JP2005531499A - 可変性ペプチドエピトープの免疫原性製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

一回の合成において免疫原性のペプチド混合物を製造する方法が開示される。上記ペプチド混合物は、病原体からの免疫原性エピトープに見られるインビボにおける可変性をひとまとめに表す。上記混合物は、超可変エピトープ構築物（ＨＥＣ）と呼ばれる。ＨＥＣによる免疫化は、ＨＥＣがそれに基づく、異なる系統の病原体に対して広く反応性である免疫を引き起こす。

Description

本発明は、一般的に、免疫原性製剤及びその製造方法に関する。より特別には、本発明は、タンパク質エピトープの可変残基において発生する選ばれたアミノ酸に基づく、免疫原性ペプチド混合物の製造方法に関する。

HIV-1及びHIV-2、インフルエンザ、A型／B型／C型肝炎、ヒトパピローマウイルス（HPV）、及びデングのようなウイルス、並びにマラリア及びトリキネラのような寄生虫を含む多くの病原体は、特別なタンパク質エピトープ内のアミノ酸配列を容易に変化させることができる。この挙動を考慮し、そして他の目的のために、合成ペプチドワクチンは、弱毒化又は不活性化されたワクチンの代替物として、ますます開発されている。有効な免疫性を与えるそれらのエピトープのみを選択することによって、病気の増悪又はT細胞抑制のような有害な免疫応答を引き起こすエピトープは、ワクチン候補から除外されることができる。さらに、それらが化学的に定義され、そしていずれの感染性物質を含まないことから、それらは最小限の健康に対するリスクを与える。最後に、決められた冷蔵温度において輸送そして貯蔵されなければならない生きた弱毒化ワクチンとは異なり、ペプチドワクチンは、比較的安定で冷蔵を要しないため、したがって、遠方への送達をより容易且つ安価なものとする。

近年、細菌、寄生虫、及びウイルスに対する防御について、合成ペプチドワクチンが評価されている。細菌エピトープワクチンは、コレラ及びシゲラに対するものを含む。マラリアに対する合成ワクチンは、ヒトにおけるフェーズＩ及びフェーズII臨床試験を行った。インフルエンザ及びB型肝炎ウイルスは、合成ワクチンが特別に期待される２のウイルスシステムを代表し、最近、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対する合成ワクチンには多くの興味が向けられてきた。

最近の進歩にもかかわらず、合成ペプチドワクチンは、エンベロープ又は表面タンパク質の可変性を説明することができなかった。いくつかのグループが、過去において多様なアプローチを用いてエピトープの可変性を説明しようと試みた。エピトープの可変性に向かう一つのアプローチは、Tamによって米国特許第５，２２９，４９０号（１９９３年７月２０日）中に記載された。この方法は、リジン官能基及びグリシンリンカー（樹枝状ポリマーと呼ばれる）を使用していくつかの類似した又は異なるエピトープを免疫原性のコアに、結合させることを含む。この方法は、多抗原ペプチドシステム（MAPS）と呼ばれる。高度に免疫原性である一方、HIVに基づくMAPSは、ウイルスのお互いに異なる系統を認識することのできる広く反応性である抗体を誘導することを証明されていない（Nardelli et al. (1992)J Immunol 148: 914-920）。

他の早期のアプローチは、抗原性エピトープを擬態する、ランダムに作り出された配列である「ミノトープ」の同定を含んだ（Lenstra et al. (1992) J Immunol Methods 152:149-157）。このアプローチを用いて、変性オリゴヌクレオチドが細菌発現ベクター中へ挿入され、６〜８アミノ酸の長さのランダムなペプチドの発現ライブラリーが得られた。抗原エピトープを擬態するそれらのぺプチドは、着目の病原体に感染した動物または人間からの（抗体を含む）血清を用いて同定される。実際、この一般的なアプローチが、HCV-感染した個人からの血清によって認識されたミノトープの同定に使用された（Prezzi et al. (1996)J Immunol 156 4504-4513）。しかしながら、ペプチドはランダムに選ばれ、そしてミノトープ組成物を製剤するためには、感染対象からの血清を入手して分析することが必要である。

