053-015, FS22-053-016, FS22-053-017, FS22-172, FS22-172-001, FS22-172-002, FS22-172-003, FS22- 172-004, FS22-172-005, e FS22-172-006 podem ser a sequência entre as posições 14 e 17, e posições 91 e 99, do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-010, FS22-053-011, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-014, FS22-053-015, FS22-053-016, FS22-053-017, FS22-172, FS22-172-001, FS22-172-002, FS22- 172-003, FS22-172-004, FS22-172-005, e FS22-172-006, respectivamente.
[0075] Alternativamente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-010, FS22-053-011, FS22-053-012, e FS22-053-016 podem ser a sequência entre as posições 14 e 17, e posições 92 e 99, do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-010, FS22-053-011, FS22-053-012, e FS22-053-016, respectivamente.
[0076] As primeira e segunda sequências de membro de ligação específico FS22-053-015 podem alternativamente ser a sequência entre as posições 14 e 17, e posições 92 e 98, do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053- 015, respectivamente.
[0077] A sequência de alça CD do membro de ligação específico é, preferencialmente, não modificada, isto é, do tipo selvagem. A sequência de alça de CD, portanto, tem preferencialmente a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2. A sequência de alça CD está, preferencialmente, localizada nas posições 43 a 78 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[0078] As primeira e segunda sequências podem ser a sequências de alça estrutural AB e EF completas, de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172- 004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, FS22-172, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053, respectivamente. A determinação da localização das alças estruturais de AB, CD e EF em uma sequência de domínio CH3, por exemplo, de acordo com os sistemas de numeração IMGT, éxon IMGT, EU ou Kabat, está dentro das capacidades do elemento versado na técnica e é descrita em Hasenhindl et al. (2013). Em uma modalidade preferencial, as alças estruturais AB, CD e EF, de acordo com o sistema de numeração IMGT estão localizadas entre as posições 10 e 19, 42 e 79, e 91 e 102 do domínio CH3 do membro de ligação específico, respectivamente. Em uma modalidade preferencial, as primeira, segunda e terceira sequências são, portanto, as sequência entre as posições 10 e 19, 42 e 79, e 91 e 102 do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009,
FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, FS22-053, FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22- 172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, respectivamente.
[0079] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 141; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 132; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 150; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 123; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 159; (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 167; ou (vii) FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 114; em que as primeira e segunda sequências estão, preferencialmente, localizadas entre as posições 14 e 17, e 91 e 99 do domínio CH3 do membro de ligação específico, respectivamente.
[0080] Em uma modalidade mais preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 141; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 132; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 150; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 123; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 159; ou (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 167.
[0081] Em uma modalidade ainda preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 141; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 132; ou (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 150.
[0082] Em uma modalidade ainda mais preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 141.
[0083] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico, em particular, um membro de ligação específico que compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, a primeira e a segunda, sequência de membro de ligação específico FS22-172-006, pode compreender uma leucina (L) na posição 19 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[0084] Em uma modalidade preferencial alternativa, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 23; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 32; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 50; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 104; (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 77; (vi) FS22-053-010 apresentado em SEQ ID NO: 41; (vii) FS22-053-012 apresentado em SEQ ID NO: 59;
(viii) FS22-053-013 apresentado em SEQ ID NO: 68; (ix) FS22-053-015 apresentado em SEQ ID NO: 86; (x) FS22-053-016 apresentado em SEQ ID NO: 95; ou (xi) FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 15; em que as primeira e segunda sequências estão, preferencialmente, localizadas entre as posições 14 e 17, e 91 e 99 do domínio CH3 do membro de ligação específico, respectivamente.
[0085] Em uma modalidade mais preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 23; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 32; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 50; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 104; ou (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 77.
[0086] Em uma modalidade ainda mais preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências do domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 23; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 32; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 50; ou (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 104.
[0087] Em uma modalidade ainda mais preferencial, o membro de ligação específico compreende a primeira e/ou segunda, preferencialmente, as primeira e segunda sequências de membro de ligação específico FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 23.
[0088] Como uma alternativa à numeração IMGT, as posições de resíduo de aminoácido, que incluem a posição de sequências de aminoácido, substituições, deleções e inserções, como descrito no presente documento, podem ser numeradas de acordo com numeração éxon IMGT (também denominada numeração consecutiva), numeração EU, ou numeração Kabat. A concordância entre numeração IMGT, numeração éxon IMGT, numeração EU, e numeração Kabat do posições de resíduo do domínio CH3 são mostradas na Figura
1. Desse modo, por exemplo, em que o presente pedido se refere à primeira sequência que está localizada entre as posições 14 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico, respectivamente, em que as posições de resíduo são numeradas de acordo com o esquema de numeração IMGT, a primeira sequência está localizada entre as posições 18 e 21 do domínio CH3, em que as posições de resíduo são numeradas de acordo com o esquema de numeração éxon IMGT, como mostrado na Figura 1. Alternativamente, a posição de aminoácido resíduos no domínio CH3, que inclui a posição de sequências de aminoácido, substituições, deleções e inserções no domínio CH3, como descrito no presente documento, pode ser definida por referência a sua posição na sequência do tipo selvagem de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 4. A concordância entre numeração IMGT e a sequência do tipo selvagem de domínio CH3 também é mostrada na Figura 1.
[0089] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende um domínio CH3 que compreende, tem ou consiste na sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002,
FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, preferencialmente, a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, ou FS22-172-006, mais preferencialmente, a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, ou FS22-172-004, ainda mais preferencialmente, a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003.
[0090] Em uma modalidade preferencial alternativa, o membro de ligação específico compreende um domínio CH3 que compreende, tem ou consiste na sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053, preferencialmente, a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, ou FS22-053-014, mais preferencialmente, a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053- 011, ou FS22-053-017, ainda mais preferencialmente, a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008.
[0091] O domínio CH3 do membro de ligação específico pode opcionalmente compreender um resíduo de lisina adicional (K) na C-terminal imediato da sequência de domínio CH3.
[0092] É possível considerar anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Essas técnicas podem envolver a introdução das CDRs, ou regiões variáveis, em uma imunoglobulina diferente. A introdução das CDRs de uma imunoglobulina em outra imunoglobulina é descrita, por exemplo, nos documentos EP-A-184187, GB 2188638A e EP-A-239400. Técnicas similares podem ser empregadas para introduzir o domínio constante sequências que compõe o sítio de ligação a antígeno CD137 de um membro de ligação específico, de acordo com a invenção em um domínio constante, por exemplo, um domínio CH3, de outro membro de ligação específico, portanto, resultando em um membro de ligação específico que compreende um sítio de ligação a antígeno CD137 em seu domínio constante. Alternativamente, uma sequência domínio constante inteira de um membro de ligação específico pode ser substituída com a sequência de domínio constante de um membro de ligação específico, de acordo com a invenção, para preparar um membro de ligação específico que compreende um sítio de ligação a antígeno CD137 em seu domínio constante. De modo similar, um fragmento da sequência de domínio constante de um membro de ligação específico pode ser substituído com um fragmento correspondente de uma sequência de domínio constante de um membro de ligação específico, de acordo com a invenção, que compreende o sítio de ligação a antígeno CD137.
[0093] O domínio CH2 do membro de ligação específico pode compreender uma ou mais mutações que reduzem ou anulam a ligação do domínio CH2 a um ou mais receptores Fcγ, como FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, e/ou a complemento. Os inventores postularam que reduzir ou anular a ligação aos receptores Fcγ diminuirá ou eliminará ADCC mediado pelo membro de ligação específico. De modo similar, espera-se que reduzir ou anular a ligação ao complemento reduza ou elimine CDC mediado pelo membro de ligação específico. As mutações para diminuir ou anular a ligação do domínio CH2 a um ou mais receptores Fcγ e/ou complemento são conhecidas na técnica (Wang et al., 2018). Essas mutações incluem a "mutação LALA" descrita em Bruhns et al., 2009 e Hezareh et al., 2001, que envolve a substituição dos resíduos de leucina nas posições IMGT 1,3 e 1,2 do domínio CH2 com alanina (L1.3A e L1.2A). Alternativamente, a geração de anticorpos de a-glicosil através de mutação do sítio de glicosilação ligado por N conservado mutacionando-se a aparagina (N) na posição IMGT 84,4 do domínio CH2 para alanina, glicina ou glutamina (N84.4A, N84.4G ou N84.4Q) também é conhecida por diminuir a função de efetor de IgG1 (Wang et al., 2018). Como uma alternativa adicional, a ativação de complemento (ligação de C1q) e ADCC são conhecidos por serem reduzidos através de mutação da prolina na posição IMGT 114 do domínio CH2 para alanina ou glicina (P114A ou P114G) (Idusogie et al., 2000; Klein et al., 2016). Essas mutações também podem ser combinadas a fim de gerar membros de ligação específicos com atividade de ADCC ou CDC adicionalmente reduzida ou nenhuma atividade.
[0094] Desse modo, o membro de ligação específico pode compreender um domínio CH2, em que o domínio CH2 preferencialmente compreende: (i) resíduos de alanina nas posições 1.3 e 1.2; e/ou (ii) uma alanina ou glicina na posição 114; e/ou (iii) uma alanina, glutamina ou glicina na posição
84,4; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[0095] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende um domínio CH2, em que o domínio CH2 preferencialmente, compreende: (i) resíduos de alanina nas posições 1.3 e 1.2; e/ou (ii) uma alanina ou glicina na posição 114; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[0096] Em outra modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende um domínio CH2, em que o domínio CH2 compreende: (i) um resíduo de alanina na posição 1.3; e (ii) um resíduo de alanina na posição 1.2; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[0097] Por exemplo, o domínio CH2 pode ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 6. [LALA]
[0098] Em uma modalidade preferencial alternativa, o membro de ligação específico compreende um domínio CH2, em que o domínio CH2 compreende: (i) um resíduo de alanina na posição 1.3; (ii) um resíduo de alanina na posição 1.2; e (iii) uma alanina na posição 114; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.
[0099] Por exemplo, o domínio CH2 pode ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 5. [LALA-PA]
[0100] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende, tem ou consiste em: a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22- 172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, preferencialmente, a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, ou FS22-172-006, mais preferencialmente, a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, ou FS22-172-004, ainda mais preferencialmente, a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-172- 003, em que a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172- 004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, e FS22-172 é mostrado na SEQ ID NOs 141, 132, 150, 123, 159, 167, e 114, respectivamente, que começa em aminoácido 7 em diante.
[0101] Em uma modalidade preferencial alternativa, o membro de ligação específico compreende, tem ou consiste em: a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22- 053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22- 053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053, preferencialmente, a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, ou FS22-053-014, mais preferencialmente, a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, ou FS22-053-017, ainda mais preferencialmente, a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, em que a sequência de domínio CH2 e CH3 de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22- 053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22- 053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, e FS22-053 é mostrado na SEQ ID NOs 23, 32, 50, 104, 77, 41, 59, 68, 86, 95 e 15 respectivamente, que começa em aminoácido 7 em diante.
[0102] Em uma modalidade preferencial alternativa, o membro de ligação específico compreende, tem ou consiste na sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053, preferencialmente, a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, ou FS22-053-014, mais preferencialmente, a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, ou FS22-053-017, ainda mais preferencialmente, a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, em que a sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, e FS22-053 é apresentado em SEQ ID NOs 23, 32, 50, 104, 77, 41, 59, 68, 86, 95, e 15, respectivamente.
[0103] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico pode compreender um ou mais sítios de ligação a antígeno adicionais que se ligam a um ou mais antígenos adicionais, além do sítio de ligação a antígeno CD137 localizado no domínio constante do membro de ligação específico. O um ou mais sítios de ligação a antígeno adicionais, preferencialmente, se ligam a seus antígenos cognatos, especificamente.
[0104] O um ou mais sítios de ligação a antígeno adicionais podem se ligar a CD137 ou outro antígeno. O membro de ligação específico pode, desse modo, ser uma molécula multiespecífica, por exemplo, uma molécula biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica, preferencialmente, uma molécula biespecífica. Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico tem a capacidade para se ligar simultaneamente a CD137 e a um ou mais antígenos adicionais.
[0105] As moléculas de anticorpo são conhecidas por ter uma arquitetura modular que compreende domínios distintos, que podem ser combinados em uma variedade de formas diferentes para criar formatos de anticorpo multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, triespecíficos ou tetraespecíficos. Os formatos de anticorpo multiespecíficos exemplificativos são descritos em Spiess et al. (2015) e Kontermann (2012), por exemplo. Os membros de ligação específicos da presente invenção podem ser empregados em tais formatos de anticorpo multiespecíficos. Isso tem a vantagem adicional de introduzir um sítio de ligação a antígeno adicional em tal formato de anticorpo multiespecífico através da presença do sítio de ligação a antígeno do domínio constante, por exemplo, o domínio CH3, do membro de ligação específico.
[0106] Por exemplo, o membro de ligação específico da invenção pode ser uma molécula de anticorpo heterodimérica, como uma molécula de imunoglobulina completa heterodimérica, ou um fragmento da mesma. Nesse caso, uma parte da molécula de anticorpo terá uma sequência ou sequências, como descrito no presente documento. Por exemplo, em que o membro de ligação específico da invenção é uma molécula de anticorpo heterodimérica biespecífica, o membro de ligação específico pode compreender uma cadeia pesada que compreende um domínio CH3, como descrito no presente documento pareado com uma cadeia pesada que se liga a um antígeno diferente de CD137. As técnicas para preparar anticorpos heterodiméricos são conhecidas na técnica e incluem tecnologia botões em orifícios [knobs- into-holes] (KIHs), que envolve modificar geneticamente os domínios CH3 de uma molécula de anticorpo para criar um “botão (knob)” ou um “orifício (hole)” para promover a heterodimerização de cadeia. Alternativamente, anticorpos heterodiméricos podem ser preparados através da introdução de pares de carga na molécula de anticorpo para evitar a homodimerização de domínios CH3 por repulsão eletrostática e para direcionar a heterodimerização por atração eletrostática. Exemplos de formatos de anticorpo heterodimérico incluem CrossMab, mAb-Fv, SEED-corpo, e IgG KIH.
[0107] Alternativamente, um membro de ligação específico multiespecífico da invenção pode compreender uma molécula de imunoglobulina completa ou um fragmento da mesma e uma fração ou frações de ligação a antígeno adicionais. A fração de ligação a antígeno pode, por exemplo, ser um anticorpo de domínio Fv, scFv ou único, e pode ser fusionada à molécula de imunoglobulina completa ou um fragmento da mesma. Exemplos de moléculas de anticorpo multiespecíficas que compreendem frações de ligação a antígeno adicionais fusionadas a uma molécula de imunoglobulina completa incluem moléculas de DVD-IgG, DVI- IgG, scFv4-IgG, IgG-scFv, e scFv-IgG (Spiess et al., 2015; Figura 1). Exemplos de moléculas de anticorpo multiespecíficas que compreendem frações de ligação a antígeno adicionais fusionadas a um fragmento de imunoglobulina que compreendem um domínio CH3 incluem scDiacorpo-CH3, Diacorpo-CH3, e KIH scFv-CH3, por exemplo (Spiess et al., 2015; Figura 1).
[0108] Outros formatos multiespecíficos adequados seriam prontamente evidentes ao elemento versado na técnica.
[0109] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico compreende um segundo sítio de ligação a antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo sítio de ligação a antígeno preferencialmente, é um sítio de ligação a antígeno com base em CDR. Um sítio de ligação a antígeno à base de CDR é um sítio de ligação a antígeno em uma região variável de anticorpo. Um sítio de ligação a antígeno com base em CDR é formado por seis CDRs; três CDRs de domínio variável de cadeia leve (VL) CDRs e três CDRs de domínio variável de cadeia pesada (VH).
[0110] A preparação de moléculas de anticorpo contra um determinado antígeno e a determinação das sequências de CDR de tais moléculas de anticorpo, é bem estabelecida e muitas técnicas adequadas são conhecidas na técnica. As sequências de CDR podem, por exemplo, ser determinadas de acordo com Kabat et al., 1991 ou o sistema de informações internacional ImMunoGeneTics (IMGT) (Lefranc et al., 2015).
[0111] Por exemplo, o membro de ligação específico pode ser um anticorpo biespecífico de mAb2 (TM). Um anticorpo biespecífico mAb2 (TM), como denominado no presente documento, é uma imunoglobulina IgG que inclui um sítio de ligação a antígeno com base em CDR em cada uma de suas regiões variáveis e pelo menos um sítio de ligação a antígeno em um domínio constante. Quando o membro de ligação específico da invenção está em um formato de mAb2, o membro de ligação específico, desse modo, compreende um sítio de ligação a antígeno com base em CDR em cada uma de suas regiões variáveis, além de um sítio de ligação a antígeno CD137 em um domínio constante do membro de ligação específico.
[0112] As três CDRs de domínio VH do sítio de ligação a antígeno podem estar localizadas em um domínio VH de imunoglobulina e as três CDRs de domínio VL podem estar localizadas em um domínio VL de imunoglobulina. Por exemplo, o sítio de ligação a antígeno à base de CDR pode estar localizado em uma região variável de anticorpo.
[0113] O membro de ligação específico pode ter um ou, preferencialmente, mais que um, por exemplo, dois, sítios de ligação a antígeno com base em CDR para o segundo antígeno. O membro de ligação específico desse modo, pode compreender um domínio VH e um domínio VL, mas, preferencialmente, compreende dois domínios VH e dois domínios VL, isto é, dois pares de domínio VH/VL, como é o caso em moléculas de IgG de ocorrência natural.
[0114] Em algumas modalidades preferenciais, o membro de ligação específico pode ser uma imunoglobulina que compreende duas regiões variáveis, em que cada região variável compreende um sítio de ligação a antígeno com base em CDR para o segundo antígeno.
[0115] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo é,
desse modo, uma molécula de anticorpo que se liga a CD137 e um segundo antígeno, em que a molécula de anticorpo compreende: (i) dois sítios de ligação a antígeno para CD137 localizados nos dois domínios CH3 da molécula de anticorpo; e (ii) dois sítios de ligação a antígeno com base em CDR para o segundo antígeno, em cada um é formado por um domínio VH de imunoglobulina e um domínio VL de imunoglobulina.
[0116] Em uma modalidade mais preferencial, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina completa, por exemplo, uma molécula de IgG1 completa, que se liga a CD137 e um segundo antígeno, em que a molécula de anticorpo compreende: (i) dois sítios de ligação a antígeno para CD137 localizados nos dois domínios CH3 da molécula de anticorpo; e (ii) dois sítios de ligação a antígeno com base em CDR para o segundo antígeno, em que cada um é formado por um domínio VH de imunoglobulina e um domínio VL de imunoglobulina; e em que a molécula de imunoglobulina compreende adicionalmente domínios CH1, CH2 e CL.
[0117] A ativação de CD137 exige o agrupamento de CD137 na superfície de célula imunológica, por exemplo, a superfície de célula T, que, por sua vez, estimula trajetórias de sinalização intracelular e ativação de célula imunológica. A ligação de membros de ligação específicos a CD137 na superfície de célula imunológica na ausência de reticulação dos membros de ligação específicos pode não fazer com que CD137 forme agrupamentos, e, consequentemente, pode não resultar na ativação de célula imunológica.
[0118] Os presentes inventores mostraram que os membros de ligação específicos das linhagens FS22-53 e FS22-172 não causam a ativação de célula T na ausência de reticulação do membro de ligação específico (consultar o Exemplo 5).
[0119] Como explicado acima, a reticulação de moléculas de anticorpo através da ligação a receptores Fcγ é ineficaz e não pode ser alvejada a uma local particular, por exemplo, o sítio de uma doença, visto que as células que expressam receptor Fcγ estão presentes ao longo de todo o corpo humano. O segundo antígeno ligado pelo segundo sítio de ligação a antígeno, portanto, preferencialmente não é um receptor Fcγ.
[0120] Em uma modalidade preferencial, os membros de ligação específicos da invenção, portanto, compreendem um segundo sítio de ligação a antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno tem a capacidade para se ligar e reticular múltiplos membros de ligação específicos.
[0121] Por exemplo, os presentes inventores mostraram que quando o segundo antígeno for uma molécula multimérica, a ligação do membro de ligação específico ao segundo antígeno resulta em, ou melhora, ativação de célula T. O segundo antígeno é, portanto, preferencialmente um antígeno multimérico, como um dímero, trímero ou multímero de ordem superior, e, desse modo, tem a capacidade para reticular diversos membros de ligação específicos.
[0122] Os presentes inventores também mostraram, com o uso de moléculas de CD137/segundo mAb2 antígeno, que quando o segundo antígeno é um antígeno de superfície, como um antígeno de superfície celular, que pode ser monomérico ou multimérico e está presente em altas concentrações e/ou agrupado em uma superfície, por exemplo, uma superfície celular, a ligação da molécula de anticorpo ao segundo antígeno resulta em, ou melhora, ativação de célula T. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a ligação da molécula de anticorpo a um antígeno de superfície celular abundante, por exemplo, resulta em uma alta concentração de moléculas de anticorpo ligadas à superfície celular que coloca as moléculas de anticorpo em proximidade suficiente para ter a capacidade para acionar o agrupamento de CD137 e a ativação de célula imunológica. Em uma modalidade preferencial, o segundo antígeno é, portanto, um antígeno de superfície que é expresso em uma alta concentração em uma superfície, por exemplo, uma superfície celular.
[0123] Um membro de ligação específico que compreende um segundo sítio de ligação a antígeno que se liga a um segundo antígeno, como descrito no presente documento, e que ativa células imunológicas, como células T, apenas na ligação ao segundo antígeno, ou cuja atividade de ativação de célula imunológica é melhorada na ligação ao segundo antígeno, também é denominado agonista condicional. Essa atividade de ativação de célula imunológica na ligação ao segundo antígeno é independente de ligação do membro de ligação específico a receptores Fcγ e/ou agentes de reticulação externos, como proteína A ou G ou anticorpos secundários, e, portanto, permite que a atividade de agonista condicional do membro de ligação específico seja alvejada para sítios em que o segundo antígeno esteja presente. Por exemplo, quando o segundo antígeno é um antígeno de doença, o membro de ligação específico pode ativar a célula imunológica seletivamente no sítio de doença e não em outro lugar em um indivíduo.
[0124] Além disso, um membro de ligação específico que ativa células imunológicas, como células T, apenas na ligação a um segundo antígeno, preferencialmente, tem atividade de ativação de célula imunológica aumentada em comparação com membros de ligação específicos que dependem da reticulação por outros mecanismos, como agentes de reticulação externos, ou reticulação por meio de interação de receptor Fcγ. Devido a ativação de CD137 ser mais eficaz, a ativação de célula imunológica pode ser obtida em concentrações menores de membros de ligação específicos descritos no presente documento com relação a outros membros de ligação específicos.
[0125] Desse modo, o membro de ligação específico da invenção preferencialmente induz a ativação aumentada de células imunológicas, como células T, quando o membro de ligação específico é reticulado, por exemplo, através da ligação a um segundo antígeno, que quando o membro de ligação específico não é reticulado.
[0126] A habilidade de uma molécula de anticorpo ou membro de ligação específico para ativar células T pode ser medida com o uso de um ensaio de ativação de célula T. As células T liberam IL-2 na ativação. Um ensaio de ativação de célula T pode, portanto, medir a liberação de IL-2 para determinar o nível de ativação de célula T induzido pela molécula de anticorpo ou membro de ligação específico.
[0127] Por exemplo, a habilidade da molécula de anticorpo ou membro de ligação específico para ativar células T pode ser determinada medindo-se a concentração da molécula de anticorpo ou membro de ligação específico exigida para obter metade da liberação máxima de IL-2 pelas células T em um ensaio de ativação de células T quando o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo é reticulado. Isso é denominado EC50 da molécula de anticorpo ou membro de ligação específico abaixo. Um EC50 menor indica que uma concentração menor da molécula de anticorpo ou membro de ligação específico é necessária para obter a metade da liberação máxima de IL-2 pelas células T no ensaio de ativação de células T, e, desse modo, que a molécula de anticorpo ou membro de ligação específico tem uma atividade de ativação de célula T maior. O membro de ligação específico ou molécula de anticorpo pode ser reticulado com o uso de um anticorpo anti-CH2, por exemplo.
[0128] Em uma modalidade preferencial, a molécula de anticorpo ou membro de ligação específico tem um EC50 em um ensaio de ativação de célula T que está dentro de 10 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes ou 2 vezes do EC50 de FS22-172- 003/HelD1.3 (que compreende a mutação LALA) no mesmo ensaio, em que FS22-172-003/HelD1.3 (LALA) consiste em ou compreende a cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 145 e a cadeia leve apresentado em SEQ ID NO: 173.
[0129] Em uma modalidade preferencial alternativa, a molécula de anticorpo ou membro de ligação específico tem um EC50 em um ensaio de ativação de célula T que está dentro de 10 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, ou 2 vezes do EC50 de FS22-053-008/HelD1.3 (que compreende a mutação
LALA) no mesmo ensaio, em que FS22-053-008/HelD1.3 (LALA) consiste em ou compreende a cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 27 e a cadeia leve apresentado em SEQ ID NO:
173.
[0130] Por exemplo, a molécula de anticorpo ou membro de ligação específico pode ter um EC50 em um ensaio de ativação de célula T de 5 nM ou menos, 4 nM ou menos, 3 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1 nM ou menos, ou 0,5 nM ou menos.
[0131] Além disso, ou alternativamente, a habilidade de uma molécula de anticorpo ou membro de ligação específico para ativar as células T pode ser determinada medindo-se a concentração máxima de IL-2 liberada pelas células T em um ensaio de ativação de célula T na presença da molécula de anticorpo ou membro de ligação específico, em que a molécula de anticorpo ou membro de ligação específico é reticulado.
[0132] Em uma modalidade preferencial, a concentração máxima de IL-2 liberada pelas células T em um ensaio de ativação de célula T na presença da molécula de anticorpo ou membro de ligação específico na presença de reticulação está dentro de 3 vezes, 2 vezes, ou 1,5 vez da concentração máxima de IL-2 liberada pelas células T na presença de FS22-053-008/HelD1.3 (que compreende a mutação LALA) ou FS22-172-003/HelD1.3 (que compreende a mutação LALA).
[0133] A ensaio de ativação de célula T pode ser um ensaio de célula T como descrito no presente documento, como um ensaio de célula T CD8+, como descrito nos presentes Exemplos, consultar, por exemplo, Exemplo 5.4.
[0134] Por exemplo, um ensaio de ativação de célula T pode ser um ensaio de liberação de IL-2 com base em células
T CD8+ isoladas das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) humanas. Por exemplo, o ensaio de ativação de célula T pode compreender isolar PBMCs humanas dos cones de depleção de leucócito. Métodos para isolar PBMCs são conhecidos na técnica e descritos nos presentes exemplos. As células T CD8+ podem, então, ser isoladas das PBMCs. Os métodos para isolar células T CD8+ de PBMCs são conhecidos na técnica e descritos nos presentes exemplos.
[0135] As células T CD8+ pode, então, ser adicionadas a placas de múltiplas paredes revestidas com um anticorpo anti-CD3 humano. Uma diluição adequada de cada molécula de anticorpo ou membro de ligação específico testado pode ser preparada e adicionada aos poços. As células T podem, então, ser incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 24 horas com o anticorpo de teste. Os tensoativos podem ser coletados e ensaiados para determinar a concentração de IL-2 no tensoativo. Métodos para determinar a concentração de IL-2 em uma solução são conhecidos na técnica e descritos nos presentes exemplos. A concentração de IL-2 humano pode ser plotada versus a concentração de log da molécula de anticorpo ou do membro de ligação específico. As curvas resultantes podem ser ajustadas com o uso do log (agonista) versus equação de resposta.
[0136] O segundo antígeno ligado pelo segundo sítio de ligação a antígeno do membro de ligação específico pode ser um antígeno de célula imunológica, ou um antígeno de doença. Antígenos de doença incluem antígenos patogênicos e antígenos tumorais.
[0137] O antígeno de célula imunológica ligado pelo membro de ligação específico pode estar presente na mesma célula imunológica ou em uma célula imunológica diferente a CD137.
