EA008143B1 - Иммуногенные композиции из вариабельных пептидных эпитопов и способ их получения - Google Patents
Иммуногенные композиции из вариабельных пептидных эпитопов и способ их получения Download PDFInfo
- Publication number
- EA008143B1 EA008143B1 EA200400897A EA200400897A EA008143B1 EA 008143 B1 EA008143 B1 EA 008143B1 EA 200400897 A EA200400897 A EA 200400897A EA 200400897 A EA200400897 A EA 200400897A EA 008143 B1 EA008143 B1 EA 008143B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- amino acids
- frequency
- peptide
- pathogen
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 182
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 215
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 58
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 201
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 37
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 40
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 39
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 31
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 193
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 189
- 206010048643 Hypereosinophilic syndrome Diseases 0.000 description 112
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 14
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 7
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 101001112162 Homo sapiens Kinetochore protein NDC80 homolog Proteins 0.000 description 4
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 4
- 102100023890 Kinetochore protein NDC80 homolog Human genes 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 3
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 3
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000002311 trypanosomiasis Diseases 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100175355 Arabidopsis thaliana GEK1 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100030324 Ephrin type-A receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021601 Ephrin type-A receptor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100031968 Ephrin type-B receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241001462948 Ethope Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000938351 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000898676 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001064462 Homo sapiens Ephrin type-B receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000843569 Homo sapiens Transcription factor HES-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000009620 Orthomyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100030773 Transcription factor HES-3 Human genes 0.000 description 1
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000852 deltoid muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Описан способ получения иммуногенной пептидной смеси в одном синтезе. Пептидная смесь совокупно представляет вариабельность, наблюдаемую in vivo в иммуногенных эпитопах патогена. Такую смесь называют гипервариабельным эпитопным комплексом (ГЭК). Иммунизация ГЭК вызывает широкореактивную иммунность против дивергентных линий патогена, на основе которого создан ГЭК.
Description
Настоящее изобретение в общем относится к иммуногенным композициям и способам их получения. А именно настоящее изобретение относится к способам получения смесей иммуногенных пептидов на основе отобранных из аминокислотных последовательностей вариабельных участков белковых эпитопов.
Уровень техники
Многие патогены, включая такие вирусы, как ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирус гриппа, гепатитов А, В и С, папилломавирус человека (ВПЧ), вирус тропической лихорадки, а также паразиты, такие как возбудитель малярии и трихинелла, могут легко изменять аминокислотную последовательность в композиции определенных белковых эпитопов. Принимая во внимание это обстоятельство, а также имея в виду и иные цели, в качестве альтернативы вакцинам из ослабленных или инактивированных возбудителей интенсивно исследуются вакцины на основе синтетических пептидов. Отбор только тех эпитопов, которые являются эффективными иммуногенами, исключает присутствие в вакцине эпитопов, ответственных за нежелательный иммунный ответ, например стимуляцию заболевания или супрессию Т-клеток. Кроме того, они химически полностью определены и не содержат никакого инфекционного материала, они несут минимальный риск для здоровья. Наконец, в отличие от живых ослабленных вакцин, которые следует хранить и транспортировать только при определенных пониженных температурах, пептидные вакцины относительно требуют охлаждения, что делает их распространение более простым и менее затратным.
В настоящее время испытываются синтетические пептидные вакцины для защиты от бактерий, паразитов и вирусов. Бактериальные эпитопные вакцины, например, включают вакцины против холеры и шигеллы. Синтетическая вакцина от малярии уже прошла первую и вторую фазы клинических испытаний на человеке. Вирусы гриппа и гепатита В представляют собой две вирусные системы, для которых синтетические вакцины выглядят особенно перспективно, и в последнее время проявляется интерес к синтетическим вакцинам от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
Несмотря на давние успехи, вакцины из синтетических пептидов не способны учитывать вариабельность оболочечных или поверхностных белков. Несколько групп исследователей пытались в прошлом учитывать эпитопную вариабельность, используя различные подходы. Один из таких подходов учета эпитопной вариабельности описан Таммом в патенте США 5229490 (20 июля 1993 г.). Способ включает конъюгацию нескольких одинаковых или разных этитопов в один иммуногенный кор, используя функциональные группы лизина и глициновые линкеры (дендритные полимеры). Этот способ относится к созданию пептидных систем множественных антигенов (ПСМА). Однако хотя ПСМА на основе ВИЧ и является высоко иммуногенной, она не индуцирует антител с широкой реактивностью, которые могли бы распознавать дивергентные штаммы вируса (ИагбеШ е! а1., 1992 1. 1ттипо1. 148:914-920).
Еще один более известный подход включает идентификацию «мимотопов», которые представляют собой произвольно генерированные последовательности, подобные этитопу антигена (Ьеп51га е! а1., 1992, 1. 1ттипо1. Ме!йо6к 152:149-157). При таком подходе дегенеративные олигонуклеотиды вставляют в бактериальные экспрессионные вектора, что приводит к экспрессии библиотеки произвольных пептидов по 6-8 аминокислот в длину. Те пептиды, которые подобны этитопам антигена, идентифицируют с помощью сыворотки (содержащей антитела) животных или лиц, инфицированных соответствующим патогеном. И действительно, в общем этот подход используют для идентификации мимотопов, которые распознавались сывороткой лиц, инфицированных вирусом гепатита С (Ριόζζι е! а1., 1996 1. 1ттипо1. 156:45044513). Однако при этом пептиды отбираются произвольно, поэтому для составления мимотопной композиции необходимо получать и анализировать сыворотку от инфицированных субъектов.
Еще одним недостатком прежних подходов, требующих сыворотки от инфицированных субъектов, является то, что многие инфицированные субъекты не генерируют антител к данному патогену. Таким образом, выбор требуемых пептидов с использованием сыворотки пациента потенциально может привести к потере важных антигенных пептидов, подобных этитопам, против которых данный пациент не способен генерировать иммунный ответ.
Используя систему вирус иммунодефицита обезьян (ВИО)/макака-резус как модель ВИЧ-инфекций у людей, описаны оболочечный гликопротеин ВИО В-клеточной нейтрализации и Т-клеточный эпитоп, разработан и синтезирован синтетический иммуноген на основе гипервариабельного и высоко антигенногоэпитопа оболочечного гликопротеина (др130) ВИО тас142 (Апбегкоп е! а1., 1994, Уассше 12:736740). Этот синтетический иммуноген состоит из смеси пептидов, представляющих собой варианты аминокислотных замен, обнаруженных в последовательности оболочечного гена ВИО. Таким образом, этот синтетический иммуноген в совокупности представляет все существующие ш у1уо варианты, наблюдаемые для данного эпитопа. Оценка иммуногенности такого синтетического антигена показывает у иммунизированных макак-резусов повышенное количество антител, способных связываться с биологически нативным ВИО. Более того, он усиливает иммунореактивность к дивергентным аналогам эпитопа. В этой и последующей публикациях (Меуег е! а1., 1998, АШ8 Век. Нитап Ре1го 14:751-760) показывается, что такой подход может вполне учитывать эпитопную вариабельность.
В последние годы стало ясно, что Т-клетки дегенерируют в своей способности распознавать пеп
- 1 008143 тидные антигены. Это открытие вызвало интерес потому, что пептиды из некоторых инородных антигенов могут быть схожими с некоторыми собственными антигенами и непреднамеренно приводить к активации аутореактивных Т-клеток и приступам аутоиммунных заболеваний. Соответственно, существует риск аутоиммунных заболеваний, связанных с иммунизацией животных или человека смесью произвольно синтезированных пептидов. Методика мимотопов (Ьепйта с1. а1., 1992, 1. 1ттипо1. Мс11юЙ5 152:149-157) подразумевает отбор субпопуляции пептидов для иммунизации из смеси произвольно синтезированных пептидов, используя сыворотку инфицированных животных или человека, что таким образом снижает риск аутоиммунных заболеваний. Однако синтетические иммуногенные композиции, описанные выше (Апйегаоп е!.а1., 1994, Уассше 12:736-740; Меуег е! а1., 1998, ΑΙΌ8 Кек. Нитап Ке1го 14:751760), не содержат полностью произвольных смесей пептидов, поскольку получение этих пептидов основано на добавлении только нескольких из возможных 20 аминокислот на лишь некоторых стадиях реакции синтеза. Тем не менее, синтетические иммуногенные композиции, такие как описаны ранее, могут содержать свыше 8000 различных пептидных антигенов. Хотя такой способ и приводит к получению иммуногена, который вызывает широкореактивную иммунность, эти композиции слишком сложны для биохимической или иммунологической характеризации, поэтому иммунизация людей такими композициями сопровождается бы значительным риском аутоиммунных заболеваний. Кроме того, без полного состава пептидной смеси получить одобрение соответствующих контрольных органов будет просто невозможно. Полный анализ состава пептидной смеси, состоящей из сотен или тысяч различных пептидов, будет чрезвычайно длительным и очень затратным.
Многие из описанных ранее синтетических иммуногенных композиций представляют собой смеси десятков различных пептидов. Принимая во внимание, что Т-клетки дегенерируют в своей способности распознавать инородные антигены, в смеси пептидов такой сложности высок риск содержания пептидов, подобных собственным антигенам, которые в ходе иммунизации могут индуцировать патогенный аутоиммунный ответ. Более того, высокая сложность прежних схем синтеза делает весьма трудным, если не невозможным, химическую идентификацию и оценку качества каждой полученной партии таких композиций.
Таким образом, существует необходимость в новом способе получения смесей иммуногенных пептидов, приводящем к менее сложным по составу композициям, чем описанные прежде, при этом обладая оптимальной иммуногенностью. Такой новый способ должен позволять получать и анализировать композиции для применения их на людях. Кроме того, существует необходимость разработки процедуры контроля качества таких композиций с целью проверки целостности и антигенности смеси, полученной в реакции синтеза.
Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения является устранение или смягчение, как минимум, одного недостатка известных ранее иммуногенных композиций или известных ранее способов получения таких композиций.
Настоящее изобретение относится к способу, с помощью которого получают смесь пептидов, являющихся вариантами наблюдаемых ш νίνο последовательностей белковых эпитопов. Пептидные смеси, полученные таким образом, вызывают экстенсивный иммунный ответ и полезны в производстве вакцин, терапевтических средств и диагностикумов для определения различных патогенных организмов, таких как вирусы и паразиты. Способ может быть применен к широкому диапазону эпитопов патогенных организмов.
Настоящее изобретение представляет способ получения смеси пептидов, именуемой гипервариабельным эпитопным комплексом (ГЭК), которая в совокупности представляют всю вариабельность, наблюдаемую ш νίνο среди иммуногенных эпитопов, и, в то же время, достаточно проста для анализа. Эта смесь представляет вариации, связанные с аминокислотными заменами, обнаруживаемыми в эпитопе. После иммунизации субъекта смесью пептидов индуцируется мощный ответ Т-хелперов и В-клеток, что приводит к высокому титру антител с увеличенным сродством к даже отдаленно родственным нативным белкам патогена. Кроме того, эти антитела могу нейтрализовать инфекционность дивергентных линий патогенов, на основе которых создан ГЭК.
