ES2328507T3

ES2328507T3 - Proteinas de envoltura del vih heterooligomericas.

Info

Publication number: ES2328507T3
Application number: ES05855755T
Authority: ES
Inventors: Leonidas Stamatatos
Original assignee: Seattle Biomedical Research Institute
Current assignee: Seattle Biomedical Research Institute
Priority date: 2004-12-29
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2009-11-13
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: EP1831247A2; ATE435234T1; WO2006071933A2; EP2088155A1; EP1831247B1; WO2006071933A3; DE602005015256D1; CN101094862A; DK1831247T3; ZA200706186B; HK1107998A1; US20080248063A1

Abstract

Vacuna que comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el heterotrímero de envoltura del VIH comprende por lo menos dos monómeros de glicoproteína Env diferentes.

Description

Proteínas de envoltura de VIH heterooligoméricas.

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional US nº 60/640.329, presentada el 29 de diciembre de 2004.

Declaración de los derechos de licencia gubernamentales

El gobierno de los Estados Unidos posee una licencia pagada sobre la presente invención y el derecho en circunstancias limitadas de exigir al propietario de la patente que conceda licencia a terceros en términos razonables, tal como se especifica en los términos de la concesión nº R01 AI047708, concedida por los National Institutes of Health.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de envoltura recombinantes heterooligoméricas del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y a sus aplicaciones, por ejemplo como vacunas.

Antecedentes de la invención

Cada vez resulta más evidente que una metodología de vacunación eficaz contra el VIH debe desencadenar tanto anticuerpos neutralizantes (NAb) como respuestas antivíricas mediadas por células. A pesar de que el papel protector de las respuestas por anticuerpos neutralizantes de novo que siguen poco después de la infección por VIH/VIS sigue siendo objeto de controversia, existen abundantes pruebas de que, si existen NAb en el momento de la exposición al virus, los mismos proporcionarán una protección significativa al individuo vacunado.

Los estudios previos indican que, para que una vacuna contra el VIH resulte eficaz, la misma debe desencadenar no solo títulos elevados de NAb, sino también anticuerpos que puedan neutralizar un panel lo más variado posible de aislados primarios de VIH. La generación de títulos elevados de NAb durante la inmunización depende en gran medida de la metodología de inmunización. Sin embargo, el desarrollo de NAb de reacción cruzada depende principalmente de la estructura del inmunogén (un derivado de la glicoproteína de envoltura del VIH). El inmunogén no sólo tiene que contener epítopos de neutralización que se conserven entre los aislados primarios de VIH heterólogos, sino que dichos epítopos tienen que estar expuestos sobre la superficie del inmunogen, de tal modo que den lugar a una estimulación eficaz del sistema inmune.

A pesar de la significativa variabilidad de aminoácidos de la envoltura del VIH, algunos dominios de dicha proteína deben permanecer estructuralmente inalterados a lo largo del tiempo y entre los diversos subtipos con el fin de que dicha proteína vírica conserve su funcionalidad. Entre dichos dominios se encuentran los que participan en la interacción de la envoltura del VIH con las moléculas receptoras y correceptoras presentes en las membranas de las células diana. Unas regiones adicionales conservadas están presentes en la parte extracelular del gp41 (para VIH-1; gp36 para VIH-2), que es esencial para la etapa de fusión entre la envoltura vírica y la membrana de la célula diana, y dentro del bucle V3, que contiene determinantes críticos para la función de envoltura. Dichas regiones de envoltura estructural y funcionalmente conservadas son accesibles a los anticuerpos. Por ejemplo, se han aislado (raramente) anticuerpos monoclonales (MAbs) que pueden neutralizar muchos aislados primarios diversos, aunque no todos, a partir de pacientes infectados por VIH, y reconocer epítopos localizados en dichas regiones conservadas (Burton et al, 1994; Calarese et al, 2003; Conley et al, 1994; Moulard et al, 2002; Muster et al, 1993; Pantophlet et al, 2003; Purtscher et al, 1996; Purtscher et al, 1994; Sanders et al, 2002a; Scanlan et al, 2002; Thali et al, 1993; Trkola et al, 1996; Xiang et al, 2002; Zwick et al, 2001).

Uno de los principales problemas al abordar el "diseño racional" para el diseño de inmunogenes de envoltura del VIH sobre la base de información derivada del análisis estructural e inmunoquímico de la envoltura del VIH reside en la presente incapacidad de predecir las propiedades inmunogénicas de las proteínas de envoltura del VIH examinando su estructura antigénica. Por ejemplo, las proteínas monoméricas gp120 no desencadenan NAb contra aislados primarios heterólogos de VIH-1, a pesar de que están presentes epítopos conservados de neutralización en dichos constructos y en los anticuerpos enlazados a los mismos (Beddows et al, 1999; Bures et al, 2000; Cho et al, 2001; Haigwood et al, 1992; Hanson, 1994; Mascola et al, 1996; Nara et al, 1988; VanCott et al, 1999). Los anticuerpos desencadenados por gp120 monoméricos reconocen principalmente epítopos lineales dentro de las regiones variables de gp120, tales como la tercera región variable (bucle V3), así como la primera y la segunda regiones variables, los bucles V1 y V2, respectivamente (Stephens et al, 1992; VanCott et al, 1999) y presentan una amplitud limitada de actividad neutralizante contra aislados primarios de VIH-1 (Bures et al, 2000; Hanson, 1994; Mascola et al, 1996), a pesar de que reaccionan con glicoproteínas de envoltura procedentes de dichos aislados (Gorse et al, 1999).

Actualmente, en el campo del diseño de inmunogenes de envoltura del VIH se considera mayoritariamente que, con el fin de que los inmunogenes de envoltura del VIH desencadenen NAb más relevantes, los mismos se deben presentar en una forma similar a la de las envolturas asociadas a viriones, la diana de los NAb, es decir, en forma trimérica. De hecho, se han utilizado envolturas asociadas a viriones (Grovit-Ferbas et al, 2000; Lifson et al, 2004). Se han desarrollado procedimientos para generar formas triméricas solubles estables de la envoltura del VIH, que comprenden la subunidad gp120 (gp125 para VIH-2) y la región extracelular de la subunidad gp41 (gp36 para VIH-2), como inmunogenes (designados gp140 para VIH-1) (Binley et al, 2000; Binley et al, 2002; Buckner et al, 2004; Farzan et al, 1998; Sanders et al, 2002b; Schulke et al, 2002; Srivastava et al, 2003a; Yang et al, 2000). Los inmunogenes gp140 parecen ser más eficaces que las proteínas monoméricas gp120 a la hora de desencadenar NAb, incluyendo NAb de reacción cruzada (Dong et al, 2003; Earl et al, 2001; Yang et al, 2001; Yang et al, 2004a). Sin embargo, a pesar de las similitudes potenciales entre las proteínas gp140 triméricas solubles y las proteínas de envoltura gp160 asociadas a viriones, el diseño de dichas proteínas gp140 solubles todavía no resulta óptimo, y la exposición de epítopos de neutralización es menos que óptima en ambas formas.

