ES2260754T3 - Metodo para producir un conjunto de antigenos polipeptidicos combinatorios. - Google Patents

Metodo para producir un conjunto de antigenos polipeptidicos combinatorios.

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ES2260754T3 ES93916641T ES93916641T ES2260754T3 ES 2260754 T3 ES2260754 T3 ES 2260754T3 ES 93916641 T ES93916641 T ES 93916641T ES 93916641 T ES93916641 T ES 93916641T ES 2260754 T3 ES2260754 T3 ES 2260754T3
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Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN GRUPO DE ANTIGENOS DE POLIPEPTIDOS QUE TIENE SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DERIVADAS DE SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE UNA POBLACION DE VARIANTES DE UNA PROTEINA, O DE UNA PORCION DE LA MISMA, Y A METODOS PARA LA PRODUCCION DE DICHO GRUPO DE ANTIGENOS DE POLIPEPTIDOS. EN GENERAL EL METODO CONSISTE EN (I) SELECCIONAR UNA PROTEINA, O UNA PORCION DE LA MISMA, QUE PRESENTE UNA POBLACION DE N VARIANTES, REPRESENTADA POR LA FORMULA A{SUB,1}A{SUB,2}A{SUB,3} ... A{SUB,N2}A{SUB,N-1}A{SUB,N}, DONDE A{SUB,N} ES UN AMINOACIDO QUE OCURRE EN LA POSICION N DEL AMINOACIDO DE LA PROTEINA, O DE UNA PORCION DE LA MISMA; (II) DETERMINAR EL NUMERO DE VECES O{SUB,N}{SUP,AA} QUE TIENE LUGAR CADA AMINOACIDO EN CADA POSICION N DEL AMINOACIDO DE LOS N VARIANTES; (III) CALCULAR LA FRECUENCIA CON LA QUE OCURRE (O{SUB,N}{SUP,AA}/N){SUB,N} EN CADA TIPO DE AMINOACIDO EN CADA POSICION N DEL AMINOACIDO DE LOS N VARIANTES; Y (IV) GENERAR UN GRUPO DE ANTIGENOS DE POLIPEPTIDOS QUE TENGAN LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS REPRESENTADAS SUSTANCIALMENTE POR LA FORMULA A''{SUB,1}A''{SUB,2}A''{SUB,3} ... A''{SUB,N-2}A''{SUB,N-1}A''{SUB,N} DONDE A''{SUB,N} QUEDA DEFINIDO COMO UN TIPO DE AMINOACIDO QUE TIENE LUGAR CON UNA FRECUENCIA MAYOR QUE UNA SELECCIONADA EN LA POSICION DEL AMINOACIDO CORRESPONDIENTE DE LOS VARIANTES N.

Description

Método para producir un conjunto de antígenos polipeptídicos combinatorios.
Antecedentes del invento
La defensa del huésped es una característica clave de los sistemas inmunes de los vertebrados. Con este fin, los anticuerpos desempeñan numerosas funciones en la defensa contra patógenos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden neutralizar una molécula biológicamente activa, inducir la vía del complemento, estimular la fagocitosis (opsonización) o participar en citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC; del inglés, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity).
Si el anticuerpo se une a un sitio crítico para la función biológica de una molécula, la actividad de la molécula puede resultar neutralizada. De esta manera, anticuerpos específicos pueden bloquear la unión de un virus o un protozoo a la superficie de una célula. Similarmente, toxinas bacterianas y de otros tipos pueden unirse a, y ser neutralizadas por, los anticuerpos apropiados. Además, independientemente de si un anticuerpo unido neutraliza o no a su diana, el complejo antígeno-anticuerpo resultante puede interaccionar con otros mecanismos de defensa para dar lugar a la destrucción y/o eliminación del antígeno.
Los parásitos han desarrollado un conjunto de mecanismos para evitar una respuesta inmune. La variación antigénica es quizás la más estudiada de las estrategias de evasión, en parte porque dicha variación hace que el desarrollo de vacunas sea especialmente difícil. Generalmente, hay dos modos en que puede producirse la variación antigénica: deriva antigénica y cambio antigénico. La deriva antigénica es relativamente sencilla. Surgen mutaciones puntuales en genes que codifican antígenos de patógenos, lo que altera algunos de los epítopos del antígeno de modo que la memoria inmunológica del huésped hacia el antígeno original no es desencadenada por el mutante. Puesto que la inmunidad hacia una variante no asegura necesariamente inmunidad hacia otras, la acumulación de dichas mutaciones puntuales en una población de patógenos puede dar lugar a múltiples infecciones en el mismo huésped. Se ha hallado deriva antigénica en la mayoría de los patógenos (incluyendo virus, bacterias y protozoos), variando su importancia entre especies individuales.
Muchos virus son capaces de una gran variación antigénica, y se ha identificado un gran número de cepas serológicamente distintas de esos virus. Como resultado, una cepa particular de un virus se vuelve insensible a la inmunidad generada en la población por una infección o vacunación previa. Por ejemplo, el progreso del desarrollo de la vacuna del HIV-1 ha venido dificultado por la variabilidad entre diferentes productos de aislamiento de HIV-1 en cuanto a la secuencia de aminoácidos. Esta variabilidad es particularmente elevada en la proteína gp120 de la envoltura externa, que es la diana primaria para los anticuerpos que neutralizan la infectividad viral [Robey et al. (1.986), PNAS 83: 7.023; Putney et al. (1.986), Science 234: 1.392; y Rusche et al. (1.987), PNAS 84: 6.924]. Estudios en seres humanos y ratones han revelado una pequeña región de la gp120, denominada bucle V3 o determinante principal de neutralización (PND; del inglés, principal neutralizing determinant), que comprende aproximadamente 35 restos entre dos cisteínas invariantes entrelazadas por disulfuro [Cys-303 a Cys-338: nomenclatura de HIV-1 de Takahashi et al. (1.992), Science 255: 333], que provoca los principales anticuerpos neutralizantes hacia el virus [Palker et al. (1.988), PNAS 85: 1.932; Rusche et al. (1.988), PNAS 85: 3.198; y Goudsmit et al. (1.988), PNAS 85: 4.478]. Aunque esta misma región es una de las más variables en cuanto a secuencia entre los diferentes productos de aislamiento clonales [Takahashi et al. (1.992), Science 255: 333], el análisis de las secuencias de aminoácidos de este dominio reveló una conservación superior al 80 por ciento de los aminoácidos en 9 de 14 posiciones de la porción central del bucle V3, lo que sugiere que hay constricciones en la variabilidad del bucle V3 [LaRosa et al. (1.990), Science 249: 932]. Sin embargo, a causa de esta variabilidad, los anticuerpos neutralizantes provocados por el PND de un producto de aislamiento no neutralizan generalmente los productos de aislamiento con PNDs de diferente secuencia de aminoácidos.
Asimismo, los intentos para controlar la influenza mediante vacunación han tenido hasta la fecha un éxito limitado y están dificultados por los cambios continuos del antígeno superficial principal de los influenzavirus, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA), contra los que se dirigen principalmente los anticuerpos neutralizantes [Caton et al. (1.982), Cell 31: 417; Cox et al. (1.983), Bulletin W.H.O. 61: 143; E. A. Eckert (1.973), J. Virology 11: 183]. Los influenzavirus tienen la capacidad de experimentar un elevado grado de variación antigénica en un corto periodo de tiempo. Es esta propiedad del virus lo que hace difícil controlar los brotes estacionales de influenza por todas las poblaciones humanas y animales.
Por medio de estudios serológicos y de secuenciación, se han demostrado dos tipos de variaciones antigénicas en influenzavirus A. El cambio antigénico tiene esencialmente lugar cuando HA o NA, o ambas, son sustituidas en una nueva nueva cepa vírica por una nueva HA o NA antigénicamente distinta. La aparición de nuevos subtipos creados por cambio antigénico da normalmente lugar a pandemias de infección.
La deriva antigénica se produce en influenzavirus de un subtipo dado. Los análisis de secuencias de aminoácidos y nucleótidos sugieren que la deriva antigénica se produce a través de una serie de mutaciones secuenciales, lo que da lugar a cambios de aminoácidos en el polipéptido y a diferencias en la antigenicidad del virus. La acumulación de varias mutaciones por medio de deriva antigénica da finalmente lugar a un subtipo capaz de eludir la respuesta inmune de un gran número de sujetos previamente expuestos a un subtipo similar. De hecho, se han seleccionado experimentalmente nuevas variantes similares mediante el paso de virus en presencia de pequeñas cantidades de anticuerpos por ratones o embriones de pollo. La deriva antigénica da lugar a brotes o epidemias de infección menos graves. También se ha observado deriva antigénica en influenzavirus B.