Во-первых, настоящее изобретение относится к способу получения иммуногенных пептидных смесей, состоящему из следующих этапов: получение иммуногенных эпитопных последовательностей патогена, а именно иммуногенных эпитопных последовательностей, имеющих общий для всех регион и, как минимум, один вариабельный аминокислотный остаток, которым последовательности отличаются друг от друга; определение частоты, с которой различные аминокислоты обнаруживаются в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности; и синтез пептидной смеси, содержащей до примерно 100 различных пептидов, каждый из которых имеет общий для всех регион и содержит в вариабельной позиции аминокислоту, выбранную из ряда аминокислот, обнаруживаемых в качестве вариабельного остатка иммуногенной эпитопной последовательности с частотой выше пороговой от примерно 10 до примерно 30%.
Кроме того, настоящий изобретение относится к способу получения иммуногенных пептидных смесей, состоящему из следующих этапов: получение иммуногенных эпитопных последовательностей,
- 2 008143 имеющих общий для всех регион и, как минимум, один вариабельный аминокислотный остаток, которым последовательности отличаются друг от друга; определение частоты, с которой различные аминокислоты обнаруживаются в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности; округление частоты, с которой аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции, до ближайших 25%; и синтез пептидной смеси, содержащей до примерно 100 различных пептидов, каждый из которых имеет общий для всех регион и содержит в вариабельной позиции аминокислоту, выбранную из ряда аминокислот, наиболее часто обнаруживаемых в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности с округленной частотой, отличной от нуля; где в вариабельной позиции выбраны от двух до четырех различных аминокислот, каждая из которых представлена в пептидной смеси пропорционально своей округленной частоте.
Дополнительно к этому, настоящее изобретение относится к пептидной смеси, иммуногенной к патогену, а именно смеси, содержащей до примерно 100 различных пептидов, каждый из которых имеет общий для всех регион и несет вариабельную позицию; общий регион различных пептидов состоит из невариабельных аминокислот иммуногенной эпитопной последовательности патогена и соседствует с вариабельной позицией иммуногенной эпитопной последовательности; а вариабельная позиция занята аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из наиболее часто встречающихся в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности аминокислот, и при этом: (а) не более 4 различных аминокислот могут быть представлены в вариабельной позиции различных пептидной смеси; и (Ь) аминокислоты, представленные в вариабельной позиции различных пептидов, представлены в ней с частотой, большей, чем пороговая, от примерно 10 до примерно 30%.
Настоящее изобретение отличается от прежних подходов к получению иммуногенных композиций тем, что они [походы] были модифицированы с целью разработки способа, подходящего для получения вакцин, которые могли бы быть использованы для иммунизации людей, т. е. содержали бы ограниченное количество пептидов, оставаясь в то же время высоко представительными по отношению ко всей вариабельности, обнаруживаемой в нативных иммуногенных эпитопных последовательностях.
Настоящее изобретение обеспечивает простой способ получения иммуногенных композиций, состоящих из смеси пептидов, именуемой гипервариабельным эпитопным комплексом (ГЭК). Часть способа, относящаяся к синтезу пептидов, может быть осуществлена «в одну стадию» с использованием известных методик химического синтеза.
Несомненным преимуществом является то, что настоящее изобретение дает возможность получать различные ГЭК на основе различных вирусных эпитопов, которые синтезируют, используя способ настоящего изобретения так, чтобы получить большие наборы пептидов при минимуме стадий синтеза. Число различных получаемых пептидов контролируется таким образом, чтобы состав иммуногенной композиции мог быть предсказуем и мог быть проверен соответствующим аналитическим методом. ГЭК, изготовленный в соответствии с настоящим изобретением, способен вызывать широкую иммунореактивность к белкам, из которых получены пептиды.
Еще одним преимуществом является то, что после иммунизацией ГЭКом индуцированная широкая иммунореактивность к дивергентным линиям патогена приводит к повышению эффективности нейтрализацией инфекционности патогена.
ГЭК по настоящему изобретению способен преодолевать ограничения главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), который является обычным барьером для разработки вакцин, универсальных для всех рас и типов людей во всем мире. Кроме того, ГЭК может быть модифицирован для индукции клеточного (цитотоксического т-лимфоцитарного (ЦТЛ)) иммунного ответа. Помимо вакцин, ГЭК могут быть использованы в качестве основы для диагностических систем.
Другие аспекты и детали настоящего изобретения станут очевидными для специалистов по прочтении следующего ниже описания конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, включая сопровождающие текст рисунки.
Краткое описание чертежей
Далее будут описаны варианты реализации настоящего изобретения с помощью конкретных примеров и со ссылками на приложенные фигуры, где фиг. 1 представляет собой упрощенную схему синтеза ГЭК в соответствии с настоящим изобретением;
фиг. 2 представляет собой диаграмму способа получения пептидной смеси в соответствии с настоящим изобретением;
фиг. 3 демонстрирует аминокислоты, выбранные для синтеза пяти ГЭК на основе вируса иммунодефицита человека, тип I (ВИЧ-1), в соответствии с настоящим изобретением;
фиг. 4 демонстрирует, что иммунизация приматов (обезьян) ГЭК на основе ВИЧ-1 индуцирует ответ клеток Т-хелперов;
фиг. 5 демонстрирует высокий титр антител, индуцируемых у обезьян в результате иммунизации ГЭК 1-5 на основе ВИЧ-1;
фиг. 6 демонстрирует, что антитела, индуцируемые иммунизацией ГЭК на основе ВИЧ-1, связываются с эпитопами дивергентных линий ВИЧ-1;
- 3 008143 фиг. 7 демонстрирует, что антитела, полученные от обезьян, иммунизированных ГЭК 1-5 на основе ВИЧ-1, нейтрализуют инфекционность дивергентных линий ВИЧ-1 в лимфоцитах периферической крови (ЛПК) человека;
фиг. 8 демонстрирует, что антитела от серопозитивных пациентов, инфицированных дивергентными подтипами ВИЧ-1А, В, С, Ό, Е и Е, распознают ГЭК 1-5 на основе ВИЧ-1;
фиг. 9 представляет собой описание состава двух ГЭК на основе вируса гепатита С (ВГС);
фиг. 10 представляет собой описание состава четырех ГЭК на основе участков антигенной изменчивости, обнаруженных на гемагглютининовом оболочечном белке вируса гриппа А;
фиг. 11 демонстрирует ответ клеток Т-хелперов у мышей, иммунизированных ГЭК на основе вируса гриппа, описанных на фиг. 10;
фиг. 12 иллюстрирует иммунный ответ у мышей, иммунизированных ГЭК на основе вируса группа, описанных на фиг. 10, в сравнении с неродственными пептидами;
фиг. 13 иллюстрирует иммунный ответ у мышей линии Ва1Ь/с после иммунизации их ГЭК на основе ВИО. На этом чертеже показано, что у мышей линии Ва1Ь/с, которые неспособны формировать иммунный ответ к единичному эпитопу, происходящему от ВИО, в силу генотипа их главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), иммунизация ГЭК на основе того же эпитопа приводит к формированию иммунного ответа;
фиг. 14 демонстрирует связывание мышиных антител с ВИО. Приведенные данные показывают, что антитела, сформированные в результате иммунизации линии мышей, обычно не дающей иммунного ответа, ГЭК на основе ВИО, способны связывать вирус, на основе которого получен ГЭК;
фиг. 15 показывает, что конъюгация ГЭК с липидной частью позволяет индуцировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ);
фиг. 16 иллюстрирует состав пяти пептидных смесей, каждая из которых состоит из набора пептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Подробное описание изобретения
В общих чертах, настоящее изобретение представляет собой способ получения иммуногенной пептидной смеси или гипервариабельного эпитопного комплекса (ГЭК).
В одном из вариантов реализации способ получения иммуногенной пептидной смеси состоит из следующих стадий. Получают иммуногенные эпитопные последовательности, которые имеют общий регион из одинаковых аминокислотных остатков и, как минимум, один вариабельный остаток, которым последовательности отличались друг от друга. Определяют частоту, с которой различные аминокислоты обнаруживаются в вариабельной позиции. Затем синтезируют пептидную смесь, состоящую приблизительно из 100 различных пептидов, каждый из которых имеет регион из одинаковых аминокислотных остатков и в вариабельной позиции аминокислоту, выбранную из тех аминокислот, которые встречаются в вариабельной позиции иммуногенных эпитопных последовательностей с частотой выше пороговой от примерно 10 до примерно 30%, например 20%. В соответствии с этим вариантом реализации пептидная смесь содержит последовательности, имеющие в вариабельной позиции аминокислоту, выбранную из тех аминокислот, которые наиболее часто обнаруживаются в вариабельной позиции иммуногенных эпитопных последовательностей, с необязательным ограничением, чтобы не более 4 различных аминокислот использовались в вариабельной позиции различных пептидов в пептидной смеси.
В ходе получения пептидной смеси, пептиды могут быть синтезированы таким образом, что различные аминокислоты, обнаруживаемые в вариабельной позиции, присутствуют относительно друг друга пропорционально частоте, с которой каждая аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции иммуногенных эпитопных последовательностей.
Частота, с которой аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции, может быть округлена до ближайших 25%, и выбранными для включения в состав пептидов пептидной смеси могут быть только те аминокислоты, которые имеют не нулевую округленную частоту. В этом случае пептиды пептидной смеси могут иметь данную аминокислоту в вариабельной позиции с частотой, пропорциональной их округленной частоте.
Как вариант, частоты сходных аминокислот, обнаруживаемых в вариабельной позиции, могут быть объединены, и суммарная частота применена к наиболее часто встречаемой их сходных аминокислот при подсчете округленной частоты. В этом случае надо иметь в виду, что частоты сходных аминокислот, обнаруживаемых в вариабельной позиции, могут быть объединены только, если каждая их сходных аминокислот имеет частоту ниже пороговой. Частоты сходных аминокислот могут быть объединены, если при округлении частоты каждой из сходных аминокислот до ближайших 25%, не будет ни одной сходной аминокислоты, имеющей округленную частоту 25% или выше.
В соответствии с настоящим изобретением «сходные аминокислоты» выбирают из аминокислот, входящих в группы, состоящие из аминокислот, алифатических аминокислот, аминокислот с боковым гидроксилом на алифатической цепи, основных аминокислот, кислых аминокислот, амидосодержащих аминокислот и серосодержащих аминокислот.
