JP3764476B2 - 組合せポリペプチド抗原 - Google Patents

Description

発明の背景
宿主防御は脊椎動物の免疫系の特徴である。この目的のためには病原体に対する防御作用において抗体は数々の機能を行う。例えば抗体は生物学的に活性な分子を中和させ、補体経路を誘発させ、食作用を刺激化させ（オプソニン作用）、あるいは抗体依存的細胞介在性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に関与することができる。
抗体がある分子の生物学的機能に関して重要な部位に結合する場合には、その分子の活性が中和されることがある。このようにして特異的抗体はウイルスもしくは原生動物の細胞表面に対する結合を遮断することができる。同様に、細菌性もしくは他の種類の毒素が結合し、そして適切な抗体により中和されることがある。そのうえ結合抗体がその標的を中和するか否かに関係なく、生じる抗原−抗体複合体は他の防御機構と相互作用を行うことができ、その結果抗原の破壊および／または除去をもたらす。
寄生生物が免疫反応を回避するための膨大な機構を導き出してきた。抗原変異は恐らく最も良く研究されている回避方法であると思われるが、その理由の一部はこのような変異によりワクチンの開発が特に困難になるためである。一般的には抗原変異が生じるのには２つの経路があり、それらは抗原浮動および抗原転位である。抗原浮動は比較的簡単なものである。点突然変異が病原体の抗原をコード化する遺伝子内において生じ、抗原上のエピトープの内の幾つかを、本来抗原に対する宿主の免疫学的記憶が変異型によっては誘発されないように変化させる。ある変異型に対する免疫性は必ずしも他のものに対する免疫性を保証するわけではないため、病原体集団内におけるこのような点突然変異の蓄積が、同一宿主内における複数の感染をもたらすことがある。抗原転位はほとんどの病原対内（ウイルス、細菌、および原生動物）において発見されており、この重要性は個々の種によって異なる。
殆どのウイルスはかなりの抗原変異を生じることができ、そしてこれらのウイスルの血清学的に異なる種の多大な数にのぼるものが同定されている。その結果、特別な種のウイルスが既往の感染もしくはワクチン接種によりその集団内において形成される免疫性に対して非感受性となる。例えば、ＨＩＶ−１ワクチン開発の進展は、ＨＩＶ−１の異なる単離物の間におけるアミノ酸配列の変異性により妨げられている。この変異性は特に外部包膜蛋白質であるｇｐ１２０内において特に高く、そしてこの蛋白質はウイルスの感染性を中和する抗体についての初期標的である（引用することにより本明細書中に組み入れられるＲｏｂｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：７０２３；Ｐｕｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３９２；およびＲｕｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：６９２４）。ヒトおよびマウスにおける研究によりｇｐ１２０の小領域が明らかにされ、これはＶ３ループもしくは主要中和性決定基（ＰＮＤ）と称され、非変異性でありジスルフィド交差結合されている２つのシステインの間の約３５残基を含み（Ｃｙｓ−３０からＣｙｓ−３３８、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．のＨＩＶ−１命名法（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３３３）、これがウイルスに対する主要中和抗体を誘導する（Ｐａｌｋｅｒ ａｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：１９３２；Ｒｕｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：３１９８、およびＧｏｕｄｓｍｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：４４７８）。この同一領域は各種のクローン性単離物の間では配列が最も可変的なもののうちのひとつである一方（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３３３）、このドメインのアミノ酸配列の分析によりＶ３ループの中央部分内の１４位置の内の９つにおいて８０パーセントを上回るまでのアミノ酸の保存性が明らかにされており、このことによりＶ３ループの変異性には抑制がかかっていることが示唆される（ＬａＲｏｓａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：９３２）。しかしながらこの可変性がために、ある単離物からのＰＮＤにより誘導される中和抗体は一般的には異なるアミノ酸配列のＰＮＤを有する単離物は中和しない。
同様に、ワクチン接種によりインフルエンザを抑制する試みはこれまでは限られた場合にのみ成功を収めてきており、そして中和抗体をもともとインフルエンザウイルスの主要表面抗原である血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対して特異的なものとして作製しているにもかかわらず、これらの主要表面抗体の継続的変化によりそのような試みは妨害されてしまっている（Ｃａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：４１７；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｗ．Ｈ．Ｏ． ６１：１４３；Ｅｃｋｅｒｔ，Ｅ．Ａ．（１９７３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１：１８３）。インフルエンザウイルスは高次の抗原性変異を短い期間内に行う能力を有している。ヒトおよび動物集団全体にわたるインフルエンザの季節的大発生を抑制することを困難にしているのはウイルスのこの特性なのである。
血清学的研究および配列研究を通して２つの種類の抗原性変異がインフルエンザＡウイルスにおいて証明されている。抗原転移はＨＡもしくはＮＡ、あるいはその両方が、新しい免疫原性を有する新規のＨＡもしくはＮＡを有する新しいウイルス株内において置換される際に初めて生じる。抗原転移により作成される新しいサブタイプの発生により通常は感染の汎流行がもたらされる。
抗原浮動は特定のサブタイプのインフルエンザウイルスにおいて生じる。アミノ酸および核酸配列分析により、抗原浮動は一連の遂次突然変異の間にわたり生じ、その結果ポリペプチドにおけるアミノ酸変化およびウイルスの抗原性の差異をもたらす。抗原浮動を介する数々の突然変異の蓄積により最終的には、類似するサブタイプに対して予め露出させられているかなりの数の被検体の免疫反応を回避させることができるサブタイプを生じる。事実、類似する新しい変異型が、マウスもしくはニワトリのヒナの胚内の少量の抗体の存在下におけるウイルスの継代により実験的に選択されている。抗原浮動が深刻なほどの感染の大発生もしくは流行を引き起こすことは少ない。抗原浮動はまたインフルエンザＢウイルスにおいても観察されている。
臨床実験において近年Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な抗原ワクチンが精製されているが、これは一般的には単一のウイルスサブタイプの抗原からできている。このことを決定するための推論は、Ｂ型肝炎ウイルスを中和する際にいくぶん有効であることが示されたＳ領域特異的抗体およびプレーＳ（２）領域特異的抗体の両方は元々群特異的であるというものであった。しかしながらこの論理はＴ−細胞認識の際のウイルスサブタイプの影響を考慮に入れてはいない。マウスのプレーＳ（２）特異的Ｔ−細胞反応は高度にサブタイプ特異的であることが証明されている（Ｍｉｌｉｃ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３５３５）。
単細胞性原生動物であるプラスモディウム ファルキパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、ヒトにおけるマラリアを引き起こす優勢病原体である。感染は、ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）である蚊の唾液腺内に存在する種虫（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）が感受性宿主の血液内に混入した際に開始する。種虫は迅速に肝細胞に侵入し、そしてそこでそれらは更に発育を遂げて肝分裂体（ｌｉｖｅｒ ｓｈｉｚｏｎｅ）となる。成熟後、感染性分裂小体（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）は宿主の血液内に放出され、そして赤血球に侵入し、マラリアの臨床症状に関連する新しい増員生殖周期（ｓｃｈｉｚｏｇｏｎｉｃ ｃｙｃｌｅ）を開始する。世界保険機構により予測されるマラリアの症例数は世界的に１０億を越えている。