感染した個人からの血清を必要とする従来技術によるアプローチのさらなる不利益は、多くの感染した個人が適切な抗‐抗原抗体をうまく作り出すことができないということである。したがって、患者血清を用いて着目のペプチドを選択することは、感染した個人がそれに対して免疫応答をおこすことができなかったエピトープを擬態する重要な抗原ペプチドの脱落に、潜在的に導きうるものであった。

ヒトのHIV感染のSIV：アカゲザルモデルを用いて、B細胞によるSIVエンベロープ糖タンパク質の中和及びT細胞エピトープが説明され、SIVmac１４２エンベロープ糖タンパク質（gp１３０）の超可変且つ高度に抗原性であるエピトープに基づいて、合成免疫原が設計され、そして合成された（Anderson et al.(1994) Vaccine 12:736-740）。ペプチド混合物から成るこの合成免疫原は、SIVエンベロープの遺伝子配列中に見出されるアミノ酸置換の並べ替えを表している。したがって、合成免疫原は、この特別なエピトープについて観察されるすべてのインビボにおける可変性をひとまとめに表した。この合成免疫原の免疫原性は、評価され、そして免疫化アカゲザルにおける自然の生物学的SIVに結合する抗体量の増加を誘導することが示された。さらに、それは、お互いに異なるエピトープアナログへの免疫反応性を高めた。本明細書及び以下の刊行物（Meyer et al (1998) AIDS Res Human Retro 14 :751-760）において、このアプローチがエピトープの可変性を説明することができたことが実証された。

近年、T細胞がそれらのペプチド抗原の認識において変性することが明らかとなった。この発見は、なんらかの外来抗原がなんらかの自己抗原を擬態し、そして自己反応性T細胞の活性化及び自己免疫疾患の発病へ間違って導くという懸念をもたらした。結局、ランダムに合成されたペプチド混合物による動物又はヒトの免疫化に関連する自己免疫疾患の危険性が存在する。ミノトープによる方法（Lenstra et al(1992) J Immunol Methods 152:149-157）は、感染動物又はヒトからの血清を用いて、ランダムに合成されたペプチド混合物から免疫化のためのペプチド亜群を選択し、そのようにして自己免疫疾患の危険性を減少させる。しかしながら、上記の合成免疫原性製剤（Anderson et al(1994)Vaccine 12:736-740; Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14:751-760）は、完全にランダムなペプチド混合物を含まない。それはなぜなら、作り出されたペプチドは、合成反応のいくつかのステップにおいて付加された、可能な２０アミノ酸のうちのいくつかのみに基づくからである。それにも拘わらず、従来技術において記載されたような合成免疫原性製剤は、８，０００を超える異なるペプチド抗原を含むことができる。この方法が広い反応性を有する免疫性を発生させた一方、上記製剤は生物化学的又は免疫学的な特徴づけをするには複雑すぎて、且つそのような化合物によるヒトの免疫化は自己免疫疾患の顕著な危険性を伴う。さらに、完全な組成分析をせずに、混合ペプチド組成物の規制許可を得ることはおそらく不可能であろう。何百または何千の異なるペプチドを含む混合ペプチド組成物についての完全な組成分析は、極端に時間がかかり、費用効果の低いものとなる可能性がある。

先に記載した合成免疫原性製剤の多くが何万もの異なるペプチドの混合物である。T細胞がそれらの外来抗原の認識において変性しているとすると、ペプチド混合物であるこの複合体は、自己抗原を擬態するペプチドを含む危険性を有し、そしてこれらのペプチドは免疫化によって病原性の自己免疫応答を誘導することができる。さらに、同じ組成を有する多数の個々の生成物の質を科学的に定義及び評価することが不可能でない場合、先の合成スキームの複雑性はそれを困難にした。

