ES2282473T3 - Utilizacion de vectores peptidicos para mejorar la respuesta inmunitaria a antigenos. - Google Patents

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Abstract

Conjugado de un antígeno acoplado a un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena beta, en el que dicho antígeno es un péptido, una proteína completa, o una subunidad de proteína del grupo que consiste en una proteína de un virus, una proteína de una bacteria, una proteína autóloga y una proteína del cáncer, y en el que un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadenabeta es un péptido antibiótico de cadena beta de mamífero que ha sido modificado para eliminar los enlaces disulfuro internos formados entre los residuos de cisteína, y opcionalmente modificado además mediante sustitución, inserción o eliminación de manera que retiene la capacidad del péptido de atravesar la membrana de una célula de mamífero.

Description

Utilización de vectores peptídicos para mejorar la respuesta inmunitaria a antígenos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al sector de la inmunología y la tecnología de vacunas. Más específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos de liberación de antígenos en las células con el fin de estimular la respuesta inmunitaria para su uso en vacunación y profilaxis.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario huésped proporciona un mecanismo de defensa sofisticado que permite el reconocimiento y la eliminación de entidades exógenas, tales como agentes de infección o neoplasmas, del cuerpo. Cuando funciona correctamente, un sistema inmunitario eficaz distingue entre invasores exógenos y los propios tejidos del huésped. La primera respuesta a agentes exógenos es la secreción de anticuerpos que son capaces de reconocer, bloquear y destruir agentes microbianos. Sin embargo, esta respuesta frecuentemente es insuficiente, ya que, en algunos casos, tales como partículas virales, los patógenos son capaces de escapar una respuesta de anticuerpos de células B entrando rápidamente en células diana en las que los anticuerpos no pueden alcanzarlos. A continuación, el patógeno se puede replicar intracelularmente e infectar otras células periféricas. El desafío de los científicos es estimular la respuesta de las células T contra agentes microbianos. La respuesta de las células t es la capacidad del sistema inmunitario de desarrollar un tipo especial de linfocitos [CD4+, CD8+] que son capaces de reconocer específicamente las células infectadas y destruirlas. Este mecanismo de respuesta de las células T es complementario a la respuesta de los anticuerpos de células B y ambas son necesarias para conseguir una respuesta inmunitaria. Como ejemplo, una vacuna eficaz contra la infección por VIH es un largo proceso a causa de la dificultad para generar una respuesta de CTL contra varias vacunas candidatas.
Las células dendríticas (DCs) son células presentadoras de antígenos (APC) eficaces que inician una respuesta inmunitaria a antígenos péptidos asociados con MHC de la clase I y la clase II (Freudenthal, P.S. and Steinman, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7698, 1990; Steinman, R.M., Ann. Rev. Immune. 9:271, 1991). Las DCs representan una subpoblación pequeña ampliamente distribuida de leucocitos derivados de médula espinal, que son las únicas células presentadoras de antígenos naturales capaces de cebar células T no tratadas. Activan una respuesta inmunitaria primaria de linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ y son, por lo menos, tan eficaces como otras APCs, tales como monocitos en la estimulación de respuestas inmunitarias secundarias (Peters y otros, Immunol. Today L7:273,
1997).
Con el fin de estimular las respuestas de los linfocitos T, primero se deben unir fragmentos peptídicos de antígenos contenidos en una vacuna a receptores de unión a péptidos (moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II) que muestran los péptidos antigénicos en la superficie de células presentadoras de antígenos (APCs). Los linfocitos T producen un receptor de antígeno que utilizan para monitorizar la superficie de APCs para la presencia de péptidos exógenos. Los modelos actuales de presentación y procesado de antígenos a linfocitos T sugieren que existen dos mecanismos principales. Brevemente, los antígenos exógenos se internalizan en los compartimentos endocíticos de APCs donde se hidrolizan en péptidos, algunos de los cuales quedan unidos a moléculas de MHC de clase II. Los complejos MHC clase II/péptido maduros se transportan a continuación a la superficie celular para la presentación a linfocitos T CD4^{+} restringidos a la clase II. En cambio, para las moléculas de MHC de clase I, los antígenos endógenos se degradan en el citoplasma mediante la acción de una partícula proteolíticamente activa conocida como el proteasoma antes de su transporte al retículo endoplasmático, en el que se unen a moléculas de MHC de clase I nuevas. Los complejos de clase I/péptido estables se transportan a través del aparato de Golgi hasta la superficie celular al CTL CD8^{+}. Dado que la respuesta de CTL es crucial para la protección contra muchas infecciones víricas o parasitarias y algunas células de tumores, se han propuesto varias estrategias nuevas de vacunas: 1) Complejos de inmunoestimulación (Takahasci y otros, 1990. Nature 344: 873); 2) liposomas sensibles al pH cargados de antígenos (Nair y otros, 1992, J. Exp. Med. 175: 609); 3) bacterias recombinantes que expresan antígenos exógenos (Tuner y otros, 1993, Infect. Immun. 61: 5374; Ikonomidis y otros, 1994, J. Exp. Med 180: 2209); 4) toxinas bacterianas fusionadas a epítopos de CTL (Donnelly y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3530); 5) antígenos particulados (Schirmbeck y otros, 1994. Eur. J. Immunol. 24: 2068, Layton y otros, 1993, J. Immunol. 151: 1097); 6) utilización de varios vectores (Schutze-Redelmeier y otros, 1996, J. Immunology 157: 650-655; Schluesener 1996, J. Neurosci. Res. 46: 258-262); y 7) ADN desnudo inyectado en células de músculo (Ulmer y otros, 1993, Science 259: 1745). Esta variedad de estrategias refleja la dificultad inherente de liberar antígenos intracelularmente con el fin de obtener una respuesta de CTL. En muchos casos, estas aproximaciones tienen una eficacia in vivo escasa y están limitadas por consideraciones de seguridad, respuestas inmunitarias contra el vector y el coste.
Además del sistema inmunitario, se sabe que los mamíferos producen péptidos pequeños que tienen una actividad antimicrobiana directa. La mayoría de estos péptidos actúan provocando la lisis directa de la membrana de procariotas. Una familia principal de estos péptidos son péptidos antibióticos de cadena \beta unidos por puentes disulfuro. Entre los miembros de la familia se incluyen defensinas (Lehrer y otros, 1991, Cell 64: 229-230; Lehrer y otros, 1993, Ann. Rev. Immunol. 11: 105-128, protegrinas (Kokryakov y otros, 1993, FEBS 337: 231-236) y taquiplesinas (Nakamura y otros, 1988, J. Biol. Chem. 236: 16709-16713; Miyata y otros, 1989, J. Biochem. 106: 663-668).