[0138] O antígeno de célula imunológica pode ser um membro da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFRSF) diferente de CD137. Os receptores de TNFRSF são receptores de citocina ligados a membrana que compreendem um domínio rico em cisteína extracelular que se liga a um ou mais ligantes da superfamília de fator de necrose tumoral (TNFSF).
[0139] O receptor de TNFRSF pode estar localizado na superfície de uma célula imunológica. Mediante a ligação de um ligante de TNFRSF, os receptores de TNFRSF formam agrupamentos na superfície de célula imunológica que ativam a célula imunológica. Por exemplo, receptores de TNFRSF ligados por ligantes podem formar multímeros, como trímeros, ou agrupamentos de multímeros. A presença de agrupamentos de receptores de TNFRSF ligados por ligante estimula trajetórias de sinalização intracelular que ativam a célula imunológica.
[0140] Sem desejar se ligar por teoria acredita-se que engatando-se tanto CD137 quanto um segundo receptor de TNFRSF em uma superfície de célula imunológica, os membros de ligação específicos farão com que tanto CD137 quanto o segundo receptor de TNFRSF se agrupem e ativem a célula imunológica (ou células imunológicas). Em outras palavras, o membro de ligação específico atuará como um agonista de receptor de TNFRSF quando ambos os alvos forem ligados.
[0141] Os receptores de TNFRSF incluem CD27, CD40, EDA2R, EDAR, FAS, LTBR, RELT, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF4, TNFRSF6B, TNFRSF8, TNFRSF10A-10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B,
TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21 e TNFRSF25.
[0142] CD27 (TNFRSF7: ID de Gene 939) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001233.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001242.4. CD40 (TNFRSF5: ID de Gene 958) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001241.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001250.5. EDA2R (TNFRSF27: ID de Gene 60401) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001186616.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001199687.2. EDAR (ID de Gene 10913) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_071731.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_022336, 3. FAS (TNFRSF6: ID de Gene 355) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_000034.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000043.5. LTBR (TNFRSF3: ID de Gene 4055) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001257916.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001270987.1. RELT (TNFRSF19L: ID de Gene 84957) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_116260.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_032871.3. TNFRSF1A (ID de Gene 7132) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001056.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001065.3. TNFRSF1B (ID de Gene 7133) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001057.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de
NM_001066.2.
[0143] TNFRSF4 (ID de Gene 7293) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_003318 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_003327). TNFRSF6B (ID de Gene 8771) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_003814.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_003823.3. TNFRSF8 (ID de Gene 943) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001234.3 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001243.4. TNFRSF10A (ID de Gene 8797) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_003835.3 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_003844.3. TNFRSF10B (ID de Gene 8795) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_003833.4 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_003842.4. TNFRSF10C (ID de Gene 8794) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_003832.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_003841.4. TNFRSF10D (ID de Gene 8793) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_003831.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_003840.4. TNFRSF11A (ID de Gene 8792) tem a sequência de aminoácidos de referência de XP_011524547.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de XM_11526245.2. TNFRSF11B (ID de Gene 4982) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_002537.3 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_002546.3. TNFRSF12A (ID de Gene 51330) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_057723.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_016639.2. TNFRSF13B (ID de Gene 23495) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_0036584.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_012452.2. TNFRSF13C (ID de Gene 115650) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_443177.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_052945.3. TNFRSF14 (ID de Gene 8764) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001284534.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001297605.1. TNFRSF17 (ID de Gene 608) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001183.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001192.2. TNFRSF18 (ID de Gene 8784) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_004195.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_004186.1. TNFRSF19 (ID de Gene 55504) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001191387.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001204458.1. NFRSF21 (ID de Gene 27242) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_055267.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_014452.4. TNFRSF25 (DR3: ID de Gene 8718) que se liga a TNFSF15 ligante (TL1A) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001034753.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001039664.1.
[0144] Alternativamente, o antígeno de célula imunológica ligado pelo segundo sítio de ligação a antígeno pode ser uma molécula que tem uma função regulatória no sistema imunológico diferente de um membro de TNFRSF, por exemplo, uma molécula coestimulatória imunológica ou uma molécula de ponto de verificação inibitória. Exemplos de tais moléculas regulatórias imunológicas incluem ICOS (CD278), LAG3, PD1, PD-L1, PD-L2, B7H3, B7H4, CTLA4, TIGIT, BTLA, HVEM, imunoglobulina de célula T, domínio 3 que contém mucina (TIM-3), CD47, CD73, A2aR, CD200, CD200R, receptor de fator estimulador de colônia 1 (CSF-1R), VISTA CD28, CD80, LLT1, galectina-9, NKG2A, NKG2D e KIR.
[0145] A célula imunológica na qual o antígeno de célula imunológica está presente pode pertencer a qualquer subconjunto de célula imunológica e pode ser uma célula T, um leucócito de infiltração de tumor (TIL), a célula de linhagem mieloide como uma célula apresentadora de antígeno (APC), uma célula NK e/ou uma célula B. Quando o antígeno de célula imunológica é um receptor de TNFRSF, a célula imunológica na qual o receptor de TNFRSF está presente é, preferencialmente, uma célula T.
[0146] Alternativamente, o segundo sítio de ligação a antígeno pode se ligar a antígeno de doença, como mencionado acima. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a ligação do membro de ligação específico a CD137 e um antígeno de doença resultarão na ativação de células T nas proximidades da doença. As células T ativadas podem, então, iniciar, promover ou participar de uma resposta imunológica, por exemplo, uma resposta imunológica contra um patógeno ou uma célula cancerígena. Uma visão geral do papel que o sistema imunológico desempenha em reconhecer e erradicar células cancerígenas é fornecido por Chen e Mellman (2013).
[0147] Em uma modalidade preferencial, o antígeno de doença é um antígeno tumoral. Um antígeno tumoral é um antígeno que está predominantemente presente no ambiente de um tumor, e não é onipresente em outra parte em um indivíduo. Por exemplo, o antígeno tumoral pode estar presente na superfície de células tumorais ou pode estar presente em outras células estromais do microambiente tumoral ou em fluidos biológicos nas proximidades de um tumor. O antígeno tumoral é, portanto, um marcador da localização de células tumorais em um indivíduo.
[0148] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral pode ser um antígeno que é localizado na superfície de uma célula cancerígena. Preferencialmente, o antígeno tumoral é regulado de modo ascendente ou superexpresso em células tumorais, embora não seja expresso de modo abundante pelas células somáticas normais correspondentes do mesmo tecido na ausência de um tumor.
[0149] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é regulado de modo ascendente ou superexpresso em células estromais do microambiente tumoral, em comparação com células estromais do tecido normal correspondente na ausência de um tumor.
[0150] Antígenos tumorais preferenciais existem na superfície celular e não são rapidamente internalizados.
[0151] Os antígenos tumorais que são adequados para alvejamento pelos membros de ligação específicos podem ser identificados com o uso de métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, um membro de ligação específico que alveja receptor de CD137 e um antígeno tumoral pode ser usado em um ensaio em que uma célula que expressa CD137 é cocultivada com uma célula que expressa antígeno tumoral e a ativação da célula que expressa CD137 é medida, por exemplo, por um ensaio de ativação de célula T, um ensaio de proliferação ou ensaio de citotoxicidade.
[0152] Um antígeno tumoral de superfície celular pode ser um Antígeno Associado a Tumor (TAA) ou um antígeno específico de Tumor (TSA).
[0153] Antígenos tumorais expressos por células cancerígenas podem incluir, por exemplo, antígenos de câncer-testicular (CT) codificados por genes de linhagem germinal de câncer, como MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE- A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-I, RAGE- 1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE- C1/CT7, MAGE-C2, NY-ESO-I, LAGE-I, SSX-I, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-I e XAGE e fragmentos imunogênicos ou variantes dos mesmos (Simpson et al., 2005; Gure et al., 2005; Velazquez et al., 2007; Andrade et al., 2008; Tinguely et al., 2008; Napoletano et al., 2008).
[0154] Outras superfície celular antígenos tumorais incluem, por exemplo, AFP, αvβ3 (receptor de vitronectina), αvβ6, agente de maturação de célula B (BCMA), CA125 (MUC16), CD4, CD20, CD22, CD33, CD52, CD56, CD66e, CD80, CD140b, CD227 (MUC1), EGFR (HER1), EpCAM, GD3 gangliosídeo, HER2, antígeno de membrana específica de próstata (PSMA), antígeno específico de próstata (PSA), CD5, CD19, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, HLA-DR, anti-idiótipo, antígeno carcinoembriônico (CEA), por exemplo, molécula de adesão a célula relacionada a antígeno carcinoembriônico 5
(CEACAM5), TAG-72, proteína de ligação a Folato, A33, G250, ferritina, glicolipídeos como gangliosídeos, carboidratos como CA-125, receptor IL-2, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), IGF1R, B7H3, B7H4, PD-L1, CD200, EphA2, e mesotelina ou variantes dos mesmos. Esses e outros antígenos tumorais de superfície celular são descritos em Carter et al., 2004; Scott e Renner, 2001; e Cheever et al., 2009; Tai e Anderson, 2015; e Podojil e Miller, 2017.
[0155] Outros antígenos tumorais incluem complexos de peptídeo-MHC fora do quadro gerados pelos mecanismos de iniciação de tradução de não AUG empregados por células cancerígenas “tensionadas” (Malarkannan et al., 1999).
[0156] Outros antígenos tumorais incluem complexos peptídeo-MHC na superfície de células tumorais ou de células do microambiente tumoral, em que os complexos peptídeo-MHC compreendem a fragmento de peptídeo de neoantígeno específico tumoral de um antígeno tumoral intracelular mutado, e em que o neoantígeno de peptídeo porta uma ou mais mutações específicas de tumor (Gubin et al., 2015). Outros antígenos tumorais são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, o documento WO00/20581; Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) editores Stern, Beverley e Carroll, Cambridge University Press, Cambridge). As sequências desses antígenos tumorais são prontamente disponibilizadas a partir de bancos de dados públicos, mas também são constatadas nos documentos WO1992/020356 A1, WO1994/005304 A1, WO1994/023031 A1, WO1995/020974 A1, WO1995/023874 A1 e WO1996/026214 A1.
[0157] Antígenos tumorais preferenciais incluem HER2, FAP, EpCAM, CEACAM5, CD20, CD73, PSMA, mesotelina, EphA2,
IGF1R, CD200, αvβ6, BCMA, PD-L1, B7H3, B7H4 e EGFR.
[0158] Em uma modalidade mais preferencial, o antígeno tumoral é mesotelina (MSLN).
[0159] Em uma modalidade alternativa mais preferencial, o antígeno tumoral é PD-L1.
[0160] HER2 (ERBB2; ID de Gene 2064) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001005862.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001005862.2. FAP (ID de Gene 2191) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001278736.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001291807.1. EpCAM (ID de Gene 4072) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_002345.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_002354.2.
[0161] CEACAM5 (ID de Gene 1048) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001278413.1and pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001291484.2. CD20 (MS4A1; ID de Gene 931) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_068769.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_021950.3. CD73 (NT5E; ID de Gene 4907) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001191742.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001204813.1. PSMA (FOLH1; ID de Gene 2346) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001014986.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001014986.1. Mesotelina (MSLN; ID de Gene 10232) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001170826.1 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001177355.2. EphA2 (ID de Gene 1969) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001316019.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001329090.1. IGF1R (ID de Gene 3480) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000866.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000875.4. CD200 (ID de Gene 4345) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001004196.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001004196.3. αvβ6 é um heterodímero composto pela subunidade de integrina alfa V e subunidade de integrina beta 6. Subunidade de integrina alfa V (ITGAV; ID de Gene 3685) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001138471.1 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001144999.2. Subunidade de integrina beta 6 (ITGB6; ID de Gene 3694) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000879.2 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000888.4. BCMA (TNFRSF17; ID de Gene 608) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001183.2 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001192.2. PD- L1 (CD274; ID de Gene 29126) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001254635.1 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001267706.1. B7H3 (CD276; ID de Gene 80381) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001019907.1 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001024736.1. B7H4 (VTCN1; ID de Gene
79679) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001240778.1 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001253849.1. EGFR (ID de Gene 1956) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001333826.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001346897.1.
[0162] Em outras modalidades, o antígeno tumoral pode ser um antígeno tumoral solúvel, por exemplo, um fator de crescimento que é produzido por ou em resposta a células cancerígenas. Um fator solúvel pode ser regulado de modo ascendente ou superexpresso em fluidos biológicos nas proximidades de um tumor. Um antígeno tumoral solúvel pode ser multimérico, por exemplo, um dímero ou um trímero. Um antígeno tumoral solúvel pode estar presente em concentrações superiores no sítio tumoral ou no microambiente tumoral que em outro lugar no corpo de um indivíduo. O microambiente tumoral e antígenos tumorais solúveis associados são descritos em maiores detalhes em Bhome et al. (2015).
[0163] Antígenos tumorais solúveis adequados incluem VEGF, HGF, SDF1 e TGF-beta, por exemplo, TGF-beta-1, TGF- beta-2, TGF-beta-3 e TGF-beta-4.
[0164] VEGF (VEGFA; ID de gene 7422) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_001020537.2 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001025366.2. HGF (ID de gene 3082) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_000592.3 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000601.5. SDF1 (CXCL12; ID de gene 6387) tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_000600.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000609.6. TGF-beta-1 (TGFB1; ID de gene 7040) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000651.3 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000660.6. TGF-beta-2 (TGFB2; ID de gene 7042) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001129071.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001135599.3. TGF-beta-3 (TGFB3; ID de gene 7043) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001316867.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001329938.1. TGF-beta-4 (LEFTY2; ID de gene 7044) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001165896.1 e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001172425.2.
[0165] Em uma modalidade preferencial alternativa, o antígeno de doença é um antígeno patogênico.
[0166] Espera-se que a ativação de células imunológicas, como células T, células NK e/ou macrófagos pelo membro de ligação específico nas proximidades de um sítio de uma doença infecciosa seja útil no tratamento da doença infecciosa. A doença infecciosa pode ser uma doença infecciosa grave ou persistente, mas preferencialmente é uma doença infecciosa persistente.
[0167] O antígeno patogênico é, preferencialmente, um antígeno expresso por um patógeno humano, como um antígeno viral, bacteriano, fúngico ou parasítico (por exemplo, um antígeno de protozoário), preferencialmente, um antígeno viral ou bacteriano. Um antígeno patogênico é um antígeno que está predominantemente presente em um patógeno, ou nas proximidades de um sítio de uma doença infecciosa, e não é onipresente em outra parte em um indivíduo.
[0168] Por exemplo, o antígeno patogênico pode ser um antígeno presente na superfície de um vírus, bactéria, fungo ou parasita, ou um antígeno solúvel expresso por um vírus, bactéria, fungo ou parasita. O vírus, bactéria, fungo ou parasita podem ser um vírus, bactéria, fungo ou parasita, como denominado em outra parte no presente documento.
[0169] Quando o antígeno patogênico é um antígeno solúvel, o antígeno pode ser regulado de modo ascendente ou superexpresso em fluidos biológicos nas proximidades do sítio da doença infecciosa. Por exemplo, um antígeno solúvel patogênico pode estar presente em concentrações superiores, ou nas proximidades de, no sítio da doença infecciosa que em outro lugar no corpo de um indivíduo. O antígeno solúvel patogênico pode ser multimérico, por exemplo, um dímero ou um trímero.
[0170] Os antígenos patogênicos que são adequados para alvejamento pelo o membro de ligação específico podem ser identificados com o uso de métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um membro de ligação específico que alveja CD137 e um antígeno patogênico pode ser usado em um ensaio em que uma célula que expressa CD137 é cocultivada com um patógeno ou antígeno patogênico e a ativação da célula que expressa OX40 é medida, por exemplo, pelo ensaio de ativação de célula T, um ensaio de proliferação ou ensaio de citotoxicidade.
[0171] Diversos antígenos patogênicos adequados para alvejamento pelo membro de ligação específico são adicionalmente mais conhecidos na técnica e podem ser selecionados pelo elemento versado na técnica, de acordo com a doença infecciosa a ser tratada. Exemplos de antígenos virais incluem proteínas p24, gp120 e gp41 expressos por vírus de imunodeficiência humano (HIV), antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) expresso por vírus da hepatite B (HBV), e hemaglutinina e neuraminidase expressas por vírus influenza. Exemplos de antígenos bacterianos incluem Rv1733, Rv2389 e Rv2435n expressos por Mycobacterium tuberculosis.
[0172] O membro de ligação específico também pode compreendem uma variante de uma primeira ou segunda sequência, sequência de alça estrutural AB, CD ou EF, domínio CH3, domínio CH2, Fcab, CDR, domínio VH, domínio VL, sequência de cadeia leve e/ou cadeia pesada, como revelado no presente documento. Variantes adequadas podem ser obtidas por meio de métodos de alteração de sequência, ou mutação e triagem. Em uma modalidade preferencial, um membro de ligação específico que compreende uma ou mais sequências variantes retém uma ou mais das características funcionais do membro de ligação específico parental, como especificidade de ligação e/ou afinidade de ligação com CD137. Por exemplo, um membro de ligação específico que compreende uma ou mais sequências variantes, de preferência, se liga a CD137 com a mesma afinidade, ou uma afinidade maior, que o membro de ligação específico (parental). O membro de ligação específico parental é um membro de ligação específico que não compreende a inserção (ou inserções), deleção (ou deleções) e/ou substituição (ou substituições) de aminoácido que foram incorporadas no membro de ligação específico variante.
[0173] Por exemplo, um membro de ligação específico pode compreender uma primeira, segunda ou terceira sequência, sequência de alça estrutural AB, CD ou EF, domínio CH3, domínio CH2, Fcab, CDR, domínio VH, domínio VL, sequência de cadeia leve e/ou cadeia pesada que tem pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência a uma primeira, segunda ou terceira sequência, sequência de alça estrutural AB, CD ou EF, domínio CH3, domínio CH2, Fcab, CDR, domínio VH, domínio VL, sequência de cadeia leve ou cadeia pesada revelada no presente documento.
[0174] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico tem ou compreende uma sequência de domínio CH3 que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência, preferencialmente, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência, a uma sequência de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 21, 30, 48, 102, 75,
39, 57, 66, 84, 93, 175, 139, 130, 148, 121, 157, 165 ou
112.
[0175] Em uma modalidade preferencial adicional, o membro de ligação específico tem ou compreende uma sequência de domínio CH2, que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência com a sequência de domínio CH2 apresentada em SEQ ID NO: 5 ou 6.
[0176] Em outra modalidade preferencial, o membro de ligação específico tem, compreende ou consiste em, uma sequência, que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência à sequência de Fcab apresentada em SEQ ID NO: 23, 32, 50, 104, 77, 41, 59, 68, 86, 95, 15, 141, 132, 150, 123, 159, 167, 114, 25, 34, 52, 106, 79, 43, 61, 70, 88, 97, 16, 143, 134, 152, 125, 161, 169 ou 116.
[0177] A identidade de sequência é comumente definida com referência ao algoritmo GAP (pacote GCG Wisconsin, Accelerys Inc, San Diego, EUA). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de intervalos. De modo geral, parâmetros padrão são usados, com uma penalidade de criação de intervalo igual a 12 e uma penalidade de extensão de intervalo igual a 4. O uso de GAP pode ser preferencial, mas outros algorítimos podem ser usados, por exemplo, BLAST (que usa o método de Altschul et al., (1990)), FASTA (que usa o método de Pearson e Lipman, (1988)), ou o algoritmo de Smith-Waterman (Smith e Waterman, (1981)), ou o programa TBLASTN, de Altschul et al., (1990) supra, que emprega, de modo geral, os parâmetros padrão. Em particular, o algoritmo psi-Blast pode ser usado.
[0178] Um membro de ligação específico pode compreender uma primeira, segunda ou terceira sequência, sequência de alça estrutural AB, CD ou EF, domínio CH3, domínio CH2, Fcab, CDR, domínio VH, domínio VL, sequência de cadeia leve ou cadeia pesada que tem uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), preferencialmente, 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com uma primeira, segunda ou terceira sequência, sequência de alça estrutural AB, CD ou EF, domínio CH3, domínio CH2, Fcab, CDR, domínio VH, domínio VL, sequência de cadeia leve ou cadeia pesada revelada no presente documento.
[0179] Em uma modalidade preferencial, o membro de ligação específico pode compreender uma sequência de domínio CH3 com uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), de preferência, 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com a sequência de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 21, 30, 48, 102, 75, 39, 57, 66, 84, 93, 175, 139, 130, 148, 121, 157, 165 ou 112.
[0180] Em uma modalidade adicional preferencial, o membro de ligação específico compreende uma sequência de domínio CH2, com uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), preferencialmente 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com a sequência de domínio CH2 apresentada em SEQ ID NO: 5 ou 6.
[0181] Em uma modalidade preferencial adicional, o membro de ligação específico compreende ou consiste em uma sequência, com uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), preferencialmente, 40 alterações ou menos, 30 alterações ou menos, 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com a sequência de Fcab apresentada em SEQ ID NO: 23, 32, 50, 104, 77, 41, 59, 68, 86, 95, 15, 141, 132, 150, 123, 159, 167, 114, 25, 34, 52, 106, 79, 43, 61, 70, 88, 97, 16, 143, 134, 152, 125, 161, 169 ou 116.
[0182] Quando o membro de ligação específico compreende uma variante de uma primeira sequência, sequência de alça estrutural AB, domínio CH3, Fcab ou sequência de cadeia pesada, como revelado no presente documento, o membro de ligação específico, preferencialmente, mantém a sequência de PPY entre as posições 11 e 19, preferencialmente, posições 15 e 17, do domínio CH3 do membro de ligação específico. Além disso, o membro de ligação específico, preferencialmente, mantém uma inserção, preferencialmente, uma inserção de 5 aminoácidos entre as posições 16 e 17 do domínio CH3 do membro de ligação específico. Em uma modalidade preferencial adicional, o membro de ligação específico, preferencialmente, mantém a sequência nas posições 97 e 98 do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[0183] Em particular, o membro de ligação específico pode ser (ou molécula de anticorpo pode compreender) uma variante de membro de ligação específico FS22-053, em que a variante: (i) compreende uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), preferencialmente, 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com a sequência de membro de ligação específico FS22-053 revelada no presente documento; ou (ii) tem pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos
99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência para a sequência de membro de ligação específico FS22-053, revelado no presente documento; e em que o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo compreende a sequência de PPY entre as posições 15 e 17, e compreende opcionalmente uma inserção de 5 aminoácidos entre as posições 16 e 17, do domínio CH3 do membro de ligação específico ou molécula de anticorpo; e em que a numeração de resíduo está de acordo com o esquema de numeração de resíduo de IMGT.
[0184] Além disso, ou alternativamente, quando o membro de ligação específico compreende uma variante de domínio CH3, domínio CH2 e CH3, Fcab, sequência de cadeia leve ou cadeia pesada revelada no presente documento, a variante, preferencialmente, não compreende quaisquer alterações de aminoácido nas primeira, segunda e terceira sequências localizadas nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3 do membro de ligação específico. Por exemplo, a variante pode não compreender quaisquer alterações de aminoácido nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3 do membro de ligação específico.
[0185] Em modalidades preferenciais em que um ou mais aminoácidos são substituídos com outro aminoácido, as substituições podem ser substituições conservativas, por exemplo, de acordo com a seguinte Tabela. Em algumas modalidades, aminoácidos na mesma categoria na coluna intermediária são substituídos por outro, isto é, um aminoácido não polar é substituído com outro aminoácido não polar, por exemplo. Em algumas modalidades, os aminoácidos na mesma linha na coluna da direita são substituídos por outros. ALIFÁTICO Não polar G A P
I L V Polar - não carregado C S T M
N Q Polar - carregado D E
K R AROMÁTICO H F W Y
[0186] Em algumas modalidades, substituição (ou substituições) pode ser funcionalmente conservativa. Isto é, em algumas modalidades a substituição pode não afetar (ou pode substancialmente não afetar) uma ou mais propriedades funcionais (por exemplo, afinidade de ligação) do membro de ligação específico que compreende a substituição em comparação com o membro de ligação específico não substituído equivalente.
[0187] Também é contemplado um membro de ligação específico que compreende um sítio de ligação a antígeno CD137 localizado em um domínio constante, preferencialmente, um domínio CH3, do membro de ligação específico e que compete com um membro de ligação específico da invenção pela ligação a CD137, ou que se liga ao mesmo epítopo em CD137 como um membro de ligação específico da invenção. Os métodos para determinar a competição para um antígeno por dois membros de ligação específicos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a competição de ligação a um antígeno por dois membros de ligação específicos pode ser determinada com o uso de ressonância de plasmon de superfície, como Biacore. Os métodos para mapear o epítopo ligado por um membro de ligação específico são similarmente conhecidos na técnica.
[0188] Em algumas modalidades, o membro de ligação específico pode não compreender um sítio de ligação a antígeno com base em CDR.
[0189] Em particular, o membro de ligação específico pode não compreender um sítio de ligação a antígeno com base em CDR que se liga a PD-L1.
[0190] Além disso, ou alternativamente, o membro de ligação específico pode não compreender um sítio de ligação a antígeno com base em CDR que se liga a mesotelina (MSLN).
[0191] Por exemplo, o membro de ligação específico pode não compreender um sítio de ligação a antígeno com base em CDR que se liga a PD-L1 ou MSLN, em que o membro de ligação específico compreende as primeira, segunda e terceira sequências localizada nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-53-008, ou FS22-172-003, as sequências de alça estrutural AB e EF completas do domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-53-008, ou FS22-172-003, e/ou a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico FS22-53-008, ou FS22- 172-003.
[0192] Em particular, o membro de ligação específico pode não compreender as CDRs, domínios VH e/ou VL, e/ou sequências de cadeia pesada e/ou leve de FS22-172-003- AA/E12v2 e FS22-053-008-AA/E12v2 apresentados abaixo. CDRs de domínio VH de FS22-172-003-AA/E12v2 e FS22-053-008- AA/E12v2
HCDR1 (IMGT) GYPFTSYG HCDR1 (Kabat) SYGIS HCDR2 (IMGT) ISAYSGGT HCDR2 (Kabat) WISAYSGGTNYAQKLQG HCDR3 (IMGT) ARDLFPTIFGVSYYYY HCDR3 (Kabat) DLFPTIFGVSYYYY Domínio VH de FS22-172-003-AA/E12v2 e FS22-053-008-AA/E12v2
EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQG LEWMGWISAYSGGTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRS
DDTAVYYCARDLFPTIFGVSYYYYWGQGTLVTVSS CDRs de domínio VL de FS22-172-003-AA/E12v2 e FS22-053-008- AA/E12v2 LCDR1 (IMGT) QSIGNR LCDR1 (Kabat) RASQSIGNRLA LCDR2 (IMGT) EAS LCDR2 (Kabat) EASTSET LCDR3 (IMGT) QQSYSTPYT LCDR3 (Kabat) QQSYSTPYT Domínio VL de FS22-172-003-AA/E12v2 e FS22-053-008-AA/E12v2
DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITCRASQSIGNRLAWYQHKPGKAPKL LIYEASTSETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSY
STPYTFGQGTKLEIK Cadeia pesada de FS22-172-003-AA/E12v2
EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGGTN YAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLFPTIFGVSYYYYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve de FS22-172-003-AA/E12v2
DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITCRASQSIGNRLAWYQHKPGKAPKLLIYEASTSETGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Cadeia pesada de FS22-053-008-AA/E12v2
EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGGTN YAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLFPTIFGVSYYYYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve de FS22-053-008-AA/E12v2
DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITCRASQSIGNRLAWYQHKPGKAPKLLIYEASTSETGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0193] Além disso, ou alternativamente, o membro de ligação específico pode não compreender as CDRs e/ou domínios VH e/ou VL de anticorpo anti-MSLN FS28-256-271 apresentados abaixo. CDRs de domínio VH de FS28-256-271 HCDR1 (AA) (IMGT) GFTFTHTY HCDR1 (AA) (Kabat) HTYMS HCDR2 (AA) (IMGT) ISPTYSTT HCDR2 (AA) Kabat) AISPTYSTTNYADSVKG HCDR3 (AA) (IMGT) ARYNAYHAALDY
HCDR3 (AA) (Kabat) YNAYHAALDY Domínio VH de FS28-256-271
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTHTYMSWVRQAPGKGLEWVSNISPTYSTTN YADSVKGRFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYNAYHAALDYWGQGTLVTVS
S CDRs de domínio VL de FS28-256-271 LCDR1 (AA) (IMGT) QSVSSSY LCDR1 (AA) (Kabat) RASQSVSSSYLA LCDR2 (AA) (IMGT) GAS LCDR2 (AA) (Kabat) GASSRAT LCDR3 (AA) (IMGT) QQTVPYPYT LCDR3 (AA) (Kabat) QQTVPYPYT Domínio VL de FS28-256-271
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTVPYPYTFGQGTKVEIK
[0194] O membro de ligação específico pode ser conjugado a uma molécula bioativa ou um marcador detectável. Nesse caso, o membro de ligação específico pode ser referido como um conjugado. Tais conjugados são usados no tratamento de doenças, como descrito no presente documento.