このことに基づいて、最適の免疫原性を保持する一方、従来技術において記載されたものよりもより単純な複合体製剤を得る、免疫原性ペプチド混合物の設計のための新しい方法が必要である。そのような新しい方法は、そのような混合物をヒトへの使用のために製造及び分析することを可能とするだろう。さらに、合成反応において形成される混合物の完全性及び抗原性を確実にするために、そのような製造において行われるアッセイの開発が必要である。

発明の要約
本発明の目的は、従前の免疫原性製剤又はそのような製剤の従前の製造方法の少なくとも１の不利益を回避し、又は軽減することである。

本発明は、インビボにおいて観察されたタンパク質エピトープの配列異形を表すペプチド混合物を形成する方法を提供する。そのようにして形成されたペプチド混合物は反応性の広い免疫性を引きおこし、ウイルス及び寄生虫のような病原性生物に対するワクチン、治療剤、及び診断キットの製造に有用である。上記方法は病原性生物における広範囲のエピトープに適用可能である。

本発明は、超可変エピトープ構築物（HEC）と呼ばれる、ペプチド混合物の製造方法を提供し、該ペプチド混合物は、免疫原性エピトープに見られるインビボにおける可変性をひとまとめにして表すが、その組成は分析を可能とするのに充分単純である。この混合物は、エピトープ内に見出されるアミノ酸置換の並べ替えを表す。対象をペプチド混合物によって免疫化することによって、強力なTヘルパー細胞及びB細胞応答が誘導され、それは、関連性の遠い固有の病原タンパク質への結合が亢進された抗体の高い力価を生じる。さらに、これらの抗体は、HECがそれに基づくところの系統の異なる病原体の感染性を中和することができる。

第一の側面において、本発明は、免疫原性ペプチド混合物の製造方法であって、以下のステップ：病原体の免疫原性エピトープの配列を得ること、ここで該免疫原性エピトープの配列は共通残基領域及び配列がそれによって相互に相違する、少なくとも１の可変残基を含む；免疫原性エピトープ配列の可変残基において見出される異なるアミノ酸の出現頻度を決定すること；及び、約１００以下の異なるペプチドを含むペプチド混合物を合成すること、ここで、各ペプチドは共通残基領域、及び免疫原性エピトープ配列の可変残基において約１０％〜約３０％の頻度閾値よりも高い出現頻度で見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を、可変残基の位置に有する；を含むものを提供する。

さらに、本発明は、免疫原性ペプチド混合物の製造方法であって、以下のステップ：病原体の免疫原性エピトープ配列を得ること、ここで、該免疫原性エピトープは共通残基領域、及びそれによって配列が相互に相違する、少なくとも１の可変残基を含む；免疫原性エピトープ配列の可変残基において見出される異なるアミノ酸の出現頻度を決定すること；可変残基において見出されるアミノ酸の出現頻度を至近２５％に概数化すること；及び約１００以下の異なるペプチドを含むペプチド混合物を合成すること、ここで、各ペプチドは共通残基領域、及び可変残基位置において、アミノ酸の概数化された出現頻度がゼロでないという条件下で、免疫原性エピトープ配列の可変残基において最も高頻度で見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を有する；ここで、上記可変残基位置が２〜４の異なるアミノ酸から選ばれ、上記２〜４の異なるアミノ酸のそれぞれがその概数化された出現頻度に比例してペプチド混合物中に表される；を含むものを提供する。

さらなる実施態様において、ある病原体に対して免疫原性であるペプチド混合物が提供され、ここで、該混合物は以下の：各ペプチドが共通残基領域及び可変残基位置を有する、約１００以下の異なるペプチド；免疫原性エピトープ配列の可変性領域に隣接し、病原体の免疫原性エピトープ配列の非可変性アミノ酸である、異なるペプチドの共通残基領域；及び、可変残基位置であって、以下の：（ａ）４以下の異なるアミノ酸がペプチド混合物の異なるペプチドの可変残基の位置に存在し；且つ（ｂ）異なるペプチドの可変残基位置に存在するアミノ酸は、約１０％〜約３０％の頻度閾値よりも高い出現頻度で免疫原性エピトープ配列の可変残基において出現する；という条件下で、免疫原性エピトープ配列の可変残基において最も高頻度に発生するアミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸によって占められる上記可変残基位置；を含む。