限定された場合における成功例は、寄生生物の生周期の内の少なくとも一つのものの間に発現される精製表面抗原で免疫化することによる特定の種のプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）による感染からサルを保護することにおいて報告されている。例えば、血液段階のワクチン(blood-stage vaccine)のための興味ある候補物はｐ１９０と称される分裂小体蛋白質もしくは多形性分裂体（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｃｈｉｚｏｎｔ）抗原である（Ｈｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０：１５４−１５８；Ｍｅｒｋｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１１：３７９−３８２；Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：３８２３−３８２９）。ｐ１９０は大きな糖蛋白質であり、これは分裂小体形成中に合成されそして大規模にプロセッシングされ、この糖蛋白質の８０ｋＤａのプロセシング産物が成熟した分裂小体の主要コート蛋白質である。ｐ１９０に対するモノクローナル抗体プローブおよび一次配列分析により、この抗原は、プラスモディウムの種および亜種の間の抗原変異を引き起こす多形性配列を含むことが明らかにされた。
発明の要約
本発明は、ある蛋白質もしくはその一部分の変異型の集団のアミノ酸配列から得られるアミノ酸配列を有するポリペプチド抗原のセット、ならびにそのポリペプチド抗原のセットを作製する方法に関する。一般的には、この方法は以下に示す、
ａ．式
Ａ₁Ａ₂Ａ₃....Ａ_n-2Ａ_n-1Ａ_n,
［式中、Ａ_nはその蛋白質もしくはその一部分のアミノ酸の位置ｎに出現するアミノ酸である］
により表され、Ｎ個の変異型（本明細書において、Ｎ変異型ともいう。）の集団を示すある蛋白質もしくはその一部分を選択する段階、
ｂ．Ｎ変異型における各アミノ酸の位置ｎに出現する各種類のアミノ酸の回数Ｏ_n ^aaを決定する段階、
ｃ．Ｎ変異型における各アミノ酸の位置ｎにおける各種類のアミノ酸の発生頻度（Ｏ_n ^aa／Ｎ）_nを算出する段階、および
ｄ．式
Ａ'₁Ａ'₂Ａ'₃....Ａ'_n-2Ａ'_n-1Ａ'_n
［式中、Ａ’_nはＮ変異型中における対応するアミノ酸の位置において選択された頻度を上回って出現するアミノ酸の種類として定義する］により実質的に表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのセットを作成する段階、
を含んでなる。
好ましい態様においては、ポリペプチド抗原のセットを各コドンの位置ｎにおける最小数のヌクレオチド組合せ物を有し、そしてその組合せ物には少なくとも各種類のアミノ酸Ａ’₁からＡ’_nまでをコードするコドンが含まれる縮重オリゴヌクレオチド配列を決定することにより作製する。縮重オリゴヌクレオチドを発現可能な遺伝子内に取り込ませて遺伝子セットを作製する。この遺伝子セットを適切な発現系内において発現させて一連のポリペプチド抗原のセットを作製する。
Ａ'₁Ａ'₂Ａ'₃....Ａ'_n-2Ａ'_n-1Ａ'_n
典型的には、ｎは８から約１５０までの範囲にわたるであろう。特定の位置におけるポリペプチド抗原のセット内のアミノ酸の含有物(inclusion)について選択された閾頻度を、すべてのアミノ酸の位置について同一の値で設定することができる。別法では、選択された頻度閾値を各アミノ酸の位置について個々に設定することができ、そしてその値は位置によって変化することができる。典型的にはこの閾頻度は５−１５％の範囲にわたるであろう。このことは、作製されるポリペプチド抗原のセット内の特定の位置における具体的なアミノ酸の含有物については、このアミノ酸がＮ変異型の５−１５％を上回ってその位置に出現する必要があることを意味する（すなわち、Ｏ_n ^aa／Ｎは５−１５％を上回る必要がある）。
このポリペプチド抗原のセットはある蛋白質のペプチド配列全体に対して、あるいはその一部分のみに対応することがある。そのうえ、変異型配列は蛋白質内において隣接している必要はなく、それは単一の蛋白質もしくは蛋白質サブユニットあるいは一つを上回る蛋白質もしくは蛋白質サブユニット内に分散していることができる。
このポリペプチドのセットを人工ワクチンとして使用することができる。これらの抗原は生理学的に許容される賦形剤内において、そしてその抗原の変異型の集団に対して保護的免疫性を生じさせるに十分な投薬養生法の下において宿主生物体に投与することができる。例えばこの蛋白質が病原体の構成成分である場合には、この蛋白質もしくはその一部分はそのポリペプチド抗原のセットのような一つもしくは複数の中和用エピトープを含む配列を包含することがあり、免疫原として投与する場合には宿主生物体による病原体に対する中和抗体の産生をもたらす。
別法では、そのポリペプチド抗原のセット投与の形態ならびに経路を免疫寛容を生じるように適応させ、そしてそれにより変異型蛋白質抗原もしくはその一部分に対して宿主生物体内に人工的寛容状態を作成することができる。
発明の詳細な記述
病原体による臨床的に明白なあるいは不顕性の感染のいずれかが免疫性を導くことがあり、そして同一な抗原構造の病原体に対する免疫性は長期持続性のものであるらしい。しかしながら、病原体による再感染は重要ではない抗原の違いを有する変異型により引き起こされることがある。そのうえ免疫性は高度にエピトープ特異的であるため、病原体に対して人工的に誘導させる免疫性はしばしば病原体の顕著な抗原変異により制限される。したがって抗原浮動を受ける病原体の能力のために、しばしば常用のワクチンが無効になるということがもたらされる。
本発明は、ある蛋白質（もしくはその一部分）から得られるポリペプチド抗原のセットであって、その蛋白質の天然のもしくは人工的に誘導させた変異型の間でいくらかの配列異質性をもって発現されるポリペプチド抗原のセットを作成する方法を提供する。この目的は変異型およびおそらくは生じ得る可能な未知のもしくは新規の変異型に対して免疫化するために使用することができる抗原混合物を提供することである。
本発明の方法に従って、各アミノ酸の種類についての発生頻度を変異型集団内におけるその蛋白質（もしくはその蛋白質の一部分）のアミノ酸の各位置について決定する。変異型集団内において予め決定されている頻度（例えば５％、１０％、１５％など）を上回って各位置に出現するアミノ酸をポリペプチド抗原のセットを作成するために含有物について選択する。
一般的には、ポリペプチドは８から１５０までのアミノ酸、好ましくは約１０から５０までのアミノ酸の長さの範囲にわたるであろう。
好ましい態様においては、ポリペプチド抗原のセットを縮重オリゴヌクレオチドの方法により産生する。縮重オリゴヌクレオチドの配列は、含有物（つまり、変異型の集団における対応するアミノ酸の位置ｎにおいて選択された頻度を上回って出現するもの）について選択された各アミノ酸の種類を生じるのに必要な各コドンについて、最低数のヌクレオチド組合せ物を産生するように決定することができる。
合成オリゴヌクレオチドの混合物を、ポリペプチド抗原のセットが個々のポリペプチドとして、あるいはポリペプチドのセットを含むより大きな融合蛋白質のセットとして発現可能となるように遺伝子配列内に酵素的に連結させることができる。別法では、ポリペプチド抗原のセットを有機化学的ペプチド合成により作製することができる。各回のアミノ酸カップリングを実施して所定のアミノ酸の位置において決定されている異質性を有する種類のアミノ酸の種類を産生させることができる（合成の適切な段階において一つを上回る活性化アミノ酸を組み入れることによる）。このアミノ酸混合物はＮ変異型の頻度分析に基づく。別法では、このアミノ酸混合物を縮重オリゴヌクレオチドを作製する際に作製されるヌクレオチド（コドン）組合せ物に基づいて決定することができる。
縮重オリゴヌクレオチド配列の利用により生じる組合せ物効果により、典型的には、変異型の元々の集団内においては出現することがない幾つかの種類のアミノ酸を生じるであろう。この方法により、天然においては生じることがないと思われるポリペプチドが、ポリペプチド抗原のセット全てにおいて作製される。これらのヌクレオチド組合せ物は元々は既知の変異型に基づいているため、追加的アミノ酸について生じるコドンは可能性としては、その蛋白質の構造分析により人工的に作製されるものと比較してむしろ天然においてより多く存在する可能性のある突然変異を表す。したがって、ポリペプチド抗原のセットは、その蛋白質の広範囲にわたる可能な変異型ならびに既知の変異型に対する免疫性をもたらすことがある。
ある蛋白質の変異型の集団の配列を分析するためには、目的のアミノ酸配列を配列の相同性に関して整列させることができる。ある具体的な変異型の配列を整列させてみてアミノ酸の存在もしくは非存在を読み取るが、このようなアミノ酸の存在もしくは非存在は、実在のものもしくは人工的なものであることができる選択された共通の長さを有する対照配列に対応させてある。配列のアラインメントにおいて最高の相同性を保持させるために、対照配列に対応させられている変異型の配列中における欠損を、アミノ酸間隙（＊）により表すことができ、一方で対照配列に対応させられている変異型内における挿入的突然変異は無視し、そして整列させた際の変異型の配列から省略することができる。例えば、以下に示されているものは既知の屈性を有するＨＩＶ単離物のＶ３ループの３つの配列の内の２つの可能なアラインメントである（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：７１−７６）。

