ES2326114T3

ES2326114T3 - Un peptido de hsp70 estimulador de la actividad de las celulas asesinas naturales (nk) y los usos del mismo.

Info

Publication number: ES2326114T3
Application number: ES01980380T
Authority: ES
Inventors: Gabriele Multhoff
Original assignee: Multimmune GmbH
Current assignee: Multimmune GmbH
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2009-10-01
Anticipated expiration: 2021-09-13
Also published as: US20040063173A1; US7517948B2; AU2002212236A1; WO2002022656A2; ATE430161T1; BE1019732A4; WO2002022656A3; US7745399B2; EP1319023B8; EP1319023B1; DE60138558D1; US20090239802A1; EP1319023A2

Abstract

Péptido que comprende 30 o menos aminoácidos, comprendiendo dicho péptido (a) la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELXG, en donde X es T o S, o (b) una secuencia de aminoácidos que se desvía de la secuencia de aminoácidos de (a) por medio de una sustitución de aminoácido, en donde se retienen los aminoácidos TKDN y X tal como se define en (a), y en donde dicho péptido estimula la actividad de las células NK.

Description

Un péptido de Hsp70 estimulador de la actividad de las células asesinas naturales (NK) y los usos del mismo.

La presente invención se refiere a un péptido inmunoestimulador derivado de una proteína Hsp70, y a péptidos que comprenden dicho péptido inmunoestimulador. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dicho péptido, a vectores que comprenden dichos polinucleótidos, a (poli)péptidos de fusión que comprenden dicho péptido, y a composiciones que comprenden dicho péptido. Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de dicho péptido, polinucleótido, vector o (poli)péptido de fusión, para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades y para la estimulación de la actividad de las células asesinas naturales (células NK).

Las proteínas de choque térmico (HSP) son proteínas altamente conservadas que son inducibles por una variedad de estímulos estresantes y por procesos biológicos, incluyendo la diferenciación y el desarrollo celular (Lindquist y Craig. 1988). Las HSP intracelulares funcionan como chaperonas moleculares, están implicadas en el plegamiento y transporte de proteínas, en el procesamiento y presentación de antígeno (DeNagel y Pierce, 1992; Hartl, 1996). Se ha observado también que las HSP con un peso molecular de 70 y 90 kDa funcionan como proteínas portadores para péptidos inmunogénicos derivados de tumores, los cuales inducen una respuesta inmunitaria contra el cáncer mediada por células T (Tamura et al., 1997; Schild et al., 1999; Srivastava et al., 1998). Las células presentadoras de antígeno son claves para la captación mediada por receptor de los complejos HSP-péptido (Arnold-Schild et al., 1999). Varios grupos han descrito una ubicación inusual de las HSP en la membrana plasmática en células tumorales (Altmeyer et al., 1996; Ferrarini et al., 1992; Piselli et al., 1995; Tamura et al., 1993). Los presentes inventores fueron los primeros que demostraron que las células NK también deben ser tenidas en cuenta como células efectoras relevantes para el reconocimiento de la Hsp70 unida a membrana sobre células tumorales (Multhoff et al., 1995a, 1995b; Multhoff et al., 1997; Botzler et al., 1996a, 1996b). En relación a estos hallazgos, y debido al hecho que las células normales no expresan la Hsp70, el miembro inducible del grupo Hsp70 sobre la membrana plasmática, se puede especular que Hsp70 actúa para las células NK como una estructura de reconocimiento selectiva para tumor. Estudios de bloqueo de anticuerpos revelaron que la Hsp70 es una estructura de reconocimiento importante para las células NK transitoriamente adherentes al plástico (Multhoff et al., 1995a, 1995b; Multhoff et al., 1997; Botzler et al., 1998). Aunque varios anticuerpos detectaron la Hsp70 unida a membrana sobre células tumorales, sólo el mAb RPN1197 fue capaz de bloquear la actividad citolítica de las células NK (Multhoff et al. 1995a). Recientemente se ha demostrado que la proliferación y actividad citolítica de las células NK contra células tumorales que expresan la Hsp70 puede estimularse con proteína Hsp70 recombinante, pero no con Hsc70 o DnaK (Multhoff et al. 1999). Como células diana de la actividad citolítica de las células NK, se usaron las sublíneas tumorales CX+ y CX- con un MHC y patrón de expresión de molécula de adhesión idénticos, y que difieren con respecto a la capacidad para expresar la Hsp70 sobre la membrana plasmática (Multhoff et al. 1997). En WO99/49881, se demostró adicionalmente que no sólo la proteína Hsp70 intacta activa las células NK, sino que también lo hace el dominio C-terminal de la Hsp70hom. Hsp70hom, un miembro de la familia Hsp70 específico de los testículos, tiene un 94% de homología con el dominio C-terminal de la Hsp70.

Para la producción de un (poli)péptido y su formulación en composiciones farmacéutica, es generalmente deseable reducir su tamaño tanto como sea razonable con relación a su actividad biológica. Una reducción en tamaño y complejidad incrementa el rendimiento de un péptido expresado de forma recombinante, y generalmente incrementa su estabilidad química. Cuando se produce un péptido sintéticamente, el rendimiento y la fiabilidad del proceso aumentan también con un péptido de tamaño reducido, a la vez que se minimiza el coste de producción.

Por tanto, el problema técnico que subyace la presente invención fue proporcionar una molécula pequeña, fácilmente obtenible, con actividad inmunoestimuladora, la cual puede producirse sintética o recombinantemente en grandes cantidades y a bajo coste. La solución de dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, la presente invención proporciona un péptido que comprende o tiene la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELXG, en donde X es T o S, en donde se prefiere S (también a lo largo de las realizaciones adicionales citadas en esta especificación). La invención también abarca fragmentos o derivados de dicho péptido, los cuales se explicarán adicionalmente más abajo.

El término "péptido", tal como se usa en la presente invención, indica secuencias de aminoácidos que comprenden 30 o menos aminoácidos.

Se ha hallado, de forma sorprendente, que un péptido que comprende o tiene la secuencia TKDNNLLGRFELXG, en donde X es T o S, en donde se prefiere S, es suficiente para la estimulación de la activación de las células NK. Se ha hallado que una concentración final ventajosa del péptido está en el rango de 0,2 a 2,5 \mug/ml, al menos para las utilidades in vitro.

A partir de los datos disponibles de la técnica previa, no se podía deducir que una estructura peptídica que abarcara poco más que un epítopo de unión de anticuerpo pudiera provocar una cascada de sucesos tan compleja. Al contrario, se creía de forma general que un péptido solo no era suficiente para provocar la activación de células T. El tamaño de la estructura que se halló era suficiente para provocar tales sucesos excluye que los sucesos de entrecruzamiento estén implicados en la estimulación de la actividad NK mediante el mecanismo subyacente, lo cual, de nuevo, es sorprendente en vista de la creencia general de la técnica previa.

La invención también comprende fragmentos y derivados del péptido de la invención en donde los derivados tienen una secuencia de aminoácidos diferentes, la cual se desvía de la del péptido de la invención mediante sustitución, inserción, supresión, duplicación, inversión, etcétera, a condición de que dichos fragmentos o derivados estimulen la activación de las células NK. Preferentemente, en estos péptidos se retienen los aminoácidos TKDN en las posiciones 450 a 453 (del Hsp70), R en la posición 458 y S en la posición 462. Dichos derivados o fragmentos pueden derivatizarse adicionalmente mediante, por ejemplo, peptidomiméticos, tal como se esbozará más abajo. También pueden formar parte de una proteína de fusión tal como se describe más abajo. Los derivados y fragmentos que se componen de acuerdo con la presente invención pueden ensayarse, sin complicación excesiva para determinar su funcionalidad y utilidad médica, tal como se describe a lo largo de esta memoria, y tal como se describe más particularmente en los ejemplos adjuntos. Los derivados o fragmentos preferiblemente tienen la longitud de al menos 13 aminoácidos y preferiblemente no son más largos de 30 aminoácidos, más preferiblemente no más largos de 20
aminoácidos.

La presente invención se refiere también a un péptido, como el definido más arriba, que comprende o tiene la secuencia de aminoácidos EGERAMTKDNNLLGRFELXG, en donde X es T o S. La invención también abarca los fragmentos o derivados de dicho péptido que tienen la función de activación y pueden seleccionarse como se ha descrito más arriba.

El péptido de la presente invención puede unirse a otras secuencias (poli)peptídicas o pueden ser parte de
un(os) (poli)péptidos(s) de fusión. Tales (poli)péptidos de fusión/proteínas de fusión pueden diseñarse para mejorar las características de dichos fragmentos, derivados o variantes. Por ejemplo, pueden añadirse aminoácidos adicionales para mejorar la estabilidad y/o persistencia durante los procesos de purificación, manipulación o almacenamiento, o para mejorar la estabilidad, vida media y/o persistencia in vitro y en organismos huéspedes, y/o en pacientes. Además, el péptido de la invención puede fusionarse a otras proteínas o péptidos, los cuales desempeñan un papel en las respuestas inmunitarias y en su tratamiento potencial. Dentro del ámbito de la presente invención se hallan también moléculas que comprenden el péptido de la invención, las cuales están unidas a moléculas marcadoras y/o a secuencias de aminoácidos marcadoras. Tales secuencias comprenden, pero no se limitan a las etiquetas peptídicas, a las etiquetas de histidina, a las moléculas fluorescentes, a la GFP, FLAG y GST.

Por tanto, la invención se refiere además a un (poli)péptido de fusión que comprende el péptido de la invención.

La invención se refiere también a un polinucleótido que codifica el péptido de la invención, o a dicho (poli)péptido de fusión que comprende el péptido de la invención.

El polinucleótido, que se emplea de acuerdo con esta invención y codifica el péptido descrito anteriormente, puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN, o un ADN o ARN producido sintéticamente, o una molécula quimérica de ácido nucleico, producida de forma recombinante, que comprende cualquiera de esos polinucleótidos bien solo o en combinación.

En una realización adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud, que se hibrida con un polinucleótido como el descrito más arriba, o con una hebra complementaria del mismo. La hibridación específica ocurre preferiblemente en condiciones rigurosas, e implica ninguna o muy poca hibridación cruzada con secuencias de nucleótidos que codifican péptidos que no son diferentes o no son sustancialmente diferentes. Tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse como sondas y/o para el control de la expresión génica. La tecnología de sonda de ácido nucleico es bien conocida por los especialistas en la técnica, quienes apreciarán fácilmente que tales sondas pueden variar en longitud. Las preferidas son las sondas de ácido nucleico de 17 a 35 nucleótidos de longitud. Por supuesto, puede ser conveniente usar también ácidos nucleicos de hasta 100 y más nucleótidos de longitud. Por tanto, los polinucleótidos que codifican el péptido de la invención pueden usarse como sondas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican (poli)péptidos diferentes del HSP70, y que comprenden el péptido de la invención. Tales (poli)péptidos pueden ser herramientas útiles para investigar diferentes vías que pueden estar implicadas en la activación de las células NK. Dichas sondas de ácido nucleico son útiles también para varias aplicaciones farmacéuticas y/o diagnósticas. Por otra parte, pueden usarse como cebadores de la PCR para la amplificación de polinucleótidos que codifican el péptido de la invención. En este contexto, pueden servir como herramientas diagnósticas útiles para determinar, por ejemplo, el nivel de expresión de (poli)nucleótidos que comprenden el péptido de la invención, verificando o prediciendo de ese modo el estado de la actividad de las células NK. Las moléculas de ácido nucleico empleadas en esta realización preferida de la invención, que son complementarias de un polinucleótido como el descrito más arriba, pueden usarse también para la represión de la expresión de un gen que comprende semejante polinucleótido, por ejemplo, mediante un efecto de hélice antisentido o triple, o para la construcción de ribozimas apropiados (consultar, por ejemplo, EP A1-0.291.533, EP A1-0.321.201, EP A2-0.360.257) que cortan específicamente el (pre)-ARNm de un gen que comprende un polinucleótido como el descrito más arriba en la presente invención. La selección de sitios diana apropiados y de los correspondientes ribozimas puede hacerse según se describe, por ejemplo, en Steinecke, "Ribozymes, Methods in Cell Biology 50", editores Galbraith et al., Academic Press, Inc. (1995), 449-460. También se ha descrito los procedimientos relacionados con la tecnología antisentido (Melani, Cancer Res. (1991), 2897-2901). Dicho efecto de hélice antisentido o tripe, así como la construcción de los ribozimas relevantes, es/son parcialmente útiles en las composiciones farmacéuticas que van a emplearse en la supresión de la actividad de células NK, por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias, en infecciones víricas, en sepsis, etcétera. Además, la persona capacitada en la técnica es consciente de que también se puede marcar esa sonda de ácido nucleico con un marcador apropiado para aplicaciones específicas (entre otras, el diagnóstico), tal como para la detección de la presencia de un polinucleótido, según se describe más arriba en la presente invención, en una muestra derivada de un organismo.

Las moléculas de ácido nucleico descritas más arriba pueden ser ADN o ARN o un híbrido de los mismos. Además, dicha molécula de ácido nucleico puede contener, por ejemplo, enlaces tioéster y/o análogos de nucleótidos, comúnmente usados en estrategias antisentido con oligonucleótidos. Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácido nucleico respecto las endo- y/o exonucleasas de la célula. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden transcribirse mediante un vector apropiado que contiene un gen quimérico que permite la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula.

Con respecto a las secuencias nucleotídicas caracterizadas más arriba, se entiende que el término "hibridante" en este contexto se refiere a las condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente tales como la hibridación en 50% de formamida/6x SSC/0,1% de SDS/100 \mug/ml ADNss, en la cual las temperaturas para la hibridación son superiores a 37ºC, y las temperaturas para el lavado en 0,1x SSC/0,1% SDS son superiores a 55ºC. Preferiblemente, el término "hibridante" se refiere a condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo, tales como las descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen la hibridación a 65ºC en 0,2x SSC, 0,1% SDS.

En una realización adicional, la invención se refiere a un vector que comprende el polinucleótido que codifica el péptido de la invención.

Muchos vectores apropiados son conocidos por los especialistas en biología molecular, y su elección depende de la función deseada e incluyen los plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos, y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética. Pueden usarse procedimientos, que son bien conocidos por los especialistas en la técnica, para construir varios plásmidos y vectores; consultar, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y en Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, los vectores y polinucleótidos de la invención pueden reconstituir dentro de liposomas para su suministro a células diana. Tal como se discute más detalladamente más abajo, se usó un vector de clonación para aislar secuencias individuales de ADN. Las secuencias relevantes pueden transferirse a vectores de expresión cuando se requiere la expresión de un determinado polipéptido. Los vectores de clonación típicos incluyen el pBscpt sk, el pGEM, el pUC9, el pBR322 y el pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen el pTRE, el pCAL-n-EK, el pESP-1, y el pOP13CAT.

Por tanto, en una realización preferida de la presente invención, los polinucleótidos que codifican el péptido de la invención, bien solo o en presente en un vector, están unidos a secuencias de control que permiten la expresión del polinucleótido en células procariotas y/o eucariotas.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN reguladoras, las cuales son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En los procariotas, las secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión de ribosomas, y terminadores. En los eucariotas, las secuencias de control generalmente incluyen promotores, terminadores, y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. El término "secuencia de control" se pretende que incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y puede incluir también componentes ventajosos adicionales.

El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos de ese modo tienen en una relación que les permite funcionar de la manera prevista para ellos. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante está unida de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso en que la secuencia de control es un promotor, es obvio, para una persona especialista en la técnica, que preferiblemente se usa un ácido nucleico de doble hebra.

Por tanto, el vector de la invención es preferiblemente un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que puede usarse para transformar una célula huésped seleccionada, y que proporciona la expresión de una secuencia codificante en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación, vectores binarios, o vectores de integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico, preferiblemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas son bien conocidos por los especialistas en la técnica. En el caso de células eucariotas, éstos normalmente comprenden promotores que garantizan el inicio de la transcripción, y opcionalmente señales poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huéspedes procariotas comprenden, por ejemplo, los promotores PL, lac, trp o en E. coli, y son ejemplo de elementos reguladores, que permiten la expresión en células huéspedes eucariotas, los promotores AOX1 o GAL1 en levaduras, o los promotores del CMV, del SV40, del RSV (virus del sarcoma de Rous), el potenciador del CMV, el potenciador del SV40, o un intrón de globina en células de mamífero y otros animales. En este contexto, se conocen en el estado de la técnica vectores de expresión apropiados, tales como el pcDV1, un vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg (Pharmacia), el pCDM8, el pRc/CMV, el pcDNA1, el pcDNA3 (Invitrogene), y el pSPORT1 (GIBCO BRL). Un sistema de expresión alternativo, que puede usarse para expresar una proteína que interacciona con el ciclo celular, es un sistema de insectos. En uno de tales sistemas, el virus de la polihedrosis de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes ajenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico de la invención puede clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa de dicha secuencia codificante hará que el gen de la polihedrina se desactive, y producirá virus recombinantes sin la proteína de cubierta. Los virus recombinantes se usan a continuación para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa la proteína de la invención (Smith et al., 1983; Engelhard et al., 1994).

Para obtener agentes derivados del péptido de la presente invención con una estabilidad incrementada, y para mejorar la captación a través del tracto gastrointestinal, o de otras rutas diferentes de una aplicación parenteral como, por ejemplo, la piel o el pulmón, pueden utilizarse peptidomiméticos para diseñar análogos pseudopeptídicos. Un rediseño por ordenador de la estructura del péptido de la invención puede realizarse usando programas de ordenador apropiados (Olszewski et al., 1996; Hoffman et al., 1995). En particular, los programas apropiados pueden usarse para la identificación de sitios interactivos del péptido, y si están presentes, de su receptor u otras proteínas que interaccionan, mediante búsquedas asistidas por ordenador de secuencias peptídicas complementarias (Fassina, 1994). En la técnica anterior se describen otros sistemas informáticos apropiados para el diseño de proteínas y péptidos, por ejemplo, en Berry et al. (1994), Wodak et al., (1987) o Pabo et al. (1986). Los resultados obtenidos del análisis mediante ordenador descrito más arriba pueden usarse para, por ejemplo, la preparación de peptidomiméticos del péptido de la invención. Tales análogos pseudopeptídicos de la secuencia de aminoácidos natural del péptido pueden imitar muy eficientemente la proteína progenitora (Benkirane et al., 1996). Por ejemplo, la incorporación de residuos aminoácidos W aquirales, fácilmente asequibles, en el péptido de la invención resulta en la sustitución de enlaces amida por unidades de polimetileno de una cadena alifática, proporcionando de ese modo una estrategia conveniente para construir un péptido mediante peptidomiméticos (Banerjee et al., 1996). Los análogos peptidomiméticos superactivos de pequeñas hormonas peptídicas en otros sistemas se describen en la técnica previa (Zhang et al., 1996). Los peptidomiméticos apropiados del péptido de la presente invención pueden identificarse también mediante la síntesis de bibliotecas combinatorias de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos a través de la sucesiva alquilación de amidas, y ensayando, por ejemplo, las propiedades inmunológicas de los compuestos resultantes. Los procedimientos para la generación y uso de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos se describen en la técnica previa, por ejemplo, en Ostresh et al. (1996), y en Domer et al. (1996).

Además, puede usarse una estructura tridimensional y/o cristalográfica del péptido de la invención para el diseño de inhibidores peptidomiméticos con la actividad biológica de la proteína de la invención (Rose et al., 1996; Rutenber et al., 1996).

Por tanto, la invención se refiere también a un procedimiento para refinar el péptido de la invención, que comprende (a) modelar dicho péptido por medio de peptidomiméticos y (b) sintetizar químicamente el péptido modelado. Un punto de partida de lo más apropiado para modelar por medio de peptidomiméticos es ensayar bibliotecas de péptidos de diferentes longitudes y secuencias para estimular la activación de células NK. Determinando donde (es decir, a qué residuos aminoácido de qué proteína) se une el péptido de la invención a una célula NK, pueden identificarse los aminoácidos cruciales para la unión en el péptido de la invención. En los pasos siguientes, el péptido de la invención puede optimizarse mediante modificación química de forma que se consiga una estimulación más eficiente de la activación de las células NK. Otros activadores putativos de las células NK pueden modelarse de la misma
forma.

En otra realización, la presente invención se refiere además a una composición que comprende dicho péptido o un fragmento o derivado del mismo, el polinucleótido que codifica dicho péptido o un fragmento o derivado del mismo, un vector que comprende dicho polinucleótido o un (poli)péptido de fusión que comprende dicho péptido o un fragmento o derivado del mismo, y un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El término "composición", tal como se usa en la presente invención, abarca también los productos médicos y los adyuvantes médicos, y las vacunas.

De acuerdo con la invención, los productos médicos son todas las sustancias o preparaciones usadas individualmente, o en combinación con cada una de las otras sustancias, u otras materias relacionadas, que, de acuerdo con el productor, están destinadas a ser aplicadas a humanos debido a sus funciones, con el propósito de detectar, prevenir, monitorizar, tratar o aliviar enfermedades, y cuyo efecto principal en o sobre el cuerpo humano no se consigue ni mediante preparaciones farmacológica o inmunológicamente efectivas, ni mediante un metabolismo cuya efectividad puede ser apoyada efectivamente por tales preparaciones.

De acuerdo con la invención, los adyuvantes médicos son sustancias que se usan para la producción (como ingredientes activos) de preparaciones o composiciones farmacéuticas.

En una realización preferida, la composición es una composición farmacéutica.

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Dicha composición farmacéutica ventajosamente comprende también un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente se prefiere que la composición farmacéutica descrita aquí, o producida de acuerdo con otras realizaciones de esta invención, comprenda además IL-2 y/o IL-18 en una dosis apropiada, preferiblemente en un concentración de 1 ng a 1 \mug/ml.

El término portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable generalmente denota vehículos comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para su administración a animales o humanos. El diluyente se selecciona para que no afecte la actividad biológca de la combinación. Son ejemplos de tales diluyentes el agua destilada, la solución salina fisiológica, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa, la solución de Hank, el medio RPMI 1640, y la solución salina con tampón fosfato (PBS). Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir también otros portadores, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, y similares. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad de proteína o de sus anticuerpos, antagonistas, o inhibidores, que mejoran los síntomas o condiciones. La eficacia terapéutica y toxicidad de tales compuestos puede determinarse, mediante procedimientos farmacéuticos estándares, en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, la ED_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva para el 50% de la población) y la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población). El proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción LD_{50}/ED_{50}.

Otros ejemplos de portadores farmacéuticamente apropiados son bien conocidos en el estado de la técnica, e incluyen las soluciones salinas con tampón fosfato, el agua, la emulsiones, tales como las emulsiones aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales portadores pueden formularse mediante procedimientos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis apropiada. La administración de las composiciones apropiadas puede efectuarse por diferentes vías, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. El régimen de dosificación será determinado por el médico responsable y por los factores clínicos. Como es bien sabido en los campos médicos, las dosis para cualquier paciente individual depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se vaya a administrar, el sexo, el tiempo y la ruta de administración, la salud general, y otros fármacos que se estén administrando de forma concurrente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el rango de 0,001 a 1000 \mug (o de ácido nucleico para una expresión o una inhibición de la expresión en este rango); sin embargo, se contemplan la dosis por debajo o por encima de este rango ilustrativo, especialmente considerando los factores antes mencionados. Generalmente, el régimen, como una administración regular de la composición farmacéutica, debería estar en el rango de 1 \mug a 10 mg de unidades por día. Si el régimen es una infusión continua, también debería estar respectivamente en el rango de 1 \mug a 10 mg de unidades por kilogramo de peso corporal por minuto. El progreso puede monitorizarse mediante examen periódico.

Las composiciones que comprenden el péptido, el fármaco compuesto, el profármaco, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden convenientemente administrarse mediante cualquiera de las rutas usadas convencionalmente para la administración de fármacos, por ejemplo, de forma oral, tópica, parenteral o mediante inhalación. Las sales aceptables incluyen las de acetato, metiléster, HCl, sulfato, cloruro, y similares. Los fármacos pueden administrarse en formas convencionales de dosificación, preparadas mediante la combinación de los fármacos con portadores farmacéuticos estándares de acuerdo con procedimientos convencionales. Los fármacos y profármacos identificados y obtenidos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse también en dosis convencionales en combinación con un segundo compuesto conocido y terapéuticamente activo. Tales compuestos terapéuticamente activos comprenden, por ejemplo, los mencionados más arriba. Estos procedimientos pueden implicar la mezcla, el granulado, y la compresión o disolución de los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada. Se comprenderá que la forma y carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable estará dictada por la cantidad de ingrediente activo con el que debe combinarse, la ruta de administración, y otras variables bien conocidas. El portador o portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, y de no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. El portador farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, un sólido o un líquido. Son ejemplo de portadores sólidos la lactosa, el caolín (terra alba), la sacarosa, el talco, la gelatina, el agar, la pectina, la goma arábiga, el estearato de magnesio, el ácido esteárico, y similares. Son ejemplo de portadores líquidos la solución salina con tampón fosfato, los jarabes, los aceites, tales como el aceite de cacahuete y el aceite de oliva, el agua, las emulsiones, varios tipos de agentes humectantes, las soluciones estériles, y similares. De forma similar, el portador o diluyente puede incluir materiales retardantes en el tiempo, tales como el glicerilmonoestearato o el glicerildiestearato, solos o con una cera.

Pueden emplearse una amplia variedad de formas farmacéuticas. Así pues, si se usa un portador sólido, la preparación puede prepararse en tabletas, colocarse en una cápsula de gelatina dura en forma de polvo o pella, o en forma de una pastilla o pastilla para chupar. La cantidad de portador sólido variará ampliamente, pero preferiblemente será desde aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 1 g. Cuando se usa un portador líquido, la preparación estará en forma de un jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda, líquido inyectable estéril, tal como una ampolla o una suspensión líquida no acuosa.

La composición puede administrarse tópicamente, es decir, mediante administración no sistémica. Esto incluye la aplicación de forma externa a la epidermis o a la cavidad bucal, y la instilación de tal compuesto en la oreja, ojo y nariz, de tal forma que el compuesto no entre significativamente en el torrente sanguíneo. Por contra, al administración sistémica se refiere a la administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular.

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Las formulaciones apropiadas para la administración tópica incluyen las preparaciones líquidas o semilíquidas apropiadas para la penetración a través de la piel hasta el sitio de inflamación, tal como los linimentos, las lociones, las cremas, las pomadas o pastas, y las gotas apropiadas para su administración a los ojos, oídos o nariz. El ingrediente activo puede comprender, para la administración tópica, desde 0,001% hasta 10% p/p, por ejemplo, desde el 1% hasta el 2% en peso de la formulación. No obstante, puede comprender tanto como el 10% p/p, pero preferiblemente comprenderá menos del 5% p/p, más preferiblemente del 0,1% al 1% p/p de la formulación.

Las lociones acordes con la presente invención incluyen las apropiadas para la aplicación sobre la piel o en el ojo, las cuales son apropiadas, por ejemplo, para su uso en la protección UV. Una loción para ojos puede comprender una solución acuosa estéril que opcionalmente contiene un bactericida, y puede prepararse mediante procedimientos similares los de la preparación de gotas. Las lociones o linimentos para aplicación sobre la piel pueden incluir también un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un agente hidratante tal como el glicerol, o un aceite tal como el aceite de castor o el aceite de cacahuete.

Las cremas, ungüentos o pastas según la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden prepararse mezclando el ingrediente activo en finamente dividido o en forma de polvo, solo o en solución o en suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de la maquinaria apropiada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como la parafina dura, blanda o líquida, el glicerol, la cera de abejas, un jabón metálico; un mucílago; una aceite de origen natural tal como el aceite de almendras, de maíz, de cacahuete, de castor, o de oliva; la lanolina o sus derivados, o un ácido graso tal como el esteárico u oleico junto con un alcohol tal como el propilenglicol, o un macrogel. La formulación puede incorporar cualquier agente activo de superficie apropiado, tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, tal como un éster de sorbinato o un derivado polioxietileno del mismo. También puede incluirse agentes de suspensión tales como las gomas naturales, los derivados de celulosa, o los materiales inorgánicos tales como los sílices, y otros ingredientes tales como la lanolina.

Las gotas según la presente invención pueden incluir soluciones o suspensiones acuosas o aceitosas estériles, y pueden prepararse disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa apropiada de un agente bactericida y/o fungicida, y/o cualquier conservante apropiado, y preferiblemente incluyendo un agente activo de superficie. La solución resultante puede clarificarse a continuación mediante filtración, transferirse a un contenedor apropiado, el cual se sella a continuación y se esteriliza mediante autoclavado o manteniéndolo a 98-100ºC durante media hora. Alternativamente, la solución puede esterilizarse mediante filtración y transferirse al contenedor usando una técnica aséptica. Los ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas apropiados para su inclusión en las gotas son el nitrato o acetato de fenilmercurio (0,002%), el cloruro de benzalconio (0,01%) y el acetato de clorhexidina (0,01%). Los solventes apropiados para la preparación de una solución aceitosa incluyen el glicerol, el alcohol diluido, y el
propilenglicol.

La composición según la presente invención puede administrarse parenteralmente, es decir, mediante administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, intrarrectal, intravaginal o intraperitoneal. Generalmente se prefieren las formas subcutáneas e intramusculares de administración parenteral. Las formas de dosificación apropiadas para tales administraciones pueden prepararse mediante técnicas convencionales. La composición puede administrarse también mediante inhalación, es decir, mediante administración intranasal u oral. Las formas de dosificación apropiadas para tal administración, tal como una formulación en aerosol o un inhalador de dosis fija, pueden prepararse mediante técnicas convencionales.

En todos los procedimientos de uso descritos en la presente invención para composiciones según la invención, el régimen de dosificación oral diaria preferiblemente será desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal total, preferiblemente desde aproximadamente 0,2 hasta 30 mg/kg, más preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mg hasta 15 mg. El régimen de dosificación oral diaria será aproximadamente desde 0,1 hasta aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal total, preferiblemente desde aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 30 mg/kg, y más preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mg hasta 15 mg/kg. El régimen de dosificación tópica diaria será preferiblemente desde 0.1 mg hasta 150 mg, administrado de una a cuatro, preferiblemente de dos a tres veces por día. El régimen de dosificación por inhalación diaria será preferiblemente desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg por día. Alguien con formación en el campo reconocerá que la cantidad y espaciado óptimos de las dosis individuales de las composiciones vendrá determinadas por la naturaleza y alcance de la enfermedad que se está tratando, la forma, ruta y sitio de administración, y el paciente concreto que se esté tratando, y que tal óptimo puede determinarse preferiblemente mediante los procedimientos descritos en la presente invención. Un especialista en la técnica se percatará también que el curso óptimo de tratamiento, es decir, el número de dosis de las composiciones administradas por día durante un número definido de días, puede ser establecido por los expertos en la materia usando ensayos convencionales de determinación del curso del tratamiento. El régimen de dosificación será determinado por el médico responsable y por otros factores clínicos. Como es bien sabido en los campos médicos, las dosis para cualquier paciente individual depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se vaya a administrar, el sexo, el tiempo y la ruta de administración, la salud general, y otros fármacos que se estén administrando de forma concurrente. El progreso puede monitorizarse mediante examen periódico.

En otra realización, la secuencia de ADN o el vector de la invención, según se describen más abajo, pueden administrarse directamente a un paciente que los necesita. Este tipo de administración generalmente se conoce como vacunación con ADN. Las rutas para la administración de vacunas de genes son bien conocidas en el estado de la técnica, y la vacunación con ADN se ha usado exitosamente para generar respuestas aloinmunitarias, y respuestas inmunitarias anti-tumores y antiidiotipo (Tighe M. et al., 1998). Además, se ha hallado que la inoculación con moléculas de ácido nucleico/ADN es protectora frente a diferentes modos de enfermedades víricas (Fynan, et al., 1993; Boyer, 1997; Webster, et al., 1994; Montgomery et al., 1993; Barry, 1995; Xu y Liew, 1995; Zhong et al., 1996; Luke et al., 1997; Mor, 1998; MacGregor et al., 1998).

El ADN que codifica el péptido de la invención, usado en una composición farmacéutica como una vacuna de ADN, puede formularse por ejemplo, como forma neutra o salina. La sales farmacéuticamente aceptables, tales como las sales por adición de ácido, y otras, son bien conocidas en el estado de la técnica. Las vacunas de ADN se administran en dosis compatibles con el procedimiento de la formulación, y en tales cantidades que serán farmacológicamente efectivas para los tratamientos profilácticos y terapéuticos. Preferiblemente, la vacuna comprende un vector de expresión según se describe en la presente invención más arriba.

Típicamente, las vacunas se preparan como inyectables, bien como soluciones líquidas o como suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas apropiadas para una solución o una suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación puede estar emulsionada o la proteína puede encapsularse en liposomas. Los ingredientes inmunogénicos activos a menudo se mezclan con excipientes farmacológicamente aceptables, los cuales son compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes apropiados incluyen, pero no se limitan, al agua, la solución salina, la dextrosa, el glicerol, el etanol y similares; también pueden usarse combinaciones de estos excipientes en varias cantidades. Las vacunas pueden contener también pequeñas cantidades de sustancias auxiliares, tales como reactivos humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, y/o adyuvantes que potencian la efectividad de la vacuna. Por ejemplo, tales adyuvantes pueden incluir el hidróxido de aluminio, la N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), la N-acetil-nornuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también llamada nor-MDP), la N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también conocida como MTP-PE), y la RIBI (MPL + TDM + CWS) en una emulsión con 2% de
escualeno/Tween-80®.

Las vacunas usualmente se administran mediante inyección intravenosa o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son apropiadas para otros modos de administración incluyen los supositorios y, en algunos casos, las formulaciones oral o nasal. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, pero no se limitan, a los polialquilenglicoles o los triglicéridos. La formulación oral incluye excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, el manitol, la lactosa, el almidón, el estearato de magnesio, la sacarina sódica, la celulosa, el carbonato de magnesio, y similares, de calidad farmacéutica. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación continuada, o polvos, y contienen de aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 95% de ingrediente activo, preferiblemente desde aproximadamente el 25% hasta aproximadamente el 70%.

El péptido de la invención, o un ADN que lo codifica, se administra como una vacuna de forma compatible con la formulación de dosificación, y en tales cantidades que será efectivo profiláctica y/o terapéuticamente. La cantidad a administrarse generalmente está en el rango de aproximadamente 0,2 nanogramos hasta aproximadamente 500 microgramos de péptido o ADN por dosis, y depende del sujeto que debe tratarse con la dosis, y del grado de inmunoactivación buscado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que deben administrarse pueden depender también del criterio del medico, y pueden ser únicas para cada sujeto. El péptido o ADN pueden suministrarse con un plan de dosis única o múltiple. Una dosis múltiples es aquella en la cual un curso principal de vacunación puede hacerse con de una a diez dosis separadas, seguidas por otras dosis, suministradas a intervalos de tiempo subsiguientes, necesarias para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, de una semana a cuatro meses para una segunda dosis, y si el individuo lo precisa, dosis subsiguientes semanal o mensualmente. El régimen de dosificación estará determinado también, al menos en parte, por las necesidades del individuo, y dependerá del juicio del médico. Se contempla que la vacuna que contiene los compuestos inmunogénicos de la invención puede administrarse conjuntamente con otros agentes inmunoreguladores, por ejemplo, con inmunoglobulinas o con citocinas.

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En otra realización, el procedimiento de la invención se refiere a un procedimiento para producir un péptido inmunoestimulador que comprende,

(a): mutar a nivel de ADN o de aminoácidos, en una o más posiciones de nucleótidos o aminoácidos, una molécula de ADN que codifica la secuencia TKDNNLLGRFELXG, o un péptido que la incluye, en donde X es T ó S;

(b): ensayar la respuesta proliferativa de las células NK a la estimulación con IL-2 y/o IL-18 junto con el péptido mutado;

(c): comparar la respuesta proliferativa de las células NK a la IL-2 y/o IL-8 junto con el péptido mutado, con la respuesta proliferativa a la IL-2 y/o IL-8 sin el péptido mutado o con un péptido que tiene la secuencia descrita en (a);

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(d): seleccionar un péptido que comprende la secuencia mutada o una molécula de ADN recombinante que codifica un péptido que comprende la secuencia mutada, en donde dicho péptido mutado muestra un incremento en la respuesta proliferativa en comparación con la IL-2 y/o IL-18 sin el péptido mutado o con una secuencia descrita en (a) en el paso (c).

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Si los nucleótidos está mutados (es decir, cambiador por nucleótidos diferentes que ocurren de forma natural o no natural), se entenderá que al menos un intercambio debería conducir a una intercambio a nivel de aminoácidos. Los más preferido, es que en estos péptidos se retienen los aminoácidos TKDN en las posiciones 450 a 453 (del Hsp70), R en la posición 458 y S en la posición 462.

El término "respuesta proliferativa de las células NK", tal como se usa en la presente invención, denota la proliferación de una población de células NK, la cual puede determinarse mediante ensayos de proliferación estándares. Tales ensayos comprenden la medición de la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) o timidina en el genoma celular durante la fase S, tal como se menciona en los ejemplos siguientes. El porcentaje de incremento debería ser al menos de l10%, preferiblemente al menos del 20%, más preferiblemente al menos del 50%. Si se compara la respuesta proliferativa del péptido mutado con la del péptido que tiene la secuencia descrita en (a), y se observa un incremento, entonces puede seleccionarse un compuesto con una actividad estimuladora mejorada.

En el procedimiento de la invención, puede mutarse la secuencia de ADN a partir de la cual se expresa el péptido en un huésped recombinante tal como E. coli, una célula de mamífero, u otra célula. Para esto, la secuencia de ADN se expresa habitualmente en un vector.

En una realización adicional el producto se refina mediante rediseño por ordenador y/o con peptidomiméticos.

La invención se refiere también a un procedimiento para producir una composición farmacéutica, un producto médico, un adyuvante médico, o una vacuna, el cual comprende el paso de formular el péptido o la molécula de ADN recombinante, seleccionados según el procedimiento de la invención, con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere además a un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende una molécula que estimula la activación de las células NK, el cual comprende los pasos de (a) modificar el péptido de la invención como un compuesto líder para conseguir (i) un sitio de acción, espectro de actividad, especificidad por órgano modificados, y/o (ii) potencia mejorada, y/o (iii) toxicidad disminuida (índice terapéutico mejorado), y/o (iv) efectos secundarios reducidos, y/o (v) inicio de la acción terapéutica y duración del efecto mejorados, y/o (vi) parámetros farmacocinéticos modificados (resorción, distribución, metabolismo y excreción), y/o (vii) parámetros fisicoquímicos modificados (solubilidad, higroscopicidad, color, sabor, olor, estabilidad, estado), y/o (viii) especificidad general y especificidad órgano/tejido mejoradas, y/o (ix) forma y ruta de aplicación optimizadas mediante (i) la esterificación de grupo carboxílicos, o (ii) la esterificación de grupos hidroxilo con ácidos de carbono, o (iii) la esterificación de grupos hidroxilo a, por ejemplo, fosfatos, pirofosfatos, o sulfatos, o hemisuccinatos, o (iv) la formación de sales farmacéuticamente aceptables, o (v) la formación de complejos farmacéuticamente aceptables, o (vi) la síntesis de polímeros farmacológicamente activos, o (vii) la introducción de fragmentos hidrofílicos, (viii) la introducción/intercambio de sustituyentes sobre aromatos o cadenas laterales, el cambio del patrón de sustituyentes, o (ix) la modificación por introducción de fragmentos isostéricos o bioisostéricos, o (x) la síntesis de compuestos homólogos, o (xi) la introducción de cadenas laterales ramificadas, o (xii) la conversión de sustituyentes alquilos por análogos cíclicos, o (xiii) la derivatización del grupo hidroxilo a cetales, acetales, o (xiv) la N-acetilación a amidas, fenilcarbamatos, o (xv) la síntesis de bases de Mannich, de iminas, o (xvi) la transformación de cetonas o aldehídos a bases de Schiff, oximas, acetales, cetales, enolésteres, oxazolidinas, tiozolidinas o combinaciones de los mismos; y (b) formular el producto de dicha modificación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Los varios pasos mencionados más arriba son conocidos generalmente en el estado de la técnica. Ellos incluyen o se basan en análisis cuantitativos de la relación estructura-acción (QSAR) (Kubinyi, 1993), en la bioquímica combinatoria, en la química clásica y en otros (consultar, por ejemplo, Holzgrabe y Bechtold, 2000).

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para producir una composición farmacéutica, un producto médico, un adyuvante médico, o una vacuna, el cual comprende formular el producto obtenido por el procedimiento anterior con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Empleando los datos que pueden obtenerse con el péptido de la invención, pueden generarse nuevas sustancias inmunoestimuladoras. La secuencia del péptido de la invención proporcionada en la presente invención permite diseñar moléculas modificadas o alternativas con actividad inmunoestimuladora. En una alternativas, pueden ensayarse sustancias inmunoestimuladoras potenciales sobre células NK naturales. Aquellas sustancias que, en cotratamiento con IL-2 y/o IL-18, estimulan una respuesta proliferativa que es mayor que la respuesta proliferativa a la IL-2 y/o IL-18 sola, se formularán en composiciones farmacéuticas para el desarrollo, partiendo desde su origen, de sustancias inmunoestimuladoras apropiadas para su formulación en composiciones farmacéuticas. Las nuevas sustancias estimuladoras pueden refinarse adicionalmente mediante peptidomiméticos, o de otra forma conocida en el estado de la técnica, dependiendo del propósito médico o ruta de administración específicos, o pueden prepararse como proteína de fusión. Las realizaciones mencionadas en este parágrafo también pertenecen a la presente invención.

Las concentraciones preferidas de IL-2 y/o IL-18 están en el rango de 1 ng - 1 \mug/ml.

Tal como se ha mencionado más arriba, la invención se refiere también a un procedimiento preferido, en donde dicho producto se refina mediante rediseño por ordenador y/o mediante peptidomiméticos.

En aún otra realización, la invención se refiere al uso del péptido de la presente invención, del (poli)péptido de fusión de la invención, del polinucleótido de la invención, del vector de la invención, o del péptido refinado por el procedimiento de la invención, o que se formulará en una composición farmacéutica producida por el procedimiento de la invención, para la preparación de una composición farmacéutica para la activación de células NK.

El término "células NK" ("células asesinas naturales") tal y como se usa en la presente invención, denota los linfocitos granulares grandes que expresan el CD45 sobre su superficie, y que además tienen actividad asesina de células sin estimulación previa. Las células NK se caracterizan especialmente por la expresión del CD16 y/o por sus sensibilidad a la estimulación con interleucina-2, y/o por no expresar el CD3, y/o por no expresar los receptores \alpha/\beta- \gamma/\delta- de células T.

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Las células asesinas naturales de la presente invención preferiblemente se caracterizan además por las siguientes características:

-: se adhieren sobre plástico de forma transitoria después de su estimulación con IL-2 en una dosis de 10 a 10.000 unidades, por ejemplo, de 100 unidades, en donde la IL-2 se puede obtener de la Chiron Corp.;

-: se pueden observar adherentes 3-18 h después de la estimulación con IL-2 de PBL (linfocitos de sangre periférica) previamente aislados;

-: las células NK expresan el CD16dim (el valor promedio de la fluorescencia es débil);

-: las células NK expresan el CD56 y el CD57 como marcadores NK típicos;

-: las células NK expresan el CD94 (receptor lectinas del tipo C de células asesinas);

-: las células NK secretan IFNgamma después de su activación con Hsp70 y citocinas.

-: las células NK pueden activarse (crecimiento y actividad citotóxica) mediante Hsp70 (proteína purificada);

-: no son dependientes en pacientes del tipo MCH.

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En la presente invención pueden aplicarse diferentes poblaciones de células NK. Sin embargo, se requiere que las células NK, tal como se ha caracterizado en la presente invención, puedan ser activadas por el péptido de la invención. Es posible usar células NK aisladas, pero también pueden aplicarse mezclas que contengan diferentes tipos de células como las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) que incluyan células NK.

En una realización preferida, dicha activación comprende la activación de la proliferación de células NK y/o de la actividad citolítica de las células NK.

En una realización final, la invención se refiere al uso del péptido de la invención, del (poli)péptido de fusión de la invención, del polinucleótido de la invención, del vector de la invención, o del péptido refinado por el procedimiento de la invención, o que se formulará en una composición farmacéutica producida por el procedimiento de la invención, para la preparación de una composición farmacéutica en inmunoterapia y/o para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de entre los carcinomas de pulmón, colorectal, páncreas, laringe, estómago, sistema nervioso central y periférico, de otros carcinomas, sarcomas, leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloica aguda (AML), leucemia linfática aguda (ALL), linfoma no-Hodgkin (NHL), síndrome mieloproliferativo (MPS), síndrome mielodisplásico (MDS), plasmocitoma, otras leucemias, otras enfermedades malignas en donde la Hsp70 está presente sobre la superficie de las células malignas, una infección con un virus HI, otras infecciones víricas o bacterianas en las que la Hsp70 está presente sobre la superficie de las células infectadas, la artritis reumatoide, el lupus eritematoso, otras enfermedades autoinmunes, el asma bronquial, y otras enfermedades inflamatorias.

Las figuras muestran:

Figura 1

Comparación de la respuesta proliferativa de las células NK frente a péptidos de la Hsp70

Se estimularon células NK con IL-2 (100 IU/ml) sola o con IL-2 más péptidos NLL (8-meros, Figura 1a), TKD (14-meros, Figura 1b) y GIPP (13 meros, Figura 1c) a concentraciones de 0,02, 0,2, 2, 4 y 8 \mug/ml. Como control positivo, las células NK se estimularon con proteína rHsp70 a una concentración de 10 \mug/ml. La respuesta proliferativa de las células NK se midió 72 h después de la incubación con el péptido y de un período de incubación de 18 h con ^{3}H-timidina (1 \muCi/ml). En la Figura 1d se muestra la estimulación con diferentes péptidos a una concentración de 2 \mug de péptido por ml. En la Figura 1e, se muestra la estimulación con TKD en una escala más refinada entre 0,1 y 3 \mug. La Figura 1f muestra la estimulación con varios péptidos. Los valores se dan como las medias de cuatro experimentos independientes +/- SD.

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Figura 2

La actividad citolítica de las células NK estimuladas con IL-2 sola, o con IL-2 más el péptido TKD de 14-meros o IL-2 más el péptido NLL de 8-meros.

Actividad citolítica de las células NK estimuladas con una dosis baja de IL-2 (100 IU/ml) sola, o con la IL-2 (2 \mug/ml) más el péptido TKD de 14-meros o la IL-2 más el péptido NLL (2 \mug/ml) de 8-meros durante 4 días. Como células diana se usaron células tumorales, marcadas con ^{51}Cr, CX+ (Figura 2a) y CX- (Figura 2b) que difieren en su capacidad para expresar la Hsp70 sobre la membrana plasmática. Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis específica a distintas proporciones E:T que iban desde 2:1 hasta 40:1. El porcentaje de liberación espontánea de cada línea celular tumoral diana fue inferior al 20%. Una caracterización fenotípica de las células NK revela lo siguiente: células NK más TKD: CD3, 6%; CD16/56, 79%; células NK más NLL: CD3, 8%; CD16/56 80%; células NK: CD3, 5%; CD16/56, 81%.

Los datos representan un experimento representativo de tres posibles.

A partir de los siguientes ejemplos, proporcionados a modo de ilustración, se tendrá una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.

Ejemplo 1 Análisis de mapeado del epítopo del mAb específico de la Hsp70

Previamente, con la ayuda del mAb RPN1197 específico contra la Hsp70, mostramos una inusual localización de la Hsp70 en la membrana plasmática, selectivamente sobre células tumorales (Multhoff et al., 1995a/b; Botzler et al., 1996; Multhoff et al., 1997). Se halló también que este anticuerpo inhibe la actividad citolítica de las células contra las células tumorales que expresan la Hsp70 (Multhoff et al., 1995b). Mediante el uso de mutantes de supresión de la Hsp70 que carecen del dominio C- o N-terminal, se pudo localizar el epítopo unidor del mAb RPN1197 dentro del dominio C-terminal unidor de sustrato de la Hsp70, entre los aa 428-618 (Botzler et al., 1998). Debido al hecho que RPN1197 exhibe un efecto inhibidor sobre la actividad citolítica de las células NK contra las células tumorales que expresan la Hsp70, fue interesante mapear el epítopo unidor. Mediante el barrido del péptido (pepscan) del dominio unidor de sustrato C-terminal, dentro de los aminoácidos 384-618, se pudo determinar que el péptido de 8-meros NLLGRFEL (aa 454-461) era la estructura de reconocimiento relevante para el mAb RPN1197 (Tabla I a).

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

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Ejemplo 2 Análisis de la capacidad inmunoestimuladora de diferentes péptidos de la Hsp70

Se halló que una incubación de células NK con dosis baja de IL-2 (100 IU/ml) más proteína Hsp70 humana recombinante (rHsp70) o el dominio C-terminal de la Hsp70hom incrementaba la respuesta proliferativa de las células NK humanas, en comparación con las células NK que habían sido estimuladas sólo con IL-2 (Multhoff et al. 1999). En un esfuerzo para definir la secuencia inmunoestimuladora mínima en el dominio C-terminal de la Hsp70, se han sintetizado tres péptidos. En base al epítopo de 8-meros unidor del anticuerpo (NLLGRFEL) del RPN1197 mAb, se produjeron péptidos extendidos C-terminal (GIPP) y N-terminal (TKD) para ensallarlos en un ensayo estándar de captación de ^{3}H-timidina. Las extensiones C- y N-terminales concordaban con la secuencia primaria de la Hsp70 humana (Tabla I b).

2

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Como control interno, se investigó la capacidad proliferativa de las células NK frente la proteína Hsp70 recombinante intacta (rHsp70). Previamente se había definido una concentración de 10 \mug/ml de rHsp70 como una dosis estimuladora óptima (loc. cit.). Con respecto al peso molecular de los diferentes péptidos, se calculó que la concentración equivalente a 10 \mug de proteína Hsp70 de longitud completa (72 kDa) era de 0,2 \mug/ml para TKD (1563 Da) y GIPP (1452 Da), y de 0,1 \mug/ml para NLL (942 Da). Con respecto a estos resultados, todos los péptidos se ensayaron a un rango de concentración de 0,02 \mug a 8 \mug/ml. Tal como se muestra en la Figura 1, el péptido NLL de 8-meros y el péptido extendido C-terminal GIPP no estimularon la capacidad proliferativas de las células NK a ninguna de las concentraciones de péptido ensayadas. Sin embargo, el péptido extendido N-terminal TKD exhibió una capacidad inmunoestimuladora parecida a las de la proteína Hsp70 de longitud completa, a un rango de concentración entre 0,2 y 2 \mug/ml. Esta concentración de péptido es comparable a una concentración de 10-100 \mug/ml de la proteína Hsp70 de longitud completa.

Se ensayó también la respuesta proliferativa de células T, derivadas del mismo donante, respecto a los péptidos más una dosis baja de IL-2 (100 IU/ml). Tal como se esperaba, ninguno de los tres péptidos, NLL, GIPP o TKD, estimula el crecimiento de las células T a ninguna de las concentraciones ensayadas (no se muestran los datos). Sin embargo, hay experimentos en marcha que investigan la respuesta inmune de las células T contra complejos consistentes de la proteína rHsp70 y los péptidos NLL, GIPP y TKD de la Hsp70.

Puesto que el TKD parece estimular la actividad proliferativa de las células NK, surge la pregunta de si este péptido, al igual que la proteína Hsp70, estimula también la actividad citolítica. El papel de la expresión en membrana de la Hsp70, como una estructura de reconocimiento específica de tumor para la actividad citolítica de las células NK, se demostró con las sublíneas CX+ y CX- de carcinoma de colon, con idéntico HLA, que difieren profundamente con respecto a su capacidad para expresar la Hsp70 sobre la membrana plasmática (14). En el presente estudio, se comparó la actividad citolítica de las células NK estimuladas durante 4 días, bien con IL-2 sola (100 IU/ml), o con IL-2 más NLL o IL-2 con péptido TKD (2 \mug/ml). La caracterización fenotípica de las células efectoras se realizó directamente, antes de la estimulación y el día 4 después de la estimulación. Los resultados se muestra en el pie de figura de la Figura 2. Las células NK estimuladas con IL-2 más TKD exhibieron una actividad lítica significativamente potenciada, contra las células tumorales CX+ que expresaban la Hsp70, en comparación con la de las células NK que fueron estimuladas bien con IL-2 sola o con IL-2 más el péptido NLL. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la lisis de las células tumorales CX- después de su estimulación con cualquiera de los péptidos. Este hallazgo indica que los efectos inmunoestimuladores del péptido TKD de 14-meros sobre las células NK es específico de
Hsp70.

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Ejemplo 3 Comparación de los péptidos de la Hsp70 estimuladores y no estimuladores de las NK, y de sus secuencias proteicas

Una comparación de la secuencia del péptido estimulador de 14-meros (TKD) de la Hsp70 (indicada en negrita) con la región apropiada de la Hsp70hom revela un intercambio de aminoácidos conservador en la posición 462, de serina (S) a treonina (T), como se muestra en la Tabla II.

3

Puesto que ambas proteínas Hsp70 y Hsp70hom, y el péptido de 14-meros TKD son capaces de estimular las células NK, el aminoácido en la posición 462 no parece ser relevante para la estimulación de las células NK. Por contra, el intercambio conservador de aminoácido en la posición 458 de arginina (R) a lisina (K) entre Hsp70 y Hsc70 puede ser importante, puesto que sólo la Hsp70, pero no la Hsc70, es capaz de activar las células NK. Además, este intercambio de aminoácido puede ser el responsable de la especificidad de anticuerpo RPN1197 específico de la Hsp70. Se sabe que este anticuerpo reacciona con la Hsp70, pero no reacciona de forma cruzada con la Hsc70. La única diferencia de aminoácidos entre la Hsp70 y las Hsc70 dentro del epítopo de 8-meros unidor de anticuerpo (aa 454-460) es el intercambio en la posición 458 de arginina (R) a lisina (K).

En un experimento adicional que se programó tal como se ha esbozado más arriba, sólo se ensayaron péptidos en función de su capacidad para estimular células NK, ver la TABLA III, a continuación. Todos estos experimentos permiten la conclusión de que los aminoácidos TKDN en las posiciones 450 a 45, R en la posición 458, y S en la posición 462, son cruciales para la efectividad del péptido.

5

Conclusiones

En resumen, estos datos proporcionaron evidencia de que, no sólo la proteína Hsp70 de longitud completa o el dominio C-terminal de la Hsp70hom son capaces de estimular la proliferación y actividad citolítica de las células NK contra las células tumorales que expresan la Hsp70, sino también el péptido de 14-meros que es parte del dominio C-terminal de la Hsp70. La secuencia del péptido de 14-meros es una extensión N-terminal del epítopo unidor de 8-meros del anticuerpo RPN1197 específico para la Hsp70. Este mAb no sólo detecta la Hsp70 unida a la membrana plasmática, sino que se ha visto que es capaz de inhibir también la lisis medida por las NK contra células tumorales positivas para la Hsp70. Esta es la primera vez que se informa de que las células NK pueden ser estimuladas por un péptido de 14-meros derivado de la región C-terminal de la Hsp70. Recientemente, mediante experimentos de internalización de HSP marcado con oro y mediante microscopía confocal, se ha mostrado la existencia de receptores específicos de las HSP en células que presentan el antígeno (Arnold-Schild et al., 1999; Asea et al., 2000). Funcionalmente, demostramos que los receptores específicos de la Hsp70 pueden existir también sobre las células NK (Multhoff et al., 1999). Hay investigaciones en curso para responder la pregunta de si el péptido de 14-meros derivado del dominio C-terminal de la Hsp70 interacciona físicamente con el receptor específico de la Hsp70 sobre células NK.

Materiales y procedimientos Análisis de mapeado del epítopo

El anticuerpo monoclonal RPN1197 reacciona sólo con la HSP de 72 kDa inducible, y tiene una reactividad similar a la del anticuerpo descrito por Welch y Suhan (1986). Su especificidad fue confirmada por inmunoprecipitación de la proteína de 72 kDa a partir de células sometidas a choque térmico. El análisis de mapeado del epítopo del mAb RPN1197 se realizó usando membranas "pepspot" con conjugados de peroxidasa de rábano silvestre y luminol quimioluminiscente (Jerini Bio Tools GmbH, Berlin, Alemania). Se usaron los péptidos de 13-meros del dominio C-terminal de la Hsp70 (aa 384-618), unidos a celulosa, que exhibían un solapamiento de péptidos de 11-meros (Reineke et al., 1996).

Hsp70 y péptidos de la Hsp70

La proteína Hsp70 humana recombinante (rHsp70) se obtuvo de StressGen, Victoria, Columbia Británica, Canadá (SPP-755). Los péptidos de 8-meros, 14-meros y 13-meros NLLGRFEL (NLL), TKDNNLLGRFELS (TKD), NLLGRFELSGIPP (GIPP) se produjeron mediante la síntesis del F-moc (procedimiento químicos en fase sólida basado en fluorenilmetoxicarbonil/t-butilo, en sintetizadores SMPS 850 (Zinser Analytic) y ABI 488A (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.). La pureza de las proteínas Hsp70 y de los péptidos de la Hsp70 se determinaron mediante el ensayo del lisado de Limulus amebeocyte (BioWhittaker, Maryland, EE.UU.).

Células NK

De forma resumida, se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) desprovistos de monocitos a partir de capas leucocitarias de voluntarios humanos sanos (Multhoff et al., 1995a). Las células NK se purificaron mediante selección por adherencia siguiendo un protocolo modificado de Vujanovic (1993). Las células T permanecen en la población de células sobrenadante.

Análisis FACScan

Se añadieron mAb conjugados directamente a fluoresceína (CD3^{FITC}/CD16/CD56^{PE}, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) a las suspensiones de células (0,1 x 10^{6} células), se incubaron durante 20 minutos sobre hielo, se lavaron y analizaron sobre un instrumento FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). El porcentaje de células teñidas positivamente se definió como el número de células viables (negativas para yoduro de propidio), teñidas específicamente, menos el número de células teñidas con un anticuerpo control del mismo isotipo, en un instrumento FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania).

Líneas celulares tumorales

Las sublíneas de carcinoma de colon CX+ (>90% de células positivas para la Hsp70) y CX- (<20% de células positivas para la Hsp70) descritas en la solicitud de patente EP-A2-084.300-5, y derivadas originalmente de células de carcinoma de colon CX2 (Tumorzentrum Heidelberg, TZB 610005, Alemania), que difieren con respecto a su capacidad para expresar la Hsp70 sobre su membrana plasmática, se cultivaron a 37ºC, 5% de CO_{2}, en medio RPMI-1640 (Gibco, Eggenstein, Germany) suplementado con un 10% de FCS (Gibco) inactivado con calor, y 2 mM de L-glutamina, y antibióticos (penicilina/estreptomicina). Las líneas celulares se mantuvieron en cultivo en condiciones de crecimiento exponencial, y se recolectaron con una solución de tripsina/EDTA. Los experimentos se realizaron entre los pasajes 10-30. Todas las líneas celulares estaban libres de contaminación por micoplasma, según se determinó mediante controles repetidos usando el ensayo del 6-metilpurindesoxirribósid (Boehringer Mannheim, Alemania).

Ensayo de captación de ^{3}H-timidina

La capacidad proliferativa de las células NK y T frente a diferentes péptidos de la Hsp70 y la proteína Hsp70 (loc. cit.) se determinó en una ensayo estándar de captación de ^{3}H-timidina (22). Las células viables (5 x 10^{4} células/100 \mul) se sembraron en placas de microvaloración de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Nuertingen, Alemania) en medio RPMI-1640 suplementado que contenía 100 IU de IL-2 y proteína Hsp70 (10 \mug/ml), o diferentes cantidades de péptidos de la Hsp70 que iban desde 0,02 hasta 10 \mug/ml. Como control interno, se midió en paralelo la proliferación frente a IL-2 sola. Transcurrido un período de incubación de 24 ó 48 horas, las células se pulsaron con ^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo), y la captación total se midió a continuación de un período de incubación de 18 horas a 37ºC en un contador de centelleo líquido (Beckmann Instruments, Munich, Alemania).

Ensayo de linfolisis mediada por células (CML)

La actividad citolíticas de las células NK se monitorizó en un ensayo estándar de ^{51}Cr (23). Las diluciones de las células efectoras se incubaron con células diana tumorales marcadas con ^{51}Cr (100 \muCi de Na^{51}CrO_{4}, NEN-Dupont, Boston, MA) (3 x 10^{3} células por pocillo), en duplicados, con un volumen final de 200 \mul de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FCS, a 37ºC, durante 4 h, en placas de 96-pocillos con fondo en U (Greiner, Nuertingen, Alemania). Transcurrido el período de incubación, se recolectaron los sobrenadantes, y se contó la radiactividad en un contador \gamma (Packard Instruments). El porcentaje de lísis específica se determinó de acuerdo con la ecuación:

(liberación experimental - liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea) x 100.

El porcentaje de liberación espontánea fue siempre <15% para cada línea celular diana.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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Claims

1. Péptido que comprende 30 o menos aminoácidos, comprendiendo dicho péptido

(a): la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELXG, en donde X es T o S, o

(b): una secuencia de aminoácidos que se desvía de la secuencia de aminoácidos de (a) por medio de una sustitución de aminoácido, en donde se retienen los aminoácidos TKDN y X tal como se define en (a), y en donde dicho péptido estimula la actividad de las células NK.

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2. El péptido según la reivindicación 1 que comprende además la secuencia de aminoácidos EGERAM en el extremo N-terminal.

3. (Poli)péptido de fusión que comprende el péptido de la reivindicación 1 ó 2.

4. Polinucleótido que codifica el péptido de la reivindicación 1 ó 2 o el polipéptido de fusión de la reivindicación 3.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4 que es ADN.

6. Vector que comprende el ADN de la reivindicación 5.

7. Composición que comprende el péptido de la reivindicación 1 ó 2, el (poli)péptido de la reivindicación 3, el polinucleótido de la reivindicación 4 ó 5, o el vector de la reivindicación 6, y una portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

8. La composición de la reivindicación 7 que es una composición farmacéutica, producto médico, adyuvante médico, o vacuna.

9. La composición de la reivindicación 7 u 8, que comprende además interleucina-2 y/o interleucina-18.

10. Procedimiento de producción de un péptido inmunoestimulador que comprende

(d): seleccionar un péptido que comprende la secuencia mutada o una molécula de ADN recombinante que codifica un péptido que comprende la secuencia mutada, en donde dicho péptido mutado muestra un incremento en la respuesta proliferativa en comparación con la IL-2 y/o IL-18 sin el péptido mutado o con un péptido que tiene la secuencia descrita en (a) en el paso (c).

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11. Uso del péptido de la reivindicación 1 ó 2 como un compuesto líder en un procedimiento para producir una composición farmacéutica para estimular la activación de células NK.

12. Uso del péptido de la reivindicación 1 ó 2, del (poli)péptido de fusión de la reivindicación 3, del polinucleótido de la reivindicación 4 ó 5, o del vector de la reivindicación 6, y de un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, para la preparación de una composición farmacéutica para la activación de células NK.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde dicha activación comprende la activación de la proliferación de células NK y/o de la actividad citolítica de las células NK.

14. Uso del péptido de la reivindicación 1 ó 2, del (poli)péptido de fusión de la reivindicación 3, del polinucleótido de la reivindicación 4 ó 5, o del vector de la reivindicación 6, y de un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en inmunoterapia y/o para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de entre los carcinomas de pulmón, colorectal, pancreas, laringe, estómago, sistema nervioso central y periférico, de otros carcinomas, sarcomas, leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloica aguda (AML), leucemia linfática aguda (ALL), linfoma no-Hodgkin (NHL), síndrome mieloproliferativo (MPS), síndrome mielodisplásico (MDS), plasmocitoma, otras leucemias, otras enfermedades malignas en donde la Hsp70 está presente sobre la superficie de las células malignas, una infección con un virus HI, otras infecciones víricas o bacterianas en las que la Hsp70 está presente sobre la superficie de las células infectadas, la artritis reumatoide, el lupus eritematoso, otras enfermedades autoinmunes, el asma bronquial, y otras enfermedades inflamatorias.