本発明は、免疫原性組成物の製造のための従前のアプローチとは、それがヒトにおいて使用されるワクチンの設計に好適な方法作製のために改変され、本来の免疫原性エピトープ配列中に見出される可変性を高度に表す少数のペプチドに該組成物が限定される点において異なる。

本発明は、超可変エピトープ構築物（ＨＥＣ）と呼ばれるペプチド混合物を含む、免疫原性製剤の単純な製造方法を提供する。方法のペプチド合成部分は、本分野において知られた化学合成方法を使用する「ワンステージ」法として、単純に実施されることができる。

有益には、本発明は、最小限の合成ステップでペプチドの大きなプールを作製する、本発明の方法を用いて合成された、異なるウイルスエピトープに基づく多様なＨＥＣを提供する。作製される異なるペプチドの数は、免疫原性製剤の完全な組成が予想され、且つ分析によって実証されることのできるような方法で制御される。発明のＨＥＣは、ペプチドがそれに由来するタンパク質との広い免疫反応を生み出すことができる。

有益には、ＨＥＣによる免疫化の後、誘導された異なる系統の病原体との広い免疫学的反応性は、病原体の感染性の中和の亢進に導く。

発明のＨＥＣは、世界的なヒトワクチンの開発に対する共通の障壁である、主要組織適合性（ＭＨＣ）拘束を克服することができる。さらに、ＨＥＣは、細胞性（ＣＴＬ）免疫応答を誘導するように改変されることができる。ワクチンに加えて、ＨＥＣは診断キットの基礎として使用されることができる。

本発明の他の側面及び特徴は、以下の本発明の特別の実施態様についての記載を付随する図面に関連して総覧することによって当業者に明らかとなるであろう。

詳細な説明
一般的には、本発明は免疫原性ペプチド混合物又は超可変エピトープ構築物（ＨＥＣ）の製造方法を提供する。

１の実施態様において、免疫原性ペプチド混合物の製造方法は以下のステップを含む。共通残基領域、及び配列がそれによって相互に相違する、少なくとも１の可変残基を有する、病原体の免疫原性エピトープ配列が得られる。免疫原性エピトープ配列の可変残基において見出される異なるアミノ酸の出現頻度が決定される。その後、約１００以下の異なるペプチドを含み、各ペプチドが共通残基領域、及び免疫原性エピトープ配列の可変残基において、約１０％〜約３０％の頻度閾値よりも高頻度で見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を可変残基位置に有する、ペプチド混合物が合成される。この実施態様によれば、ペプチド混合物は、免疫原性エピトープ配列中の可変残基として最も高頻度に見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を可変残基において有し、場合により、４以下の異なるアミノ酸がペプチド混合物中の異なるペプチドの可変性残基位置において現れるという制約が伴う、配列を含む。

ペプチド混合物の合成ステップの間、可変残基位置において現れる異なるアミノ酸は、免疫原性エピトープ配列の可変残基において現れる各異なるアミノ酸の出現頻度に比例して相互に相対的に存在する。可変残基において見出されるアミノ酸の出現頻度は、至近２５％と概数化されることができ、アミノ酸は、ペプチド混合物のペプチド中の可変残基位置において含まれるゼロでない出現頻度を有するもののみから選ばれることができる。この場合、ペプチド混合物のペプチドは、その概数化された出現頻度に比例した出現頻度で可変性残基位置において存在する所定のアミノ酸を有することができる。

場合により、可変残基において見出される類似のアミノ酸の出現頻度は、プールされることができ、プールされた出現頻度はその後概数化された出現頻度を計算する時に、類似するアミノ酸に見出された最高頻度に割り当てられる。この場合の任意の但し書きとして、類似するアミノ酸がそれぞれ、頻度閾値未満の出現頻度を有する場合にのみ、可変残基において見出される類似するアミノ酸の出現頻度はプールされる。類似するアミノ酸の出現頻度は、各類似するアミノ酸の出現頻度を至近２５％に概数化した上で、２５％以上の概数化された出現頻度を有する類似するアミノ酸がない場合に、プールされることができる。