[0195] Por exemplo, a molécula bioativa pode ser um modulador de sistema imunológico, como uma citocina, preferencialmente, uma citocina humana. Por exemplo, a citocina pode ser uma citocina que estimula a ativação e/ou proliferação de célula T. Exemplos de citocinas para conjugação ao membro de ligação específico incluem IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF e IFN-gama.
[0196] Alternativamente, a molécula bioativa pode ser uma armação de ligante, como uma armação de ligante de uma citocina, por exemplo, de TGF-beta ou IL-6.
[0197] Os marcadores detectáveis adequados que podem ser conjugados a membros de ligação específicos são conhecidos na técnica e incluem radioisótopos como iodo-125, iodo-131, ítrio-90, índio-111 e tecnécio-99; fluorocromos, como fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, vermelho Texas e derivados de corante ciano, por exemplo, Cy7 e Alexa750; corantes cromogênicos, como diaminobenzidina; microesferas de látex; marcadores de enzima como rábano peroxidase; corantes de fósforo ou laser com absorção espectralmente isolada ou características de emissão; E frações químicas, como biotina, que podem ser detectadas por meio de ligação a uma fração detectável de cognato específico, por exemplo, avidina identificada.
[0198] O membro de ligação específico pode ser conjugado à molécula bioativa ou marcador detectável por meio de qualquer ligação covalente ou não covalente adequada, como uma ligação de dissulfeto ou peptídeo. Quando a molécula bioativa é uma citocina, em que a citocina pode ser unida ao membro de ligação específico por meio de um ligante peptídico. Os ligantes de peptídeo adequados são conhecidos na técnica e podem ser de 5 a 25, 5 a 20, 5 a 15, 10 a 25, 10 a 20, ou 10 a 15 aminoácidos em comprimento.
[0199] Em algumas modalidades, a molécula bioativa pode ser conjugada ao membro de ligação específico por um ligante clivável. O ligante pode permitir a liberação da molécula bioativa do membro de ligação específico em um sítio de terapia. Os ligantes podem incluir ligações de amida (por exemplo, ligantes peptídicos), ligações de dissulfeto ou hidrazonas. Os ligantes de peptídeo, por exemplo, podem ser clivados por proteases específicas de sítio, as ligações de dissulfeto podem ser clivadas pelo ambiente de redução do citosol e hidrazonas podem ser clivadas por hidrólise mediada por ácido.
[0200] O conjugado pode ser a proteína de fusão que compreende o membro de ligação específico e a molécula bioativa. Nesse caso, a molécula bioativa pode ser conjugada ao membro de ligação específico por meio de um ligante peptídico ou ligação peptídica. Quando o membro de ligação específico é uma molécula de múltiplas cadeias, como em que o membro de ligação específico é ou compreende um Fcab ou é um mAb2, em que a molécula bioativa pode ser conjugada a uma ou mais cadeias do membro de ligação específico. Por exemplo, a molécula bioativada pode ser conjugada para uma ou ambas as cadeias pesadas da molécula de mAb2. As proteínas de fusão têm a vantagem de serem mais fáceis de serem produzidas e purificadas, facilitando a produção de material de grau clínico.
[0201] A invenção também fornece uma molécula ou moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam um membro de ligação específico da invenção. A pessoa versada não teria dificuldade em preparar essas moléculas de ácido nucleico com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.
[0202] Em uma modalidade preferencial, a molécula de ácido nucleico codifica o domínio CH3 de membro de ligação específico: FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22- 172-001, FS22-172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, preferencialmente, FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172- 004, FS22-172-001, FS22-172-005, ou FS22-172-006, mais preferencialmente, FS22-172-003, FS22-172-002, ou FS22-172- 004, ainda mais preferencialmente, FS22-172-003.
[0203] Em uma modalidade preferencial alternativa, a molécula de ácido nucleico codifica o domínio CH3 de membro de ligação específico: FS22-053-008, FS22-053-009, FS22- 053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22- 053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22- 053, preferencialmente, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22- 053-011, FS22-053-017, ou FS22-053-014, mais preferencialmente, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053- 011, ou FS22-053-017, ainda mais preferencialmente, FS22- 053-008.
[0204] As sequências de domínio CH3 desses membros de ligação específicos são descritas no presente documento.
[0205] Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica o domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016 ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 22, 31, 49, 103, 76, 40, 58, 67, 85, 94 e 176, respectivamente; ou (ii) FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172- 001, FS22-172-005, FS22-172-006 ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 140, 131, 149, 122, 158, 166 e 113, respectivamente.
[0206] Em uma modalidade preferencial, a molécula de ácido nucleico codifica membro de ligação específico: FS22- 172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22- 172-005, FS22-172-006, ou FS22-172, preferencialmente, FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, ou FS22-172-006, mais preferencialmente, FS22-172-003, FS22-172-002, ou FS22-172-004, ainda mais preferencialmente, FS22-172-003.
[0207] Em uma modalidade preferencial alternativa, a molécula de ácido nucleico codifica membro de ligação específico: FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22- 053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22- 053-013, FS22-053-015, FS22-053-016, ou FS22-053, preferencialmente, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053- 011, FS22-053-017, ou FS22-053-014, mais preferencialmente, FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, ou FS22-053-017, ainda mais preferencialmente, FS22-053-008.
[0208] Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica o membro de ligação específico: (i) FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016 ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 24, 33, 51, 105, 78, 42, 60, 69, 87, 96 e 177, respectivamente; ou (ii) FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172- 001, FS22-172-005, FS22-172-006 ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 142, 133, 151, 124, 160, 168 e 115, respectivamente.
[0209] Uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser usada para expressar um membro de ligação específico da invenção. O ácido nucleico geralmente será fornecido na forma de um vetor recombinante para expressão. Outro aspecto da invenção, desse modo, fornece um vetor que compreende um ácido nucleico como descrito acima. Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, em que contêm sequências regulatórias adequadas, que incluem sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências, como apropriado. Preferencialmente, o vetor contém sequências regulatórias adequadas para acionar a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago ou fagemídeo, como adequado.
[0210] Uma molécula de ácido nucleico ou vetor, como descrito no presente documento, pode ser introduzida em uma célula hospedeira. As técnicas para a introdução de ácido nucleico ou vetores em células hospedeiras são bem apresentadas na técnica e qualquer técnica adequada pode ser empregada. Uma faixa de células hospedeiras adequada para a produção de membros de ligação específicos recombinantes é conhecida na técnica, e inclui células hospedeiras bacterianas, de levedura, de inseto ou de mamífero. Uma célula hospedeira preferencial é uma célula de mamífero, como uma célula CHO, NS0 ou HEK, por exemplo, uma célula HEK293. Uma célula hospedeira mais preferencial é uma célula CHO.
[0211] Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de um membro de ligação específico da invenção que compreende expressar um ácido nucleico que codifica o membro de ligação específico em uma célula hospedeira e opcionalmente isolar e/ou purificar o membro de ligação específico assim produzido. Métodos para cultivar células hospedeiras são bem conhecidos na técnica. O método pode compreender adicionalmente isolar e/ou purificar o membro de ligação específico. As técnicas para a purificação de membros de ligação específicos recombinantes são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, HPLC, FPLC ou cromatografia por afinidade, por exemplo, com o uso de Proteína A ou Proteína L. Em algumas modalidades, a purificação pode ser realizada com o uso de uma etiqueta de afinidade no membro de ligação específico. O método também pode compreender formular o membro de ligação específico em uma composição farmacêutica, opcionalmente com um excipiente farmaceuticamente aceitável ou outra substância conforme descrito abaixo.
[0212] Como explicado acima, CD137 é expresso em células do sistema imunológico, que inclui células T CD8+, células T CD4+, células Treg, células B, células NK, células NKT, células dendríticas e linfócitos de infiltração de tumor (TILs). Em particular, mostrou-se que a ativação de CD137 desempenha um papel de intensificar a proliferação, a sobrevivência e a função efetora de citotoxicidade de células T CD8+, bem como diferenciação e manutenção de célula T CD8+ de células T CD8+ de memória. CD137 é expresso em um nível inferior nas células T CD4+ que células T CD8+, mas também mostrou-se estar envolvido na indução de proliferação e ativação de alguns subconjuntos de células T CD4+. Também foi demonstrado que a ativação de CD137 intensifica ADCC mediado por célula NK, bem como a proliferação de célula B, sobrevivência e produção de citocina.
[0213] Em vista da resposta imunológica que melhora a atividade de CD137, investigou-se as moléculas agonistas de CD137 no contexto de câncer tratamento, bem como o tratamento de infecções crônicas.
[0214] Os membros de ligação específicos, como descrito no presente documento, podem, desse modo, ser úteis para aplicações terapêuticas, in particular no tratamento de câncer. Além disso, espera-se que os membros de ligação específicos sejam úteis no tratamento de doenças infecciosas, como doenças infecciosas persistentes.
[0215] Um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser usado em um método de tratamento do corpo humano ou animal. Os aspectos relacionados da invenção fornecem; (i) um membro de ligação específico descrito no presente documento para uso como um medicamento, (ii) um membro de ligação específico descrito no presente documento para uso em um método de tratamento de uma doença ou um transtorno, (iii) o uso de um membro de ligação específico descrito no presente documento na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença ou um transtorno; e, (iv) um método de tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um membro de ligação específico como descrito no presente documento.
[0216] O indivíduo pode ser um paciente, preferencialmente, um paciente humano.
[0217] O tratamento pode ser qualquer tratamento ou terapia no qual algum efeito terapêutico desejado é obtido, por exemplo, a inibição ou atraso do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, um impedimento na taxa de progresso, melhoria da condição, cura ou remissão (seja parcial ou total) da condição, prevenção, melhoria, atraso, anulação ou detenção de um ou mais sintomas e/ou sinais da condição ou prolongamento de sobrevivência de um indivíduo ou paciente além do esperado na ausência de tratamento.
[0218] O tratamento como uma medida profiláctica (isto é, profilaxia) também é incluído. Por exemplo, um indivíduo suscetível a ou em risco da ocorrência ou recorrência de uma doença, como câncer pode ser tratado como descrito no presente documento. Tal tratamento pode impedir ou atrasar a ocorrência ou recorrência da doença no indivíduo.
[0219] Um método de tratamento como descrito pode compreender administrar pelo menos um tratamento adicional ao indivíduo além do membro de ligação específico. O membro de ligação específico descrito no presente documento pode, desse modo, ser administrado a um indivíduo em separado ou em combinação com um ou mais outros tratamentos. Quando o membro de ligação específico é administrado ao indivíduo em combinação com outro tratamento, o tratamento adicional pode ser administrado ao indivíduo simultaneamente com, sequencialmente a ou separadamente da administração do membro de ligação específico. Quando o tratamento adicional é administrado simultaneamente com o membro de ligação específico, o membro de ligação específico e o tratamento adicional podem ser administrados ao indivíduo como uma preparação combinada. Por exemplo, a terapia adicional pode ser uma terapia ou agente terapêutico conhecido para a doença a ser tratada.
[0220] Embora um membro de ligação específico possa ser administrado por si só, os membros de ligação específicos serão frequentemente administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação específico. Outro aspecto da invenção, portanto, fornece uma composição farmacêutica que compreende um membro de ligação específico, como descrito no presente documento. Um método que compreende formula um membro de ligação específico em uma composição farmacêutica também é fornecido.
[0221] As composições farmacêuticas podem compreender, além do membro de ligação específico, um excipiente farmaceuticamente aceitável, carreador, tampão, estabilizante ou outros materiais bem conhecido por aqueles elementos versados na técnica. O termo “farmaceuticamente aceitável” como usado no presente documento pertence a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de julgamento médico, adequados para o uso em contato com os tecidos de um indivíduo (por exemplo, ser humano) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, compatível com uma razão de benefício/risco razoável. Cada carreador, excipiente, etc. também deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação. A natureza precisa do carreador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser por infusão, injeção ou qualquer outra via adequada, como discutido abaixo.
[0222] Para administração parenteral, por exemplo, subcutânea ou intravenosa, por exemplo, por injeção, a composição farmacêutica que compreende o membro de ligação específico pode estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é isenta de pirogênio e tem pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Aqueles de conhecimento relevante na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas com o uso, por exemplo, de veículos isotônicos como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer com Lactato. Os conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser empregados como exigido, incluindo tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, como ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenílico, butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3’- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos, como TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG).
[0223] Em algumas modalidades, os membros de ligação específicos podem ser fornecidos em uma forma liofilizada para reconstituição antes da administração. Por exemplo, membros de ligação específicos liofilizados podem ser reconstituídos em água estéril e misturados com solução salina antes da administração a um indivíduo.
[0224] A administração pode ser em uma "quantidade terapeuticamente eficaz", que é suficiente para mostrar benefício a um indivíduo. A quantidade real administrada, e taxa e período de tempo de administração, dependerão da natureza e severidade do que está sendo tratado, o indivíduo particular que está sendo tratado, a condição clínica do indivíduo, a causa do distúrbio, o sítio de entrega da composição, o tipo de membro de ligação específico, o método de administração, a programação de administração e outros fatores conhecidos por profissionais da área médica. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões em dosagem etc., está dentro da responsabilidade dos profissionais em geral e outros profissionais da área médica, e muitos dependem da severidade dos sintomas e/ou progressão de uma doença que está sendo tratada. Doses adequadas de imunoglobulinas são bem conhecidas na técnica (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; e Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Dosagens específicas indicadas no presente documento, ou no Physician's Desk Reference (2003) conforme apropriado para uma molécula de anticorpo que está sendo administrada, podem ser usadas. Quanto a moléculas de anticorpo, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose adequada de um membro de ligação específico pode ser determinada por comparação de atividade in vitro e atividade in vivo em um modelo animal. Métodos para extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais de teste para seres humanos são conhecidos. A dose precisa dependerá de vários fatores,
incluindo o tamanho e localização da área a ser tratada, e a natureza precisa do membro de ligação específico.
[0225] Uma dose de imunoglobulina típica está na faixa 100 µg a 1 g para aplicações sistêmicas, e 1 µg a 1 mg para aplicações tópicas. Uma dose de carga superior inicial, seguida por uma ou mais doses inferiores, pode ser administrada. Essa é uma dose para um tratamento simples de um indivíduo adulto, que pode ser proporcionalmente ajustado para crianças e jovens, e também ajustado para outros formatos de membro de ligação específico em proporção ao peso molecular.
[0226] Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanais ou mensais, a critério do médico. A programação de tratamento para um indivíduo pode ser dependente das propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da composição de membro de ligação específico, em que a via de administração e a natureza da condição é tratada.
[0227] O tratamento pode ser periódico, e o período entre administrações pode ser de cerca de duas semanas ou mais, por exemplo, cerca de três semanas ou mais, cerca de quatro semanas ou mais, cerca de uma vez por mês ou mais, cerca de cinco semanas ou mais, ou cerca de seis semanas ou mais. Por exemplo, o tratamento pode ser a cada duas a quatro semanas ou a cada quatro a oito semanas. As formulações e vias adequadas de administração são descritas acima.
[0228] Em uma modalidade preferencial, um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser para uso em um método de tratamento de câncer.
[0229] O câncer pode ser caracterizado pela proliferação anormal de células cancerígenas malignas. Em que um tipo particular de câncer, como câncer de mama, é denominado, se refere a uma proliferação anormal de células malignas do tecido relevante, como tecido de mama. Um câncer secundário que está localizado na mama, mas é o resultado de proliferação anormal de células malignas de outro tecido, como tecido de ovário, não é um câncer de mama, como denominado no presente documento, mas é um câncer de ovário.
[0230] O câncer pode ser um câncer primário ou secundário. Desse modo, um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser para uso em um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer é um tumor primário e/ou uma metástase tumoral.
[0231] Um tumor de um câncer a ser tratado com o uso de um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode compreender TILs que expressam CD137, por exemplo, em suas superfícies celulares. Em uma modalidade, o tumor pode ter sido determinado para compreender TILs que expressam CD137. Métodos para determinar a expressão de um antígeno em uma superfície celular são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, citometria de fluxo.
[0232] Por exemplo, o câncer a ser tratado com o uso de um membro de ligação específico como descrito no presente documento pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em leucemias, como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL) e leucemia linfoblástica crônica (CLL); linfomas, como linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin e mieloma múltiplo; e cânceres sólidos, como sarcomas (por exemplo, sarcomas de tecido mole), câncer de pele (por exemplo, carcinoma de célula Merkel), melanoma, câncer de bexiga (por exemplo, carcinoma urotelial), câncer do cérebro (por exemplo, glioblastoma multiforme), câncer de mama, câncer de útero/endometrial, câncer de ovário (por exemplo, cistadenoma seroso de ovário), câncer de próstata, câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC) e câncer de pulmão de célula pequena (SCLC), câncer colorretal (por exemplo, adenocarcinoma colorretal), câncer cervical (por exemplo, câncer de célula escamosa cervical e adenocarcinoma cervical), câncer de fígado (por exemplo, carcinoma hepatocelular), câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço), câncer esofágico, câncer do pâncreas, câncer renal (por exemplo, câncer de célula renal), câncer adrenal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer da vesícula biliar e dos tratos biliares (por exemplo, colangiocarcinoma), câncer da tireoide, câncer do timo, câncer ósseo e câncer cerebral.
[0233] Em uma modalidade preferencial, o câncer a ser tratado com o uso de um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, é um câncer sólido. Mais preferencialmente, o câncer a ser tratado com o uso de um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, é um câncer sólido selecionado a partir do grupo que consiste em: sarcoma, melanoma, câncer de bexiga, câncer do cérebro, câncer de mama, câncer uterino/endometrial, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer colorretal, cervical câncer,
fígado câncer, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, renal câncer e câncer de estômago.
[0234] No contexto de câncer, tratamento pode incluir inibir crescimento de câncer, incluir remissão completa de câncer e/ou inibir a metástase de câncer, bem como inibir a recorrência de câncer. O crescimento de câncer se refere, de modo geral, a qualquer um dentre um número de índices que indicam a alteração no câncer para uma forma mais desenvolvida. Desse modo, índices para medir uma inibição de crescimento de câncer incluem uma diminuição em sobrevivência de célula cancerígena, uma diminuição em volume de tumor ou morfologia (por exemplo, como determinado com o uso de tomografia computadorizada (CT), sonografia ou outro método de imageamento), um crescimento tumoral atrasado, uma destruição de vasculatura de tumor, desempenho aprimorado em teste de pele com hipersensitividade atrasada, um aumento na atividade de células anti-cancerígenas imunológicas ou outras respostas imunológicas anticâncer, e uma diminuição em níveis de antígenos específicos de tumor. As respostas imunológicas de ativação e intensificação para tumores cancerígenos em um indivíduo pode aprimorar a capacidade do indivíduo para resistir ao crescimento de câncer, em particular, o crescimento de um câncer já presente no indivíduo e/ou para diminuir a propensão para crescimento de câncer no indivíduo.
[0235] No contexto de tratamento de câncer, um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser administrado a um indivíduo em combinação com outra terapia anticâncer ou agente terapêutico, como uma terapia anticâncer ou agente terapêutico que mostrou ser adequado, ou espera-se que sejam adequados, para o tratamento do câncer em questão. Por exemplo, o membro de ligação específico pode ser administrado ao indivíduo em combinação com um agente quimioterápico, radioterapia, um agente imunoterápico, uma vacina antitumoral, um vírus oncolítico, uma terapia de transferência de célula adotiva (ACT) (como terapia de célula NK adotiva ou terapia com células T de receptor de antígeno quimérico (CAR), linfócitos de infiltração de tumor (TILs) autólogos, ou células T gama/delta, ou um agente para terapia hormonal.
[0236] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que o membro de ligação específico descrito no presente documento pode atuar como um adjuvante em terapia anticâncer. Especificamente, acredita-se que administração do membro de ligação específico a um individual em combinação com quimioterapia e/ou radioterapia, ou em combinação com uma vacina antitumoral, por exemplo, acionará uma resposta imunológica maior contra o câncer que é obtida com quimioterapia e/ou radioterapia, ou com uma vacina antitumoral, por si só.
[0237] Um ou mais agentes quimioterápicos para administração em combinação com um membro de ligação específico como descrito no presente documento podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: taxanos, antibióticos citotóxicos, inibidores de tirosina quinase, inibidores de PARP, inibidores de enzima de B-Raf, inibidores de MEK, inibidores de c-MET, inibidores de VEGFR, inibidores de PDGFR, agentes alquilantes, análogos de platina, análogos de nucleosídeo, antifolatos, derivados de talidomídeo, agentes quimioterápicos antineoplásicos e outros. Taxanos incluem docetaxel, paclitaxel e nab- paclitaxel; antibióticos citotóxicos incluem actinomicina, bleomicina, e antraciclinas como doxorubicina, mitoxantrona e valrubicina; inibidores de tirosina quinase incluem erlotinibe, gefitinibe, axitinibe, PLX3397, imatinibe, cobemitinibe e trametinibe; inibidores de PARP incluem piraparibe; inibidores da enzima B-Raf incluem vemurafenibe e dabrafenibe; agentes alquilantes incluem dacarbazina, ciclofosfamida e temozolomida; análogos de platina incluem carboplatina, cisplatina e oxaliplatina; análogos de nucleosídeo incluem azacitidina, capecitabina, fludarabina, fluorouracila e gemcitabina; antifolatos incluem metotrexato e pemetrexede. Outros agentes quimioterápicos adequados para uso na presente invenção incluem defactinibe, entinostate, eribulina, irinotecano e vinblastina.
[0238] Os agentes terapêuticos preferenciais para administração com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento são doxorubicina, mitoxantrona, ciclofosfamida, cisplatina e oxaliplatina.
[0239] Uma radioterapia para administração em combinação com um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser radioterapia ou braquiterapia de feixe externo.
[0240] Um agente imunoterápico para administração em combinação com um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser uma molécula de anticorpo terapêutica, ácido nucleico, citocina ou terapia à base de citocina. Por exemplo, a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar a uma molécula regulatória imunológica, por exemplo, uma molécula de ponto de verificação inibitória ou uma molécula coestimulatória imunológica, ou um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral de superfície celular ou um antígeno tumoral solúvel. Exemplos de moléculas regulatórias imunológicas às quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, VISTA, PD-L1, PD-1, CD47, CD73, CSF-1R, KIR, CD40, HVEM, IL-10 e CSF-1. Exemplos de receptores do sistema imunológico inato aos quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem receptores TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9, semelhante a RIG-I (por exemplo, RIG-I e MDA-5), e STING. Exemplos de antígenos de tumor aos quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem HER2, EGFR, CD20 e TGF-beta.
[0241] O ácido nucleico para administração em combinação com um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser um siRNA.
[0242] As citocinas ou terapia à base de citocina podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em: IL-2, pró-fármaco de IL-2, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-9, IL-15, IL- 18, IL-21 conjugados, e interferon tipo I.
[0243] Vacinas antitumorais para o tratamento de câncer foram ambas implantadas na clínica e discutidas em detalhes na literatura científica (como Rosenberg, S. 2000). Isso envolve principalmente estratégias para estimular o sistema imunológico a responder a vários marcadores celulares expressos por células cancerosas autólogas ou alogênicas com o uso daquelas células como um método de vacinação, com ou sem fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). O GM-CSF provoca uma forte resposta na apresentação de antígenos e trabalha particularmente bem quando empregado com as ditas estratégias.
[0244] O agente quimioterápico, radioterapia, agente imunoterápico, vacina antitumoral, vírus oncolítico, terapia de ACT, ou agente para terapia hormonal é, preferencialmente, um agente quimioterápico, radioterapia, agente imunoterápico, vacina antitumoral, vírus oncolítico, ACT terapia, ou agente para terapia hormonal para o câncer em questão, isto é, um agente quimioterápico, radioterapia, agente imunoterápico, vacina antitumoral, vírus oncolítico, terapia de ACT, ou agente para terapia hormonal que foi mostrado como eficaz no tratamento do câncer em questão. A seleção de um agente quimioterápico adequado, radioterapia, agente imunoterápico, vacina antitumoral, vírus oncolítico, terapia de ACT, ou agente para terapia hormonal que foi mostrado como eficaz para o câncer em questão está nas capacidades do elemento versado na técnica.
[0245] Em vista da resposta imunológica que melhora a atividade de CD137, espera-se que as moléculas agonistas de CD137 tenham aplicação no tratamento de doenças infecciosas. Desse modo, em outra modalidade preferida, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser para uso em um método de tratamento uma doença infecciosa, como uma doença grave ou infecciosa persistente.
[0246] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que moléculas agonistas CD137 podem ter a capacidade para melhorar a resposta imunológica contra uma doença infecciosa grave causada por um patógeno induzindo-se a rápida infiltração e ativação de células imunológicas inatas, como neutrófilos e monócitos, dessa forma, facilitando a liberação do patógeno responsável pela doença infecciosa grave. Portanto, em uma modalidade adicional, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser para uso em um método de tratamento uma doença infecciosa grave, como uma doença bacteriana grave. Em uma modalidade preferida, a doença infecciosa grave é uma doença bacteriana grave causada por uma infecção por uma bactéria gram positiva, como uma bactéria do gênero Listeria, Streptococcus pneumoniae ou Staphylococcus aureus.
[0247] Doenças infecciosas são normalmente liberadas pelo sistema imunológico, mas algumas infecções persistem por longos períodos de tempo, como meses ou anos, e são combatidas de forma ineficaz pelo sistema imunológico. Tais infecções também são denominadas como infecções persistentes ou crônicas.
[0248] Preferencialmente, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento é usada para tratar uma doença infecciosa persistente, como uma infecção vira, bacteriana, fúngica ou parasitária persistente, preferencialmente, uma infecção viral ou bacteriana persistente.
[0249] Em uma modalidade preferencial, a infecção viral persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente por: vírus imunodeficiente humano (HIV), vírus Epstein-Barr, Citomegalovírus, vírus de
Hepatite B, vírus de Hepatite C, vírus Varicela Zoster.
[0250] Em uma modalidade preferida, a infecção bacteriana persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente de: Staphylococcus aureus, Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Helicobacter pylori, Treponema pallidum ou Streptococcus pneumoniae.
[0251] Descreveu-se o agonismo de CD137 como benéfico no contexto de tratamento de infecções por bactéria gram positiva. Desse modo, em uma modalidade preferida, a infecção bacteriana persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente por uma bactéria gram positiva. Em uma modalidade mais preferida, a infecção bacteriana persistente é uma infecção persistente por uma bactéria gram positiva selecionada a partir do grupo que consiste em: Staphylococcus aureus, Mycobacterium leprae e Streptococcus pneumoniae.
[0252] Em uma modalidade preferencial, a infecção fúngica persistente a ser tratada com o uso de um membro de ligação específico, como descrito no presente documento, é uma infecção persistente de: Candida (por exemplo, Candida albicans), Cryptococcus (por exemplo, Cryptococcus gattii ou Cryptococcus neoformans), Talaromyces (Penicillium) (por exemplo, Talaromyces marneffe), Microsporum (por exemplo, Microsporum audouinii) ou Trichophyton tonsurans.
