MXPA04007646A

MXPA04007646A - Formulaciones inmunogenicas de epitodes peptidicos y procesos para la preparacion de las mismas.

Info

Publication number: MXPA04007646A
Application number: MXPA04007646A
Authority: MX
Inventors: V Torres Jose
Original assignee: Variation Biotechnologies Inc
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2005-05-27
Also published as: ATE533113T1; EP1476182A1; WO2003066090A1; JP2005531499A; AP2004003081A0; EA008143B1; JP4391827B2; AP2393A; EP1476182B1; AU2002231510A1; CN1625409B; CN1625409A; EA200400897A1; AU2002231510B2; CA2472265A1; CA2472265C

Abstract

Se describe un proceso para la preparacion de una mezcla de peptidos inmunogenica en una sintesis unica. La mezcla de peptidos representa colectivamente la variabilidad in vivo observada en epitopes inmunogenicos de un patogeno. La mezcla se denomina una construccion de epitope hipervariable (HEC). La inmunizacion con HEC evoca inmunidad ampliamente reactiva contra cepas divergentes de un patogeno en el cual HEC se basa.

Description

FORMULACIONES INMUNOGÉNICAS DE EPÍTOPES PEPTÍDICOS VARIABLES Y PROCESOS PARA LA PREPARACIÓN DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a una formulación inmunogénica y un proceso para su preparación . Más particu larmente , la presente invención se refiere a un proceso para preparar una mezcla de péptidos inmunogénica en base a los aminoácidos seleccionados que ocurren en un residuo variable de un epitope de proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos patógenos, incluyendo virus tales como H IV-1 y HIV-2, influenza, hepatitis A/B/C, papilomavirus humano (HPV), y dengue, así como también parásitos tales como malaria y triquinela, pueden alterar fácilmente la secuencia de aminoácidos dentro de los epítopes de proteína particula res. En vista de esta cond ucta y para otros propósitos, las vacunas de péptido sintéticas se exploran cada vez más como alternativas para vacunas inactivas o atenuadas. Por selección de solamente aquellos epítopes q ue confieren una inmunidad efectiva, los epítopes responsables de las respuestas inmunes dañinas, tal como mejora de enfermedad o supresión de célula T, pueden excluirse de las vacunas candidatas. Adicíonaimente, como se definen químicamente y carecen de cualquier material infeccioso, poseen mínimos riesgos de salud. Finalmente, ' diferente a las vacunas atenuadas que deben transportarse y almacenarse a temperaturas refrigeradas, definidas, las vacunas de péptido son relativamente estables y no requieren de refrigeración, haciendo así a la distribución más fácil y menos costosa. Actualmente, las vacunas de péptido sintético se evalúan para protección contra bacterias, parásitos y virus. Las vacunas de epítope bacteriano incluyen aquellas dirigidas contra Cólera y Shigella. Una vacuna sintética contra malaria incluye aquellas ha experimentado pruebas clínicas en fase I y fase II en humanos. Los virus de hepatitis B e influenza representan dos sistemas virales en los cuales las vacunas sistémicas se buscan, y ha habido más interés reciente en vacunas sintéticas contra virus de inmunodeficiencia humana (HIV). A pesar de los avances recientes, las vacunas de péptido sintético han sido incapaces de considerarse para la variabilidad de la proteína de superficie o cubierta. Varios grupos han intentando en el pasado considerar la variabilidad del epítope utilizando una variedad de planteamientos. Un planteamiento para dirigir la variabilidad del epítope se ha descrito por Tam en la Patente de Estados Unidos número 5,229,490 (20 de Julio de 1993). Este proceso incluye conjugar varios epítopes similares o diferentes a un núcleo inmunogénico al utilizar grupos funcionales de lisina y enlazadores de glicina (llamados polímeros dendríticos)este proceso se refiere como un sistema de péptido de antígeno múltiple (MAPS). Aunque altamente inmunogénicos, no se ha probado que MAPS a base de HIV inducen ampliamente los anticuerpos reactivos que pueden reconocer cepas de virus divergentes (Nardelli et a/., (1992) J Immunol 148:914-920).

Otro planteamiento anterior incluyó la identificación de 'mimotopos', que son secuencias generadas aleatoriamente que imitan los péptidos antigénicos (Lenstra et al., (1992) J Immunol ethods 152: 149-157). Utilizando este planteamiento, los oligonucleótidos degenerados se insertan en los vectores de expresión bacteriana, resultando en una biblioteca de expresión de péptidos aleatorios de 6-8 aminoácidos en longitud. Aquellos péptidos que imitan los epítopes antigénicos se identifican utilizando suero (que contiene anticuerpos) de animales o individuos infectados con el patógeno de interés. Sin embargo, este planteamiento general se ha utilizado para identificar mimotopos que se reconocen por sueros de individuos infectados por HI (Prezzi et al., (1996) J Immunol 156:4504-451 3). Sin embargo, los péptidos se seleccionan aleatoriamente y existe una necesidad de adquirir y analizar sueros de sujetos infectados con objeto de formular la composición de mimotopo. Una desventaja adicional a los planteamientos déla técnica anterior que requieren sueros de individuos infectados es que muchos individuos infectados no se manejan para crear anticuerpos anti-patógeno apropiados. De esta manera, la selección de los péptidos de interés utilizando sueros de paciente podría conducir potencialmente a la omisión de importantes péptidos antigénicos que imitan los epítopes contra los cuales los individuos infectados han sido incapaces de montar una respuesta inmune. Utilizando un modelo de SIV:rhesus macaque para infección por HIV en humanos se han descrito una neturalización de la célula B de glicoproteína de envoltura B y el epítope de la célula T y un inmunógeno sintético se diseña y sintetiza en base al epítope altamente antigénico e hipervariable de la glicoproteína de envoltura SIVmac142 (gp 130) (Anderson et al., (1994) Vaccine 12:736-740). Este inmunógeno sintético consistió de una mezcla de péptidos que representan permutaciones de substituciones de aminoácido encontradas en las secuencias genéticas de envoltura SIV. De esta manera, el inmunógeno sintético representó colectivamente toda la variabilidad in vivo observada para este epltopé particular. La inmunogenicidad de este inmunógeno sintético se evaluó, y se mostró que induce cantidades mejoradas de anticuerpos en rhesus machaques inmunizados con unión a SIV biológico nativo. Además, mejoró la inmunoreactividad a análogos de epítope divergentes. En esta y publicación subsecuente ( eyer et al., (1998) AIDS Res Human Retro 14:751 -760) se demostró que este planteamiento podría considerar la variabilidad del epítope. En años recientes se ha vuelto claro que las células T se degeneran en su reconocimiento de los antígenos de péptido. Este descubrimiento ha originado intereses de que los péptidos de algunos antígenos externos pueden imitar algunos auto antígenos e inadvertidamente conducir a la activación de las células T autoreactivas y el inicio de la enfermedad autoinmune. Consecuentemente, existiría un riesgo de enfermedad autoinmune asociada con inmunización de animales o humanos con una mezcla de péptidos aleatoriamente sintetizados: Los procesos de mimotopo (Lenstra et al., (1992) J Immunol Methods 152:149-1 57) seleccionan un subconjunto de péptidos para inmunización de una mezcla de péptidos aleatoriamente sintetizados utilizando sueros de animales infectados o humanos, y de esta manera reduce el riesgo de enfermedad autoinmune. Sin embargo, las formulaciones de inmunógeno sintético descritas arriba (Anderson et al., (1994) Vaccine 12:736-740; Meyer. et al., (1 998) AIDS Res Human Retro 14:751 -760) no contienen mezclas completamente aleatorias de péptidos, ya que los péptidos generados se basan en la adición de solamente unos pocos de los 20 aminoácidos posibles en solamente algunas etapas de las reacciones sintéticas. Sin embargo, las formulaciones inmunogénicas sintéticas tales como aquellas descritas en la técnica anterior pueden contener más de 8,000 antígenos de péptido diferentes. Aunque este proceso conduce a un inmunógeno que evoca la inmunidad ampliamente reactiva, la formulación fue demasiado compleja de caracterizar bioquímicamente o inmunológicamente, y la inmunización de humanos que tal compuesto podría llevar con un riesgo significativo de enfermedad autoinmune. Además, sin análisis composicional completo, la aprobación reguladora de una composición de péptidos mezclada probablemente no se obtiene. El análisis composicional completo para una composición de péptidos mezclada que tiene cientos o miles de péptidos diferentes podría extremadamente ser consumidor de tiempo y es improbable que sea efectivo en costo. Muchas de las formulaciones inmunogénicas sintéticas previamente descritas son mezclas de décimas de miles de diferentes péptidos. Dado que las células T se degeneran en su reconocimiento de antígenos externos, lás mezclas de péptidos de este complejo poseen el riesgo de contener péptidos que imitan los auto antígenos, que en la inmunización podrían inducir una respuesta autoinmune patogénica. Además, la complejidad de previos esquemas de síntesis hacen difícil si no es que imposible definir químicamente y valorar la calidad de las múltiples preparaciones individuales de la misma composición. En esta base, existe una necesidad de un nuevo proceso para el diseño de una mezcla de péptidos inmunogénica que resulta en una formulación menos compleja que aquel descrito en la técnica anterior, mientras mantiene inmunogenicidad óptima. Tal nuevo proceso podría permitir que tales mezclas se preparen y analicen para uso humano. Además, existe una necesidad de desarrollar los análisis para corred se en tal preparación para asegurar la integridad y antigenicidad de la mezcla formada en la reacción sintética.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención obviar o mitigar al menos una desventaja de las formulaciones inmunogénicas previas o procesos previos para preparar tales formulaciones. La invención proporciona un proceso mediante el cual una mezcla de péptidos que representa las variantes de secuencia in vivo observadas de un epítope de proteína se forma. Una mezcla de péptidos así formada evoca inmunidad ampliamente reactiva y es útil para la producción de vacunas, agentes terapéuticos, y equipos de diagnóstico contra organismos patogénicos tales como virus y parásitos. El proceso puede aplicarse a un amplio rango de epítopes en un organismo patogénico. La invención proporciona un proceso para preparar una mezcla de péptidos, denominada una construcción de epítope hipervariable (HEC), que representa colectivamente la variabilidad in vivo observada en epítopes inmunogénicos, aún es suficientemente simple en su composición para permitir el análisis. Esta mezcla representa permutaciones de substituciones de aminoácido encontradas dentro de un epítope. En la inmunización de un sujeto con la mezcla de péptidos, se inducen las respuestas de la célula B y la célula ayudante T, que resulta en altas concentraciones de anticuerpos con unión mejorada a proteínas de patógeno nativas distantemente relacionadas. Además, estos anticuerpos pueden neutralizar la infectividad de cepas divergentes de patógenos en los cuales HEC se basa. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica que comprende los pasos de: obtener secuencias de epítope inmunogénicas de un patógeno, las secuencias de epítope inmunogénicas teniendo una región de residuo común y al menos un residuo variable con el cual las secuencias difieren entre sí; determinar la frecuencia con la cual los diferentes aminoácidos se encuentran en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas; y sintetizar una mezcla de péptidos que comprende hasta aproximadamente 100 diferentes péptidos, cada péptido teniendo la región de residuo común y teniendo en una posición de residuo variable un aminoácido seleccionado de aquellos encontrados en el residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas con una frecuencia mayor que una frecuencia de umbral de desde aproximadamente 10% a aproximadamente 30%. Adiciónalmente, la invención proporciona un proceso para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica que comprende los pasos de: obtener secuencias de epítope inmunogénicas de un patógeno, las secuencias de epítope inmunogénicas teniendo una región de residuo común y al menos un residuo variable con el cual las secuencias difieren entre sí; determinar la frecuencia con la cual diferentes aminoácidos se encuentran en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas; redondear la frecuencia con la cual un aminoácido se encuentra en un residuo variable a lo más próximo de 25%; y sintetizar una mezcla de péptidos que comprende hasta aproximadamente 100 péptidos diferentes, cada péptido teniendo la región de residuo común y teniendo en una posición de residuo variable un aminoácido seleccionado de aquellos más frecuentemente encontrados en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas, estipulando que el aminoácido tiene una frecuencia redondeada a no cero; en donde la posición de residuo variable se selecciona de dos a cuatro diferentes aminoácidos, cada uno de los dos a cuatro diferentes aminoácidos representándose en la mezcla de péptidos en proporción a su frecuencia redondeada. En una modalidad adicional, se proporciona una mezcla de péptidos inmunogénica a un patógeno, la mezcla comprendiendo hasta aproximadamente 100 péptidos diferentes, cada péptido teniendo una región de residuo común y teniendo una posición de residuo variable; la región de residuo común de los diferentes péptidos siendo aminoácidos no variables de una secuencia de epítope inmunogénica de un patógeno, adyacente a un residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica; y la posición de residuo variable ocupándose por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los aminoácidos que ocurren de manera más frecuente en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica siempre que: (a) no más de cuatro diferentes aminoácidos estén presentes en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos de la mezcla de péptidos; y (b) un aminoácido presente en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos aparezca en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica con una frecuencia mayor que una frecuencia de umbral de desde aproximadamente 10% a aproximadamente 30%. La invención difiere de planteamiento previos para preparar composiciones inmunogénicas en que se ha modificado con objeto de hacer al proceso adecuado para el diseño de vacunas a utilizarse en humanos, en que la composición se limita a un número pequeño de péptidos que son altamente representativos de la variabilidad encontrada en secuencias de epítope inmunogénicas nativas. La invención proporciona un proceso simple para producir una formulación inmunogénica comprendida de una mezcla de péptidps denominada una construcción de epítope hipervariable (HEC). La porción de síntesis de péptido del procesó puede conducirse simplemente como un método de "una etapa" utilizando procesos sintéticos químicos conocidos en la materia. Ventajosamente, la invención proporciona varias HECs en base a diferentes epítopes virales que se sintetizan utilizando el proceso de la invención para producir un gran grupo de péptidos con un mínimo de etapas de síntesis. El número de diferentes péptidos producidos se controla en tal manera que la composición completa de la formulación inmunogénica puede predecirse y verificarse por análisis. HEC inventiva es capaz de generar amplia reactividad inmunológica con proteínas de las cuales los péptidos se derivan. Ventajosamente, después de la inmunización con HEC. la reactividad inmunológica amplia con cepas divergentes de un patógeno inducido conduce a neutralización mejorada de infectividad por patógeno. HEC inventiva es capaz de superar la principal restricción de histocompatibilidad (MHC), que es una barrera común para el desarrollo de vacunas humanas en el mundo. Además, HEC puede modificarse para inducir una respuesta inmune celular (CTL). Además de las vacunas, HECs pueden utilizarse como la base de equipos de diagnóstico. Otros aspectos y características de la presente invención serán aparentes para aquellos de experiencia ordinaria en la revisión de la siguiente descripción de modalidades específicas de la invención junto con las figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN OE LOS DIBUJOS Las modalidades de la presente invención se describirán ahora, a manera de ejemplo solamente, con referencia a las figuras anexas, en donde: Figura 1 es un esquema simplificado para la síntesis de HEC de acuerdo a una modalidad de la invención. Figura 2 es una representación diagramática del proceso para la preparación de una mezcla de péptidos de acuerdo a una modalidad de la invención. Figura 3 ilustra los aminoácidos seleccionados para la síntesis de cinco HECs en base al virus de inmunodeficiencia humana (HIV-1 ) de acuerdo a la invención. Figura 4 demuestra que la inmunización de primates no humanos (monos) con HIV-1 HECs induce las respuestas de la célula ayudante T. Figura 5 ilustra las concentraciones de anticuerpo potentes inducidas en monos por inmunización con HIV-1 HECs 1 a 5. Figura 6 demuestra que los anticuerpos inducidos por inmunización con HIV-1 HECs se unen a epítppes de cepas divergentes de HIV-1 . Figura 7 indica que los anticuerpos obtenidos de monos inmunizados con HIV-1 HECs 1 a 5 neutralizan la infección, de linfocitos sanguíneos periféricos humanos (PBLs) pór cepas divergentes de HIV-1 . Figuras 8 demuestra que los anticuerpos de pacientes seropositivos infectados, con subtipos HIV-1 divergente A, B, C, D, E y F reconocen HECs en base a HIV-1 1 a 5. Figura 9 describe el diseño de dos HECs en base a virus de hepatitis V (HCV). Figura 10 describe el diseño de cuatro HECs en base a los sitios de combinación de cambio antigénico encontrados en la proteína de envoltura de emaglutinina de Influenza A. Figura 1 1 demuestra la respuesta de la célula ayudante T de ratones inmunizados con HECs de influenza de la figura 1 0. Figura 12 ilustra la respuesta de anticuerpo de ratones inmunizados con HECs de influenza de la figura 1 0 en comparación con un péptido no relacionado. Figura 13 ilustra la respuesta inmune de ratones Balb/c después de la inmunización con HEC derivado de SIV. Esta figura demuestra que en los ratones Balb/c, que son incapaces de evocar una respuesta inmune contra un epítope derivado de SIV único debido a su principal genotipo de histocompatibilidad ( HC), inmunización con H EC en base a este mismo epítope resulta en una respuesta inmune. Figura 14 demuestra la unión de anticuerpos de ratones con SIV. Los datos demuestran que los anticuerpos evocados por inmun ización de una cepa no respondedora de ratones con SIV HEC son capaces de unión a los virus en los cuales HEC se basa. Figura 1 5 muestra que la conjugación de HECs a porciones de lípidos permite la inducción de respuestas del linfocito T citotóxico (CTL) . Figura 1 6 ilustra la composición de cinco mezclas de péptidos que comprenden un número de péptidos como se determina de acuerdo a la invención .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Generalmente, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica, o construcción de epítope hipervariable (HEC). En una modalidad, el proceso para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica que comprende los siguientes pasos. Las secuencias de epítope inmunogénicas de un patógenos se obtienen, las cuales tienen una región de residuo común y al menos un residuo variable con el cual las secuencias difieren entre sí. La frecuencia con la cual los diferentes aminoácidos se encuentran en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas se determina. Una mezcla de péptidos se sintetiza entonces, la cual comprende hasta aproximadamente 1 00 péptidos diferentes, cada péptido teniendo la región de residuo común y teniendo, en una posición de residuo variable, un aminoácido seleccionado de aquellos encontrados en el residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas con una frecuencia mayor que una frecuencia de umbral de desde aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, por ejemplo, 20%. De acuerdo á esta modalidad, la mezcla de péptidos comprende secuencias que tienen en el residuo variable un aminoácido seleccionado de aquellos más frecuentemente encontrados como el residuo variable en las secuencias de epítope inmunogénicas, opcionalmente con la restricción de que no más de 4 aminoácidos diferentes aparecen en la posición de residuo variable de diferentes péptidos dentro de la mezcla de péptidos. Durante el paso de sintetizar la mezcla de péptidos, los péptidos pueden formarse de manera que diferentes aminoácidos que aparecen en la posición de residuo variable están presentes relativos entre sí en proporción a la frecuencia con la cual cada aminoácido diferente aparece en el residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas. La frecuencia con la cual un aminoácido se encuentra en un residuo variable puede redondearse a lo más próximo a 25%, y los aminoácidos podrían seleccionarse como solamente aquellos teniendo una frecuencia redondeada a no cero para inclusión en la posición de residuo variable en los péptidos de la mezcla de péptidos. En este caso, los péptidos de la mezcla de péptidos pueden tener un aminoácido dado presente en la posición de residuo variable con una frecuencia proporcional a su frecuencia redondeada. Opcionalmente, las frecuencias de aminoácidos similares encontrados en un residuo variable pueden agruparse, y la frecuencia agrupada se asigna entonces al más frecuentemente encontrado de los aminoácidos similares cuando se calcula la frecuencia redondeada. Como una advertencia opcional en este caso, las frecuencias de aminoácidos similares encontrados en un residuo variable pueden agruparse solamente si los aminoácidos similares individualmente tienen una frecuencia por debajo