本発明によれば、「類似する」アミノ酸は、以下の：芳香族アミノ酸；脂肪族アミノ酸；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸；塩基性アミノ酸；酸性アミノ酸；アミド含有アミノ酸；及び含硫アミノ酸からなる群からの一般的な群中に見出されるアミノ酸から選ばれる。

本発明によれば、合成ステップは、アミノ酸結合を用いて行われることができ、ここで、可変残基位置は、その概数化された出現頻度に比例してアミノ酸を付加することによって結合される。本発明はまた、バイオインフォマティックス方法論を用いて行われる１以上のステップも含むことができる。

場合により、免疫原性エピトープ配列は２〜７の可変残基を含み、２〜約６４の異なるペプチドを含むペプチド混合物を得ることができる。

本発明はまた、特別には以下の、わずかに異なる一連のステップを含む、免疫原性のペプチド混合物の製造方法に関する。共通残基領域、及びそれによってそれらが相互に相違するところの少なくとも１の可変残基を有する病原体の免疫原性エピトープ配列が得られる。異なるアミノ酸が免疫原性エピトープ配列の可変残基に見出される出現頻度が決定され、至近２５％に概数化される。その後、約１００以下の異なるペプチドであって、それぞれが共通残基領域を有し、及び可変残基位置において、概数化された出現頻度がゼロでないという条件下で、免疫原性エピトープ配列の可変残基において最も高頻度で見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を有する、ペプチド混合物が合成される。この方法によれば、可変残基位置は、そのそれぞれがその概数化された出現頻度に比例した量でペプチド混合物中に表される、２〜４の異なるアミノ酸から選ばれる。

この方法は、追加の以下のステップ：２５％未満の概数化された出現頻度を有する類似するアミノ酸の出現頻度をプールすること；プールされた出現頻度を類似するアミノ酸の最も高頻度で出現したアミノ酸に割り当てること；プールされた出現頻度を至近２５％に概数化すること；そしてゼロでない概数化された出現頻度については、ペプチド混合物の合成ステップ中の類似するアミノ酸の最高出現頻度を含めること；を含むことができる。

本発明はまた、病原体に対して免疫原性であるペプチド混合物に関する。該混合物は、そのそれぞれが共通残基領域及び可変残基位置を有する、約１００以下の異なるペプチドを含む。異なるペプチドの共通残基領域は、免疫原性エピトープ配列の可変残基に隣接する、病原体の免疫原性エピトープ配列の非可変アミノ酸から形成される。可変残基位置は、以下の：（ａ）ペプチド混合物の異なるペプチドの可変残基位置には、４以下の異なるアミノ酸が存在し；且つ（ｂ）異なるペプチドの可変残基位置に存在するアミノ酸は、約１０％〜約３０％の頻度閾値よりも高頻度で免疫原性エピトープ配列の可変残基において現れる；という条件下で、免疫原性エピトープ配列の可変残基において最も高頻度に発生するアミノ酸から選ばれるアミノ酸によって占められる。アミノ酸が可変残基位置に現れる出現頻度は、以下のスキーム：アミノ酸が免疫原性エピトープ配列の可変残基において発生する出現頻度を至近２５％に概数化し、ゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸が異なるペプチドの可変残基位置において、概数化された出現頻度に比例した出現頻度で見出される；によって決定されることができる。

概数化された出現頻度が２５％未満である類似するアミノ酸が可変残基位置において現れる出現頻度は、類似するアミノ酸の出現頻度をプールし、そしてプールした値を至近２５％に概数化することによって決定されることができる。ゼロでない概数化された出現頻度については、概数化された出現頻度は、最も高頻度で発生する類似するアミノ酸に割り当てられる。この実施例によれば、最も高頻度で発生する類似するアミノ酸は、異なるペプチドの可変残基位置において、概数化された出現頻度に比例する出現頻度で見出される。