В соответствии с настоящим изобретением стадия синтеза может быть проведена путем соединения аминокислот, где аминокислоты в вариабельной позиции присоединяются пропорционально их округ
- 4 008143 ленным частотам. Настоящее изобретение может также включать одну или более стадий, проводимых с использованием методологии биоинформатики. В различных вариантах иммуногенные эпитопные последовательности могут включать от 2 до 7 вариабельных аминокислотных остатков, что в результате приводит к содержанию в пептидной смеси от 2 до 64 различных пептидов.
Настоящее изобретение также включает способ получения иммуногенной пептидной смеси, состоящий из слегка отличающихся последовательностей стадий, описание которых следует ниже.
Получают иммуногенные эпитопные последовательности патогена, имеющие общие аминокислотные регионы и, как минимум, один вариабельный аминокислотный остаток, которым они отличаются друг от друга. Определяют частоту, с которой различные аминокислоты обнаруживаются в вариабельной позиции иммуногенных эпитопных последовательностей, и округляют ее до ближайших 25%. Затем синтезируют пептидную смесь, содержащую примерно до 100 различных пептидов, каждый из которых имеет общий регион аминокислотных остатков и в вариабельной позиции аминокислоту, выбранную из наиболее часто встречаемых в вариабельной позиции иммуногенных эпитопных последовательностей с округленной частотой, отличной от нуля. В соответствии с этим способом в вариабельной позиции может находиться от двух до четырех различных аминокислот, и каждый из этих вариантов представлен в пептидной смеси в количестве, пропорциональном его округленной частоте.
Этот способ может включать дополнительные стадии: объединения частот сходных аминокислот, имеющих округленные частоты менее 25%; применения объединенной частоты к наиболее часто встречаемой из сходных аминокислот; округления суммарной частоты до ближайших 25%; и для отличных от нуля округленных частот включения наиболее часто встречающихся из сходных аминокислот на стадию синтеза пептидной смеси.
Настоящее изобретение также включает пептидную смесь, иммуногенную по отношению к патогену. Смесь содержит до примерно 100 различных пептидов, каждый из которых имеет общий регион аминокислотных остатков. Общий регион различных пептидов образован невариабельными аминокислотами иммуногенных эпитопных последовательностей патогена, которые соседствуют с позицией вариабельного аминокислотного остатка иммуногенной эпитопной последовательности. Вариабельную позицию занимает аминокислота, выбранная из наиболее часто встречаемых аминокислот в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности, учитывая, что: (а) не более четырех различных аминокислот могут находиться в вариабельной позиции различных пептидов пептидной смеси; и (Ь) аминокислота, находящаяся в вариабельной позиции различных пептидов, обнаруживается в вариабельной позиции иммуногенных эпитопных последовательностей с частотой выше пороговой частоты от примерно 10 до примерно 30%. Частота, с которой аминокислота должна проявляться в вариабельной позиции, может быть определена по следующей схеме: частоту, с которой аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности, округляют до ближайших 25%, и аминокислоты, имеющие округленную частоту, равную нулю, должны встречаться в вариабельную позицию различных пептидов пропорционально округленной частоте.
Частота, с которой сходные аминокислоты, имеющие округленную частоту в вариабельной позиции менее 25%, может быть определена объединением частот сходных аминокислот и округлением суммарной величины до ближайших 25%. Для округленных частот, не равных нулю, округленная частота применяется к наиболее часто встречающейся из сходных аминокислот. В соответствии с данным вариантом реализации изобретения, наиболее часто встречающаяся из сходных аминокислот находится в вариабельной позиции различных пептидов с частотой, пропорциональной округленной частоте.
В соответствии с настоящим изобретением может быть сформирована конъюгированная пептидная композиция, состоящая из пептидной смеси настоящего изобретения, конъюгированной с липидной частью или конъюгированной с белковой частью в качестве носителя. Иммуногенная композиция настоящего изобретения может содержать множество пептидных смесей, сформированных в соответствии со способом настоящего изобретения, где каждая из пептидных смесей является иммуногенной к одному и тому же патогену. Как вариант иммуногенные композиции в соответствии с настоящим изобретением могут включать множественные пептидные смеси к различным иммуногенным эпитопам одного и того же патогена, а различные иммуногенные эпитопы могут быть обнаружены в непосредственной близости друг от друга на поверхности патогена.
В соответствии с настоящим изобретением может быть получена вакцина, вызывающая иммунный ответ к патогену. Вакцина содержит пептидную смесь настоящего изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Таким образом, способ вакцинирования против заболевания, вызываемого патогеном, в соответствии с настоящим изобретением, состоит из стадии назначения субъекту эффективного количества такой вакцины.
Способ диагностики инфекции, вызываемой патогеном, также включен в рамки настоящего изобретения. Способ включает следующие стадии: получения биологических образцов, содержащих антитела, полученные от субъекта; соединения биологического образца с иммуногенной пептидной смесью, в соответствии с настоящим изобретением, на основе иммуногенной эпитопной последовательности патогена; и оценки иммунного ответа образца к пептидной смеси. Диагностический набор для определения инфекции, вызываемой патогеном, может содержать иммуногенную пептидную смесь, в соответствии с
- 5 008143 настоящим изобретением, на основе иммуногенной эпитопной последовательности патогена, вместе с указаниями для оценки иммунного ответа биологического образца субъекта, содержащего антитела, к иммуногенной пептидной смеси.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ выделения антител, иммунных к патогену, состоящий из следующих стадий: назначения субъекту пептидной смеси, в соответствии с настоящим изобретением; и получения от субъекта антитела или части антитела, реактивного в отношении патогена, где упомянутое антитело индуцировано назначением пептидной смеси.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения может быть реализован способ выделения гена, кодирующего антитело, иммунное к патогену. Способ включает следующие стадии: назначение субъекту пептидной смеси, в соответствии с настоящим изобретением; получение от субъекта антитела, индуцированного назначением пептидной смеси; выделение гена, кодирующего антитело. Подобным образом, в соответствии с настоящим изобретением может быть реализован способ выделения части гена или генетического материала, кодирующего антитело, иммунное к патогену, включающий следующие стадии: назначение субъекту пептидной смеси в соответствии с настоящим изобретением; получение от субъекта антитела, индуцированного назначением пептидной смеси; выделение части гена или генетического материала, кодирующего антитело. Таким образом, против патогена может быть разработана иммунотерапия, включающая назначение пептида или белка, кодируемого частью гена или генетическим материалом, полученным в соответствии с настоящим изобретением.
Способ получения иммуногенной смеси, в соответствии с настоящим изобретением, начинается с исчерпывающего изучения встречающихся в природе последовательностей данного патогена, которые опубликованы в научных базах данных или соответствующих научных журналах. Это позволит уменьшить число различных пептидов, продуцируемых в ходе синтеза. Сама добавляемая аминокислота(ы) и тот момент реакции пептидного синтеза, на котором она (они) добавлена, определяются априори в соответствии с этапами используемого способа синтеза, после первого сравнения последовательностей, охватывающих известные эпитопы нейтрализации клеток Т-хелперов и В-клеток. Получаемая смесь пептидов, именуемая гипервариабельным эпитопным комплексом (ГЭК), представляет вариации эпитопной последовательности, полученные в одном пептидном синтезе добавлением статистического набора аминокислот для присоединения их к уже связанным аминокислотам растущей пептидной цепи. Таким образом, в отличие от мимотопов, пептиды, входящие в состав ГЭК, не являются беспорядочно синтезированными, а представляют интересующий эпитоп антигена. По этой причине нет необходимости использовать сыворотку инфицированных животных или пациентов для выделения интересующих эпитопов. ГЭК может быть оттестирован на реактивность против сыворотки, взятой от инфицированного патогеном субъекта, с целью контроля качества, чтобы убедиться, что реакция синтеза пептидов проистекает правильным образом. Однако сыворотка пациента не используется для выделения индивидуальных пептидов, входящих в состав ГЭК, что является фундаментальным отличием от ранее известного мимотопного подхода.
Настоящее изобретение представляет простой способ, который был разработан для оценки эпитопной вариабельности. В ходе твердофазного синтеза пептидов аминокислоту пришивают или присоединяют к гранулам смолы на каждом цикле с образованием растущей пептидной цепи. Пропорция аминокислоты, добавляемой в определенном цикле, подсчитывается, в соответствии с настоящим изобретением, базируясь на частоте, с которой эта аминокислота обнаруживается на данной позиции в эпитопе. Эта информация основывается на данных о последовательности, получаемых непосредственно в лабораториях при сиквенировании, или из баз данных ίη νίνο последовательностей, и/или из соответствующей научной литературы. Иммуногенные пептидные смеси настоящего изобретения, именуемые ГЭК, содержат смесь пептидов, представляющих варианты аминокислотных замен, обнаруживаемых в белковом эпитопе.
Схема способа получения ГЭК показана на фиг. 1. Вкратце, на этапе 1 получают последовательность иммуногенного эпитопа патогена. Эпитоп имеет, как минимум, один вариабельный аминокислотный остаток, представленный различными аминокислотами в различных известных последовательностях. На этапе 2 определяют частоту, с которой каждая из этих аминокислот обнаруживается в вариабельной позиции эпитопной последовательности, и сравнивают ее с ранее установленной пороговой частотой. Пороговая частота устанавливается таким образом, что аминокислоты, представленные относительно малыми количествами в эпитопной последовательности, окажутся ниже порога и, таким образом, не будут представлены в результирующей пептидной смеси. Те аминокислоты, которые отвечают условию пороговой частоты, являются кандидатами на встраивание в вариабельную позицию в ходе пептидного синтеза на этапе 3. Те аминокислоты, которые представлены в количествах ниже пороговой частоты, не используются в ходе белкового синтеза для встраивания в вариабельную позицию. Наконец, каким бы конкретным путем ни проходит пептидный синтез, аминокислоты, преодолевшие пороговую частоту, добавляют в количестве, пропорциональном частоте, с которой они обнаруживаются в иммуногенных эпитопах. Пороговая частота может быть в диапазоне от 10 до 30%, а получаемая в результате синтетическая пептидная смесь не должна быть сложнее, чем примерно 100 различных последовательностей.
- 6 008143
Альтернативная схема способа получения ГЭК показана на фиг. 2. В кратком изложении, на этапе 1 белковые последовательности, выделенные из данного патогена ίη νίνο, находят в соответствующем источнике, таком как база данных или научные журналы. Найденные белковые последовательности сравнивают, особенно участки последовательности, содержащие иммуногенные эпитопы нейтрализации Вклеток, ЦТЛ или хелперов, если таковые существуют. Следует иметь в виду, что нет необходимости идентифицировать специфические иммуногенные эпитопы нейтрализации В-клеток, ЦТЛ или хелперов в данной белковой последовательности, используемой в настоящем изобретении. Хотя эпитоп и представляет регион белковой молекулы, который был выбран в качестве мишени некими механизмами иммунной системы, нет необходимости идентифицировать сам механизм, с помощью которого иммунная система действует на эпитоп, используемый в рамках настоящего изобретения.