[0253] Em uma modalidade preferencial, a infecção parasítica persistente a ser tratada com o uso de um membro de ligação específico, como descrito no presente documento,
é uma infecção persistente de: Plasmodium, como Plasmodium falciparum, ou Leishmania, como Leishmania donovani.
[0254] No contexto do tratamento de uma doença infecciosa persistente, o tratamento pode incluir eliminar a infecção, reduzir a carga patogênica do indivíduo, impedir a recorrência da infecção. Por exemplo, o tratamento pode compreender impedir, melhorar, atrasar, anular ou interromper um ou mais sintomas e/ou sinais da infecção persistente. Alternativamente, o tratamento pode incluir impedir uma doença infecciosa.
[0255] No contexto do tratamento de doenças infecciosas, o membro de ligação específico, como descrito no presente documento, pode ser administrado a um indivíduo em combinação com outro agente terapêutico para o tratamento da doença infecciosa, como um agente terapêutico que foi mostrado como adequado, ou espera-se que seja adequado, para o tratamento da doença infecciosa em questão. Por exemplo, o membro de ligação específico pode ser administrado ao indivíduo em combinação com um agente imunoterápico. Um agente imunoterápico para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser uma molécula de anticorpo terapêutica. Por exemplo, a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar a um receptor do sistema imunológico inato. Exemplos de receptores do sistema imunológico inato aos quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem receptores TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9, semelhante a RIG-I (por exemplo, RIG-I e MDA-5), e STING.
[0256] Quando o membro de ligação específico é usado para impedir uma doença infecciosa, o membro de ligação específico pode ser administrado em combinação com uma vacina para o patógeno em questão. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que o membro de ligação específico, descrito no presente documento, pode atuar como um adjuvante em vacinação. Especificamente, acredita-se que a administração do membro de ligação específico a um indivíduo em combinação com vacina, acionará uma resposta imunológica maior contra o patógeno do que é obtida com a vacina por si só.
[0257] Aspectos e modalidades adicionais da invenção ficarão evidentes para aqueles versados na técnica fornecida na presente revelação, incluindo a exemplificação experimental a seguir.
[0258] Todos os documentos mencionados neste relatório descritivo estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0259] “E/ou”, quando usado no presente documento, deve ser considerado como revelação específica de cada um dos dois componentes ou recursos especificados com ou sem o outro. Por exemplo, “A e/ou B” deve ser considerado como revelação específica de cada um dentre (i) A, (ii) B e (iii) A e B, como se cada um fosse apresentado individualmente no presente documento.
[0260] A menos que o contexto indique de outro modo, as descrições e definições dos recursos apresentados acima não se limitam a qualquer aspecto ou modalidade particular da invenção e se aplicam igualmente a todos os aspectos e modalidades que são descritos.
[0261] Outros aspectos e modalidades da invenção fornecem os aspectos e modalidades descritos acima com o termo “que compreende” substituído pelo termo “que consiste em” ou ”que consiste essencialmente em”, salvo caso o contexto dite o contrário.
[0262] Determinados aspectos e modalidades da invenção serão agora ilustrados por meio de exemplo e com referência às figuras descritas acima. Exemplos Exemplo 1: Produção, caracterização e seleção de antígenos humano, de camundongo e de cino
1.1 Antígenos recombinantes
[0263] Os membros da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFRSF) são conhecidos por suas tendências para formar multímeros que se agrupam quando ligados a seus ligantes cognatos (Croft, M. 2003). Essa propensão para agregarem suas funcionalidades torna desafiador produzir proteínas recombinantes solúveis que não agregam em solução para uso em seleções in vitro, como exibição de fago e levedura e para caracterização de proteínas selecionadas.
[0264] Diversos antígenos recombinantes comercialmente disponíveis foram testados e a maior parte se mostrou inadequada para uso nessas seleções devido aos níveis de agregados presentes. Dentre esses testados, apenas a proteína de fusão de hFc CDR137 secretado humano e biotinilada (BPS Biosciences, número de catálogo 71171), designada “hCD137-hFc-Avi-BPS” doravante no presente documento, teve agregação baixa o suficiente para ser adequada e foi usada nas seleções, embora com sucesso limitado (consultar o Exemplo 2).
[0265] Visto que a maior parte dos antígenos comercialmente disponíveis foi considerada como inadequada, os seguintes antígenos recombinantes CD137 diméricos e monoméricos (consultar a Tabela 1), foram produzidos internamente para uso nas seleções: Tabela 1 Tipo Designação Espécie Solúvel Biotinilado Formato ou de célula Antígeno Recombinante mCD137- Camundongo Solúvel Sim Dímero mFc-Avi Recombinante mCD137- Camundongo Solúvel Sim Monômero Avi-His Recombinante hCD137- Humano Solúvel Sim Dímero mFc-Avi Recombinante hCD137- Humano Solúvel Sim Monômero Avi-His Recombinante cCD137- Cino Solúvel Sim Dímero mFc-Avi
[0266] Os antígenos monoméricos foram produzidos por clonagem de DNA que codifica o domínio extracelular de CD137 humano (SEQ ID NO: 181) ou de camundongo (SEQ ID NO: 185) em conjunto com uma sequência de Avi e seis resíduos de histidina C-terminal em vetores de pFUSE modificados (Invivogen número de catálogo pfuse-mg2afc2) com o uso de enzimas de restrição de EcoRI-HF e BamHI-HF. Os vetores foram transfectados em células HEK293-6E (National Research Council of Canada [Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá]), e CD137 expresso foi purificado com o uso de coluna de níquel de excel HisTrap™ (GE LifeSciences 29048586) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)
para garantir que o antígeno fosse uma espécie única e não tivesse agregados.
[0267] Para produzir os antígenos diméricos, os construtos de DNA que codificam um domínio extracelular de CD137 humano, de camundongo ou cinomolgo fusionado com o domínio Fc de mIgG2a em conjunto com uma sequência de Avi foram clonados em vetores de pFUSE modificados e transfectados em células HEK293-6E. CD137 recombinante foi purificado com o uso de coluna de proteína A MabSelect SuRe™ (GE Healthcare, 11003494) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para garantir que o antígeno fosse uma espécie única e não tivesse agregados.
[0268] Cada um dentre os antígenos diméricos e monoméricos foi biotinilado com o uso de um kit de reação de proteína ligase de biotina-biotina de BirA (Avidity LLC, BirA500) para produzir antígenos monoméricos CD137 identificados como uma molécula de biotina simples e antígenos diméricos CD137 etiquetados com duas moléculas de biotina, uma em cada um dos dois monômeros. 3 mg de antígeno foram misturados com 7,8 µl de mistura de enzima BirA a uma razão molar de enzima para substrato de 1:50. Os aditivos foram, então, adicionados de acordo com as recomendações do fabricante (142 µl de Biomix A, 142 µl de Biomix B, 142 µ de Biotina) e a mistura de reação foi incubada por duas horas à temperatura ambiente. A mistura de reação teve tampão imediatamente trocado por DPBS (Life Technologies 14190-169) com o uso de filtros de 30 µm Amicon (Merck Millipore UFC503096).
[0269] As proteínas foram adicionalmente purificadas por SEC para garantir a remoção da enzima BirA e a produção de uma preparação de proteína monodispersada de alta qualidade final sem agregados de alto peso molecular. Em maiores detalhes, os materiais do mesmo lote de produção foram misturados e analisados quanto a estabilidade e pureza por cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC), eletroforese em gel de poliacrilamida de SDS (SDS-PAGE), e cromatografia por exclusão de tamanho com dispersão de luz em múltiplos ângulos (SEC-MALS). A biotinilação completa das proteínas foi confirmada em um gela de SDS-PAGE de troca de estreptavidina. Confirmou-se que os antígenos humano e de camundongo recombinantes se ligam aos anticorpos de controle positivo de anti-CD137 (20H4.9 (Patente nº US7288638)) e Lob12.3 (Universidade de Southampton), respectivamente) in vitro por ressonância de plasmon de superfície (SPR) e às células DO11.10 que expressam ligante CD137 humano e de camundongo por citometria de fluxo. As células foram incubadas com os antígenos CD137 por 1 hora, e, então, um anticorpo de fragmento Fc anticamundongo identificado de modo fluorescente foi usado para detectar a ligação de célula. Confirmou-se que o antígeno cino recombinante se ligou às células DO11.10 (National Jewish Health [Saúde Judaica Nacional]) que expressam ligante CD137 cino por citrometria de fluxo como descrito acima. Para garantir a maior pureza possível para os materiais usados nos protocolos de seleção, através de caracterização de proteína dos antígenos foi realizada para garantir que a presença de agregados de proteína não excedeu 2 %.
1.2 Antígenos expressos em célula
[0270] As células de DO11.10 (National Jewish Health
[Saúde Judaica Nacional]) que expressam CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 184) ou CD137 humano de comprimento completo (SEQ ID NO: 180), designadas “DO11.10.mCD137” e “DO11.10.hCD137” respectivamente, foram produzidas a fim de apresentar o antígeno em uma confirmação de ligação à membrana, mais similar a sua forma natural, para seleções e caracterização adicional de Fcabs selecionados, como listado na Tabela 2.
[0271] A transdução lentiviral foi usada para gerar essas células DO11.10 que superexpressam receptores CD137 humano ou camundongo com o uso do Sistema de Embalagem Lenti-X HTX (Takara, número de catálogo 631249). O vetor de expressão Lenti-X (pLVX) (Takara, número de catálogo 631253) que contém cDNA que codifica CD137 humano (SEQ ID NO: 180) ou CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 184), foi cotransfectado com uma Mistura de Embalagem HTX Lenti-X na Linhagem de Células 293T de Lenti-X (Takara, nº de catálogo 632180) para gerar vírus. A linhagem de células DO11.10 foi, então, transduzida com esses vetores lentivirais.
[0272] A expressão de CD137 humano ou CD137 de camundongo nessas células foi confirmada pela ligação de anticorpos de controle positivo anti-CD137 20H4.9 e Lob12.3, respectivamente, às células por citometria de fluxo. As células foram incubadas com os anticorpos de controle positivo humanos ou de camundongo por 1 hora e, então, um anticorpo de detecção Fc anti-humano etiquetado de modo fluorescente (Stratech Scientific Ltd, número de catálogo 109-546-098-JIR) foi usado para detectar a ligação de célula.
[0273] As células DO11.10 que expressam CD137 de cinomolgo, designadas “DO11.10.cCD137”, também foram geradas com o uso da mesma metodologia de transdução lentiviral e usadas para testar a transreação de Fcabs de anti-CD137 humano com CD137 de cinomolgo. A expressão de CD137 de cinomolgo foi confirmada por ligação de um anticorpo de controle positivo anti-CD137 (MOR_7480.1, documento US 2012/0237498 A1) às células pela citometria de fluxo como descrito anteriormente. Tabela 2 Tipo Designação Espécie Apresentação Célula DO11.10.hCD137 Humano Expresso em Célula Célula DO11.10.mCD137 Camundongo Expresso em Célula Célula DO11.10.cCD137 Cino Expresso em Célula Exemplo 2: Seleção de naïve de Fcabs anti-CD137 humano
[0274] A fim de constatar Fcabs que se ligam a CD137 humano, e para maximizar a diversidade de ligantes identificados, campanhas de seleção de exibição tanto de levedura quanto fago foram empregadas. Visto que CD137 é expresso em baixos níveis em uma diversidade de tipos de célula não imunológica, decidiu-se selecionar Fcabs anti- CD137 humano que alvejam seletivamente células que expressaram CD137 de modo abundante, como células T ativadas. Sem desejar se ligar por teoria, hipotetizou-se que as células com níveis muito baixos ou dispensáveis de expressão de CD137 seriam mais propensos a ter CD137 em estado monomérico em suas superfícies celulares, diferente de células T ativadas com expressão de CD137 altamente regulada de modo ascendente, em que espera-se que a maior parte da proteína esteja presente nos estados dimérico, trimérico ou multimérico superior na superfície celular.
[0275] As células que superexpressam CD137, ou proteínas de CD137 humano dimérico recombinante, foram usadas em seleções de Fcab a fim de expor aqueles epítopos representativos que facilitam as interações de ligação com células com CD137 multimérico altamente regulado de modo ascendente. Além disso, usar antígenos diméricos foi considerado benéfico para selecionar Fcabs bivalentes que se ligam avidamente a CD137, e permaneceram engatados ao alvo por mais tempo, o que, por sua vez, hipotetizou-se facilitar a ligação preferencial a células com níveis de expressão regulados de modo ascendente de CD137. Nesse contexto, CD137 recombinante monomérico não foi usado a fim de impedir a seleção de ligantes de Fcab monovalentes de afinidade muito alta que pode se ligar a CD137 muito fortemente.
[0276] O objetivo dessa estratégia de seleção foi obter Fcabs que se ligariam, preferencialmente, a células T ativadas e não se ligariam bem a células T naïve que exibem apenas CD137 monomérico, ou a outras células que expressam níveis muito baixos de CD137. Selecionando-se Fcabs CD137 que se ligam de modo bivalente e, preferencialmente, a antígeno dimérico e multimérico versus antígeno monomérico, acredita-se que uma ativação de célula T sem alvo potencial seria reduzida, com toxicidade associada reduzida. Exibição de fago
[0277] Seis bibliotecas de fagos naïve que exibem o domínio CH3 de IgG1 humano foram usadas para seleções por exibição de fago. Todas as seis bibliotecas compreenderam alças AB aleatorizadas (que compreendem resíduos nas posições 14-18 de acordo com numeração IMGT) e alças EF aleatorizadas (que compreendem resíduos nas posições 92- 101, de acordo com numeração IMGT). Uma dentre as bibliotecas compreendeu clones com uma inserção de dois ou quatro aminoácidos (codificados por dois ou quatro códons de NNK) na posição 101 na alça EF (os resíduos inseridos estão nas posições 101,4 - 101,1, de acordo com numeração IMGT).
[0278] Um total de 12 campanhas de seleção foi realizado para identificar ligantes de anti-CD137 humano. O antígeno hCD137-mFc-Avi interno ou células que expressam antígeno hCD137-hFc-Avi-BPS antígeno e/ou antígeno DO11.10.hCD137 de fonte comercial foram usados em seleções com o uso das seis bibliotecas de fago. Visto que apenas uma sequência de Fcab funcional foi identificada a partir de seleções iniciais com o uso do antígeno recombinante hCD137-hFc-Avi-BPS, o hCD137-mFc-Avi interno foi usado nos ciclos de seleções restantes em CD137 recombinante. Os ciclos iniciais foram realizados com o uso de 100 nM de antígeno biotinilado, com uma etapa de desmarcação com o uso de 500 nM de fragmento Fc humano recombinante não identificado produzido internamente. Os ligantes de fago foram capturados por microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina ou neutravidina. Para saídas de seleção em que a ligação não específica ao fragmento Fc foi detectada por ELISA de fago (A450-630 nm maior que 0,4), em que uma etapa de desmarcação adicional foi introduzida, por meio da qual o fragmento Fc biotinilado (produzido internamente) foi incubado com as saídas de fago. Os ligantes não Fc foram separados dos ligantes Fc por captura magnética de fago de ligação a Fc biotinilado.
[0279] A fim de ligar os ligantes à conformação natural ligada a membrana de CD137, as seleções de célula foram realizadas como a seguir: saídas de fago de seleções de antígeno recombinante foram incubadas com células DO11.10 que carecem de CD137 humano para descartar ligantes indesejados, como aqueles que não se ligam especificamente a células. Em seguida, os fagos foram incubados com 1 × 107 células DO11.10.hCD137, os ligantes foram eluídos por digestão de tripsina e, então, propagados para o próximo ciclo. O ciclo 3 seguiu um processo similar, aumentando a pressão de seleção diminuindo-se o número de células de DO11.10.hCD137 para 5 × 106.
[0280] Os ELISAs de fago foram realizados após cada ciclo de seleção para determinar o enriquecimento de fago específico de antígeno. As placas de 96 poços de estreptavidina foram revestidas durante a noite com 1 µg/ml de antígeno biotinilado. Após bloquear as placas com 4 % de PBS marvel, 50 µl de tensoativo bacteriano que contém fago foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora à temperatura ambiente com agitação a 450 rpm. A solução de fago foi descartada invertendo-se a placa e lavando 4 vezes com PBS 0,1 % de Tween e 4 vezes com PBS. O anticorpo conjugado fago-HRP anti-M13 foi, então, adicionado para detectar fago ligado a antígeno imobilizado. A solução de fago foi descartada invertendo-se a placa e lavando 4 vezes com PBS 0,1 % de Tween e 4 vezes com PBS. A solução de peroxidase em micropoço de TMB foi adicionada a cada poço e permitiu-se que a mesma desenvolvesse cor por até 30 minutos. A reação foi interrompida com ácido sulfúrico a 1 M, e a placa lida a OD450-630 em um leitor de placa de microtitulação. As manifestações específicas foram definidas como aquelas que apresentam forças de sinal para CD137 recombinante pelo menos 4 vezes maior que o fundo, como definido por um controle negativo, isto é, PBS ou um fago de não ligante negativo como CH3 do tipo selvagem, e pelo menos 10 vezes maior que a força de ligação a fragmento Fc recombinante biotinilado.
[0281] Os ensaios de ordenação de célula ativada por fluorescência de fago (FACS de fago) foram realizados em saídas de seleção de célula dos ciclos 2 e 3. Resumidamente, 2 × 105 células foram transferidas para uma placa de microtitulação de fundo redondo. O tensoativo de fago foi adicionado às células e incubado por 1 hora a 4 °C. As células foram, então, lavadas duas vezes em tampão de BSA de 2 % de PBS gelado, ressuspensas em uma solução de 100 µl de anticorpo anti-M13 e um fragmento de IgG F(ab') anticamundongo de cabra conjugado com FITC e incubadas com células por 1 hora em gelo. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo após 3 lavagens em PBS. Em FACS de fago, as manifestações específicas foram definidas como aquelas que apresentam intensidade de fluorescência média geométrica (MFI) para células positivas CD137 de sinal de ligação pelo menos 10 vezes maior para CD137 recombinante e pelo menos 4 vezes maior que o fundo, como definido por um controle negativo (PBS)
[0282] 3230 clones de fago foram triados por ELISA de fago quanto à ligação ao antígeno hCD137 recombinante dimérico e o Fc recombinante foi usado como um controle negativo. 1140 clones de fago foram triados por FACS de fago quanto a ligação às células DO11.10.hCD137. Manifestações individuais foram, então, sequenciadas e as 76 sequências únicas resultantes foram atribuídas com um identificador de clone de Fcab e subclonadas um vetor de expressão pTT5 (National Research Council of Canada [Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá]) que contém um cassete de expressão de cadeia pesada de HelD1.3 IgG1 para propósitos de expressar os clones de Fcab em formato de mAb2 (consultar o Exemplo 3.1). Exibição de levedura
[0283] Quatro bibliotecas de levedura naïve que exibem CH1 aos domínios CH3 de IgG1 humano foram usadas para seleção por exibição de levedura. Todas as quatro bibliotecas compreenderam alças AB aleatorizadas (que compreendem resíduos nas posições 14 a 18 de acordo com numeração IMGT) e alças EF aleatorizadas (que compreendem resíduos nas posições 92 a 101, de acordo com numeração IMGT) no domínio CH3. Duas dentre as bibliotecas compreenderam adicionalmente uma inserção de cinco resíduos de aminoácido na posição 16 na alça de AB do domínio CH3 (resíduos nas posições 16,5 a 16,1, de acordo com numeração IMGT).
[0284] O antígeno hCD137-mFc-Avi interno ou antígeno hCD137-hFc-Avi-BPS de fonte comercial foram usados em seleções com o uso das quatro bibliotecas de levedura, embora de modo similar às seleções de fago, o antígeno de fonte comercial não foi usado após os ciclos iniciais de seleção e o antígeno interno foi usado em vez disso. Para cada biblioteca, um primeiro ciclo de seleção foi realizado com o uso de separação de célula magnética (MACS). As bibliotecas foram cultivadas, induzidas e 1 × 1010 células foram incubadas com 250 ou 300 nM de antígeno recombinante biotinilado após uma etapa de desmarcação com 1,25 µM de Fc humano ou de camundongo não identificado. Os ligantes de levedura foram separados adicionando-se microesferas magnéticas de estreptavidina e com o uso de colunas de LS MACS (Miltenyi Biotech 130-042-401). Os ciclos subsequentes de seleções foram realizados por ordenação de célula ativada por fluorescência (FACS) em instrumentos FACS-Aria II (BD Bioscience) usando-se anticorpos fluorescentemente marcados para detectar o antígeno ligado (anti-Biotina-APC (Miltenyi Biotech 130-090-856), estreptavidina-APC (BD Biosciences 349024), ou neutravidina-DyLight-488 (Thermo Fisher 22832), arcabouços de IgG corretamente dobrados (domínio-FITC CH2 de IgG anti-humano(Biorad AbD Serotec (MCA647F)), ou expressão do construto aga2-IgG (anti-Xpress (Life Technologies R91025) e IgG-FITC anticamundongo (Sigma F2653-.5ML)). Sempre que possível, o marcador de antígeno foi usado em conjunto com um dos marcadores estruturais para normalizar o sinal de intensidade de ligação pela expressão de Fcab em superfície de levedura. As populações de levedura não colorizadas e de controle foram usadas para estabelecer as portas de ordenação como a seguir: células de levedura em uma plotagem de FSC-A e SSC-A, plotagens de FSC-W e FSC-H para discriminar singletos de multipletos ou células de levedura de brotamento, e plotagens de FITC-A e APC-A para detectar Fcab de ligação duplamente positivos.
[0285] A concentração de antígeno usada em cada ciclo foi determinada empiricamente realizando-se o controle de qualidade de saída com o uso da concentração de antígeno usada no ciclo anterior. Se o enriquecimento de ligação aumentou ao longo do ciclo anterior (> 5 vezes), a concentração de antígeno caiu 1:2 ou 1:3, do contrário, a mesma foi mantida constante. Esse processo também foi seguido para determinar quantos ciclos de seleções foram necessários e a possibilidade de a ramificação de seleção ter sido considerada como exaustiva (se a diversidade cair para apenas algumas sequências dominantes ou a ligação de antígeno não aumentar após 2 ciclos).
[0286] 2784 clones simples de levedura identificados a partir de seleções de biblioteca foram individualmente triados como a seguir: após cada ciclo de seleção, células de levedura simples foram observadas em placas de ágar SDCAA com o uso de um instrumento FACS-Aria II (BD Biosciences) e triadas no seguinte ensaio de ligação a antígeno de citometria de fluxo: colônias de clone simples foram cultivadas até que as colônias alcançassem um diâmetro de 2 mm e, então, transferidas para uma placa de poço fundo que contém 600 µl de meios líquidos de SDCAA. As culturas foram cultivadas em 30 °C com 1000 rpm de agitação durante a noite. A expressão do arcabouço de proteína aga2- IgG foi induzida substituindo-se os meios de cultivo com meios de indução SGRCAA em uma densidade óptica de 1 (OD600=1). As células foram incubadas com antígeno humano dimérico recombinante biotinilado ou fragmento Fc de camundongo para discriminar contra clones de levedura que se ligam à porção Fc do antígeno hCD137 recombinante. As células de levedura que se ligam a proteína foram identificadas com o uso de estreptavidina-APC. Um anticorpo anti-CH2-FITC também foi usado como um marcador de IgG estrutural. Para analisar o resultado da triagem, a ligação a fragmento Fc foi plotada e qualquer clone que se ligou a Fc biotiniliado foi descartada. A ligação foi definida como maior que 0,2 % de células que foram positivas para fluorescência de APC com o portal colocado com o uso de amostras não colorizadas e de controle negativo.
[0287] As seleções foram repetidas com concentrações e condições de antígeno variantes, como temperatura de indução crescente, diminuição da estringência de seleção ou redução de número de ciclos a fim de aumentar o número de manifestações. O sequenciamento de manifestação revelou diversidade de saída consideravelmente baixa, em que apenas 9 clones de Fcab têm sequências únicas identificadas: FS22- 053, FS22-172, FS22-173, FS22-174, FS22-175, FS22-176, FS22-177, FS22-178 e FS22-179. Exemplo 3: Caracterização de Fcabs anti-CD137 humano a partir de seleções de naïve
3.1 Preparação de Fcabs de anti-CD137 humano em formato de mAb2 "simulado"
[0288] Os anticorpos mAb2 “simulados” que consistem em moléculas de IgG1 que compreendem os 76 clones de Fcab anti-CD137 humano isolados de fago e 9 clones isolados de seleções de levedura foram produzidos para permitir a caracterização dos Fcabs em um formato de mAb2. Os mAb2 simulados foram preparadas substituindo-se parte dos Fcabs de domínio CH3 que compreende as alças AB, CD e EF, para a região correspondente do domínio CH3 do anticorpo de lisozima de ovo anti-hen HelD1.3. A geração do anticorpo HelD1.3 é descrita em Tello et al. 1993. As sequências de cadeia pesada e leve de anticorpo HelD1.3 são mostradas em SEQ ID 186 e 173, respectivamente. As moléculas de mAb² simulados foram produzidas por expressão transiente em células HEK293-6E. Para avaliar a quantidade de proteína produzida, o teor de proteína de IgG foi quantificado por Interferometria BioLayer com o uso da plataforma Octet QKe com biossensores de quantificação de Proteína A da PALL (18-5021). As proteínas foram purificadas por cromatografia por afinidade de proteína A com o uso de colunas de mAb SelectSure. 53 proteínas de mAb² CD137 derivadas por fago apresentaram medições abaixo do limite de detecção e, portanto, foram determinadas como inadequadas para análise adicional. 32 mAb² foram purificados com o uso de colunas de proteína A de mAb Select SuRe (GE Healthcare, 11003494): FS22-005, FS22-007, FS22-033, FS22-042, FS22-049, FS22-050, FS22-052, FS22-053, FS22-054, FS22-167, FS22-169, FS22-170, FS22-171, FS22-172, FS22-173, FS22-174, FS22-175, FS22-176, FS22-177, FS22-178, FS22-179, FS22-180, FS22-181, FS22-183, FS22-184, FS22-186, FS22-187, FS22-191, FS22-192, FS22-193, FS22-194, FS22-195.
[0289] Para os fins de comparação de níveis de expressão, alguns dos Fcabs iniciais também foram subclonados e expressos como Fcabs solúveis (que contêm uma dobradiça truncada) em células HEK293-6E e purificada com o uso de colunas de proteína A mAb Select SuRe. Interessantemente, constatou-se que alguns dos Fcabs observados têm comportamento biofísico e rendimentos de produto significativamente melhores em formato de mAb2 simulado que como Fcabs solúveis. Esse foi o caso de clone naïve FS22-053 que foi produzido em rendimentos muito baixos como Fcab solúvel, mas isso foi aprimorado 25 vezes quando expresso em um formato de mAb² simulado, que resulta em mais clones serem disponibilizados para caracterização.
3.2 Ligação a antígeno recombinante por BLI
[0290] 31 dentre as moléculas de mAb² simulado purificadas (excluindo o clone FS22-175) foram testadas quanto a ligação a antígeno recombinante humano em um experimento de ligação a ponto único por Interferometria BioLayer com o uso da plataforma QKe Octet. Os biossensores BLI de Estreptavidina (PALL 18-5021) foram usados para capturar antígeno hCD137-mFc-Avi biotinilado a 10 µg/ml em tampão cinético (PALL). Os sensores foram, então, imersos por 240 segundos em um poço com mAb² purificado diluído em 1:1 no mesmo tampão cinético, seguido por um poço que contém 1× tampão cinético por 240 segundos. As manifestações de ligação foram classificadas em um critério de sim/não booleano simples, como definido por uma resposta de BLI acima de tampão e mAb HelD1.3 de controle de IgG1 do tipo selvagem (G1/HelD1.3): 12 mAb² não se ligaram e 19 se ligaram a sensores revestidos com CD137 (FS22-007, FS22- 033, FS22-042, FS22-049, FS22-050, FS22-052, FS22-053, FS22-054, FS22-169, FS22-172, FS22-173, FS22-174, FS22-179, FS22-180, FS22-181, FS22-183, FS22-187, FS22-194, FS22- 195).