Las vacunas de antígeno purificado dirigidas contra el virus de la hepatitis B, actualmente en ensayos clínicos, consisten generalmente en antígenos de un solo subtipo vírico. Lo razonable de esta decisión ha sido que los anticuerpos específicos tanto de la región S como de la región pre-S(2), que han mostrado ser algo eficaces en cuanto a neutralizar el virus de la hepatitis B, son esencialmente específicos de grupo. Sin embargo, esta lógica no toma en consideración la influencia del subtipo viral en el reconocimiento de células T. Se ha demostrado que la respuesta murina de células T específicas de pre-S(2) es muy específica de subtipo [H. Milic et al. (1.990), J. Immunol. 144: 3.535].
El protozoo unicelular Plasmodium falciparum es el patógeno predominante que causa la malaria en seres humanos. La infección comienza cuando se inocolan esporozoitos, presentes en las glándulas salivales de mosquitos Anopheles, en la sangre de huéspedes susceptibles. Los esporozoitos penetran rápidamente en los hepatocitos, en los que luego se desarrollan hasta esquizontes hepáticos. Después de la maduración, los merozoitos infecciosos se liberan en la sangre del huésped e invaden los eritrocitos, comenzando un nuevo ciclo esquizogónico que se asocia con los síntomas clínicos de la malaria. El número de casos mundiales de malaria previstos por la Organización Mundial de la Salud es más de 100 millones.
Se ha comunicado un éxito limitado en la protección de monos frente a la infección por ciertas especies de Plasmodium mediante la inmunización con antígenos superficiales purificados, expresados durante al menos una fase del ciclo vital del parásito. Por ejemplo, un candidato atractivo para una vacuna de fase sanguínea es la proteína merozoítica denominada p190, o antígeno esquizonte polimórfico [Herra et al. (1.992), Infection and Immunity 60; 154-158; Merkli et al. (1.984), Nature 311: 379-382; Mackay et al. (1.985), EMBO J. 4: 3.823-3.829]. p190 es una glicoproteína grande que es sintetizada y ampliamente procesada durante la formación de merozoitos, siendo su producto de procesamiento de 80 kDa la principal proteína de cubierta de los merozoitos maduros. Sondas de anticuerpos monoclonales contra p190 y análisis de secuencias primarias revelan que el antígeno contiene secuencias polimórficas que dan lugar a variación antigénica entre especies y subespecies de Plasmodium.
Sumario del invento
Este invento se refiere a un conjunto de antígenos polipeptídicos que tienen secuencias de aminoácidos derivadas de secuencias de aminoácidos de una población de variantes de una proteína, o una porción de la misma, y a métodos para producir el conjunto de antígenos polipeptídicos. En general, el método comprende:
a.
seleccionar una proteína, o una porción de la misma, que presenta una población de N variantes, representada por la fórmula
A_{1} A_{2} A_{3} \ ... \ A_{n-2} A_{n-1} A_{n},
en la que A_{n} es un aminoácido que se encuentra en la posición n de aminoácido de la proteína, o la porción de la misma;
b.
determinar el número de veces O^{aa}_{n} que cada tipo de aminoácido se encuentra en cada posición n de aminoácido de las N variantes;
c.
calcular la frecuencia de aparición (O^{aa}_{n}/N)_{n} de cada tipo de aminoácido en cada posición n de aminoácido de las N variantes; y
d.
sintetizar un conjunto de antígenos polipeptídicos que tienen secuencias de aminoácidos representadas sustancialmente por la fórmula
A'_{1} A'_{2} A'_{3} \ ... \ A'_{n-2} A'_{n-1} A'_{n}
en la que A'_{n} se define como un tipo de aminoácido que se presenta con una frecuencia mayor que una frecuencia seleccionada en la correspondiente posición de aminoácido de las N variantes.
En una realización preferida, el conjunto de antígenos polipeptídicos es generado determinando una secuencia oligonucleotídica degenerada que tiene un número mínimo de combinaciones de nucleótidos en cada posición n de codón, combinaciones que incluyen al menos los codones que codifican cada tipo de aminoácido A'_{1} a A'_{n}. El oligonucleótido degenerado es incorporado a un gen expresable para crear un conjunto de genes. El conjunto de genes se expresa en un sistema de expresión apropiado para generar el conjunto de antígenos polipeptídicos:
A'_{1} A'_{2} A'_{3} \ ... \ A'_{n-2} A'_{n-1} A'_{n}
Típicamente, n variará de 8 aproximadamente 150. La frecuencia umbral seleccionada para la inclusión de un aminoácido en el conjunto de antígenos polipeptídicos en una posición dada puede ser ajustada al mismo valor para todas las posiciones de aminoácido. Alternativamente, el umbral de frecuencia seleccionado puede ser ajustado individualmente para cada posición de aminoácido y puede variar de posición a posición. Típicamente, la frecuencia umbral variará de 5 a 15%. Esto significa que para la inclusión de un aminoácido concreto en una posición dada del conjunto de antígenos polipeptídicos generados, el aminoácido debe aparecer en esa posición en más del 5-15% de las N variantes (es decir, O^{aa}_{n} /N debe ser superior a 5-15%).
El conjunto de antígenos polipeptídicos puede corresponder a una secuencia peptídica entera de una proteína o sólo a una porción de la misma. Además, no es necesario que la secuencia variante esté contigua en la proteína; puede estar dispersa en una sola proteína o subunidad proteica o en más de una proteína o subunidad proteica.
El conjunto de polipéptidos puede ser utilizado como una vacuna artificial. Los antígenos pueden ser administrados al organismo huésped en un vehículo fisiológicamente aceptable y bajo un régimen de dosificación suficiente para crear una inmunidad protectora frente a una población de variantes del antígeno. Por ejemplo, si la proteína es un componente de un patógeno, la proteína o porción de la misma puede incluir secuencias que comprendan uno o más epítopos neutralizantes para que el conjunto de antígenos polipeptídicos, cuando se administre como un inmunógeno, de lugar a la producción de anticuerpos neutralizantes hacia el patógeno por un organismo huésped.
Alternativamente, la forma así como la vía de administración del conjunto de antígenos polipeptídicos pueden ajustarse para que sean tolerigénicos y de este modo crear una tolerancia artificial a un antígeno proteico variante, o una porción del mismo, en un organismo huésped.
Descripción detallada del invento
Una infección, sea clínicamente evidente o no, por un patógeno puede conducir a inmunidad, y parece que la inmunidad a patógenos de la misma estructura antigénica es de larga duración. Sin embargo, la reinfección por el patógeno puede ser causada por variantes con diferencias antigénicas menores. Además, puesto que la inmunidad es muy específica de epítopos, la inmunidad artificialmente inducida hacia un patógeno está a menudo limitada por la notable variación antigénica del patógeno. Por lo tanto, la capacidad de un patógeno para experimentar deriva antigénica da lugar a menudo a la ineficacia de una vacuna convencional.
Este invento proporciona un método para generar un conjunto de antígenos polipeptídicos derivados de una proteína (o una porción de la misma) que se expresa con cierto grado de heterogeneidad de secuencias entre variantes natural o artificialmente inducidas de la proteína. La finalidad es proporcionar una mezcla de antígenos que pueda ser utilizada para inmunizar frente a las variantes y, preferiblemente, a las posibles variantes desconocidas o nuevas que puedan surgir.
De acuerdo con el método de este invento (Reivindicaciones 1-11), la frecuencia de aparición para cada tipo de aminoácido es determinada para cada posición de aminoácido de la proteína (o una porción de la proteína) en la población de variantes. Los aminoácidos que aparecen en cada posición con una frecuencia superior a una frecuencia predeterminada en la población de variantes (por ejemplo, 5%, 10%, 15%, etc,) son seleccionados para inclusión, para generar el conjunto de antígenos polipeptídicos.
En general, la longitud de los polipéptidos variará de 8 a 150 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 aminoácidos.
En la realización preferida, el conjunto de antígenos polipeptídicos es producido por medio de un oligonucleótido degenerado. La secuencia del oligonucleótido degenerado puede ser determinada con objeto de obtener el número mínimo de combinaciones de nucleótidos para cada codón necesario para dar lugar a cada tipo de aminoácido seleccionado para inclusión (es decir, aquellos que se presentan con una frecuencia superior a la seleccionada en la correspondiente posición n de aminoácido de la población de variantes).
La mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ser enzimáticamente ligada a secuencias génicas para que el conjunto de antígenos polipeptídicos sea expresable como polipéptidos individuales o como un conjunto de proteínas de fusión más grandes que contenga el conjunto de antígenos polipeptídicos en él. Alternativamente, el conjunto de antígenos polipeptídicos puede ser generado por síntesis peptídica organoquímica. Cada ciclo de copulación de aminoácidos puede ser llevado a cabo para obtener una determinada heterogeneidad de tipos de aminoácido (incluyendo más de un aminoácido activado en las operaciones apropiadas de la síntesis) en una posición de aminoácido dada. La mezcla de aminoácidos se basa en el análisis de frecuencias de las N variantes. Alternativamente, la mezcla de aminoácidos puede ser determinada basándose en la combinación de nucleótidos (codones) generada al preparar el oligonucleótido degenerado.