На этапе 2 определяют частоту, с которой аминокислота обнаруживается в каждой позиции в пределах интересующего эпитопа. Для тех позиций, в которых обнаруживается более одной аминокислоты, аминокислоты включаются в пептидную смесь, в соответствии с набором указаний, определяемых на этапах с 3 по 6. А именно, для каждой аминокислоты, обнаруживаемой в вариабельной позиции (этап 3) частоты округляются до ближайших 25%. Например, частота 12% округляется вниз до 0%, тогда как частота 13% округляется вверх до 25%.
На этапе 4 для сходных аминокислот, представленных в вариабельной позиции, но имеющих округленную частоту менее 25%, частоты объединяются, и суммарная частота присваивается наиболее часто встречающейся из сходных аминокислот. Эта величина затем округляется до ближайших 25%.
Под сходными аминокислотами подразумеваются те, которые имеют сходные химические структуры или свойства, что делает их консервативно взаимозаменяемыми. Примерами таких сходных аминокислот являются алифатические аминокислоты (Гли, Ала, Вал, Лей, Иле и Про), аминокислоты, содержащие боковые алифатические цепи с гидроксилом (Сер, Тре), серосодержащие аминокислоты (Цис, Мет), ароматические аминокислоты (Фен, Тир и Три), основные аминокислоты (Лиз, Арг и Гис), кислые аминокислоты (Асп, Глу) и амидосодержащие аминокислоты (Асн, Глн).
В качестве примера для этого этапа, если метионин представлен частотой 10%, а цистеин - частотой 8%, то частота каждой из этих аминокислот по отдельности не может быть округлена до 25%. Однако поскольку метионин и цистеин являются сходными аминокислотами (обе серосодержащие), их частоты складываются с получением суммарных 18%, которые округляются до 25%, и эта частота присваивается метионину, который обнаруживается в вариабельной позиции чаще цистеина.
На этапе 5 аминокислоты, обнаруживаемые в вариабельной позиции и имеющие не нулевую округленную частоту (например, частоту 25, 50, 75 или 100%), добавляются в ходе пептидного синтеза в количествах, пропорциональных их округленной частоте. Если сумма округленных частот оказывается менее 100%, то она используется в качестве делителя, на который делят каждую округленную частоту с целью определения пропорции, в которой аминокислота будет добавляться в вариабельную позицию. Например, если первая аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции с частотой 60%, а вторая аминокислота - с частотой 30%, никакие другие аминокислоты или объединенные комбинации аминокислот не могут иметь не нулевую округленную частоту. Итак, первая аминокислота округляется вниз до 50%, а вторая аминокислота - вниз до 25%. Поскольку сумма первой и второй округленных частот составляет только 75%, пропорция каждой аминокислоты для добавления в ходе синтеза может быть определена делением каждой округленной частоты на суммарную частоту 75%. Таким образом, первая аминокислота будет добавлена в количестве 50%, деленных на 75% (или 66,7%), а вторая аминокислота будет добавлена в количестве 25%, деленных на 75% (или 33,3%).
Этап 4 также подразумевает условие, что не более 4 аминокислот могут быть выбраны для добавления в вариабельную позицию. В случае, например, когда 5 различных аминокислот обнаруживаются в вариабельной позиции с приблизительно равной частотой 20%, каждая аминокислота будет иметь округленную частоту 25%. Таким образом, сумма не равных нулю округленных частот будет равна 125%. Однако, поскольку максимум 4 аминокислоты может быть добавлено на этом этапе, из пяти различных аминокислот следует выбрать 4, наиболее часто обнаруживаемых, и тогда суммарная неокругленная частота будет равна 100%. В этом случае каждая из 4 наиболее часто встречающихся аминокислот будет добавлена в эту вариабельную позицию в количестве 25%.
На этапе 6 синтезируют пептидную смесь, включающую аминокислоты, выбранные на этапе 5. Данный этап может быть проведен, используя любой приемлемый способ пептидного синтеза, который позволяет избирательное размещение аминокислот в конкретной позиции. Могут быть использованы известные способы пептидного синтеза, такие как Етос-химия. Данный этап подразумевает условие, что в составе смеси может быть не более 100 различных пептидов. Подсчет числа различных пептидов, которые будут содержаться в смеси, производится следующим образом.
Для каждой вариабельной позиции в пептиде определяют число различных аминокислот, которые могут быть добавлены. Эти числа умножают друг на друга с получением возможного числа различных пептидов, синтезируемых на этапе 6.
Например, необходимо синтезировать 11-мерный пептид с тремя вариабельными позициями. В первую из трех вариабельных позиций следует добавить 4 различных аминокислоты, тогда как в остав
- 7 008143 шиеся 2 вариабельные позиции следует добавить только по две аминокислоты. Общее возможное число различных пептидов подсчитывается как 4x2x2=16. Для невариабельных позиций (оставшиеся 8 аминокислот 11-мерного пептида), может быть использована только одна аминокислота. Таким образом, через невариабельные позиции не вносится дополнительная вариабельность.
В качестве еще одного примера этапа 6 служит пептидная смесь на основе 16-мерного эпитопа, имеющего 6 вариабельных и 10 невариабельных позиций. Для каждой из вариабельных позиций выбрано по 2 аминокислоты. Общее возможное число различных пептидов, образуемых на этапе 6, подсчитывается как 2х2х2х2х2х2 (или 26)=64.
На этапе 7, пептидную смесь, образованную на этапе 6, очищают в соответствии с любым приемлемым способом. Например, для того, чтобы убедиться в чистоте полученных пептидов, можно провести лиофилизацию и диализ необходимое число раз. Также можно использовать гель-фильтрацию или другие способы разделения пептидов.
Этап 8 представляет собой подтверждение состава пептидной смеси. Это этап контроля качества, который может быть важен, когда работают с новой пептидной смесью, для которой не разработана методика очистки. Этот этап может быть необязательным, если вся процедура хорошо проработана для этой конкретной иммуногенной пептидной смеси. Чтобы убедиться в том, что ГЭК содержит именно ожидаемые аминокислоты, можно использовать аминокислотный анализ. Кроме того, для подтверждения того, что ГЭК содержит пептиды в ожидаемом диапазоне молекулярных весов, можно использовать электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-электрофорез) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).
На этапе 9 подтверждают иммуногенность пептидной смеси. Опять же, этот этап полезен, если данный ГЭК формируется впервые. Когда иммуногенность данного ГЭК уже известна, нет необходимости снова подтверждать его эффективность при каждом новом синтезе. Для тестирования на иммуногенность очищенный ГЭК смешивают с соответствующим фармацевтическим носителем и адъювантом, одобренным для применения на людях. Такой состав может быть введен мышам и/или макакам-резусам для подтверждения иммуногенности, или для идентификации конкретной иммуногенной композиции ГЭК, если были получены различные варианты ГЭК. В этом случае может быть желательным получение сыворотки от патоген-инфицированного субъекта, которую затем тестируют на реактивность против ГЭК, чтобы убедиться в его антигенной активности.
В целом, концепция способа получения ГЭК основана на том принципе, что в изолятах ίη νίνο данного патогена существует множество различных белков, которым соответствуют иммуногенные эпитопы (например, которые активизируют Т-хелперы, ЦТЛ и/или формирование антител). Их последовательности могут быть получены из соответствующих баз данных или научных публикаций и затем подвергнуты сравнению. При этом идентифицируют вариабельные аминокислоты в вариабельных позициях и определяют все аминокислоты, обнаруживаемые в каждой вариабельной позиции. Из возможных двадцати природных аминокислот, вариабельную позицию занимают только несколько аминокислот.
В соответствии с одним из вариантов реализаций настоящего изобретения, использующим твердофазный синтез пептидов и Ртос-химию, аминокислоты, которые должны быть добавлены на данной стадии пептидного синтеза, определяются в соответствии со следующими правилами: 1) смесь не более чем четырех аминокислот может быть использована на любой стадии связывания в ходе синтеза, 2) количество каждой аминокислоты, используемое на любой стадии связывания, определяется на основе частоты, с которой каждая аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции, округленной до ближайших 25%, 3) если две или более аминокислоты с частотами менее 25% обнаруживаются в данной позиции и являются сходными по их химической структуре или свойствам, то частоты этих аминокислот суммируют, округляют до ближайших 25% и добавляют только ту аминокислоту, которая обнаруживается с наибольшей частотой среди этих аминокислот, и 4) математический подсчет предсказывает, что в такой смеси будет содержаться не более 100 различных вариантов эпитопа.
В каждой вариабельной позиции вводимая аминокислота присоединяется к предыдущей аминокислоте растущей пептидной цепи после добавления статистической смеси аминокислот. Их пропорции устанавливают путем изучения известных последовательностей, существующих ίη νίνο. Таким образом, одна процедура синтеза дает полный набор вариаций эпитопа. Чтобы удостовериться, что такой коктейль пептидов в ГЭК действительно представляет все варианты, можно провести аминокислотное сиквенирование набора пептидов и убедиться, что соответствующие аминокислоты действительно присутствуют.
Кроме использования при вакцинации против заболеваний, ГЭК, сформированные на базе гипервариабельных эпитопов данного патогена, могут также быть использованы в диагностике инфекции у субъектов, несущих патоген, который сложно детектировать с помощью обычных серологических подходов. Это, например, проявляется в случаях, когда нет универсального антигена, который бы распознавался антисывороткой от любого инфицированного субъекта, независимо от линии патогена, которой субъект был инфицирован.
Настоящее изобретение может также быть использовано для получения композиции (или вакцины), которая, когда используется для иммунизации субъекта, такого как человек, примат или другие живот
- 8 008143 ные, индуцирует образование защитных антител. После идентификации и выделения генов, которые кодируют эти антитела, гены и генные продукты могут быть в свою очередь использованы как терапевтические средства для лечения организмов, инфицированных патогеном, на основе которого была создана данная композиция.
ГЭК может включать различные иммуномодулирующие агенты с тем, чтобы вызвать ответ различных эффекторов иммунной системы, таких как ЦТЛ или иммунный ответ слизистой оболочки.
Настоящее изобретение относится к способу получения ГЭК, которые представляют наблюдаемые ίη νίνο варианты последовательности белкового эпитопа. В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения, белковую последовательность изолятов патогена ίη νίνο находят в научной литературе или базах данных. Найденные последовательности сравнивают, особенно по регионам, относящимся к белкам, содержащим иммуногенные эпитопы. Подсчитывают частоты, с которыми аминокислоты обнаруживаются в каждой позиции интересующего эпитопа, и только те аминокислоты, чья частота выше пороговой, включаются в смесь. Пороговая частота обычно представлена величиной от примерно 10 до примерно 30. Независимо от числа аминокислот, определенных, как имеющие частоту выше пороговой, не более четырех различных аминокислот используют на любом этапе присоединения в ходе синтеза.