Los resultados del análisis cristalográfico de la envoltura del VIH indican que las regiones variables de la glicoproteína de envoltura del VIH son las regiones más accesibles de la envoltura trimérica (Kwong et al, 1998; Wyatt et al, 1998; Wyatt et al, 1995). Dichos resultados resultan avalados por numerosos estudios inmunoquímicos de moléculas de envoltura asociadas a viriones y proteínas gp140 triméricas solubles. Además, la proteína de envoltura del VIH está fuertemente glicosilada en las regiones variables y alrededor de las mismas. La posición de las regiones variables y su patrón de glicosilación limitan la accesibilidad de las regiones conservadas por parte de los anticuerpos, aunque unos pocos NAb de amplia reactividad acceden eficazmente a sus epítopos conservados en la envoltura oligomérica del VIH (Kwong et al, 2002). La organización particular de las regiones variables y los sitios de glicosilación en los constructos de envoltura oligomérica del VIH limita la inmunogenicidad de las regiones conservadas. Se ha propuesto que deben ser introducidas modificaciones específicas dentro de las regiones variables de la envoltura del VIH con el fin de amortiguar su inmunogenicidad y paralelamente favorecer (directa o indirectamente) la inmunogenicidad de las regiones conservadas (Coffin, 1986). Dichas modificaciones incluyen la eliminación de los sitios de glicosilación enlazados a N (NLGS) y la eliminación de segmentos de las regiones variables.

Los primeros intentos de modificar las propiedades inmunogénicas de los inmunogenes basados en la envoltura del VIH tuvieron escaso éxito, muy probablemente debido a la utilización de proteínas derivadas de gp120 como inmunogenes. A medida que se fue generando más información sobre la estructura antigénica y oligomérica de la envoltura del VIH, el diseño de inmunogenes de envoltura del VIH resultó más sofisticado. Se puso de manifiesto que las eliminaciones introducidas en las regiones V1, V2 y V3 de las envolturas asociadas a células del VIH (derivadas del aislado X4-trópico y adaptado a laboratorio HxB2) aumentan el enlazamiento de anticuerpos anti-sitio de enlazamiento de CD4, tales como F105 (Wyatt et al, 1995; Wyatt et al, 1993). Desafortunadamente, los inmunogenes gp120 o gp140 derivados de HxB2 desprovistos de las regiones V1, V2 y V3, o los inmunogenes gp160/gp120 derivados de DH12 desprovistos de las regiones V1 y V2, o de las regiones V1, V2 y V3, no lograron desencadenar NAb ni siquiera contra los respectivos virus homólogos (Kim et al, 2003; Lu et al, 1998). Probablemente, las eliminaciones grandes modifican la estructura inmunogénica adecuada de las proteínas de envoltura del VIH. Se ha puesto de manifiesto que una modificación menos perjudicial de la región V2 en la envoltura R5-trópica de SF162 desencadena fuertes NAb contra el virus parental SF162 y contra algunos aislados heterólogos de VIH-1 (Barnett et al, 2001). Más recientemente, otros han informado de que los inmunogenes de envoltura de VIH-1 con bucles V3 específicamente modificados desencadenan NAb de reacción cruzada (Gzyl et al, 2004; Lorin et al, 2004; Yang et al, 2004b).

Otro tipo de modificación consiste en modificar el patrón de glicosilación de las envolturas del VIH. En el modelo de virus de inmunodeficiencia de los simios (VIS), se demostró que los virus Env que se modificaron específicamente con el fin de no presentar determinados NLGS del bucle V1 pudieron infectar a macacos y generar títulos elevados de NAb contra el virus VIS parental homólogo que expresa Env no modificado (Reitter et al, 1998). Los animales infectados con estos virus modificados generaron títulos más elevados de NAb contra el virus parental que los generados en animales infectados con el propio virus parental. Dichos resultados sugieren que la eliminación de los NLGS de la región V1V2 del VIS modifica la exposición y aumenta la inmunogenicidad de los epítopos de neutralización. Sin embargo, dichos epítopos no se tienen que conservar a lo largo de las cepas de VIS, ya que los anticuerpos desencadenados por las envolturas de VIS desglicosiladas mencionadas anteriormente presentaron una amplitud de actividad neutralizante muy reducida. Se ha informado de que la eliminación de los NLGS de los bucles V1 y V2 de inmunogenes de envoltura de VIH-1 89.6 da lugar a la generación de NAb homólogos, pero no heterólogos (Quinones-Kochs et al, 2002). De forma similar, los inmunogenes desprovistos de NLGS específicos del bucle V3 de VIH BRU desencadenan NAb contra los aislados de VIH-1 parentales pero no heterólogos (Bolmstedt et al, 2001; Schonning et al, 1996). Recientemente, se ha informado de que la eliminación de los NLGS de la cara inmunológicamente "silenciosa" de la envoltura del VIH expone numerosos epítopos de neutralización conservados situados en gp120 y en gp41 (McCaffrey et al, 2004). De este modo, es probable que los inmunogenes de envoltura del VIH que contienen modificaciones en las regiones V4, C4 y V5 sean más eficaces a la hora de desencadenar NAb de reacción cruzada que los constructos que contienen mutaciones únicamente en las regiones V1, V2 y V3.

En conjunto, en años recientes se han realizado avances graduales aunque significativos en el diseño de inmunogenes gp140, pero resulta necesario un mayor desarrollo con el fin de mejorar el potencial de estos constructos para desencadenar NAb de reacción cruzada (Barnett et al, 2001; Dong et al, 2003; Gzyl et al, 2004; Jeffs et al, 2002; Lorin et al, 2004; Yang et al, 2001; Yang et al, 2004b). La técnica requiere de inmunogenes que desencadenen una respuesta inmune heteróloga al VIH, tales como NAb de amplia reactividad. La presente invención se ocupa de esta y otras necesidades.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la presente invención da a conocer una vacuna que comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que el heterotrímero de envoltura del VIH comprende por lo menos dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. Los monómeros de glicoproteína Env en los heterotrímeros según la presente invención pueden ser monómeros de glicoproteína Env maduros o monómeros de glicoproteína Env solubles. En algunas formas de realización, por lo menos dos monómeros de glicoproteína Env proceden de diferentes aislados del VIH, por ejemplo diferentes aislados de VIH-1. En un heterotrímero que comprende monómeros de glicoproteína Env de diferentes aislados de VIH, los diferentes aislados de VIH pueden pertenecer al mismo clado o a diferentes clados, o a ambos.