El efecto combinatorio que surge del uso de secuencias oligonucleotídicas degeneradas dará típicamente lugar a ciertos tipos de aminoácido que no se encuentran en la población original de variantes. Esto proporciona la generación de polipéptidos, dentro del conjunto global de antígenos polipeptídicos, que pueden no haber surgido en la naturaleza. Puesto que estas combinaciones de nucleótidos se basan inicialmente en variantes conocidas, los codones que surgen para aminoácidos adicionales representan potencialmente mutaciones más probables en la naturaleza que aquéllas creadas artificialmente mediante un análisis estructural de la proteína. De esta manera, el conjunto de antígenos polipeptídicos puede dar lugar a inmunidad frente a una gran variedad de variantes potenciales así como frente a variantes conocidas de la proteína.
Para analizar las secuencias de una población de variantes de una proteína, las secuencias de aminoácidos de interés pueden ser alineadas con relación a una homología de secuencias. La presencia o ausencia de aminoácidos de una secuencia alineada de una variante concreta está en relación con una elegida longitud de consenso de una secuencia de referencia, que puede ser real o artificial. Con objeto de mantener la máxima homología en una alineación de secuencias, las deleciones en la secuencia de una variante con respecto a la secuencia de referencia pueden ser representadas por un hueco de aminoácido (*), mientras que las mutaciones por inserción en la variante con respecto a la secuencia de referencia pueden ser descartadas y dejadas fuera de la secuencia de la variante cuando se alinea. Por ejemplo, a continuación se muestran dos posibles alineaciones de tres secuencias del bucle V3 de productos de aislamiento de HIV de tropismo conocido [Hwang et al. (1.991), Science 253: 71-76].
Las secuencias:
1
pueden ser alineadas como:
2
en que los restos 15 y 16 de la cepa HTLV-IIIB original están incluidos en la alineación, o, alternativamente, como:
3
en que los restos 15 y 16 de la cepa HTLV-IIIB original son excluidos de la alineación de las secuencias.
Dadas N variantes de la proteína, el número de veces O^{aa}_{n} que un aminoácido (aa) dado se encuentra en una posición n dada, la frecuencia de aparición de ese aminoácido en esa posición n, se calcula mediante O^{aa}_{n}/N. La frecuencia con que tiene lugar una deleción de aminoácido en una posición dada puede ser también un factor en este cálculo.
Alternativamente, si no se consideran las deleciones en el cálculo de frecuencias, puede ser entonces deseable que el valor de N usado en el cálculo para una posición n de aminoácido dada deba ser el número de variantes menos el número de variantes en que un hueco de aminoácido está presente en esa posición dada. De este modo, en el primer ejemplo de alineación, O^{Q}_{16}/N = 0,333 (33%) y O^{\text{*}}_{16}/N = 0,667 (67%) si el hueco de aminoácido es definido como un tipo
de aminoácido, y O^{Q}_{16}/N = 1,0 (100%) si no lo es.
Basándose en la determinación de la frecuencia de aparición de tipos de aminoácido en cada posición n de la población de variantes, se determina un "valor umbral" para la inclusión de un tipo de aminoácido concreto en la correspondiente posición n para el conjunto de antígenos polipeptídicos. Puede entonces crearse una secuencia oligonucleotídica degenerada. La secuencia oligonucleotídica degenerada es diseñada para que tenga el número mínimo de combinaciones de nucleótidos necesario, en cada posición de codón, que dé lugar a codones para cada tipo de aminoácido seleccionado basándose en el valor umbral elegido.
De esta manera, si la población de N variantes viene representada por la fórmula general:
A_{1} A_{2} A_{3} \ ... \ A_{n-2} A_{n-1} A_{n},
en la que cada variable A_{n} representa un aminoácido que se encuentra en la n^{a} posición de aminoácido de la proteína, mediante la fórmula general siguiente puede entonces representarse un conjunto de antígenos polipeptídicos generados a partir de la secuencia oligonucleotídica degenerada:
A'_{1} A'_{2} A'_{3} \ ... \ A'_{n-2} A'_{n-1} A'_{n}
en la que cada variable A'_{n} representa un tipo de aminoácido codificado por una posible combinación de nucleótidos en la correspondiente posición n de codón de la secuencia oligonucleotídica degenerada.
La frecuencia umbral utilizada para seleccionar tipos de aminoácidos para inclusión en el conjunto de antígenos polipeptídicos y, en consecuencia, para determinar la secuencia oligonucleotídica degenerada, puede ser aplicada uniformemente a cada posición de aminoácido. Por ejemplo, puede aplicarse un valor umbral de 15 por ciento a través de la secuencia proteica completa. Alternativamente, el valor umbral puede ser ajustado independientemente para cada posición n de aminoácido. Por ejemplo, el valor umbral puede ser ajustado en cada posición n de aminoácido con objeto de incluir los tipos de aminoácido que se encuentran más comúnmente, por ejemplo, aquellos que aparecen en esa posición en al menos el 90% de las N variantes.
En algunos casos, puede que sea deseable aplicar otro criterio a la determinación de una secuencia oligonucleotídica degenerada, que comprenda restringir la degeneración de una posición codónica para que no pueda surgir más de un número dado de tipos de aminoácido en la correspondiente posición de aminoácido del conjunto de antígenos polipeptídicos. Por ejemplo, la secuencia degenerada de una posición codónica n dada puede ser restringida de modo que se encuentren aminoácidos seleccionados en al menos aproximadamente el 11% de los polipéptidos del conjunto de antígenos polipeptídicos. Esto significa que todas las posibles combinaciones de nucleótidos de ese codón degenerado no darán lugar a más de 9 aminoácidos diferentes en la posición. De esta manera, la frecuencia con que aparece un aminoácido concreto en una posición dada dependerá de la posible degeneración de la correspondiente posición codónica. Preferiblemente, el número será 11,1 (9 aminoácidos diferentes), 12,5 (8 aminoácidos diferentes), 16,6
(6 aminoácidos diferentes), 25 (4 aminoácidos diferentes) o 50 (2 aminoácidos diferentes).
Asimismo, los criterios utilizados para elegir la población de variantes para el análisis de frecuencias pueden ser determinados mediante factores tales como la esperada utilidad del conjunto de antígenos polipeptídicos y factores relativos a la vacunación o la tolerancia. Por ejemplo, el análisis de una secuencia proteica variante puede ser restringido a subpoblaciones de una población mayor de variantes de la proteína basándose en factores tales como datos epidemiológicos, incluyendo la presencia geográfica, o, alternativamente, en familias alélicas conocidas (tales como variantes del alelo DQ de HLA de clase II). Asimismo, en el caso de componentes proteicos de patógenos, la población de variantes seleccionada para el análisis puede ser escogida basándose en tropismos conocidos para un concreto organismo huésped susceptible.
Hay muchos modos mediante los cuales se puede generar el conjunto de antígenos polipeptídicos a partir de la secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de un oligonucleótido degenerado puede ser llevada a cabo en un sintetizador automático de DNA, y los oligonucleótidos sintéticos pueden ser luego ligados a un gen apropiado para expresión. Si se desea, puede construirse un codón de inicio (ATG) en la secuencia. Las secuencias oligonucleotídicas degeneradas pueden ser incorporadas a una construcción génica con objeto de permitir la expresión de una proteína que consista esencialmente en el conjunto de antígenos polipeptídicos. Alternativamente, el conjunto de antígenos polipeptídicos puede expresarse como partes de proteínas de fusión. El banco de genes creado puede ser sometido a un apropiado control transcripcional mediante la manipulación de secuencias reguladoras transcripcionales. Puede que sea deseable crear proteínas de fusión que contengan una secuencia líder que dirija el transporte de las proteínas recombinantes por las apropiadas vías celulares secretoras.
Se conocen diversos métodos para sintetizar químicamente polidesoxinucleótidos, incluyendo la síntesis en fase sólida que, como la síntesis de péptidos, ha sido totalmente automatizada en sintetizadores de DNA comercialmente asequibles (véanse la Patente de EE.UU. nº 4.598.049 de Itakura et al., la Patente de EE.UU. nº 4.458.066 de Caruthers et al., y las Patentes de EE.UU. n^{os} 4.401.796 y 4.373.071 de Itakura).