Частоты аминокислот, которые должны быть добавлены на данном этапе присоединения аминокислоты, могут быть округлены или использованы как есть. Округление частот может быть произведено например до ближайших 5, 10 или 25% для облегчения расчетов. Если две или более аминокислоты обнаруживаются в данной позиции с частотами менее 25% и являются сходными по их химической структуре или свойствам, то частоты этих аминокислот могут быть объединены и, при необходимости, округлены. В этом случае добавлена будет только та аминокислота, которая обнаруживается с наибольшей частотой среди тех, чьи частоты были объединены, в пропорции, соответствующей объединенной частоте. Получаемая в этих условиях пептидная смесь, согласно подсчетам, будет содержать не более ста вариантов пептидов.
Синтез смеси может быть проведен включением на каждом этапе связывания аминокислоты набора аминокислот в пропорциях, отражающих частоты (или округленные частоты) выше пороговой частоты. Таким путем смесь пептидов формируется в ходе одного синтеза. Для контроля состава, антигенности и иммуногенности смесь может быть проанализирована. Такая смесь способна к индукции широкой иммунореактивности к белкам, на основе которых были получены пептиды, и каждый пептид в смеси имеет последовательность, соответствующую варианту аминокислотной замены в эпитопе, послужившем основой для пептидной смеси.
Пептидная смесь, в соответствии с настоящим изобретением, может быть сформирована с применением внутренних поперечных сшивок между пептидами. Как альтернативный вариант пептиды смеси могут быть пришиты к опорному полимеру, который может быть либо синтетическим, либо природным полимерным материалом, таким как белок-носитель. Примером белка-носителя может служить тот белок, на основе которого была получена пептидная смесь. Преимущества применения поперечных сшивок между пептидами или сшивки пептидов смеси с опорным полимером-подложкой заключены в том, что таким образом пептидная смесь привлекает особое внимание иммунной системы, тем самым, повышая свою иммуногенность. Такой подход также имеет преимущества в случаях, когда пептидная смесь недостаточно иммуногенна сама по себе, тогда как конъюгация или поперечные сшивки могут поднять иммуногенность до эффективного уровня. Для образования поперечных сшивок или конъюгации пептидов с носителем могут быть использованы стандартные способы, известные специалистам.
Диагностический набор в соответствии с настоящим изобретением содержит эффективное количество ГЭК, обладающего иммунореактивностью к антителам из организма, инфицированного патогеном, на основе которого получен ГЭК. Каждый пептид в пептидной смеси имеет последовательность, соответствующую варианту аминокислотных замен в иммуногенном эпитопе белка, происходящего от патогена.
Терапевтическая иммуногенная композиция может быть приготовлена в соответствии с настоящим изобретением получением ГЭК, иммунизацией этим ГЭК животного, такого как примат, и выделением антител и генов, кодирующих эти антитела, индуцированные иммунизацией с помощью ГЭК. Такая иммуногенная композиция или генетический материал, кодирующий антитела, индуцированные иммунизацией, могут быть назначены субъекту.
Белковым эпитопом для использования в рамках настоящего изобретения может быть эпитоп белка, происходящего от вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2 (ВИЧ-1/2), от вируса гриппа, папилломавируса человека (ПВЧ), возбудителей малярии, тропической лихорадки или трипаносомоза. Могут быть также использованы эпитопы, происходящие и от других патогенов.
ГЭК или смесь пептидов может быть сформирована в суспензию с любым фармацевтически приемлемым носителем. Например, ГЭК может быть суспендирован в солевом растворе. Кроме того, ГЭК может быть смешан с адъювантом.
Настоящее изобретение относится и к вакцинам, которые могут содержать два или более ГЭК, созданных на основе одного или более белков, происходящих от одного патогена и несущих один или более
- 9 008143 эпитопов, от которых и происходит упомянутая пептидная смесь. Количества разных ГЭК могут быть эквимолярными. Упомянутые пептидные смеси в эквимолярных количествах могут нести внутренние поперечные сшивки или быть пришитыми к опорному полимеру.
Частота аминокислоты, добавляемой в данной позиции в упомянутую пептидную смесь, определяется только частотой встречаемости аминокислот в этой единственной позиции, но не структурой или длиной белковой последовательности или изолятов. Например, если существует 10 последовательностей эпитопов, которые значительно отличаются по длине, единственным критерием для определения частоты аминокислот, добавляемых в данной позиции в упомянутую пептидную смесь, является общее число аминокислот, обнаруживаемых в данной позиции в эпитопе, от которого происходит пептидная смесь. Если, при сравнивании последовательностей, независимо от длины каждой из 10 последовательностей, во второй позиции всех десяти последовательностей находится одна и та же аминокислота, то при синтезе пептидной смеси будет использовано 100% именно этой аминокислоты.
Если частоты округляются до ближайших 25% (или до 5, 10% или другой выбранной величины), то должно соблюдаться известное специалистам условие, заключающееся в том, что любая величина, находящаяся точно посредине между двумя указанными целыми числами, будет округляться вверх до следующего большего целого числа, тогда как любая величина менее, чем срединная, будет округляться вниз до меньшего целого числа. Например, аминокислота, которая обнаруживается в третьей позиции белкового эпитопа в 30% всех сравниваемых последовательностей этого эпитопа, будет иметь округленную частоту 25% для данной позиции. Если, однако, аминокислота присутствует в 38% всех сравниваемых последовательностей данного эпитопа, то она будет содержаться в пептидной смеси с частотой 50% в данной позиции. Аминокислота, обнаруживаемая с частотой 12% при округлении до ближайших 25%, будет округлена до 0% и, таким образом, не будет включена в смесь в отсутствие других сходных аминокислот, с чьей частотой частота 12% могла бы быть объединена.
Хотя в качестве примеров здесь приводятся ГЭК, разработанные специфически для потенциального использования против ВИЧ-1, вируса гепатита С и вируса гриппа, настоящее изобретение может быть также использовано для вакцинации против заболеваний, вызываемых любыми другими патогенами человека и животных, имеющие эпитопные вариации. Настоящее изобретение особенно полезно для использования против тех патогенов, диагностика и защита от которых сложна в силу значительных эпитопных вариаций. В их число включаются, но не ограничиваются ими, ВИЧ-2, ПВЧ, возбудители малярии, тропической лихорадки и трипаносомоза.
Описанные выше варианты реализации настоящего изобретения следует рассматривать только как примеры. В частных случаях реализации опытные специалисты могут осуществить также изменения, модификации и варианты, не выходя за рамки настоящего изобретения, которые определены формулой изобретения, приведенной ниже.
Общая методология
Описанные ниже методики были использованы как в настоящем изобретении, так и в конкретных примерах, приведенных далее.
Пептидный синтез
Синтез пептидных смесей проводят с помощью 9-фторэтилметоксикарбонильной методики (Ртосхимия) с применением смолы Кнорра высокой (0,7 ммоль/г) емкости с поперечными сшивками 1% дивинилбензолом. Смолу нейтрализуют двукратным добавлением 50% (объем/объем) раствора пиперидина в Ν',Ν'-диметилформамиде (ДМФ). Затем смолу последовательно промывают ДМФ и метанолом. Добавляли соответствующие молярные количества аминокислот, на основе их частот в данной позиции. Связывание происходит в течение 2 ч при комнатной температуре. Смолу снова промывают ДМФ и метанолом. Вслед за подтверждением связывания смолу промывают ДМФ и снимают защиту смесью 50% пиперидин:ДМФ в течение 9 мин. После связывания последней аминокислоты смолу промывают ДМФ и метанолом. Пептидные смеси отделяют и снимают защиту добавлением к смоле раствора состава: 90% трифторуксусной кислоты (ТФК), 5% 1,2-этандитиола (ЭДТ), 5% воды. Смолу инкубируют при комнатной температуре 6-12 ч. Затем смолу промывают ТФК и метанолом. Смыв ТФК собирают, как содержащий пептиды.
Пептидные смеси экстрагируют холодным эфиром. Объем растворов пептид/ТФК доводят до малого (приблизительно 1 мл) объема выпариванием в атмосфере азота. К раствору пептида добавляют эфир (25 объемов) и перемешивали. После инкубации в течение 5 мин на сухом льду, образец центрифугируют при 1000 д в течение 5 мин и удаляют эфир. Процедуру экстракции повторяют трижды. Затем раствор пептидной смеси последовательно трижды экстрагируют смесью этилацетат:эфир (1,5:1 объем/объем) тем же образом, что и при экстракции эфиром. После финальной эфирной экстракции остаточный эфир удаляют выпариванием в атмосфере азота, пептидную смесь ресуспендируют в воде и лиофилизируют. Конъюгация ГЭК с белком-носителем
После синтеза некоторые ГЭК могут быть конъюгированы с белком-носителем для увеличения их иммуногенности. Если так, то используется соотношение 100 молей ГЭК:1 моль белка-носителя (пептиды:носитель). Как белок, так и ГЭК растворяют в 0,5 М Ν-метилимидазоле, рН 6,0 в концентрации 1 мг/мл. Растворы белка и ГЭК объединяют и добавляют по 50 молей 1-этил-3
- 10 008143 (диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК) на каждый моль объединенного раствора ГЭК/белок. Смесь перемешивают 30 мин при 20°С и затем тщательно диализуют (до 10 кДа) против 5% буферного раствора уксусной кислоты. После последующего диализа против бидистиллированной воды, вакцину лиофилизируют и хранят под вакуумом при 20°С.
Иммунизация животных
Мышей получают из 1аск§оп ЬаЬога1опе8 (Ваг НагЬог, МЕ). Мышей иммунизируют 100 мкг пептида одной последовательности (ПОП) или ГЭК, когда используют конъюгацию с КЬН или 200 мкг, когда иммунизируют пептидами без носителя. Для последующего использования иммуноген растворяют в стерильном буфере РВ8 (фосфатно-солевом буферном растворе). Первичную иммунизацию назначают подкожно в основание хвоста, повторную иммунизацию назначают также две недели спустя.
Макак-резусов дважды иммунизируют ГЭК или комплексом ГЭК/белок-носитель. Для каждой иммунизации каждая обезьяна получают 500 мкг ГЭК или комплекса ГЭК/белок-носитель, растворенного в 250 мкл буфера РВ8 и 250 мкл Моп1апйе 18А-51. После тщательного встряхивания, полученную эмульсию инъецируют внутримышечно в дельтовидную мышцу. Через 8 недель после начальной иммунизации проводят бустерную.
Анализ (тест) ЕЬ18А
Тестирование на ответ к данному ГЭК проводят с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЬ18А), используя стандартную методику. Вкратце, ГЭК, пептиды или белки растворяют в 0,05М натрийбикарбонатном буфере, рН 9,5 и вносят в лунки микротитровальных планшетов с плоским дном (Согшпд, ΝΥ). Вирус вносят по 500 нг на лунку, а пептиды и белки по 1 мкг на лунку. После инкубации с тестовой сывороткой антигенсвязывающие первичные антитела детектируют с помощью вторичных антител, меченых щелочной фосфатазой (антимышь или антиобезьяна) (ЕЬНег. РШьЬигдЕ, РА). Оптическую плотность измеряют при 405 нм, используя автоматический планшетный ридер (ВюКай 3550).