Se sabe que los péptidos de estas clases son capaces de pasar a través de las membranas de células de mamíferos, aunque debido a las diferencias entre las membranas de células bacterianas y mamíferas, los péptidos no son tóxicos a las células de mamíferos.
La solicitud de PCT WO-A-02/02595 publicada el 10-01-2002 reivindica la fecha de prioridad del 3-7-200. Se ha proporcionado a la Oficina Europea de Patentes en una de sus lenguas oficiales y se ha pagado la tasa nacional de acuerdo con el Artículo 22, párrafo 1 o el Artículo 39, párrafo 1 del Tratado de Cooperación. Por consiguiente, se cumplen los requisitos del Artículo 158 (2) EPC.
Se considera, por tanto, que su contenido tal y como se presentó está comprendido en el estado de la técnica pertinente a la cuestión de novedad, según los Artículos 54(3) y (4) EPC. Aunque esta solicitud anterior describe extensamente el "derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta" de las presentes reivindicaciones, esta solicitud anterior sólo se refiere a composiciones que comprenden conjugados de dicho derivado con "sustancias activas". A partir de la descripción, está claro que dichas sustancias activas tienen propiedades farmacéuticas. Además, esta solicitud anterior no se refiere explícitamente a composiciones que comprenden conjugados de dicho derivado con antígenos.
FR-A-2 767 323 describe (cf. Ejemplos) un conjugado de un antígeno (biotina, que se detecta utilizando anticuerpos en dichos ejemplos) acoplado a un péptido antibiótico de cadena \beta.
WO99/07728 describe un conjunto de derivados de estos péptidos como vectores para la introducción de sustancias a células o para sustancias para pasar a través de la barrera hemato-encefálica. Entre estos derivados se incluyen derivados lineales en los que los péptidos no tienen enlaces disulfuro. La ausencia de enlaces disulfuro se consigue mediante la sustitución de residuos de cisteína o bloqueando sus grupos tiol terminales.
Descripción de la invención
Los solicitantes han observado sorprendentemente que cuando los vectores peptídicos basados en los péptidos de WO99/07728 se utilizan para unirse a un antígeno, el producto resultante puede ser captado por células presentadoras de antígenos que a continuación son capaces de procesar el antígeno y expresar el antígeno en su superficie de forma que facilitan una respuesta de CTL. Se ha observado que estimula la respuesta de CTL en comparación con la utilización del antígeno solo.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado de un antígeno acoplado a un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta, en el que dicho antígeno es un péptido, una proteína completa, o una subunidad de proteína del grupo que consiste en una proteína de un virus, una proteína de una bacteria, una proteína autóloga y una proteína del cáncer.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho conjugado en un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención permite un procedimiento de estímulo de la respuesta inmunitaria a un antígeno en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la administración al mamífero de una cantidad eficaz de un conjugado de dicho antígeno acoplado a un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta.
La presente invención también proporciona la utilización de un conjugado de un antígeno acoplado a un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta para la fabricación de un medicamento para estimular la respuesta inmunitaria a dicho antígeno en un mamífero.
La presente invención también proporciona un conjugado de un antígeno acoplado a un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta para su utilización en un procedimiento de estímulo de la respuesta inmunitaria a dicho antígeno en un mamífero.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la captación de los conjugados SynB3-NP de gripe y SynB4-NP de gripe por células K562, junto con un péptido NP de gripe de control. El eje X es el tiempo en minutos y el eje Y indica la Intensidad de Fluorescencia Promedio.
La figura 2 muestra las respuestas de CTL obtenidas de ratones inmunizados con controles ((a), (b) y (c)) y conjugados de la presente invención ((d) y (e)).
La figura 3 muestra la captación de los conjugados SynB3-DPV y SynB4-DPV por células K562, junto con una proteína DPV de control. El eje X es el tiempo en minutos y el eje Y indica la Intensidad de Fluorescencia Promedio.
La figura 4 muestra las respuestas de CTL obtenidas de ratones inmunizados con controles y conjugados DPV de la invención.
Descripción detallada de la invención Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
Este término se refiere a cualquier péptido antibiótico de cadena \beta de mamífero que ha sido modificado para eliminar los enlaces disulfuro internos formados entre los residuos de cisteína, y opcionalmente modificado además mediante sustitución, inserción o eliminación de manera que retiene la capacidad del péptido de atravesar la membrana de una célula de mamífero.
La modificación para eliminar los enlaces disulfuro se puede conseguir mediante el bloqueo químico del grupo tilo (por ejemplo, mediante conversión a un grupo R-tio, tal como metil-tio), o mediante sustitución del residuo de cisteína por otro aminoácido, tal como serina, alanina o glicina.
Dado que un enlace disulfuro requiere de dos residuos de cisteína, es perfectamente posible dejar un residuo sin modificar en el péptido, aunque esto no es preferible, con el fin de evitar la formación de dímeros.
En un aspecto, el péptido lineal se puede definir como un péptido de estructura: Nter-Mid-Cter, en la que Mid es un péptido de fórmula (I):
X1/3-(X1/2 o un enlace)-(X o un enlace)-X3-(X1 o un enlace)-X1-X-X1/2-
(X2/3 o un enlace)-Db-(X2/3 o un enlace)-X1/3 (SEC ID No: 1);
en la que Db es X3 - X3 o bien, X1 - X1; y
en la que Nter es un extremo N-terminal, o bien
X1/X3-X1-X1/2-X1-X3 (SEC ID No: 2);
y
en la que Cter es un extremo C-terminal, o bien
X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-X3 (SEC ID No: 3).
en las que:
- cada X1, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar;
- cada X2, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar; y
- cada X3, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica;
- X es cualquiera de entre X1, X2 y X3;
en el que dicho péptido es lineal (es decir, no contiene ningún enlace disulfuro intramolecular) y retiene la capacidad de atravesar una membrana de mamífero;
o un fragmento del mismo que retiene la capacidad de atravesar una membrana de mamífero.