de la frecuencia de umbral. Las frecuencias de aminoácidos similares pueden agruparse si, en el redondeo de cada frecuencia de aminoácido similar a lo más próximo a 25%, ningún aminoácido similar tuvo una frecuencia redondeada de 25% o más. De acuerdo a la invención aminoácidos "similares" se seleccionan de aquellos encontrados en un grupo común, entre los grupos que consisten de: aminoácidos aromáticos; aminoácidos atifáticos; aminoácidos de cadena lateral de hidroxilo alifático; aminoácidos básicos, aminoácidos ácidos, aminoácidos que contienen amida, y aminoácidos que contienen azufre. De acuerdo a la invención, el paso de síntesis puede conducirse utilizando acoplamiento de aminoácido, en donde la posición de residuo variable se acopla al agregar aminoácidos en proporción a sus frecuencias redondeadas. La invención también puede incluir uno o más pasos conducidos utilizando una metodología de bioinformática. Opcionalmente, las secuencias de epítope inmunogénicas comprenden de 2 a 7 residuos variables, y pueden resultar en una mezcla de péptidos que contiene de 2 a aproximadamente 64 diferentes péptidos. La invención también se refiere a procesos para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica que comprende una serie de pasos ligeramente diferente, en particular, lo siguiente. Las secuencias de epítope inmunogénicas dé un patógeno se obtienen, las cuales tienen una región de residuo común y al menos un residuo variable con el cual difieren entre sí. La frecuencia con la cual los diferentes aminoácidos se encuentran en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas se determina y redondea a lo más próximo a 25%. Una mezcla de péptidos se sintetiza entonces comprendiendo hasta aproximadamente 100 péptidos diferentes, cada uno teniendo la región de residuo común y teniendo, en una posición de residuo variable, un aminoácido seleccionado de entre aquellos más frecuentemente encontrados en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas, estipulando que la frecuencia redondeada no es cero. Oe acuerdo a este proceso, la posición de residuo variable se selecciona de dos a cuatro diferentes aminoácidos, cada uno de los cuales se representa en (a mezcla de péptidos en una cantidad proporcional a su frecuencia redondeada. Este proceso puede comprende los pasos adicionales de agrupar las frecuencias de amino similar que tienen frecuencias redondeadas menores a 25%; asignar la frecuencia agrupada al que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares; redondear la frecuencia agrupada a lo más próximo a 25%; y, para frecuencias redondeadas de no cero, incluyendo el que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares en el paso de sintetizar una mezcla de péptidos. La invención también se réfiere a una mezcla de péptidos inmunogénica a un patógeno. La mezcla comprende hasta aproximadamente 100 péptidos diferentes, cada uno teniendo una región de residuo común y una posición de residuo variable. La región de residuo común de los diferentes péptidos se forma de aminoácidos no variables de una secuencia de epítope inmunogénica de un patógeno, adyacente a un residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica. La posición de residuo variable se ocupa por un aminoácido seleccionado del que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica siempre que: (a) no más de cuatro aminoácidos diferentes estén presentes en la posición de residuo variable de la mezcla de péptidos; y (b) un aminoácido presente en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos aparezca en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica con una frecuencia mayor que una frecuencia de umbral de desde aproximadamente 10% a aproximadamente 30%. La frecuencia con la cual un aminoácido aparece en una posición de residuo variable puede determinarse de acuerdo al siguiente esquema: la frecuencia con la cual ocurre un aminoácido en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica se redondea a lo más próximo a 25%, y los aminoácidos que tienen frecuencias redondeadas de no cero se encuentran en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos con una frecuencia proporcional a la frecuencia redondeada. La frecuencia con la cual los aminoácidos similares que tienen una frecuencia redondeada menor a 25% aparecen en una posición de residuo variable, puede determinarse al agrupar las frecuencias de aminoácidos similares y redondear el valor agrupado a lo más próximo a 25%. Para frecuencias redondeadas de no cero, la frecuencia redondeada se asigna al que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares. De acuerdo a esta modalidad, el que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares se encuentra en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos con una frecuencia proporcional a la frecuencia redondeada. Una composición de péptido conjugada puede formarse de acuerdo a la invención, comprendiendo la mezcla de péptidos inventiva conjugada con una porción de lípido, o conjugada con una porción de proteína vehículo. La composición inmunogénica inventiva puede comprender una pluralidad de mezclas de péptido formadas de acuerdo al proceso inventivo, en donde cada una de las mezclas de péptido es inmunogénica al mismo patógeno. Opcionalmente, la composición inmunogénica de acuerdo a la invención, puede incluir una pluralidad de mezclas de péptido dirigidas a diferentes epítopes inmunogénicos del mismo patógeno, y los diferentes epítopes inmunogénicos pueden encontrarse en proximidad en la superficie del patógeno. Una vacuna puede formarse de acuerdo a la invención invocando una respuesta inmunogénica contra un patógeno. La vacuna comprende la mezcla de péptidos inventiva en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. De esta manera un método de vacunación contra una enfermedad patogénica de acuerdo a la invención comprende los pasos de administrar a un sujeto una cantidad efectiva de esta vacuna. Un método para diagnosticar la infección de un sujeto por un patógeno cae dentro del alcance de la invención. El método comprendiendo los pasos de: obtener una muestra biológica que contiene anticuerpo de un sujeto; contactar la muestra biológica con la mezcla de péptidos inmunogénica de acuerdo a la invención, en base a las secuencias de epítope inmunogénicas del patógeno, y evaluar la respuesta inmunogénica de la muestra con la mezcla de péptidos. Un equipo de diagnóstico para determinar la infección de un sujeto por un patógeno puede comprender la mezcla de péptidos inmunogénica de acuerdo a la invención, en base a las secuencias de epítope inmunogénicas del patógeno, junto con direcciones para evaluar una respuesta inmunogénica de un anticuerpo que contiene la muestra biológica del sujeto con la mezcla de péptidos inmunogénica. Además, la invención proporciona un proceso para aislar un anticuerpo inmunogénico a un patógeno que comprende tos pasos de: administrar a un sujeto ia mezcla de péptidos de acuerdo a la invención; y obtener del sujeto un anticuerpo, o una parte del anticuerpo reactivo con el patógeno, dicho anticuerpo induciéndose por administración de la mezcla de péptidos. i Un proceso para aislar un gen que codifica un anticuerpo inmunogénico a un patógeno puede construirse de acuerdo a un aspecto adicional de la invención. El proceso comprende los pasos de: administrar a un sujeto ia mezcla de péptidos de acuerdo a la invención; obtener un anticuerpo del sujeto inducido por administración de la mezcla de péptidos; y aislar un gen que codifica el anticuerpo. De manera similar, un proceso para aislar una porción de un gen o material genético que codifica un anticuerpo inmunogénico a un patógeno puede conducirse de acuerdo a la invención, que comprende los pasos de: administrar a un sujeto la mezcla de péptidos de acuerdo a la invención; obtener un anticuerpo del sujeto inducido por administración de la mezcla de péptidos; y aislar la porción de un gen o material genético que codifica el anticuerpo. De esta manera, una inmunoterapia contra un patógeno puede desarrollarse incluyendo la administración de un péptido o proteína codificada por una porción del gen o material genético obtenido de acuerdo a este proceso. El proceso para preparar la mezcla inmunogénica de acuerdo a la invención comienza con una examinación comprensiva de secuencias que ocurren de manera natural de un patógeno dado que se ha reportado en las bases de datos científicas o diarios científicos revisados. Esto sirve para reducir el número de péptidos diferentes producidos durante la síntesis. El(los) aminoácido(s) que se agregan , y en los cuales los pasos durante la reacción de síntesis de péptido se agregan, se determinan a priori de acuerdo a los pasos del proceso especificado, después de alinear primero las secuencias q ue extienden epítopes de neutralización de la célula B y célula ayudante T. La mezcla resultante de péptidos, denominada una construcción de epítope hipervariable (HÉC), representa las permutaciones de secuencia de epítope generadas en una síntesis de péptido única al agregar mezcla(s) estadísticamente pesada(s) de aminoácido(s) para enlazarse a aminoácidos ensamblados anteriores en la cadena de péptido naciente. De esta manera, diferente a los mimotopos, los péptidos contenidos en HEC no son completamente aleatorios y ya se espera que representen u n epítope antigénico de interés. Por esta razón , no existe necesidad de utilizar sueros de animales infectados o pacientes para aislar los epítopes de interés. HECs pueden probarse para reactividad contra sueros de individuos infectados por patógeno como un aspecto de control de calidad , para asegurar que la reacción de síntesis de péptido proceda de manera apropiada. En ningún punto es suero del paciente se utilizó para seleccionar péptidos individuales contenidos dentro de una HEC, que es una diferencia fundamental del planteamiento de mimotopo de la técnica anterior. La invención representa un proceso simple que se ha desarrollado para considerar la variabilidad de epítope . Durante la síntesis de péptido de fase sólida , un a minoácido se "acopia" o agrega a perlas de resina en cada ciclo para formar una cadena de péptido creciente. El porcentaje de un aminoácido agregado en un ciclo particular se calcula de acuerdo a la invención, en base a la frecuencia con la cual el aminoácido se encuentra en una ubicación específica en un epítope. Esta información se basa en la información de secuencia, derivada de datos obtenidos directamente en un lab a través de la secuenciación de aminoácidos, o se deriva de datos de la secuencia in vivo obtenidos de las bases de datos de secuencia, y/o literatura científica revisada. La mezcla de péptidos inmunogénica inventiva o HEC, consiste de una mezcla de péptidos que representan permutaciones de substituciones de aminoácidos encontradas dentro de un epítope de proteína. Un diagrama esquemático del proceso para preparar un HEC se ilustra en la figura 1 . Brevemente, en el paso 1 , las secuencias de un epítope inmunogénico