Por lo menos uno de los monómeros de glicoproteína Env en un heterotrímero según la presente invención se puede modificar de tal modo que se modifique su composición de aminoácidos. Por ejemplo, se puede modificar un monómero eliminando una o más regiones de bucle variables, o cambiando uno o más de sus sitios de glicosilación.

Las composiciones pueden comprender un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que el heterotrímero de envoltura del VIH comprende por lo menos dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. En algunos casos, las composiciones comprenden dos o más heterotrímeros diferentes.

En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer una vacuna que comprende una cantidad efectiva de un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el heterotrímero de envoltura del VIH comprende por lo menos dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. En algunas formas de realización, la vacuna comprende dos o más heterotrímeros diferentes. La vacuna puede comprender además uno o más adyuvantes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y aplicaciones de composiciones para la preparación de un medicamento para la inducción de una respuesta inmune en un huésped vertebrado contra el VIH o una célula infectada por VIH. Las composiciones, que pueden ser administradas a un huésped vertebrado en una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva, comprenden un heterotrímero de envoltura del VIH, comprendiendo el heterotrímero, por lo menos, dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. En algunas formas de realización, la composición administrada comprende dos o más heterotrímeros diferentes. La composición puede comprender además uno o más adyuvantes.

En algunas formas de realización, la respuesta inmune desencadenada utilizando las composiciones según la presente invención es una respuesta inmune heteróloga, de tal modo que la respuesta inmune se dirige, por lo menos, a un aislado del VIH que es distinto del aislado o aislados del VIH representados por los monómeros de glicoproteína Env en los heterotrímeros administrados. En algunas formas de realización, la respuesta inmune heteróloga es una respuesta inmune humeral y proporciona anticuerpos, tales como anticuerpos neutralizantes y/o anticuerpos protectores. En algunas formas de realización, la respuesta inmune heteróloga comprende anticuerpos neutralizantes de amplia reactividad, por ejemplo anticuerpos neutralizantes que se dirigen, por lo menos, a diez aislados del VIH diferentes (tal como 20, 50 ó 100 aislados del VIH diferentes). En algunas formas de realización, la respuesta inmune heteróloga comprende anticuerpos neutralizantes dirigidos aislados del VIH de diferentes clados.

De este modo, se dan a conocer procedimientos para desencadenar una respuesta inmune contra el VIH o una célula infectada por VIH en un vertebrado que comprende la etapa que consiste en administrar a un huésped vertebrado una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH, comprendiendo el heterotrímero, por lo menos, dos monómeros de glicoproteína Env diferentes, y en los que la composición desencadena una respuesta inmune, por lo menos, a un aislado del VIH que es diferente del aislado o aislados del VIH representados por los monómeros de glicoproteína Env en los heterotrímeros.

Además, se describen procedimientos para prevenir o tratar una infección por VIH que comprende la etapa que consiste en administrar a un huésped vertebrado una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH, en los que dicho heterotrímero comprende, por lo menos, dos monómeros diferentes de glicoproteína Env.

También se dan a conocer procedimientos para producir anticuerpos neutralizantes y anticuerpos neutralizantes desencadenados utilizando los heterotrímeros como inmunogenes.

Descripción detallada de la forma de realización preferida

Uno de los mayores obstáculos en el desarrollo de una vacuna eficaz contra el VIH es la presente incapacidad de desencadenar por inmunización NAb de amplia reactividad, es decir, anticuerpos de bloqueo en la infección de diversos aislados clínicos del VIH. Los NAb son uno de los diversos tipos de respuestas inmunes anti-VIH que debería desencadenar una vacuna eficaz contra el VIH. Sin embargo, hasta el momento, por inmunización con inmunogenes de proteína de envoltura del VIH no se han desencadenado NAb con una amplitud de actividad significativa. Los inmunogenes basados en la envoltura del VIH analizados hasta el momento en animales o humanos desencadenan respuestas de anticuerpos que se dirigen principal o exclusivamente a virus que expresan una envoltura homóloga a la vacuna. No ha sido así posible forzar al sistema inmune a concentrarse en regiones determinadas de la envoltura del VIH, las que contienen epítopos de neutralización conservados (la diana de los NAb de amplia reactividad).

Se cree que el VIH Env funcional está constituido por tres moléculas (gp160 para VIH-1; gp140 para VIH-2). Cada molécula gp160 (monómero) está constituida por una subunidad extracelular (gp120) asociada no covalentemente a una subunidad de transmembrana (gp41). Las dos subunidades gp120 y gp41 están glicosiladas. Los tres monómeros gp160 de cada trímero presentan la misma secuencia de aminoácidos y el mismo patrón de glicosilación (homotrímeros). Se han utilizado vectores víricos, así como vectores de ADN, que expresan dichas proteínas gp160 como inmunogenes para la generación de respuestas inmunes anti-VIH, particularmente anticuerpos neutralizantes (NAb).

Se puede utilizar mutagénesis con el fin de crear una forma soluble de Env que sea secretada. Por ejemplo, la introducción de secuencias de codón de parada en una región inmediatamente anterior con respecto a la región de transmembrana del gp41 de VIH-1 produce la secreción de una glicoproteína designada gp140, que consiste en la subunidad entera gp120 y el dominio extracelular de gp41. Dichas proteínas gp140 Env también han sido expresadas utilizando vectores víricos o de ADN y han sido utilizadas como inmunogenes con el fin de desencadenar NAb anti-VIH, tal como se ha descrito anteriormente. Los constructos de gp140 también se pueden purificar a partir de una solución y utilizarse como proteínas purificadas con el fin de desencadenar respuestas inmunes anti-VIH.

Se ha puesto de manifiesto que los inmunogenes homotriméricos gp160 o gp140 desencadenan respuestas de anticuerpos neutralizantes anti-VIH de amplitud limitada en animales, es decir, desencadenan NAb que pueden neutralizar un puñado de aislados del VIH, principalmente aquellos que expresan Env con una estrecha relación (en su secuencia de aminoácidos y patrón de glicosilación) con el propio inmunogen.