を、

［配列中、元々のＨＩＬＶ−ＩＩＩＢ株の残基１５および１６がアラインメント中に含まれる］
のように、あるいはまた、

［配列中、元々のＨＩＬＶ−ＩＩＩＢ株の残基１５および１６がこの配列のアラインメントから棄却されてある］
のように整列させることができる。
蛋白質の所定のＮ個の変異型を、特定のアミノ酸（ａａ）が特定の位置ｎにおいて出現する回数をＯ_n ^aaとして、位置ｎにおけるアミノ酸についての出現頻度をＯ_n ^aa／Ｎにより算出する。特定の位置においてアミノ酸欠損が起こる頻度もこの計算中の因子として組み入れることができる。
別法では、欠損を頻度計算中に考慮しない場合には、特定のアミノ酸の位置ｎにおける計算の際に使用するＮの値は、アミノ酸間隙がその所定位置において存在する変異型の数を下回る変異型の数であるべきことが望ましいであろう。したがってアラインメントの最初の例においてはＯ₁₆ ^Q／Ｎ＝．３３３（３３％）であり、そしてアミノ酸間隙をアミノ酸の種類として特定する場合にはＯ₁₆＊／Ｎ＝．６６７（６７％）であり、そしてそのような特定を行わない場合にはＯ₁₆ ^Q／Ｎ＝１．０（１００％）である。
変異型集団内の各位置ｎにおけるアミノ酸の種類の出現頻度の決定に基づき、ポリペプチド抗原のセットについて対応する位置ｎにおけるある具体的なアミノ酸の種類の含有物についての「閾値」を決定する。その後縮重オリゴヌクレオチド配列を作製することができる。この縮重オリゴヌクレオチド配列は、選択された閾値に基づいて選択された各アミノ酸の種類についてのコドンを生じるように、各コドンの位置において必要なヌクレオチド組合せ物の最低数を有するように設計する。
したがって、Ｎ変異型の集団を一般式
Ａ₁Ａ₂Ａ₃....Ａ_n-2Ａ_n-1Ａ_n,
［式中、各可変Ａ_nはその蛋白質のｎ番目のアミノ酸の位置において出現するアミノ酸を表す］
により表す場合には、縮重オリゴヌクレオチド配列から作製されるポリペプチド抗原のセットを、一般式
Ａ'₁Ａ'₂Ａ'₃....Ａ'_n-2Ａ'_n-1Ａ'_n
［式中、各可変Ａ’_nは縮重オリゴヌクレオチド配列中に対応するコドンの位置における可能なヌクレオチド組合せ物によりコードされるアミノ酸の種類を表す］
により表すことができる。
縮重オリゴヌクレオチド配列を決定するために、ポリペプチド抗原のセット内の含有物についてのアミノ酸の種類を選択するのに使用する閾頻度を一様に各アミノ酸の位置に対して適用させることができる。例えば１５パーセントの閾値を蛋白質配列全体にわたって適用させることができる。別法ではこの閾値を、独立的に各アミノ酸の位置ｎについて設定することができる。例えば閾値を、Ｎ変異型の少なくとも９０％においてその位置に出現するものを例とする最も一般的に出現するアミノ酸の種類を含むように、各アミノ酸の位置ｎにおいて設定することができる。
幾つかの事例においては、ポリペプチド抗原のセット内において対応するアミノ酸の位置において所定数のみのアミノ酸の種類が生じることができるようなコドンの位置の縮重の制約を含む、縮重オリゴヌクレオチド配列の決定のための更に別の基準を適用させることが望ましい。例えば、所定のコドンの位置ｎの縮重配列を、ポリペプチド抗原のセットの内の少なくとも約１１％のポリペプチド内において選択されたアミノ酸が出現するように制限することができる。これは、その縮重コドンの内の可能なヌクレオチド組合せ物の全てがその位置において９つのみのアミノ酸が生じるであろうことを意味する。したがって、ある特定のアミノ酸が所定の位置において出現する頻度は対応するコドンの位置の可能な縮重度に依存するであろう。おそらくこの数は１１．１（９つの異なるアミノ酸）、１２．５（８つの異なるアミノ酸）、１６．６（６つの異なるアミノ酸）２５（４つの異なるアミノ酸）、もしくは５０（２つの異なるアミノ酸）になるであろう。
同様に、頻度分析について変異型の集団を選択するために用いる基準を、ポリペプチド抗原セットの期待される用途のような因子、およびワクチン接種もしくは寛容形成に関する因子により決定することができる。例えば変異型蛋白質配列の分析は、地理学的出現率を初めとする疫学的データのような因子、あるいは別法として既知の対立遺伝子の一族（ＤＱ ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の変異型のようなもの）に基づいて、その蛋白質の変異型のより大きな集団の亜集団のみに限定することができる。同様に、病原体の蛋白質構成成分の場合においては、分析のために選択された変異型の集団を、ある具体的な感受性宿主生物体についての既知の屈性を基にして選択することができる。
ポリペプチド抗原のセットを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる多くの方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドの化学合成を自動ＤＮＡ合成機内において実施することができ、そしてその後に合成オリゴヌクレオチドを発現のための適切な遺伝子内に連結させることができる。開始コドン（ＡＴＧ）を所望であらばこの配列内に作製することができる。この縮重オリゴヌクレオチド配列をある遺伝子構築物内に取り込ませ、そのため主にポリペプチド抗原のセットからなるある蛋白質の発現を可能にさせることができる。別法では、ポリペプチド抗原のセットを融合蛋白質の一部分として発現させることができる。作製した遺伝子ライブラリーを、転写調節配列の操作により適切な転写抑制下にもってくることができる。適切な細胞性分泌経路に沿う組換え蛋白質の輸送を指令するリーダー配列を含む融合蛋白質を作製することが望ましいであろう。
ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られており、それにはペプチド合成のように市販品として入手することができるＤＮＡ合成機内において完全に自動化されている固相合成法がある（引用することによって本明細書中に取り入れられるＩｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，５９８，０４９号明細書、Ｃａｕｒｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，４５８，０６６号明細書、およびＩｔａｋｕｒａの米国特許第４，４０１，７９６号明細書および第４，３７３，０７１号明細書を参照せよ）。
オリゴヌクレオチドの縮重セットの目的は、一つの混合物においてポリペプチドの所望のセットをコード化する全ての配列を提供することである。一般的にはこの混合物の各オリゴペプチドを一つずつ合成することは特に可能な変異型の数が大きい場合には実際的ではないであろう。これらの事例においては、最終オリゴヌクレオチド混合物がポリペプチド抗原の所望のセットをコードする配列を含むように、この配列内の適切な位置にカップリング単位（ヌクレオチド単量体）の混合物を添加するという手法によりその混合物を合成することができる。ＤＮＡ合成の通常の技術は、増進中のオリゴマー内への取り込みに際してそのオリゴマーに対する更に進んたカップリングを後続の脱保護段階が行われるまで阻害するように、反応性デオキシヌクレオチド上の保護基を利用している。したがって縮重配列を作製するためには、一つを上回る種類のデオキシヌクレオチドを同時に、または予めヌクレオチドを混合しておくことか、あるいは合成機をヌクレオチド含有性反応物溶液の適切な容量を送り出すようにプログラム化させておくことのいずれかにより、一回のカップリングの間に増進中のオリゴヌクレオチドと反応させることができる。あるアミノ酸の位置に対応する各コドンの位置には最終的に得られるポリペプチド抗原のセット内のただ一つのみのアミノ酸の種類があるため、オリゴヌクレオチドの縮重セットの各オリゴヌクレオチドは同一のヌクレオチド配列を有するであろう。最終的に得られるセット内に一つを上回るアミノ酸の種類が出現するであろうアミノ酸の位置に対応するコドンの位置においては、オリゴヌクレオチドの縮重セットはそのセット内のその位置においてこれらのアミノ酸をコードするコドンを生じるヌクレオチド配列を含むであろう。幾つかの事例においては、縮重ヌクレオチド配列が有することができる他の組合せ物のために、得られるオリゴヌクレオチドは変異型における出現頻度の分析に基づいて存在するように設計されたもの以外の種類のアミノ酸に特異的なコドンを有するであろう。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当業者に良く知られている（例えば、引用することによって本明細書中に取り入れられる、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９中のＩｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照せよ）。
当業者には良く知られているこの技術を更に詳しく説明するために、蛋白質をコードする遺伝子をＤＮＡ中のデオキシリボヌクレオチドの順序によりアミノ酸配列を具体的に示すが、これはより直接的にはそれらのｍＲＮＡ転写物中のリボヌクレオチドの配列により示される。遺伝子コードの重要な特徴は、２種のアミノ酸を除く全てが一つを上回るヌクレオチドトリプレット（コドン）によりコード化されていることである。この遺伝子コード（デオキシリボヌクレオチドによるもの）は以下のように示すことができる。