El fin de un conjunto degenerado de oligonucleótidos es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de antígenos polipeptídicos. Generalmente no será práctico sintetizar cada oligonucleótido de esta mezcla uno tras otro, particularmente en el caso de un gran número de posibles variantes. En estos casos, la mezcla puede ser sintetizada mediante una estrategia por la cual se añade una mezcla de unidades de copulación (monómeros nucleotídicos) en las apropiadas posiciones de la secuencia de modo que la mezcla oligonucleotídica final incluya las secuencias que codifican el conjunto deseado de antígenos polipeptídicos. Las técnicas convencionales de síntesis de DNA se aprovechan de grupos protectores sobre los desoxinucleótidos reactivos de modo que, tras la incorporación a un oligómero en crecimiento, la ulterior copulación con ese oligómero resulte inhibida hasta que se proporcione una operación de desprotección subsiguiente. De este modo, para crear una secuencia degenerada, pueden hacerse reaccionar simultáneamente más de un tipo de desoxinucleótido con el oligonucleótido en crecimiento durante un ciclo de copulación, sea premezclando nucleótidos o sea programando el sintetizador para que suministre volúmenes apropiados de disoluciones de reaccionantes que contienen nucleótidos. Para cada posición de codón que corresponda a una posición de aminoácido que sólo tenga un tipo de aminoácido en el conjunto final de antígenos polipeptídicos, cada oligonucleótido del conjunto degenerado de oligonucleótidos tendrá una secuencia de nucleótidos idéntica. En una posición de codón que corresponda a una posición de aminoácido en la que se encuentren más de un tipo de aminoácido en el conjunto final, el conjunto degenerado de oligonucleótidos comprenderá secuencias de nucleótidos que darán lugar a codones que codificarán esos tipos de aminoácido en esa posición del conjunto. En ciertos casos, debido a otras combinaciones que puede tener la secuencia de nucleótidos degenerada, los oligonucleótidos resultantes tendrán codones dirigidos a tipos de aminoácido distintos de los diseñados para que estuvieran presentes basándose en el análisis de la frecuencia de aparición en la variante. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es bien conocida en la técnica [véanse, por ejemplo, S. A. Narang (1.983), Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1.981) en Recombinant DNA, Proc. 3rd. Cleveland Sympos. Macromolecules, compilado por A. G. Walton, Amsterdam: Elsevier páginas 273-289; Itakura et al. (1.984), Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1.984), Science 198: 1.056; e Ike et al. (1.983), Nucleic Acid Res. 11: 477].
Para ilustrar más esta técnica, como se conoce bien en este campo técnico, los genes que codifican proteínas especifican las secuencias de aminoácidos por el orden de los desoxirribonucleótidos en el DNA, pero más directamente por la secuencia de ribonucleótidos en sus transcritos de mRNA. Una importante característica del código genético es que todos los aminoácidos salvo dos son codificados por más de un triplete de nucleótidos (codón). El código genético (en términos de desoxirribonucleótidos) puede ser representado del modo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
4
Como se indicó anteriormente, una estrategia para sintetizar el oligonucleótido degenerado implica hacer reaccionar simultáneamente más de un tipo de desoxinucleótido durante un ciclo dado de copulación. Por ejemplo, si fuera a aparecer una histidina (His) o treonina (Thr) en una posición de aminoácido dada, la síntesis del conjunto de oligonucleótidos podría ser llevada a cabo del modo siguiente (suponiendo que la síntesis se desarrollara de 3' a 5'): el oligonucleótido en crecimiento sería primero copulado con un desoxinucleótido de timidina 5'-protegido, desprotegido y luego hecho reaccionar simultáneamente con una mezcla de un desoxinucleótido de adenina 5'-protegido y un desoxinucleótido de citidina 5'-protegido. Tras la desprotección de los oligonucleótidos resultantes, se hace reaccionar simultáneamente otra mezcla de un desoxinucleótido de adenina 5'-protegido y un desoxinucleótido de citidina 5'-protegido. El conjunto resultante de oligonucleótidos contendrá ACT (Thr), AAT (Asn), CAT (His) o CCT (Pro) en esa posición codónica. De esta manera, cuando se varía más de un nucleótido de un codón, el uso de monómeros nucleotídicos en la síntesis puede dar potencialmente lugar a una mezcla de codones que incluye, pero no se limita a, los que se prevé que estén presentes mediante el análisis de frecuencias.
Puede emplearse la Tabla 1 para calcular secuencias de nucleótidos degeneradas que tengan posibles combinaciones que correspondan a codones para tipos de aminoácido dados de modo que, en las posiciones codónicas degeneradas, se minimice el número de tipos de aminoácido fuera de los seleccionados por el análisis de frecuencias. Para uso a la hora de diseñar secuencias de oligonucleótidos degeneradas, se proporcionan los siguientes símbolos y significados de la IUPAC:
TABLA 2 
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Símbolo  \+  \hskip1cm  \+  Corresponde   a \cr  A \+ \+
A:adenina\cr  C \+ \+ C:citosina\cr  G \+ \+ G:guanina\cr  T \+ \+
T:timina\cr  M \+ \+ A   o C\cr  R \+ \+ A   o G\cr  W \+ \+ A   o
T\cr  S \+ \+ C   o G\cr  Y \+ \+ C   o T\cr  K \+ \+ G   o T\cr  V
\+ \+ A   o C o G; no T\cr  H \+ \+ A   o C o T; no G\cr  D \+ \+ A 
 o G o T; no C\cr  B \+ \+ C   o G o T; no A\cr  N \+ \+ A o C   o G
o T o
desconocido\cr}
Para crear un hueco de aminoácido (deleción) en una posición de aminoácido dada, una porción de la mezcla de oligonucleótidos puede ser dejada aparte durante los apropiados ciclos de adiciones de nucleótidos (es decir, tres ciclos de copulación por codón) con objeto de que falte una posición codónica concreta por completo, y ser luego añadida de vuelta a la mezcla al comienzo de la síntesis de la subsiguiente posición codónica.
La secuencia de codificación completa para el conjunto de antígenos polipeptídicos puede ser sintetizada mediante este método. En algunos casos, puede que sea deseable sintetizar fragmentos oligonucleotídicos degenerados mediante este método, que son luego ligados a secuencias de DNA invariantes sintetizadas separadamente para crear un oligonucleótido degenerado más largo.
Asimismo, no es necesario que las posiciones de aminoácido que contienen más de un tipo de aminoácido en el conjunto generado de antígenos polipeptídicos sean contiguas en la secuencia polipeptídica. En ciertos casos, puede que sea deseable sintetizar un número de fragmentos oligonucleotídicos degenerados, correspondiendo cada fragmento a un fragmento distinto de la secuencia de codificación para el conjunto de antígenos polipeptídicos. Cada fragmento oligonucleotídico degenerado puede ser luego enzimáticamente ligado a las apropiadas secuencias de DNA invariantes que codifican tramos de aminoácidos para los que sólo se presenta un tipo de aminoácido en cada posición del conjunto de antígenos polipeptídicos. De este modo, la secuencia de codificación degenerada final es creada mediante la fusión de ambas secuencias, la degenerada y la invariante.
Estos métodos son útiles cuando las mutaciones basadas en la frecuencia se concentran en porciones del antígeno polipeptídico que se va a generar y es deseable sintetizar secuencias nucleotídicas invariantes largas separadamente de la síntesis de las secuencias nucleotídicas degeneradas.
Además, el oligonucleótido degenerado puede ser sintetizado como fragmentos degenerados que son luego ligados entre sí (es decir, pueden crearse salientes complementarios o puede usarse una ligación de extremos romos). Es habitual sintetizar fragmentos solapantes como cadenas complementarias, y luego hibridar y rellenar las restantes regiones de cadena sencilla de cada cadena. En los casos que requieran la hibridación de cadenas complementarias, será generalmente deseable que la unión sea en una zona de poca degeneración.
Las secuencias de nucleótidos derivadas de la síntesis de una secuencia oligonucleotídica degenerada y que codifican el conjunto de antígenos polipeptídicos pueden ser utilizadas para producir el conjunto de antígenos polipeptídicos por medio de procesos microbianos. La ligación de las secuencias en una construcción génica, tal como un vector de expresión, y la transformación o transfección de huéspedes, sean eucarióticos (levaduras, aves o mamíferos) o sean procarióticos (células bacterianas), son procedimientos estándares utilizados para producir otras proteínas bien conocidas, tales como, por ejemplo, insulina, interferones, hormona de crecimiento humana, IL-1, IL-2 y similares. Pueden emplearse procedimientos similares, o modificaciones obvias de los mismos, para preparar el conjunto de antígenos polipeptídicos por medios microbianos o tecnología de cultivos tisulares de acuerdo con el presente invento.
Como se indicó anteriormente, el conjunto degenerado de oligonucleótidos que codifica el conjunto de antígenos polipeptídicos, en forma de un banco de construcción génicas, puede ser ligado a un vector adecuado para expresión en células procarióticas, células eucarióticas o ambas. Los vehículos de expresión para la producción del conjunto de antígenos polipeptídicos de este invento incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados para la expresión del conjunto degenerado de oligonucleótidos incluyen plásmidos de los tipos: pBR322, plásmidos pEMBL, plásmidos pEX, plásmidos pBTac y plásmidos pUC para expresión en células procarióticas, tal como
E. coli.
Existen diversos vectores para la expresión de proteínas recombinantes en levadura. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52 e YRP17 son vehículos de clonación y expresión útiles para la introducción de construcciones genéticas en S. cerevisiae [véase, por ejemplo, Broach et al. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, compilado por M. Inouye, Academic Press, página 83). Estos vectores pueden replicarse en E. coli a causa de la presencia del ori de pBR322, y en S. cerevisiae a causa del determinante de replicación del plásmido de 2 \mum de levadura. Además, pueden utilizarse marcadores de resistencia a fármacos, tal como a ampicilina.