En la presente memoria se describen heterotrímeros Env de VIH que comprenden, por lo menos, dos monómeros de glicoproteína Env diferentes. El término "heterotrímero de Env de VIH" o "heterotrímero" se refiere a un complejo que contiene, por lo menos, dos monómeros de glicoproteína de envoltura VIH-1 o VIH-2 no idénticos. Las glicoproteínas Env en los heterotrímeros pueden ser monómeros Env maduros o monómeros Env solubles. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "monómero Env maduro" se refiere tanto a una glicoproteína Env gp160 de VIH-1 que comprende la subunidad gp120 Env de VIH-1 y la subunidad gp41 de transmembrana Env de VIH-1, como a una glicoproteína gp140 de VIH-2 que comprende la subunidad gp125 Env de VIH-2 y la subunidad gp36 de transmembrana de VIH-2. El término "monómero Env soluble" se refiere tanto a la glicoproteína Env de VIH-1 soluble (designada gp140), que comprende la subunidad gp120 Env de VIH-1 y la región extracelular de la subunidad gp41 Env de VIH-1, y a la glicoproteína Env de VIH-2 soluble que comprende la subunidad gp125 Env de VIH-2 y la región extracelular de la subunidad gp36 Env de VIH-2. Es probable que la naturaleza heterotrimérica de estas proteínas Env del VIH comporten la presentación de epítopos de neutralización diferentes de los presentes en homotrímeros, lo que puede conllevar el desencadenamiento de respuestas de anticuerpos neutralizantes más amplios tras la inmunización.

Existen dos tipos distintos de VIH, el VIH-1 y el VIH-2, que se distinguen por su organización genómica y su evolución a partir de otros lentivirus. Sobre la base de criterios filogenéticos (es decir, de diversidad debida a la evolución), el VIH-1 se puede dividir en tres grupos (M, N, y O). El grupo M se subdivide en 11 clados (A a K). El VIH-2 se puede dividir en seis linajes filogenéticos distintos (clados A a F) (Human Retroviruses and AIDS 1998: A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, 1998, http://hivweb.lanl.gov). En algunas formas de realización de la presente invención, los heterotrímeros comprenden monómeros de glicoproteína Env de VIH-1. En algunas formas de realización, los heterotrímeros comprenden monómeros de glicoproteína Env de VIH-2.

En algunas formas de realización, por lo menos dos monómeros de glicoproteína Env presentes en los heterotrímeros proceden de diferentes aislados de VIH. Por ejemplo, uno de los monómeros de glicoproteína Env presente en un heterotrímero puede proceder de un aislado de VIH-1, y otro monómero de glicoproteína Env puede proceder de un aislado de VIH-2. Similarmente, uno de los monómeros de glicoproteína Env presente en un heterotrímero puede proceder de un aislado de VIH-1, y otro monómero de glicoproteína Env puede proceder de otro aislado de VIH-1. En un heterotrímero que comprende monómeros de glicoproteína Env de diferentes aislados de VIH, los diferentes aislados de VIH pueden pertenecer al mismo clado o a diferentes clados, o a ambos (por ejemplo, dos aislados diferentes de un clado y un aislado de otro clado). De este modo, un heterotrímero de ejemplo de la presente invención comprende monómero o monómeros de glicoproteína Env a partir de aislados de clado A y clado B (heterotrímeros de clado A/B), o monómero o monómeros de glicoproteína Env a partir de aislados de clado A y clado C (heterotrímeros de clado A/C), o monómero o monómeros de glicoproteína Env a partir de aislados de clado A y clado D (heterotrímeros de clado A/D), o monómero o monómeros a partir de aislados de clado B y clado C (heterotrímeros de clado B/C), o monómero o monómeros de glicoproteína Env a partir de aislados de clado B y clado D (heterotrímeros de clado B/D), o monómero o monómeros de glicoproteína Env a partir de aislados de clado C y clado D (heterotrímeros de clado C/D): por ejemplo, un heterotrímero puede incluir uno o dos monómeros de glicoproteína Env a partir de un aislado de clado B (por ejemplo, SF162) y uno o dos monómeros de glicoproteína Env a partir de un aislado de clado A (por ejemplo, Q168, Q259, Q461 y/o Q769). Los heterotrímeros que comprenden monómeros procedentes de aislados de VIH de tres clados diferentes también están incluidos dentro del alcance de la presente invención (por ejemplo, heterotrímeros de clado A/B/C). Las secuencias de aminoácido de monómeros de glicoproteína Env que pueden ser incluidas en un heterotrímero según la presente invención se pueden encontrar en la bibliografía, por ejemplo en la base de datos de secuencias VIH de Los Alamos National Laboratories (accesible en http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html).

En algunas formas de realización, por lo menos uno de los monómeros de glicoproteína Env de un heterotrímero se modifica de tal modo que se modifica su composición de aminoácidos utilizando procedimientos estándares de biología molecular. Un monómero modificado de glicoproteína Env es una molécula que presenta por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del aislado de VIH de tipo salvaje del que se deriva. Por ejemplo, un monómero se puede modificar eliminando una o más regiones de bucle variables (por ejemplo, V1, V2 y/o V3), por ejemplo tal como se describe en los ejemplos 1 y 3. La composición de aminoácidos de una o más glicoproteínas Env también se puede modificar con el fin de variar su patrón de glicosilación, por ejemplo añadiendo o eliminando uno o más sitios de glicosilación (por ejemplo, sitios de glicosilación enlazados a N o sitios de glicosilación enlazados a O) en comparación con el aislado de tipo salvaje (véase, por ejemplo, McCaffrey et al, 2004; Saunders et al, 2005). Heterotrímero según la reivindicación 1, en el que por lo menos uno de los monómeros de glicoproteína Env comprende una eliminación de una región de bucle variable. En algunas formas de realización de la presente invención, los heterotrímeros comprenden por lo menos un monómero de glicoproteína Env que comprende una modificación en un sitio de glicosilación.

En algunas formas de realización, uno o más de los monómeros de glicoproteína Env de los heterotrímeros se puede modificar con el fin de incrementar la estabilidad de dichos heterotrímeros. Por ejemplo, un motivo trimérico (por ejemplo, una hélice enrollada) o uno o más residuos de cisteína se pueden introducir en uno o más monómeros, tal como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, las patentes US nº 6.716.429 y nº 6.911.205, la publicación de patente US nº 20050089526, o Farzan et al, 1998).

En algunas formas de realización, los heterotrímeros comprenden monómeros de glicoproteína Env solubles. Los procedimientos para preparar glicoproteína Env soluble son estándares en la técnica. Por ejemplo, uno o más monómeros de glicoproteína Env se pueden sintetizar como proteína de fusión que comprende una etiqueta. Generalmente, dicha etiqueta está presente tanto en el terminal amino como en el terminal carboxi de dicho monómero. Se pueden utilizar diferentes etiquetas con diferentes monómeros. Los ejemplos de etiquetas adecuadas incluyen, sin limitarse a los mismos, proteína de unión de maltosa (MBP), His, FLAG, Myc, GST, etc. (Véase, por ejemplo, Nilson et al, 1997, en Protein expression and purification 11: 1-16). Las proteínas de fusión etiqueta-monómero pueden incluir además un sitio de disociación entre la etiqueta y el monómero, permitiendo así que la etiqueta sea eliminada enzimáticamente tras la purificación. Los ejemplos de sitios de disociación incluyen, sin limitarse a los mismos, sitios escindidos por la proteasa HCV-3C, enteroquinasa, factor Xa, trombina, subtilisina H64A, proteasa IGA, proteasa GST 3C, proteasa ABP 3C-His_{6}, etc.