En el péptido anterior, se prefiere que si el valor indicado como "X1 o un enlace" es un enlace, entonces existe un residuo X2 o X3 en la posición indicada como la primera aparición (desde la dirección de N a C terminal) de "X2/3 o un enlace". Asimismo, cuando éste último es un enlace, se prefiere que el primero sea X1.
Entre los aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares se incluyen alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína, norleucina, cisteína^{Acm}, penicilamina, prolina, norvalina, fenilglicina, Abu, ácido amino-1-ciclohexano carboxílico, Aib, ácido 2-aminotetralina carboxílico, 4-bromofenilalanina, tert-Leucina, 4-clorofenilalanina, 3,4-diclorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, homoleucina, 4-metilfenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, 4-nitrofenilalanina, 3-nitrotirosina, 3-piridilalanina, [2-tienil]alanina.
Los aminoácidos con cadenas laterales no polares preferidos son glicina, valina, norvalina, leucina, isoleucina, norleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano.
\newpage
Entre los aminoácidos que tienen cadenas laterales polares se incluyen serina, treonina, tirosina, asparaginas, glutamina, citrulina, homocitrulina, isoasparagina, \beta-homoglutamina, \beta-homoglutamina \beta-glutamina, \beta-homoserina, \beta-homotreonina, homoserina, isoserina.
Entre los preferidos de dichos aminoácidos se encuentran serina, treonina, tirosina, asparaginas y glutamina.
Entre los aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas se incluyen arginina, lisina, histidina, ornitina, ácido diaminoacético, ácido diaminobutírico, y ácido diaminopropiónico. Entre los preferidos de dichos aminoácidos se incluyen arginina y lisina. La arginina es particularmente preferida.
De este modo, en una realización preferida, X1 se selecciona entre glicina, valina, norvalina, leucina, isoleucina, norleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano, X2 se selecciona entre serina, treonina, tirosina, asparaginas y glutamina y X3 se selecciona entre arginina y lisina.
En una subclase particular de la fórmula anterior, el péptido puede ser un derivado de protegrina de fórmula:
R-(Xa)-R-L-X1/2-Y-X2/3-Db-(R o un enlace)-F-X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-R (SEC ID No: 4)
en la que Xa es X1-X1 o bien, un enlace, o un fragmento de la misma de por lo menos 7 aminoácidos.
Preferiblemente, cuando Xa es X1-X1, los dos grupos son el mismo.
Más preferiblemente, la fórmula es:
R-(Xa)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-Db-R-F-(G/S/A)-X1-(R/S)-(V/T)-G-R (SEC ID No: 5);
y aún más preferiblemente la fórmula es:
R-(Xb)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-R-R-R-F-(G/S/A)-(T/I/V)-(R/S)-(V/T)-G-R (SEC ID No: 6)
en las que Xb es un enlace, o bien, A-A o G-G.
Entre los ejemplos de péptidos de la fórmula anterior se incluyen:
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-V-S-V-G-R (SEC ID No: 7)
R-A-A-R-L-A-Y-R-L-L-R-F-A-I-R-V-G-R (SEC ID No: 8)
R-A-A-R-L-G-Y-R_{n}-_{n}L-L-R-F-G-Z-R-V-G-R (SEC ID No: 9)
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-T-S-T-G-R (SEC ID No: 10)
R-R-L-S-Y-S-R-R-R-F (SEC ID No: 11)
en las que _{n}L es norleucina y Z es norvalina.
En otra realización preferida, el péptido es un derivado de taquiplesina de fórmula:
X1/3-X1-X1/2-X1-R-X1-X1/2-X2-R-X1-X1-S/R-X2-Db-X2/3-X2/3 (SEC ID NO: 12)
o un fragmento del mismo de por lo menos 7 aminoácidos.
Preferiblemente, los dos residuos de Db son los mismos entre sí.
Preferiblemente, está fórmula es:
(K/R/A)-W-(S/A)-F-R-X1-(S/A)-Y-R-X1-X1-(S/R)-Y-Db'-(R/S)-(R/L/_{n}L) (SEC ID No: 13)
en la que Db' se selecciona de entre L-L, _{n}L-_{n}L y R-R (donde _{n}L es norleucina).
Más preferiblemente, la fórmula es:
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-Y-R-G-I-(S/R)-Y-R-R-R-Xc-(R/L) (SEC ID No: 14).
Entre los ejemplos de péptidos se incluyen:
K-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (SEC ID No: 15);
R-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (SEC ID No: 16);
K-W-A-F-R-V-A-Y-R-G-I-R-Y-L-L-R-L (SEC ID No: 17);
y
A-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (SEC ID No: 18). 
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Para evitar dudas, en las fórmulas de péptidos anteriores, se utiliza el código estándar de 1 letra de los aminoácidos para representar los aminoácidos naturales. Las otras letras se utilizan tal y como se han definido. La presencia de residuos alternativos en una posición se indica como "/"; de este modo, X1/2 significa que el residuo en el péptido puede ser X1 o bien, X2, y de forma similar, R/S significa que la arginina o la serina pueden estar en el lugar indicado.
Todos los péptidos de la presente invención pueden comprender aminoácidos en la configuración L o en la configuración D. Además, estos L- o D-péptidos pueden estar en la forma retro, es decir, secuencias en las que el orden de N- a C-terminal está invertido. Un ejemplo de dicho péptido es:
R-S-R-R-Y-S-I-G-R-Y-S-V-R-F-S-W-A (SEC ID No: 19),
que es la forma retro del primer péptido derivado de taquiplesina mostrado en el párrafo anterior.
Fragmentos
También se pueden utilizar fragmentos de las secuencias anteriores que retienen la capacidad del péptido de atravesar una membrana de mamífero. En general, los fragmentos tendrán por lo menos 7 aminoácidos de tamaño. Preferiblemente, los péptidos tendrán un intervalo de tamaño de w7 a 24 aminoácidos, tales como de 10 a 24, por ejemplo, de 10 a 20 aminoácidos de tamaño. Un intervalo de tamaños habitual dentro de éste es de 12 a 20 aminoácidos de tamaño.
Residuos básicos
Los péptidos y fragmentos de la presente invención contienen un conjunto de aminoácidos X3, que son preferiblemente arginina o lisina. Se prefiere que los péptidos y fragmentos se seleccionen de manera que contengan por lo menos 4, preferiblemente por lo menos 5, y más preferiblemente por lo menos 6 residuos X3.