Нейтрализация вирусной инфекционности
Исходные вирусы наращивают на клетках СЕМх174, полученных из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, КоскуШе, МО). Изоляты ВИЧ-1 получены из репозитория ΝΙΑΙΌ Национального Института Здоровья. Клетки из этой линии используют для определения титров вируса, а также для проверки инфекционности вируса в процессе нейтрализации. Образцы сыворотки подвергают серийному разведению (от 1:20 до 1:2560) и вносят в трех параллелях в 96-луночные планшеты. В качестве положительного контроля используют инактивированную теплом сыворотку ВИЧ-1 нейтрализующих антител, полученных из репозитория ΝΙΗ. Отрицательный контроль включает сыворотку простых обезьян и преиммунизационную сыворотку всех тестовых животных. Вирус добавляют на уровне 50 ИДТК50 (50% инфекционной дозы для тканевой культуры), затем планшеты инкубируют в течение 1 ч. После инкубации в контрольные лунки (только клетки) и в лунки, содержащие вирус/антитела, добавляют клетки СЕМх174 в концентрации 1х105 клеток на лунку. Планшеты инкубируют при 37°С в СО2-инкубаторе и ежедневно проверяют образование соклетий. Нейтрализационную способность сыворотки оценивают тестированием активности обратной транскриптазы (ОТ) в пробе надосадочной жидкости (супернатанта) на 8-й день, и на 10-й день клетки подвергают действию ХТТ - 2,3-бис[2-метокси-4-нитро-5сульфофенил]-2Н-тетразол-5-карбоксанилида (81дта, 81. Ьошк, МО) для определения жизнеспособности. Преиммунная сыворотка не вызывает снижение активности ОТ. Наибольшее разведение сыворотки, вызывающей подавление активности ОТ более чем на 50%, определяют как сильно нейтрализующий титр антител. 30-50% подавление активности ОТ, полученное наибольшим разведением сыворотки, рассматривается как слабый нейтрализующий титр.
Ответ Т-клеточной пролиферации
Антигены и митоген (РНА-Р, 81дта СЕетюа1 Со., 81. Ьоцщ, МО) вносят в концентрации от 1 до 10 мкг на лунку в трех параллелях в 96-луночный планшет с круглыми донышками. Цельную кровь, полученную от иммунизированных обезьян, разводят 1:2 буфером РВ8, наслаивают на градиент Исо11 (Ь8М, Огдапоп Текпка Согр., ОцгЕат, ΝΟ) и центрифугируют при 200 д в течение 30 мин при комнатной температуре. Лимфоциты собирают, промывают, подсчитывают и доводят до концентрации 1х106 жизнеспособных клеток на 1 мл средой КРМ1-1640, содержащей 10% ЕС8, Ь-глутамин и антибиотики. В каждую антигенсодержащую лунку 96-луночного планшета (планшетов) добавляют по 0,1 мл лимфоцитарной суспензии. Планшеты инкубируют при 37°С и 5% СО2. После инкубации с митогеном в течение 3 дней или с антигеном в течение 6 дней, добавляют 1 мкКюри 3Н-тимидина на 16-18 ч, после чего немедленно собирают на стекловолоконный фильтр с помощью сборника клеток \Уа11ас™. После добавления водной сцинтилляционной жидкости (8с1п118аРе, ЕЬНег 8с1еп(1Пс), определяют включение 3Н-тимидина путем измерения радиоактивности в жидкостно-сцинтилляционном счетчике ЬКВ \Уа11ас 1209 КаскЬе!а™. Результаты выражают в виде усредненного коэффициента стимуляции (КС) и рассчитывают как среднее число импульсов в минуту (СИМ) в экспериментальных лунках (антиген или митоген) в сравнении со средним числом импульсов в минуту в контрольных лунках (только клетки). Усредненная величина КС, превышающая 2, рассматривается как значительная.
- 11 008143
Процедура ЦТ Л
Спленоциты суспендируют в среде для тканевых культур ΚΡΜΙ-1640. Для специфической рестимуляции 3x107 отвечающих клеток культивируют совместно с 1,5x106 сингенных, антигенстимулированных спленоцитов (облученные 20000 рад) в течение 5 дней в 10 мл среды в вертикальных на 25 мл сосудах для тканевых культур во влажной атмосфере СО2 при 37°С. Для неспецифической рестимуляции отвечающие клетки культивировали в течение ночи в среде, содержащей интерлейкин 2 (ΙΓ2) в концентрации 10 ед/мл. Антиген-специфически и антиген-неспецифически стимулированные спленоциты собирают после 5 дней культивирования и промывают средой дважды; они служат в качестве эффектронных клеток. Специфическую цитолитическую активность эффекторов тестируют, используя разведение эффекторных клеток мечеными 51 Ст целевыми клетками (сингенные спленоциты, стимулированные антигеном в течение 4 ч) в количестве 2x103 в 200 мкл среды в 96-луночном круглыми донышками. Собирают 100 мкл супернатанта и считывают в гамма-счетчике. Удельный лизис рассчитывают следующим образом:
(экспериментальный выход - спонтанный выход) χ Ю0 (общий выход - спонтанный выход)
Спонтанный выход представлен величиной, полученной от целевых клеток без добавления эффекторных клеток, тогда как общий выход определяют после лизиса меченых целевых клеток раствором детергента.
Примеры
Пример 1. ГЭК на основе ВИЧ-1.
Эпитопные белковые последовательности получают из базы данных ретровирусов человека и СПИД (Гоз А1ашо8, 1998 г). На основе данных по последовательностям, пять регионов оболочечного гликопротеина ВИЧ-1 (§р120) определяют как гипервариабельные зоны. Эти пять гипервариабельных регионов включали эпитопы, нейтрализующие антитела, ЦТ Л и/или клетки Т-хелперы (Н1У Мо1еси1аг 1штипо1о§у Эа1аЬазе, 1998).
Возможные аминокислоты для каждой позиции нейтрализующего эпитопа определяют исходя из информации о последовательностях изолятов ВИЧ-1 линий С1абе В ΐη νΐνο путем сравнивания и оценки последовательностей. Как следствие, некоторые этапы связывания аминокислот в синтезе нейтрализирующего эпитопа выполняют с включением смеси соответствующих аминокислот, так как это определяется при оценке последовательностей. Этот подход применяют на каждом этапе связывания аминокислоты в ходе синтеза. Таким образом, в одном синтезе получают смесь пептидов, представляющую все наблюдаемые ΐη νΐνο варианты нейтрализирующего эпитопа.
На фиг. 3 показана приведенная в качестве примера коллекция ГЭК, полученная в соответствии с настоящим изобретением, со всеми аминокислотными добавлениями, использованными как в константных, так и в вариабельных позициях, при синтезе пяти ГЭК к ВИЧ-1. ГЭК создают на основе вариабельности, обнаруженной в эпитопных последовательностях гипервариабельных регионов оболочечного гликопротеина (§р120) ВИЧ-1. Эта коллекция ГЭК, созданная для использования в вакцине против ВИЧ-1 в рамках настоящего изобретения, состоит из пяти различных ГЭК на основе ВИЧ-1. Каждый из пяти ГЭК состоит из смеси менее 100 различных пептидов. Для каждого из пяти эпитопов последовательности §р120 ВИЧ-1 линий С1абе В сравнивают между собой, чтобы оценить наличие и природу вариабельности. Наиболее часто встречаемые аминокислоты в каждой позиции интересующего гипервариабельного региона отбирают для добавления в ходе пептидного синтеза в соответствии с указаниями, которые являются неотъемлемой частью настоящего изобретения. Более конкретно, количество аминокислоты (аминокислот), добавляемое в данный момент в синтез при использовании Гшос-химии, округляют до ближайших 25%, и не более четырех аминокислот может быть добавлено на каждом этапе связывания аминокислоты. Кроме того, расчетное число пептидов, получаемых в ходе синтеза ГЭК, никогда не превышает 100 различных пептидов. Например, 64, 32, 64, 6 и 4 различных пептида, согласно расчетам, содержится в каждом из пяти ГЭК на основе ВИЧ-1 соответственно.
На фиг. 3 показано, что упомянутая смесь пептидов, обозначенная как ВИЧ-1 ГЭК1, содержит смесь двух аминокислот в позициях 3, 7, 12, 13, 16 и 18 и по одной аминокислоте во всех остальных позициях. Биномиальное умножение показывает, что всего 64 варианта будет содержаться в этой смеси пептидов. Это получается путем умножения коэффициента 1 по каждой позиции, содержащей только одну аминокислоту, и умножением на коэффициент 2 по каждой из 6 вариабельных позиций. Длина эпитопа ограничена так, что не более 100 различных пептидов могут быть получены в результате. Таким образом, например, ВИЧ-1 ГЭК1 не может включать дополнительно даже одну позицию, содержащую более одной аминокислоты, так как 64 варианта при умножении на любой коэффициент, больший единицы, приведут к образованию смеси пептидов, содержащей более ста вариантов.
Для тестирования иммуногенности ГЭК на основе ВИЧ-1 на приматах, две макаки-резус (Масаса пш1айа) иммунизируют ГЭК, смешанными с адъювантом, одобренным для применения на людях. Через 76 недель после иммунизации животных пятью ГЭК на основе ВИЧ-1 получают лимфоциты периферической крови (ЛИК). При стимуляции ΐη νΐίτο ГЭК, также как и пептидами, которые представляют эпито
- 12008143 пы дивергентных линий ВИЧ-1, ЛПК экстенсивно пролиферируют, как показано на фиг. 4. Фиг 4 также показывает, что иммунизация приматов ГЭК на основе ВИЧ-1 приводит к индукции Т-клеток, которые пролиферируют в ответ на высоковариабельную петлю У3 в последовательности пяти основных дивергентных подтипов ВИЧ-1 (линии С1айе А-Е). Эти данные показывают, что сильный, продолжительный и широкореактивный ответ памяти Т-хелперных клеток может быть индуцирован у приматов после иммунизации этими ГЭК на основе ВИЧ-1.