Se pueden introducir plásmidos que codifiquen diferentes monómeros de glicoproteína Env en células huésped adecuadas utilizando procedimientos estándares. Los ejemplos de células huésped incluyen, sin limitarse a los mismos, líneas celulares de mamíferos tales como, por ejemplo, la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano 293; células de riñón de cría de hámster (BHK); células de ovario de hámster chino DHFR* (CHO); células de ovario de hámster chino DHFR-(DXB11); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); línea celular de ratón (C127); y líneas celulares de mieloma. Se pueden utilizar otros sistemas de expresión eucariotas que utilizan combinaciones de líneas celulares/vectores no mamíferos con el fin de producir los monómeros de glicoproteína Env y los heterotrímeros según la presente invención. Los mismos incluyen, sin limitarse a los mismos, sistemas de expresión de vector de baculovirus/células de insectos y sistemas expresión de vector lanzadera de levadura/células de levadura. La relación entre los diferentes plásmidos introducidos en las células huésped se pueden ajustar con el fin de proporcionar la mayor proporción de heterotrímeros, tal como es bien conocido en la técnica.

En algunas formas de realización, los heterotrímeros comprenden monómeros de glicoproteína Env maduros. Un procedimiento ejemplificativo para preparar heterotrímeros gp160 se describe, por ejemplo, en los ejemplos 1 y 2. Las partículas virales que comprenden heterotrímeros que comprenden monómeros de glicoproteína Env maduros se pueden purificar utilizando procedimientos estándares en la técnica. En algunas formas de realización, los heterotrímeros se pueden expresar en proteoliposomas, tal como se describe, por ejemplo, en la patente US nº 6.761.902.

En algunas formas de realización, los heterotrímeros están purificados. Los monómeros individuales de glicoproteína Env etiquetados, o los heterotrímeros que contienen monómeros etiquetados, se pueden purificar a partir de homotrímeros utilizando anticuerpos anti-etiqueta. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes etiquetas para diferentes monómeros, tal como se describe en los ejemplos 3 y 4. Los heterotrímeros formados a partir de monómeros etiquetados incluirán preferentemente, por lo menos, dos etiquetas diferentes, mientras que los homotrímeros formados a partir de estos monómeros únicamente incluirán un tipo de etiqueta. Los heterotrímeros que contienen monómeros procedentes de diferentes aislados se pueden preparar y purificar a partir de homotrímeros utilizando anticuerpos específicos del aislado, específicos del clado o específicos de VIH. Se pueden separar diferentes especies de heterotrímeros aprovechando las diferencias de tamaño y/o patrones de glicosilación de los monómeros individuales, por ejemplo utilizando cromatografía de exclusión de tamaño. Los heterotrímeros que contienen monómeros etiquetados se pueden dividir enzimáticamente con el fin de eliminar la etiqueta o etiquetas. Los heterotrímeros se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, utilizando una columna de lectina, tal como se ha descrito anteriormente (Srivastava et al, 2003a). En algunas formas de realización, los heterotrímeros purificados pueden presentar entre un 75% y un 100% de pureza, tal como entre un 80% y un 99% de pureza, o entre un 85% y un 98% de pureza. Se describen procedimientos ejemplificativos para preparar heterotrímeros gp140, por ejemplo, en los ejemplos
3 y 4.

También se describen composiciones que comprenden un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que el heterotrímero de envoltura del VIH comprende por lo menos dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. La preparación de los heterotrímeros es tal como se ha descrito anteriormente. De este modo, por lo menos uno de los monómeros presentes en un heterotrímero se puede modificar de tal modo que se modifique su composición de aminoácidos, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden modificar uno o más monómeros eliminando uno o más bucles variables y/o añadiendo o eliminando uno o más sitios de glicosilación. En algunos casos, los heterotrímeros incluyen monómeros procedentes, por lo menos, de dos aislados diferentes del VIH, tal como se ha descrito anteriormente. Las composiciones pueden comprender también dos o más heterotrímeros diferentes.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a uno o más portadores, excipientes, diluyentes u otros componentes que se pueden utilizar con el fin de facilitar la administración de la composición sin producir efectos no deseados. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse a los mismos, agua estéril o solución salina fisiológica estéril, particularmente solución salina tamponada con fosfato (PBS), tal como es bien conocido en la técnica. Las composiciones también pueden incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adoptados incluyen, sin limitarse a los mismos, alumbre, adyuvante incompleto de Freund, Saponin, Quil A, QS21, Ribi Detox, monofosforil lípido A y copolímeros de bloque no iónicos, tales como L-121 (Pluronic; Syntex SAF). El experto en la materia puede determinar fácilmente adyuvantes adecuados para ser incluidos con el fin de alcanzar el efecto deseado. Los procedimientos de combinación de adyuvantes con antígenos también son bien conocidos en la técnica.

La presente invención proporciona una vacuna que comprende una cantidad efectiva de un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el heterotrímero de envoltura del VIH, por lo menos, dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. La preparación de los heterotrímeros en este aspecto de la presente invención ha sido descrita anteriormente. En algunas formas de realización, la vacuna comprende dos o más heterotrímeros diferentes. En algunas formas de realización, la vacuna puede comprender además uno o más adyuvantes, tal como se ha descrito anteriormente.

El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para desencadenar una respuesta inmune en un huésped vertebrado, por ejemplo, una respuesta inmune humeral (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes y/o anticuerpos protectores). En algunas formas de realización, la respuesta inmune desencadenada es una respuesta inmune heteróloga, de tal modo que la respuesta inmune se dirige, por lo menos, a un aislado del VIH que es distinto del aislado o aislados del VIH representados por los monómeros de glicoproteína Env en los heterotrímeros de la vacuna. Por ejemplo, una respuesta inmune heteróloga a un heterotrímero que comprende uno o dos monómeros Env Q168 de aislados de clado A (de tipo salvaje o modificados) y uno o dos monómeros Env SF162 de aislados de clado B (de tipo salvaje o modificados) pueden desencadenar una respuesta inmune heteróloga a uno o más aislados diferentes de clado A, uno o más aislados diferentes de clado B, y/o uno o más aislados pertenecientes a un clado diferente (por ejemplo, clado C). El experto en la materia puede determinar fácilmente la capacidad de un inmunogén para desencadenar una respuesta inmune heteróloga a VIH en un huésped vertebrado. Los procedimientos ejemplificativos para medir respuestas inmunes desencadenadas por inmunizaciones de Env VIH han sido descritos anteriormente (véase, por ejemplo, Barnett et al, 2001; Buckner et al, 2004; Srivastava et al, 2003b; publicación de solicitud de patente USA No. 20020127238).