3.3 Atividade de mAb2 simulado anti-CD137 selecionado em um ensaio de repórter NF-κB humano
[0291] A multimerização e o agrupamento são exigidos para sinalização de TNFR (Bitra et al., 2017). CD137 agrupa e ativa a trajetória de sinalização de NF-κB quando o mesmo interage com seu ligante cognato, CD137L. As moléculas agonistas imitam o ligante no acionamento do agrupamento e da ativação de CD137, portanto, ativando a trajetória de sinalização de NF-κB. Sabe-se que alguns anticorpos agonísticos podem causar inerentemente o agrupamento de CD137 mediante a ligação, por exemplo, de urelumabe, enquanto outros exigem reticulação adicional do próprio anticorpo para induzir o agrupamento de CD137, como utomilumabe (Fisher et al., 2012). Os receptores Fc gama em células efetoras são conhecidos por induzir tal reticulação in vivo, embora isso seja ineficiente e possa ocorrer distante do sítio de interesse terapêutico. Visto que as toxicidades dose-limitantes foram associadas ao tratamento com alguns anticorpos anti-CD137, decidiu-se selecionar por Fcabs de ligação ao anti-CD137 que não tiveram a habilidade para agonizar inerentemente, mas selecionar apenas aqueles que exigem a reticulação adicional a fim de induzir o agrupamento de CD137. Portanto, foi desenvolvido um ensaio que pode detectar a ativação da trajetória de sinalização de NF-κB em uma célula mediante o agrupamento de CD137 expresso na superfície celular por anticorpos reticulados, mas que mostraram pouca atividade quando os anticorpos foram reticulados. Esse ensaio foi, então, usado para testar a atividade funcional agonística de 27 clones de Fcab anti-CD137 em formato de mAb2 simulados, e 6 clones de Fcab anti-CD137 em formato de mAb² anti-CD20, independentemente da possibilidade de se constatar que os Fcabs se ligam ao antígeno recombinante por BLI ou não.
[0292] A proteína L foi usada como um agente de reticulação para acionar a reticulação dos mAb2 simulados por meio de suas porções de Fab no ensaio e a ativação de
NF-κB foi medida.
[0293] cDNA que codifica CD137 humano (SEQ ID 180) foi subclonado em vetor pMSCV-neomicina (Takara Clontech, Cat. 634401) com o uso de enzimas de restrição de EcoRI-HF e XhoI. A linhagem celular RetroPack PT67 (Clontech, Cat. 631510) foi usada para produzir partículas retrovirais seguindo os protocolos do fabricante. Esse retro vírus foi subsequentemente usado para transduzir células HEK.FRT.luc que foram anteriormente geradas transduzindo-se uma linhagem de células Flp-In T-REx 293 HEK (Life Technologies, R780-07) com lentivírus de Repórter de NFkB Qiagen Cignal Lenti (luc) (Qiagen, nº de catálogo 336851) que contêm um promotor sensível a NF-κB que controla a expressão de luciferase. Essas células HEK.FRT.luc.hCD137 foram usadas para triar os mAb² simulados que contêm os ligantes CD137 identificados nas seleções.
[0294] Uma diluição de 2 µM de cada um dos mAb2 simulados foi preparada em DPBS (Life Technologies, 14190169) e adicionalmente diluída 1:3 em meio celular repórter (DMEM (Gibco, Cat. 61965-026); 10 % de FCS (Gibco, Cat. 10270-106); 1x PennStrep (Gibco, Cat. 15140-122); Blasticidina de 15 µg/ml (Melford Laboratories Ltd. Cat. B1105); Puromicina de 5 µg/ml (Life technologies, Cat. A11113803); Zeocina 100 µg/ml (InvivGen, Cat. 11006-33-0); Geneticina de 500 µg/ml (Life Technologies, Cat. 10131- 027). Proteína L (Life Technologies, 21189), foi usada como um agente de reticulação artificial e foi misturada com as moléculas de mAb² em uma razão molar de 1:4. Após uma incubação de 24 horas, as células foram tratadas com 100 µl de reagente de ensaio de luciferase Promega Bio-Glo™
(Promega número de catálogo G7941) de acordo com as instruções do fabricante e a luminescência foi medida com um tempo de integração de 0,5 segundos em um leitor de placa com o Software Gen5, BioTek. Os valores de luminescência são uma medição da luciferase produzida em resposta à ativação da trajetória de sinalização de NF-κB pelo agrupamento de CD137 induzido por Fcabs reticulados. Os valores de luminescência foram plotados versus a concentração de log de Fcab e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism.
[0295] As manifestações foram identificadas por ter pelo menos um aumento de 10 vezes em sinal de luciferase quando reticuladas com proteína L como em comparação com quando não foram reticuladas. Esses clones foram determinados como com a capacidade para induzir o agrupamento de CD137 e a ativação subsequente de trajetórias de sinalização a jusante. Dentre todos os clones testados, dois tiveram a capacidade para induzir esse aumento de 10 vezes em luciferase na reticulação, FS22-053 e FS22-172, embora um EC50 não possa ser determinado para qualquer um desses. Ambos foram selecionados para caracterização adicional em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10. Surpreendentemente, a atividade não foi observada para os clones restantes em condições reticuladas independentemente da ligação a CD137 alvejada por BLI, em que indica, talvez, que os mesmos se ligaram a um epítopo irrelevante em CD137, ou que a afinidade de tais clones não foi suficiente para se ligar a CD137 forte o suficiente para iniciar a cascata de sinalização de NF-κB.
[0296] De modo geral, embora mais que 30 Fcabs fossem testados, apenas dois Fcabs (FS22-053 e FS22-172) foram identificados a partir das seleções de naïve que exibiram a função desejada no ensaio de repórter de NF-κB quando reticulados e tiveram pouca atividade quando não foram reticulados.
3.4 Atividade dos mAb2 simulados anti-CD137 selecionados em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10
[0297] O agrupamento de CD137 por meio de moléculas agonistas em células T ativadas sucinta a ativação de célula T e sinalização a jusante que resulta em, porém sem limitação, produção de IL-2. Visto que FS22-053 e FS22-172 foram identificados como tendo atividade no ensaio de repórter de NFKB, suas habilidades para ativar CD137 foram testadas em um ensaio de ativação de célula T. Um ensaio de ativação de célula T de DO11.10 com o uso de células T de DO11.10 geneticamente modificadas para superexpressar CD137 humano foi desenvolvido e a ativação de célula T foi avaliada medindo-se a liberação de IL-2.
[0298] As células T de DO11.10 (National Jewish Health [Saúde Judaica Nacional]) foram transduzidas com um vetor lentiviral projetado para superexpressar CD137 de camundongo ou humano como descrito anteriormente. Bem como FS22-053 e FS22-172, os seguintes clones foram testados nesse ensaio de ativação de célula T de DO11.10: FS22-007, FS22-033, FS22-042, FS22-049, FS22-050, FS22-052, FS22-054, (todos em formato de mAb2 HelD1.3 “simulado”). As diluições de mAb2 ou mAb de controle positivo 20H4.9 com ou sem reticulador de Proteína L recombinante (Life Technologies, 21189) foram preparadas e adicionadas às células
DO11.10.hCD137 em uma placa de fundo redondo de 96 poços que foi revestida durante a noite com 0,1 µg/ml de anticorpo anti-CD3 (clone 17A2, BioLegend, 100208). Após uma incubação de 18 horas, os tensoativos foram coletados e ensaiados com kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience, 88-7024-86) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com Software Gens, BioTek. Os valores de absorbância de 570 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gens, BioTek). A concentração de mlL-2 foi plotada vs a concentração de log de mAb2 ou mAb de referência e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism.
[0299] Os clones FS22-053 e FS22-172 mostraram atividade significativamente intensificada quando reticulados com Proteína L nesse ensaio. FS22-053 teve uma atividade de 126 nM quando não reticulado e uma atividade de 21 nM quando reticulado (um aprimoramento de 6 vezes), enquanto FS22-172 teve uma atividade de 950 nM quando não reticulado e uma atividade de 44 nM quando reticulado (um aprimoramento de 22 vezes). Como resultado, ambos os clones foram selecionados para maturação de afinidade. Além disso, embora o clone de FS22-033 não mostrou atividade nesse ensaio, esse também foi selecionado quanto a maturação por afinidade visto que se acredita-se que esse seja propenso a se ligar a antígeno recombinante em um epítopo diferente devido ao mesmo não competir com clones de FS22-053 e FS22- 172 para ligação no ensaio de ligação a BLI (dados não mostrados). Acredita-se que um aprimoramento em afinidade de ligação do clone a CD137 também pode resultar em atividade funcional aprimorada (consultar o Exemplo 4.1).
3.5 Preparação de Fcabs anti-CD137 humano em um formato de mAb2 CD137/CD20
[0300] Um painel de Fcabs anti-CD137 (FS22-053, FS22- 175, FS22-176, FS22-177, FS22-178, FS22-179) foi produzido para permitir a caracterização dos Fcabs em um formato de mAb2 mais biologicamente relevante. Os mAb2 foram preparadas substituindo-se parte dos Fcabs de domínio CH3 que compreende as alças AB, CD e EF, para a região correspondente do domínio CH3 do clone 2F2 anti-CD20 (do documento nº US 8.529.902 B2) para produzir mAb2 que se ligam tanto a CD137 quanto a CD20. Esses mAb2CD137/CD20 foram produzidos por meio de expressão transiente em células HEK293-6E e purificado com o uso de colunas de proteína A Select SuRe de mAb.
3.6 Atividade de mAb2 anti-CD137/CD20 em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10
[0301] O Exemplo 3.4 descreve um ensaio de ativação de célula T no qual mAb² simulados anti-CD137 foram reticulados com o uso de Proteína L. Tal configuração forneceu uma forma confiável e reproduzível para triar um número substancial de moléculas, embora as estruturas de ordem superior formadas pelos anticorpos e mAb2 quando reticulados sejam subideais e não representativas do ambiente fisiológico. Uma configuração biologicamente é uma em que a molécula de mAb² é reticulada através de seus braços Fab a um alvo presente no sistema biológico. Esse sistema in vitro com base em célula otimiza a apresentação dos anticorpos e mAb2 por meio de ligação de Fab a membranas celulares, que aciona o agrupamento dos anticorpos que, por sua vez, aumenta a afinidade do braço Fcab de CD137 para seu alvo em células T.
[0302] As células Daudi CD20+ (ATCC CCL-213) foram semeadas em placa de 96 poços de fundo redondo em razão de 1:1 com as células DO11.10.hCD137 usadas no Exemplo 3.4. Os 6 clones produzidos no Exemplo 3.5 nos mAb² CD137/CD20 foram testados nesse ensaio de ativação de célula T de DO11.10. As diluições de mAb2 ou mAb de controle positivo om ou sem reticulador de Proteína L recombinante (Life Technologies, 21189) foram preparadas e adicionadas às células DO11.10.hCD137 e Daudi em uma placa de fundo redondo de 96 poços que foi revestida durante a noite com 0,1 µg/ml de anticorpo anti-CD3 (clone 17A2, BioLegend, 100208). Após uma incubação de 18 horas, os tensoativos foram coletados e ensaiados com kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience, 88-7024-86) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com Software Gens, BioTek. Os valores de absorbância de 570 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gens, BioTek). A concentração de mlL-2 foi plotada vs a concentração de log de mAb2 ou mAb de referência e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism. Dentre todos os clones testados, FS22-053 foi o único que mostrou produção de IL-2 significativa nessa configuração de reticulação com base em célula CD20,
com um EC50 de 0,3 nM (e 126 nM na ausência de células CD20+).
[0303] Os Exemplos 3.4 e 3.6 mostram que FS22-053 pode acionar o agrupamento e a ativação de CD137 na superfície de células T de DO11.10 quando reticulado por Proteína L ou por célula com base em reticulação por meio de Fab que se liga a outro alvo nos formatos de mAb² testados (HelD1.3 e CD20). Exemplo 4: Maturação por afinidade de Fcabs anti-humano
[0304] Como discutido anteriormente, três clones foram selecionados para maturação de afinidade com base em suas características funcionais no ensaio de repórter de NF-κB, os ensaios de ativação de célula T de DO11.10 FS22-053 e FS22-172) ou que se acreditam que se ligam a uma área diferente de CD137 (FS22-033).
4.1 Maturação de afinidade de FS22-033
[0305] Duas bibliotecas que exibiram levedura e duas bibliotecas que exibiram fago foram construídas a partir do clone FS22-033, uma aleatorizando-se cinco resíduos na alça AB do domínio CH3 e a outra aleatorizando-se cinco resíduos na alça EF do domínio CH3 com o uso de iniciadores de ELLA. Os iniciadores de ELLA especificam os códons usados para cada aminoácido e suas abundâncias relativas na mistura. Apenas a cisteína foi excluída da mistura e nenhum desvio foi gerado para qualquer outro aminoácido.
[0306] Para as bibliotecas de AB FS22-033 e EF FS22-033 de fago, dois ciclos de seleções para clones maturados por afinidade foram realizadas com o uso de 200 nM de hCD137- mFc-Avi no ciclo 1 e 10 nM de hCD137-mFc-Avi no ciclo 2. 96 clones de cada saída de seleção foram triados por ELISA de fago. Essa triagem identificou 24 clones únicos (FS22-033- 001 a FS22-033-024), em que todos foram produzidos como mAb² simulados que contêm HelD1.3 e, então, testados quanto a cinética de ligação aprimorada por BLI, como descrito no Exemplo 3.2. Nenhum desses 24 clones maturados por afinidade teve melhor desempenho que o clone FS22-033 parental nesse ensaio e, dessa forma, não foram buscados. Para as bibliotecas AB FS22-033 e EF FS22-033 de levedura, três ciclos de seleções foram realizados como a segui: ciclos 1 e 2 com 300 nM de hCD137-mFc-Avi seguidos por um terceiro ciclo com 300 nM de hCD137-mFc-Avi, 300 nM de CD137-mFc-Avi de cino, ou 300 nM de hCD137-Avi-his. 1056 clones das saídas de ciclos 2 e 3 foram sequenciados, todos os clones únicos identificados foram triados em um ensaio de citometria de fluxo de ligação a antígeno para ligação aprimorada a antígeno em comparação com o clone FS22-033 parental com o uso de 30 nM de antígeno recombinante dimérico humano, e os clones foram classificados pela porcentagem de células APC+ que se correlacionam a força de ligação. Os cinco melhores clones (FS22-033-025, FS22-033- 026, FS22-033-027, FS22-033-028, FS22-033-029) foram, então, produzidos como mAb² HelD1.3 (como descrito no exemplo 3.1) e a ligação a antígeno recombinante dimérico humano foi testada por BLI, como descrito anteriormente, mas nenhum dos clones mostrou perfil cinético aprimorado para o clone FS22-033 parental e, assim, esses clones não foram adicionalmente buscados.
4.2 Maturação de afinidade de FS22-053 e FS22-172
[0307] Quatro bibliotecas exibiram levedura foram construídas a partir dos clones de Fcab FS22-053 e FS22-
172. Sete resíduos (nas posições 15-16.1, de acordo com o IMGT) foram aleatorizados com o uso de iniciadores de ELLA, com a mesma distribuição de trinucleotídeo, como aquele descrito no Exemplo 4.1, na alça AB do domínio CH3 de cada clone para compor as bibliotecas AB de FS22-053 e AB de FS22-172 AB. Cinco resíduos (nas posições 92-94 e 97-98 de acordo com IMGT) foram aleatorizados com o uso de iniciadores ELLA na alça de EF do domínio CH3 que resulta em bibliotecas FS22-053 EF e FS22-172 EF.
[0308] Para as bibliotecas de AB FS22-053 e EF FS22-053, e AB FS22-172 e EF FS22-172, três ou quatro ciclos de seleção foram realizados nas bibliotecas de levedura para selecionar quanto aos clones maturados por afinidade com o uso de antígeno hCD137-mFc-Avi dimérico ou antígeno hCD137- Avi-His monomérico. O antígeno monomérico foi usado na alteração com antígenos diméricos para garantir que os clones mantivessem a afinidade ao antígeno e não se ligassem exclusivamente através de avidez. O uso de antígeno monomérico ou dimérico, bem como a concentração usada, foi determinado empiricamente durante cada ciclo por citometria de fluxo, determinado pela possibilidade de enriquecimento contra o antígeno monomérico ou dimérico ter sido observada no ciclo anterior. Sempre que possível, uma porta de ordenação acima da parental foi usada para isolar os clones maturados por afinidade em comparação com a molécula parental. A pressão de seleção foi aumentada até 1 nM de antígeno dimérico. Durante cada ciclo de seleção, clones individuais foram localizados em placas de ágar para avaliar o progresso da seleção. Cada clone foi cultivado e induzido individualmente e em seguida seus parâmetros de ligação e estruturais foram determinados por citometria de fluxo com o uso de antígeno dimérico biotinilado bem como marcadores estruturais anti-CH2, como descrito anteriormente. Essa cascata de triagem foi seguida para permitir a determinação de sucesso de seleção com base em uma amostra de clones do resultado de seleção e para permitir a triagem precoce de clones individuais que podem ser subsequentemente produzidos como proteínas solúveis.
[0309] 1152 clones simples de levedura no total foram triados quanto a ligação ao antígeno recombinante biotinilado em uma citometria de fluxo de ligação de antígeno, como descrito anteriormente. As seleções na biblioteca de EF FS22-053 resultaram em enriquecimento de 138 sequências de alça único. De modo semelhante, 30 sequências de alça único foram isoladas da biblioteca de AB FS22-172. As bibliotecas de AB FS22-053 e EF FS22-172 não contiveram quaisquer clones que mostraram qualquer aprimoramento de ligação ao longo dos clones parentais. A análise de sequência ao longo dos clones de melhor ligação das bibliotecas de EF FS22-053 e AB FS22-172 revelaram uma sequência de PPY conservada padrão nas alças AB. Visto que essa sequência foi conservada após a maturação por afinidade, e foi independentemente selecionada em suas linhagens separadas de Fcabs, pode ser importante para ligação de epítopo em CD137. Adicionalmente, um padrão de sequência de LE ou LD conservado nas alças EF do domínio CH3 dos clones tanto da linhagem FS22-053 quanto da linhagem FS22-172, que sugere que esse motivo de aminoácido na alça de EF é exigido para ligação aprimorada.
[0310] A fim de avaliar o progresso das seleções e a possibilidade de ser necessário recombinar alças AB e EF mutadas entre clones maturados por afinidade, os cinco clones únicos principais da biblioteca de EF FS22-053 (FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-010, FS22-053-011, FS22-053-012) classificados por apresentar ligação específica ao antígeno humano dimérico de 10 nM (maior que 30 % de células positivas de APC em um ensaio de ligação de citometria de fluxo), e os seis clones únicos principais da biblioteca de AB FS22-172 (FS22-172-001, FS22-172-002, FS22-172-003, FS22-172-004, FS22-172- 005, FS22-172-006, em que todos mostram células positivas de APC de acima 10 % quando triados com antígeno humano dimérico de 10 nM no mesmo ensaio) foram produzidos como mAb2 simulados (HelD1.3) e mAb2 de mAb² modelo (PD-L1) para avaliar o aprimoramento funcional e cinético das alças aleatorizadas. Exemplo 5: Construção, expressão e caracterização de Fcabs anti-CD137 humano maturados por afinidade em formato de mAb² “simulados”
5.1 Construção de Fcabs de anti-CD137 humano em formato de mAb² “simulados” e modelo
[0311] 16 clones maturados por afinidade derivados do clone FS22-053 parental (FS22-053-001 a FS22-053-016), e 6 clones derivados dos clones FS22-172 parentais (FS22-172- 001 a FS22-172-006) foram preparados em formato de mAb2. Os clones FS22-053-001 a FS22-053-007 não foram adicionalmente considerados visto que os mesmos não se expressam em formato de mAb2 em um nível que permitiu a purificação a jusante para teste e caracterização adicional. Constatou-se que os clones restantes tiveram pelo menos 95 % de identidade de sequência nos seus domínios CH3 quando comparados à sequência de CH3 do clone parental a partir do qual foi derivado. Uma matriz de similaridade de sequência de porcentagem foi gerada comparando-se cada posição de aminoácido com aquela da sequência de referência (clones parentais FS22-053 ou FS22-172). A Figura 1D mostra a porcentagem de identidade de sequência do domínio CH3 de clones FS22-053-008 a FS22-053-016 e FS22-053-017 (consultar o Exemplo 10.1) em comparação com o domínio CH3 de FS22-053 parental. A Figura 1E mostra a porcentagem de identidade de sequência do domínio CH3 de clones FS22-172- 001 a FS22-172-006 em comparação com o domínio CH3 de FS22- 053 parental.
[0312] Os anticorpos mAb² "simulados" que compreendem os Fcabs de anti-CD137 humano em HelD1.3 foram preparados para caracterização adicional dos Fcabs maturados por afinidade em formato de mAb². Esses mAb² foram preparados como descrito no Exemplo 3.1.
[0313] Os mAb2 modelo também foram produzidos compreendendo os Fcabs de anti-CD137 humano e também uma região de Fab de ligação ao PD-L1 (clone YW243.55.S70 do documento US 8.217.149 B2). Os mesmos foram preparados de maneira similar ao método descrito no Exemplo 3.1 por substituição de parte do CH3 do anticorpo de ligação ao anti-PD-L1 que contém as alças AB, CD e EF com a região correspondente do Fcab. Esses mAb² modelo de PD-L1 contêm uma mutação LALA no domínio CH2 (AA). A introdução da mutação LALA no domínio CH2 de IgG1 humano é conhecida por reduzir a ligação de receptor Fc (Bruhns, P., et al. (2009) e Hezareh M., et al. (2001)).
[0314] Os mAb² CD137/HelD1.3 e CD137-AA/PD-L1 foram produzidos por expressão transiente em células HEK293-6E e purificados com o uso de colunas de proteína A de mAb Select SuRe.
5.2 Atividade de Fcabs humano em formato de mAb2 simulado em ensaio de Célula Repórter NF-κB humana
[0315] A atividade funcional dos Fcabs de anti-CD137 humano maturados por afinidade em formato de mAb² simulados (HelD1.3) listados na Tabela 3 foi testada no mesmo ensaio de NF-κB luciferase descrito no Exemplo 3.3. A luminescência foi medida com um tempo de integração de 0,5 segundo em um leitor de placa com Software Gen5, BioTek. Os resultados desse ensaio são mostrados na Tabela 3 e na Figura 2. Como esperado, nenhum dentre os Fcabs mostrou atividade sem reticulação de Proteína L (-XL). Todos os Fcabs CD137 maturados por afinidade mostraram aprimoramento amplo ao longo de Fcabs CD137 parentais para os quais, embora positivos nesse ensaio, o cálculo de um valor de EC50 não foi possível (consultar o Exemplo 3.3). FS22-053- 008 e FS22-172-003 mostraram a melhor atividade de cada família com o menor EC50 quando reticulado com a Proteína L (+XL). Tabela 3 Clone de Fcab (em Sinalização de NF-kB com ou sem formato de mAb2 reticulação de proteína L (XL) HelD1.3) -XL +XL (EC50 nM) FS22-053-008 N/A 26,34 FS22-053-009 N/A 64,57 FS22-053-010 N/A 47,48 FS22-053-011 N/A 32,78
Clone de Fcab (em Sinalização de NF-kB com ou sem formato de mAb2 reticulação de proteína L (XL) HelD1.3) -XL +XL (EC50 nM) FS22-053-012 N/A 119,3 FS22-172-002 N/A 124,1 FS22-172-003 N/A 32,64 FS22-172-004 N/A 123,6 FS22-172-005 N/A N/A FS22-172-006 N/A 382,4 N/A – não aplicável visto que o sinal baixo não permitiu a determinação de EC50
5.3 Atividade de Fcabs humanos maturados por afinidade em formato de mAb2 modelo em ensaio de ativação de célula T de DO11.10 humana
[0316] A atividade funcional dos Fcabs humano maturado por afinidade em formato de mAb² modelo (PD-L1 LALA) listado na Tabela 4 foi testada em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10, similar ao ensaio como descrito no Exemplo 3.6.
[0317] As células HEK.mPD-L1 foram produzidos por subclonagem de cDNA que codifica PD-L1 de camundongo (SEQ ID NO: 188) em vetor pcDNA5FRT (Life Technologies) com o uso de sítios de restrição KpnI e NotI e que transforma os vetores na linhagem de células Flp-In T-REx 293 (Life Technologies, R780-07) com o uso de Lipofectamina 2000 (Life Technologies, 11668-019). As células foram cultivadas em DMEM que contêm 10 % de FBS, 100 µg/ml de Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475) e 15 µg/ml de Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) por 3-4 semanas até que as colônias de células estavelmente transformadas tenham se formado. Essas colônias foram amplificadas na presença de 1 µg/ml de Doxiciclina (Sigma Aldrich, D9891) e testadas quanto a expressão de PD-L1 com o uso de PE conjugado de anticorpo PD-L1 de anticamundongo (MIH5) conjugado (BD Biosciences, 558091).
[0318] As células foram desafixadas com o uso de tampão de dissociação de célula, lavadas com PBS e 2x105 células foram plaqueadas em poços de uma placa de 96 poços e, então, incubadas com anticorpo diluído 1:20 em PBS por 1 hora em 4 °C. As células foram lavadas uma vez em PBS e, então, medidas em um citômetro Accuri C6 (BD Biosciences) e os dados foram analisados com o uso de FlowJoX. A expressão de PD-L1 de camundongo foi novamente confirmada.
[0319] Os 15 clones produzidos no Exemplo 5.1 nos mAb² CD137/PD-L1 foram testados nesse ensaio de ativação de célula T de DO11.10. As diluições de mAb2 ou mAb de controle positivo foram preparadas e adicionadas a células DO11.10.hCD137 (7,5x103 células por poço) e HEK.mPD-L1 (2x104 células por poço) ou a células DO11.10.hCD137 (7,5x103 células por poço) e HEK que não foram transduzidas para expressar mPD-L1 (2x104 células por poço) em uma placa de fundo plano de 96 poços que foram revestidas durante a noite com 0,1 µg/ml de anticorpo anti-CD3 (clone 17A2, BioLegend, 100208). Após uma incubação de 18 horas, os tensoativos foram coletados e ensaiados com kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience, 88-7024-86) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com Software Gens, BioTek. Os valores de absorbância de 570 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gens, BioTek). A concentração de mlL-2 foi plotada vs a concentração de log de mAb2 ou mAb de referência e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism. A ativação de célula T foi detectada medindo-se a liberação de IL-2.
[0320] Os resultados desse ensaio são mostrados na Tabela 4 e na Figura 3. Nenhuma atividade de célula T foi observada sem reticulação por ligação a células que expressam PD-L1 (Nenhuma coluna XL com base em célula). Mediante a reticulação, todos os mAb2 tiveram atividade de célula T potente como observado pela liberação de altos níveis de IL-2 e valores de EC50 subnanomolares. Em concentrações crescentes, o mAb anti-CD137 humano de controle positivo, G1-AA/20H4.9, mostra um aumento em liberação de mIL-2, no entanto a liberação máxima foi significativamente menor que aquela dos Fcabs anti-CD137 humano. Todos os clones diferentes de FS22-053-009 e FS22- 172-005, tiveram um EC50 menor que 0,3 nM, dessa forma foram tão bons quanto, se não melhores, que o controle positivo. O menor Emáx, que é uma medição de ativação de célula T máxima, e pode ser relevante para atividade antitumoral de célula T maior in vivo, observada como 7758 pg/ml que foi maior que o controle positivo.
Tabela 4 Liberação de IL-2 com ou sem reticulação Clone de Fcab de HEK de mPD-L1 (em formato de Nenhum XL mAb2 modelo com base em +XL Emáx (IL-2 +XL EC50 PD-L1) ou mAb Célula pg/ml) (nM) FS22-053 N/A 5366 0,28 FS22-053-008 N/A 8176 0,28 FS22-053-009 N/A 8083 0,52 FS22-053-010 N/A 8301 0,15 FS22-053-011 N/A 7923 0,28 FS22-053-012 N/A 9808 0,20 FS22-053-013 N/A 15551 0,12 FS22-053-014 N/A 12849 0,09 FS22-053-015 N/A 17079 0,18 FS22-053-016 N/A 18003 0,10 FS22-172 N/A 5952 0,53 FS22-172-001 N/A 10006 0,23 FS22-172-002 N/A 7001 0,20 FS22-172-003 N/A 10958 0,18 FS22-172-004 N/A 7758 0,24 FS22-172-005 N/A 13021 1,27 FS22-172-006 N/A 9089 0,32 G1-AA/20H4.9 N/A 3755 0,26 N/A – não aplicável visto que o sinal baixo não permitiu a determinação de EC50
5.4 Ensaio de ativação de célula T CD8+ humana primária
[0321] A atividade dos Fcabs para ativar CD137 em CD137 que superexpressam células HEK foi mostrada no Exemplo 5.3.