先に記載するように、縮重オリゴヌクレオチドを合成するある手法は所定の回のカップリング中に一つを上回る種類のデオキシヌクレオチドを同時に反応させることを伴う。例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）もしくはスレオニン（Ｔｈｒ）のいずれかが所定のアミノ酸の位置に出現した場合には、オリゴヌクレオチドのセットの合成を以下に示すように実施することができ、それは、（合成が３’から５’へと進行すると仮定して）増進中のオリゴヌクレオチドを最初に５’−保護を施してあるチミジンデオキシヌクレオチドに対してカップリングさせ、脱保護化を行い、その後同時に５’−保護を施してあるアデニンデオキシヌクレオチドと５’−保護を施してあるシチジンデオキシヌクレオチドとの混合物と反応させる。得られるオリゴヌクレオチドの脱保護化に際し、５’−保護を施してあるアデニンデオキシヌクレオチドと５’−保護を施してあるシチジンデオキシヌクレオチドとの別の混合物を同時に反応させる。得られるオリゴヌクレオチドのセットはＡＣＴ（Ｔｈｒ）、ＡＡＴ（Ａｓｎ）、ＣＡＴ（Ｈｉｓ）、もしくはＣＣＴ（Ｐｒｏ）のいずれかをそのコドンの位置に含むであろう。したがって、あるコドンの内の一つを上回るヌクレオチドが変化した場合、その合成においてヌクレオチドモノマーを利用すると、可能性としては頻度分析により存在するように設計されたものを含むがこれらには限定されないコドンの混合物をもたらすことがある。
表１を利用して、縮重コドンの位置において頻度分析により選択される値を越えるアミノ酸の種類の数を最小限にするように、特定のアミノ酸の種類についてコドンに対応する可能な組合せ物を有する縮重ヌクレオチド配列を算出することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列を表示するのに利用するために、以下に示すＩＵＰＡＣシンボルおよびその意味を提供する。