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y aplicaciones de composiciones para la preparación de un medicamento para la inducción de una respuesta inmune en un huésped vertebrado contra el VIH o una célula infectada por VIH. Las composiciones, que pueden ser administradas a un huésped vertebrado en una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva, comprenden un heterotrímero de envoltura del VIH, comprendiendo el heterotrímero, por lo menos, dos monómeros diferentes de glicoproteína Env. La preparación de los heterotrímeros en este aspecto de la presente invención ha sido descrita anteriormente. En algunas formas de realización, la composición administrada comprende dos o más heterotrímeros diferentes. En algunas formas de realización, la composición puede comprender además uno o más adyuvantes, tal como se ha descrito anteriormente.

La expresión "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad que resulta suficiente para prevenir o reducir el riesgo o la probabilidad de ser infectado por VIH o sufrir una enfermedad inducida por VIH. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que resulta suficiente para tratar, mejorar, frenar o detener el progreso de una infección por VIH o una enfermedad inducida por VIH. El huésped vertebrado puede ser un huésped mamífero, por ejemplo un huésped humano. El huésped vertebrado puede estar infectado por el VIH o presentar riesgo de ser infectado por el mismo, o presentar una enfermedad inducida por VIH. De este modo, las composiciones según la presente invención se pueden utilizar terapéuticamente con el fin de tratar o mejorar una infección por VIH o una enfermedad inducida por VIH, o profilácticamente con el fin de prevenir o reducir la probabilidad de infección por VIH o enfermedad inducida por VIH.

Las composiciones o vacunas que comprenden un heterotrímero de envoltura del VIH pueden ser administradas de entre cualquier procedimiento de administración adecuado conocido en la técnica, incluyendo, sin limitarse a los mismos, intradérmico, subcutáneo, intramuscular, intraperitoneal, oral, ocular (por ejemplo, en forma de spray ocular), tópico, intravaginal o intravenoso. Las composiciones se pueden facilitar en una forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacológica. La dosificación se selecciona empíricamente con el fin de alcanzar la respuesta inmune deseada en el huésped, por ejemplo, un grado adquirido y aumentado de inmunidad protectora, preferentemente protección completa, contra la exposición posterior al VIH. Las dosificaciones variarán en función del sujeto y la vía de administración utilizada, y se pueden determinar fácilmente utilizando experimentación de rutina.

La composición que comprende uno o más heterotrímeros puede ser administrada como parte de cualquier tipo de protocolo para inmunizaciones. Dichos protocolos de inmunización pueden incluir inmunogenes adicionales, que pueden presentarse en forma de ADN, proteína vírica y/o combinaciones de los mismos. Un procedimiento típico para inducir una respuesta inmune es el conocido como inmunización combinada de vectores (prime-boost). Por ejemplo, una respuesta inmune se provoca inicialmente utilizando un heterotrímero o una mezcla de diferentes heterotrímeros, y a continuación se estimula utilizando un heterotrímero o una mezcla de diferentes heterotrímeros. El heterotrímero o heterotrímeros utilizados para despertar la respuesta inmune pueden ser diferentes del heterotrímero o heterotrímeros utilizados para estimular la respuesta inmune. Se pueden utilizar vectores de ADN o replicones que expresen antígenos víricos de VIH (por ejemplo, antígenos homotriméricos) con el fin de despertar la respuesta inmune, seguido de estimulación con un heterotrímero o heterotrímeros según la presente invención. Los procedimientos ejemplificativos para inmunizar huéspedes vertebrados con antígenos del VIH han sido descritos anteriormente (véase, por ejemplo, Barnett et al, 2001; Buckner et al, 2004; publicación de solicitud de patente US nº 20020127238).

En algunas formas de realización, la respuesta inmune desencadenada utilizando las composiciones según la presente invención es una respuesta inmune heteróloga, de tal modo que la respuesta inmune se dirige, por lo menos, a un aislado del VIH que es distinto del aislado o aislados del VIH representados por los monómeros de glicoproteína Env en los heterotrímeros administrados al huésped. En algunas formas de realización, la respuesta inmune heteróloga es una respuesta inmune humeral y proporciona anticuerpos, tales como anticuerpos neutralizantes y/o anticuerpos protectores. En algunas formas de realización, las composiciones según la presente invención desencadenan anticuerpos neutralizantes de amplia reactividad, por ejemplo anticuerpos neutralizantes que se dirigen, por lo menos, a diez aislados del VIH diferentes (tal como 20, 50 ó 100 aislados del VIH diferentes). En algunas formas de realización, la respuesta inmune heteróloga comprende anticuerpos neutralizantes dirigidos a aislados del VIH de diferentes clados.

De este modo, se proporcionan procedimientos para desencadenar una respuesta inmune en un vertebrado contra el VIH o una célula infectada por VIH que comprende la etapa de administrar a un huésped vertebrado una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH, en los que el heterotrímero comprende, por lo menos, dos monómeros de glicoproteína Env diferentes, y en los que la composición desencadena una respuesta inmune, por lo menos, a un aislado del VIH que es diferente del aislado o aislados del VIH representados por los monómeros de glicoproteína Env en los heterotrímeros.

También se proporcionan procedimientos para preparar una composición de vacuna suspendiendo y empaquetando los inmunogenes de heterotrímero en una solución portadora farmacéuticamente aceptable adecuada.

En la presente memoria se describen además procedimientos para producir anticuerpos neutralizantes. En algunos casos, los anticuerpos neutralizantes se producen por inmunización de un huésped con los heterotrímeros según la presente invención. El huésped puede ser cualquier huésped que pueda provocar una respuesta inmune contra los heterotrímeros, incluyendo un huésped mamífero, tal como un huésped humano. A veces, los anticuerpos neutralizantes se pueden generar in vitro a partir de un huésped mamífero que se ha inmunizado con los heterotrímeros de la presente invención, tal como ha sido descrito anteriormente (Cole et al, 2001; Feldhaus y Siegel, 2004; Persson et al, 1991; Robinson et al, 1998; Williamson et al, 1993). En algunos casos, los procedimientos para generar anticuerpos neutralizantes comprenden poner en contacto células productoras de anticuerpos con un heterotrímero según la presente invención.

También se dan a conocer anticuerpos neutralizantes desencadenados utilizando los heterotrímeros como inmunogenes. Dichos anticuerpos neutralizantes pueden estar presentes en el suero o las secreciones mucosales, o en una fracción de inmunoglobulina de suero o secreciones mucosales, o se pueden purificar sustancialmente (monoclonales o policlonales) utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Dichos anticuerpos resultan útiles para propósitos diagnósticos y/o inmunoterapéuticos. En algunos casos, los anticuerpos neutralizantes presentan una amplia reactividad, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes pueden presentar una especificidad similar al anticuerpo monoclonal b12 descrito en las patentes US nº 5.652.138 y nº 5.804.440. la afinidad y especificidad de los anticuerpos se pueden determinar utilizando procedimientos estándar.

Los ejemplos siguientes ilustran las formas de realización representativas para llevar a cabo la presente invención, pero no se deben considerar limitativos de la misma.

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Ejemplo 1

Este ejemplo describe heterotrímeros gp160 de VIH-1 que contienen por lo menos un monómero con, por lo menos, una eliminación de bucle variable.

Las regiones V1, V2 y V3 (individualmente o en combinaciones) del Env SF162 han sido eliminadas por mutagénesis por nuestro grupo (Saunders et al, 2005; Stamatatos y Cheng-Mayer, 1998; Stamatatos et al, 2000; Stamatatos et al, 1998). Se han generado vectores de ADN que expresan las proteínas parentales y estas proteínas modificadas. Estas proteínas gp140 homotriméricas desprovistas del bucle V2 (dV2), del bucle V3 (dV3) o de los dos bucles V2 y V3 (dV2dV3), así como la proteína gp140 parental (SF162), han sido utilizadas como inmunogenes con el fin de desencadenar NAb en animales (Barnett et al, 2001; Buckner et al, 2004; Cherpelis et al, 2001; Derby et al, manuscrito en preparación). También se han generado constructos SF162 homotriméricos desprovistos del bucle V1 (dV1) (Saunders et al, 2005).

En este ejemplo, se diseñan heterotrímeros que contienen monómeros derivados de SF162 que difieren en sus regiones V1, V2 y V3. Son posibles diversas combinaciones. Por ejemplo, algunos homotrímeros pueden presentar dos moléculas gp160/gp140 de un determinado Env y una tercera molécula de un Env diferente, o pueden presentar tres moléculas gp160/gp140 diferentes. Un heterotrímero de ejemplo se compone de dos moléculas gp160/gp140 de SF162 y una molécula gp160/gp140 dV3, dV2 o dV2dV3. Otro heterotrímero de ejemplo contiene una molécula gp160/gp140 de SF162 y dos moléculas gp160/gp140 dV2, dV3 o dV2dV3. También son posibles otras combinacio-
nes.

Se han coexpresado SF162gp160 y o bien dV3gp160 o bien dV2gp160 sobre la superficie de partículas virales. Dado que dV3gp160 no es capaz de mediar una fusión virus-celular, los dV3gp160 que expresan partículas virales no son infecciosos (Saunders et al, 2005). En cambio, las partículas que expresan SF162gp160 sí lo son. La coexpresión de dV3gp160 con SF162gp160 resultará en una reducción de infectividad viral si dV3gp160 y SF162gp160 coexisten dentro del mismo trímero gp160 (heterotrímero SF162/DV3). El grado de reducción debería ser proporcional a las concentraciones relativas de dV3gp160 y SF162gp160. De hecho, se confirma que este es efectivamente el caso, lo que indica que SF162 Env y dV3 Env se pueden asociar. Similarmente, dado que dV2gp160 es varios órdenes de magnitud menos eficiente en la mediación de la infección que SF162gp160 (Saunders et al, 2005), la coexpresión de dV2gp160 con SF162gp160 reduce significativamente la infectividad viral, un indicio de que dV2gp160 y SF162gp160 pueden formar heterotrímeros.

Se están diseñando heterotrímeros gp140 solubles que contienen por lo menos un monómero más con, por lo menos, una eliminación de bucle variable, utilizando metodologías estándares, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 3.

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Ejemplo 2

Este ejemplo describe heterotrímeros gp160 de VIH-1 que contienen por lo menos un monómero de un clado diferente.

Los vectores ADN que expresaban las proteínas Env gp160 de las cuatro envolturas de clado A (Q168, Q259, Q461 y Q769) nos fueron suministradas por la Dra. Julie Overbaugh del FHCRC. Se introdujeron diversas modificaciones en dichos constructos. Los bucles V1 o V2 se eliminaron utilizando metodologías similares a las utilizadas para eliminar dichos bucles del Env SF162 (Saunders et al, 2005; Stamatatos y Cheng-Mayer, 1998; Stamatatos et al, 2000; Stamatatos et al, 1998). También se eliminó un sitio de glicosilación enlazado a N conservado (NLGS) de la región N-terminal de V2 (GMV2) y un NLGS conservado del terminal N del bucle V3 (GMV3). Estas modificaciones afectan de forma diferente a la función de dichas Env. Algunas pierden su capacidad de mediar una infección, algunas la reducen y otras no se ven afectadas. Se generaron viriones que coexpresaban los Env derivados de SF162 y clado A mencionados anteriormente y, utilizando metodologías de infectividad similares descritas en el ejemplo 1, se puso de manifiesto que las proteínas Env de clado A y SF162 pueden formar heterotrímeros.

Se están diseñando heterotrímeros gp140 solubles que contienen por lo menos un monómero más procedente de un clado diferente utilizando metodologías estándares, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 4.

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Ejemplo 3

Este ejemplo describe la generación de heterotrímeros gp140 de VIH-1 solubles que contienen por lo menos un monómero con, por lo menos, una eliminación de bucle variable.

Se puede utilizar uno de diversos procedimientos para diseñar heterotrímeros gp140 solubles que contienen por lo menos un monómero con una eliminación de bucle variable, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 1. En un procedimiento, se introdujo una proteína de unión de maltosa (MBP) en el terminal C de dV3gp140 y una etiqueta His en el terminal C de dV2gp140. En primer lugar, se introdujo la secuencia del sitio de escisión de HCV-3C en el terminal C de dV3gp140 y dV2gp140. A continuación, se introdujo una secuencia de etiqueta His en el terminal C de HCV-3C para dV2gp140, y se introdujo una secuencia de proteína de unión de maltosa (MBP) el terminal C de HCV-3C para dV3gp140.

La adición de la etiqueta His en el terminal C de HCV-3C de dV2gp140 se llevó a cabo utilizando el kit de mutagénesis dirigida a sitio de Stratagene. Se utilizaron cebadores que incorporaban la etiqueta His en una posición inmediatamente posterior de la región linker de 12 nucleótidos para añadir seis residuos de histidina (5' CATCAC
CATCACCATCAC 3', SEC ID nº:1) al terminal C del constructo SF162dV2 gp140, el terminal C del sitio de escisión HCV-3C nuevamente introducido. Se llevaron a cabo las reacciones de mutagénesis y la transformación en células químicamente competentes de acuerdo con el protocolo.

La etiqueta MBP se introdujo en el extremo de terminal C del sitio de escisión HCV-3C de SF162dV3 tal como sigue. Utilizando mutagénesis dirigida al sitio, se añadieron sitios de restricción EcoRI en cada extremo del gen malE en el vector pMAL-c2x (New England Biolabs #E8000S). El nuevo vector se digirió con EcoRI, se aisló el gen malE y se ligó en el vector de ADN que expresaba dV3gp140 en el terminal C del sitio de escisión HCV-3C.