Para testar a atividade dos Fcabs nas células que não foram geneticamente modificadas para superexpressar CD137, foi necessário um ensaio de célula T humana primária. As células T CD8+ citotóxicas ativadas são responsáveis por matar diretamente células cancerígenas e expressar CD137 em suas superfícies celulares (Ye et al, 2014). O agrupamento de CD137 é conhecido por ser essencial para induzir a sinalização a jusante e a ativação de célula T CD8+ adicional. Um ensaio de ativação de célula T CD8+ foi, portanto, usado para avaliar a habilidade de Fcabs (em formato de mAb2, como detalhado abaixo) para acionar o agrupamento e sinalização a jusante subsequente de CD137. A ativação de célula T CD8+ foi determinada pela liberação de IL-2.
[0322] Para isolar células T, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas a partir de cones de depleção de leucócito, um subproduto de doações de plaqueta. Resumidamente, teores de cones de leucócito foram lavados com PBS e revestidos em um gradiente Ficoll (Sigma- Aldrich, 1440-02). PBMCs foram isoladas por centrifugação e as células que não cruzaram o gradiente Ficoll foram recuperadas. PBMCs foram adicionalmente lavadas com PBS e as hemácias restantes foram lisadas através da adição de 10 ml de 1X tampão de lise de hemácia (eBioscience, 00- 4300-54), de acordo com as instruções do fabricante. As células T CD8+ foram isoladas das PBMCs presentes no eluante com o uso do kit de isolamento de célula T CD8+ II (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-495), de acordo com as instruções do fabricante.
[0323] A incubação com um anticorpo anti-CD3 foi usada como um primeiro sinal para acionar ativação inicial das células T. As placas de cultura de tecido de fundo plano de 96 poços foram revestidas com 8 µg/ml anticorpo anti-CD3 (Clone UCHT1, R&D Systems, MAB100-SP) em PBS durante a noite em 4 °C. As placas foram, então, lavadas 3 vezes com 200 µl de PBS.
[0324] Para reticulação com base em célula de Fcabs de CD137 humano maturados por afinidade em formato de mAb2 modelo de PD-L1, as células HEK293 que superexpressam hPD- L1 (HEK.hPD-L1) foram produzidas essencialmente como descrito no exemplo 5.3, mas por subclonagem de cDNA que codifica o PD-L1 humano (SEQ ID NO: 187) em vez de PD-L1 de camundongo. As células HEK.hPD-L1 foram plaqueadas a 2 x 105 células por poço nas placas de fundo plano de 96 poços revestidas com anticorpo anti-CD3 (8 µg/ml) em meio de cultura de célula T de 100 µl (meio de RPMI (Life Technologies, 61870-044) com 10 % de FBS (Life Technologies), 1X de Estreptomicina de Penicilina (Life Technologies, 15140122), 1 mM de Piruvato de Sódio (Gibco, 11360-070), 10 mM de Hepes (Sigma-Aldrich, H0887), 2 mM de L-Glutamina (Sigma-Aldrich, G7513) e 50 µM de 2- mercaptoetanol (Gibco, M6250)). Uma vez que as células HEK.hPD-L1 ou células HEK que não foram transduzidas para expressar hPD-L1 tenham se aderido após 4 horas de incubação, todo o meio de cultura de célula T foi removido e substituído com meio de cultura de célula T de 100 µl que contém células T em uma concentração de 5,0 x 105 células/ml que resulta em 5,0 x 104 células/poço.
[0325] Os mAb2 foram diluídos em meio de célula T em concentração final de 2X que começa a 500 nM e uma titulação 1:3 foi realizada. 100 µl de titulação de mAb2 foram adicionados às células por um volume de ensaio total de 200 µl e 1X de concentração de anticorpo.
[0326] O anticorpo anti-CD137 de controle positivo (G1- AA/20H4.9) e o anticorpo de IgG isotipo de controle negativo (G1-AA/HelD1.3) foram, cada um, diluídos em meio de célula T a uma concentração final de 2X que começa a 500 nM que contém 500 nM de agente de reticulação (anti- humano CH2, clone MK1A6 (Jefferis et al., 1985 e Jefferis et al., 1992), produzido internamente) e uma titulação de 1:3 foi realizada. 100 µl de mistura de anticorpos/reticuladores de controle positivo ou mistura de IgG/reticulador de controle negativo diluídas foram adicionadas às células para um total de 200 µl de volume de ensaio e concentração de 1X de anticorpo.
[0327] O ensaio foi incubado a 37 °C, 5 % de CO2 por 72 horas. Os tensoativos foram coletados e ensaiados com kit de ELISA de IL-2 humano Ready-SET-Go! (eBioscience, Cat. 88-7025-88) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com o Software Gen5, BioTek. Os valores de absorbância de 630 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A concentração de IL-2 humano (hIL-2) foi plotada vs a concentração de log de anticorpo e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism.
[0328] A Tabela 5 mostra os valores de EC50 e resposta máxima de liberação de IL-2 observada no ensaio de ativação de célula T na presença dos clones de Fcab maturados por afinidade em formato de mAb2 modelo de PD-L1 testado com reticulação com base em célula.
O mAb anti-CD137 humano de controle positivo, 20H4.9, mostra um aumento em liberação de hIL-2 com um EC50 de 0,5 nM quando reticulado com anticorpo anti-hCH2. Todos os clones tiveram atividade no ensaio, em que a maioria exibiu boa potência com EC50s submolares.
Os mAb2 que contêm Fcabs FS22-053-007, FS22- 053-008, FS22-053-010, FS22-053-011, FS22-053-012, FS22- 172-003, FS22-172-004, FS22-172-005 elicitaram a maior resposta de célula T com o menor EC50s na faixa de 0,19 - a 0,49 nM.
Um subconjunto dos mAb2 (que contém Fcabs FS22- 053-008, FS22-053-011, FS22-053-014, FS22-173-003 e FS22- 172-004) também foi testado sem reticulação por PD-L1 expressa em células HEK e mostrou nenhuma atividade nesse ensaio, como esperado.
Isso confirma a atividade observada no ensaio de NF-kB e ensaio de ativação de célula T de DO11.10. A Figura 4 mostra plotagens representativas de liberação de IL-2 para o ensaio de ativação de célula T para mAb2FS22-053-007-AA/PD-L1, FS22-053-008-AA/PD-L1 e FS22-172-002-AA/PD-L1, FS22-172-003-AA/PD-L1, FS22-172-004- AA/PD-L1. Tabela 5 Liberação de IL-2 com reticulação de HEK de hPD-L1 Clone de Fcab (em formato de Doador 170505B mAb2 modelo PD-L1) ou mAb Emáx EC50 (nM) FS22-053 4344 0,55 FS22-053-007 13119 0,22
Liberação de IL-2 com reticulação de HEK de hPD-L1 Clone de Fcab (em formato de Doador 170505B mAb2 modelo PD-L1) ou mAb Emáx EC50 (nM) FS22-053-008 25112 0,42 FS22-053-009 15230 0,69 FS22-053-010 13978 0,37 FS22-053-011 14959 0,19 FS22-053-012 12282 0,20 FS22-172 10729 1,83 FS22-172-001 19135 0,58 FS22-172-002 20615 2,69 FS22-172-003 30311 0,45 FS22-172-004 22611 0,36 FS22-172-005 23626 0,49 FS22-172-006 27871 0,89 20H4.9 14780 0,89 20H4.9 + XL 44940 0,50
5.5 Determinação de especificidade de Fcabs anti-CD137 humano por Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR)
[0329] A especificidade dos Fcabs de CD137 anti-humano para CD137 humano em comparação com outros membros da família TNFSFR relacionados foi testada. 8 dos Fcabs foram testados em formato de mAb2 simulados (HelD1.3) e medidos por SPR em um Biacore T200 (GE Healthcare) por teste quanto a ligação a outros receptores de TNFRSF humanos: CD40, OX40 e GITR. O acoplamento de amina (kit de acoplamento de amina, GE Healthcare, BR-1000-50) foi usado para revestir
CD40 humano, GITR e OX40 a aproximadamente 1000 RU em chips CM5 Biacore (GE Healthcare, nº de catálogo 29149603). As diluições de Fcabs de anti-CD137 humano em formato de mAb2 simulados (FS22-053-008/HelD1.3, FS22-053-009/HelD1.3, FS22-053-010/HelD1.3, FS22-053-011/HelD1.3, FS22-053- 012/HelD1.3, FS22-053-014/HelD1.3, FS22-172-003/HelD1.3, FS22-172-004/HelD1.3) que começam em 1 µM foram preparados em tampão de HBS-EP+ (BR100669) e injetados por 3 min a 30 µl/min e, então, foi permitido que o mesmo se dissociasse em tampão por 4 min. O chip foi regenerado por injeção de 10 mM de glicina, pH 2,5 por 12 s a 30 µl/min. Anticorpos específicos para os membros de TNFRSF diferentes foram usados como controles positivos para verificar revestimento de chip Biacore. Os dados foram substituídos por dupla referência e analisados com o uso de software BIAevaluation 3.2. Os Fcabs não se ligaram a qualquer um dos receptores de TNFRSF testados, demonstrando sua especificidade para CD137. Como resultado, não é esperado que os Fcabs elicitarão ligação sem alvo.
5.6 Afinidade de ligação de Fcabs anti-CD137 humano em formato de mAb2 simulado para CD137 humano, de cinomolgo e de camundongo por SPR
[0330] A afinidade dos Fcabs anti-CD137 humano (FS22- 053-008, FS22-053-011, FS22-053-014, FS22-172-004, FS22- 172-004) para CD137 humano, de cinomolgo (cino) e de camundongo foi medida por SPR, para determinar a possibilidade de os Fcabs poderem ser úteis para testar em estudos de animal. Um anticorpo de captura de Fab humano foi imobilizado em todas as quatro células de fluxo de um chip série S CM5 (GE Healthcare #BR-1005-30) a uma densidade de superfície média de 6000 RU seguindo as recomendações do fabricante (GE Healthcare, Kit de captura de Fab humano, nº 28958325). Cada mAb² foi capturado a aproximadamente 150 RU injetando-se uma solução de mAb² de 3 µg/ml diluída em tampão de HBS-EP+ (GE Healthcare nº BR1006-69) por 60 segundos a 30 µl/min. Então, concentrações diferentes de antígeno CD137 humano, cino ou de camundongo (CD137-mFc-Avi humano, cino ou de camundongo não biotinilado ou CD137-Avi-His humano) em tampão de HBS- EP+ foram fluidas através do chip por 3 min a 60 µl/min e, então, foi permitido que as mesmas se dissociassem por 10 minutos. Após cada concentração de antígeno o chip foi regenerado infectando-se 10 mM de glicina de pH 2,1 a uma taxa de fluxo de 30 µl/min por 30 segundos. Tampão HBS-EP+ foi injetado antes da maior concentração de antígeno e após a menor concentração de antígeno para subtração de referência, e uma das concentrações escolhida aleatoriamente foi repetida duas vezes. A cinética de ligação foi ajustada com um modelo de 1:1 Langmuir para gerar constantes de ligação de equilíbrio (KD) para cada amostra. A análise de dados foi realizada com o software BiaEvaluation versão 3.2. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
[0331] A análise dos resultados revelou uma ligação aprimorada tanto para CD137 humano quanto de cinomolgo por todos os clones maturados por afinidade, em comparação com as respectivas moléculas parentais. A afinidade de ligação para os antígenos CD137 humano monoméricos foi mais fraca (em pelo menos 100 vezes) que para os antígenos de fusão de Fc humano e de cino diméricos. Como discutido no Exemplo 2,
os Fcabs foram selecionados para se ligarem preferencialmente a CD137 dimérico em vez de formas monoméricas de CD137 e esses dados confirmam que a estratégia de seleção foi bem-sucedida. Esse comportamento cinético torna essas menos propensas a se ligarem a CD137 monomérico expresso em níveis mínimos em células T não estimuladas para resultar em risco reduzido de toxicidades de fígado ou sistêmicas associadas a algumas terapias de anticorpo monoclonal anti-CD137.
[0332] Os dados também mostram que os Fcabs de CD137 anti-humano se ligam a CD137 dimérico de cinomolgo com afinidade comparável a CD137 dimérico humano.
[0333] A habilidade dos Fcabs para se ligar a CD137 de camundongo dimérico também foi testada. Nenhum dos clones mostrou ligação forte ao antígeno de camundongo (como mostrado na Tabela 6 em que N/A indica que nenhum KD pode ser calculado) exceto para clone FS22-053-014 que foi constatado surpreendentemente que tem um KD de 24 nM para o antígeno de camundongo. Isso foi inesperado visto que CD137 de camundongo e CD137 humano compartilha menos que 57 % de homologia de sequência. Tabela 6 Fcab CD137 CD137 CD137 CD137 dimérico dimérico monomérico dimérico de humano KD de humano KD vezes camundongo (nM) cinomolgo de diferença KD (nM) KD (nM) relativa a KD dimérico humano FS22- 38 34 N/A N/A
Fcab CD137 CD137 CD137 CD137 dimérico dimérico monomérico dimérico de humano KD de humano KD vezes camundongo (nM) cinomolgo de diferença KD (nM) KD (nM) relativa a KD dimérico humano 053 FS22- 4,2 0,9 170 vezes N/A 053- 008 FS22- 5,5 1,3 >200 vezes N/A 053- 011 FS22- 3,2 0,9 100 vezes 24 053- 014 FS22- 52 203 N/A N/A 172 FS22- 1,5 1,3 >200 vezes N/A 172- 003 FS22- 4,3 3,5 >200 vezes N/A 172- 004 N/A - não aplicável visto que o sinal baixo não permite a determinação de KD
5.7 Determinação de valência de ligação de Fcab com o uso de Fcabs heterodiméricos e homodiméricos
[0334] Fcabs frequentemente contêm duas cadeias de Fc homodiméricas com sítios de ligação a antígeno nos domínios CH3. Visto que esses sítios de ligação a antígeno nos dois domínios CH3 estão próximos, a valência de ligação do Fcab foi testada para determinar a possibilidade de os domínios CH3 poderem se ligar a CD137 independentemente uns dos outros. Os Fcabs heterodiméricos que contêm um único domínio CH3 de ligação a antígeno foram construídos combinando-se uma cadeia do FS22-172-003 com uma cadeia de um Fc do tipo selvagem, com o uso de mutações knob-into- hole (Knob: T22W, Hole: T22S L24A Y66V) (Atwell S et al, 1997). Consequentemente, cada heterodímero conteve um CH3 de FS22-172-003 (SEQ ID NO: 139) em uma cadeia e um CH3 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 4) na outra cadeia. Fcabs foram preparados em um formato de mAb2.
[0335] O Fcab heterodimérico foi comparado à molécula de homodímero de FS22-172-003 (que contém dois domínios CH3 de ligação a antígeno) por análise de ligação de SPR. Para esse experimento, CD137-mFc-Avi humano monomérico foi preferencial em vez de antígeno CD137 dimérico. Para compensar pela ligação mais fraca a antígeno monomérico descrito no Exemplo 5.6, CD137-mFc-Avi humano foi imobilizado em um chip CM5 em uma densidade superior de 450 RU. Fcabs de hetero ou homodímero foram injetados e fluidos ao longo do antígeno imobilizado. Os resultados na Figura 14 mostram que o Fcab heterodimérico, que contém apenas um domínio CH3 de ligação a CD137, teve a capacidade para se ligar a antígeno mesmo nessas condições subideais. A taxa de separação observada para o Fcab heterodimérico foi significativamente mais rápida que aquela do Fcab homodimérico. Esses resultados confirmam que o Fcab FS22-
172-003 teve a capacidade para se ligar a CD137 através de qualquer um ou ambos os domínios CH3 e confirmou que a estratégia de seleção descrita no Exemplo 2 foi bem- sucedida, visto que o Fcab teve a capacidade para engatar seu alvo de modo bivalente.
5.8 Ligação de Fcabs anti-CD137 a células com níveis de expressão de CD137 diferentes
[0336] Como descrito no Exemplo 2, os Fcabs foram selecionados para se ligarem a CD137, de modo que os mesmos preferencialmente se liguem a células com níveis de expressão de CD137 elevados. A ligação bivalente e, portanto, ávida de FS22-172-003 foi confirmada por SPR no Exemplo 5.6: FS22-172-003 exibiu alta avidez e ligação mais forte a CD137 dimérico em comparação com CD137 monomérico.
[0337] Uma faixa de células DO11.10 que expressam níveis diferentes de CD137 foi produzida como descrito no Exemplo
3.5. Para determinar a expressão relativa de CD137 em cada linhagem celular, a capacidade de ligação de anticorpo (ABC) foi determinada de acordo com o protocolo do fabricante (Quantum™ Simply Cellular® nº 816 Bangs Labs). Cada linhagem celular foi classificada em ordem de níveis de expressão de CD137 após a subtração do fundo: hCD137 alto (ABC: 1.206.283), hCD137 intermediário (ABC: 404.597), hCD137 intermediário/baixo (ABC: 143.065), hCD137 baixo (ABC: 14.208), hCD137 negativo (ABC: 0).
[0338] A ligação de Fcab anti-CD137 humano em formato de mAb² simulado (FS22-172-003-AA/HelD1.3), anticorpo de controle positivo (G1-AA/20H4.9), ou controle de isotipo (G1-AA/HelD1.3) a cada uma das células descritas acima foi testada como a seguir: As células DO11.10 foram colhidas a partir de frascos de cultura celular T175 e centrifugadas a 1200 rpm por 3 min e ressuspensas em tampão de FACS congelado feito de DPBS (Life Technologies, 14190169) e 1 % de BSA (Sigma-Aldrich, A7906) a 2x106 células/ml e 50 µl por poço foi semeado em uma placa de 96 poços de fundo em V (Costar, 3894). Todos os anticorpos testados foram diluídos em tampão de FACS em 120 µl. As células DO11.10 foram, então, centrifugadas, o tensoativo removido e as células ressuspensas em 100 µl de cada diluição de anticorpo e incubadas a 4 °C por 45 min. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação com 150 µl de tampão de FACS, ressuspensas em 100 µl que contêm anticorpo de fragmento-R- Ficoeritrina de F(ab')2 anti-IgG humano de cabra (específico de cadeia-γ) (Sigma, P8047) diluído em 1:1000 em tampão de FACS e incubado a 4 °C por 45 min. As células foram lavadas uma vez com 150 µl de tampão de FACS e, então, com 150 µl de DPBS, ressuspensas em 150 µl de DPBS que contêm DAPI (Biotium, 40043) a 1:10.000 e lido no BDCantoII ou iQue (Intellicyt). Os dados foram analisados com o uso de FlowJo v10 para determinar a média geométrica de sinal para PE para células vivas em cada poço.
[0339] Como mostrado na Figura 15, FS22-172-003- AA/HelD1.3 se ligou mais fortemente a células com expressão de CD137 superior (Figura 15D: CD137int e Figura 15E: CD137alto), e não se ligou a células que expressaram níveis muito baixos de CD137 (Figura 15B: CD137baixo e Figura 15C: CD137int/baixo), em comparação com o controle positivo G1- AA/20H4.9. Comparativamente, o controle positivo G1- AA/20H4.9 se ligou melhor tanto a antígeno dimérico quanto monomérico, com KD para antígenos dimérico ou monomérico dentro de 10 vezes um do outro, diferente de FS22-172-003- AA/HelD1.3 que teve ligação pelo menos 200 vezes mais fraca a antígeno CD137 monomérico que o antígeno dimérico, como descrito no Exemplo 5.6. Exemplo 6: Seleção de naïve de Fcabs CD137 anticamundongo
[0340] Para testar a atividade de Fcabs anti-CD137 em modelos de camundongo in vivo, os Fcabs que se ligaram especificamente a CD137 de camundongo foram gerados e caracterizados. Exibição de fago
[0341] As seis bibliotecas de fago naïve que exibem o domínio CH3 de IgG1 humano anteriormente usado para seleção de Fcabs que se ligam a CD137 humano foram usadas para seleções de Fcabs que se ligam a CD137 de camundongo, com CD137 de camundongo dimérico recombinante ou células que expressam CD137 de camundongo de comprimento total usadas como antígenos.
[0342] O antígeno mCD137-mFc-Avi interno e as células DO11.10 que expressam mCD137 (DO11.10.mCD137) foram usados em seleções com o uso das seis bibliotecas de fago. Um esquema de seleção simples foi seguido, no qual todos os ciclos de seleção (três no total) foram realizados com o uso de 100 nM de antígeno biotinilado, com uma etapa de desmarcação com o uso de 500 nM de fragmento Fc humano recombinante não identificado. Os ligantes foram capturados por microesferas magnéticas revestidas em estreptavidina ou neutravidina. Adicionalmente, as saídas de ciclo 1 que se ligam a antígeno recombinante também foram usadas nas seleções em células de DO11.10.mCD137 que expressam CD137 de camundongo. Resumidamente, as saídas de fago foram incubadas com células de DO11.10 que carecem de CD137 de camundongo para descartar ligantes indesejados, como aqueles que se ligam não especificamente a células. Em seguida, os fagos foram incubados com 1 × 107 células de DO11.10.mCD137. Os ligantes foram, então, eluídos por digestão de tripsina e, então, propagados para o segundo ciclo de seleção. O ciclo 3 seguiu um processo similar, aumentando a pressão de seleção diminuindo-se o número de células de DO11.10.mCD137 para 5 × 106.
[0343] Todas as saídas de antígeno recombinante de ciclo 3 (576 clones) e todas as saídas de seleção de célula de ciclo 3 (576 clones) foram triadas por ELISA de fago (como anteriormente descrito) e para ligação de célula a células de DO11.10.mCD137. Para ELISA, a maior parte dos clones apresentaram uma força de sinal alta para ligação a antígeno (OD450 >1). Portanto, os clones que mostram menos que um aumento de 10 vezes em ligação de antígeno em comparação com ligação a Fc de camundongo foram descartados. Para ligação de célula, um MFI de FITC maior que 5 × 105 foi considerado positivo. Três das bibliotecas de fago foram realizadas consideravelmente piores, em que muitos clones exibiram ligação não específica às células de DO11.10.mCD137 e antígenos recombinantes. 34 manifestações de clone de Fcab foram subclonadas e produzidas como mAb² HelD1.3, como descrito no Exemplo 3.1. Exibição de levedura
[0344] As quatro bibliotecas de levedura naïve que exibem domínios CH1 a CH3 de IgG1 humano anteriormente usadas para seleção de Fcabs que se ligam a CD137 humano foram usadas para seleções de Fcabs que se ligam a CD137 de camundongo.
[0345] Um total de 53 ciclos de seleções separados foram realizados para identificar ligantes CD137 anticamundongo. O antígeno CD137 de camundongo biotinilado, dimérico, recombinante de produção interna (mCD137-mFc-Avi) foi usado para selecionar ligantes das bibliotecas de naïve de levedura. Resumidamente, os ligantes de ciclo 1 foram selecionados incubando-se as bibliotecas de naïve com 300 nM de antígeno recombinante e desmarcadas com 2,5 µM de fragmento Fc de IgG2a de camundongo não identificado. As saídas foram separadas com o uso de MACS e microesferas magnéticas de estreptavidina. Três ciclos de seleções de FACS foram realizados com 300 nM de antígeno recombinante e 1,5 µM de Fc de camundongo que são usados para seleções e desmarcações, respectivamente, como descrito anteriormente no Exemplo 2.
[0346] Os clones simples de cada um dos ciclos 2, 3 e 4 foram observados em placas de ágar. Par determinar a diversidade de saída, pelo menos 96 clones de cada saída de seleção foram sequenciados. 126 clones únicos (50 clones do ciclo 3 para uma dentre as bibliotecas, 48 clones do ciclo 3 para outra dentre as bibliotecas, e 18 clones do ciclo 4 para a biblioteca restante) foram triados quanto a ligação a antígeno recombinante por citometria de fluxo. Os clones que mostraram mais que 10 % de células positivas no canal de fluorescência de APC quando incubados com o antígeno recombinante e menos que 0,2 % quando incubados com Fc recombinante foram considerados como manifestações. Exemplo 7: Caracterização de Fcabs CD137 anticamundongo de seleções de naïve
7.1 Determinação de especificidade de Fcab CD137 anticamundongo por BLI
[0347] A especificidade dos Fcabs de CD137 anticamundongo para CD137 de camundongo foi testada em formato de mAb2 "simulado" HelD1.3 e medida por BLI em um sistema Octet QKe por teste quanto a ligação dos Fcabs a quaisquer outros receptores de TNFRSF de camundongo (CD40, OX40, GITR). Os biossensores de estreptavidina (PALL ForteBio 18-5021) para revestir 10 ng/µl de receptores CD40, GITR, OX40 de camundongo (todos obtidos junto a R&D Systems e biotinilados com o uso de um kit de Sulfo-NHS-SS- Biotina EZ-Link da Thermoscientific nº 21328). Fcabs de CD137 anticamundongo em formato de mAb² simulados foram diluídos em 1:1 em tampão cinético (PALL 18-1092) a uma concentração final de pelo menos 1 µM. Sensores revestidos por antígeno foram imersos nas soluções de mAb² por 180 segundos seguido por 180 segundos em 1 × de tampão cinético. Anticorpos para cada um dos receptores de TNFRSF foram usados como controles positivos. Os clones de Fcab FS22m-055, FS22m-063, FS22m-066, FS22m-075, FS22m-135, FS22m-055, FS22m-063, FS22m-066 não se ligaram a qualquer um dos receptores de TNFRSF testados, desse modo, demonstrando suas especificidades para CD137 de camundongo.
7.2 Atividade de Fcabs de camundongo em formato de mAb2 simulado em um ensaio de célula repórter NF-κB de camundongo
[0348] As células HEK.FRT.luc que expressam a sequência de CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 184 foram produzidos seguindo a mesma metodologia que anteriormente descrito no exemplo 3.3. Os mAb² que contêm os Fcabs de CD137 anticamundongo anteriormente selecionados foram triados com o uso dessa linhagem celular, HEK.FRT.luc.mCD137, de acordo com o método descrito no exemplo 3.3. 56 mAb2 foram testados dos quais 29 foram positivos para atividade de NF- kB. Lob12.3 que contêm um Fc IgG1 humano com a mutação LALA (G1AA/Lob12.3), foi usada como um mAb CD137 anti-camundongo de controle positivo e mostrou um aumento em luminescência que confirmou a validade do ensaio. HelD1.3, que também contém um Fc de IgG1 humano com uma mutação LALA, foi usada como um isotipo IgG humano de controle negativo para retirar a interferência do Fab simulado de IgG humano nesse ensaio. EC50s foram calculados quando possível e mAb2 que não alcançaram um platô em atividade foram descartados em favor de mAb2 que mostraram cinética de atividade sigmoidal clássica. mAb2 foram classificados na ordem de EC50 e alteração em vezes em atividade mediante a reticulação de Proteína L. FS22m-063 foi selecionado com base no fato de ter o melhor EC50 mediante a reticulação (1,44 nM) e a maior alteração em vezes em atividade mediante a reticulação (27 vezes). A Figura 5 mostra que o Fcab CD137 anticamundongo FS22m-063 em formato de mAb2 simulado HelD1.3 aciona o agrupamento de CD137 e a sinalização de NF-kB quando reticulado com Proteína L no ensaio de repórter NF-kB de mCD137 de HEK. Exemplo 8: Atividade antitumoral in vivo de Fcab FS22m-063 (em mAb2 FS22m-063-AA/PD-L1)
[0349] Tendo mostrado que o Fcab FS22m-063 tem a capacidade para acionar o agrupamento e a ativação de CD137 in vitro, é desejável testar suas habilidades para ativar CD137 in vivo.