Los vectores de expresión de mamífero preferidos contienen tanto secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucarióticas que se expresan en células eucarióticas. Los vectores derivados de pSV2gpt, pSV2neo, pSV2dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucarióticas. Estos vectores son modificados con secuencias de plásmidos bacterianos tales como pBR322 para facilitar la replicación y la selección por resistencia a fármacos en células tanto procarióticas como eucarióticas. Alternativamente, pueden utilizarse derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1; del inglés, bovine papilloma virus-1) y el virus de Epstein-Barr (pHEBo y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucarióticas. Los diferentes métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos huéspedes son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procarióticas como eucarióticas, así como para procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning, 2ª edición, compilado por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.989).
Para que se exprese el banco de construcciones génicas del conjunto degenerado de oligonucleótidos, puede que sea deseable incluir elementos reguladores de transcripción y traducción y otras secuencias no codificantes en la construcción para expresión. Por ejemplo, pueden incorporarse elementos reguladores que incluyan potenciadores y promotores constitutivos e inducibles.
En algunos casos, será necesario añadir un codón de inicio (ATG) a la secuencia oligonucleotídica degenerada. Es bien sabido en la técnica que una metionina en la posición N-terminal puede ser enzimáticamente escindida mediante el uso de la enzima metionina aminopeptidasa (MAP). Se ha clonado MAP de E. coli [Ben-Bassat et al. (1.987), J. Bacteriol. 169: 751-757] y de Salmonella typhimurium y se ha demostrado su actividad in vitro sobre proteínas recombinantes [Miller et al. (1.987), PNAS 84: 2.718-2.722]. Por lo tanto, la eliminación de una metionina N-terminal, si se desea, puede ser llevada a cabo in vivo haciendo que se exprese el conjunto de antígenos polipeptídicos en un huésped que produce MAP (por ejemplo, E. coli o CM89 o S. cerevisiae), o in vitro mediante el uso de MPA purificada (por ejemplo, el procedimiento de Miller et al.).
Alternativamente, las secuencias de codificación para los antígenos polipeptídicos pueden ser incorporadas como parte de un gen de fusión que incluya una proteína endógena para expresión por el microorganismo. Por ejemplo, la proteína de cápsida VP6 de rotavirus puede ser utilizada como una proteína portadora inmunológica para el conjunto de antígenos polipeptídicos, sea en forma monómera o sea en forma de una partícula vírica. El conjunto de secuencias oligonucleotídicas degeneradas puede ser incorporado a una construcción génica de fusión que incluya secuencias de codificación para una proteína estructural tardía de virus vaccinia, para producir un conjunto de virus recombinantes que expresen proteínas de fusión que comprendan el conjunto de antígenos polipeptídicos como parte del virión. Con el uso de proteínas de fusión de bucle V-3/ antígeno superficial de la hepatitis B se ha demostrado que también pueden utilizarse viriones de la hepatitis B recombinantes en esta función. Similarmente, pueden crearse construcciones quiméricas que codifiquen proteínas de fusión que contengan el conjunto de antígenos polipeptídicos y la proteína de la cápsida de poliovirus, para potenciar la inmunogenicidad del conjunto de antígenos polipeptídicos. El uso de dichos sistemas de expresión de proteínas de fusión para establecer un conjunto de antígenos polipeptídicos tiene la ventaja de que a menudo se puede provocar la proliferación de células B en respuesta al inmunógeno [véanse, por ejemplo, la Publicación EP nº 0259149; Evans et al. (1.989), Nature 339: 385; Huang et al. (1.988), J. Virol. 62: 3.855; y Schlienger et al. (1.992), J. Virol. 66: 2]. Puede utilizarse el sistema de péptidos antigénicos múltiples (MAP; del inglés, multiple antigen peptide) para vacunas basadas en péptidos, mediante el cual el conjunto de antígenos polipeptídicos se obtiene directamente a partir de la síntesis organoquímica de los péptidos sobre un núcleo de lisinas con ramificación oligómera [véanse, por ejemplo, Posnett et al. (1.988), JBC 263: 1.719; y Nardelli et al. (1.992), J. Immunol. 148: 914]. Determinantes antigénicos extraños pueden ser también expresados y presentados por células bacterianas.
Las técnicas para preparar genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de DNA que codifican diferentes secuencias polipeptídicas es llevada a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, empleando términos de punta roma o punta escalonada para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, compleción de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación enzimática. Alternativamente, el gen de fusión puede ser sintetizado mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de DNA automatizados.
Un planteamiento alternativo para generar el conjunto de antígenos polipeptídicos es llevar directamente a cabo la síntesis peptídica. En cada posición codónica n del oligonucleótido degenerado, puede determinarse cada posible combinación de nucleótidos y diseñarse el correspondiente aminoácido para inclusión en la correspondiente posición de aminoácido del conjunto de antígenos polipeptídicos. De esta manera, se puede dirigir la síntesis de una secuencia polipeptídica degenerada en la cual se produzca divergencia de secuencia en aquellas posiciones de aminoácido en la que se codifica más de un aminoácido por la correspondiente posición codónica del oligonucleótido degenerado. La síntesis organoquímica de polipéptidos es bien conocida y puede ser llevada a cabo mediante procedimientos tales como la síntesis peptídica en estado sólido usando sintetizadores de proteínas automatizados.
La síntesis de polipéptidos es llevada generalmente a cabo a través de la condensación del grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido para formar un enlace peptídico. Se puede construir una secuencia repitiendo la condensación de restos de aminoácido individuales en prolongación gradual, de una manera análoga a la síntesis de oligonucleótidos. En dichas condensaciones, los grupos amino y carboxilo que no van a participar en la reacción pueden ser bloqueados con grupos protectores que son fácilmente introducidos, estables frente a las reacciones de condensación y selectivamente eliminables del péptido completado. De esta manera, el procedimiento global comprende generalmente protección, activación, copulación y desprotección. Si un péptido implica aminoácidos con cadenas laterales que pueden reaccionar durante la condensación, las cadenas laterales pueden ser también reversiblemente protegidas, realizándose la eliminación en la fase final de la síntesis.
Con una síntesis exitosa de un polipéptido grande mediante una estrategia lineal se deben alcanzar recuperaciones casi cuantitativas en cada operación química. Muchos esquemas de síntesis peptídica automatizada sacan partido de la fijación de la cadena polipeptídica en crecimiento a un soporte de resina polímera insoluble de modo que el polipéptido puede ser liberado de los subproductos y los reaccionantes en exceso mediante lavado después de cada operación de reacción [véanse, por ejemplo, Merrifield (1.963), J.A.C.S. 85: 2.149; Chang et al. (1.978), Int. J. Peptide Protein Res. 11: 246; Barany y Merrifield, The Peptides, volumen 2, 1.979, New York, Academic Press, páginas 1-284; J. P. Tam (1.988), PNAS 85: 5.409; y Tam et al., Patente de EE.UU. nº 4.507.230]. Por ejemplo, un primer aminoácido es fijado a una resina por su grupo carboxílico mediante una unión escindible, desbloqueado por su lado amínico y copulado con un segundo aminoácido activado que lleva un grupo a-amino protegido. El dipéptido protegido resultante es desbloqueado para obtener un extremo amino libre y es copulado con un tercer aminoácido N-protegido. Después de muchas repeticiones de estas operaciones, el polipéptido completo es escindido del soporte de resina y es apropiadamente desprotegido.
Para generar el conjunto de antígenos polipeptídicos, pueden hacerse reaccionar simultáneamente más de un tipo de aminoácido N-protegido con la cadena polipeptídica en crecimiento en cada ciclo de copulación, para crear la deseada secuencia de aminoácidos degenerada en cada posición de aminoácido. En una realización, el conjunto de polipéptidos incluirá sólo aquellos aminoácidos que están presentes en cualquier posición n de la población de variantes con una frecuencia superior a la frecuencia umbral predeterminada. Alternativamente, se puede diseñar primero el oligonucleótido degenerado, y luego determinar los aminoácidos codificados por la combinación de codones e incluir todos los aminoácidos en la síntesis química. Por ejemplo, a nivel de síntesis peptídica puede crearse un codón degenerado en la posición codónica n, que tenga la secuencia MMT y, por lo tanto, codifique una Thr (ACT), una Asn (AAT), una His (CAT) o una Pro (CCT), al hacer reaccionar simultáneamente los cuatro tipos de aminoácido N-protegido con el extremo amínico libre del péptido en crecimiento, unido a la resina. De esta manera, se crearán cuatro subpoblaciones de péptidos, cada una definible por el tipo de aminoácido presente en la posición n de aminoácido que corresponde a la posición codónica n.