Фиг. 5 демонстрирует, что иммунизация ВИЧ-1 ГЭК приводит к продолжительному ответу антителами, направленными против всех пяти ГЭК, а также против каждого из пяти ГЭК. Индукция широкореактивных Т-хелперных клеток, направленных против эпитопов др120 из различных линий ВИЧ-1, корреллирует с широкореактивным связыванием антител с дивергентными эпитопами ВИЧ-1. Обезьяны продуцируют антитела к ВИЧ-1 ГЭК1, ГЭК3, ГЭК4 и ГЭК5 после первой иммунизации и ко всем ГЭК после второй иммунизации. Таким образом, иммунизация всеми ГЭК одновременно не предотвращает формирование иммунных ответов на каждый из ГЭК. ВИЧ-1 ГЭК3 индуцирует ответ в течение двух недель после первой иммунизации и создает сильнейший антительный ответ ко всем пяти комплексам. Титр антител увеличивается до более чем 1:40000 после бустера и остается высоким, хотя и с медленным спадом, в течение 22 месяцев. Оценка постиммунизационного здоровья обезьян является отличной и состояние крови всегда - нормальным. Никаких вторичных или поведенческих симптомов не отмечено. Сыворотка (содержащая антитела) от иммунизированных обезьян оттестирована на присутствие широкореактивных антител с применением эпитопов, обнаруживаемых в гипервариабельных регионах др120 (У1-У5) линии С1айе В ВИЧ-1 штаммов ΜΝ, КГ и 8Е2.
Фиг. 6 показывает, что через две недели после второй иммунизации ВИЧ-1 ГЭК, наблюдается реактивность антител ко всем аналогам. Сыворотка от обеих обезьян (25705 и 25598) связывает строго все пептидные аналоги из всех трех изолятов ВИЧ-1. Более важно, что антитела от обеих обезьян способны распознавать и связывать очищенный рекомбинантный белок из 120 ВИЧ-1 8Г2.
Фиг. 7 показывает, что антитела от иммунизированных обезьян тестированы на нейтрализационную активность против различных лабораторных штаммов и первичных изолятов ВИЧ-1. Антитела от обеих обезьян способны нейтрализовать первичный изолят ВИЧ-1 89,6 и адаптированный лабораторный штамм ВИЧ-1 ΙΙΙΒ. В качестве положительного контроля используют известную сыворотку, содержащую нейтрализующие антитела. Полученные данные говорят о том, что иммунизация приматов ВИЧ-1 ГЭК индуцирует ответ Т-хелперов и антител, которые являются широкореактивными в отношении дивергентных штаммов ВИЧ-1. Фиг. 8 демонстрирует, что, кроме того, лица, инфицированные самыми разными штаммами ВИЧ-1 со всего мира, несут антитела, которые распознают ВИЧ-1 ГЭК.
Фиг. 4-6 демонстрируют, что смеси пептидов на основе оболочечного белка ВИЧ-1 являются иммуногенными. Фиг. 8 демонстрирует их антигенность, а фиг. 7 иллюстрирует их защитный эффект против репликации вируса ш νίΐτο.
Пример 2. ГЭК, основанные на эпитопах вируса гепатита С.
Получают два ГЭК против двух гипервариабельных регионов вируса гепатита С (ВГС) в соответствии с настоящим изобретением. В базах данных и соответствующей научной литературе находят последовательности ш νίνο изолятов вируса, интересующие эпитопы сравнивают между собой. Затем определяют пропорции аминокислот, добавляемых на конкретных этапах пептидного синтеза, в соответствии с указаниями, установленными настоящим изобретением, округлением частот аминокислот до ближайших 25% при определении аминокислот для включения в вариабельную позицию. Фиг. 9 демонстрирует аминокислоты, обнаруживаемые в различных позициях в пептидной смеси. Пептидную смесь синтезируют, используя стандартную Етос-химию (методику).
В частности, на примере ВГС ГЭК1 на фиг. 9 можно видеть, что 24-мерный пептид получают, имея равные количества тирозина (Υ) и гистидина (Н) в положении 4, равные количества лейцина (Ь) и фенилаланина (Г) в позиции 17, равные количества аланина (А) и треонина (Т) в позиции 18 и равные количества серина (8) и аспарагина (Ν) в позиции 19. Число различных получаемых пептидов подсчитывается как 2х2х2х2 (или 24)=16.
Пример 3. ГЭК на основе эпитопов вируса гриппа.
За многие годы исследователями вируса гриппа получена важная информация, которая дает возможность разработать ГЭК на основе вариаций вируса гриппа. Эти данные получены в результате выполнения рутинных процедур, введенных такими организациями как ВОЗ и СИС, для идентификации вариантов, ожидаемых к появлению в следующем году. В кратком изложении, дикие изоляты вируса гриппа получают от различных хозяев со всего мира. После идентификации типа (А или В), их подвергают скринингу против антивирусной антисыворотки хорька для идентификации штаммов, которые являются кросс-реактивными и поэтому защищенными от имеющихся вакцин против вируса гриппа. Затем их подвергают скринингу против набора антисывороток хорька для подтверждения того, что имеют тот же тип реактивности. Это убеждает в том, что нет точечных мутаций. Каждый год подавляющее большинство штаммов вируса гриппа являются антигенно идентичными. Однако всегда находится несколько штаммов, которые продуцируют уникальные типы реактивности, они тщательно изучаются, поскольку они могут стать преобладающим штаммом в будущем. Эти уникальные штаммы вируса гриппа подвер
- 13 008143 гают аминокислотному сиквенированию.
На фиг. 10 описаны четыре ГЭК на основе вируса гриппа, полученные в соответствии с настоящим изобретением, которые в совокупности представляют комбинированные участки антигенных сдвигов, обнаруженные на оболочечном белке гемагглютинине вируса гриппа А. Эти ГЭК отчасти отличаются от описанных ранее и характеризуются тем, что они представляют гипервариабельные эпитопы, образованные непрерывными эпитопами оболочечного белка вируса гриппа. Аминокислоты, выбранные для конструирования каждого из этих ГЭК на основе вируса гриппа, не из одного гипервариабельного участка аминокислот в составе поверхностного белка вируса, скорее каждый основан на аминокислотах из различных порций внутри линейной аминокислотной последовательности вирусного белка, которые видимо расположены в тесной близости друг с другом, если учесть трехмерную структуру белка. Пропорции аминокислот, используемых в синтезе, выводят из аминокислот в каждой позиции на основе примерно 61 человеческого изолята вируса гриппа А (включая 5 последовательностей вируса гриппа А свиньи), полученных из СспсЬапк и Швейцарской белковой базы данных.
В соответствии с результатами, полученными после иммунизации обезьян ВИЧ-1 ГЭК, иммунизация мышей четырьмя ГЭК на основе вируса гриппа, вызывает мощные ответы клеток Т-хелперов и антител (фиг. 11 и 12 соответственно).
Очень важно, что клетки Т-хелперы, индуцированные иммунизацией ГЭК, отвечают, когда их стимулируют ίη νίΐτο цельным неактивированным вирусом гриппа А (фиг. 11).
ГЭК, представляющие многие слабо отличающиеся вариации эпитопа, могут помочь убедиться в том, что в аутбредной популяции, в которой молекулы ГКГ высоко полиморфны, формируется такой ГЭК, который содержит поднабор эпитопных вариантов, способных связывать молекулы ГКГ любых индивидуальных субъектов для представления иммунной системе. Таким образом, вакцины на основе ГЭК преодолевают ограничения ГКГ. Действительно, на фиг. 13 и 14 демонстрируется этот принцип. На фиг. 13 показано, что даже иммунизация инбредных мышей Ва1Ь/с пептидом одной последовательности (ПОП), представляющим эпитоп 414-434 вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), приводит к индукции антител, которые связывают этот пептид. В противоположность этому, иммунизация генетически отличающейся линии мышей (С57Ь1) с иным ограничением ГКГ, не может продуцировать антитела, которые связывают пептид. Однако иммунизация не отвечающих мышей (С57Ь1) и отвечающих мышей Ва1Ь/с ГЭК на основе этого эпитопа приводит к индукции антител, которые могут связывать вирус, а также вирусный белок, который содержит этот эпитоп (фиг. 14).
Пример 4. Конъюгация ГЭК на основе ВИО с липидной частью.
Помимо индукции мощного ответа клеток Т-хелперов и антител, ГЭК могут также индуцировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), если сконъюгированы с липидной частью. Липо-ГЭК, используемые для индукции ЦТЛ, получают конъюгацией Рат с конъюгированным на смоле ГЭК на основе ВИО. Это стандартный способ получения липопептидов. Мышей иммунизируют липо-ГЭК с адъювантом (липо-ГЭК) или буфером РВ8 с адъювантом (А-РВ8), после чего спленоциты из этих мышей вместе со спленоцитами обычных мышей тестируют на активность ЦТЛ против целевых клеток, инкубированных с ГЭК. Данные, показанные на фиг. 15, отражают процент специфического лизиса после вычитания неспецифического фонового лизиса. Наблюдаемый специфический лизис получают на животных, которые получают только две иммунизации. После одной иммунизации лизис не наблюдали вовсе (данные не показаны). Фиг. 15 демонстрирует, что иммунизация липо-ГЭК индуцирует значительную активность ЦТЛ.
Липо-ГЭК также получают, используя способ конъюгации, в котором эфир пальмитиновой кислоты присоединяют непосредственно к пептидам, без участия смолы. Два типа конъюгатов липо-ГЭК являются одинаково эффективны в индукции иммунных ответов, что приводит к заключению, что способ конъюгации не оказывает влияния на иммуногенность формируемых липо-ГЭК.
Пример 5. Получение композиций на основе оболочечного гликопротеина ВИЧ-1.
Фиг. 16 показывает последовательности пяти пептидных смесей (композиций), полученных в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности основаны на пяти гипервариабельных регионах оболочечного гликопротеина ВИЧ-1 (др120). А именно, смесь соответствует эпитопам, окруженным следующими аминокислотными последовательностями для штамма ВИЧ-1 В.И8.8Р2: др 120-1, аминокислоты 130-155; др120-2 аминокислоты 159-193; др120-3 аминокислоты 307-333; др120-4 аминокислоты 387-410; и др120-5 аминокислоты 456-471. В вариабельных позициях, где две или более аминокислот обнаруживаются с частотой 25% или более после округления до ближайших 25%, две или более аминокислоты добавляют в ходе синтеза в количествах, представленных их округленными частотами.
Пептидные смеси, полученные в соответствии с настоящим изобретением, содержат множество различных пептидов, которые отражают наиболее часто встречаемые вариабельные аминокислоты в оболочечном гликопротеине др120 ВИЧ-1, как об этом сообщается в литературе. Более конкретно, др120-1 - др120-5 представляют собой отдельные пептидные смеси, которые содержат 64, 64, 32, 32 и 48 различных пептидов соответственно.
Описанные выше варианты реализации настоящего изобретения предназначены для рассмотрения только в качестве примеров. Опытные специалисты могут применить к конкретным вариантам реализа
- 14 008143 ции изменения, модификации и вариации, не выходя за рамки настоящего изобретения, которые определены формулой изобретения, приведенной далее.