de un. patógeno se obtienen. El epítope tiene al menos un residuo variable representado por diferentes aminoácidos en las diversas secuencias conocidas. La frecuencia con la cual cada aminoácido diferente ocurre en el residuo variable de las secuencias de epítopes se determina en el paso 2, y se compara con una frecuencia de umbral predeterminada. Una frecuencia de umbral se establece de manera que los aminoácidos representados en cantidades relativamente pequeñas en las secuencias de epítopes caen por debajo del umbral y de esta manera no se representarán en la mezcla de péptidos resultante. Aquellos aminoácidos qué satisfacen la frecuencia de umbral son candidatos para la adición durante la síntesis de péptido en el paso 3 en la posición de residuo variable. Aquellos aminoácidos representados en una cantidad por debajo de la frecuencia de umbral no se utilizan en la posición de residuo variable durante la síntesis de péptido. Finalmente, la síntesis de una mezcla de péptidos se toma utilizando cualquier vía sintética de manera que en las posiciones de residuo variable, los aminoácidos arriba de la frecuencia de umbral se agregan en cantidades proporcionales a la frecuencia con la cual ocurren en el epítope inmunogénico. La frecuencia de umbral puede variar de 10% a 30%, y la mezcla de péptidos sintética resultante no debería ser muy compleja para contener más de aproximadamente 100 secuencias diferentes. Un diagrama esquemático alternativo del proceso para preparar una HEC se ilustra en la figura 2. Brevemente, en el paso 1 , las secuencias de proteína de aislados in vivo de un patógeno dado se obtienen de fuentes apropiadas tales como bases de datos o diarios revisados. Las secuencias de proteína se alinean, particularmente con referencia a aquellas secuencias que contienen neutralización de la célula B inmunogénica, CTL, o epítopes ayudantes, si están presentes. Observe que no es necesario identificar una neutralización de la célula B inmunogénica específica, CTL, o epítope ayudante en una secuencia de proteína dada utilizada en la invención. Aunque un epítope representa una región de una proteína que algún aspecto del sistema inmune se ha elegido para objetivo, no es necesario identificar el mecanismo mediante el cual el sistema actúa con el objeto de que un epítope se utilice en la invención. En el paso 2, la frecuencia con la cual un aminoácido aparece en cada posición dentro de un epítope de interés se determina. Para aquellas posiciones que tienen más de un aminoácido que aparece, los aminoácidos se incluyen en la mezcla de péptidos de acuerdo a un conjunto particular de reglas definidas en los pasos 3 a 6. En particular, las frecuencias se redondean a lo más próximo a 25% para cada aminoácido que aparece en la posición de residuo variable (paso 3). Por ejemplo, una frecuencia de 12% se redondea hacia abajo a 0%, mientras que una frecuencia de 3% se redondea hacia arriba a 25%. En el paso 4, para aminoácidos similares presentes en un residuo variable pero teniendo una frecuencia redondeada menor a 25%, las frecuencias se agrupan, y la frecuencia agrupada se asigna al que ocurre de manera más frecuente de los aminoácidos similares. Este valor se redondea entonces a lo más próximo a 25%. Los aminoácidos similares pueden considerarse como aquellos teniendo estructuras químicas similares o propiedades que los vuelven conservadorámente intercambiables. Ejemplos de tales aminoácidos similares son aminoácidos aiifáticos (Gly, Ala, Val, Leu, lie y Pro), aminoácidos que contienen cadenas laterales de hidroxilo alifático (Ser, Thr), aminoácidos que contienen azufre (Cys, Met), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), aminoácidos básicos (Lys, Arg y His), aminoácidos ácidos (Asp, Glu) y aminoácidos que contienen amida (Asn, Gln). Como un ejemplo de este paso, si metionina está presente en una frecuencia de 10% y cisteina está presente en una frecuencia de 8%, ningún aminoácido solo puede redondearse a 25%. Sin embargo, debido a que metionina y cisteina son aminoácidos similares (ambos son aminoácidos que contienen azufre) sus frecuencias se agregan juntas para hacer una frecuencia agrupada de 18%, que se redondea a 25% y esta frecuencia se asigna entonces a metionina que ocurre más frecuentemente que cisteína en el residuo variable. En el paso 5, aquellos aminoácido encontrados en el residuo variable y que tienen una frecuenciá redondeada de no cero (por ejemplo, un frecuencia de 25%, 50%, 75% o 100%) se agregan durante la síntesis de péptido en cantidades proporcionales a su frecuencia redondeada. Si la suma de las frecuencias redondeadas no aumenta hasta 100%, la suma de la frecuencia redondeada se utiliza como un legador por el cual cada frecuencia redondeada se divide para llegar a un porcentaje proporciona para utilizarse cuando se agregan aminoácidos en el residuo variable. Por ejemplo, si un primer aminoácido está presente en un residuo variable con una frecuencia de 60%, y un segundo aminoácido está presente en un residuo variable con una frecuencia de 30%, ningún otro aminoácido o combinación agrupada de aminoácidos se redondearía a una frecuencia de no cero. De esta manera, el primero aminoácido se redondea a por debajo de 50%, y el segundo aminoácido se redondea a por debajo de 25%. Debido a que el total de las frecuencias redondeadas, primera y segunda, es 75%, las proporciones de cada aminoácido a agregarse durante la síntesis puede calcularse al dividir cada frecuencia redondeada por el total de 75%. De esta manera, el primer aminoácido se agrega en una cantidad de 50% dividida por 75% (o 66.7%) y el segundo aminoácido se agrega en una cantidad de 25% dividido por 75% (o 33.3%). El paso 4 también incluye una advertencia de que no más de 4 aminoácidos se eligen para un residuo variable. En el caso, por ejemplo, donde 5 aminoácidos diferentes ocurren en una posición de residuo variable con frecuencia aproximadamente igual de 20%, cada aminoácido tendría una frecuencia redondeada de 25%. De esta manera, el total de las frecuencias redondeadas de no cero sería 125%. Sin embargo, debido a que un máximo de 4 aminoácidos puede agregarse a este paso, los 4 que ocurren más frecuentemente de los cinco aminoácidos diferentes se seleccionarían, y la frecuencia no redondeada total sería de 100%. En este caso, cada uno de los 4 aminoácidos que ocurren más frecuentemente se agregaría en una cantidad de 25% en este residuo variable. En el paso 6, una mezcla de péptido se sintetiza, que incluye los aminoácidos seleccionados en el paso 5. Este paso puede conducirse utilizando cualquier método aceptable de síntesis de péptido que permite la colocación selectiva de aminoácidos en residuos particulares. Los métodos de síntesis conocidos, tales como química Fmoc pueden utilizarse. Este paso incluye la advertencia de que no más de 100 péptidos diferentes se forman en la mezcla. Para calcular el número de diferentes péptidos que estaría presente en una mezcla, puede utilizarse la siguiente ecuación. Para cada residuo variable del péptido, el número de diferentes aminoácidos que puede presentarse se determina. Estos números se multiplican juntos para llegar al numero de diferentes péptidos posibles formados en el paso 6. Por ejemplo, un 1 1 -mer que tiene 3 posiciones de residuo variable está por hacerse. La primera de las 3 posiciones variables tiene 4 elecciones de aminoácidos diferentes. El número total de diferentes péptidos posibles formados se calcula como: 4x2x2=16. Para residuos no variables (los 8 aminoácidos restantes del 1 1 -mer), solamente un aminoácido puede utilizarse. De esta manera, no se introduce variabilidad extra por los aminoácidos no variables. Como un ejemplo adicional del paso 6, una mezcla de péptidos en base a un epítope de 16 residuos se forma teniendo 6 residuos variables y 10 residuos no variables. Cada uno de los residuos variables tiene una elección de 2 aminoácidos. El número total de diferentes péptidos formados en el paso 6 puede calcularse como 2x2x2x2x2x2 (o 26) = 64. En el paso 7, la mezcla de péptidos formada en el paso 6 se purifica de acuerdo a cualquier proceso aceptable. Por ejemplo, la liofilización y diálisis pueden conducirse y repetirse tantas veces como sea necesario para asegurar la pureza de los péptidos. La purificación de gel u otros métodos de separación de péptido pueden utilizarse. En el paso 8 se incluyó la confirmación de la composición de la mezcla de péptidos. Este es un paso de control de calidad que puede ser importante cuando se trabaja con una nueva mezcla dé péptidos para la cual ninguna purificación de rutina se ha desarrollado aún. Este paso puede ser opcional una vez que un procedimiento completo se elabore y perfecciones para una mezcla de péptidos particular. El análisis de aminoácidos puede utilizarse para asegurar que los aminoácidos esperados de la mezcla se contengan dentro de HEC. Además, la electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE) de una HEC puede utilizarse para confirmar que HEC contiene péptidos dentro del rango de pesos moleculares esperados.

En et paso 9, la inmunogenicidad de una mezcla de péptidos se confirma. De nuevo, este paso es benéfico si es la primera vez que tal HEC se forma. Sin embargo, después de que se conoce la inmunogenicidad de HEC, no se requiere reconfirmar la eficacia con cada síntesis. Con objeto de probar la inmunogenicidad, HEC purificada se mezcla con un vehículo farmacéutico apropiado, y un adyuvante aprobado para uso humano. Esta composición puede administrarse a ratones y/o rhesus machaques para confirmar la inmunogenicidad, o identificar las composiciones HEC particularmente inmunogénicas si una variedad de diferentes HECs se forma. En este punto, puede ser deseable obtener sueros de un sujeto infectado con el patógeno qüe podría entonces probarse para reactividad contra HECs para asegurar la antigenicidad. En general, el concepto para el proceso para formación de HEC se basa en el principio de que existen muchas proteínas diferentes encontradas dentro de aislados in vivo de un patógeno dado que corresponden a epítopes inmunogénicos (por ejemplo, aquellos que evocan respuestas del ayudante T, CTL y/o anticuerpo). Estas secuencias pueden obtenerse de bases de datos y/o publicaciones científicas revisadas y se alinean. Las posiciones de aminoácido variables se identifican como residuos variables, junto con los diferentes aminoácidos que ocupan cada posición de residuo variable. D lo posible veinte aminoácidos que ocurren de manera natural pueden existir, las posiciones variables se ocupan usualmente por solamente unos pocos aminoácidos diferentes. De acuerdo a una modalidad de la invención, utilizando síntesis de péptido de fase sólida y química Fmoc, los aminoácidos a agregarse en un paso dado dentro de la reacción de síntesis se determinan de acuerdo a las siguientes directrices: 1 ) una mezcla de no más de cuatro aminoácidos se utiliza en cualquier paso de acoplamiento de aminoácido en la síntesis, 2) la cantidad de cada aminoácido utilizado en cualquier paso de acoplamiento se determina en base a la frecuencia de cada aminoácido que aparece en la posición de residuo variable, redondeada a lo más próximo a 25%, 3) si dos o más aminoácidos ocurren en una posición dada en frecuencias menores a 25% y son similares en sus estructuras químicas o propiedades, entonces las frecuencias de estos aminoácidos se agregarán, redondearán a lo más próximo a 25%, y solamente el aminoácido que ocurre más frecuentemente entre estos aminoácidos se agregará, y 4) los cálculos matemáticos predicen que cien o menos variantes de un epítope dado se contienen dentro de dicha mezcla. En cada posición variable el aminoácido entrante se enlaza con el aminoácido anterior en la cadena naciente al agregar una mezcla estadísticamente pesada de aminoácidos. La proporción se estableció a partir de la examinación de las secuencias conocidas que ocurrieron ¡n vivo. Por lo tanto, un procedimiento sintético produce el rango total de epítopes variables. Para verificar que el cocktail de péptidos en HEC no representa todas las variantes, la secuenciación de aminoácido puede realizarse en los péptidos en volumen para verificar que los aminoácidos apropiados están presentes. Además de su uso en vacunación contra enfermedad, HECs en base a epítopes hipervariables de un patógeno dado pueden utilizarse para diagnosticar la infección de un individuo con un patógeno que no se detecta fácilmente por serología de rutina. Esto puede ocurrir por falta de un antígeno "universal" que puede reconocerse por antisueros de todos los individuos infectados sin considerar la cepa del patógeno con la cual un individuo se infecta. La invención también puede utilizarse para producir una composición (o vacuna) que cuando se utiliza para inmunizar un sujeto, tal como un humano, un primate, u otro animal, induce los anticuerpos protectores. En la identificación y aislamiento de los genes que codifican estos anticuerpos, los genes y productos de genes pueden a su vez utilizarse como agentes terapéuticos para el tratamiento de organismos infectados con los patógenos en los cuales la composición se basa. Una HEC puede formarse con varios agentes inmunomoduladores con objeto de evocar diferentes brazos efectuores del sistema inmune, tales como respuestas CTL o respuestas inmunes mucosales. La invención se refiere a un proceso para preparar una HEC que representa variantes de secuencia in vivo observadas de un epítope de proteína. De acuerdo a una modalidad de la invención, las secuencias de proteína de aislados in vivo de un patógeno dado se obtienen de la literatura y/o bases de datos. Las secuencias se alinean, particularmente en las regiones de las proteínas que contienen epítopes inmunogénicos. La frecuencia con la cual los aminoácidos aparecen en cada posición dentro de un epítope de interés se calcula de manera que solamente aquellos aminoácidos que ocurren con una frecuencia arriba de una frecuencia de umbral se incluyen en la mezcla. La frecuencia de umbral es típicamente un valor de desde aproximadamente 10 a aproximadamente 30. Sin considerar el número de aminoácidos que aparecen arriba de la frecuencia de umbral, no más de cuatro aminoácidos diferentes se utilizan en cualquier paso de acoplamiento de aminoácido en la síntesis. Las frecuencias de aminoácidos a agregarse en un paso de acoplamiento de aminoácido dado pueden redondearse o pueden utilizarse como están. Si se redondean, las frecuencias pueden ser lo más próximo a 5%, 10%, o 25%, por ejemplo, para facilidad de cálculo. Si dos o más aminoácidos ocurren en una posición dada en frecuencias menores a 25%, y son similares en sus estructuras químicas o propiedades, entonces las frecuencias de estos aminoácidos pueden agruparse y opcionalmente redondearse. En tal caso, solamente el aminoácido que ocurre más frecuentemente entre aquellos aminoácidos agrupados se agregará, y en proporción a la frecuencia agrupada. La mezcla de péptidos resultante puede calcularse por tener cien o menos variantes de péptido. La síntesis de la mezcla puede conducirse al realizar cada paso de acoplamiento de aminoácido al incluir los aminoácidos en cantidades que reflejan las frecuencias (o frecuencias redondeadas) arriba déla frecuencia de umbral. De esta manera, la mezcla de péptidos se produce en una trayectoria de síntesis única. La mezcla puede analizarse para asegurar la composición, antigenicidad, e inmunogenicidad . La mezcla es capaz de generar inmunidad ampliamente reactiva con proteínas de las cuales los péptidos se derivan y cada péptido dentro de la mezcla tiene una secuencia que corresponde a una permutación de substituciones de aminoácido por un epitope en el cual la mezcla se basa. La mezcla de péptidos de acuerdo a la invención puede formarse al degradar internamente los péptidos uno a otro. Alternativamente, los péptidos dentro de la mezcla puede enlazarse a un polímero de soporte, que podría ser cualquiera material de polímero que ocurre de manera natural o sintético, tal como una proteína vehículo. Un ejemplo de un polímero de soporte es la proteína de la cual la mezcla de péptidos se deriva. Ventajosamente, la degradación de los péptidos o combinación de la mezcla de péptidos con un polímero de soporte puede tener el efecto de llamar la atención del sistema inmune a la mezcla de péptidos, incrementando así la inmunogenicidad de la mezcla de péptidos. Tal planteamiento también es benéfico en caso donde la mezcla de péptidos no es suficientemente inmunogénica, ya que la conjugación o degradación puede incrementar la inmunogenicidad a un nivel efectivo. Los métodos estándar, como se conocen en la materia, pueden utilizarse para formar las degradaciones o conjugar los péptidos a tal vehículo. Un equipo de diagnóstico de acuerdo con la invención contiene una cantidad eficaz de una HEC capaz de reactividad inmunológica con anticuerpos de organismos infectados con un patógeno del cual se deriva una HEC. Cada péptido dentro de la mezcla de péptidos tiene una secuencia que corresponde a una permeación de substituciones de aminoácidos para un epitope inmunogénico común en una proteína derivada del patógeno. Una composición inmunogénica terapéutica puede prepararse de acuerdo a la invención al preparar una HEC, inmunizando un animal, tal como un primate, con HEC, y obteniendo anticuerpos y genes que codifican los anticuerpos inducidos por inmunización con HEC. Tales composiciones ínmunogénicas, o la información genética que codifica anticuerpos que se originan de la inmunización pueden administrarse a un sujeto. Un epítope de proteína para utilizarse con la invención puede estar presente en una proteína derivada de virus de ¡nmunodeficiencia humana tipo 1 o 2 (HIV-1/2), influenza, papilomavirus humano (HPV), malaria, virus del dengue, o tripanosomiasis. Epítopes derivados de otros patógenos también pueden utilizarse. HEC o mezcla de péptidos pueden suspenderse en cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, HEC puede suspenderse en solución salina. Además, HEC puede mezclarse con un adyuvante. La invención se refiere a una vacuna que puede tener cantidades de dos o más HECs en base a una o más proteínas de un solo patógeno que contiene uno o más epítopes de los cuales dichas mezclas de péptidos se derivan. Las cantidades de HECs pueden ser equimolares. Las cantidades equimolares de dichas mezclas de péptidos se degradan intermitentemente, o enlazan a un polímero de soporte. La frecuencia de un aminoácido a agregarse en una posición dada en dicha mezcla de péptidos se determina solamente de la frecuencia de aminoácidos en esa posición única, no por la estructura o longitud de las secuencias de proteína o aislados. Por ejemplo, si existen 10 secuencias de un epítope disponibles que varían considerablemente en longitud, la única consideración para determinar la frecuencia de aminoácidos a agregarse en un posición dada en dicha mezcla de péptidos es el número total de diferentes aminoácidos en la posición dada en el epitope en el cual una mezcla de péptidos se basa. Una vez que las secuencias se han alineado, sin considerar la longitud de la secuencia de cada una de las 10 secuencias, si en la segunda posición todas las 10 secuencias tienen un aminoácido único, entonces 100% de ese aminoácido se utilizará en síntesis de la mezcla de péptidos. Cuando las frecuencias se redondean a lo más próximo a 25% (o 5% o 10% u otro valor seleccionado), la convención conocida por aquellos expertos en la materia es que cualquier valor exactamente a la mitad entre dos números enteros especificados, se redondeará hacia arriba a siguiente número entero más alto mientras que cualquier valor inferior a la mitad del valor se redondeará hacia abajo del número entero inferior. Por ejemplo, un aminoácido que apareció en la tercer posición en un epitope de proteína en 30% de todas las secuencias alineadas para ese epitope tendrían una frecuencia redondeada de 25% en esa posición. Si, sin embargo, un aminoácido está presente en 38% de las secuencias alineadas para ese epitope, entonces, estaría presente en la mezcla de péptidos en una frecuencia de 50% en esa posición. Un aminoácido presente con una frecuencia de 12% cuando se redondea a lo más próximo a 25% se redondearía por debajo de 0%, y de esta manera no se incluiría en la mezcla, en la ausencia de otros aminoácidos similares con los cuales la frecuencia de 12% puede agruparse. Aunque HECs designadas específicamente para uso potencial contra HIV-1 , HCV, e influenza, se describen como ejemplos en la presente, la invención también puede utilizarse para vacunación contra enfermedades causadas por cualquier patógeno anímal o humano que tiene variación de epítope. La invención es particularmente benéfica para utilizarse contra los patógenos que han probado dificultad para diagnosticarse y protegerse debido a la variación considerable del epítope. Estos incluyen, pero no se limitan a, HIV-2, HPV, malaria, dengue y tripanosomiasis. Las modalidades arriba descritas de la presente invención se propone para ser ejemplos solamente. Alteraciones, modificaciones y variaciones pueden efectuarse a las modalidades particulares por aquellos de experiencia ordinaria en la materia sin apartarse del alcance de la invención, que se define solamente por las reivindicaciones anexas. METODOLOGÍA G ENERAL Las siguientes metodologías se utilizan como con la invención, y particularmente con referencia a los ejemplos proporcionados abajo. Síntesis de péptido Las mezclas de péptidos se sintetizan por química de 9-fluoroenilmetoxicarbonil (Fmoc) utilizando resina Knorr de alta capacidad (0.7 mmol/g) con 1 % de degradador de divinilbenceno. La resina se neutraliza con dos adiciones de un 50% (v/v) de solución de piperidina: N', N'-dimetil formamida (DMF). Subsecuentemente, la resina se lava con DMF y metanol. Las cantidades molares apropiadas de ami oácidosl, en base a frecuencias para una posición dada, se agregan . Se deja que el acoplamiento ocurra por dos horas a temperatura ambiente.