Puesto que el aminoácido que se añade al polipéptido unido a la resina está protegido, el crecimiento de la cadena peptídica termina tras la adición del aminoácido protegido hasta la subsiguiente operación de desbloqueo. Los expertos en la técnica reconocerán que, a causa de las posibles diferencias de reactividad de los diversos compuestos análogos de aminoácido, puede que sea deseable utilizar relaciones no equimolares de los tipos de aminoácido cuando se hacen reaccionar simultáneamente más de un tipo de aminoácido, con objeto de obtener relaciones equimolares de subpoblaciones. Alternativamente, puede que sea deseable dividir el polipéptido unido a la resina en partes alícuotas, cada una de las cuales es hecha reaccionar con un distinto tipo de aminoácido, recombinándose los productos polipeptídicos antes de la siguiente reacción de copulación. Esta técnica puede ser aplicada para crear un hueco de aminoácido en una subpoblación, simplemente dejando a un lado una parte alícuota apropiada durante un ciclo de copulación y luego recombinando todos los polipéptidos unidos a resina antes del siguiente ciclo de copulación. Además, es evidente que, dados los muy diferentes grupos bloqueadores y activadores disponibles, la síntesis química del polipéptido puede llevarse a cabo en dirección N-terminal a C-terminal, o C-terminal a N-terminal.
El conjunto generado de antígenos polipeptídicos puede ser covalente o no covalentemente modificado con materiales no proteicos tales como lípidos o hidratos de carbono, para potenciar la inmunogenicidad o la solubilidad. Se entiende que el presente invento incluye todas las citadas modificaciones químicas del conjunto de antígenos polipeptídicos con tal que los antígenos peptídicos modificados conserven sustancialmente todas las propiedades antigénicas/inmunogénicas de la mezcla originaria.
El conjunto generado de antígenos polipeptídicos puede ser también copulado con, o incorporado a, una partícula vírica, un virus replicante u otro microorganismo con objeto de potenciar la inmunogenicidad. El conjunto de antígenos polipeptídicos puede ser químicamente fijado a la partícula vírica o el microorganismo, o a una porción inmunogénica de los mismos.
Hay un gran número de agentes entrelazantes químicos que son conocidos por los expertos en la técnica. Para el presente invento, los agentes entrelazantes preferidos son agentes entrelazantes heterobifuncionales que pueden ser utilizados para unir proteínas de forma gradual. Los agentes entrelazantes heterobifuncionales proporcionan la capacidad para diseñar métodos de copulación más específicos para conjugar proteínas, reduciendo por ello las apariciones de reacciones secundarias indeseadas, tal como polímeros homoproteicos. En la técnica se conoce una gran variedad de agentes entrelazantes heterobifuncionales. Estos incluyen 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC); éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB); 4-(p-maleimidofenil)-butirato de succinimidilo (SMPB); hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMTP); 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo (SPDP); y 6-[3-(2-piridilditio)-propionato]-hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP). Los agentes entrelazantes que tienen restos de N-hidroxisuccinimida pueden ser obtenidos como compuestos análogos de N-hidroxisulfosuccinimida, los cuales tienen generalmente una mayor solubilidad en agua. Además, los agentes entrelazantes que tienen puentes disulfuro en la cadena enlazante pueden ser alternativamente sintetizados como derivados alquílicos con objeto de reducir la cantidad de escisión de conectores in vivo.
La introducción de un antígeno en un animal inicia una serie de procesos que culminan en una inmunidad tanto celular como humoral. Por convención, la propiedad de una molécula que permite inducir una respuesta inmune es llamada inmunogenicidad. La propiedad de poder reaccionar con un anticuerpo que ha sido inducido es llamada antigenicidad. Los anticuerpos capaces de reaccionar cruzadamente con dos o más antígenos diferentes lo pueden hacer en virtud de cierto grado de similitud estructural y química entre los determinantes antigénicos (o "epítopos") de los antígenos. Un inmunógeno proteico está normalmente compuesto de diversos determinantes antigénicos. Por lo tanto, la inmunización con una proteína da lugar a la formación de moléculas de anticuerpo con diferentes especificidades, número de
anticuerpos diferentes que depende del número de determinantes antigénicos y de su inmunogenicidad inherente.
Las proteínas son muy inmunogénicas cuando se inyectan a un animal para el que no son componentes normales ("propios"). Por el contrario, los péptidos y otros compuestos con pesos moleculares inferiores a aproximadamente 5.000 dáltones (denominados "haptenos") no provocan generalmente por sí mismos la formación de anticuerpos. Sin embargo, si estos antígenos de molécula pequeña son copulados primero con un antígeno inmunogénico más grande, tal como una proteína, pueden generarse anticuerpos que se unan específicamente a epítopos situados sobre las moléculas pequeñas. La conjugación de haptenos con proteínas portadoras puede ser llevada a cabo del modo anteriormente descrito.
Cuando fuera necesario, la modificación de dicho ligando para preparar un inmunógeno debería tener en cuenta el efecto sobre la especificidad estructural del anticuerpo. Es decir, a la hora de elegir un sitio de un ligando para su conjugación con un portador tal como una proteína, el sitio seleccionado es elegido para que la administración del inmunógeno resultante proporcione anticuerpos que reconozcan el ligando original. Además, no sólo debe el anticuerpo reconocer el ligando original, sino que deben quedar características significativas de la porción de ligando del inmunógeno para que el anticuerpo producido después de la administración del inmunógeno distinga más probablemente compuestos estrechamente relacionados con el ligando que también puedan estar presentes en la muestra del paciente. Además, los anticuerpos deberían tener elevadas constantes de unión.
Pueden prepararse vacunas que comprendan el conjunto generado de antígenos polipeptídicos, y variantes de los mismos que tengan propiedades antigénicas, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichas vacunas pueden ser preparadas como productos inyectables, por ejemplo, disoluciones o suspensiones líquidas. Pueden también prepararse formas sólidas para disolución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección. Opcionalmente, la preparación puede ser también emulsionada. Puede mezclarse el ingrediente o los ingredientes antigénicos activos con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares, y combinaciones de los mismos, son ejemplos de excipientes adecuados. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsivos, agentes tamponadores del pH, y adyuvantes tales como hidróxido de aluminio y muramil-dipéptido o variaciones del mismo. En el caso de péptidos, la copulación con moléculas mayores, tal como hemocianina de lapa Fissurella (KLH; del inglés, keyhole limpet hemocyanin), potencia a veces la inmunogenicidad. Las vacunas son convencionalmente administradas parenteralmente o por inyección, por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los vehículos y agentes aglutinantes tradicionales incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles y triglicéridos. Pueden formarse supositorios a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%, preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Las formulaciones orales pueden incluir excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico y similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de disoluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación continua o polvos, y contener de aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.
Los compuestos activos pueden ser formulados en la vacuna como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales por adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos), que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico y fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como los ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden proceder también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, los hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico y férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína y similares. Una composición de vacuna puede incluir péptidos que contengan epítopos de células T cooperadoras en combinación con fragmentos proteicos que contengan el dominio neutralizante principal. Por ejemplo, se han mapeado varios de estos epítopos en la envoltura del HIV y se ha mostrado que estas regiones estimulan la proliferación y la liberación de linfocinas desde linfocitos. La disposición de estos dos epítopos en una vacuna que comprende un conjunto generado de antígenos polipeptídicos procedentes del análisis de productos de aislamiento de HIV-1 puede dar lugar a la estimulación de las respuestas inmunes tanto humoral como celular. Además, se dispone de portadores y adyuvantes comerciales para potenciar la inmunomodulación de poblaciones tanto de células B como de células T
en cuanto a un inmunógeno (por ejemplo, el sistema Imject Supercarrier™, Pierce Chemical, nº 77151G del catálogo).
Alternativamente, una composición de vacuna puede incluir un compuesto que actúe para aumentar la respuesta inmune general. Uno de dichos compuestos es la interleucina 2 (IL-2), de la que se ha comunicado que potencia la inmunogenicidad por estimulación inmune general [Nunberg et al. (1.988) en New Chemical and Genetic Approaches to Vaccination, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU.]. La IL-2 puede ser copulada con los polipéptidos del conjunto generado de antígenos polipeptídicos, para potenciar la eficacia de la vacunación.
Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que resulten terapéuticamente eficaces e inmunogénicas. La cantidad que se ha de administrar depende del sujeto que se trata, la capacidad del sistema inmune de los sujetos para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las cantidades exactas de ingrediente activo que se necesitan administrar dependen del juicio del médico y son propias de cada individuo. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida por una inyección subsiguiente u otra administración en intervalos de una o dos semanas.