Claims (11)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Пептидная смесь, иммуногенная к патогену, включающая до примерно 100 различных пептидов, каждый из которых имеет регион общих аминокислотных остатков и позицию вариабельного аминокислотного остатка;область общих аминокислотных остатков различных пептидов, представленную невариабельными аминокислотами иммуногенной эпитопной последовательности патогена, расположенную рядом с вариабельным аминокислотным остатком иммуногенной аминокислотной последовательности;положение вариабельного аминокислотного остатка занято аминокислотой, выбранной из группы, содержащей наиболее часто встречающиеся в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности аминокислоты, при условии, что:(a) не более четырех различных аминокислот представлены в положении вариабельного аминокислотного остатка различных пептидов пептидной смеси;(b) аминокислота, представленная в положении вариабельного аминокислотного остатка различных пептидов, имеется в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности с частотой выше пороговой частоты от примерно 10 до примерно 30%.
- 2. Пептидная смесь по п.1, где частота, с которой аминокислота имеется в положении вариабельного аминокислотного остатка, определяется в соответствии со следующей схемой:частота, с которой аминокислота обнаруживается в вариабельной позиции иммуногенной эпитопной последовательности, округляется до ближайших 25%;аминокислоты, имеющие не равные нулю округленные частоты, находятся в положении вариабельного аминокислотного остатка различных пептидов с частотой, пропорциональной округленной частоте.
- 3. Пептидная смесь по п.2, где частота, с которой сходные аминокислоты, имеющие округленную частоту менее 25%, находятся в положении вариабельного аминокислотного остатка, определяется в соответствии со следующей схемой:частота сходных аминокислот объединяется и округляется до ближайших 25%;для округленных частот, не равных нулю, округленная частота присваивается наиболее часто встречающейся из сходных аминокислот;сходные аминокислоты наиболее часто находятся в положении вариабельного аминокислотного остатка различных пептидов с частотой, пропорциональной округленной частоте.
- 4. Конъюгированная пептидная композиция, включающая пептидную смесь по п.1, конъюгированную с липидной частью.
- 5. Конъюгированная пептидная композиция, включающая пептидную смесь по п.1, конъюгированную с частью белка-носителя.
- 6. Иммуногенная композиция, включающая множественные пептидные смеси, охарактеризованные в п.1, где каждая из упомянутых пептидных смесей является иммуногенной к одному и тому же патогену.
- 7. Иммуногенная композиция по п.6, где каждая из упомянутых множественных пептидных смесей предназначена для различных иммуногенных эпитопных последовательностей одного и того же патогена, а различные иммуногенные эпитопные последовательности обнаруживаются в тесной близости на поверхности патогена.
- 8. Вакцина для формирования иммунного ответа к патогену, содержащая пептидную смесь по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 9. Способ получения антител, иммуногенных к патогену, включающий этапы:назначение субъекту пептидной смеси по п.1 и получение от субъекта антител, индуцированных назначением пептидной смеси.
- 10. Способ получения части гена или генетического материала, кодирующего полностью или частично антитело, реактивное к патогену, включающий этапы:назначение субъекту пептидной смеси по п.1;получение от субъекта антитела или части антитела, реактивного к патогену и индуцированного назначением пептидной смеси;выделение упомянутых части гена или генетического материала, кодирующего антитело или часть антитела, реактивного к патогену.
- 11. Иммунотерапия против патогена, включающая назначение субъекту пептида или белка, кодируемого частью гена или генетическим материалом, полученным в соответствии со способом по п.10.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CA2002/000137 WO2003066090A1 (en) | 2002-02-08 | 2002-02-08 | Immunogenic formulations of variable peptidic epitopes and process for preparation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200400897A1 EA200400897A1 (ru) | 2005-04-28 |
| EA008143B1 true EA008143B1 (ru) | 2007-04-27 |
Family
ID=27671946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200400897A EA008143B1 (ru) | 2002-02-08 | 2002-02-08 | Иммуногенные композиции из вариабельных пептидных эпитопов и способ их получения |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1476182B1 (ru) |
| JP (1) | JP4391827B2 (ru) |
| CN (1) | CN1625409B (ru) |
| AP (1) | AP2393A (ru) |
| AT (1) | ATE533113T1 (ru) |
| AU (1) | AU2002231510B2 (ru) |
| CA (1) | CA2472265C (ru) |
| EA (1) | EA008143B1 (ru) |
| MX (1) | MXPA04007646A (ru) |
| WO (1) | WO2003066090A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2237065C2 (ru) * | 2002-10-03 | 2004-09-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Иммуногенная библиотека химерных пептидов, мимикрирующая генетическое многообразие гипервариабельного района v3 белка оболочки gp120 вируса иммунодефицита человека |
| US20090104216A1 (en) * | 2005-06-01 | 2009-04-23 | Variation Biotechnologies, Inc. | Peptide-Based Influenza Vaccine Formulation |
| CN101622009B (zh) * | 2006-11-30 | 2012-08-22 | 变异生物技术公司 | 流感疫苗制剂 |
| CN102123724B (zh) * | 2008-06-19 | 2018-05-01 | 变异生技公司 | 治疗流行性感冒的组合物和方法 |
| CA2755285C (en) * | 2009-03-20 | 2014-02-11 | Yunxin Y. Bo | Inhibitors of pi3 kinase |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994000151A1 (en) * | 1992-06-18 | 1994-01-06 | Creagen, Inc. | Combinatorial polypeptide antigens |
-
2002
- 2002-02-08 AT AT02711695T patent/ATE533113T1/de active
- 2002-02-08 CN CN028287061A patent/CN1625409B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-08 WO PCT/CA2002/000137 patent/WO2003066090A1/en active Application Filing
- 2002-02-08 AP APAP/P/2004/003081A patent/AP2393A/en active
- 2002-02-08 EA EA200400897A patent/EA008143B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-08 EP EP02711695A patent/EP1476182B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-08 CA CA2472265A patent/CA2472265C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-08 MX MXPA04007646A patent/MXPA04007646A/es active IP Right Grant
- 2002-02-08 AU AU2002231510A patent/AU2002231510B2/en not_active Expired
- 2002-02-08 JP JP2003565513A patent/JP4391827B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994000151A1 (en) * | 1992-06-18 | 1994-01-06 | Creagen, Inc. | Combinatorial polypeptide antigens |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ANDERSON DAVID E. ET AL.: "Overcoming original (antigenic) sin". CLINICAL IMMUNOLOGY (ORLANDO), vol. 101, no. 2, November 2001 (2001-11), pages 152-157, XP002225146, ISSN: 1521-6616, page 152, right-hand column, 2nd paragraph; table 1; figure 1 * |
| CARLOS MARIA P. ET AL.: "Immunogenicity of a vaccine preparation representing the variable regions of the HIV type 1 envelope glycoprotein". AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, vol. 16, no. 2, 20 January 2000 (2000-01-20), pages 153-161, XP002224415, ISSN: 0889-2229, page 154, left-hand column, 2nd paragraph; page 155, left-hand column, lines 18-19; page 157, right-hand column, lines 7-11, 26-33; figure 1 * |
| MEYER D. ET AL.: "HYPERVARIABLE EPITOPE CONSTRUCTS REPRESENTING VARIABILITY IN ENVELOPE GLYCOPROTEIN OF SIV INDUCE A BROAD HUMORAL IMMUNE RESPONSEIN RABBITS AND RHESUS MACAQUES". AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, NEW YORK, NY, US, vol. 14, no. 9, 10 June 1998 (1998-06-10), pages 751-760, XP001021061, ISSN: 0889-2229, cited in the application, abstract * |
| MEYER DEBRA ET AL.: "Induction of cytotoxic and helper T cell responses by modified simian immunodeficiency virus hypervariable epitope constructs". VIRAL IMMUNOLOGY, vol. 12, no. 2, 1999, pages 117-129, XP009002712, ISSN: 0882-8245, abstract * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4391827B2 (ja) | 2009-12-24 |
| AP2004003081A0 (en) | 2004-09-30 |
| WO2003066090A1 (en) | 2003-08-14 |
| JP2005531499A (ja) | 2005-10-20 |
| AU2002231510A1 (en) | 2003-09-02 |
| MXPA04007646A (es) | 2005-05-27 |
| CA2472265A1 (en) | 2003-08-14 |
| AP2393A (en) | 2012-04-04 |
| EP1476182A1 (en) | 2004-11-17 |
| CN1625409A (zh) | 2005-06-08 |
| EA200400897A1 (ru) | 2005-04-28 |
| EP1476182B1 (en) | 2011-11-09 |
| CA2472265C (en) | 2013-02-05 |
| ATE533113T1 (de) | 2011-11-15 |
| CN1625409B (zh) | 2010-07-28 |
| AU2002231510B2 (en) | 2008-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20060240030A1 (en) | Anti-hiv immunogenic formulation and process for preparation thereof | |
| Belshe et al. | Induction of immune responses to HIV-1 by canarypox virus (ALVAC) HIV-1 and gp120 SF-2 recombinant vaccines in uninfected volunteers | |
| Graham et al. | Safety and immunogenicity of a candidate HIV-1 vaccine in healthy adults: recombinant glycoprotein (rgp) 120: a randomized, double-blind trial | |
| CN104244973B (zh) | 针对口蹄疫(fmd)的基于合成肽的紧急疫苗 | |
| RU2003104976A (ru) | Соединения и способ для лечения и диагностики хламидийной инфекции | |
| AU621097B2 (en) | A synthetic antigen evoking anti-hiv response | |
| JPH0762031B2 (ja) | エイズウイルスおよびエイズウイルスのタンパク質に対する細胞性免疫を誘導する合成ペプチド | |
| WO1991009869A1 (en) | Hiv-1 core protein fragments | |
| ES2248816T3 (es) | Moleculas polipeptidicas de fase preeritrocitica del paludismo. | |
| US5346989A (en) | Peptides for use in induction of T cell activation against HIV-1 | |
| EA008143B1 (ru) | Иммуногенные композиции из вариабельных пептидных эпитопов и способ их получения | |
| EP0601108B1 (en) | Multideterminant peptide antigens that stimulate helper t lymphocyte response to hiv in a range of human subjects | |
| US6287565B1 (en) | Modified HGP-30 heteroconjugates, compositions and methods of use | |
| EP0750636A1 (en) | Methods to diagnose and treat hiv-1 infection | |
| US20080267989A1 (en) | Hiv Gp-41-Membrane Proximal Region Arrayed On Hepatitis B Surface Antigen Particles as Novel Antigens | |
| EP2324049B1 (en) | Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine | |
| EP0594638A1 (en) | Peptides for use in induction of t cell activation against hiv-1 | |
| ZA200405492B (en) | Immunogenic formulations of variable peptidic epitopes and process for preparation thereof. | |
| WO2023004307A1 (en) | T cell epitopes and related compositions useful in the prevention and treatment of respiratory syncytial virus infection | |
| GB2273709A (en) | Peptide fragments of HIV | |
| Paterson | Rational approaches to immune regulation | |
| DAFÜR et al. | VACCINAL, THERAPEUTICAL AND DIAGNOSTIC APPLICATIONS THEREOF |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |