CN1625409A - 含可变肽表位的免疫原制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用一次合成制备免疫原肽混合物的方法。该肽混合物综合体现了病原体的免疫原表位的体内可变性。该混合物被称为高可变表位构建体(HEC)。用HEC进行免疫能够激发抗HEC所基于的该病原体的各种株的广泛免疫反应性。

Description

含可变肽表位的免疫原制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种免疫原制剂及其制备方法，尤其涉及基于所选氨基酸制备免疫原肽混合物的方法，所述氨基酸选自蛋白表位的可变残基处出现的氨基酸。
背景技术
很多病原体，包括病毒，如HIV-1和HIV-2、流感、肝炎A/B/C、人类乳头状瘤(HPV)、和登革热，以及寄生虫，如疟疾和旋毛虫，都易于改变尤其是蛋白表位中的氨基酸序列。鉴于这种行为以及其它目的，越来越多地探索将合成肽疫苗作为减活或灭活疫苗的可供选择物。选择具有有效免疫力的表位，而对于产生有害免疫应答的表位，如促进疾病形成或抑制T-细胞，都应该被排除在候选疫苗范围以外。此外，由于合成肽疫苗是通过化学设计，不含任何感染性物质，对身体危害很小。最后，减活疫苗需要在限定的冷却温度下运输和储存，与活的减活疫苗不同，合成肽疫苗相对稳定，且无须冷冻，因此更易于分配，成本也低。
通常，合成肽疫苗具有抗细菌、抗寄生虫和抗病毒疫苗。细菌表位疫苗包括直接抗霍乱和Shigella的疫苗。抗霍乱的合成疫苗已经进行了人类I期和II期临床实验。流感和乙肝病毒代表两个病毒体系，其中合成疫苗看起来更具前景，最近人们又对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的合成疫苗产生了兴趣。
尽管目前进展很快，但合成肽疫苗还是不能跟上包膜蛋白或表面蛋白的变异速度。之前，有几个研究小组采用了几种方法试图克服表位变异。Tam在U.S.Patent number 5,229,490(July 20，1993)中描述了一种克服表位变异的方法。该方法涉及利用赖氨酸功能基和甘氨酸连接体将几个相似或不同的表位聚合成一种免疫原核(称为树枝状聚合物)。该方法被称为多抗原肽体系(MAPS)。然而高免疫原的、基于HIV的MAPS没有证明能诱导产生能识别各种病毒株的广泛反应性抗体(Nardelli et al.(1992)J Immunol 148：914-920)。
另一种早期方法涉及识别模拟簇(mimotopes)，随机产生模拟抗原表位的序列(Lenstra et al.(1992)J Immunol Methods 152：149-157)。利用该方法，退化的寡核苷酸被嵌入细菌的表达载体上，导致形成长为6-8个氨基酸的随机肽库。利用感染了相应病原体的动物或人的血清(含有抗体)鉴定模仿抗原表位的肽。这种方法的确已经用于鉴定被感染了HCV的个体的血清所识别出的模拟簇(Prezzi et al.(1996)J Immunol 156：4504-4513)。然而，这些肽是被随机选出的，因此，有必要获得并分析感染主体的血清，以制备模拟簇组合物。
现有技术的方法的另一个缺点是，需要来自感染个体的血清，而很多感染个体并没有产生适宜的抗病原抗体。因此，利用患者血清来选择肽，很有可能会由于感染个体没能产生免疫应答，而导致漏掉重要的模拟表位抗原肽。
利用SIV：感染人类HIV的恒河短尾猴模型，已经描述了SIV包膜糖蛋白B细胞neutralization以及T细胞表位，并且基于高可变性和高抗原性表位SIVMACL42包膜糖蛋白(GPL30)设计并合成了合成免疫原(Anderson et al.(1994)Vaccine 12：736-740)。该合成免疫原由肽的混合物组成，这些肽体现了SIV包膜基因序列中发现的氨基酸替代物的变异体。因此，合成免疫原综合表达了所发现的该具体表位的所有体内变化。通过测定该合成免疫原的免疫性，其显示了能诱导接受免疫的恒河短尾猴体内与天然SIV结合的抗体数量的增加。而且，该合成免疫原还促进对多种表位类似物的免疫反应性。在此文献以及以后的文献中都揭示了这种方法能够适应表位的可变性(Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14：751-760)。
最近的研究渐渐澄清了T细胞识别肽抗原的能力显得退化了。该发现使得人们更加注意一些外来抗原的肽能够模拟一些自身抗原并导致自身反应性T细胞的反应和自身免疫性疾病的形成。随后，就存在用随机合成肽的混合物免疫动物或人类而引起自身免疫性疾病的危险。模拟簇方法(LENSTRA et al.(1992)J Immunol Methods 152：149-157)利用被感染动物或人的血清从随机合成的肽混合物中选择一亚类肽，因此降低自身免疫性疾病发生的危险。然而，尽管合成免疫原制剂如现有技术中所描述的那些，可以包含超过8000个不同的肽抗原，但上述合成免疫原制剂(Anderson et al.(1994)Vaccine 12：736-740；Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14：751-760)并不包括全部随机肽混合物，因为这些肽是基于仅在部分合成反应步骤中加入一些约20个氨基酸的肽而合成。该方法获得的免疫原会激起大范围的免疫反应性，这种制剂过于复杂以致难于进行生化或免疫性定性，对人类进行免疫后会承受引起免疫性疾病的严重风险。而且，没有完全的组成分析，混合的肽组合物也不会得到管理部门的认可。对于含有成千上百种肽的混合肽组成，进行完全分析将是一个耗时、高成本的工作。
很多前述的合成免疫原制剂，是由上万种肽所组成的。如果T细胞识别外来抗原的能力退化，则混合肽就会导致含有模拟自身抗原的肽的危险，这将会诱导产生病原性自身免疫性应答。而且，即使不是没有进行化学定义和定性分析的可能，但前述合成路线的复杂性会使得对相同组成的多个制剂的定义和定性工作带来困难。
基于上述原因，需要一种涉及免疫原肽混合物的新方法，该方法会产生比现有技术所描述的复合制剂成份更简单的制剂，但仍保留最佳的免疫原性。利用这种方法，使制备的混合物能够进行分析以便人类使用。而且，还需要一种用于分析该制剂的检测方法，以保证合成反应中形成的混合物的统一性和抗原性。
发明简述
本发明的目的之一是减少或消除先前免疫原制剂或制备该制剂的方法的至少一种缺陷。
本发明提供了一种制备肽混合物的方法，所述肽混合物体现了蛋白表位体内序列变体。由该方法所制备的肽混合物能激起广泛免疫反应性，该肽混合物可用于制备抗病原性微生物如病毒和寄生虫的疫苗、治疗剂和诊断试剂盒。该方法可被应用于病原微生物的多种表位中。
本发明提供了一种制备肽混合物的方法，该肽混合物被称为高可变表位构建体(HEC)，所得肽混合物综合体现了免疫原表位中体内可见的可变性，但组成简单足以能进行分析。该混合物表现了表位中氨基酸替代的变化。用该肽混合物对人体进行免疫，T细胞和B细胞应答减弱，导致抗体的高滴度，该抗体与远相关的天然病原蛋白的结合增强。此外，这些抗体能够中和HEC所基于的多种病原株的感染。
本发明的一个方案提供了一种制备免疫原肽混合物的方法，其包括步骤：获得病原体免疫原表位序列，该免疫原表位序列具有共同的残基区域，和至少一种各序列互不相同的可变残基；测定在免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率；合成肽混合物，其包括至多约100个不同肽，每种肽都具有共同的残基区域和一种可变残基位点上的氨基酸，该氨基酸选自出现频率大于约10％-约30％阈频率的免疫原表位序列中可变残基处的氨基酸。
本发明还提供一种制备免疫原肽混合物的方法，其包括步骤：获得病原体免疫原表位序列，该免疫原表位序列具有共同的残基区域，和至少一种各序列互不相同的可变残基；测定在免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率；将出现在可变残基处的氨基酸频率进行舍入至其最接近的25％；合成肽混合物，其包括至多约100个不同肽，每种肽都具有共同的残基区域和一种可变残基位点上的氨基酸，该氨基酸选自在免疫原表位序列的可变残基处出现频率最高的氨基酸，条件是该氨基酸的舍入频率不等于零；其中可变残基位点选自两个至四个不同氨基酸，其中每个氨基酸在肽混合物中的比例相当于其舍入频率。
在一个实施方案中，本发明提供了一种对病原体产生免疫性的肽混合物，该混合物包括至多约100个不同肽，每种肽具有一共同氨基区域和可变残基位点；不同肽的共同残基区域是病原体的免疫原表位序列的不变氨基酸，与其相邻的是一种免疫原表位序列的可变残基；可变残基位点被一种氨基酸所占据，该氨基酸选自免疫原表位序列的可变残基处出现频率最多的氨基酸，条件是：
(a)在肽混合物的不同肽中的可变残基位点处的氨基酸不超过4种；和(b)不同肽的可变残基位点处的氨基酸在免疫原表位序列的可变残基处出现的频率大于约10％-约30％的阈频率。
本发明不同于从前制备免疫原组合物的方法在于其为了使该方法适用于人体的疫苗设计中所进行的改进，组合物被限于含有种类少的肽，这些肽充分体现了天然免疫原表位序列的可变性。
本发明提供了一种制备包含被称为高可变表位构建体的混合肽的免疫原制剂的简便方法。该方法的肽合成部分可以被简化为本领域熟知的化学合成方法，“一步”法。
有利地，本发明提供了基于不同病毒表位的各种HECs，从而采用本发明的方法用最少的合成步骤制备出大量的肽库。制备的不同肽的种类采用这样一种方法进行控制，即免疫原制剂的全部组成都能够通过分析而被预知和证实。所发明的HEC能够与衍生出该肽的蛋白发生大范围免疫原反应。
有利地，用HEC进行免疫后，诱导产生与各种病原体株的广泛免疫反应，从而导致对病原体感染的抑制。
本发明的HEC能够克服主要的组织相容性限制，这是世界范围内开发人类疫苗的共同障碍。而且，HEC能够被改进用以诱导产生细胞(CTL)免疫应答。除了应用于疫苗，HECs还可以被用于诊断试剂盒中。
通过结合附图对以下具体实施方案的描述，使本发明的其它方案和特征对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
附图说明
本发明的实施方案通过实施例并参照附图进行描述。
图1是本发明一个实施例中合成HEC的简化示意图。
图2是本发明一个实施例制备肽混合物的步骤略图。
图3图示了本发明基于人类I型免疫缺陷病毒使用选择的氨基酸进行5种HECs的合成。
图4图示了对非人类的灵长目(猴子)进行HIV-1 HECs免疫而诱导T辅助性细胞的应答。
图5图示了通过对猴子进行HIV-1 HECs 1至5的免疫，诱导体内产生有效的抗体滴度。
图6显示了通过HIV-1 HECs免疫诱导产生的抗体与来自不同HIV-1株的表位结合。
图7显示了用HIV-1 HECs1-5对猴子免疫后产生的抗体中和了由不同HIV-1引起的人类外周血管淋巴细胞(PBLs)的感染。
图8显示了来自感染不同HIV-1亚型A，B，C，D，E和F的患者的阳性血清中的抗体识别基于HIV-1的HECs 1-5。
图9显示了基于丙型肝炎病毒(HCV)的两个HECs的设计。
图10显示了基于在流感A的红血球凝聚素包膜蛋白上发现的抗原迁移联合位点设计4种HECs。
图11显示了用图10的流感HECs进行免疫的小鼠的T辅助细胞应答。
图12显示了用图10的流感HECs进行免疫的小鼠的抗体应答与非相关肽的比较。
图13显示了用SIV-衍生的HEC免疫后的Balb/c小鼠的免疫应答。该图说明了Balb/c小鼠不能激发对单纯SIV-衍生的表位产生免疫应答，这是由于它们主要的组织相容性基因型而造成，基于相同表位的HEC进行的免疫才能导致免疫应答。
图14显示了进行SIV免疫的小鼠的抗体结合性。该数据表明用SIV HEC对无应答品系的小鼠进行免疫激发的抗体能够结合HEC所基于的病毒。
图15显示了将HECs结合到脂质部分上可以诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。
图16显示了本发明的5种肽混合物的组合物，其包含了已测定的一系列肽。
发明详述
本发明提供了一种用于制备免疫原肽混合物或高可变表位构建体(HEC)的方法。
在一个实施例中，制备免疫原肽混合物的方法包括以下步骤。获得病原体免疫原表位序列，该序列具有一共同残基区域和至少一个序列之间互不相同的可变残基。测定免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率。然后合成混合肽，该混合肽包括至多约100种不同的肽，每种肽具有共同的残基区域以及在可变残基位点的一种氨基酸，该氨基酸选自在免疫原表位序列的可变残基处出现频率大于阈频率的氨基酸，该阈频率约为10％-约30％，如20％。根据该实施例，肽混合物包括一种位于可变残基处的氨基酸的序列，该氨基酸选自免疫原表位序列的可变残基处最频繁出现的氨基酸，任选的限制条件是肽混合物中不同肽的可变残基处出现的不同氨基酸种类不超过4种。
在合成肽混合物的步骤中，使肽的可变残基位点处的不同氨基酸的出现频率与免疫原表位序列的可变残基处的不同氨基酸的频率相当。可变残基位点的氨基酸出现频率可以被舍入计算到其最接近的25％，肽混合物中的各种肽的可变残基位点处的氨基酸只能选择舍入频率值非零的氨基酸。在这种情况下，肽混合物中的肽可以被赋予一氨基酸，其在可变残基位点出的频率与其舍入计算的频率值相当。
任选地，当计算频率时，可以累计可变残基处出现的相似氨基酸的频率，然后将累计后的频率赋予给最频繁出现的相似氨基酸。这种任选情况的限制条件是，只有相似氨基酸单独出现的频率低于阈频率时，才可以累积可变残基处出现的相似氨基酸的频率。在舍入计算每种相似氨基酸的频率至其最接近的25％时，没有相似氨基酸具有25％或更高的频率，相似氨基酸频率值才可以被累计。
本发明的“相似”氨基酸选自共同组群中的氨基酸，其选自：芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、带羟基侧链的脂肪族氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸、含酰胺氨基酸和含硫氨基酸。
本发明的合成步骤可以采用氨基酸的偶合，其中可变残基位点处的偶合可以采用加入相当于舍入计算频率的氨基酸而进行。本发明也可以包括一个或多个采用生物信息方法学的步骤。
任选地，免疫原表位序列包括2至7个可变残基，其会使肽混合物包含2至约64个不同肽。
本发明还涉及免疫原肽混合物的方法，其包括略微不同的几个步骤，尤其是以下步骤。获得病原体免疫原表位序列，该序列具有一共同残基区域以及至少一种使序列各不相同的可变残基。测定免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率，舍入至其最接近的25％。然后合成一种肽混合物，其包括至多约100种不同的肽，每种肽具有共同的残基区域以及在可变残基位点处具有一种选自免疫原表位序列的可变残基处出现频率最高的氨基酸，条件是舍入频率值是非零。根据该步骤，可变残基位点选自2至4种不同氨基酸，其中每种氨基酸在肽混合物中的量相当于其舍入计算的频率值。
该步骤还可以包括将相似氨基酸的频率累计的步骤，所述频率舍入值低于25％；将该累计后的频率赋予给出现频率最多的相似氨基酸；舍入该累计频率至其最接近的25％，且用于累计的氨基酸是非零舍入频率的氨基酸，包括在肽混合物的合成步骤中最频繁出现的相似氨基酸。
本发明还涉及一种针对病原体的肽混合物免疫原。该混合物包括至多约100种不同的肽，每种具有一共同残基区域和一可变残基位点。不同肽的共同残基区域由病原体的免疫原表位序列的非可变氨基酸组成，与其相邻的是免疫原表位序列的可变残基。该可变残基位点被一氨基酸占据，该氨基酸选自免疫原表位序列的可变残处最频繁出现的氨基酸，条件是：(a)肽混合物中的不同肽的可变残基位点处的氨基酸不超过4种不同的氨基酸；和(b)不同肽的可变残基位点处出现的一种氨基酸在免疫原表位序列的可变残基处出现的频率高于约10％至约30％的阈频率。可变残基位点处出现的氨基酸频率可以根据以下方案进行测定：免疫原表位序列的可变残基处出现的氨基酸的频率被舍入为其最接近的25％，且具有非零舍入频率的氨基酸在不同肽中的可变残基位点处的频率相当于舍入频率。
舍入频率低于25％的可变残基位点处出现的相似氨基酸可以通过累计相似氨基酸的频率并将该累计值舍入至其最接近的25％而进行测定。对于非零舍入频率，将该舍入频率赋予于最频繁出现的相似氨基酸。根据该实施例，不同肽中的可变残基位点处最频繁出现的相似氨基酸的频率与舍入频率相当。
本发明的结合的肽组合物的构成包括将本发明的肽混合物结合到脂质部分或结合到载体蛋白部分上。
本发明的免疫原组合物可以包括多个由本发明的方法制备所得的肽混合物，其中每个肽混合物的免疫性都针对同一种病原体。任选地，本发明的免疫原组合物可以包括多个针对相同病原体的不同免疫原表位的肽混合物，这些不同的免疫原表位可以在病原体表面上的紧邻区域上。
根据本发明可以构成能激发对一种病原体产生免疫原应答的疫苗。该疫苗包括本发明的肽混合物与可药用载体的混合物。因此，本发明的疫苗对抗病原性疾病的方法包括给主体施用有效量的疫苗。
主体感染病原体的诊断方法也是本发明的保护范围。该方法包括步骤：从主体体内获得含有抗体的生物样品；将该生物样品与基于该病原体的免疫原表位序列的本发明免疫原肽混合物相接触；评价样品与肽混合物的免疫原应答。检测主体感染病原体的诊断试剂盒包括基于该病原体的免疫原表位序列的本发明免疫原肽混合物，以及评价来自主体的含有抗体的生物样品对免疫原肽混合物的免疫应答的说明书。
此外，本发明提供了一种分离对病原体具有免疫原性抗体的方法，其包括步骤：给主体施用本发明的肽混合物；从主体获得抗体，或与病原体反应的一部分抗体，所述抗体通过施用肽混合物而诱导产生。
本发明的进一步方案是提供一种用于分离编码对病原体具有免疫原性的抗体的基因的方法。该方法包括步骤：给主体施用本发明的肽混合物；从主体获得由施用肽混合物而诱导产生的抗体；分离编码该抗体的基因。相似地，本发明还包括提供一种分离编码对病原体具有免疫原性的抗体的一部分基因或基因物质的方法，其包括步骤：给主体施用本发明的肽混合物；从主体获得由施用肽混合物而诱导产生的抗体；分离编码该抗体的一部分基因或基因物质。因此，通过施用由该方法获得的一部分基因或基因物质而编码的肽或蛋白质，可以开发出抗病原体的免疫疗法。
本发明的制备免疫原混合物的方法从分析天然存在的一种病原体的序列开始，这些病原体已经在科学性数据库或同行们阅读的科学性期刊上被报导。这项工作是用于减少合成过程中产生的不同肽的数量。所加入的氨基酸以及在哪一步合成反应中加入都是根据特定步骤事先确定的，即在第一次校准包含已知T辅助性细胞和B细胞中和表位的序列之后进行的。得到的肽混合物，被称为高可变表位构建体(HEC)，体现了单一肽合成中所形成的表位序列的变异，这是通过加入统计学重量的氨基酸混合物使其与初链上的在先装配的氨基酸相连接而实现的。因此，与模拟簇不同，HEC中的肽不完全是随机形成的，其可以呈现抗原性表位的作用。基于该原因，没有必要采用受感染的动物或患者的血清以分离重要表位。HECs能够用于检测其与作为活性对照的感染病原体个体的血清的反应性，以此确保肽合成反应的正常进行。无需使用患者血清选择HEC所包含的各种肽，而这正是与现有技术的模拟簇方法的根本不同之处。
本发明呈现了一种简便的方法，其已可用于弥补表位的可变性。在固相肽合成中，在每一循环中，一种氨基酸被“偶合”或被加入到树脂珠上以逐渐构成肽链。某一特定循环所加入的氨基酸百分比是基于表位中某特定位点上该氨基酸出现的频率计算所得。该信息是基于序列的信息，其来自直接的实验室氨基酸测序获得的数据，或来自序列数据库和/或来自同行阅读的科学性期刊所获得的体内序列数据。本发明的免疫原肽混合物或HEC，由蛋白表位中发现的氨基酸替代物的变异性肽混合物组成。
图1表示了制备HEC的方法示意图。简言之，在步骤1中，获得了病原体的免疫原表位序列。该表位至少具有一种可变残基，其代表了不同的已知序列中的不同氨基酸。每种不同氨基酸在表位序列的可变位点处出现的频率在步骤2中测定，并与在先测定的阈频率相比较。设定阈频率以使表位序列中低于阈频率的较小数量的氨基酸不会在所合成的肽混合物中出现。那些接近阈频率的氨基酸才是步骤3的肽合成中在可变残基位点处添加的氨基酸。低于阈频率的氨基酸是不会在肽合成中用于可变氨基位点处的。最终，肽混合物的合成可采用能使上述高于阈频率的氨基酸以相当于免疫原表位中出现的频率的数量而添加到可变残基位点处的任何肽合成路线。阈频率的范围为10％至30％，且合成的肽混合物不应该太复杂而超过约100种不同的序列。
图2表示了一种制备HEC的方法的可选示意图。简言之，在步骤1中，来自适宜来源如数据库或同行阅读的期刊的病原体的体内分离物获得蛋白序列。对蛋白序列进行校准，如果存在，则尤其对于含有免疫原B细胞中和、CTL或辅助性表位的序列校准。注意，无需鉴定用于本发明的某一蛋白序列中的特定免疫原B细胞中和、CTL或辅助性表位。尽管表位代表了已选择作为免疫系统靶点的蛋白某区域，但无需对于该免疫系统的作用机理进行鉴定。
步骤2中，测定表位中每个位点的氨基酸的出现频率。对于超过一个氨基酸出现的位点，根据步骤3至6所描述的方法将这些氨基酸包含在肽混合物中。尤其是，将可变残基位点处出现的每种氨基酸的频率舍入到其最接近的25％(步骤3)。例如，12％的频率被舍为0％，而13％的频率被入为25％。
步骤4中，将可变残基处出现的相似氨基酸，其舍入频率不足25％的频率进行累计，再将该累计频率赋予于最频繁出现的相似氨基酸。然后将该数值进行舍入至最接近的25％。
相似氨基酸是那些具有相似化学结构或性质的可进行保守性变换的氨基酸。相似氨基酸的实例为脂肪族氨基酸((Gly，Ala，Val，Leu，Ile，和Pro)，含有脂肪羟基侧链的氨基酸(Ser，Thr)，含硫氨基酸(Cys，Met)，芳香族氨基酸(Phe，Tyr，和Trp)，碱性氨基酸(Lys，Arg，和His)，酸性氨基酸(Asp，Glu)，和含有酰胺的氨基酸(Asn，GLN)。
作为该步骤的一个实例，如果蛋氨酸的出现频率为10％，半胱氨酸的出现频率为8％，两种氨基酸都不能舍入为25％。然而，由于蛋氨酸和半胱氨酸是相似氨基酸(二者都为含硫氨基酸)，将二者频率相加得到累计频率18％，然后舍入为25％，再将该频率赋予于蛋氨酸，因其比半胱氨酸在可变残基处出现得更频繁。
步骤5中，在肽合成过程中，以舍入频率相当的数量添加可变残基处非零舍入频率(如频率为25％、50％、75％或100％)的氨基酸。如果舍入频率的总和没有达到100％，则将舍入频率的总和作为除数，尤其取出每个舍入频率以得到所加入的可变残基处的氨基酸的所需百分数。例如，如果可变残基处的第一种氨基酸的出现频率为60％，第二种氨基酸出现频率为30％，没有其它氨基酸或累计组合的氨基酸用于舍入到非零频率。因此，第一种氨基酸被舍为50％，而第二种氨基酸被舍为25％。由于第一和第二氨基酸的舍入频率总和为75％，每种氨基酸加入到合成中的比例应为各自舍入频率除以总和75％所得的比值。因此，第一种氨基酸所加入的量为50％除以75％(66.7％)，第二种氨基酸所添加的量为25％除以75％(33.3％)。
步骤4还涉及的一个限制条件是可变残基处不超过4种氨基酸。例如，一个可变残基位点处出现了5种氨基酸，其频率大约都为20％，则每种氨基酸的舍入频率为25％。那么，所有非零舍入频率总和将为125％。然而，由于该步骤中可添加的最多氨基酸是4种，而需在5种氨基酸中选择最频繁出现的4种氨基酸，则非零舍入频率的总和为100％。在这种情况下，这4种最频繁出现的氨基酸中的每一种将被以25％的数量添加在可变残基处。
步骤6是合成肽混合物，其包括步骤5中选择的氨基酸。该步骤可采用任何可接受的肽合成方法，其使得氨基酸在具体残基处被选择性置入其中。可以采用已知的肽合成方法，如Fmoc化学法。该步骤的限制性条件是所形成的肽混合物不超过约100种不同的肽。可以使用下列方程式计算混合物总的不同肽的数目。
测定每种肽的可变残基的不同氨基酸的数目。将这些数目相乘即得到步骤6所形成的不同种肽的可能数目。
例如，合成出含有3个可变残基位点的11-mer肽。3个可变位点中的第一个具有4个不同氨基酸选择，而其余2个可变位点中的每一个都只具有2个不同的氨基酸选择。合成肽中的所有可能的不同肽数目为4×2×2＝16。对于不可变残基(11-mer中的其余8个氨基酸)，只能使用一种氨基酸。因此，非可变氨基酸不会引起可变性。
步骤6的另一个实例是，合成了具16个残基表位的肽混合物，其具有6个可变残基和10个非可变残基。每个可变残基具有2种氨基酸的选择。步骤6中合成的不同种肽的总数为2×2×2×2×2×2(或26)＝64。
步骤7中，采用任何可接受的方法，将步骤6形成的肽混合物进行纯化。例如，可采用冻干法和渗析法，并根据需要重复多次以确保肽的纯度。也可以采用硅胶纯化或其它肽分离的方法。
步骤8涉及确定肽混合物的组合物。这是一个质量控制步骤，当所得肽混合物是一种新的肽混合物，还没有开发出常规纯化方法时，该步骤显得更为重要。当整个程序都完成，对某一具体的疫原性肽混合物进行精制时，可选择该步骤。可进行氨基酸分析以确保所需基酸包含在HEC中。而且，可以采用HEC的SDS聚酰胺凝胶电泳(PAGE)来确认HEC中是否包含预定分子量范围的肽。
步骤9用以确定肽混合物的免疫性。再一次，如果合成的HEC是第一次得到，则采用该步骤是有利的。然而，当HEC的免疫性已知后，则无需再次确认每次合成物的有效性。为了测试免疫性，将纯化的HEC与适宜的药用载体以及适于人类使用的佐剂相混合。将该组合物施用于小鼠和/或恒河短尾猴以确定免疫性，如果构成了多个不同的HEC，则用以鉴定免疫原HEC组合物。在这个意义上，需要获得感染病源体主体的血清，然后测试血清中抗HECs的反应性以保证HECs的抗原性。
通常，制备HEC的方法源于这样的原理，即发现一种病源体的体内分离物中具有很多种蛋白，其相当于免疫原表位(如，那些激发T辅助性、CTL、和/或抗体应答的蛋白)。这些序列可以从数据库和/或同行阅读的科学性出版物中获得，然后校准。可变氨基酸位点被鉴定为可变残基，以及占据每个可变残基位点的不同氨基酸。在天然存在的20种氨基酸中，可变位点通常只被几个不同的氨基酸所占据。
根据本发明的一个实施例，采用固相肽合成和Fmoc化学，根据以下原则确定加入到特定步骤的氨基酸：(1)合成中偶合步骤中使用的氨基酸混合物不超过4种氨基酸，(2)任一偶合步骤中使用的每种氨基酸数量是基于出现在可变残基位点的每种氨基酸的频率确定的，该频率被舍入到最接近25％的数值，(3)如果两种或更多种氨基酸出现在一位点的频率低于25％，且这些氨基酸是化学结构或性质相似的，那么这些氨基酸的频率将被累计，再舍入到最接近其值的25％，只添加这些氨基酸中出现频率最高的氨基酸，以及(4)通过数学计算估计混合物中包含100种或更少的表位变体。
在每一个可变位点处，通过加入计算重量的氨基酸混合物，使加入的氨基酸与初链上的在先氨基酸相链接。加入比例通过测定体内已知序列而确定。因此，一种合成方法可以合成出全部的可变表位。为了证明HEC中的混合肽确实代表了所有的变体，对全部肽进行氨基酸测序以确证所需氨基酸的存在。
除了用于制备抗病疫苗以外，基于某一病源体的高可变表位的HECs还可用于诊断不易被常规血清检测法诊断出的病源体感染。当缺乏“广泛性”抗原时，就可能发生上述不易被检测的情况，所述的“广泛性”抗原是指其能够被所有感染个体的抗血清所识别而无需考虑个体所感染的病原体的菌株类型。
本发明还能用于制备组合物(或疫苗)，该组合物被用于免疫主体，如人类、灵长目、或其它动物，并能够在主体内诱导产生预防性抗体。将编码这些抗体的基因鉴定并分离出，基因产品能够依次被用作治疗剂，用于治疗组合物所针对的病原体感染的生物体。
HEC可以与各种免疫调节剂一同组成，以激发免疫系统的各种效应器，如CTL应答或粘膜免疫应答。
本发明涉及一种制备HEC的方法，该HEC体现了体内蛋白表位变体的序列。根据本发明的一个实施例，一种病原体的体内分离物的蛋白序列可从文献和/或数据库中获得。校准该序列，尤其是校准包含免疫原表位的蛋白区域。对目标表位的每一个位点出现的氨基酸的频率进行计算，使混合物只包含出现频率高于阈频率的氨基酸。该阈频率典型为约10至约30。无论高于上述阈频率的氨基酸的数目有多少，在合成的偶合步骤中使用的氨基酸不超过4种氨基酸。
偶合步骤所加入的氨基酸频率可以是舍入后的频率或是其本来频率。如果是舍入频率，该频率取其最接近的5％、10％或25％，以方便计算。如果一个位点上的两种或更多种氨基酸出现的频率都低于25％，而它们在化学结构或性质上属于相似氨基酸，这些氨基酸的频率可被累计并可进行舍入。这种情况下，只能加入这些氨基酸中最频繁出现的氨基酸，其加入比例与累计频率相当。计算出的合成后的肽混合物具有约100或更少的不同种肽。
混合物的合成是通过将出现频率(或舍入频率)高于阈频率的氨基酸以其频率相当的量在每个氨基酸偶合步骤中进行偶合而实现。以该方法，肽混合物的制备采用的是单一合成路径。对该混合物进行分析以确保组合物、抗原性和免疫原性。对用于衍生肽的蛋白质，该混合物能够产生与所衍生肽的蛋白质的广泛免疫反应，混合物中的每种肽都具有一序列，该序列相应于替代混合物所基于的表位的氨基酸变体。
本发明的肽混合物可以通过肽之间的交联而构成。或者，混合物中的肽可以被联于支撑聚合物上，该聚合物可以是合成的或天然的聚合材料，如载体蛋白。支撑聚合物的范例为衍生肽混合物的蛋白。有利地，将肽或肽混合物与支撑聚合物交联或结合有利于吸引免疫系统对肽混合物的注意，由此增强肽混合物的免疫性。这种方法还有利于肽混合物自身不足以产生免疫性的情况，通过结合或交联可以增强免疫性而达到有效水平。本领域已知的标准方法可被用于制备交联剂或将肽与该载体结合。
本发明的诊断试剂盒包含有效量的HEC，其能与感染HEC所针对的病原体的生物体内的抗体产生免疫反应。肽混合物中的每种肽具有一序列，该序列相当于替代与病原体所衍生的一种蛋白质相同的免疫原表位的氨基酸变体。
本发明的治疗用免疫原组合物的制备可以通过制备HEC，用HEC对动物，如灵长目进行免疫，获得抗体和基因而完成，该基因用于表达被诱导产生的所述抗体。这样的免疫原组合物或编码由免疫产生的抗体的基因信息可被施用于主体中。
本发明所使用的蛋白表位可以是来自人类1型或2型免疫缺陷病毒(HIV-1/2)、流感、人类乳头状瘤(HPV)、疟疾、登革热或旋毛虫中的一种蛋白表位。也可以是其它病原体的蛋白表位。
HEC或肽混合物可被悬浮于任何药用载体中。例如，HEC可被悬浮于盐水中。HEC还可与佐剂混合。
本发明涉及一种疫苗，其具有两种或多种HECs，该HECs是基于来自一种病原体的一种或多种蛋白而制得，所述病原体包含一种或多种表位，所述肽混合物就是以这些表位而衍生的。HECs的量可以是等摩尔的。等摩尔的所述肽混合物被交联或连接到支撑聚合物上。
在所述混合物的位点上添加氨基酸的频率只由该位点氨基酸的频率决定，而与蛋白序列或分离物的结构或长度无关。例如，如果一表位具有10个序列，其长度各自完全不同，决定在混合物的某一位点出添加氨基酸的频率只由该肽混合物所基于的表位中该位点上的不同氨基酸的全部数目来决定。一旦序列被校准后，无论这10个序列的长度如何，如果这10个序列的第二个位点上都具有同一氨基酸，那么100％的该氨基酸将被用于肽混合物的合成中。
当频率被四舍五入到其最接近的25％(或5％、10％或其它所选数值)时，本领域技术人员传统上的认识是任何两个整数的中间值都会被入到其上限值，而任何低于该中间值的数值都会被舍为其下限值。例如，出现在蛋白表位第三位点处的氨基酸占所有位点校准序列的30％，则其在该位点的舍入频率为25％。如果以38％的频率出现在表位的校准序列中，则其在肽混合物中该位点处的频率为50％。将出现频率为12％的氨基酸舍入最接近25％的数值时，其应被舍至0％，如果没有其它相似氨基酸可将该频率12％进行累计的话，该氨基酸将因此不会被包含在混合物中。
虽然，如实施例所描述的，本发明所设计的HECs是用于抗HIV-1、HCV和流感，但本发明还可用于制备抵抗由任何具有表位变体的人类或动物病原体所导致疾病的疫苗。本发明尤其利于用于抵抗由于多种表位变体而导致的难于诊断并防御的病原体。这些病原体包括，但不限于HIV-2、HPV、疟疾、登革热和锥虫病。
本发明的上述实施例只是用于举例而已。在不超出本发明的范围下，本领域技术人员能够进行有效变换，如利用可选择方案、修改和变换方式，但本发明的保护范围只由所附权利要求而限定。
总方法
以下方法被用于本发明，尤其参照下述实施例进行说明。
肽的合成
通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学，利用高容量(0.7mmol/g)Knorr树脂与1％二乙烯基苯交联剂，进行肽混合物的合成。该树脂用50％(v/v)哌啶：N′，N′-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中和两次。随后用DMF和甲醇洗涤。加入由频率计算所得的适宜摩尔量的氨基酸。室温下进行偶合2个小时。再次用DMF和甲醇洗涤树脂。为了用于以后确认偶合，用DMF洗涤，用50％(v/v)哌啶：DMF进行9分钟的脱保护。当最后的氨基酸偶合之后，用DMF和甲醇洗涤该树脂。加入90％三氟乙酸(TFA)，5％1，2-乙二醇(EDT)，5％水溶液至树脂中，以切除肽混合物并脱保护。在室温下放置树脂6-12个小时。然后用TFA和甲醇洗涤树脂。收集含有肽的TFA洗涤液。
用冷乙醚提取肽混合物。氮气氛围下浓缩肽/TFA溶液(约1ml)。将乙醚(25倍体积)加入到肽溶液中并混合。在干冰上放置5分钟，在1000Xg下离心样品5分钟，除去乙醚。提取过程重复三次。随后，用乙酸乙酯∶乙醚(v/v)(1.5∶1)提取肽混合物三次，提取方式与用乙醚提取方式相同。最后一次用薏米提取，残余物在氮气氛围下浓缩，再次将肽混合物悬浮于水中，并冻干。
HECs与载体蛋白的结合
合成之后，将一些HECs结合到载体蛋白上以增强其免疫性。结合时采用HEC∶载体蛋白＝100摩尔∶1摩尔。将蛋白和HECs溶于0.5M N-甲基-咪唑中，pH为6.0，浓度为lmg/ml。蛋白和HEC溶液相结合，加入50摩尔的1-乙基-3-(二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)/摩尔的HEC/蛋白溶液。在20℃下，搅拌混合物30分钟，然后在5％的乙酸缓冲液中进行透析(取舍值为10kDa)。随后在蒸馏两次的蒸馏水中透析，冻干疫苗，在20℃下，真空储存。
动物的免疫
小鼠选自杰克逊实验室(Bar Harbor，ME)。用100μg与KLH结合的单一序列肽(SSP)或HEC，或使用200μg不与载体结合的肽，对小鼠进行免疫。将免疫原溶解于无菌PBS中使用。初次免疫经鼠尾底部下进行，第二次免疫是在两个星期后以相同方式进行。
用HECs或HEC/载体蛋白复合物对恒河短尾猴免疫两次。每次免疫，每只猴子接受溶于250μlPBS和250μl Montanide ISA-51的500μgHECs或HEC/载体蛋白。充分振摇后，将乳液肌内注射至三角肌内。在初次免疫后的8周后出现反应。
ELISA检测
通过标准方法固相酶联免疫吸附检测(ELISA)进行HEC的应答测试。简言之，将HECs、肽或蛋白质溶于0.05M碳酸氢钠缓冲液中，其pH为9.5，然后置入平底微滴定板(Coming，NY)中。滴定板中，病毒的量为500ng/孔，蛋白质为1μg/孔。然后与待检血清混合，放置，用标记碱性磷酸酶的二级抗体(抗-小鼠或抗-猴子)(Fisher，Pittsburgh，PA)检测结合抗原的初级抗体。用自动板读取器(BioRad 3550)读取405nm处的光密度。
病毒感染的中和
在美国典型培养物中心(ATCC，Rockville，MD)提供的CEMx174细胞中生长病毒株。HIV-1分离物由NIH，NIAID储存库提供。利用该细胞系测定病毒滴度，并在中和检测中体现病毒感染性。将血清样品进行系列稀释(1∶20至1∶2560)，然后加入到96孔板中，一式三份。采用NIH储存库提供的HIV-1中和抗体的热灭活血清作为阳性对照。阴性对照包括未经试验用的猴子以及经免疫的所有试验动物的血清。加入50TCID50(50％组织培养物的感染剂量)病毒，将板放置1个小时。然后将CEMx174细胞以1×105细胞/孔的浓度加入到对照孔中(只有细胞)和病毒/抗体孔中。将培养板置入37℃的CO2培育箱中，每天检测合胞体的形成。8天时，检测一部分上清液的逆转录酶(RT)活性以测定血清的中和能力，10天时，使细胞与XTT，即2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-2H-四唑-5-羧苯胺(5-carboxanilide)(Sigma，St.Louis，MO)接触以检测细胞的存活率。预先免疫的血清没有引起RT活性。经检测，RT活性减弱超过50％的最高稀释度的血清具有强的中和抗体滴度。RT活性减弱30-50％的最高稀释度的血清具有弱的中和滴度。
T细胞增生应答
将抗原和促细胞分裂剂(PHA-P，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，以1至10μg/孔的浓度加入到96孔圆底培养板中，一式三份。取免疫后的猴子血液，用PBS稀释，比例为1∶2，铺于在Ficoll梯度(LSM，Organon Teknika Corp.，Durham，NC)上，并在室温下以200Xg离心30分钟。收集淋巴细胞，洗涤，计数，然后在包含10％FCS、L-谷氨酸和抗生素的RPMI-1640介质中，配成浓度为1×106个活细胞/ml。将0.1ml的淋巴细胞悬浮液加入到含有抗原的96孔板中的每个孔中。将培养板置入37℃、CO2环境中。与促细胞分裂剂一同培养3天或与抗原培养6天，与1μCi的3H-胸苷培养16-18个小时，然后立即用WallacTM收集器收集到玻璃纤维过滤纸上。加入闪烁水溶液(Scintisafe，Fisher Scientific)，在LKB Wallac 1209Rackβ液体闪烁计数器中测量与3H-胸苷一同培养的放射活性。用平均刺激指数(SI)表示结果，其是通过计算多于对照平均cpm的试验样品(抗原或促细胞分裂剂)的每分钟平均数量(CPM)而得到。平均SI值高于2的就属于具显著性。
CTL检测
将脾细胞悬浮于RPMI 1640组织培养介质中。为了进行特异性再刺激，将3×107应答细胞与1.5×106同源的、受抗原脉冲式作用的脾细胞(以20,000rad进行照射)，在25ml组织培养瓶中，于37℃，潮湿CO2氛围中，10ml介质中共同培养5天。对于非特异性再刺激，应答细胞在含有白介素-2(IL-2)的10IU/ml介质中培养过夜。5天后收集受抗原特异性和非特异性刺激的脾细胞，用介质洗涤2次；将这些细胞作为效应器细胞。用2×103 51Cr-标记的靶细胞(被抗原脉冲式作用4个小时的同源性脾细胞)在96圆底孔板中的200μl介质中稀释效应器细胞，然后测试效应器的特异性细胞溶活性。收集100μl上清液，用γ计数器计数。特异性溶解的细胞数计算如下：
Figure A0282870600231
用没有加入效应细胞的靶细胞中获得的数值表示自发释放数。全部释放数是洗涤溶液溶解标记的靶细胞后所测定的数值。
实施例
实施例1：基于HIV-1的HECs
由人类逆转录病毒和AIDS数据库(Los Alamos，1998)提供表位蛋白序列。基于该序列数据，将的HIV-1包膜糖蛋白(gp120)的5个区域作为可识别的高可变区域。这5个高可变区域包括抗体中和、CTL、和/或T辅助细胞表位(HIV分子免疫数据库，1998)。
中和表位上的每个位点的可能氨基酸由HIV-1进化枝B株的体内分离物的序列构成而测定，对每个表位的序列构成进行校准并进行评价。随后，使上述获得的序列数据所测定的适宜氨基酸的混合物进行合成中和表位的氨基酸偶合步骤。在合成中的每个氨基酸偶合步骤中重复该步骤。因此，在一次合成中，制备出一肽混合物，其表现了所有测得的中和表位的体内变体。
图3图示了本发明制备的HECs集合的典范示例，其显示出合成5个HIV-1HECs时，加入用于不变和可变残基的氨基酸。该HECs是基于HIV的包膜糖蛋白(gp120)的高可变区域的表位序列中所观察到的可变性。用于人类抗HIV-1疫苗的HECs合成集合包括5个不同的HIV-1 HECs。每个HECs包括100个以下的不同肽。对于5个表位中的每一个，都将HIV-1分化枝B株的gp120序列进行校准以测定可变性的模式和性质。将最经常观察到的高可变区域上的各位点处氨基酸加入肽合成中，其加入应遵守本发明的整体因素。更具体而言，利用Fmoc化学进行合成，其中某特定氨基酸的加入量是被舍入到其最接近的25％，且氨基酸偶合步骤中添加的氨基酸不超过4种。此外，HEC合成中得到的肽的数目不能超过100个不同肽。例如，所计算的这5个HIV-1 HEC中不同肽的数目分别为64，32，64，6，和4。
图3表示了所述肽混合物是指″HIV-1 HEC 1″，其在3，7，12，13，16，和18的氨基酸位点的氨基酸为两种氨基酸的混合物，而在其它位点都为一个氨基酸。二项式混合显示该肽混合物包含共64种不同肽。这是从含有单一氨基酸的每个位点的因子为1，而6个可变残基的每个因子为2的混合所得出。该表位的长度受到限制，其含有的不同肽不能超过100个。例如，如果任何附加的氨基酸位点包含超过一种氨基酸，则HIV-1 HEC 1不能进一步延伸，因为任何因子大于1的64种混合，都会导致肽混合物包含大于100个不同肽。
用HECs与适于人类使用的佐剂对两只恒河短尾猴(Macaca mulatta)进行免疫，对灵长目中的HIV-1 HECs的免疫性进行检测。在先前用5种HIV-1HECs进行动物免疫76周后，获取外周血淋巴细胞。当用HECs及代表HIV-1不同株的表位肽进行体外刺激时，PBLs大量增殖，如图4所示。图4还显示了用HIV-1 HECs对灵长目进行免疫，而诱导繁殖出应答HIV-1的不同亚型(进化枝A-E)的高可变V3环序列的T细胞。这些数据显示了强而持久、大范围反应的T辅助细胞记忆应答可以在用HIV-1 HECs对灵长目免疫后而诱导产生。
图5显示了用HIV-1 HECs免疫导致抗5种HECs混合及抗5种HECs单体的持久抗体应答。诱导产生直接抗HIV-1不同株gp120表位的广泛反应的T辅助细胞与结合HIV-1不同表位的广泛反应性抗体相关。在第一次免疫后，猴子产生了抗HIV-1 HEC1、HEC3、HEC4和HEC5的抗体，在第二次免疫后，产生了抗所有HECs的抗体。因此，立即用所有HECs进行免疫并不能阻止诱导产生对每种HECs的免疫应答。HIV-1 HEC 3是在第一次免疫后的两周内诱导应答产生，是所有5个HECs中产生抗体应答最强的。加强免疫后，抗体滴度增加到1∶40,000以上，尽管显示有缓慢降低趋势，其仍保持了22个月的高滴度。免疫后的猴子的健康状况评价良好，血液生化指标也正常。没有对间接的或行为方面的症状进行观察。利用分化枝B HIV-1株MN、RF和SF2的gp120超变量区域(V1-V5)中的表位检测经过免疫的猴子血清(包含抗体)中是否存在广泛反应性抗体。图6表示了用HIV-1 HECs进行第二次免疫的两周后，观察到抗所有类似物的抗体反应。两只猴子(25705和25598)的血清与所有3种HIV-1分离物中的肽类似物强结合。更重要的，两只猴子的抗体能够识别并结合到纯化的HIV-1 SF2重组gp120蛋白上。
图7显示了对免疫后的猴子产生的抗体进行抗不同HIV-1试验株和灵长目分离物的中和活性的检测。两只猴子产生的抗体能够中和灵长目HIV-1分离物89.6和HIV-1的HIV-1IIIB试验株。将已知的中和抗体血清作为阳性对照。数据显示用HIV-1 HECs对灵长目进行免疫可诱导产生T辅助细胞和抗各种HIV-1株的广泛反应性抗体应答。图8还显示了感染各种HIV-1株(分化枝)的个体都具有识别HIV-1 HECs的抗体。
图4-6的说明表明基于HIV-1包膜蛋白的肽混合物具有免疫原性。图8显示了其免疫原性，图7显示了其体外抗病毒复制的预防作用。
实施例2：基于丙型肝炎病毒表位的HECs
本发明设计了抗丙型肝炎病毒(HCV)的两个高可变区域的两种HECs。病毒体内分离物的序列由数据库和同行阅读的科学文献获得，对这些表位进行校准。根据本发明建立的原则，测定可变残基础所包含的氨基酸时，将氨基酸频率舍入至其最接近的25％，然后确定偶合步骤中所加入的氨基酸的比例。图9表示肽混合物中不同位点出现的氨基酸。用标准的Fmoc化学合成混合物。
尤其是，图9中的HCV HEC-1构成了24-mer，其在残基4位具有等量的酪氨酸(Y)和组氨酸(H)，在位点17具有等量的亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)，在位点18具有等量的丙氨酸(A)和(T)，在位点19具有等量的丝氨酸(S)和天冬氨酸(N)。不同肽的数目通过计算为2×2×2×2(或24)＝16。
实施例3：基于流感病毒表位的HECs
对于流感的多年研究，获得了重要信息，使得设计基于多变流感病毒的HECs成为可能。这些数据包括常规程序，如WHO和CDC这样的组织先鉴定所预测的第二年出现的流感病毒变体。简言之，从全球各种宿主体内获得野生分离物。在对病毒进行类型(A或B)鉴定后，用抗雪貂抗流感抗血清筛选出具交叉反应的病毒株，然后将其作为流感疫苗的作用对象。用一系列雪貂抗血清对这些病毒株作进一步筛选，以确定反应类型是否相同。这样确保不会发生变异。每年，大部分流感株的抗原性相同。但总有一些少数病毒株，产生独特的反应类型，对于这些株要进行详细研究，因为它们在将来也会成为主要病毒株。对这些独特的流感病毒株进行氨基酸排序。
图10描述了本发明制备的4种流感HECs，它们联合呈现了流感A的血凝素包膜蛋白上的抗原迁移结合位点。这些HECs与其它先前描述的HECs略有不同，其特征在于它们体现了流感包膜蛋白不连续表位所构成的高可变表位。设计每种流感HECs所选择的氨基酸并不是来自病毒表面蛋白上的一段连续的高可变氨基酸，而是，每种氨基酸都选自病毒蛋白的线性氨基酸序列的不同部分上的氨基酸，这些氨基酸从三维结构的角度考虑其位置是紧邻的。氨基酸在合成中的百分比来自于基因库和瑞士蛋白数据库所提供的流感A(包括5种猪流感A序列)的约61种人体分离物的基础上所获得的各个位点上的氨基酸。
与用HIV-1 HECs对猴子免疫后所获得的结果相同，用4种流感HECs诱导产生有效的T辅助细胞和抗体应答(图11和12)。更重要的，用HECs免疫诱导产生的T辅助细胞对所有失活的流感A病毒的体外刺激产生了应答(图11)。
一种呈现了表位的很多略微变化的HEC，能够有利于确保MHC分子高度多样性的远交种群中形成一种HEC，其包含有能够结合任何个体中代表免疫系统的MHC分子。因此，基于HEC的疫苗克服了MHC的限制。确实，图13和14显示了这一原理。图13显示了用一种代表猿免疫缺陷病毒(SIV)表位414-434的序列肽(SSP)对近交Balb/c小鼠进行免疫，导致产生与该肽结合的抗体。相反，用不同的MHC限制型对不同基因型的小鼠株(C57b1)进行免疫，却不能产生与该肽结合的抗体。然而，用基于该肽的HEC对无应答的小鼠(C57b1)和产生应答的小鼠Balb/c进行免疫，会导致抗体的产生，该抗体与病毒结合并与包含该表位的病毒蛋白结合(图14)。
实施例4：由SIV衍生的HEC与脂质部分的结合
除了能诱导产生有效T细胞和抗体应答以外，将HECs与脂质部分结合后，HECs还能诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)的应答。用于诱导CTLs的脂质-HECs是通过将Pam结合到与树脂结合的基于SIV的HECs上而制得。这是制备脂质-肽的标准方法。用脂质-HEC和佐剂(脂质-HEC)或用PBS和佐剂(A-PBS)对小鼠进行免疫，分离上述小鼠以及未经试验用小鼠的脾细胞，通过与HECs一起培养，而测试抗靶细胞的CTL活性。图15中显示的数据体现了减去非特异性裂解后的特异性裂解百分比。所观察到的特异性裂解来自只接受了两次免疫的动物。仅进行一次免疫，观察不到裂解现象(数据未显示)。图15表示用脂质-HECs免疫诱导产生明显的CTL活性。
脂质-HECs还可利用将棕榈酸的一种酯与未结合树脂的肽结合的方法进行制备。两种类型的脂质-HEC结合物在诱导免疫应答的作用相同，可以得出结论，即结合物的制备方法并不明显影响脂质-HECs的免疫原性。
实施例5：基于HIV1包膜糖蛋白制备组合物
图16显示了本发明制备的5种肽混合物(或组合物)的序列。这些序列是基于HIV-1包膜糖蛋白(gp120)的5个高可变区域。更具体而言，混合物对应于包含以下氨基酸序列的表位，以HIV-1株B.US.SF2为例：gp120-1，氨基酸130-155；gp120-2，氨基酸159-193；gp120-3，氨基酸307-333；gp120-4，氨基酸387-410；以及gp120-5，氨基酸456-471。在可变残基处，存在的两个或更多氨基酸的频率为25％或更高，将其舍入到其最接近的25％，在合成步骤中加入的两种或更多种氨基酸的量相当于其舍入频率。
本发明所形成的肽混合物包括多个不同肽，其反映了HIV-1包膜糖蛋白(gp120)中最常出现的可变氨基酸，同文献所报导的。具体而言，gp120-1至gp120-5是独立的肽混合物，其分别包含64，64，32，32和48种变体。
上述实施例只是用于举例说明。在不超出本发明的范围下，本领域技术人员能够进行有效变换，如利用可选择方案、修改和变换方式，但本发明的保护范围只由所附权利要求而限定。

Claims (31)

1.一种制备免疫原肽混合物的方法，其包括步骤：
获得病原体的免疫原表位序列，所述免疫原表位序列具有一共同残基区域和至少一种可变残基，该可变残基使所述序列各不相同；
测定免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率；
合成包含至多约100种不同肽的肽混合物，每种肽具有一共同残基区域和至少一种处于可变残基处的氨基酸，该氨基酸选自在免疫原表位序列的可变残基处出现频率大于约10％至约30％的阈频率的氨基酸。
2.权利要求1的方法，其中，阈频率为约12％。
3.权利要求1的方法，其中，肽混合物包括具有一种可变残基处的氨基酸的序列，该氨基酸选自免疫原表位序列的可变残基处出现频率最高的氨基酸，前提条件是肽混合物中的不同肽的可变残基处的氨基酸不超过4种氨基酸。
4.权利要求3的方法，其中合成肽混合物的步骤中，合成的肽中出现在可变残基处的不同氨基酸相当于免疫原表位序列的可变残基处出现的各氨基酸的频率。
5.权利要求1的方法，其中，可变残基处出现的氨基酸频率被舍入到其最接近的25％，而只有那些具非零舍入频率的氨基酸才被包含在肽混合物中的肽可变残基位点处。
6.权利要求5的方法，其中，肽混合物中的肽具有一特定氨基酸，其在可变残基位点处的频率相当于所述特定氨基酸的舍入频率。
7.权利要求6的方法，其中，当计算舍入频率时，累计可变残基处的相似氨基酸频率，将累计后的频率赋予给最频繁出现的相似氨基酸上。
8.权利要求7的方法，其中，只有可变残基处的各相似氨基酸的频率低于阈频率时，才累计相似氨基酸的频率。
9.权利要求7的方法，其中，当舍入各相似氨基酸的频率至其最接近的25％时，相似氨基酸的频率只有被累计才会达到25％或更高的舍入频率。
10.权利要求7的方法，其中，相似氨基酸选自组群：芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、带脂肪族羟基侧链的氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸、含酰胺的氨基酸和含硫的氨基酸。
11.权利要求5的方法，其中，合成步骤采用氨基酸的偶合进行，可变位点处通过加入氨基酸而进行偶合，其加入量相当于其舍入频率值。
12.权利要求1的方法，其中，所述免疫原表位序列包括2至7个可变残基。
13.权利要求1的方法，其中，肽混合物包含2至约64个不同肽。
14.权利要求1的方法，其中，至少一个步骤采用了生物信息学方法学。
15.一种制备免疫原肽混合物的方法，包括步骤：
获得病原体的免疫原表位序列，所述免疫原表位序列具有一共同残基区域和至少一种可变残基，该可变残基使所述序列各不相同；
测定免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率；
舍入可变残基处出现的氨基酸的频率至其最接近的25％；
合成包含至多约100种不同肽的肽混合物，每种肽具有一共同残基区域和一种处于可变残基处的氨基酸，该氨基酸选自最频繁出现在免疫原表位序列的可变残基处的氨基酸，条件是所述氨基酸的舍入频率不等于零。
16.权利要求15的方法，进一步包括步骤：
累计舍入频率低于25％的相似氨基酸的频率；
将累计频率赋予给最频繁出现的相似氨基酸；
舍入该累计频率至其最接近的25％；以及
在合成肽混合物的步骤中，加入非零舍入频率中最频繁出现的相似氨基酸。
17.对一种病原体具有免疫原性的肽混合物，所述混合物包括至多约100种不同的肽，每种肽具有一共同残基区域和一可变残基位点；
不同肽的共同残基区域是病原体免疫原表位序列的不变氨基酸，与其相邻的是一免疫原表位序列的可变残基；
可变残基位点被一种氨基酸所占据，该氨基酸选自免疫原表位序列的可变残基处最频繁出现的氨基酸，条件是：
(a)肽混合物中不同肽的可变残基位点处的不同氨基酸不超过4种氨基酸；和
(b)出现在免疫原表位序列的可变残基位点处的不同肽中的可变残基位点处的氨基酸频率大于约10％至约30％的阈频率。
18.权利要求17的肽混合物，其中，出现在可变残基位点处的氨基酸频率根据以下方案确定：
出现在免疫原表位序列的可变残基处的氨基酸频率被舍入到其最接近的25％，和
具有非零舍入频率的不同肽的可变残基位点处的氨基酸，其频率相当于舍入频率。
19.权利要求18的肽混合物，其中，舍入频率低于25％的相似氨基酸在可变残基位点处出现的频率由以下方案确定：
累计相似氨基酸的频率并将其舍入至其最接近的25％；
对于非零舍入频率，将该舍入频率赋予给最频繁出现的相似氨基酸；
不同肽的可变残基位点处最频繁出现的相似氨基酸的频率相当于舍入频率。
20.一种结合的肽组合物，其包括与脂质部分结合的权利要求17的肽混合物。
21.一种结合的肽组合物，其包括与载体蛋白部分结合的权利要求17的肽混合物。
22.一种包括权利要求17的多个肽混合物的免疫原组合物，其中，每个所述肽混合物对于相同病原体都具有免疫原性。
23.根据权利要求22所述的免疫原组合物，其中，所述多个肽混合物中的每一个都针对相同病原体的不同免疫原表位序列，不同免疫原表位序列处于病原体表面上的紧邻区域。
24.一种激发产生抗病原体的免疫应答疫苗，其包括权利要求17的肽混合物和可药用载体。
25.一种抗病原性疾病的疫苗接种方法，其包括将有效量的权利要求24的疫苗施用于主体。
26.一种诊断主体感染病原体的方法，该方法包括步骤：
从所述主体体内获得含有抗体的生物样品；
将该生物样品与权利要求1的免疫原肽混合物相接触，该肽混合物是基于该病原体的免疫原表位序列而制得；以及
评价所述样品与所述肽混合物的免疫应答。
27.一种检测主体感染病原体的诊断试剂盒，其包括：
权利要求1的免疫原肽混合物，该肽混合物是基于该病原体的免疫原表位序列而制得，和
评价含有抗体的主体生物样品与免疫原肽混合物的免疫应答的说明书。
28.一种分离对病原体具有抗性的抗体的方法，其包括步骤：
给主体施用权利要求17的肽混合物，和
获取主体中由施用肽混合物而诱导产生的抗体。
29.一种分离编码对病原体具有抗性的抗体的基因的方法，其包括步骤：
给主体施用权利要求17的肽混合物；
获取主体中由施用肽混合物而诱导产生的抗体；以及
分离编码该抗体的基因。
30.一种分离编码所有或部分与病原体具有反应性的抗体的部分基因或基因性物质的方法，包括步骤：
给主体施用权利要求17的肽混合物；
获取主体中由施用肽混合物而诱导产生的抗体、与病原体反应的部分抗体；以及
分离编码该抗体或部分抗体的所述部分基因或基因物质。
31.一种抗病原体的免疫疗法，其包括给主体施用由权利要求30的方法所获得的部分基因或基因物质所编码的肽或蛋白质。
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