Los antígenos que inducen tolerancia son denominados tolerágenos para distinguirlos de los inmunógenos, que generan inmunidad. La exposición de un individuo a antígenos inmunogénicos estimula la inmunidad específica y, para la mayoría de las proteínas inmunogénicas, las exposiciones subsiguentes generan respuestas secundarias potenciadas. Por contraste, la exposición a un antígeno toleragénico no sólo no consigue inducir una inmunidad específica, sino que además inhibe la activación de linfocitos mediante la subsiguiente administración de formas inmunogénicas del mismo antígeno. Muchos antígenos extraños pueden ser inmunógenos o tolerágenos dependiendo de la forma físicoquímica, la dosis y la vía de administración. Esta capacidad para manipular las respuestas a antígenos puede ser clínicamente explotada para aumentar o suprimir la inmunidad específica. Por ejemplo, en el contexto de la tecnología de trasplantes de órganos, puede que sea deseable hacer tolerante a un receptor de trasplante con un conjunto de antígenos polipeptídicos derivado del análisis de frecuencias de sub-haplotipos conocidos de un péptido de clase II (es decir, tales como los productos alélicos DQ o DR) presente en el tejido trasplantado, con objeto de minimizar el rechazo. También está dentro de la equivalencia de este invento que el conjunto de antígenos polipeptídicos pueda ser químicamente copulado, o incorporado como parte de una proteína de fusión, con un agente apoptótico, por ejemplo, un agente que provoque la desregulación de la expresión de C-myc, o una toxina celular tal como el toxoide diftérico, de modo que se provoque la muerte celular programada de una manera antigénicamente específica.
Por lo tanto, para un experto en la técnica sería rutinario determinar el apropiado régimen de administración necesario para inducir tolerancia al conjunto de antígenos polipeptídicos del presente invento.
El ejemplo siguiente sirve para ilustrar adicionalmente el presente invento.
El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1; del inglés, human immunodeficiency virus type 1), el agente causativo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), muestra una diversidad de secuencias muy acusada entre los diferentes productos de aislamiento. Se ha mostrado que la glicoproteína gp120 de la envoltura externa del HIV-1, que facilita la unión del virión a CD4, es la diana principal de los anticuerpos neutralizantes. Estudios en seres humanos y ratones han revelado una pequeña región de esta proteína, denominada bucle V3, entre los restos de cisteína 303 y 338, que provoca los principales anticuerpos neutralizantes hacia el virus. Se ha mostrado que polipéptidos recombinantes o sintéticos que contienen epítopos del bucle V3 de un producto de aislamiento de HIV-1 inducen títulos relativamente elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de cepa. Sin embargo, incluso sustituciones únicas de aminoácido en el bucle V3 son suficientes en ciertos casos para reducir mucho la unión al anticuerpo, lo que está de acuerdo con la estricta especificidad de los anticuerpos neutralizantes hacia el bucle V3.
En la Tabla 3 se exponen los resultados obtenidos del análisis de frecuencias de secuencias del bucle V3 de una población de productos de aislamiento de HIV-1 obtenidos en gran medida de pacientes con sida en Norteamérica [Wolinsky et al. (1.992), Science 225: 1.134; LaRosa et al. (1.990), Science 249: 931; y Holley et al. (1.991), PNAS 88: 6.800]. La alineación de cada secuencia variante es relativa a la secuencia de referencia:
5
en que cys-1 de la secuencia de referencia corresponde a cys-303 de gp120 de acuerdo con la nomenclatura aquí utilizada.
TABLA 3 Análisis de frecuencias de productos norteamericanos de aislamiento de HIV-1
6
7
A partir de la frecuencia de los datos de aparición calculados en la Tabla 3, se han determinado los tipos de aminoácido más comúnmente presentes en cada posición que están colectivamente representados en al menos el 90% de las variantes analizadas. Se seleccionó el correspondiente codón degenerado para cada una de las posiciones de aminoácido y se utilizó para determinar una secuencia oligonucleotídica degenerada, que incluye los codones para 10 restos de aminoácido que flanquean las secuencias del bucle V3 por cada lado, representada por la secuencia general:
8
Este código de nucleótidos degenerado es para antígenos polipeptídicos representados por la secuencia general:
9
en la que
Xaa_{1} es Thr o Ile;
Xaa_{2} es Asn o Ser;
Xaa_{3} es Arg o Lys;
Xaa_{4} es Arg o Lys;
Xaa_{5} es Arg, Gly o Ser;
Xaa_{6} es Asn, Pro, Ser, Arg, Thr o His;
Xaa_{7} es Met o Ile;
Xaa_{8} es Lys o Arg;
Xaa_{9} es Val o Ala;
Xaa_{10} es Ile o Phe;
Xaa_{11} es His o Tyr;
Xaa_{12} es Ala o Thr;
Xaa_{13} es Ile o Thr;
Xaa_{14} es Arg, Asn, Glu o Gly;
Xaa_{15} es Gly, Arg, His, Gln, Asp o Glu;
Xaa_{16} es Phe o Ile;
Xaa_{17} es Ala, Thr, Val o Ile;
Xaa_{18} es Asn o Asp; y
Xaa_{19} es Lys o Gln.
Como se describió anteriormente, el oligonucleótido degenerado puede ser enzimáticamente ligado con las apropiadas secuencias de DNA para crear un banco génico que codifique proteínas que comprendan el conjunto de antígenos polipeptídicos.
Asimismo, se analizaron los tipos de aminoácido más comúnmente presentes, en cada posición, que están colectivamente representados en al menos el 80% de las variantes. En este caso, la determinada secuencia oligonucleotídica degenerada está representada por la secuencia general:
10
y corresponde al conjunto de antígenos polipeptídicos representado por la secuencia general siguiente:
11
en la que
Xaa_{1} es Lys o Arg;
Xaa_{2} es Ser o Gly;
Xaa_{3} es His, Arg, Pro, Thr o Asn;
Xaa_{4} es Ile o Met;
Xaa_{5} es Phe o Ile;
Xaa_{6} es Thr o Ala;
Xaa_{7} es Gly o Glu;
Xaa_{8} es Glu, Asp, Arg, Lys o Gln; y
Xaa_{9} es Ile o Val.
Cuando la población de variantes del bucle V3 de HIV-1 analizadas fue seleccionada de modo que incluyera secuencias de productos de aislamiento de HIV-1 de origen ugandés [Oram et al. (1.991), AIDS Research and Human Retroviruses 7: 605], se determinó la siguiente secuencia oligonucleotídica degenerada:
12
Este conjunto codifica el siguiente conjunto de antígenos polipeptídicos representado por la fórmula general:
13
en la que
Xaa_{1} es Thr o Ser;
Xaa_{2} es Asn o Tyr;
Xaa_{3} es Asn o Lys;
Xaa_{4} es Asn o Lys;
Xaa_{5} es Thr o Ile;
Xaa_{6} es Arg o Ile;
Xaa_{7} es Lys o Gln;
Xaa_{8} es Ser, Gly o Arg;
Xaa_{9} es Ile, Met o Leu;
Xaa_{10} es His, Asn, Arg, Ser, Pro o Thr;
Xaa_{11} es Ile, Met o Leu;
Xaa_{12} es Arg, Lys o Gln;
Xaa_{13} es Ala o Val;
Xaa_{14} es Phe, Leu, Ile, Met o Val;
Xaa_{15} es Tyr, Phe, His o Leu;
Xaa_{16} es Gly, Lys, Arg o Glu;
Xaa_{17} es Ile, Lys o Arg;
Xaa_{18} es Ile o Thr;
Xaa_{19} es Asp o Tyr;
Xaa_{20} es Arg o Gly; y
Xaa_{21} es His o Tyr.
Para sintetizar esta secuencia oligonucleotídica degenerada, se produjeron los siguientes oligonucleótidos sintéticos:
14
Estos oligonucleótidos se ensamblaron del modo siguiente:
140
Se prepararon disoluciones madre de cada uno de los anteriores oligonucleótidos al disolver el oligonucleótido en agua estéril. Partes alícuotas de las disoluciones madre fueron tratadas con quinasa y fueron luego mezcladas entre sí para hibridación en tampón Klenow y agua estéril. La mezcla de reacción fue calentada a 94ºC y fue lentamente enfriada 1ºC cada 15 segundos. Luego se añadieron dGTP, dCTP, dTTP, dATP, fragmento Klenow, ATP y ligasa a la mezcla de reacción. La mezcla fue incubada a temperatura ambiental durante la noche. La mezcla fue luego sometida a precipitación con etanol al 95%, y el sedimento de DNA fue lavado con etanol al 70%, secado y disuelto en 20 microlitros de agua estéril.
Las secuencias de DNA aisladas fueron luego multiplicadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) usando CR11 y CR12, respectivamente, como los amplímeros 5' y 3'. El amplímero 5' tiene sitios EcoRI, NcoI y PvuII y el amplímero 3' tiene un sitio SalI que permite la clonación en diversos sistemas de expresión.
Los productos de PCR fueron aislados por electroforesis en gel, limpiados con "Gene Clean" (Bio101), y cortados con las enzimas de restricción EcoRI y SalI. El banco de DNA restringido fue luego clonado en el plásmido pFLAG (IBI FLAG Biosystem, número de catálogo: IB 13000) tratado con EcoRI y SalI y con fosfatasa intestinal de ternera. El banco de vectores así producido codifica una fusión, en marco, del gen del péptido FLAG y variantes del gen V3. Tras una inducción con IPTG, se produjo un banco de polipéptidos de fusión compuestos del péptido FLAG (extremo amínico) y variantes del bucle V3 (extremo carboxílico).