La resina se enjuaga de nuevo con DMF y metanol. Después de ia confirmación de acopiamiento, la resina se lava con DMF y desprotege con 50% de piperidina: DMF por 9 minutos. Después de que el último aminoácido se acopla, la resina se lava con DMF y m tanol. Las mezclas de péptido se separan y desprotegen por la adición de una solución de 90% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de 1 ,2-etanoditiol (EDT), 5% de agua a la resina. La resina se incuba a temperatura ambiente por 6-12 horas. La resina se lava con TFA y metanol. Los lavados con TFA que contienen el péptido se recolectan. Las mezclas de péptidos se extraen con éter frío. Las soluciones de péptido/TFA se reducen a un volumen pequeño (aprox. 1 mi) por evaporación bajo gas de nitrógeno. Éter (25 volúmenes) se agrega a la solución de péptido y se mezcla. Después de ia incubación por 5 minutos en hielo seco, la muestra se centrífuga a 1 ,000Xg por 5 minutos, y el éter se remueve. Este proceso de extracción se repite tres veces: Subsecuentemente, la solución de mezcla de péptidos se extrae tres veces con acetato de etilo:éter (v/v) (1 .5: 1 ) en una manera idéntica a aquella de la extracción de éter. Después de una extracción de éter final, el éter final se evapora bajo gas de nitrógeno, y la mezcla de péptido se resuspende en agua y liofiliza. Conjugación de HECs a proteínas vehículo Después de la síntesis, algunas HECs pueden conjugarse con proteínas vehículo para aumentar su inmunogenicidad. Si es así, la proporción de 100 moles HEC: 1 mol proteína vehículo (péptidos:vehículo) se utiliza. Tanto la proteína como HECs se disuelven en d.5M N-metil- imidazola, pH 6.0 a una concentración de 1 mg/ml. Las soluciones HEC y proteína se combinan y 50 moles de 1 -etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC/mol de HEC/solucipón de protelna se agrega. La mezcla se agita por 30 minutos a 20°C, y después se dializa (corte de 10 kDa) extensivamente en un 5% de regulador de ácido acético. Después de la diálisis en agua destilada doble, la vacuna se liofiliza y almacena al vacío a 20°C. Inmunización de animales Los ratones se obtienen de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se inmunizan con 100 µ9 de péptido de secuencia único (SSP) o HEC cuando se conjugan con KLH o con 200 µg cuando se inmunizan con péptidos libres de vehículo. El inmunógeno se disuelve en PBS estéril para utilizarse. Las inmunización primarias se administran subcutáneamente en la base de la cola mientras que las inmunizaciones secundarias se administran de manera similar de manera subcutánea en la base de la cola dos semanas después. Rhesus machaques se inmunizan con HECs o con complejos de HEC/proteína vehículo un total de 2 veces. Para cada inmunización, cada mono recibió 500 µ& de HECs o HEC/proteína vehículo disueltas en 250 µ? PBS y 250 µ? Montanide ISA-51 . Después del vórtice extensivo, la emulsión se inyecta intramuscularmente en el músculo deltoide. La carga ocurre ocho semanas después de la inmunización inicial. Análisis ELISA La prueba por las repuestas a una HEC dada se realiza por el análisis inmunoabsorbente enlazado de enzima de fase sólida (ELISA) utilizando metodología estándar. Brevemente, HECs, péptidos o proteínas se disuelven en 0.05M de regulador de bicarbonato de sodio, pH 9.5 y se aplica a placas de microconcentración de fondo plano (Corning, NY). Virus se coloca en placa en 500 ng/cavidad mientras que los péptidos y proteínas se colocan en 1 µg cavidad. Después de la incubación con el suero de prueba, los anticuerpos primarios unidos a antígeno se detectan con anticuerpos secundarios marcados con fosfatasa alcalina (anti-ratón o anti-mono) (Fisher, Pittsburg, PA). La densidad óptima se mide en 405 nm utilizando un lector de placa automático (BioRad 3550). Neutralización de infectividad viral Las reservas virales se desarrollan en células CEMx174 obtenidas de la colección de cultivo tipo americano (ATCC, Rockville, MD). Los aislados de HIV-1 se obtienen de NIH, NIAID Repository. Las células de esta línea se utilizan para determinar las concentraciones de virus y también indicar la infectividad viral en el análisis de neutralización. Las muestras de suero se diluyen serialmente (1 :20 a 1 :2560) y agregan por triplicado a una cavidad de 96 cavidades. Como controles positivos, los sueros inactivados por calor de un anticuerpo neutralizante de HIV-1 obtenido de NIH Repository se utilizan. Los controles negativos incluyeron sueros de monos así como también sueros de preinmunización de todos los animales de prueba. El virus se agrega a 50 TCID (50% de dosis infectiva de cultivo de tejido) y las placas se incuban por 1 hora. Después de la incubación, las células CE x174 se agregan a las cavidades de control (células solas) así como también a las cavidades de virus/anticuerpo en una concentración de 1x105 células/cavidad. Las placas se incuban a 37°C en un incubador de C02, y verifican diariamente para formación de sincitio. Las capacidades neutralizantes de los sueros se valoran al probar la actividad de transcriptasa inversa (RT) de una porción de la suspensión el d ía 8 y las células se exponen a XTT, una 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-sulfofenil]-2H-tetrazoíio-5-carboxanilida (Sigmá, St. Louis, MO) para determinar la viabilidad el día 10. Los sueros preinmunes no causaron reducción en la actividad RT. La dilución de suero más alta que logra más del 50% de reducción en actividad RT se determina por ser una concentración de anticuerpo de neutralización fuerte. Una reducción de 30-50% en actividad RT obtenida con la dilución de suero más alta se considera una concentración de neutralización débil . Respuesta de proliferación de la célula T Los antígenos y mitógeno (PHA-P, Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) se colocan en la placa en una concentración de 1 a 1 0 µg/cavidad por triplicado en placas de fondo redondo de 96 cavidades. La sangre completa se obtiene de monos inmunizados, diluye 1 :2 en PBS, retrasa sobre gradiente Ficoll (LS , Organon Teknika Corp. , Durnham, NC) y centrífuga a 200 X g por 30 minutos a temperatura ambiente. Los linfocitos se recolectan , lavan, cuentan y ajustan a una concentración de 1 x 1 06 células viables/ml en medio RPMI-1640 conteniendo 1 0% FCS, L-g lutamina y antibióticos. Una suspensión de linfocito de 0.1 mi se distribuye en cada cavidad que contiene antígeno de la(s) placa(s) de 96 cavidades . Las placas se incuban a 37°C y 5% C02. Después de la incubación con mitógeno por 3 días o antígeno por 6 días, 1 µ?\' de 3H-timidina por 1 6-18 horas inmediatamente se recolectan sobre el papel de filtro de fibra de vidrio cón un recolector de células Wallac™. Después de la adición de fluido de centelleo acuoso (Scinisafe, Fisher Scientific), la incorporación de 3H-timidina se determina al medir la radioactividad en un contador de centello líquido LKB Wallac 1209 Rackbeta™. Los resultados se expresan como índice de estimulación promedio (SI) y se calculan como conteos promedios por minuto (CP ) de experimental (antígeno o mitógeno) arriba de cpm promedio del control (células solas). Un valor SI promedio más alto que 2 se considera significativo. Análisis CTL Los esplenocitos se suspenden en medio de cultivo de tejido RP I 1640. Para reestimulación específica, 3x107 células respondedoras se cocultivan con 1 .5x10e esplenocitos impulsados por antígeno, singenéicos (irradiados con 20,000rad) por 5 días en 10ml de medio en matraces de cultivo de tejido de 25ml en una atmósfera húmeda de C02 a 37*0. Para reestimulación no específica, las células respondedoras se cultivan durante la noche en medios que contiene interleucina 2 (IL-2) a 10 lU/ml. Los esplenocitos no específicamente y específicamente estimulados por antígeno se recolectan después de 5 días de cultivo y layan dos veces con medio: estos sirven como células efectuoras. La actividad citolítica específica de efectuores se prueba utilizando diluciones de células efectuoras con 2x103 células objetivo marcadas con 51Cr (esplenocitos singenéicos impulsados por 4 horas con antígeno) en 200 µ? de medio en 96 cavidades de fondo redondo. Un volumen de 100 µ? de sobrenadante se recolecta y lee erí un contador gamma. La lisis específica se . calcula como sigue: (liberación experimental-liberación espontánea)X100 (liberación total-liberación espontánea) La liberación espontánea se representa por el valor obtenido de células objetivo sin ninguna célula efectuora agregada, mientras que la liberación total se determina después de lisar las células objetivo marcadas con una solución detergente. EJEMPLOS Ejemplo 1 : HECs en base a HIV-1 Las secuencias de proteína de epítope se obtienen de las bases de datos de SIDA y retrovirus humanos (Los Alamos, 1998). En base a los datos de secuencia, cinco regiones de la glicoproteína de envoltura de HIV-1 (gp120) se reconocen como áreas hipervariables. Estas cinco regiones hipervariables incluyen epítopes neutralizantes de anticuerpo. CTL, y/o de célula ayudante T (HIV Molecular Immunology Datábase, 1998). Los aminoácidos posibles para cada posición a lo largo de un epítope de neutralización se determinan de la información de secuencia de aislados in vivo de cepas B de clade HIV-1 y la información de secuencia para cada epítope se alinea y evalúa. Subsecuentemente algunos pasos de acoplamiento de aminoácido en la síntesis del epítope neutralizante se realizan con una mezcla de aminoácidos apropiados como se determina a partir de los datos de secuencia observados. Este proceso se repite en cada paso de acoplamiento de aminoácido en la síntesis. De esta manera, en una síntesis única, una mezcla de péptidos que representa todas las variantes in vivo observadas del epítope neutralizante se produce.

Figura 3 ¡lustra una colección ejemplificativa de HECs producidas de acuerdo a la invención, que muestra las adiciones de aminoácido utilizadas en tos residuos variables y constantes para la síntesis de cinco HIV-1 HECs. HECs se basan en la variabilidad observada en secuencias epitópicas de las regiones hipervariables de glicoproteína de envoltura (gp120) de HIV-1 . Esta colección de HECs sintetizada para utilizarse en una vacuna humana contra HIV-1 en la invención sujeto se comprende de cinco diferentes HIV-1 HECs. Cada una de las cinco HECs comprende una mezcla de menos de 100 péptidos diferentes. Para cada uno de los cinco epítopes, las secuencias gp120 de cepas Clade B de HIV-1 se alinean para valorar tanto el patrón como la naturaleza de variabilidad. Los aminoácidos más comúnmente observados en cada posición a lo largo de la región hipervariable de interés se seleccionan para la adición durante la síntesis de péptido de acuerdo con las directrices que son un elemento integral de la invención sujeto. Más específicamente, la cantidad de aminoácido(s) agregada a una adición dada en la síntesis utilizando química Fmoc se redondea a lo más próximo a 25% y no más de cuatro aminoácidos se agregan en un paso de acoplamiento de aminoácido. Además, el número calculado de péptidos producidos en una síntesis HEC jamás excedió 100 péptidos diferentes. Por ejemplo, 64, 32, 64, 6 y 4 péptidos distintos se calculan que están presentes en cada uno de los cinco HIV-1 HECs, respectivamente. Figura 3 indica que dicha mezcla de péptidos referida como "HIV-1 HEC1 " contiene una mezcla de dos aminoácidos en las posiciones de aminoácido 3, 7, 12, 13, 16 y 18 con aminoácidos únicos en todas las otras posiciones. La multiplicación binominal indica que un total de 64 variantes se contendrá dentro de esta mezcla de péptidos. Este se deriva por una multiplicación por un factor de 1 en cada posición que contiene un aminoácido único y multiplicación por un factor de 2 en cada una de las 6 posiciones variables. La longitud del epítope se limita de manera que no más de 100 péptidos diferentes se forman. De esta manera, por ejemplo, HIV-1 HEC podría no extenderse más si cualquier posición de aminoácido adicional contuvo más de un aminoácido, como 64 variantes multiplicadas por cualquier factor mauro a uno resultaría en una mezcla de péptidos que contiene más de cien variantes. Para probar la ¡nmunogenicidad de HIV-1 HECs en primates, dos rhesus machaques (Macaca mulata) se inmunizan con HECs, mezclan con un adyuvante aprobado para uso humano. Los linfocitos de sangre periféricos (PBLs) se obtienen 76 semanas después de la inmunización previa del animal con cinco HIV-1 HECs. Cuando se estimulan in vitro con HECs así como también con péptidos que representan epítopes de cepas divergentes de HIV-1 , PBLs se proliferan extensivamente, como se ilustra en la figura 4. La figura 4 también demuestra la inmunización de primates con resultados de HIV-1 HECs en la inducción de las células T que se proliferan en respuesta a las secuencias de ciclo V3 altamente variables de cinco subtipos divergentes, principales de HIV-1 (Clades A-E). Estos datos indican que respuestas de memoria de la célula ayudante T ampliamente reactiva, fuerte, y que dura mucho tiempo pueden inducirse en primates después de la inmunización con estas HIV-1 HECs. Figura 5 indica que la inmunización con HIV-1 HECs resultó en una respuesta de anticuerpo que dura mucho tiempo dirigida contra las cinco HECs colectivamente, y también contra cinco HECs individuales. La inducción de célula del ayudante de la célula T ampliamente reactiva se dirige contra epítopes gp120 de diferentes cepas de HIV-1 correlacionadas con unión de anticuerpo ampliamente reactivo a epítopes divergentes de HIV-1 . Los monos produjeron anticuerpos contra HIV-1 HEC1 , HEC2, HEC3, HEC4 y HEC5 después de la primer inmunización, y contra todas las HECs después de una segunda inmunización. De esta manera, la inmunización con todas las HECs una vez no evita que las respuestas inmunes se produzcan a cada una de las HECs. HIV-1 HEC 3 induce una respuesta dentro de dos semanas después de la primer inmunización y constituye la respuesta de anticuerpo más fuerte entre todas las cinco construcciones. La concentración de anticuerpo aumentó a más de 1 :40,000 después de la carga, y permaneció alta, con un pequeña declinación, por 22 meses. La valoración de la salud post-inmunización de los monos fue excelente y la química de la sangre siempre fue normal. Ningún síntoma de conducta o secundario se detecta. Los sueros (que contienen anticuerpos) d los monos inmunizados se prueban para la presencia de anticuerpos ampliamente reactivos utilizando epítopes encontrados en las regiones hipervariables gp120 de (VI-V5) de cepas dé HIV-1 Clade B MN, RF, y SF2. Figura 6 indica que dos semanas después de una segunda inmunización con HIV-1 HECs, la reactividad del anticuerpo se observa contra todos los análogos. Los sueros de ambos monos (25705 y 25598) se unieron fuertemente a todos los análogos de péptido de todos los tres aislados de HIV-1. De manera más importante, ios anticuerpos de ambos monos no son capaces de reconocer y unirse a proteína gp120 recombinante SF2 de HIV-1 . Figura 7 muestra los anticuerpos de los monos inmunizados se prueba para actividad neutralizante contra diferentes cepas de laboratorio y los aislados primarios. Los anticuerpos de ambos monos son capaces de neutralizar el aislado de HIV-1 primario 89.6 y la cepa de HIV-1 adaptada por el laboratorio de HIV-1 IIIB. Un suero de anticuerpo neutralizante conocido se utiliza como un control positivo. Los datos indican que la inmunización de primates con HIV-1 HECs induce las respuestas del anticuerpo y ayudante T que son ampliamente reactivos contra las cepas divergentes de HIV-1 . Figura 8 indica que, además, los individuos infectados con cepas diversas (clades) de HIV-1 de alrededor del mundo poseen anticuerpos que reconocen HIV-1 HECs. Las figuras 4-6 de la especificación demuestran que las mezclas de péptidos a base de proteína de envoltura de HIV-1 son inmunogénicas. Figura 8 demuestra su antigenicidad, y la figura 7 ilustra su efecto protector contra replicación viral in vitro. Ejemplo 2: HECs en base a epítopes del virus de hepatitis C Dos HECs contra las dos regiones hipervariables de virus de hepatitis C (HCV) se designan de acuerdo a la invención. Las secuencias de aislados in vivo de los virus se obtienen de bases de datos y literatura científica revisada y los epítopes de interés sé alinean. Las proporciones de aminoácidos agregadas en pasos de acoplamiento de aminoácido individuales se determinan entonces de acuerdo a las directrices establecidas por la invención sujeta al redondear las frecuencias de aminoácidos a lo más próximo a 25% cuando se determina que los aminoácidos se incluyen en un residuo variable. Figura 9 ilustra los aminoácidos que aparecen en diferentes posiciones dentro de la mezcla de péptido. La mezcla de péptido se sintetiza utilizando química Fmoc estándar. En particular, puede observarse en HIV-1 HECs de la figura 9 que un 24-mer se forma teniendo cantidades iguales de tirosina (Y) e histidina (H) en el residuo 4, cantidades iguales de leuciná (L) y fenilalanina (F) en posición 17, cantidades iguales de alanina (A) y (T) en la posición 18, y cantidades iguales de serina (S) y asparagina (N) en posición 19. El número de diferentes péptidos generados se calcula así como 2x2x2x2 (o 24) = 16. Ejemplo 3: HECs en base a epítopes del virus de influenza Muchos años de búsqueda en influenza han producido información importante que hace el diseño de HECs en base a variación entre los virus de influenza posibles. Estos datos vienen de los procedimientos de rutina que las organizaciones tales como WHO y CDC han colocado en su lugar para identificar las variantes esperadas para aparecer durante el siguiente años. Brevemente, los aislados silvestres de influenza se obtienen de varios huéspedes alrededor del mundo. Se identifican por tipo (A o B), se seleccionan contra antisuero anti-influenza para identificar las cepas que son reactivas, y por lo tanto se protegerán por la vacuna de influenza actual. Se seleccionan demás contra un panel de antisueros para confirmar que el patrón de reactividad es el mismo.

Esto asegura que las mutaciones exactas no han ocurrido. En cada año, la vasta mayoría de cepas de catarro son antigénicamente idénticas. Siempre existen pocas cepas, sin embargo, que producen patrones de reactividad únicos, y estos se estudian cuidadosamente, ya que pueden volverse cepas predominantes en el futuro. La secuenciación de aminoácido se realiza en estas cepas de influenza únicas. La figura 10 describe cuatro HECs de influenza formados de acuerdo a la invención que representan colectivamente los sitios de combinación de cambio antigénicos encontrados en la proteína de envoltura de hemaglutitina de Influenza A. Esta HECs difieren de alguna manera de aquellas previamente descritas y caracterizadas en que representan epítopes hipervariables formados por epítopes discontinuos de la proteína de envoltura de influenza. Los aminoácidos elegidos en el diseño de cada una de estas HECs de influenza no son de un estiramiento hipervariable secuencial, único de aminoácidos en la proteína de superficie viral, en lugar, cada una se basa en aminoácidos de varias porciones dentro de la secuencia de aminoácidos lineal de la proteína viral que se piensa que existen en proximidad entre sí cuando se observan en tres dimensiones. Los porcentajes de los aminoácidos utilizados en síntesis se derivan de aminoácidos de cada posición en base a aproximadamente 61 aislados humanos de Influenza A (incluyendo secuencias de Influenza A de puerco) obtenidos del banco genético de la base de datos de proteína Suiza. Consistente con resultados obtenidos después de la inmunización de monos con HIV-1 HECs, inmunización de ratones con cuatro HECs de influenza produjeron célula ayudante T potente y respuestas de anticuerpo (figuras 1 1 y 12, respectivamente). De manera más importante, la célula ayudante T producida por inmunización con HECs respondió cuando se estimula in vitro con virus de Influenza A, inactivado total (figura 1 ). Una HEC, que representa muchas variaciones ligeramente diferentes de un epítope, pueden ayudar a asegurar que una población ya criada en la cual las moléculas MHC son altamente polimórficas, se forma HEC que contiene un subcpnjunto de variantes de epítope capaces de unir la ranura de cualquier molécula MHC del sujeto individual para presentación al sistema inmune. De esta manera, las vacunas a base de HEC superan la restricción de MHC. Sin embargo, las figuras 13 y 14 demuestran este principio. Figura 13 demuestra que mientras la inmunización de ratones Balb/c en crianza con un péptido de secuencia único (SSP) representado el epítope de virus de inmunodeficiencia de mono (SIV) 414-434 conduce a la inducción de anticuerpos que unen este péptido. En contraste, la inmunización de una cepa genéticamente diferente de ratones (C57b1 ) con una restricción de MHC diferente no puede producir anticuerpos que se unen al péptido. Sin embargo, la inmunización de los ratones que no responden (C57b1 ), así como también los ratones Balb/c que responde, con una HEC en base a este epítope, conduce a la inducción de anticuerpos qué pueden unirse al virus así como también la proteína que contiene este epítope (figura 14). Ejemplo 4: Conjugación de HEC derivada SIV con porción lípida Además de inducir las respuestas de anticuerpo y ayudante de la célula T potente, HECs pueden también inducir respuestas de linfocito T citotóxico (CTL) cuando se conjugan con porciones de lípidos. Lipo-HECs utilizadas para la inducción de CTLs se preparan al conjugar Pam con HECs conjugadas con resina en base a SIV. Este es un método estándar para producir lipo-péptidos. Los ratones se inmunizan con lipo-HEC y adyuvante (lipo-HEC) o con PBS y adyuvante (A-PBS) y esplenocitos de estos ratones así como también de ratones naturales se probaron para actividad CTL contra células objetivo incubadas con HECs. Los datos mostrados en la figura 1 5 representan el por ciento de tisis especifica después de la substracción de lisis anterior no específica. La lisis específica observada se obtiene con animales que recibieron solamente dos inmunizaciones. No se observó lisis después de solamente una inmunización única (datos no mostrados). Figura 15 demuestra que la inmunización lipo-HECs induce actividad CTL significativa. Lipó-HECs también se prepara utilizando un método de conjugación en el cual un éster de ácido palmítico se une a péptidos libres de resina. Los dos tipos de conjugados lipo-HEC fueron igualmente efectivos para inducir las respuestas inmunes, conduciendo a la conclusión de que los métodos de conjugación parecen influenciar la inmunogenicidad de lipo-HECs formadas. Ejemplo 5: Formación de composición en base a glicoproteína de envoltura HIV1 Figura 16 ilustra secuencias para 5 mezclas de péptido (o composiciones) formadas de acuerdo a la invención. Las secuencias se basan en 5 regiones hipervariables de la glicoproteína de envoltura HIV-1 (gp120). Más específicamente, las mezclas corresponden a epítopes comprendidos por las siguientes secuencias de aminoácidos en la cepa de HIV-1 de referencia B.US.SF2; gp120-1 , aminoácidos 130-155; aminoácidos gp120-2 159-1 93; aminoácidos gp120-3 307-333; aminoácidos gp120-4 387-410; y aminoácidos gp120-5 456-471 . En residuos variables, donde dos o más aminoácido aparecen con una frecuencia de 25% o más cuando se redondea a lo más próximo a 25%, los dos o más aminoácidos se agregan al proceso de sintetización de aminoácido en cantidades representativos de sus frecuencias redondeadas. Las mezclas de péptido formadas de acuerdo a la invención comprenden una pluralidad de diferentes péptidos, que reflejan los aminoácidos variables más comunes encontrados en la giicoproteína de envoltura HIV-1 (gp120), como se reporta en la literatura. Específicamente, gp120-1 a gp120-5 son mezclas de péptido separadas que contienen 64, 64, 32, 32 y 48 diferentes péptidos, respectivamente. Las modalidades arriba descritas de la presente invención se proponen como ejemplos solamente. Alteraciones, modificaciones y variaciones pueden efectuarse a las modalidades particulares por aquellos de experiencia en la materia sin apartarse del alcance de la invención, que se define solamente por las reivindicaciones anexas a la misma.

Claims

EIVINDICACIONES 1 . Un proceso para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica que comprende los pasos de: obtener secuencias de epítope inmunogénicas de un patógeno, dichas secuencias de epítope inmunogénicas teniendo una región de residuo común y al menos un residuo variable con el cual dichas secuencias difieren entre sí; determinar la frecuencia con la cual los diferentes aminoácidos se encuentran en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas; sintetizar una mezcla d péptidos que comprende hasta aproximadamente 1 00 diferentes péptidos, cada péptido teniendo la región de residuo común y teniendo en una posición de residuo variable un aminoácido seleccionado de aquellos encontrados en el residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas con una frecuencia mayor que una frecuencia de umbral de desde aproximadamente 1 0% a aproximadamente 30%. 2. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque la frecuencia de umbral es aproximadamente 12%. 3. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque la mezcla de péptidos comprende secuencias que tienen en el residuo variable un aminoácido seleccionado de los aminoácidos más frecuentemente encontrados como el residuo variable en las secuencias de epítope inmunogénicas, siempre que no más de 4 diferentes aminoácidos aparezcan en la posición de residuo variable de diferentes péptidos dentro de la mezcla de péptidos. 4. El proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque durante la etapa de sintetización de la mezcla de péptidos, los péptidos se forma de manera que diferentes aminoácidos que aparecen en la posición de residuo variable, se presentan relativos entre sí en proporción a la frecuencia con la cual diferente aminoácido aparece en el residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas. 5. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque la frecuencia con la cual un aminoácido se encuentra en un residuo variable se redondea a lo más próximo a 25%, y solamente aquellos aminoácidos que tienen frecuencia redondeada de no cero se incluyen en la posición de residuo variable en los péptidos de la mezcla de péptidos. 6. El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque los péptidos de la mezcla de péptidos tienen un aminoácido dado presente en la posición de residuo variable con una frecuencia proporcional a la frecuencia redondeada de dicho aminoácido dado. 7. El proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque las frecuencias de aminoácidos similares encontrados en un residuo variable se agrupan, y la frecuencia agrupada se asigna ai aminoácido más frecuentemente encontrado de los aminoácidos similares cuando se calcula la frecuencia redondeada. 8. El proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque las frecuencias de aminoácidos similares encontrados en un residuo variable se agrupan solamente si los aminoácidos similares individualmente tienen una frecuencia por debajo de la frecuencia de umbral. 9. El proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque las frecuencias de aminoácidos similares solamente se agrupan si, en el redondeo de cada frecuencia de aminoácido similar, a lo más próximo s a 25%, ningún aminoácido similar tienen una frecuencia redondeada de 25% o más. 10. El proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque los aminoácidos similares se seleccionan de aquellos que pertenecen al grupo que consiste de: aminoácidos aromáticos, 0 aminoácidos alifáticos, aminoácidos de cadena lateral de hidroxilo alifático, aminoácidos básicos, aminoácidos ácidos, aminoácidos que contienen amida y aminoácidos que contiene azufre. 1 1 . El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque el paso de síntesis se conduce utilizando acoplamiento de 5 aminoácido, y la posición de residuo variable se acopla al agregar los aminoácidos en proporción a sus frecuencias redondeadas. 12. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque dichas secuencias de epítope inmunogénicas comprenden de 2 a 7 residuos variables. 0 13. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque la mezcla de péptidos contiene de 2 a aproximadamente 64 péptidos diferentes. 14. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque al menos un paso se conduce utilizando una metodología de 5 bioinformática. - 63 - 15. Un proceso para la preparación de una mezcla de péptidos inmunogénica que comprende los pasos de: obtener secuencias de epítope inmunogénicas de un patógeno, dichas secuencias de epítope inmunogénicas teniendo una región de residuo común y al menos un residuo variable con el cual dichas secuencias difieren entre sí; determinar la frecuencia con la cual diferentes aminoácidos se encuentran en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas; redondear la frecuencia con la cual un aminoácido se encuentra en un residuo variable a lo más próximo de 25%; sintetizar una mezcla de péptidos que comprende hasta aproximadamente 100 péptidos diferentes, cada péptido teniendo la región de residuo común y teniendo en una posición de residuo variable un aminoácido seleccionado de aquellos más frecuentemente encontrados en un residuo variable de las secuencias de epítope inmunogénicas, estipulando que dicho aminoácido tiene una frecuencia redondeada de no cero; dicha posición de residuo variable seleccionándose de dos a cuatro diferentes aminoácidos, cada uno de dichos dos a cuatro diferentes aminoácidos representándose en dicha mezcla de péptidos en proporción a su frecuencia redondeada. 16. El proceso según la reivindicación 15, que comprende adicionalmente los pasos de: agrupar las frecuencias de amino similar que tienen frecuencias redondeadas menores a 25%; asignar la frecuencia agrupada al que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares; redondear la frecuencia agrupada a 16 más próximo a 25%; y, para frecuencias redondeadas de no cero, incluyendo el que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares en el paso de sintetizar una mezcla de péptidos. 17. Una mezcla de péptidos inmunogénica a un patógeno, dicha mezcla comprendiendo hasta aproximadamente 100 péptidos diferentes, cada péptido teniendo una región de residuo común y teniendo una posición de residuo variable; la región de residuo común de los diferentes péptidos siendo aminoácidos no variables de una secuencia de epítope inmunogénica de un patógeno, adyacente a un residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica; la posición de residuo variable ocupándose por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los aminoácidos que ocurren de manera más frecuente en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica siempre que: (a) no más de cuatro diferentes aminoácidos estén presentes en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos de la mezcla de péptidos; y (b) un aminoácido presente en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos aparezca en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica con una frecuencia mayor que una frecuencia de umbral de desde aproximadamente 10% a aproximadamente 30%. 18. La mezcla de péptidos según la reivindicación 17, caracterizada porque la frecuencia con la cual un aminoácido aparece en una posición de residuo variable se determina de acuerdo al siguiente s esquema: la frecuencia con la cual un aminoácido ocurre en el residuo variable de la secuencia de epítope inmunogénica se redondea a lo más próximo a 25%, y los aminoácidos que tienen frecuencias redondeadas de no 0 cero se encuentran en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos con una frecuencia proporciona a la frecuencia redondeada. 19. La mezcla de péptidos según la reivindicación 18, caracterizada porque la frecuencia con la cual los aminoácidos similares que tienen una frecuencia redondeada menor a 25% aparecen en una 5 posición de residuo variable, se determina de acuerdo al siguiente esquema: las frecuencias de aminoácidos similares se agrupan y redondean a lo más próximo a 25%; para frecuencias redondeadas de no cero, la frecuencia 0 redondeada se asigna al aminoácido que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares; el que ocurre más frecuentemente de los aminoácidos similares se encuentra en la posición de residuo variable de los diferentes péptidos con una frecuencia proporciona a la frecuencia redondeada. 5 20. Una composición de péptido conjugada que comprende la mezcla de péptidos de la reivindicación 17 conjugada con una porción lipida. 21 . Una composición de péptido conjugada que comprende la mezcla de péptidos de la reivindicación 1 7 conjugada con una porción s de proteína veh ículo. 22. Una composición que comprende una pluralidad de mezclas de péptidos formadas de acuerdo a la reivindicación 17 , en donde cada una de dichas mezclas de péptidos es inmunogénica al mismo patógeno. 0 23. La composición inmunogénica según la reivindicación 22, caracterizada porque cada una de dicha pluralidad de mezclas de péptidos se dirige a una secuencia de epítope inmunogénica diferente del mismo patógeno, y las diferentes secuencias de epítope inmunogénicas se encuentran en las regiones en proximidad a la superficie de patógeno. 5 24. Una vacuna para invocar una respuesta inmunogénica contra un patógeno que comprende la mezcla de péptidos de la reivindicación 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25. Un método de vacunación contra una enfermedad patogénica que comprende el paso de administrar a un sujeto una cantidad 0 efectiva de la vacuna de la reivindicación 24. 26. Un método para diagnosticar ja infección de un sujeto por un patógeno, el método comprendiendo los pasos de: obtener una muestra biológica que contiene anticuerpo de dicho sujeto; 5 contactar la muestra biológica con la mezcla de péptidos inmunogénica de acuerdo a la reivindicación 1 , en base a las secuencias de epítope inmunogénicas del patógeno, y evaluar la respuesta inmunogénica de dicha muestra con dicha mezcla de péptidos. 27. Un equipo de diagnóstico para determinar la infección de un sujeto por un patógeno que comprende: la mezcla de péptido inmunogénica de la reivindicación 1 en base a las secuencias de epitope inmunogénicas del patógeno, y direcciones para evaluar una respuesta inmunogénica de una muestra biológica que contiene anticuerpo del sujeto con la mezcla de péptidos inmunogénica. 28. Un proceso para aislar un anticuerpo inmunogénico a un patógeno que comprende los pasos de: administrar a un sujeto la mezcla de péptidos de la reivindicación 17; y obtener un anticuerpo del sujeto inducido por la administración de la mezcla de péptidos. 29. Un proceso para aislar un gen que codifica un anticuerpo inmunogénico a un patógeno que comprende los pasos de: administrar a un sujeto la mezcla de péptidos de la reivindicación 17; obtener un anticuerpo del sujeto inducido por la administración de la mezcla de péptidos; y aislar un gen que codifica el anticuerpo. 30. Un proceso para aislar una porción de un gen o material genético que codifica todo o parte de un anticuerpo reactivo con un patógeno que comprende los pasos de: administrar a un sujeto la mezcla de péptidos de la reivindicación 17; obtener del sujeto un anticuerpo, o parte de un anticuerpo reactivo con el patógeno, inducido por la administración de la mezcla de péptidos; y aislar dicha porción de un gen o material genético que codifica el anticuerpo o la parte del anticuerpo reactivo con el patógeno. 31 . Una inmunoterapia contra un patógeno que comprende la administración de un péptido o proteína codificada por una porción del gen o material genético obtenido de acuerdo al proceso de la reivindicación 30 a un sujeto.