Extensiones N- y C-terminales de los péptidos
Los péptidos (incluyendo los fragmentos) de la presente invención funcionarán como un vector para el estímulo de una respuesta inmunitaria a un antígeno. Cuando el antígeno se une a los extremos N- o C-terminal del péptido, el antígeno se puede unir directamente mediante un enlace amida, o indirectamente mediante un enlazador. En el caso de este último, el enlazador puede ser de 1 a 25 aminoácidos y estar compuesto de cualquier secuencia de péptidos. El enlazador puede ser un enlazador flexible del tipo utilizado para unir cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en un anticuerpo de cadena única.
Cuando el extremo N- o C-terminal del vector peptídico no está unido al antígeno, puede contener opcionalmente una cantidad corta de secuencias adicionales, por ejemplo, de 1 a 25 residuos, que pueden estar presentes, por ejemplo, por razones convencionales en la técnica de la ingeniería genética. Por ejemplo, la secuencia puede formar una cola ("tag") corta con objetivos de purificación o identificación, o puede formar una presecuencia divisible para el transporte fuera de una célula huésped en la que se produce la fusión péptido-antígeno.
Cuando el extremo N-terminal del péptido no se extiende por la presencia de secuencias adicionales o no se une al antígeno, el extremo N-terminal del péptido comprenderá generalmente un grupo amino, aunque pueden estar presentes las modificaciones en el grupo, tales como las que pueden resultar de la síntesis química del péptido. Asimismo, el extremo C-terminal de un péptido puede se un extremo terminal carboxilo modificado, tal como un grupo carboxilo amidado o similar.
Retiene la capacidad de atravesar una membrana de mamífero
Por este término, se entiende que el péptido será capaz de atravesar la membrana celular de una célula de mamífero en un cultivo a 37ºC en por lo menos un 50%, preferiblemente por lo menos un 75% de la penetración conseguida por el péptido SynB3 a una concentración de (ambos de) 1 \muM, medida después de 60 minutos de cultivo. La célula de mamífero puede ser una línea celular primaria, una línea celular cancerígena o cualquier línea celular disponible generalmente en la técnica, tal como células K562.
Antígeno
El antígeno acoplado al péptido puede ser cualquier antígeno al que se desea que provoque una respuesta inmunitaria en un mamífero huésped.
Entre los antígenos se incluyen péptidos, proteínas completas, y subunidades de proteínas.
Los antígenos son víricos, bacterianos o derivados de proteínas autólogas, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o cánceres.
Entre los ejemplos de agentes víricos se incluyen, pero sin limitarse a, antígenos derivados del virus de la gripe; adenovirus; virus de la hepatitis A, B y C; virus de la fiebre amarilla; virus de la fiebre del dengue; VIH-1 y VIH-2, HSV1 y HSV2; virus de Epstein-Barr; virus del herpes asociado a fibromatosis retroperitoneal, virus del papiloma humano, virus del herpes del sarcoma de Kaposi, y citomegalovirus (CMV).
Entre los ejemplos de agentes bacterianos se incluyen, pero sin limitarse a, antígenos de bacterias infecciosas, tales como Mycobacterium tuberculosis, Acne vulgaris, Propionibacterium acnes, Chlamydia trachomatis, Babesia microti, Ehrlichia risticii, Borrelia burgdorferi, Leishmania aethiopica, Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus sapropyticus, y Trypanosoma cruzi.
Entre los auto-antígenos se incluyen antígenos que aparecen en células asociadas con la aparición de enfermedades autoinmunitarias o cáncer. Los antígenos de ejemplo se asocian con los siguientes cánceres: Leucemia mielógena aguda (AML), Leucemia linfocítica aguda (ALL), Leucemia mielógena crónica (CML), Leucemia linfocítica crónica (CLL), Leucemia de células pilosas, Mieloma, y todos los tumores sólidos de todos los tipos de tejidos.
Los ejemplos adjuntos ilustran la utilización de un antígeno péptido de sólo 9 aminoácidos, y una proteína de 8,4 kD derivada de M. tuberculosis. Por consiguiente, el vector peptídico se puede utilizar con un amplio rango de antígenos, por ejemplo, desde un epítopo único de péptido de aproximadamente 6 aminoácidos hasta proteínas o subunidades de las mismas de por lo menos 200 kDa, aunque preferiblemente no más de 100 kDa.
Los antígenos también incluyen ADN u oligonucleótidos que se pueden utilizar para la vacunación basada en ADN en la que proteínas inmunogénicas se expresan en células transfectadas in vivo de los receptores de las vacunas en su conformación nativa de ADN plásmido de expresión codificante de antígeno.
Mamífero
Por "mamífero" se entiende cualquier mamífero, incluyendo un humano. Los conjugados de la invención pueden ser útiles en medicina veterinaria, por ejemplo, para la vacunación de ganado y aves de corral o animales domésticos, así como en medicina humana.
Estímulo de la respuesta inmunitaria
Los conjugados de la presente invención serán útiles en la provocación de una respuesta inmunitaria en un sujeto mamífero que es superior que la respuesta inmunitaria que se conseguiría en el mamífero mediante la administración de una cantidad de antígeno no conjugado equivalente a la cantidad de antígeno en el conjugado. La capacidad de un conjugado para hacer esto se puede medir de varias maneras conocidas en la técnica. Un ensayo para medir la respuesta de CTL en ratones, ilustrado en los ejemplos adjuntos, es uno de dichos procedimientos.
Preparación de conjugados
Los conjugados se pueden preparar mediante síntesis química o mediante la utilización de técnicas de biología molecular. La sustancia antígeno se puede acoplar a un vector peptídico en las composiciones según la presente invención mediante cualquier medio de unión aceptable considerando la naturaleza química, el tamaño y el número de sustancias y péptidos activos y asociados. Pueden ser enlaces covalentes, hidrofóbicos o iónicos, o enlaces encindibles o no escindibles en el medio fisiológico o en el interior de células.
El acoplamiento se puede conseguir en cualquier sitio del vector peptídico en el que los grupos funcionales, tales como -OH, -SH, -COOH, -NH_{2} estén presentes de forma natural o se hayan introducido. De este modo, una molécula de antígeno se puede acoplar al péptido en los extremos N-terminal o C-terminal, o en las cadenas laterales del péptido.
De forma similar, el acoplamiento se puede conseguir en cualquier sitio en la molécula de antígeno, por ejemplo, en el que los grupos funcionales, tales como -OH, -SH, -COOH, -NH_{2} estén presentes de forma natural o se hayan introducido.
El acoplamiento del antígeno puede tener lugar también mediante medios no covalentes. Por ejemplo, el vector peptídico puede comprender un grupo (por ejemplo, estreptavidina) que se une a un grupo afín unido al antígeno (por ejemplo, biotina). Los grupos iónicos unidos al vector peptídico y al antígeno también pueden proporcionar un acoplamiento adecuado. El enlazador se puede diseñar para dividirse en una APC con el fin de facilitar el procesado y la presentación del antígeno. Por ejemplo, se puede utilizar un enlace disulfuro, ya que estos enlazadores son generalmente estables en plasma y disminuyen en la célula.
Es posible acoplar más de un antígeno a cada vector peptídico y/o viceversa. Esto dependerá en cierto grado de los tamaños relativos del vector y el antígeno. De este modo, la proporción de las moléculas del vector peptídico con respecto a las moléculas de antígeno por conjugado puede variar desde 10:1 a 1:10, preferiblemente desde 5:1 a
1:5.
Cuando el vector peptídico y el antígeno se unen mediante la fusión de C a N-terminal (en cualquier orden), la fusión se puede preparar como una proteína de fusión única mediante medios recombinantes.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico que codifica dicha fusión. El ácido nucleico puede ser ADNs o ARNs y se pueden asociar con secuencias de control, tales como un promotor y/o insertadas en vectores. El vector utilizado se escoge para que sea compatible con el huésped al que se transferirá, para proporcionar la expresión de la proteína de fusión. La preparación de estos vectores y la producción o expresión de péptidos o compuestos con una fórmula de tipo (II) en un huésped, pueden producirse utilizando biología molecular y técnicas de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia.
De este modo, en otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento de fabricación de un conjugado tal y como se ha definido anteriormente, cuyo procedimiento comprende la expresión en un cultivo de células huésped de una secuencia de ácidos nucleicos que codifican dicho conjugado y la recuperación del cultivo de dicho conjugado.
Composiciones
La composiciones de la presente invención comprenden conjugados de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones se pueden formular para cualquier ruta y medio de administración adecuados. Entre los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen aquellos utilizados en formulaciones adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en forma de dosis unitarias y se pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos conocidos en sector de la farmacia. Entre dichos procedimientos se incluyen la etapa de asociar el principio activo con el portador que constituye uno o más de los ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan mediante la asociación uniforme e íntima del principio activo con los portadores líquidos o con los portadores sólidos finamente divididos o con ambos, y a continuación, si es necesario, se le da forma al producto.
Para composiciones sólidas, entre los portadores sólidos no tóxicos convencionales que se pueden utilizar se incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa, derivados de celulosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, glucosa, sacarosa, carbonato magnésico, y similares. El compuesto activo tal y como se ha definido anteriormente se puede formular como supositorios utilizando, por ejemplo, polialquilenglicoles, triglicéridos acetilados y similares, como portador. Las composiciones farmacéuticamente administrables líquidas se pueden preparar, por ejemplo, mediante la disolución, dispersión, etc, de un compuesto activo tal y como se ha definido anteriormente, y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, para formar de esta manera una solución o una suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar puede contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH y similares, por ejemplo, acetato sódico, monolaurato de sorbitano, acetato sódico de trietanolamina, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Los procedimientos actuales de preparación de dichas formas de dosificación son conocidas, o serán evidentes, para un experto en la materia; por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15ª Edición, 1975. La composición o formulación a administrar contendrán, en cualquier caso, una cantidad del compuesto o compuestos activos en una cantidad eficaz para aliviar los síntomas del sujeto en tratamiento.
Se pueden preparar formas de dosificación o composiciones que contienen el principio activo en el intervalo de un 0,25 a un 95% equilibrando a partir de un portador no tóxico.
Para la administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquier excipiente utilizado normalmente, tal como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa, derivados de celulosa, croscarmelosa sódica, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, glucosa, sacarosa, carbonato magnésico, y similares. Dichas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación controlada y similares. Dichas composiciones pueden contener de un 1 a un 95% de principio activo, más preferiblemente de un 2 a un 50%, aún más preferiblemente de un 5 a un 8%.
La administración parenteral se caracteriza generalmente por la inyección, de forma subcutánea, intramuscular o intravenosa. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, como soluciones líquidas o suspensiones, formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH y similares, tales como, por ejemplo, acetato sódico, monolaurato de sorbitano, trietanolamina, oleato de trietanolamina, acetato sódico de trietanolamina, etc.
Un aproximación ideada más recientemente para la administración parenteral utiliza la implantación de un sistema de liberación lenta o liberación controlada, de manera que se mantiene un nivel constante de dosis. Ver, por ejemplo, Patente USA No. 3.710.795.
El porcentaje de compuesto activo contenido en dichas composiciones parenterales es muy dependiente de la naturaleza específica del mismo, así como de la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto. Sin embargo, son utilizables los porcentajes de principio activo de un 0,1% a un 10% en solución, y serán más elevados si la composición es un sólido que se diluirá posteriormente hasta los porcentajes anteriores,. Preferiblemente, la composición comprenderá de un 0,2 a un 2% del agente activo en solución.
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Dosis y rutas de administración
El conjugado de la invención, por ejemplo, en forma de una composición descrita anteriormente, se puede administrar mediante diferentes mecanismos, por ejemplo, mediante administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural).
La cantidad eficaz del conjugado de la presente invención a administrar será en última instancia a juicio del médico, teniendo en cuenta la gravedad de la enfermedad en un sujeto particular (por ejemplo, un paciente humano o un modelo animal) y la condición global del sujeto. Las dosis adecuadas estarán habitualmente en el intervalo de 1 \mug a 10 mg de antígeno, más preferiblemente entre 10 \mug y 1 mg de antígeno y aún más preferiblemente entre 100 \mug y 1 mg de antígeno.
Con el fin de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto mamífero, el conjugado se puede administrar en dosis de repetición, por ejemplo, para proporcionar dosis de refuerzo a intervalos repetitivos.
El conjugado se puede utilizar para reforzar la inmunidad de pacientes que tienen una enfermedad particular o para proporcionar una respuesta inmunitaria a una enfermedad particular. Preferiblemente, el conjugado proporciona una respuesta inmunitaria protectora a la enfermedad.
Otras ventajas y características de la presente invención quedarán claras después de leer el siguiente ejemplo referido a la preparación de compuestos con una fórmula de tipo (I) en la que un epítopo de péptido y antígenos de proteínas se han acoplado a vectores peptídicos, y su aumento de la captación celular y la respuesta de CTL según la presente invención.
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Ejemplos Procolos Síntesis de péptidos
Todos los péptidos se sintetizaron según la estrategia Fmoc-tBu utilizando un AMS 422 (ABIMED, Alemania). El marcaje del extremo N-terminal de los péptidos con sonda NBD (4-fluoro-7-nitrobenzofurazano) se consiguió tal y como ya se ha descrito (Gazit y otros, 1995, Biochemistry 34: 11479-11488). La purificación de péptidos se llevó a cabo mediante HPLC de fase inversa. La purificación estaba por encima del 95% para todos los péptidos por el criterio de absorbancia de UV a 220 nm y 460 nm.
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Acoplamiento de vectores SynB a la proteína recombinante rDPV
La amina N-terminal de la proteína rDPV se derivó primero con 2-iminitiolano (2IT) con el fin de tener un tiol libre, aunque conservando la carga positiva. El 2-IT en exceso se eliminó de la proteína mediante filtración en gel. A continuación, 2IT-sDPV se incubó con un péptido 3MP-SynB activado con tiopiridinio para permitir la formación de un puente disulfuro, mediante el desplazamiento del tiopiridinio del péptido 3MP por el tiol libre de 2IT-DPV. El tiopiridinio desplazado se eliminó del conjugado de proteína mediante filtración en gel. Todas las etapas de derivación se siguieron utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF.
Captación celular
La asociación celular se midió mediante citometría de flujo utilizando un FACScan (Becton Dickinson, USA). Los compuestos libres o sectorizados se incubaron con células K562 (5 x 10^{5} células por ml) en medio Optimem a 37ºC durante varios periodos de tiempo.
A continuación, las células se lavaron dos veces y, a continuación, se resuspendieron en 0,5 ml de PBC enfriado con hielo para análisis FACS. Los fluoróforos asociados con células se excitaron a 488 nm y se midió la fluorescencia a 525 nm. Se obtuvo un histograma de la intensidad de fluorescencia por células (1 x 10^{4}) y se consideró el promedio calculado de esta distribución (Intensidad de Fluorescencia Promedio) como representativo de la cantidad de péptido asociado a las células.
Sistemas modelo in vivo
Los ratones (Balb/c) se inmunizaron con antígenos libres o vectorizados, y se mezclaron con cada formulación con 15 \mug de heparina. Los reactivos se mezclaron y, a continuación, se utilizaron para inmunizar subcutáneamente en cada costado. Los ratones se inmunizaron en el día 0 y después de 3 semanas se sacrificaron los ratones, se extrajeron los bazos y se prepararon suspensiones de células únicas. Tres días después, se irradiaron blastos de LPS derivados de Balb/c (utilizando sulfato de dextrano y LPS) y se incubaron con el antígeno. Las células del bazo (6 x 10^{6}/ml) y blastos de LPS (3 x 10^{6}/ml) se incubaron juntos durante 7 días. La actividad de las células T citotóxicas se midió en el día 6 utilizando células P815 marcadas con Cr^{51} no pulsadas o pulsadas con el antígeno como dianas. En el día 7, las células restantes se reestimulan con células P815 pulsadas con antígeno con la adición de 20 U/ml de IL-2. En todos los datos a las células anti-P815 no específicas se ha extraído CTL.
Ejemplo 1
Liberación de un epítopo de péptido
1
Captación celular
El epítopo NP de gripe se conjugó a los vectores SynB3 y SynB4. En primer lugar, se comparó la captación celular de NP de gripe libre y conjugado. El epítopo NP de gripe se conjugó a los vectores SynB3 y SynB4 y se marcó con un grupo fluorescente (NBD). Los compuestos se incubaron con células K562 varias veces y la captación celular se midió utilizando citometría de flujo.
La incubación de las células con epítopo NP de gripe libre dio lugar a una captación muy baja a juzgar por el promedio de intensidad de la fluorescencia (figura 1). Sin embargo, el acoplamiento del antígeno de péptido NP de gripe con los vectores SynB3 o SynB4 aumentó significativamente su penetración celular. La penetración celular era muy rápida en los primeros 30 minutos y a continuación a ritmo constante. El aumento de la internalización era de 2 a 5 veces dependiendo del vector utilizado. A los 45 minutos, la captación celular de SynB4/NP de gripe era de aproximadamente 5 veces superior a la observada para NP de gripe libre.
Estudios de inmunización
Los ratones Balb/c (H-2d, hembras, 6-8 semanas) se inmunizaron mediante la ruta intradérmica (base de cola) con cantidades equimolares de péptido NP de gripe libre o conjugado. Específicamente, cada ratón recibió 25 \mug de péptido NP de gripe, libre, mezclado con adyuvante de Freund incompleto (IFA), o conjugado. Los grupos de péptidos conjugados también recibieron 15 \mug de heparina. Después de tres semanas se recogieron los bazos. Las respuestas de CTL se midieron utilizando el ensayo de liberación de ^{51}Cr con esplenocitos que habían recibido dos rondas de estimulación in vitro con péptido libre.
La figura 2 muestra los resultados del experimento con NP de gripe. Específicamente, los ratones sin tratar así como los ratones que habían recibido el péptido NP de gripe solo no pudieron obtener respuestas de CTL específicas (a y b, respectivamente). Dos de los tres ratones que se inmunizaron con péptido NP de gripe en IFA consiguieron respuestas de CTL débiles (c). En cambio, todos los ratones que se inmunizaron con conjugados SynB3/NP de gripe (d) o SynB4/NP de gripe (e) consiguieron respuestas de CTL específicas, consiguiendo cinco de los seis ratones respuestas intensas de CTL. La figura 2 muestra que las respuestas obtenidas por los conjugados de péptidos NP de gripe son claramente más fuertes que las obtenidas mediante péptido libre o péptido libre en IFA, un adyuvante potente.
Ejemplo 2
Liberación de un antígeno de proteína recombinante
2
Captación celular
También se acopló la proteína rDPV con los vectores SynB3 y SynB4. El procedimiento de acoplamiento está descrito en los Protocolos. En primer lugar, se comparó la captación celular de rDPV libre y acoplada. La rDPV se marcó con un grupo fluorescente (NBD) con el fin de medir su captación. Los compuestos se incubaron con células K562 varias veces varias veces y se midió la captación celular utilizando citometría de flujo.
La incubación de las células con rDPV libre dio lugar a una captación muy baja a juzgar por el promedio de intensidad de fluorescencia (figura 3). Sin embargo, el acoplamiento de la proteína rDPV con los vectores SynB3 o SynB4 aumentó significativamente su penetración celular.
El aumento de la internalización era de 3 a 7 veces dependiendo del vector utilizado. Tal y como se observó para el epítopo de péptido, el vector SynB4 aumentó la penetración celular de rDPV ligeramente más que SynB3. La captación celular de rDPV-SynB3 alcanzó la saturación más rápidamente que con rDPV-SynB4 (30 minutos frente a 100 minutos).
Estudios de inmunización
Se inmunizaron ratones C57B1/6/c (hembras, 6-8 semanas) con 5 \mug de proteína DPV, conjugado SynB3/rDPV, o conjugado SynB4/rDPV mediante la ruta intradérmica (base de cola). El volumen de inyección fue de 100 \mul y también contenía 15 \mug de heparina. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 21 recogiéndose sus bazos el día 42 para la medición de respuestas de CTL específicas de DPV. Las respuestas de CTL se midieron utilizando el ensayo de liberación de ^{51}Cr con esplenocitos que habían recibido dos rondas de estimulación in vitro.
La figura 4 muestra las respuestas de CTL promedio para este experimento con rDPV. Los ratones sin tratar (rombos) no pudieron obtener respuestas de CTL específicas (donde una respuesta específica se define como más de un 10% de lisis específica), mientras que los ratones que recibían proteína rDPV sola consiguieron respuestas de CTL débiles (círculos). En cambio, los ratones que se inmunizaron con el conjugado SynB3/rDPV o el conjugado SynB4/rDPV consiguieron respuestas de CTL intensas (triángulos invertidos y cuadrados, respectivamente). La figura 4 muestra de este modo que la respuesta obtenida por los conjugados de rDPV es claramente más intensa que las obtenidas mediante proteína libre.
<110> SYNT:EM S.A.
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<120> Utilización de vectores peptídicos para mejorar la respuesta inmunitaria a antígenos
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<130>
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<140>
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<141>
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<150> EP 01402671.0
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<151> 2001-10-16
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<160> 22
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> SITIO
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<222> (1, 13)
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<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
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<220>
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<221> SITIO
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<222> (2)
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<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar; o un enlace
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<221> SITIO
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<222> (3)
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<223> Xaa puede ser cualquiera entre un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar, o un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica; o un enlace
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<221> SITIO
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<222> (4)
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<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
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<221> SITIO
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<222> (5)
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<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar; o un enlace
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<221> SITIO
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<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquiera entre un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar, o un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9, 12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica; o un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa es o bien (X3-X3, en que cada X3 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica), o bien (X1-X1, en que cada X1 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2, 4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Nter de un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1, 2, 4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cter de un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2..3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa es o bien X1-X1, en que cada X1, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6, 13, 14, 16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8, 15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa es o bien (X3-X3, en que cada X3 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica), o bien (X1-X1, en que cada X1 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Arg o un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Xaa Arg Leu Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa}
\sac{Xaa Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2..3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa es o bien X1-X1, en que cada X1, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien un enlace
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6, 13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gly o Ser o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8, 15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Arg o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9..10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa es o bien (X3-X3, en que cada X3 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica), o bien (X1-X1, en que cada X1 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Val o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Xaa Arg Leu Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Arg Phe Xaa Xaa Xaa Xaa}
\sac{Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2..3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa-Xaa es o bien un enlace, o bien Ala-Ala, o bien Gly-Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6, 13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Gly o Ser o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8, 15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Arg o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Thr o Ile o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Val o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Xaa Arg Leu Xaa Tyr Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa Xaa Xaa Xaa}
\sac{Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Val Ser Val}
\sac{Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ala Arg Leu Ala Tyr Arg Leu Leu Arg Phe Ala Ile Arg Val}
\sac{Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9, 10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ala Arg Leu Gly Tyr Arg Xaa Xaa Arg Phe Gly Xaa Arg Val}
\sac{Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr}
\sac{Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2, 4, 6, 10, 11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3, 7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8, 13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14..15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa es o bien (X3-X3, en que cada X3 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica), o bien (X1-X1, en que cada X1 representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16, 17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar, o bien, un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\sac{Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Lys o Arg o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3, 7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6, 10, 11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12, 16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14..15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa se selecciona entre Leu-Leu, Nle-Nle y Arg-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Arg o Leu o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Trp Xaa Phe Arg Xaa Xaa Tyr Arg Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa}
\sac{Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
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<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Lys o Arg o Ala
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> SITIO
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<222> (3, 7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> SITIO
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<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ser o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> SITIO
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<222> (14..16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa-Xaa-Xaa es o bien Arg-Arg-Ser, o bien Leu-Leu-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> SITIO
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<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Arg o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Trp Xaa Phe Arg Val Xaa Tyr Arg Gly Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa}
\sac{Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Trp Ala Phe Arg Val Ala Tyr Arg Gly Ile Arg Tyr Leu Leu Arg}
\sac{Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Arg Arg Tyr Ser Ile Gly Arg Tyr Ser Val Arg Phe Ser Trp}
\sac{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: NP de gripe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Tyr Gln Arg Thr Ala Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: SynB4/NP de gripe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser}
\sac{Arg Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: SynB3/NP de gripe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Thr Tyr Gln Arg Thr Arg}
\sac{Ala Leu Val}

Claims (20)

1. Conjugado de un antígeno acoplado a un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta, en el que dicho antígeno es un péptido, una proteína completa, o una subunidad de proteína del grupo que consiste en una proteína de un virus, una proteína de una bacteria, una proteína autóloga y una proteína del cáncer, y en el que un derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta es un péptido antibiótico de cadena \beta de mamífero que ha sido modificado para eliminar los enlaces disulfuro internos formados entre los residuos de cisteína, y opcionalmente modificado además mediante sustitución, inserción o eliminación de manera que retiene la capacidad del péptido de atravesar la membrana de una célula de mamífero.
2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el derivado lineal de un péptido antibiótico de cadena \beta tiene la estructura: Nter-Mid-Cter, en la que Mid es un péptido de fórmula (I):
X1/3-(X1/2 o un enlace)-(X o un enlace)-X3-(X1 o un enlace)-X1-X-X1/2- (X2/3 o un enlace)-Db-(X2/3 o un enlace)-X1/3 (SEC ID No: 1);
en la que Db es X3 - X3 o bien, X1 - X1; y
en la que Nter es un extremo N-terminal, o bien
X1/X3-X1-X1/2-X1-X3 (SEC ID No: 2);
y
en la que Cter es un extremo C-terminal, o bien
X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-X3 (SEC ID No: 3).
en las que:
- cada X1, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es no polar;
- cada X2, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es polar;
- cada X3, que puede ser idéntico o diferente, representa un residuo de aminoácido para el que la cadena lateral es básica;
- X es cualquiera de entre X1, X2 y X3;
en el que dicho péptido es lineal y retiene la capacidad de atravesar una membrana de mamífero;
o un fragmento del mismo que retiene la capacidad de atravesar una membrana de mamífero.
3. Conjugado según la reivindicación 2, en el que X1 se selecciona entre glicina, valina, norvalina, leucina, isoleucina, norleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano, X2 se selecciona entre serina, treonina, tirosina, asparaginas y glutamina y X3 se selecciona entre arginina y lisina.
4. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
R-(Xa)-R-L-X1/2-Y-X2/3-Db-(R o un enlace)-F-X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-R (SEC ID No: 4)
en la que Xa es X1-X1 o bien, un enlace.
5. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
R-(Xa)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-Db-R-F-(G/S/A)-X1-(R/S)-(V/T)-G-R (SEC ID No: 5)
6. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
R-(Xb)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-R-R-R-F-(G/S/A)-(T/I/V)-(R/S)-(V/T)-G-R (SEC ID No: 6)
en la que Xb es A-A, G-G o bien, un enlace.
7. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula seleccionada del grupo:
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-V-S-V-G-R (SEC ID No: 7); R-A-A-R-L-A-Y-R-L-L-R-F-A-I-R-V-G-R (SEC ID No: 8); R-A-A-R-L-G-Y-R_{n}-_{n}L-L-R-F-G-Z-R-V-G-R (SEC ID No: 9); R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-T-S-T-G-R (SEC ID No: 10);
y
R-R-L-S-Y-S-R-R-R-F (SEC ID No: 11)
en las que _{n}L es norleucina y Z es norvalina.
8. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
X1/3-X1-X1/2-X1-R-X1-X1/2-X2-R-X1-X1-S/R-X2-Db-X2/3-X2/3 (SEC ID NO: 12)
9. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-X1-(S/A)-Y-R-X1-X1-(S/R)-Y-Db'-(R/S)-(R/L/_{n}L) (SEC ID No: 13)
en la que Db' se selecciona entre L-L, _{n}L-_{n}L y R-R (donde _{n}L es norleucina).
10. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-Y-R-G-I-(S/R)-Y-R-R-R-(R/L) (SEC ID No: 14).
11. Conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho péptido tiene la fórmula seleccionada del grupo:
K-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (SEC ID No: 15); R-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (SEC ID No: 16); K-W-A-F-R-V-A-Y-R-G-I-R-Y-L-L-R-L (SEC ID No: 17);
y
A-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (SEC ID No: 18).
12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en virus de la gripe; adenovirus; virus de la hepatitis A, B y C; virus de la fiebre amarilla; virus de la fiebre del dengue; VIH-1 y VIH-2, HSV1 y HSV2; virus de Epstein-Barr; virus del herpes asociado a fibromatosis retroperitoneal, virus del papiloma humano, virus del herpes del sarcoma de Kaposi, y citomegalovirus (CMV).
13. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste en Mycobacterium tuberculosis, Acne vulgaris, Propionibacterium acnes, Chlamydia trachomatis, Babesia microti, Ehrlichia risticii, Borrelia burgdorferi, Leishmania aethiopica, Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus sapropyticus, y Trypanosoma cruzi.
14. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en Leucemia mielógena aguda (AML), Leucemia linfocítica aguda (ALL), Leucemia mielógena crónica (CML), Leucemia linfocítica crónica (CLL), Leucemia de células pilosas, Mieloma, y todos los tumores sólidos de todos los tipos de tejidos.
15. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para utilizar en un procedimiento de estímulo de la respuesta inmunitaria de un mamífero a un antígeno.
16. Composición que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 15 en un portador farmacéuticamente aceptable.
17. Procedimiento de preparación del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que comprende las etapas de:
(a) expresión en una célula huésped de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho conjugado y
(b) recuperación de dicho conjugado de dicha célula huésped.
18. Utilización de un conjugado según la reivindicación 12, en la fabricación de un medicamento destinado a estimular la respuesta inmunitaria de un mamífero a un virus seleccionado del grupo que consiste en: virus de la gripe; adenovirus; virus de la hepatitis A, B y C; virus de la fiebre amarilla; virus de la fiebre del dengue; VIH-1 y VIH-2, HSV1 y HSV2; virus de Epstein-Barr; virus del herpes asociado a fibromatosis retroperitoneal, virus del papiloma humano, virus del herpes del sarcoma de Kaposi, y citomegalovirus (CMV).
19. Utilización de un conjugado según la reivindicación 13, en la fabricación de un medicamento destinado a estimular la respuesta inmunitaria de un mamífero a una bacteria seleccionada del grupo que consiste en: Mycobacterium tuberculosis; Acne vulgaris; Propionibacterium acnes; Chlamydia trachomatis; Babesia microti; Ehrlichia risticii; Borrelia burgdorferi; Leishmania aethiopica; Candida albicans; Mycobacterium tuberculosis; Staphylococcus aureus; Staphylococcus pyogenes; Staphylococcus epidermis; Staphylococcus sapropyticus; y Trypanosoma cruzi.
20. Utilización de un conjugado según la reivindicación 14, en la fabricación de un medicamento destinado a estimular la respuesta inmunitaria de un mamífero a un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: Leucemia mielógena aguda (AML), Leucemia linfocítica aguda (ALL), Leucemia mielógena crónica (CML), Leucemia linfocítica crónica (CLL), Leucemia de células pilosas, Mieloma, y todos los tumores sólidos de todos los tipos de tejidos.
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