Se generaron vectores de ADN que expresaban dichas proteínas y se puso de manifiesto que ambas proteínas se expresaban durante la transfección. Inicialmente, el constructo dV2gp140 etiquetado con His y el constructo dV3gp140 etiquetado con MBP se sometieron individualmente a transfección en células 293T durante 72 horas. Los sobrenadantes celulares que contenían dV2gp140 etiquetado con His se colocaron en una columna de afinidad de cobalto (Clontech 635501). Se recogieron fracciones de 1 ml tras la elución con una solución 50 mM de fosfato de sodio y 300 mM de cloruro de sodio, pH 5,0. Las fracciones con las mayores cantidades de proteína (determinadas a través de ensayo Bradford) se recogieron y se sometieron a inmunotransferencia Western con anticuerpos Env antietiqueta His o anti-VIH con el fin de confirmar la presencia de proteínas dV2gp140 etiquetadas con His en el sobrenadante celular de las células transfectadas. Los sobrenadantes celulares que contenían dV3gp140 etiquetado con MBP se incubaron con una resina de amilosa (NEB E8021S) durante una noche a 4ºC con agitación. A continuación, la resina de amilosa se empaquetó en una columna, se lavó, y se recogieron fracciones de 1 ml tras la elución con maltosa 10 mM. La presencia de proteína gp140 se detectó a través de Western blotting con anticuerpos Env anti-MBP y
anti-VIH.

A continuación, se sometieron a cotransfección las células 293T con vectores ADN que expresaban dV2gp140 etiquetado con His y dV3gp140 etiquetado con MBP. El sobrenadante celular se colocó en primer lugar en una columna anti-His y a continuación en una columna anti-MBP, o en primer lugar en una columna anti-MBP y a continuación en una columna anti-His. Esto debe resultar en el aislamiento de especies heterotriméricas que contienen un componente dV2 y dos componentes dV3, o dos componentes dV2 y un componente dV3.

Los heterotrímeros que contienen SF162gp140 se pueden purificar con una versión modificada de la metodología mencionada anteriormente. Dado que el SF162gp140 puede ser reconocido por anticuerpos anti-V3 (que no reconocen el dV3gp140) y anticuerpos anti-V2 (que no reconocen el dV2gp140), los heterotrímeros SF162/dV3gp140 se pueden separar del resto de especies oligoméricas mediante cromatografía de columna de afinidad con columnas anti-V3 MAbs y anti-MBP, mientras que los heterotrímeros SF162/dV2gp140 se pueden separar del resto de especies oligoméricas mediante cromatografía de columna de afinidad con columnas anti-V2 MAbs y anti-His.

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Ejemplo 4

Este ejemplo describe la generación de heterotrímeros gp140 de VIH-1 solubles que contienen por lo menos un monómero de un clado diferente.

Se puede utilizar uno de diversos procedimientos para diseñar heterotrímeros gp140 solubles que contienen por lo menos un monómero de un clado diferente, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 2. En un procedimiento ejemplificativo, el epítopo FLAG se incorpora en el bucle V4 de los 4 Env de clado A. Se incorpora una etiqueta FLAG (5' DYKDDDDKK 3', SEC ID nº:2) en el bucle V4 de los gp140 de clado A. Esto se lleva a cabo mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR utilizando el kit QuikChange XL de Stratagene. Para este procedimiento, se utilizan cebadores que codifican la secuencia de nucleótidos de la etiqueta FLAG (5' GATTACAAGGATGACGATGACAAAAAG 3', SEC ID nº:3) y específicos a la región V4 de cada aislado. Los productos PCR se transforman en células competentes según protocolo, y se aíslan los plásmidos. Se han generado vectores de ADN que expresan las versiones gp140 de las envolturas de clado A mencionadas anteriormente. Los plásmidos que contienen el gp140 de clado A etiquetado con FLAG se transfectan en células 293T durante 72 horas. Los sobrenadantes celulares que contienen gp140 soluble se recogen y la expresión proteínica del gp140 etiquetado con FLAG se confirma mediante Western blotting con un anticuerpo anti-etiqueta. Tras la confirmación de dicha expresión, los plásmidos de clado A se cotransfectan con SF162gP140, se recogen los péptidos solubles y se purifican a través de la columna anti-FLAG (Sigma A2220). Tras la elución a través de competición péptido-FLAG (Sigma F3290), se recogen las fracciones. Las fracciones que contienen las proteínas deseadas se purifican por afinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos de clado B. La detección de heterotrímeros gp140 de clado A/B se lleva a cabo utilizando Western blotting con un anticuerpo monoclonal específico de clado B y un anticuerpo anti-FLAG.

De manera similar, los heterotrímeros de clado A/B se generan conteniendo las Env de clado A mencionadas anteriormente y las Env dV1, dV2 o dV3 derivadas de SF162. Se han generado las eliminaciones de los bucles V1 y V2 de los aislados Q168, Q259, Q461, y Q769, y dichos constructos han sido utilizados para generar heterotrímeros entre ellos y SF162Env y sus versiones modificadas V1, V2 y V3 mencionadas anteriormente.

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<110> Seattle Biomedical Research Institute

\hskip1cm

Stamatatos, Leonidas

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<120> Proteínas de envoltura de VIH heterooligoméricas como vacunas

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<130> SBHU-1-26926

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<150> US 60/640.329

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<151> 2004-12-29

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<160> 3

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador sintético

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

catcaccatc accatcac

\hfill

18

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Proteína sintética para etiqueta FLAG

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<400> 2

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys}

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<210> 3

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador sintético para etiqueta FLAG

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<400> 3

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gattacaagg atgacgatga caaaaag

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Claims

1. Vacuna que comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el heterotrímero de envoltura del VIH comprende por lo menos dos monómeros de glicoproteína Env diferentes.

2. Utilización de una composición que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH, en la que dicho heterotrímero comprende por lo menos dos monómeros de glicoproteína Env diferentes, para la preparación de un medicamento para la inducción de una respuesta inmune en un huésped vertebrado contra el VIH o una célula infectada por VIH, por ejemplo en la que la respuesta inmune inducida comprende anticuerpos neutralizantes ampliamente reactivos.

3. Composición para la inducción de una respuesta inmune en un huésped vertebrado contra el VIH o una célula infectada por VIH, que comprende un heterotrímero de envoltura del VIH, en la que dicho heterotrímero comprende por lo menos dos monómeros de glicoproteína Env diferentes, por ejemplo en la que la respuesta inmune inducida comprende anticuerpos neutralizantes ampliamente reactivos.