特定のアミノ酸の位置においてアミノ酸間隙（欠損）を作製するために、オリゴヌクレオチド混合物の一部分を、ある具体的なコドンの位置をまとめて欠損するように適切な回のヌクレオチド添加の間（すなわち、コドンあたり３回のカップリング反応）に除外させておき、その後に後続のコドンの位置の合成開始時にその混合物に戻してやることができる。
ポリペプチド抗原セットのための全コーディング配列をこの方法により合成することができる。幾つかの事例においては、この方法により縮重オリゴヌクレオチド断片を合成することが望ましく、そしてその後にこれを別に合成した未変異のＤＮＡに連結させてより長い縮重オリゴヌクレオチドを作製する。
同様に、作製したポリペプチド抗原のセット中に一つを上回るアミノ酸の種類を含むアミノ酸の位置はポリペプチド配列内に隣接して存在する必要はない。幾つかの事例においては、多数の縮重オリゴヌクレオチド断片を合成することが望ましいことがあり、この際各断片は一連のポリペプチド抗原のためのコーディング配列の個別の断片に対応する。その後各縮重オリゴヌクレオチド断片を酵素により一続きのアミノ酸をコードする適切な未変異ＤＮＡ配列に連結させることができるが、この一続きのアミノ酸についてはただ一つのみのアミノ酸の種類がポリペプチド抗原のセット内の各位置において出現する。したがって、最終的な縮重コーディング配列は縮重配列および未変異配列の両方の融合により作製する。
これらの方法は、頻度を基にする突然変異を作製するべきポリペプチド抗原の一部分に濃縮させる場合、および縮重ヌクレオチド配列の合成とは別に長い未変異のヌクレオチド配列を合成することが望ましい場合に有用である。
そのうえ、縮重オリゴヌクレオチドを縮重断片として合成し、そしてそれを互いに連結させることができる（すなわち、相補的な張り出し構造を作製することができるか、あるいは平滑末端連結を使用することができる）。相補的鎖としてオーバーラップ断片を合成し、その後アニーリングを行い、そして各鎖に残存する一本鎖領域を充填することが共通している。一般的には、相補鎖のアニーリングを必要とする事例においては、結合点は縮重をほとんど有さない領域内にあることが望ましいとされるであろう。
縮重オリゴヌクレオチド配列の合成から得られ、そしてポリペプチド抗原のセットをコード化するヌクレオチド配列を使用して、微生物作用を介してポリペプチド抗原のセットを産生させることができる。発現ベクターのような遺伝子構築物内へのこの配列の連結、および真核生物（酵母、鳥類、もしくは哺乳類）あるいは原核生物（細菌細胞）のいずれかの宿主内への形質転換もしくはトランスフェクションは、例えばインシュリン、インターフェロン、ヒトの成長ホルモン、ＩＬ−１、およびＩＬ−２などのような他の良く知られている蛋白質を産生する際に用いられる標準的な手法である。類似する手法、あるいはその手法の明白な変法を利用して、微生物的方法もしくは本発明に従う組織培養技術によりポリペプチド抗原のセットを調製することができる。
先に記載するように、遺伝子構築物のライブラリーの形態におけるポリペプチド抗原のセットをコードするオリゴヌクレオチドの縮重セットを原核生物細胞、真核生物細胞、あるいはその両方のいずれかの中における発現に適するあるベクター内に連結させることができる。本発明のポリペプチド抗原のセットの産生のための発現伝達体にはプラスミドもしくは他のベクターがある。例えば、オリゴヌクレオチドの縮重セットの発現に適するベクターには次の種類のプラスミドがあり、それはｐＢＲ３２２、ｐＥＭＢＬプラスミド、ｐＥＸプラスミド、ｐＢＴａｃプラスミド、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核生物性細胞内における発現のためのｐＵＣプラスミドである。
数々のベクターが、酵母中の組換え蛋白質の発現のために存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内への遺伝子構築物を導入させる際に有用なクローニングおよび発現伝達体である（例えば、本明細書中に引用文献として取り込まれているＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｄ Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．８３内のＢｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）を参照せよ）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉの存在のために大腸菌内において、そして酵母の２ミクロンプラスドの複製決定因子のためにＳ．セレビシアエ内において複製することができる。そのうえアンピシリンのような薬剤耐性標識を使用することができる。
好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌中のベクターの増殖を容易にさせるための原核生物性配列と、真核生物細胞中において発現される一つもしくは複数の真核生物性転写単位の両方を含む。ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ２、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適する哺乳類の発現ベクターの例である。これらのベクターはｐＢＲ３２２のような細菌性プラスミドからの配列を用いて修飾を行って、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬剤耐性選択を容易にさせる。別法では、ウシのパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、エプスタイン−バールウイルス（ｐＨＥＢｏおよびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体を、真核生物細胞内における蛋白質の一過性発現のために使用することができる。プラスミドの調製および宿主生物体の形質転換において利用する様々な方法は、当業者に良く知られている。原核生物および真核生物の両方に適する他の発現系、ならびに一般的な組換え方法については、引用することにより本明細書中に取り入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）を参照せよ。
オリゴヌクレオチドの縮重セットの遺伝子構築物のライブラリーを発現させるためには、転写および翻訳調節因子、ならびに発現構築物に対する他の非コーディング配列が含まれることが望ましいことがある。例えば、構成性および誘導可能プロモーターならびにエンハンサーを含む調節因子を取り込ませることができる。
幾つかの事例においては、縮重オリゴヌクレオチド配列に対して開始コドン（ＡＴＧ）を添加する必要があるであろう。当業者には、Ｎ−末端位置におけるメチオニンを、酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の利用により酵素的に開裂することができることが知られている。ＭＡＰは大腸菌（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：７５１−７５７）およびサルモネルラ ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からクローン化されており、そしてそのインビトロ活性が組換え蛋白質について証明されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２７１８−１７２２）。したがって、所望であらばＮ−末端メチオニンの除去を、インビボにおいてＭＡＰを産生する宿主内（例えば、大腸菌もしくはＣＭ８９もしくはＳ．セレベセシアエ）においてポリペプチド抗原のセットを発現させることにより、あるいはインビトロにおいては精製したＭＡＰの利用により（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．の手法）を達成することができる。
別法では、ポリペプチド抗原のためのコーディング配列を、微生物による発現のための内因性蛋白質を含む融合遺伝子の一部分として取り込ませることができる。一例では、ロタウイルスのＶＰ６カプシド蛋白質を、単量体形態もしくはウイルス性粒子の形態のいずれかにおいて、ポリペプチド抗原のセットのための免疫学的担体蛋白質として使用することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列のセットを、後期ワクシニアウイルス構造蛋白質のためのコーディング配列を含む融合遺伝子構築物内に取り込ませて、ビリオンの一部分としてポリペプチド抗原のセットを含む融合蛋白質を発現する組換えウイルスのセットを産生させることができる。Ｖ−３ループ／Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白質の利用に関しては、組換えＢ型肝炎ビリオンもこの役割において利用することができるということが証明されている。同様に、ポリペプチド抗原のセットおよびポリオウイルスのカプシド蛋白質を含む融合蛋白質をコードするキメラ構築物を作製して、ポリペプチド抗原のセットの免疫原性を亢進させることができる。ポリペプチド抗原のセットを確立するためのこのような融合蛋白質発現系の利用は、しばしば免疫原に対する反応の際の両方のＢ−細胞増殖を誘導するという利点を有している。（例えば、引用することによって本明細書中に取り入れられる欧州特許出願公開第０２５９１４９号明細書、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８５５；およびＳｃｈｌｉｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６６：２、を参照せよ）。ペプチドを基にするワクチンのための多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）系を利用することができるが、この系においては、ポリペプチド抗原のセットをオリゴマーである分岐鎖状のリシンコアー上に、ペプチドの有機化学合成から直接的に取得する（例えば、引用することによって本明細書中に取り入れられるＰｏｓｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＪＢＣ ２６３：１７１９、およびＮａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：９１４、を参照せよ）。外来性の抗原決定基も、細菌性細胞により発現および提供される。
融合遺伝子を作製するための技術は良く知られている。異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の接合は主に、連結のための平滑末端もしくはスタッガー末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合に応じての付着末端の充填、所望されない接合を回避させるためのアルカリフォスファターゼ処理、および酵素的連結を利用する通常の技術に従って実施する。別法では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を初めとする通常の技術により合成することができる。
ポリペプチド抗原のセットを作製するための別の研究方法は、直接的にペプチド合成を実施することである。縮重オリゴヌクレオチド内における各コドンの位置ｎにおいては、可能な各ヌクレオチド組合せ物、ならびにポリペプチド抗原のセットの対応するアミノ酸の位置における含有物のために表示される対応するアミノ酸を決定することができる。したがって縮重ポリペプチド配列の合成を行うことができるが、その配列においては配列の分岐は、縮重オリゴヌクレオチドの対応するコドンの位置において一つを上回るアミノ酸がコードされるそれらのアミノ酸の位置において出現する。ポリペプチドの有機化学的合成は良く知られており、そしてこれを、自動化蛋白質合成機を使用する固相ペプチド合成のような手法により実施することができる。
ポリペプチドの合成は一般的には、ペプチド結合を形成するためのあるアミノ酸のカルボキシル基および他のアミノ酸のアミノ基の縮合を介して実施される。一つの配列は、オリゴヌクレオチドの合成に類似する方法において、段階的伸長反応における個々のアミノ酸残基の縮合を繰り返すことにより構築することができる。このような縮合においては、この反応に関与しないアミノおよびカルボキシル基は簡便に導入することが可能で、縮合反応に対して安定であり、そして完成したペプチドから選択的に除去することができる保護基で遮蔽することができる。したがって全体的な過程は、一般的には保護化、活性化、カップリング、および脱保護化を含む。あるペプチドが、縮合の間に反応する可能性のある側鎖を有するアミノ酸を伴う場合には、この側鎖もやはり可逆的に保護し、合成の最終段階において除去することができる。
直線的手法による大きなポリペプチドについての成功例としての合成は、各化学段階に関してほぼ定量的な収率を達成する必要がある。多くの自動化ペプチド合成スキームは、各反応段階の後にポリペプチドを洗浄して副産物および余剰反応物がない状況にさせることが可能な不溶性ポリマー樹脂担体に対して増進中のポリペプチドを結合させることを利用している（引用することによって本明細書中に取り入れられるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ． ８５：２１４９；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １１：２４６；ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ｖｏｌ２ ^▲Ｃ▼１９７９ ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ１−２８４；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５４１９；およびＴａｍ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，５０７，２３０号明細書を参照せよ）。例えば、第一アミノ酸をそのカルボキシル基に対する開裂可能な連結によりある樹脂に対して付着させ、そのアミノ酸側鎖を脱保護化させ、そして保護されているａ−アミノ基を保持する第二アミノ酸とカップリングさせる。得られる保護化ジペプチドを脱保護化させて遊離アミノ末端を生じ、そして第三のＮ−保護化アミノ酸に対してカップリングさせる。これらの段階を数回反復させた後、完成したポリペプチドを樹脂担体から開裂させ、そして適切な方法で脱保護化させる。
ポリペプチド抗原のセットを作製するためには、一つを上回るＮ−保護化アミノ酸の種類を各回のカップリング反応において同時に増進中のポリペプチド鎖と反応させて、各アミノ酸の位置において所望の縮重アミノ酸配列を作製する。ある態様においては、ポリペプチドのセットは、予め決定されている閾頻度を上回る変異型集団中のいずれかの位置ｎに存在するアミノ酸のみを含むであろう。別法では、まず縮重オリゴヌクレオチドを設計し、組合せ物のコドンによりコード化されるアミノ酸を決定し、そして化学合成において全てのアミノ酸を含有させることができる。例えば、配列ＭＭＴを有し、そしてそのためＴｈｒ（ＡＣＴ）、Ａｓｎ（ＡＡＴ）、Ｈｉｓ（ＣＡＴ）、もしくはＰｒｏ（ＣＣＴ）のいずれかをコードするコドンの位置ｎにおける縮重コドンを、４つのＮ−保護化アミノ酸の種類の全てを同時に、増進中であって樹脂に結合させてあるペプチドの遊離アミノ末端と反応させることによりペプチド合成レベルにおいて作製することができる。したがってペプチドの４つの亜集団が作製されるであろうが、各亜集団は、コドンの位置ｎに対応するアミノ酸の位置ｎにおいて存在するアミノ酸の種類により特定することが可能である。
樹脂に結合させてあるポリペプチドに対して添加されているアミノ酸は保護化されているため、ペプチド鎖の増進は、後続の脱保護化段階になるまでは、保護化されているアミノ酸のみを添加の際に停止させる。当業者は、様々なアミノ酸アナログの反応性において起こり得る差異のために、当モル比の亜集団を取得する目的で一つを上回るアミノ酸の種類を同時に反応させる場合には、非当モル比のアミノ酸の種類を使用することが望ましいことがあることを理解するであろう。別法では、樹脂に結合させてあるポリペプチドを幾つかの分画に分配することが望ましいことがあり、この場合分配された分画の各々を個別のアミノ酸の種類と反応させ、ポリペプチド産物を次のカップリング反応の前に組み合わせる。この技術を適用させて、一回のカップリングの間に適切な分画を単に除外させておき、そしてその後に次の回のカップリングの前に樹脂に結合させてあるポリペプチド全てを組み合わせることにより、亜集団内にアミノ酸ギャップを作製することができる。そのうえ、取得することができる多くの異なる保護基および活性化用の基から、ポリペプチドの化学合成を、Ｎ−末端からＣ−末端方向へ、あるいはＣ−末端からＮ−末端方向へのいずれかにおいて実施することができることは明白である。
作製されたポリペプチド抗原のセットを共有結合により、あるいは非共有結合により、脂質もしくは炭化水素のような非タンパク質性物質で修飾して、免疫原性もしくは溶解度を亢進させることができる。本発明は、修飾させたペプチド抗原が親混合物の抗原／免疫原特性の全てを実質的に保持する限り、ポリペプチド抗原のセットのこのような化学修飾の全てを含むものと理解される。
作製された一連のポリペプチド抗原もやはり、免疫原性を亢進させる目的で、ウイルス粒子、複製用ウイルス、もしくは他の微生物とカップリングさせるかもしくはその中に取り込ませることができる。ポリペプチド抗原のセットは、ウイルス粒子、もしくは微生物、もしくはそれらの免疫原性部分に対して化学的に結合させることができる。
当業者に知られている多大な数の化学的架橋試薬が存在する。本発明のためには、好ましい架橋試薬は異質二官能性架橋剤であり、これを利用して段階的方法において蛋白質を連結させることができる。異質二官能性架橋剤は蛋白質を接合させるためのより特異的なカップリング方法を設計するための能力を提供し、このことによりホモ蛋白質ポリマーのようなあってほしくない副反応の発生を低減させる。広範囲にわたる様々な異質二官能性架橋剤は当業者に知られている。これらには、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル酸エステル（ＳＭＣＣ），ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチル酸エステル（ＳＭＰＢ）、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸エステル（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサン酸エステル（ＬＣ−ＳＰＤＰ）がある。Ｎ−ヒドロキシスクシンイジド部分を有するこれらの架橋試薬は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドアナログとして取得することができ、このアナログは一般的により大きな水可溶性を有する。そのうえ結合性鎖内にジスルフィド架橋を有するこれらの架橋試薬は、その代わりにインビボにおけるリンカーの開裂の量を低減させるようにアルキル誘導体として合成することができる。
動物内への抗原の導入は、細胞性および体液性免疫の両方において頂点を極める一連の出来事を開始させる。申し合わせにより、免疫反応を誘導させることができる分子の特性を免疫原性と称する。誘導された抗体と反対することが可能である特性を抗原性と称する。２つもしくはそれを上回る異なる抗原と交差反応することができる抗体は、複数の抗原の抗原決定基（もしくは「エピトープ」）の間のある程度の構造的および化学的類似性によりそのような反応を行うことができる。蛋白質免疫原は、通常数々の抗原決定基からなる。そのため、ある蛋白質での免疫化は異なる特異性を有する抗体分子の形成をもたらし、そして異なる抗体の数は抗原決定基およびそれら固有の免疫原性の数に依存する。
蛋白質は、それらが普通の（「自己の」）構成成分ではない動物内に注入される際には高度な免疫原性を示す。それとは逆に、約５０００ダルトンを下回る分子量を有するペプチドおよび他の化合物（「ハプテン」と称する）は、それ自体では一般的に抗体の形成を誘導しない。しかしながらそれらの小さな分子抗原が最初にある蛋白質のようなより長い免疫原性抗原と結合する場合には、その小さな分子上のエピトープに特異的に結合する抗体が生じることがある。ハプテンの担体蛋白質への結合は先に記載されるように実施することができる。
免疫原を調製するためのそのようなリガンドの修飾が必要である場合には、抗体の構造特異性に及ぼす影響を考慮に入れる必要がある。すなわち、蛋白質のような担体に対する結合のためのリガンド上の部位を選択する際に、得られる免疫原の投与によりもともとのリガンドを認識するであろう抗体が提供されるように選択される部位を選択するということである。そのうえ、抗体がもともとのリガンドを認識する必要があるのみではなく、免疫原の投与後に産生される抗体が患者のサンプル中においても存在する可能性があるリガンドに対して密接に関連する化合物をおそらく識別するであろうように免疫原のリガンド部分の重要な特性がそのまま残されている必要もある。そのうえ、抗体は高い係合係数を有するべきである。
作製されたポリペプチド抗原のセットを含むワクチン、および抗原特異性を有するその変異型を、当業者に良く知られている手法により調製することができる。例えば、そのようなワクチンを、液体溶液もしくは懸濁液を一例とする注射剤として調製することができる。注射の前に液体中の溶液もしくは懸濁液にさせるための固体形態も調製することができる。場合によっては調製物を乳化させることもできる。活性抗原成分もしくは複数の成分を、薬剤学的に許容されそして活性成分と適合する賦形剤と混合させることができる。適切な賦形剤の例は、水、食塩水、デキストローズ、グリセロール、およびエタノールなどのようなもの、ならびにそれらの組合せ物である。そのうえ所望であらばこのワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤のような少量の補助的物質、ｐＨ緩衝化試薬、あるいは水酸化アルミニウムもしくはムラミルジペプチドもしくはその変異型のようなアジュバントを含むことができる。ペプチドの場合においては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなより大きな分子へのカップリングは時として免疫原性を亢進させる。ワクチンは常法では例えば皮下的もしくは筋肉内的のいずれかによる注射により非経口的に投与される。他の様式の投与に適する追加的製剤には坐薬および幾つかの事例においては経口製剤がある。坐薬については、通常の結合剤および担体には例えばポリアルカレングリコールもしくはトリグリセリドがある。坐薬は約０．５％から約１０％まで、好ましくは約１％から約２％までの範囲内の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口調剤は、例えばマニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの薬剤学的等級のような通常に利用される賦形剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、除放性調剤、もしくは粉末のような形態を取り、そして約１０％から約９５％まで、好ましくは約２５％から約７０％までの活性成分を含むことができる。
活性化合物を、中性形態もしくは塩形態としてワクチンに調剤することができる。薬剤学的に許容される塩には、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基を使用して形成される）があり、そしてこれは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマンデル酸などのような有機酸を使用して形成される。遊離のカルボキシル基を使用して形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなどのような有機塩基から得ることができる。ワクチン組成物は、主要中和ドメインを含む蛋白質断片との組合せ物中においてＴヘルパー細胞エピトープを含むペプチドを含むことができる。例えば、これらのエピトープの内の幾つかのものはＨＩＶ包膜内における地図上の位置が決定されており、そしてこれらの領域は増殖および白血球からのリンホカイン放出を刺激化することが示されている。ＨＩＶ−１単離物の分析に由来して作成されたポリペプチド抗原のセットを含むワクチン中にこれらのエピトープの両方を提供することにより、体液性および細胞性免疫反応の両方の刺激化をもたらすことができる。そのうえ、市販の担体およびアジュバントを、ある免疫原についてＢ−細胞集団およびＴ−細胞集団の両方の免疫調節を亢進させるのに利用する（例えば、Ｉｍｊｅｃｔ Ｓｕｐｅｒｃａｒｒｉｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、カタログ番号第７７１５１Ｇ番）。
別法では、ワクチン組成物は、一般的な免疫反応を増大させるために機能する化合物を含むことができる。このような化合物の一つはインターロイキン−２（ＩＬ−２）であり、これは一般的免疫刺激により免疫原性を亢進させることが報告されている（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。ＩＬ−２は作成されたポリペプチド抗原のセットのポリペプチドと結合させて、ワクチン接種の効力を亢進させることが可能である。
ワクチンは、投薬調剤に適合する様式において、そして治療学的に有効でありそして免疫原性を示すであろう量において投与する。投与されるべき量は、治療されるべき被検体、抗体を合成するための被検体の免疫系の能力、および所望される保護の度合に依存する。投与するのに必要な活性成分の厳密な量は開業医の判断によって決まり、そして各固体について固有のものとなる。最初の投与およびブースター注射に適する養生法も変化させることができるものの、典型的には最初の投与の後に１週間もしくは２週間の間隔を置き、その後に後続の注射もしくは他の投与を行う。
寛容を誘導する抗原は寛容原と称され、免疫性を生じる免疫原から識別される。免疫原性抗原に対する個体の露出により特異的な免疫性が刺激化され、そして大半の免疫原性蛋白質に関しては後続の露出により二次反応の亢進が起こる。それとは対照的に、寛容原性抗原に対する露出は特異的免疫性を誘導しないばかりか、同一抗原の免疫原形態の後続の投与による白血球の活性化を阻害する。多くの外来性抗原は免疫原もしくは寛容原であることがあり、それは物理化学的形態、容量、および投与の経路に依存する。抗原に対する反応を操作するこの能力を臨床学的に活用して、特異的免疫性を増大もしくは抑制させることができる。例えば、臓器移植技術の情況においては、拒絶を最低限に押さえる目的で、移植される組織上に存在するクラスＩＩペプチド（すなわち、ＤＱもしくはＤＲ対立遺伝子産物のようなもの）の既知のサブ−ハプロタイプの頻度分析から得られるポリペプチド抗原セットで移植片受容体を寛容化させることが所望されることがある。ポリペプチド抗原のセットを、例えばＣ−ｍｙｃ発現の脱抑制化を引き起こす試薬もしくは双翅目の毒素のような細胞毒素を一例とする枯死化試薬を使用して融合蛋白質の一部分として化学的に結合させ、あるいは取り込ませ、それによりプログラム化される細胞死を抗原特異的な様式において引き起こすことができる。
したがって、本発明のポリペプチド抗原のセットに対する寛容を誘導させるのに必要な適切な投与養生法を決定することは、当業者にとっての日常的な作業になるであろう。
以下に示す実施例は更に詳しく本発明を説明するのに役立つ。
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の作因物質であるヒトの免疫不全ウイルスタイプＩ（ＨＩＶ−１）は、異なる単離物間で非常に顕著な配列多様性を示す。ビリオンのＣＤ４への結合を容易にさせるＨＩＶ−１の外部包膜糖蛋白質ｇｐ１２０は、中和抗体の主要標的であることが示されている。ヒトおよびマウスにおける研究により、この蛋白質の小領域が明らかにされたが、それはＶ３ループと称され、システイン残基３０３と３３８との間に存在し、そしてウイルスに対する主要中和抗体を誘導するものである。ＨＩＶ−１単離物のＶ３ループエピトープを含む組換えもしくは合成ポリペプチドは、比較的高い力価の種特異的中和抗体を誘導することが示されている。しかしながらＶ３ループ内におけるたった一つのアミノ酸置換でさえも、幾つかの事例においては抗体結合性をかなり低減させるのに十分であり、このことはＶ３ループに対する中和抗体の厳密な特異性に矛盾していない。
表３は、北アメリカにおけるＡＩＤＳ患者から主に取得したＨＩＶ−１単離物の集団のＶ３ループ配列の頻度分析により得られる結果を示す（引用することによって本明細書に取り入れられるＷｏｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１１３４；ＬａＲｏｓａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：９３１；およびＨｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：６８００、を参照せよ）。各変異型配列のアラインメントを対照配列のものに対応させてある

［配列中、対照配列のｃｙｓ−１は本明細書中において用いられる命名法に従うとｇｐ１２０のｃｙｓ−３０３に対応する］。

表３において算出された出現頻度のデータから、我々は分析を行った変異型の少なくとも９０％に集合的に表される各位置において最も一般的に出現するアミノ酸の種類を決定した。対応する縮重コドンを各アミノ酸の位置について選択し、そしてこれを用いて縮重オリゴヌクレオチド配列を決定したが、この縮重オリゴヌクレオチド配列は、いずれかの側にＶ３ループ配列を挟み込む１０のアミノ酸残基のためのコドンを含み、これは一般的な配列

により表される。
この縮重ヌクレオチドコードは一般的な配列

［配列中、
Ｘａａ₁は、ＴｈｒおよびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₂は、ＡｓｎおよびＳｅｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₃は、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｘａａ₄は、ＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｘａａ₅は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、およびＳｅｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₆は、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、およびＨｉｓからなる群より選択され、
Ｘａａ₇は、ＭｅｔおよびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₈は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択され、
Ｘａａ₉は、ＶａｌおよびＡｌａからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₀は、ＩｌｅおよびＰｈｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₁は、ＨｉｓおよびＴｙｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₂は、ＡｌａおよびＴｈｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₃は、ＩｌｅおよびＴｈｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₄は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、およびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₅は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₆は、ＰｈｅおよびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₇は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₈は、ＡｓｎおよびＡｓｐからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₉は、ＬｙｓおよびＧｌｎからなる群より選択される。］
により表されるポリペプチド抗原のためのものである。
先に記載されるように、縮重オリゴヌクレオチドを適切なＤＮＡと酵素的に連結させて、ポリペプチド抗原セットを含む蛋白質をコードする遺伝子ライブラリーを作製することができる。
同様に、変異型の少なくとも８０％において集合的に表される各位置における最も一般的に出現するアミノ酸の種類を分析した。この事例においては、決定された縮重オリゴヌクレオチド配列は、一般的な配列

によって表され、
そして以下に示す一般的な配列

［配列中、
Ｘａａ₁は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択され、
Ｘａａ₂は、ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ₃は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎからなる群より選択され、
Ｘａａ₄は、ＩｌｅおよびＭｅｔからなる群より選択され、
Ｘａａ₅は、ＰｈｅおよびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₆は、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択され、
Ｘａａ₇は、ＧｌｙおよびＧｌｕからなる群より選択され、
Ｘａａ₈は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ₉は、ＩｌｅおよびＶａｌからなる群より選択される。］
により表されるポリペプチド抗原セットに対応する。
分析を行ったＨＩＶ−１ Ｖ３ループ変異型の集団を、ウガンダ起源のＨＩＶ−１単離物（引用することによって本明細書中に取り入れられるＯｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ７：６０５を参照せよ）からの配列を含むように選択した場合、以下に示す縮重オリゴヌクレオチド配列を決定した。

このセットは、一般式

［配列中、
Ｘａａ₁は、ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₂は、ＡｓｎおよびＴｙｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₃は、ＡｓｎおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｘａａ₄は、ＡｓｎおよびＬｙｓからなる群より選択され、
Ｘａａ₅は、ＴｈｒおよびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₆は、ＡｒｇおよびＩｌｅからなる群より選択され、
Ｘａａ₇は、ＬｙｓおよびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ₈は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、およびＡｒｇからなる群より選択され、
Ｘａａ₉は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＬｅｕからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₀は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、およびＴｈｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₁は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＬｅｕからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₂は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＧｌｎからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₃は、ＡｌａおよびＶａｌからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₄は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＶａｌからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₅は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、およびＬｅｕからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₆は、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＧｌｕからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₇は、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₈は、ＩｌｅおよびＴｈｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₁₉は、ＡｓｐおよびＴｙｒからなる群より選択され、
Ｘａａ₂₀は、ＡｒｇおよびＧｌｙからなる群より選択され、
Ｘａａ₂₁は、ＨｉｓおよびＴｙｒからなる群より選択される。］
により与えられる以下に示すポリペプチド抗原セットをコードしている。
縮重オリゴヌクレオチド配列を合成するために、以下に示す合成オリゴヌクレオチドを作製した。

これらのオリゴヌクレオチドは以下に示すように組み立てた。

先のオリゴヌクレオチド各々の保存溶液を、そのオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解させることにより作成した。保存溶液の分画をキナーゼ処理し、その後クレノウ緩衝液と滅菌水中にアニーリングのために一緒に混ぜ合わせた。この反応混合物を９４℃に加熱し、そして１５秒毎に１℃づつの割合でゆっくりと冷却させた。その後この反応混合物に対してｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、クレノウ、ＡＴＰ、およびリガーゼを添加した。この混合物を室温において一晩インキュベートさせた。その後この混合物を９５％エタノールで沈殿させ、そしてＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、そして２０マイクロリットルの滅菌水中に溶解させた。
単離されたＤＮＡ配列を、その後５’および３’アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒｓ）として各々ＣＲ１１およびＣＲ１２を使用してＰＣＲ増幅を行った。５’アンプリマーはＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、およびＰｖｕＩＩ部位を有し、そして３’アンプリマーは幾つかの発現系内へのクローニングを可能にさせるＳａＩＩ部位を有する。
このＰＣＲ産物をゲル電気泳動上で単離し、「Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ」（Ｂｉｏ１０１）を使用して清浄な状態にさせ、そしてＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素で切断した。その後制限消化を行ったＤＮＡライブラリーを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩならびにウシの腸のフォスファターゼで処理したｐＦＬＡＧプラスミド（ＩＢＩ ＦＬＡＧ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社、カタログ番号：ＩＢ １３０００）内にクローン化させた。そのように作製されたベクターのライブラリーは、ＦＬＡＧペプチド遺伝子とＶ３遺伝子変異型との読み枠内融合物（ｉｎ−ｆｒａｍｅ ｆｕｓｉｏｎ）をコードしている。ＩＰＴＧでの誘導化の際に、ＦＬＡＧペプチド（アミノ−末端）とＶ３ループ変異型（カルボキシ−末端）からなる融合ポリペプチドのライブラリーが産生される。
このＰＣＲ産物（Ｖ３ループ遺伝子ライブラリー）もＰｖｕＩＩおよびＳａｌＩで切断し、そしてｐＥＺＺｍｐ１８もしくはｐＥＢＢｍｐ１８発現系（引用することによって本明細書中に取り入れられるＳｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １２４：４３を参照せよ）内に連結させて、ぶどう球菌の蛋白質とＶ３配列とを含む融合蛋白質のライブラリーを作製することができる。３つのプラスミド全ては、適切な宿主生物体中における複製を稼働させるためのｐＢＲ３２２ ｏｒｉ、および部位特異的突然変異誘発を容易にさせるためのＦ１ ｏｒｉを含んでいる。
例えば、先に作製したＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで切断し、そしてＶ３ループのコーディング配列を有する読み枠内のエンテロキナーゼ開裂認識（ＥＫＣＲ）配列をコード化する二本鎖のオリゴヌクレオチド

に連結させた。
その後得られるＥＫＣＲ／Ｖ３ループ誘導遺伝子を、ＥＫＣＲ／Ｖ３融合蛋白質を対応する制限エンドヌクレアーゼで処理することにより作製したＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ張り出し構造を使用して、ｐＥＺＺ−１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、カタログ番号２７−４８０−０１）のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位内に連結させた。このｐＥＺＺ−１８ベクターは、プロテインＡのシグナル配列、およびプロテインＡの「Ｂ］ＩｇＧ結合ドメインを基にした２つの合成「Ｚ」ドメインを含む。この構築物は「ＺＺ」融合蛋白質を大腸菌から選択すること、および水性環境における溶解度を増大させ、そしてＩｇＧカラム上における融合蛋白質の親和性精製を容易にさせることを可能にする。したがって、得られる融合遺伝子は、ＺＺ／ＥＫＣＲ／Ｖ３ループ融合蛋白質をコード化している。プロテインＡの配列を、エンテロキナーゼでの得られる融合蛋白質の処理によりＶ３から除去することができる。引用することによって本明細書中に取り入れられるＳｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：７５６；およびＦｏｒｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ． １１：２０１を参照せよ。
ｐＥＺＺ−１８構築物を作製し、そしてこれを使用して感応細胞を形質転換させた。その後、得られた融合蛋白質を精製した。簡潔に述べると、ＺＺ／ＥＫＣＲ／Ｖ３構築物を保持する細胞を２×ＹＴ培地中で育成させた。この細胞を生育の後期定常期に収集し、そして超音波処理用緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、１０％のグリセロール、２μｇ／ｍｌのアプロニン）中に再懸濁させた。超音波処理後、溶菌液をＢｅｃｋｍａｎ ＪＡ−１７ローター中において１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心処理を施した。その後上清を、製造元の実験計画書に従って、ＩｇＧを含む親和性精製カラムに供した。親和性精製を行ったＶ３ループを、ＰＡＧＥおよび電気溶出による更に進んだ精製に供した。
ポリペプチド抗原のセットを使用して標準的な免疫化手法により、ウサギにおけるポリクローナル血清を作製し、そしてポリクローナル抗体混合物を精製することができる。ＨＩＶの感染性アッセイおよびｇｐ１２０／ＣＤ４結合アッセイを試用してＨＩＶの変異型に対する免疫反応（すなわち抗体反応）を誘導させる際にポリペプチド抗原のセットの有効性をテストすることができる。
進化的タイムテーブルを圧縮させる目的でポリクローナル血清を試用して、ウイルスに関する選択的突然変異の圧力を人工的に適用させることができる。例えば、新規の変異型にポリクローナル血清による認識を回避させることを可能にさせるという様式において突然変異を生じることが可能なＨＩＶ−感染細胞の評価値を決定することができる。これらの変異型は配列が決定され、そして後続のポリペプチド抗原のセット内に含まれるように荷重をかけた様式における集団分析に組み入れられることであろう。
等価物
当業者は、本明細書において記載される具体的な手法に対する数々の等化物に気がつくであろうし、あるいはそのような等価物が日常的な実験のみを試用することを察知することができるであろう。このような等価物は本発明の範囲内に含まれるものとみなされ、そして以下に示す請求の範囲に含まれる。
配 列 表
（１）一般情報
（ｉ）出願者：ＣＲＥＡ，ＲＯＢＥＲＴＯ
（ｉｉ）発明の名称：組合せポリペプチド抗原
（ｉｉｉ）配列の数：１９
（ｉｖ）連絡用住所：
（Ａ）住所：ＬＡＨＩＶＥ ＆ ＣＯＣＫＦＩＥＬＤ
（Ｂ）街路名：６０ ＳＴＡＴＥ ＳＴＲＥＥＴ，ＳＵＩＴＥ ５１０
（Ｃ）市：ＢＯＳＴＯＮ
（Ｄ）州：ＭＡ
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：０２１０９
（ｖ）コンピューター解読可能形態：
（Ａ）メディウムの種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエアー：ＡＳＣＩＩ ＴＥＸＴ
（ｖｉ）現行の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）提出日：１９９３年６月１８日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）これまでの出願データ
（Ａ）出願番号：ＵＳ ０７／９００，１２３
（Ｂ）提出日：１９９２年６月１８日
（ｖｉｉｉ）弁護士／代理店の情報：
（Ａ）氏名：ＤｅＣｏｎｔｉ，Ｇｕｉｌｉｏ Ａ．
（Ｂ）登録番号：３１，５０３
（Ｃ）参照／処理番号：ＣＴＥ−００３ＰＣ
（ｉｘ）テレコミュニケーション情報：
（Ａ）電話：（６１７）２２７−７４００
（Ｂ）テレファックス：（６１７）２２７−５９４１
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｘｉ）配列

（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｘｉ）配列

（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｘｉ）配列

（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｘｉ）配列

（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｘｉ）配列

（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５５
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１２
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＴｈｒもしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１５
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｓｎもしくはＳｅｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１９
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇもしくはＬｙｓ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２０
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇもしくはＬｙｓ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２１
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇ、Ｇｌｙ、もしくはＳｅｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２３
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、もしくはＨｉｓ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２４
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＭｅｔもしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２８
（Ｄ）他の情報：／注記”ＸａａはＬｙｓもしくはＡｒｇ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２９
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＶａｌもしくはＡｌａ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３０
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅもしくはＰｈｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３１
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＨｉｓもしくはＴｙｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３２
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｌａもしくはＴｈｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３３
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅもしくはＴｈｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、もしくはＧｌｙ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３５
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＧｌｙ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３６
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＰｈｅもしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３７
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、もしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３９
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｓｎもしくはＡｓｐ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：４２
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＬｙｓもしくはＧｌｎ”
（ｘｉ）配列

（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５５
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２０
（Ｄ）他の情報：／注記”ＸａａはＬｙｓもしくはＡｒｇ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２１
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＳｅｒもしくはＧｌｙ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２３
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、もしくはＡｓｎ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２４
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅもしくはＭｅｔ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３０
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＰｈｅもしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３２
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＴｒｅもしくはＡｌａ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＧｌｙもしくはＧｌｕ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３５
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、もしくはＧｌｎ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３７
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅもしくはＶａｌ”
（ｉｘ）配列

（２）配列番号１０についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１２
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＴｈｒもしくはＳｅｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１５
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＳｅｒもしくはＴｙｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１６
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｓｎもしくはＬｙｓ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１７
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｓｎもしくはＬｙｓ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１８
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＴｈｒもしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：１９
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇもしくはＩｌｅ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２０
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＬｙｓもしくはＧｌｎ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２１
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＳｅｒ、Ｇｌｙ、もしくはＡｒｇ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２２
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＬｅｕ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２３
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＨｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、もしくはＴｈｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２４
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＬｙｓ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２８
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、もしくはＧｌｎ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：２９
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｌａもしくはＶａｌ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３０
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＶａｌ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３１
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、もしくはＬｅｕ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＧｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＧｌｕ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３５
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅ、Ｌｙｓ、もしくはＡｒｇ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３６
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＩｌｅもしくはＴｈｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：３８
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｓｐもしくはＴｙｒ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：４０
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＡｒｇもしくはＧｌｙ”
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：修飾部位
（Ｂ）存在位置：４３
（Ｄ）他の情報：／注記＝”ＸａａはＨｉｓもしくはＴｙｒ”
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３９
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６９
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３７
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

（２）配列番号１９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列

Claims (10)

1. ａ．式
   Ａ₁Ａ₂Ａ₃・・・・Ａ_n-2Ａ_n-1Ａ_n
   ［式中、Ａｎは蛋白質もしくはその一部分のアミノ酸の位置ｎに存在するアミノ酸である。］
   により表され、かつ変異型の集団を示すある蛋白質もしくはその一部分を選択する段階、
   ｂ．変異型における各アミノ酸の位置ｎに出現する各種類のアミノ酸の回数Ｏｎａａを決定する段階、
   ｃ．変異型における各アミノ酸の位置ｎにおける各種類のアミノ酸の出現頻度（Ｏｎａａ／Ｎ）ｎを算出する段階（ここで、該変異型の数はＮにより表される。）、
   ｄ．段階ｃにおける各アミノ酸の位置ｎに対応する各コドンの位置(各アミノ酸をコードするコドンの位置)におけるヌクレオチドの組み合わせ物であって、ある選択された頻度を上回って出現する各種のアミノ酸をコードするコドンおよび該選択された頻度を下回って出現する各種アミノ酸をコードするコドンを含む組み合わせ物を有するオリゴヌクレオチドのセットを合成する段階、および
   ｅ．式
   Ａ′₁Ａ′₂Ａ′₃・・・・Ａ′_n-2Ａ′_n-1Ａ′_n
   ［式中、Ａ′ _n は前記オリゴヌクレオチド中の各アミノ酸の位置ｎに対応するコドンの位置における可能なヌクレオチドの組み合わせ物によりコードされるアミノ酸の種類として定義される。］
   により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド抗原のセットを作製する発現系で該オリゴヌクレオチドを発現する段階、
   を含んでなる、ある蛋白質もしくはその一部分の変異型の集団に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチド抗原のセットの作製方法。
2. ポリペプチド抗原のセットが請求項１のｎが８以上１５０以下である請求項１に記載の方法。
3. 選択された頻度が５％である、請求項１に記載の方法。
4. 選択された頻度が１０％である、請求項１に記載の方法。
5. 蛋白質がある病原体の免疫原性構成成分である、請求項１に記載の方法。
6. 病原体の免疫原性構成成分が一つもしくは複数の中和抗原エピトープを含む、請求項５に記載の方法。
7. 蛋白質がウイルスの構成成分である、請求項５に記載の方法。
8. 蛋白質がＨＩＶ−１の構成成分である、請求項７に記載の方法。
9. 蛋白質がｇｐ１２０もしくはその一部分である、請求項８に記載の方法。
10. ある蛋白質の一部分がｇｐ１２０のＶ３ループである、請求項９に記載の方法。