8.1 Preparação de Fcab FS22m-063 em formato de mAb2 para teste in vivo em camundongos
[0350] Um mAb2 que compreende o Fcab CD137 anticamundongo, FS22m-063 e uma região Fab específica para PD-L1 com o uso de metodologia similar ao mAb2 modelo produzido no exemplo 7.1 foi preparado e testado quanto atividade antitumoral in vivo em um modelo tumoral de camundongo singênico MC38. Controles: G1-AA/Lob12.3, G1-AA/S70, G1-AA/4420.
[0351] Os anticorpos de controle para os experimentos in vivo foram produzidos por união da região pesada variável do anticorpo anti-PD-L1 S70 (clone YW243.55.S70 do documento US8.217.149 B2) à região de constante de IgG1 humano (G1m17) que contém a mutação LALA, e a região leve variável do anticorpo S70 foi unida à região de constante humana (Lm1) por meio de região J kappa humana. O mAb² foi gerado substituindo-se o domínio CH3 do construto reformatado descrito acima com FS22m-063 e foi designado “FS22m-063-AA/S70”.
8.2 Atividade de mAb2 FS22m-063-AA/S70 em um modelo tumoral singênico MC38
[0352] Os modelos de camundongo singênico são aceitos como sistemas murinos adequados para testar o efeito antitumoral de inibir alvos terapêuticos e foram usados extensivamente para validar o desenvolvimento de produtos terapêuticos humanos. O modelo de tumor singênico MC38 foi usado nesse experimento com tumores MC38 conhecidos por serem altamente imunogênicos e responderem a monoterapia com anticorpo anti-CD137 (Kocak et al, 2006) e expressarem PD-L1 (Juneja et al, 2017).
[0353] Os camundongos fêmeas C57BL/6 (The Jackson Laboratory) com 9-10 semanas de idade e pesando 17,92 a 23,89 g, cada, foram deixados em repouso por uma semana antes de o estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Cada coorte tinha 12 camundongos. A linhagem celular de carcinoma de cólon MC38 (National Cancer Institute [Instituto Americano do Câncer], EUA) foi inicialmente expandida, armazenada e, então, pré- triada para patógenos e se mostraram estar livres de patógeno. Cada animal recebeu 1 x 106 células injetadas subcutaneamente no flanco direito em 100 µl em meio de cultura isento de soro (Meio Eagle Modificado de Dulbecco). 7 dias após inoculação de célula tumoral, os camundongos que não tiveram tumores nesse momento foram removidos do estudo.
[0354] O mAb2 FS22m-063-AA/S70 e os anticorpos de controle (G1-AA/Lob12.3 (controle positivo CD137), G1- AA/S70 (controle positivo PD-L1), G1-AA/4420 (controle de isotipo)) foram injetados intraperitonealmente em camundongos a uma concentração fixa de 20 µg por dose em DPBS + 1 mM de arginina + 0,05 de Tween 80. Cada camundongo recebeu a molécula de mAb² ou o anticorpo de controle por 200 µl de injeção intraperitoneal (IP) nos dias 7, 9 e 11, após as inoculações de tumor. As medições precisas de tumores foram realizadas, qualquer dosagem de fármaco no dia em questão foi realizada, e os camundongos foram colocados sob observação pelo restante do estudo. As medições de volume tumoral foram feitas com calibres para determinar o eixo geométrico mais longo e o eixo geométrico mais curto do tumor. A fórmula a seguir foi usada para calcular o volume tumoral: L X (S2) / 2 em que L = eixo geométrico mais longo; S = eixo geométrico mais curto
[0355] Como mostrado na Figura 6, o mAb2 FS22m-063- AA/S70 mostrou inibição de crescimento tumoral significativa em comparação com os camundongos tratados com qualquer um dentre os anticorpos de controle. A significância estatística mostrou pares para taxas de crescimento ao longo do tempo total do estudo com o uso de uma análise de Modelo Misturado em comparação com todos os grupos. Como mostrado na Tabela 7, inesperadamente todos os camundongos tratados com mAb2 FS22m-063-AA/S70 estavam livres de tumor no fim do estudo, em comparação com apenas 4 de 12 camundongos tratados com uma combinação de anticorpos anti-PD-L1 e anti-CD137 (G1-AA/S70 + G1- AA/Lob12.3) ou os anticorpos PD-L1 ou CD137 por si sós. Tabela 7: Camundongos livres de tumor por grupo de tratamento em um modelo tumoral singênico MC38 Grupo % de Camundongos Número de Livres de Tumor Camundongos Livres de Tumor G1-AA/Lob12.3 16 % 2/12 G1-AA/4420 0 % 0/12 G1-AA/S70 16 % 2/12 G1-AA/S70 + G1- 33 % 4/12 AA/Lob12.3 FS22m-063-AA/S70 100 % 12/12
[0356] O estudo mostra que em camundongos com um sistema imunológico completamente funcional, agonismo de CD137, presumidamente como resultado de reticulação por meio de PD-L1, resulta em uma redução no crescimento tumoral, presumidamente através de atividade citotóxica aumentada de células T CD8+ no tumor. Exemplo 9: Atividade antitumoral in vivo de Fcab FS22m-063 (em mAb2 FS22m-063-AA/PD-1)
[0357] Tendo mostrado que o Fcab FS22m-063 tem a capacidade para acionar o agrupamento e a ativação de CD137 in vitro, é desejável testar suas habilidades para ativar CD137 por meio de outro alvo de Fab, nesse caso um alvo constatado apenas em células imunológicas, PD-1, in vivo.
9.1 Preparação de Fcab FS22m-063 em formato de mAb2 para teste in vivo em camundongos
[0358] Um mAb2 que compreende o Fcab CD137 anticamundongo, FS22m-063 e uma região Fab específica para PD-1 foi preparado com o uso de metodologia similar ao mAb2 modelo produzido no exemplo 7.1. e testado quanto atividade antitumoral in vivo em um modelo tumoral de camundongo singênico MC38.
[0359] Os anticorpos de controle (G1/Lob12.3, G1-AA/F2, G1-AA/4420) para os experimentos in vivo foram produzidos por união da região pesada variável do anticorpo anti-PD-1 F2 (clone PD1-F2 do documento WO 2004/056875 A1) à região de constante de IgG1 humano (G1m17) que contém a mutação LALA, e a região leve variável do anticorpo F2 foi unida à região de constante humana (Lm1) por meio de região J kappa humana. O mAb2 foi gerado substituindo-se o domínio CH3 do construto reformatado descrito acima com FS22m-063 e foi designado “FS22m-063-AA/F2”.
9.2 Atividade de mAb2 FS22m-063-AA/F2 em um modelo tumoral singênico MC38
[0360] O modelo tumoral singênico MC38 foi usado nesse experimento, como descrito no Exemplo 8.2 com os seguintes desvios:
[0361] Camundongos fêmea C57BL/6 (Charles River) com 9- 11 semanas de vida receberam microchips e receberam um identificador único. Cada coorte tinha 12 camundongos. Cada animal recebeu 1 x 106 células de carcinoma de cólon MC38 injetadas subcutaneamente no flanco direito dorsal em meio livre de soro de 100 µl.
[0362] O mAb2 FS22m-063-AA/F2 e os anticorpos de controle (G1-AA/Lob12.3 (controle positivo CD137), G1-AA/F2 (controle positivo PD-1), G1-AA/4420 (controle de isotipo)) foram injetados intraperitonealmente em camundongos a uma concentração fixa de 20 µg por dose em DPBS + 1 mM de arginina + 0,05 de Tween 80. Cada camundongo recebeu a molécula de mAb2 ou o anticorpo de controle por injeção intraperitoneal (IP) de 200 µl uma vez que o volume tumoral tenha alcançado 50-60 mm3 (Dia 0) e no dia 2 e 4 após a primeira dose. Os tumores foram medidos como descrito no exemplo 8.2.
[0363] Como mostrado na Figura 7 A e B, o mAb2 FS22m- 063-AA/F2 mostrou inibição de crescimento tumoral altamente significativa em comparação com camundongos tratados com o anticorpo PD-1 de controle positivo de anticorpo de controle de isotipo. Como mostrado na Tabela 8, inesperadamente 10 dentre 12 camundongos tratados com mAb2 FS22m-063-AA/F2 estavam livres de tumor no fim do estudo, em comparação com apenas 7 de 12 camundongos tratados com uma combinação de anticorpos anti-PD-1 e anti-CD137 (G1- AA/F2 + G1-AA/Lob12.3). Tabela 8 Grupo % de Camundongos Número de Livres de Tumor Camundongos Livres de Tumor G1/Lob12.3 50 % 6/12 G1-AA/4420 0 % 0/12 G1-AA/F2 16 % 2/12 G1-AA/F2 + G1- 50 % 6/12 AA/Lob12.3 FS22m-063-AA/F2 83 % 10/12
[0364] O estudo mostra que em camundongos com um sistema imunológico completamente funcional, agonismo de CD137, presumidamente como resultado de reticulação por meio de engate de PD-1 com bloqueio de PD-1 adicionado, resulta em uma redução no crescimento tumoral, presumidamente através de atividade citotóxica aumentada de células T CD8+ no tumor.
[0365] Esse também mostra que os Fcabs CD137 podem ser reticulados quando estão em formato de mAb2 por ligação dos braços Fab a um alvo de célula imunológica, resultando em agrupamento e ativação de CD137. Exemplo 10: Atividade antitumoral in vivo de um mAb2 mCD137/MSLN
[0366] Tendo mostrado eficácia de um mAb² que compreende o Fcab de FS22m-063 e um Fab de PD-L1 (Exemplo 8), desejou- se testar a habilidade do Fcabs CD137 em um formato de mAb2 para ativar CD137 reticulando-se o mAb2 por meio de ligação de seus braços Fab a um antígeno específico de tumor (TAA), nesse caso, mesotelina (MSLN). Espera-se que tal abordagem de tumor alvejado seja benéfica para localizar a ativação de célula T para o microambiente tumoral, como reticulação do mAb2, e, portanto, o agonismo de CD137 ocorrerá apenas quando MSLN for expresso.
[0367] Um modelo tumoral de camundongo singênico que expressa MSLN de camundongo foi construído. As células de carcinoma de cólon CT26 (ATCC, CRL-2638) que expressam comprimento total mesotelina de camundongo (SEQ ID NO: 189), foram produzidas por lipofecção (Lipofectamina 3000, Thermo Fisher Scientific, número de catálogo L3000008) com o uso do vetor pcDNA3.1 (+) (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo V79020). Seguindo o protocolo do fabricante, as células CT26 foram transfectadas com os vetores pcDNA3.1 que contêm o cDNA de MSLN de camundongo. Uma transfecção estável foi obtida com o uso de geneticina como o antibiótico de seleção (em 600 µg/ml) em meios completos (RPMI, 10 % de FBS).
[0368] A expressão de MSLN de camundongo nas células CT26 foi confirmada por citometria de fluxo com o uso do anticorpo de controle positivo MOR6626 (documento WO 2009/068204 A1). Especificamente, as células foram incubadas com o anticorpo de controle positivo por 1 hora e, então, a anticorpo de detecção anti-IgG humana fluorescentemente identificado (Stratech Scientific Ltd, nº de catálogo 109-546-098-JIR) foi usado para detectar a ligação de célula. As populações clonais foram expandidas e subsequentemente analisadas para determinar os níveis de expressão relativos com o uso do mesmo procedimento citométrico de fluxo, após o que um clone foi selecionado e denominado CT26.G10.
[0369] O crescimento tumoral de CT26.G10 foi confirmado in vivo. Camundongos fêmea Balb/c (Charles River) com 8-10 semanas de vida receberam microchips e receberam um identificador único. Cada coorte teve 17 camundongos e cada animal recebeu 1 x 105 células injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo dorsal em meio livre de soro de 100 µl. As medições de volume tumoral foram realizadas três vezes por semana com compassos, como descrito no Exemplo 8. O estudo foi realizado de acordo com os regulamentos do Ministério do Interior do Reino Unido, como descrito no Exemplo 8.
[0370] Os tecidos foram coletados no término do estudo, e a expressão de mesotelina ligada a membrana foi confirmada por coloração imuno-histoquímica em tecidos tumorais embebidos em parafina fixada por formalina (FFPE) como a seguir: 4 µm de cortes de tecido de FFPE foram desparafinizados e o antígeno recuperado com o uso de pH baixo de 6,1 a 97 °C (Dako PT Link) seguido por um bloco de peroxidase e bloco de proteína antes da incubação com um anticorpo antimesotelina primário (LifeSpan Biosciences, número de catálogo LS-C407883) em uma concentração de 1 µg/ml. O anticorpo antimesotelina foi detectado com o uso de a reagente secundário anticoelho de polímero HRP identificado e um ponto final cromogênico de DAB (3,3'- diaminobenzidina) (Dako EnVision+ System).
[0371] Para avaliar a eficácia de Fcab FS22m-063, as seguintes moléculas ou combinações foram testadas in vivo: o anticorpo anti-MSLN FS28m-228-010 em isotipo IgG1 humano com mutações LALA (G1-AA/FS28m-228-010), o Fcab em dois formatos de mAb2 “simulados” (FS22m-063-AA/HelD1.3 e FS22m- 063-AA/4420), uma combinação do anticorpo FS28m-228-010 com um mAb2 CD137 simulado com mutações LALA (G1-AA/FS28m-228- 010 + FS22m-063-AA/HelD1.3), um anticorpo de controle de isotipo humano (G1-AA/HelD1.3), e finalmente um mAb² CD137 (FS22m-063-AA/FS28m-228-010) com mutações LALA.
[0372] Os camundongos fêmeas Balb/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando 20-25 g, cada, foram aclimatizados por uma semana antes do estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Com a exceção de FS22m-063-AA/4420 (n=10 camundongos), cada coorte compreendeu 20 camundongos. A linhagem celular de carcinoma de cólon CT26.G10 foi expandida e os bancos celulares gerados. Cada animal recebeu 1 x 105 células injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo em meios livres de soro de 100 µl. Quaisquer camundongos que não tiveram tumores 12 dias após a inoculação de célula tumoral foram removidos do estudo.
[0373] Doses de 200 µg de cada anticorpo (~10 mg/kg) foram preparadas e injetadas intraperitonealmente (IP) em camundongos. Além disso, tanto FS22m-063-AA/HelD1.3 quanto G1-AA/FS28m-228-010 foram, cada um, preparados em 200 µg por dose (~10 mg/kg) para o grupo de combinação. Doses de 200 µl foram administradas aos camundongos nos dias 12, 14 e 16 (q2dx3), após a inoculação tumoral. As medições de volume tumoral foram realizadas três vezes por semana com o uso de compassos e os camundongos foram monitorados de perto. O ponto final do estudo foi determinado por pontos finais humanos com base em volume tumoral e condição dos camundongos.
[0374] Como mostrado na Figura 9, os mAb2FS22m-063- AA/FS28m-228-010 inibiram significativamente o crescimento tumoral em comparação com o controle de isotipo G1- AA/HelD1.3. A Tabela 9 mostra a comparação em pares das taxas de crescimento tumoral para todos os grupos de tratamento ao longo do curso completo do estudo com o uso de análise de Modelo Misto, comparando-se todos os grupos ao controle de isotipo G1-AA/HelD1.3. Tabela 9: Resultados de comparação em pares do crescimento tumoral com o uso de análise de Modelo Misto, comparando-se todos os grupos ao controle de isotipo G1-AA/HelD1.3.
Grupos Valores P Análise de Modelo Misto G1-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg (controle negativo) G1-AA/FS28m-228-010 de 10 mg/kg 0,4367 NS FS22m-063-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg 0,0017 *** FS22m-063-AA/4420 de 10 mg/kg 0,7067 NS G1-AA/FS28m-228-010 de 10 mg/kg 0,2093 NS + FS22m-063-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg FS22m-063-AA/FS28m-228-010 de 0,0000 **** 10 mg/kg NS p≥0,05; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; **** p<0,0001
[0375] Todos os animais que portam tumores com medição igual ou abaixo de 62,5 mm3 no fim do estudo foram contabilizados como animais de resposta completa (consultar
Tabela 10). 35 % dos animais tratados com mAb2 anti- CD137/MSLN tiveram resposta completa ao tratamento no final do estudo, em comparação com 0 % no controle de isotipo G1- AA/HelD1.3, FS22m-063-AA/HelD1.3, FS22m-063-AA/4420, e grupos de combinação FS22m-063-AA/HelD1.3 e G1-AA/FS28m- 228-010. Tabela 10: Número e porcentagem de camundongos livres de tumor (tumores ≤ 62 mm3) no fim do estudo no modelo de tumor singênico CT26.G10.
Grupos Camundongos livres de tumor no fim do estudo G1-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg (controle 0/20 (0 %) negativo) G1-AA/FS28m-228-010 de 10 mg/kg 1/20 (5 %) FS22m-063-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg 0/20 (0 %) FS22m-063-AA/4420 de 10 mg/kg 0/10 (0 %) G1-AA/FS28m-228-010 de 10 mg/kg + 0/20 (0 %) FS22m-063-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg FS22m-063-AA/FS28m-228-010 de 7/20 (35 %) 10 mg/kg
[0376] A análise de sobrevivência (Figura 10 e Tabela 11) mostrou que os mAb2 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 induziram um benefício de sobrevivência significativo em comparação com o anticorpo G1-AA/HelD1.3, enquanto os componentes (G1-AA/FS28m-228-010, FS22m-063-AA/HelD1.3), ou
G1-AA/FS28m-228-010 + FS22m-063-AA/4420 não demonstraram uma vantagem de sobrevivência. Além disso, os mAb2 FS22m- 063-AA/FS28m-228-010 resultaram em um tempo de sobrevivência média aprimorado de 42,5 dias em comparação com G1-AA/HelD1.3 (29 dias), FS22m-063-AA/HelD1.3 (30 dias), FS22m-063-AA/4420 (29 dias), G1-AA/FS28m-228-010 (30 dias) e combinação de FS22m-063-AA/HelD1.3 com G1-AA/FS28m- 228-010 (29 dias). Tabela 11: Tempos de sobrevivência média para animais tratados com cada composto, e resultados de análises estatísticas em pares (Classificação de log) em modelo de tumor singênico CT26.G10.
Grupos Sobrevivência Valores P Média (Dias) Classificação de log G1-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg 29 G1-AA/FS28m-228-010 de 30 0,993 NS 10 mg/kg FS22m-063-AA/HelD1.3 de 30 0,3952 NS 10 mg/kg FS22m-063-AA/4420 de 10 mg/kg 29 0,9645 NS G1-AA/FS28m-228-010 de 29 0,4706 NS 10 mg/kg + FS22m-063-AA/HelD1.3 de 10 mg/kg FS22m-063-AA/FS28m-228-010 de 42,5 <0,0001 **** 10 mg/kg
NS p≥0,05; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; **** p<0,0001
[0377] Esses dados sugerem que a reticulação dos mAb2 por meio de MSLN tem a capacidade para acionar o agonismo de CD137 no tumor; uma ação do anticorpo biespecífico que é superior ao alvejamento de CD137 e/ou MSLN por si só (e mesmo em combinação), que resultou em sobrevivência significativamente aprimorada de camundongos que portam tumor. O Fcab em um formato de mAb² simulado FS22m-063- AA/HelD1.3 ou FS22m-063-AA/4420), sem qualquer Fab de alvejamento de MSLN, não mostrou atividade intrínseca nesse estudo. Exemplo 11: Seleções para obter um Fcab com a capacidade para se ligar a CD137 murino e humano
[0378] Visto que foi constatado surpreendentemente que alguns dos Fcabs que se ligam a CD137 humano também se ligam a CD137 de camundongo (consultar o Exemplo 5.5 para especificidade de ligação a CD137 humano, de camundongo e de cinomolgo), decidiu-se observar se esses clones podem ser aprimorados.
11.1: Modificação direcionada a sítio para remover um risco de sequência potencial em clone FS22-053-014
[0379] O clone transreativo de camundongo-humano FS22- 053-014 foi selecionado devido ao fato de se ter mostrado que mesmo tem a capacidade para se ligar a CD137 de camundongo dimérico antígeno por SPR (consultar o exemplo
5.5). No entanto, mediante a análise de sequência adicional, o mesmo teve um risco de sequência potencial que pode resultar em uma isomerização de aspartato pós-tradução na alça EF de seu domínio CH3 como resultado da mutação Q98D em conjunto com a posição G99 do tipo selvagem que cria um motivo DG. Outros clones maturados por afinidade na linhagem de FS22-053 (consultar a Tabela 12) contiveram, em vez disso, uma modificação de Q98E na mesma posição na alça EF. O Q98D foi mutado para Q98E por mutagênese direcionada por sítio com o uso do kit de mutagênese de QuickChange II (Agilent, número de catálogo 200523), de acordo com as recomendações do fabricante, que renderam clone FS22-053-
017. A Tabela 12 abaixo mostra um motivo LE de ocorrência frequente na alça EF dos domínios CH3 de clones FS22-053- 008, FS22-172-003 e FS22-172-004, e o motivo DG na alça EF do domínio CH3 de clone FS22-053-014. Tabela 12 Alça EF (92-101) G1 CH3 D K S R W Q Q G N V FS22-053-008 D Y W R W L E G N V FS22-053-011 D Y W R W T D G N V FS22-053-014 Y H W R W L D G N V FS22-172-003 G A D R W L E G N V FS22-172-004 G A D R W L E G N V FS22-053-017 Y H W R W L E G N V Exemplo 12: Caracterização de clone de Fcab de FS22-053-017 mutante
12.1 Atividade de FS22-053-017 Fcab em formato de mAb2 simulado em ensaio de ativação de célula T de DO11.10 de CD137 humano
[0380] O clone de Fcab FS22-053-017 foi subclonado e expresso como mAb² “simulados” HelD1.3Fcab e, então, comparado ao clone FS22-053-014, também em formato de mAb² HelD1.3, em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10
CD137 humano como descrito no Exemplo 3.4. G1-AA/20H4.9 foi usado como um controle positivo de anti-CD137 e G1-AA/D1.3 como um controle de IgG. Os mAb² foram testados sem reticulação de Proteína L ou foram reticulados em uma razão de 1:4 com Proteína L. Tabela 13 Clone de Fcab Liberação de IL-2 com ou sem reticulação (em formato de de Proteína L mAb2 HelD1.3) +XL Emáx (IL-2 ou mAb Nenhum XL pg/ml) +XL EC50 (nM) FS22-053-014 N/A 4174 0,73 FS22-053-017 N/A 4956 0,82 G1-AA/20H4.9 Não medida 5018 0,82 N/A – não aplicável visto que o sinal baixo não permitiu a determinação de EC50
[0381] Os resultados na Tabela 13 e Figura 12 mostram que tanto Fcab FS22-053-17 em formato de mAb2 simulados quanto Fcab FS22-053-014 em formato de mAb2 simulados teve atividade comparável quando reticulado por Proteína L no mesmo ensaio de ativação de célula T de DO11.10. Portanto, a mutagênese realizada não impactou negativamente a atividade funcional. Ambos os clones em formato de mAb² simulados não tiveram atividade sem reticulação.
[0382] Como esperado, o antiCD137 de controle positivo teve atividade apenas quando reticulado e o controle de IgG não teve atividade, reticulado ou não.
12.2 Atividade de Fcab de FS22-053-017 mutante em formato de mAb2 simulado em ensaio de ativação de célula T de DO11.10 de CD137 de camundongo
[0383] O clone FS22-053-017 (em formato de mAb² simulado de HelD1.3) também foi comparado contra o clone de Fcab que se liga a CD137 murino FS22m-063 (também no formato de mAb² simulado de HelD1.3), bem como o clone parental FS22-053- 014 (no formato de mAb² simulado de HelD1.3), em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10 CD137 de camundongo como descrito no Exemplo 3.4. As moléculas de mAb² foram reticuladas com Proteína L em uma razão molar de 4:1 (mAb²:Proteína L).
[0384] Como esperado, todas as moléculas testadas mostraram atividade, como medido por liberação de IL-2, quando reticuladas por Proteína L, mas não tiveram atividade quando não reticuladas. FS22m-063 que foi selecionado para se ligar a CD137 de camundongo teve a melhor atividade no ensaio, com um EC50 de 0,39 nM quando reticulado. Tanto FS22-053-14 quanto FS22-053-017 tiveram atividade no ensaio, indicando que a função não foi perdida devido à mutagênese, embora FS22-053-017 tivesse uma perda ligeira em atividade com um EC50 que foi aproximadamente 8 vezes pior que FS22-053-14 quando reticulado por Proteína L. A Figura 12 mostra que os Fcabs transreativos humano e murino maturado por afinidade CD137 FS22-053-014 e FS22- 053-017, e Fcab CD137 anticamundongo FS22m-063, em formato de mAb2 simulados de HelD1.3 ativa CD137 quando reticulado com Proteína L que resulta em uma liberação de mIL-2 em um ensaio de ativação de célula T de DO11.10.
Tabela 14 Liberação de IL-2 com ou sem reticulação de Proteína L Clone de Fcab (em formato Nenhum +XL Emáx (IL- +XL EC50 de mAb2 HelD1.3) ou mAb XL 2 pg/ml) (nM) FS22-053-014 N/A 28071 2,04 FS22-053-017 N/A 41042 16,74 FS22m-063 N/A 24175 0,39 G1-AA/Lob12.3 + Proteína L N/A 21332 2,26 N/A – não aplicável visto que o sinal baixo não permitiu a determinação de EC50
12.3 Cinética de Ligação de FS22-053-017
[0385] A constante de dissociação de equilíbrio (KD) de clone de Fcab FS22-053-017 foi comparada àquela de clone FS22-053-014 por SPR em um sistema Biacore T200. Para o antígeno hCD137-mFc-Avi p seguinte método foi usado: uma molécula de Fab anti-humano foi imobilizada em um chip CM5 a uma densidade de superfície entre 9.000 e 11.000 unidades de resposta (RU). Os anticorpos foram diluídos a 4 µg/ml em tampão de HBS-EP e capturados pela molécula anti-Fab com uma taxa de fluxo de 30 µl/s. Oito concentrações diferentes de antígeno hCD137-mFc foram usadas: 200 nM; 66,67 nM; 22,22 nM (incluído duas vezes), 7,41 nM; 2,47 nM; 0,82 nM, 0,27 nM: 0,091 (diluído em tampão de HBS-EP+) passaram através do mAb² capturado.
[0386] Para determinação de cinética de ligação de mCD137-mFc-Avi, uma abordagem diferente foi usada. PD-L1- mFc-Avi de camundongo foi imobilizada em um chip CM5 a uma densidade de superfície de 200 RUs. mAb² que contém os Fcabs de FS22-053-014 e FS22-053-017 em combinação com um
Fab de PD-L1 anticamundongo (S70) foram diluídos a 7,5 µg/ml em tampão de HBS-EP e capturados pela proteína mPD-L1 imobilizada com uma taxa de fluxo de 60 µl/s. Oito concentrações diferentes de antígeno mCD137-mFc foram usadas: 600 nM; 200 nM; 66,67 nM (incluído duas vezes), 22,2 nM; 7,1 nM; 2,47 nM; 0,82 nM (diluído em tampão de HBS-EP+) passaram através do mAb² capturado.
[0387] A análise dos dados foi realizada com o uso do software de avaliação Biacore T200. As curvas foram subtraídas contra uma célula de fluxo bruta e ajustadas com o uso de um modelo de ligação de Langmuir de 1:1 com transferência de massa, estabelecendo RI em zero como constante e Rmáx para local. Os resultados são sumarizados na Tabela 15 e mostraram perfis cinéticos muito similares a antígeno humano para ambos os clones de Fcab, dessa forma, evidenciando que a mutação de Q98D para Q98E não teve um efeito negativo na ligação ao antígeno humano. Uma diminuição de 2 vezes na força de ligação ao antígeno de camundongo também é consistente com os dados funcionais mostrados no Exemplo 11.2. Tabela 15 Molécula ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) FS22-053-014/HelD1.3 8,304×104 3,656×10-4 4,403 FS22-053-017/HelD1.3 8,853×104 4,062×10-4 4,588 FS22-053-014/mPD-L1 1,509×105 4,025-3 27 FS22-053-017/mPD-L1 1,064×105 5,186-3 49 Exemplo 13: Envolvimento de PPY em ligação de antígeno (varredura de alanina de motivo PPY conservado)
[0388] Como descrito no Exemplo 5, um motivo PPY de sequência foi identificado na alça AB de dois Fcabs independentemente selecionados, e esse motivo foi conservado em todos os clones maturados por afinidade analisados. Desejou-se, portanto, compreender o envolvimento desse motivo na ligação a CD137 e estrutura de proteína geral. A varredura de alanina é uma técnica biológica comum usada para determinar a importância de resíduos específicos em interação de proteína-proteína. Resumidamente, cada um dos três aminoácidos em sequência e, então, em uníssono foram substituídos com resíduos de alanina. A alanina é considerada o resíduo não volumoso mais quimicamente inerte e, portanto, considera-se que a mesma não é propensa a auxiliar na ligação.
13.1 produção de clones mutantes para varredura de alanina
[0389] Os clones mutantes foram produzidos por mutagênese direcionada por sítio nos clones parentais (FS22-172-003 e FS22-053-008). As localizações de substituições de aminoácido dentro da alça AB são sumarizadas na Tabela 16, todos os outros resíduos são conservados a seus respectivos parentes. Variantes de mAb² foram, então, expressas transientemente em células HEK293- 6E e purificadas com o uso de colunas de proteína A mAb Select SuRe, como descrito no Exemplo 3. O rendimento de expressão de mutantes foi similar a parental e, portanto, isso sugere que as substituições de alanina não tiveram efeito na produção de proteína.
Tabela 16 Clone Sequência Sequência Mutada Nome de Parental Original de Alça de Alça AB Clone
AB FS22-53- NPPYLFS NAPYLFS FS22-053- 008 (SEQ ID NO: 19) 008_APY NPAYLFS FS22-053- 008_PAY NPPALFS FS22-053- 008_PPA NAAALFS FS22-053- 008_AAA FS22-172- PYIIPPY PYIIAPY FS22-172- 003 (SEQ ID NO: 138) 003_APY PYIIPAY FS22-172- 003_PAY PYIIPPA FS22-172- 003_PPA PYIIAAA FS22-172- 003_AAA
13.2 Cinética de Ligação de clones mutantes
[0390] As cinéticas de ligação dos 2 clones parentais e 8 clones mutantes foram comparadas com o uso de um sistema QKe Octet da ForteBio. hCD137-mFc-Avi biotinilado dimérico foi capturado em sensores de estreptavidina a 10ug/ml e, então, a interação com cada mAb² em uma concentração de 200 nM foi analisada. A ligação de mAb² a antígeno dimérico foi prejudicada para todos os clones mutantes FS22-172-003 quando comparada ao clone parental, em que os clones FS22-
172-003_AAA, e FS22-172-003_APY perdem todas as ligações, e os clones FS22-172-003_PPA, e FS22-172-003_PAY retêm alguma ligação, embora significativamente reduzida (unidades de resposta 5,5- e 4,4 vezes menores) em comparação com o parental. A ligação de FS22-053-008 também foi impactada, em que PAY e AAA variantes perdem todas as ligações, e APY e PPA variantes mostram ligação diminuída a antígeno e desaceleram o perfil de associação quando comparados ao clone parental FS22-053-008. Esses dados sugerem que o motivo PPY é importante para ligação de ambos os mAb² a CD137 antígeno.
13.3 Modelagem de homologia
[0391] Dado o envolvimento do motivo PPY na ligação, foi informativo modelar os Fcabs in silico para avaliar as previsões de estrutura de proteína no domínio CH3. As pesquisas de modelagem de homologia estrutural e conformacionais subsequentes foram realizas com o uso da versão 2019.0101 do pacote de software MOE (Chemical Computing Group ULC). A região Fc na estrutura 5JII do Banco de Dados de Proteína [PDB] foi usada como o padrão estrutural para a região Fcab tanto de FS22-172-003 quanto de FS22-053-008. Visto que as inserções existem nas regiões de alça AB e EF com relação ao padrão estrutural selecionado, uma pesquisa de alça de novo com otimização de cadeia lateral de resíduo foi aplicada para gerar os estruturadores de alça AB e EF. Os modelos de homologia resultantes foram minimizados por energia e pontuados de acordo com os critérios geométricos incluindo comprimentos de ligação a estrutura principal, ângulos, ângulos diedrais e quiralidade. Os modelos de homologia estruturais com pontuações que são aprovadas nos critérios foram usados como a base para amostragem conformacional com o uso do método de simulação de LowModeMD, como implantado em MOE.
[0392] Os modelos de homologia na Figura 13 mostram que as alças AB e EF de ambos os Fcabs adotam conformações diferentes em comparação com o 5JII padrão, em que o motivo PPY desempenha um papel na protrusão de alças AB do núcleo do domínio CH3. O motivo PPY também medeia interações que resultam em estabilização conformacional de alça AB através de ambas as interações na alça e entre a alça e o restante da estrutura. As pesquisas conformacionais realizadas com o uso de simulações de LowModeMD também destacaram que o resíduo de tirosina no motivo PPY interage com o Q3 (IMGT) e D12 (IMGT) no domínio CH3 da mesma cadeia no domínio CH3, possivelmente estabilizando a alça AB. Colocados em conjunto com os resultados mostrados no Exemplo 13.2, isso sugere que o motivo PPY é importante para a ligação tanto de FS22-172-003 quanto de FS22-053-008 a CD137. Listagem de Sequências Sequências de aminoácidos de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab de WT Alça AB de Fcab de WT – RDELTKNQ (SEQ ID NO: 1) Alça CD de Fcab de WT – SNGQPENNY (SEQ ID NO: 2) Alça EF de Fcab de WT – DKSRWQQGNV (SEQ ID NO: 3) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab de WT (SEQ ID NO: 4) Alças AB, CD e EF sublinhado
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos do domínio CH2 de Fcab com mutação
LALA-PA (SEQ ID NO: 5) Mutação LALA-PA sublinhado
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK Sequência de aminoácidos do domínio CH2 de Fcab com mutação LALA (SEQ ID NO: 6) Mutação LALA sublinhado
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK Sequência de aminoácidos da região de dobradiça de Fcab truncada (SEQ ID NO: 7)
TCPPCP Sequência de aminoácidos de Fcab de WT com mutação LALA (SEQ ID NO: 8) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sequência de aminoácidos de Fcab de WT sem mutação LALA (SEQ ID NO: 9) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de motivo de PPY (SEQ ID NO: 10)
PPY
Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-033 com mutação LALA (SEQ ID NO: 11) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDEYFEQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVARHRWQLGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-033 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 12) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDEYFEQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVARHRWQLGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-033/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 13) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DEYFEQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVAR
HRWQLGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-033/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 14) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DEYFEQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVAR
HRWQLGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053 com mutação LALA (SEQ ID NO: 15) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVYYNRWQDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 16) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVYYNRWQDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 17) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVYYNRWQDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 18) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVYYNRWQDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab de FS22-053-008 Primeira sequência de FS22-053-008 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-008 - DYWRWLE (SEQ ID NO: 20) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab de FS22- 053-008 (SEQ ID NO: 21) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab de FS22-053-008 (SEQ ID NO: 22)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTACTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTA CTGGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACA
ACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-008 com mutação LALA (SEQ ID NO: 23) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-008 com mutação LALA (SEQ ID NO: 24)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-008 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 25) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-008 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 26)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-008/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 27) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado
FS22-053-008/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 28) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab de FS22-053-009 Primeira sequência de FS22-053-009 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-009 - EHTRWLD (SEQ ID NO: 29) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab de FS22- 053-009 (SEQ ID NO: 30) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVEHTRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab de FS22-053-009 (SEQ ID NO: 31)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAACA TACTAGGTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-009 com mutação LALA (SEQ ID NO: 32)
Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVEHTRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-009 com mutação LALA (SEQ ID NO: 33)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAACATACTAG GTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-009 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 34) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVEHTRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-009 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 35)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAACATACTAG GTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-009/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 36) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVEHTRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-009/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 37) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVEHTRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-010 Primeira sequência de FS22-053-010 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-010 - DYMRWLD (SEQ ID NO: 38) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 010 (SEQ ID NO: 39) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDYMRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-010 (SEQ ID NO: 40)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTA CATGAGGTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-010 com mutação LALA (SEQ ID NO: 41) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDYMRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-010 com mutação LALA (SEQ ID NO: 42)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACATGAG GTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-010 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 43) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYMRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-010 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 44)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACATGAG GTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-010/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 45) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYMRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-010/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 46) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYMRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-011
Primeira sequência de FS22-053-011 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-011 - DYWRWTD (SEQ ID NO: 47) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 011 (SEQ ID NO: 48) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWTDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-011 (SEQ ID NO: 49)
GGACAGCCTCGAGAGCCTCAAGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTA CTGGAGGTGGACTGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACA
ACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-011 com mutação LALA (SEQ ID NO: 50) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWTDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-011 com mutação LALA (SEQ ID NO: 51)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAG GTGGACTGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-011 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 52) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYWRWTDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-011 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 53)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACTGGAG GTGGACTGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-011/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 54) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYWRWTDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-011/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 55) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYWRWTDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-012 Primeira sequência de FS22-053-012 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-012 - DHMRWLE (SEQ ID NO: 56) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 012 (SEQ ID NO: 57) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDHMRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-012 (SEQ ID NO: 58)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCA TATGAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-012 com mutação LALA (SEQ ID NO: 59) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDHMRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-012 com mutação LALA (SEQ ID NO: 60)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCATATGAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-012 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 61) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDHMRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-012 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 62)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCATATGAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-012/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 63) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDHMRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-012/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 64) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDHMRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-013 Primeira sequência de FS22-053-013 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-013 - GYERWLE (SEQ ID NO: 65) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 013 (SEQ ID NO: 66) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGYERWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-013 (SEQ ID NO: 67)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGTTA CGAAAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-013 com mutação LALA (SEQ ID NO: 68) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGYERWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-013 com mutação LALA (SEQ ID NO: 69)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGTTACGAAAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-013 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 70) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGYERWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-013 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 71)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGTTACGAAAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-013/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 72) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGYERWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado
FS22-053-013/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 73) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGYERWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-014 Primeira sequência de FS22-053-014 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-014 - YHWRWLD (SEQ ID NO: 74) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 014 (SEQ ID NO: 75) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-014 (SEQ ID NO: 76)
GGACAGCCTCGAGAGCCTCAAGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTACCA TTGGAGGTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACA
ACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-014 com mutação LALA (SEQ ID NO: 77)
Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-014 com mutação LALA (SEQ ID NO: 78)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTACCATTGGAG GTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-014 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 79) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-014 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 80)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTACCATTGGAG GTGGCTGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-014/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 81) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVYHWRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-014/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 82) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVYHWRWLDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-015 Primeira sequência de FS22-053-015 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-015 - DHWRWLQ (SEQ ID NO: 83) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 015 (SEQ ID NO: 84) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDHWRWLQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-015 (SEQ ID NO: 85) Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-015 com mutação LALA (SEQ ID NO: 86) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDHWRWLQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-015 com mutação LALA (SEQ ID NO: 87)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCATTGGAG GTGGCTGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-015 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 88) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDHWRWLQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-015 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 89)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCATTGGAG GTGGCTGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-015/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 90) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDHWRWLQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-015/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 91) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDHWRWLQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-016 Primeira sequência de FS22-053-016 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-016 - DYIRWLN (SEQ ID NO: 92) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 016 (SEQ ID NO: 93) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDYIRWLNGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-016 (SEQ ID NO: 94)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTA CATCAGGTGGCTGAACGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-016 com mutação LALA (SEQ ID NO: 95) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYIRWLNGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-016 com mutação LALA (SEQ ID NO: 96)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACATCAG GTGGCTGAACGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-016 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 97) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDYIRWLNGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-016 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 98)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATTACATCAG GTGGCTGAACGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-016/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 99) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYIRWLNGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-016/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 100) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDYIRWLNGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-053-017 Primeira sequência de FS22-053-017 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053-017 - YHWRWLE (SEQ ID NO: 101) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-053- 017 (SEQ ID NO: 102) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053-017 (SEQ ID NO: 103)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACTCTGCCCCCTTCACGCGACGAACTCAATCC GCCCTACCTGTTCTCCAACCAAGTCTCCCTGACCTGTCTTGTGAAGGGTTTCTACCCAT CCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAGAACAACTATAAGACTACC CCGCCTGTGCTGGACTCGGACGGCAGCTTCTTCTTGTACTCCAAACTGACCGTGTACCA CTGGCGGTGGCTGGAAGGGAACGTGTTTAGCTGCTCCGTCATGCATGAAGCCCTGCACA
ACCACTACACCCAGAAGTCCCTCTCGCTCTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-017 com mutação LALA (SEQ ID NO: 104) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-017 com mutação LALA (SEQ ID NO: 105)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACTCTGCCCCCTTCACGCGACGAACTCAATCCGCCCTA CCTGTTCTCCAACCAAGTCTCCCTGACCTGTCTTGTGAAGGGTTTCTACCCATCCGATA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAGAACAACTATAAGACTACCCCGCCT GTGCTGGACTCGGACGGCAGCTTCTTCTTGTACTCCAAACTGACCGTGTACCACTGGCG GTGGCTGGAAGGGAACGTGTTTAGCTGCTCCGTCATGCATGAAGCCCTGCACAACCACT
ACACCCAGAAGTCCCTCTCGCTCTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-053-017 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 106) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVYHWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053-017 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 107)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACTCTGCCCCCTTCACGCGACGAACTCAATCCGCCCTA CCTGTTCTCCAACCAAGTCTCCCTGACCTGTCTTGTGAAGGGTTTCTACCCATCCGATA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAGCCGGAGAACAACTATAAGACTACCCCGCCT GTGCTGGACTCGGACGGCAGCTTCTTCTTGTACTCCAAACTGACCGTGTACCACTGGCG GTGGCTGGAAGGGAACGTGTTTAGCTGCTCCGTCATGCATGAAGCCCTGCACAACCACT
ACACCCAGAAGTCCCTCTCGCTCTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-017/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 108) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVYHWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-053-017/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 109) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVYHWRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172 Primeira sequência de FS22-172 - RKYYPPY (SEQ ID NO: 110) Segunda sequência de FS22-172 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172 (SEQ ID NO: 112) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172 (SEQ ID NO: 113)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAA ATACTACCCGCCGTACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172 com mutação LALA (SEQ ID NO: 114)
Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172 com mutação LALA (SEQ ID NO: 115)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAAATACTA CCCGCCGTACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 116) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 117)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAAATACTA CCCGCCGTACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 118) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELRKYYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 119) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELRKYYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172-001 Primeira sequência de FS22-172-001 - PFVMPPY (SEQ ID NO: 120) Segunda sequência de FS22-172-001 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172- 001 (SEQ ID NO: 121) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELPFVMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172-001 (SEQ ID NO: 122)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATT CGTTATGCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-001 com mutação LALA (SEQ ID NO: 123) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELPFVMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-001 com mutação LALA (SEQ ID NO: 124)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATTCGTTAT GCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-001 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 125) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELPFVMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-001 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 126)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATTCGTTAT GCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-001/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 127) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELPFVMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-001/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 128) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELPFVMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172-002 Primeira sequência de FS22-172-002 - PFQMPPY (SEQ ID NO: 129) Segunda sequência de FS22-172-002 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172- 002 (SEQ ID NO: 130) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172-002 (SEQ ID NO: 131)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATT CCAGATGCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-002 com mutação LALA (SEQ ID NO: 132) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-002 com mutação LALA (SEQ ID NO: 133)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATTCCAGAT GCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-002 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 134) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-002 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 135)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATTCCAGAT GCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-002/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 136) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-002/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 137) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172-003 Primeira sequência de FS22-172-003 - PYIIPPY (SEQ ID NO: 138) Segunda sequência de FS22-172-003 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111)
Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172- 003 (SEQ ID NO: 139) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172-003 (SEQ ID NO: 140)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATA CATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACA
ACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-003 com mutação LALA (SEQ ID NO: 141) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-003 com mutação LALA (SEQ ID NO: 142)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCAT CCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACT
ACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-003 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 143) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-003 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 144)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCAT CCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACT
ACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-003/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 145) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-003/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 146) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172-004 Primeira sequência de FS22-172-004 - NYIYPPY (SEQ ID NO: 147) Segunda sequência de FS22-172-004 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172- 004 (SEQ ID NO: 148) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172-004 (SEQ ID NO: 149)
GGACAGCCTCGAGAGCCTCAAGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACTA CATCTACCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACA
ACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-004 com mutação LALA (SEQ ID NO: 150) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-004 com mutação LALA (SEQ ID NO: 151)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACTACATCTA CCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-004 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 152) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-004 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 153)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACTACATCTA CCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-004/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 154) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-004/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 155) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172-005 Primeira sequência de FS22-172-005 - QQVYPPY (SEQ ID NO: 156) Segunda sequência de FS22-172-005 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172- 005 (SEQ ID NO: 157) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELQQVYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172-005 (SEQ ID NO: 158)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCAGCA GGTTTACCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-005 com mutação LALA (SEQ ID NO: 159) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELQQVYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-005 com mutação LALA (SEQ ID NO: 160)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCAGCAGGTTTA CCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-005 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 161) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELQQVYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-005 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 162)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCAGCAGGTTTA CCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-005/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 163) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELQQVYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-005/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 164)
domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELQQVYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS22-172-006 Primeira sequência de FS22-172-006 - RKYYPPY (SEQ ID NO: 110) Segunda sequência de FS22-172-006 - GADRWLE (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS22-172- 006 (SEQ ID NO: 165) Primeira e segunda sequências sublinhadas
GQPREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQLSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 172-006 (SEQ ID NO: 166)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAA ATACTACCCGCCGTACAACCAGCTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGC AGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-006 com mutação LALA (SEQ ID NO: 167)
Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito), domínio CH3 (itálico), mutação LALA (negrito e sublinhado)
TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQLSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-006 com mutação LALA (SEQ ID NO: 168)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAAATACTA CCCGCCGTACAACCAGCTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos de Fcab de FS22-172-006 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 169) Região de dobradiça (sublinhado), domínio CH2 (negrito) e domínio CH3 (itálico)
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELRKYYPPYNQLSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-172-006 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 170)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCGTAAATACTA CCCGCCGTACAACCAGCTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAG GTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-006/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 171) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELRKYYPPYNQLSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb2 simulado FS22-172-006/HelD1.3 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 172) domínio VH (sublinhado)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELRKYYPPYNQLSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb2 simulado HelD1.3 (SEQ ID NO: 173) domínio VL (sublinhado)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVP SRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab de FS22-053 Primeira sequência de FS22-053 - NPPYLFS (SEQ ID NO: 19) Segunda sequência de FS22-053 - YYNRWQD (SEQ ID NO: 174) Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab de FS22-053 (SEQ ID NO: 175) (Primeira e segunda sequências são sublinhadas).
GQPREPQVYTLPPSRDELNPPYLFSNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVYYNRWQDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS22- 053 (SEQ ID NO: 176)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCC GCCGTACCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTATTA TAACAGGTGGCAGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053 Fcab com LALA (SEQ ID NO: 177)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTATTATAACAG GTGGCAGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequência de ácidos nucleicos de Fcab de FS22-053 Fcab sem LALA (SEQ ID NO: 178)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCC GCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGG TGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGT GTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAG TGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAG CCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAACCCGCCGTA CCTGTTCTCTAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTATTATAACAG GTGGCAGGATGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT
ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Sequências de aminoácidos de região de dobradiça de imunoglobulina de comprimento total (SEQ ID NO: 179)
EPKSCDKTHTCPPCP Sequência de aminoácidos de CD137 humano (SEQ ID NO: 180)
Domínio extracelular (itálico); Domínios transmembrana e intracelular (negrito) lqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecssts naecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsl dgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqIISFFLALTSTALL
FLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL Sequência de aminoácidos de domínio extracelular CD137 humano (SEQ ID NO: 181)
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTS NAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSL
DGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ Sequência de aminoácidos de CD137 de cinomolgo (SEQ ID NO: 182) Domínio extracelular (itálico); Domínios transmembrana e intracelular (negrito)
LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTS NAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSL DGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQIIFFLALTSTVVLF
LLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL Sequência de aminoácidos de domínio extracelular de CD137 de cinomolgo (SEQ ID NO: 183)
LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTS NAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSL
DGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ Sequência de aminoácidos CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 184) Domínio extracelular (itálico); Domínios transmembrana e intracelular (negrito) vqnscdncqpgtfcrkynpvckscppstfssiggqpncnicrvcagyfrfkkfcssthn aececiegfhclgpqctrcekdcrpgqeltkqgcktcslgtfndqngtgvcrpwtncsl dgrsvlktgttekdvvcgppvvsfspsttisvtpeggpgghslqvlTLFLALTSALLLA
LIFITLLFSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYEL Sequência de aminoácidos de domínio extracelular CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 185)
VQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHN AECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSL
DGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVL Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de mAb G1/HelD1.3 (SEQ ID NO: 186)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de PD-L1 humano (SEQ ID NO: 187)
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEM EDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISY GGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSG KTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPN
ERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET Sequência de aminoácidos de PD-L1 de murino (SEQ ID NO: 188)
MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEK EDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISY GGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGK RSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQN RTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET
Sequência de aminoácidos de mesotelina de camundongo (SEQ ID NO: 189)
DAEQKACPPGKEPYKVDEDLIFYQNWELEACVDGTMLARQMDLVNEIPFTYEQLSIFKH KLDKTYPQGYPESLIQQLGHFFRYVSPEDIHQWNVTSPDTVKTLLKVSKGQKMNAQAIA LVACYLRGGGQLDEDMVKALGDIPLSYLCDFSPQDLHSVPSSVMWLVGPQDLDKCSQRH LGLLYQKACSAFQNVSGLEYFEKIKTFLGGASVKDLRALSQHNVSMDIATFKRLQVDSL VGLSVAEVQKLLGPNIVDLKTEEDKSPVRDWLFRQHQKDLDRLGLGLQGGIPNGYLVLD
FNVREAFS Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de mAb2 FS22m- 063-AA/FS28m-228 (SEQ ID NO: 190)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYFMVWVRQAPGKGLEWVSMISPKSSNTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFTPARFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEPYWSYVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
MNYRWELGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de cadeia leve de mAb2 FS22m-063- AA/FS28m-228 (SEQ ID NO: 191)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQPFPFSFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de mAb G1AA/HelD1.3 (com LALA) (SEQ ID NO: 192)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS22-172-004- AA/S70 (com LALA) (SEQ ID NO: 193)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS22-172-004- AA/S70 (sem LALA) (SEQ ID NO: 194)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELNYIYPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de cadeia leve de FS22-172-004- AA/S70 (SEQ ID NO: 194)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS22-172-003- AA/S70 (com LALA) (SEQ ID NO: 195)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS22-172-003- AA/S70 (sem LALA) (SEQ ID NO: 196)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS22-172-002- AA/S70 (com LALA) (SEQ ID NO: 197)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS22-172-002- AA/S70 (sem LALA) (SEQ ID NO: 198)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELPFQMPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia pesada de FS22-172-002-AA/S70 (sem LALA) (SEQ ID NO: 199)
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Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Membro de ligação específico caracterizado pelo fato de que se liga a CD137 e compreende um sítio de ligação a antígeno CD137 localizado em um domínio CH3 do membro de ligação específico, em que o sítio de ligação a antígeno CD137 compreende uma primeira sequência localizada na alça estrutural AB do domínio CH3, em que a dita primeira sequência compreende a sequência de PPY (SEQ ID NO: 10).
2. Membro de ligação específico, de acordo com a reivindicação 1, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender uma inserção na alça estrutural AB.
3. Membro de ligação específico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita inserção é de 5 aminoácidos em comprimento.
4. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 138; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 129; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 147; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 120; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 156; (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 110; ou (vii) FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 110.
5. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender adicionalmente uma segunda sequência localizada na alça estrutural EF do domínio CH3, e em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico FS22- 172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22- 172-005, FS22-172-006 ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO:
111.
6. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-172-003 apresentado em SEQ ID NO: 139; (ii) FS22-172-002 apresentado em SEQ ID NO: 130; (iii) FS22-172-004 apresentado em SEQ ID NO: 148; (iv) FS22-172-001 apresentado em SEQ ID NO: 121; (v) FS22-172-005 apresentado em SEQ ID NO: 157; (vi) FS22-172-006 apresentado em SEQ ID NO: 165; ou (vii) FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 112.
7. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender a sequência de membro de ligação específico FS22-172-003, FS22-172-002, FS22-172-004, FS22-172-001, FS22-172-005, FS22-172-006 ou FS22-172 apresentado em SEQ ID NO: 141, 132, 150, 123, 159, 167 e 114, respectivamente.
8. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência é a primeira sequência de membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010,
FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016 e/ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 19.
9. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 8, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender adicionalmente uma segunda sequência localizada na alça estrutural EF do domínio CH3, e em que a segunda sequência é a segunda sequência de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 20; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 29; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 47; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 101; (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 74; (vi) FS22-053-010 apresentado em SEQ ID NO: 38; (vii) FS22-053-012 apresentado em SEQ ID NO: 56; (viii) FS22-053-013 apresentado em SEQ ID NO: 65; (ix) FS22-053-015 apresentado em SEQ ID NO: 83; (x) FS22-053-016 apresentado em SEQ ID NO: 92; ou (xi) FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 174.
10. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8 a 9, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender a sequência de domínio CH3 de membro de ligação específico: (i) FS22-053-008 apresentado em SEQ ID NO: 21; (ii) FS22-053-009 apresentado em SEQ ID NO: 30; (iii) FS22-053-011 apresentado em SEQ ID NO: 48; (iv) FS22-053-017 apresentado em SEQ ID NO: 102; (v) FS22-053-014 apresentado em SEQ ID NO: 75; (vi) FS22-053-010 apresentado em SEQ ID NO: 39; (vii) FS22-053-012 apresentado em SEQ ID NO: 57;
(viii) FS22-053-013 apresentado em SEQ ID NO: 66; (ix) FS22-053-015 apresentado em SEQ ID NO: 84; (x) FS22-053-016 apresentado em SEQ ID NO: 93; ou (xi) FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 175.
11. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8 a 10, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender a sequência de: membro de ligação específico FS22-053-008, FS22-053-009, FS22-053-011, FS22-053-017, FS22-053-014, FS22-053-010, FS22-053-012, FS22-053-013, FS22-053-015, FS22-053-016 ou FS22-053 apresentado em SEQ ID NO: 23, 32, 50, 104, 77, 41, 59, 68, 86, 95 e 15, respectivamente.
12. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender a primeira sequência, as primeira e segunda sequências, a sequência de domínio CH3 ou a sequência de membro de ligação específico FS22-172-003 ou FS22-053-008, preferencialmente, FS22-172-
003.
13. Membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 12, sendo o membro de ligação específico caracterizado por compreender adicionalmente um sítio de ligação a antígeno com base em CDR.
14. Membro de ligação específico, de acordo com a reivindicação 13, sendo o membro de ligação específico caracterizado por ser uma molécula de anticorpo.
15. Molécula de anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno com base em CDR se liga a um segundo antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em: um antígeno de célula imunológica, um antígeno tumoral e um antígeno patogênico.
16. Membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, sendo o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo caracterizado por ter sido modificado para reduzir ou anular a ligação do membro de ligação específico ou molécula de anticorpo a um ou mais receptores Fcγ.
17. Molécula de ácido nucleico caracterizada por codificar o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 17.
19. Método de produção de um membro de ligação específico, ou molécula de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira recombinante conforme definida na reivindicação 18 sob condições para a produção do membro de ligação específico ou molécula de anticorpo.
20. Membro de ligação específico, ou molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por ser para uso em um método para o tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
21. Membro de ligação específico ou molécula de anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o tratamento é o tratamento de câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo.
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