Los productos de PCR (banco génico del bucle V3) pueden ser también cortados con PvuII y SalI y ligados en el sistema de expresión pEZZmp18 o pEBBmp18 [Stahl et al. (1.989), J. Immunol. Meth. 124: 43] para crear un banco de proteínas de fusión que comprenden una proteína estafilocócica y las secuencias de V3. Los tres plásmidos contienen el ori de pBR322 para conducir la replicación en el organismo huésped apropiado y el ori de F1 para facilitar la mutagénesis dirigida al sitio.
Por ejemplo, los productos de PCR anteriormente generados fueron cortados con NcoI y SalI y fueron ligados al oligonucleótido de doble cadena:
15
que codifica una secuencia de reconocimiento de escisión por enteroquinasa (EKCR; del inglés, enterokinase cleavage recognition) en marco con la secuencia de codificación del bucle V3.
El gen de fusión EKCR/bucle V3 resultante fue luego ligado en los sitios EcoRI y SalI de pEZZ-18 (Pharmacia, nº 27-4810-01 del catálogo) usando los salientes EcoRI y SalI creados al tratar el gen de fusión EKCR/V3 con las correspondientes endonucleasas de restricción. El vector pEZZ-18 contiene la secuencia señal de la proteína A y dos dominios "Z" sintéticos que se basan en el dominio "B" ligante de IgG de la proteína A. Esta construcción permite que proteínas "ZZ" de fusión sean secretadas por E. coli y tengan una solubilidad aumentada en ambientes acuosos, y también facilita la purificación, por afinidad, de la proteína de fusión en columnas de IgG. De este modo, el gen de fusión resultante codifica una proteína de fusión ZZ/EKCR/bucle V3. Las secuencias de la proteína A pueden ser eliminadas de V3 por tratamiento de la proteína de fusión resultante con enteroquinasa; véanse Su et al. (1.992), Biotechniques 13: 756; y Forsberg et al. (1.992), J. Protein Chem. 11: 201.
Se generaron las construcciones de pEZZ-18 y se usaron para transformar células competentes. Luego se purificaron las proteínas de fusión resultantes. En resumen, células que llevaban la construcción ZZ/EKCR/V3 fueron cultivadas en medio YT 2x. Las células fueron recolectadas en la fase estacionaria tardía de crecimiento y fueron resuspendidas en tampón de sonicación (acetato sódico 20 mM, pH de 5,5, PMSF 1 mM, CHAPS 5 mM, glicerol al 10%, 2 \mug/ml de aprotinina). Después de una sonicación, el lisado fue centrifugado a 10.000 rpm en un rotor Beckman JA-17 durante 15 minutos. El sobrenadante fue luego sometido a purificación por afinidad en una columna que comprendía IgG, de acuerdo con los protocolos del fabricante. El bucle V3 purificado por afinidad fue sometido a una purificación ulterior por electroforesis en gel de poliacrilamida y electroelución.
El conjunto de antígenos polipeptídicos puede ser utilizado para generar sueros policlonales en conejos mediante procedimientos de inmunización estándares, y la mezcla de anticuerpos policlonales puede ser purificada. Pueden usarse ensayos de infectividad de HIV y de unión gp120/CD4 para probar la eficacia del conjunto de antígenos polipeptídicos en cuanto a provocar una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta de anticuerpos) contra una variante de HIV.
Los sueros policlonales pueden ser también utilizados para aplicar artificialmente una presión mutacional selectiva sobre el virus con objeto de comprimir el calendario evolutivo. Por ejemplo, pueden marcarse células infectadas con HIV que sean capaces de mutar de una manera que permita que la nueva variante escape del reconocimiento por los sueros policlonales. Estas variantes serán secuenciadas, y serán incorporadas a un análisis de poblaciones de un modo ponderado para ser incluidas en un subsiguiente conjunto de antígenos polipeptídicos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Crea, Roberto
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: ANTÍGENOS POLIPEPTÍDICOS COMBINATORIOS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: LAHIVE y COCKFIELD
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 60 STATE STREET, SUITE 510
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: BOSTON
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: MASSACHUSETTS
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 02109
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con ordenador personal IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: TEXTO ASCII
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-JUNIO-1.993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/900,123
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-JUNIO-1.992
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DeConti, Giulio A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 31,503
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: CTE-003PC
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (617) 227-7400
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (617) 227-5941
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro}
\sac{Gly Arg Ala Leu Tyr Thr Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln}
\sac{Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Lys Ile Arg Ile Gln Arg}
\sac{Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg}
\sac{Gln Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Ile Gly Pro}
\sac{Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln}
\sac{Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 4:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Lys Ile Arg Ile Gly Pro}
\sac{Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala}
\sac{His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro}
\sac{Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln}
\sac{Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 165 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Thr o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asn o Ser"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg o Lys"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg o Lys"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg, Gly o Ser"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asn, Pro, Ser, Arg, Thr o His"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Met o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Lys o Arg"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Val o Ala"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile o Phe"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 31
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es His o Tyr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ala o Thr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile o Thr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 34
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg, Asn, Glu o Gly"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Gly, Arg, His, Gln, Asp o Glu"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 36
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Phe o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 37
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ala, Thr, Val o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 39
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asn o Asp"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 42
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Lys o Gln"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 165 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Lys o Arg"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ser o Gly"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es His, Arg, Pro, Thr o Asn"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile o Met"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Phe o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Tre o Ala"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 34
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Gly o Glu"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Glu, Asp, Arg, Lys o Gln"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 37
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile o Val"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 9:
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 162 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Thr o Ser"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asn o Tyr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asn o Lys"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asn o Lys"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Thr o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg o Ile"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Lys o Gln"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ser, Gly o Arg"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile, Met o Leu"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es His, Asn, Arg, Ser, Pro o Thr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile, Met o Leu"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg, Lys o Gln"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ala o Val"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Pre, Leu, Ile, Met o Val"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 31
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Tyr, Phe, His o Leu"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 34
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Gly, Lys, Arg o Glu"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile, Lys o Arg"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 36
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Ile o Thr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Asp o Tyr"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Arg o Gly"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 43
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es His o Tyr"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGAATTCT CCATGGTTCA GCTGAACGAA TCTGTTGAC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGACGGGWG CAGTTGATGT CAACAGATTC GTTCA 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCAACTGCW CCCGTCCGWA CAAMAASAYC AKAMAGRGMN TSMVCMTSGG CCCGG 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGCTYACT GCAACATCTC TCGTGCTAAA TGGAACA 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGTCGACA GTGTTGTTCC ATTTAGCACG AGAG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCCGACG ACGATGACAA ATC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCTGCTGCT ACTGTTTAGG TAC 
\hfill
23

Claims (11)

1. Un método para producir un conjunto de antígenos polipeptídicos que tienen secuencias de aminoácidos derivadas de una proteína o una porción de la misma, que comprende las operaciones de:
a.
seleccionar la proteína o la porción de la misma, que presenta una población de Z variantes, representada por la fórmula
A_{1} A_{2} A_{3} \ ... \ A_{n-2} A_{n-1} A_{n},
en la que A_{n} es un aminoácido que se encuentra en la posición n de aminoácido de la proteína o de la porción de la misma;
b.
determinar el número de veces O^{aa}_{n} que cada tipo de aminoácido se encuentra en cada posición n de aminoácido de las Z variantes;
c.
calcular la frecuencia de aparición (O^{aa}_{n}/Z)_{n} de cada tipo de aminoácido en cada posición n de aminoácido de las Z variantes; y
d.
sintetizar el conjunto de antígenos polipeptídicos que tienen secuencias de aminoácidos representadas sustancialmente por la fórmula
A'_{1} A'_{2} A'_{3} \ ... \ A'_{n-2} A'_{n-1} A'_{n}
en la que A'_{n} se define como un tipo de aminoácido que se presenta con una frecuencia mayor que una frecuencia seleccionada en la correspondiente posición de aminoácido de las Z variantes.
2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el tamaño del conjunto de antígenos polipeptídicos varía de 8 a 150 aminoácidos.
3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que la frecuencia seleccionada es 5%.
4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que la frecuencia seleccionada es 10%.
5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que la proteína es un componente inmunogénico de un patógeno.
6. Un método de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que el componente inmunogénico del patógeno contiene uno o más epítopos antigénicos neutralizantes.
7. Un método de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que la proteína es un componente de un virus.
8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que la proteína es un componente de HIV-1.
9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que la proteína es gp120 o una porción de la misma.
10. Un método de acuerdo con la Reivindicación 9, en el que la porción de una proteína es el bucle V3 de gp120.
11. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el conjunto de antígenos polipeptídicos es generado al
i)
sintetizar una secuencia oligonucleotídica degenerada que tiene un número mínimo de combinaciones de nucleótidos en cada posición codónica n, combinaciones que incluyen al menos los codones que codifican cada tipo de aminoácido A'_{1} a A'_{n}; y
ii)
hacer que se exprese el oligonucleótido degenerado en un sistema de expresión para producir el conjunto de antígenos polipeptídicos:
A'_{1} A'_{2} A'_{3} \ ... \ A'_{n-2} A'_{n-1} A'_{n}.
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