結合ペプチド組成物は、液体部分に結合した、又はタンパク質担体部分に結合した発明のペプチド混合物を含む本発明によって形成されることができる。

発明の免疫原性組成物は、本発明の方法によって形成された複数のペプチド混合物を含むことができ、ここで、各ペプチド混合物は同じ病原体に対して免疫原性である。場合により、本発明の免疫原性組成物は、同じ病原体の異なる免疫原性エピトープに対する複数のペプチド混合物を含むことができ、上記異なる免疫原性エピトープは、病原体表面上の密接した近傍領域に見出されることができる。

病原体に対する免疫原性の応答を引き起こすワクチンが本発明によって形成されることができる。上記ワクチンは、発明のペプチド組成物を薬剤として許容可能な担体とともに含む。したがって、病原性の病気に対する本発明によるワクチン接種の方法は、このワクチンの有効量を対象に投与するステップを含む。

病原体による対象の感染の診断方法は本発明の範囲に含まれる。上記方法は、以下のステップ：抗体を含む生物学的サンプルを対象から得ること；上記生物学的サンプルを、病原体の免疫原性エピトープ配列に基づく本発明の免疫原性ペプチド混合物と接触させること；及びペプチド混合物との、上記サンプルの免疫原性の応答を評価すること；を含む。病原体による対象の感染を決定するための診断キットは、病原体の免疫原性エピトープ配列に基づく本発明の免疫原性ペプチド混合物を、免疫原性ペプチド混合物との、抗体を含む対象の生物学的サンプルの免疫原性の応答を評価するための指導書とともに含むことができる。

さらに、本発明は、病原体に対して免疫原性である抗体を単離するための方法であって、以下のステップ：対象に本発明のペプチド混合物を投与すること；及び上記対象から、病原体に対して反応性である抗体又は抗体の一部を得ること、ここで上記抗体はペプチド混合物の投与によって誘導される；を含むものを提供する。

病原体に対して免疫原性である抗体をコードする遺伝子の単離方法は、本発明のさらなる側面によって行われることができる。該方法は以下のステップ：本発明のペプチド混合物を対象に投与すること；ペプチド混合物の投与によって誘導された抗体を対象から得ること；及び抗体をコードする遺伝子を単離すること；を含む。同様に、病原体に対して免疫原性である抗体をコードする遺伝子又は遺伝物質の部分の単離方法は、本発明によって行われることができ、以下のステップ：本発明のペプチド混合物を対象に投与すること；ペプチド混合物の投与によって誘導された抗体を対象から得ること；及び抗体をコードする遺伝子又は遺伝物質の部分を単離すること；を含む。したがって、病原体に対する免疫療法は、本発明によって得られた遺伝子又は遺伝物質の部分によってコードされるペプチド又はタンパク質の投与を含んで、開発されることができる。

本発明による免疫原性の混合物の製造方法は、科学的データベース又は専門的な科学的刊行物中に報告された、所定の病原体の天然の配列の総合的な調査から始まる。これは、合成中に製造される異なるペプチドの数を減少させることに役立つ。付加されるアミノ酸及びペプチド合成反応中のどのステップにおいてそれらが付加されるかは、知られたＴヘルパー細胞及びＢ細胞中和エピトープにわたる配列の最初の整列の後に、特異的な方法のステップによって事前に決定される。超可変エピトープ構築物（ＨＥＣ）と呼ばれる、得られたペプチド混合物は、初期のペプチド鎖上の先に構築されたアミノ酸に連結される、統計的に偏ったアミノ酸混合物を付加することによる、一回のペプチド合成中で生成されるエピトープ配列の並べ替えを表す。したがって、ミノトープとは異なり、ＨＥＣ中に含まれるペプチドは、完全にランダムではなく、着目の抗原エピトープを表すことがすでに期待される。この理由によって、着目のエピトープを単離するために、感染動物又は患者からの血清を使用することは不必要である。ペプチド合成反応が適切に行われたことを確認するための質のコントロールの側面として、病原体に感染した個体からの血清に対する反応性についてＨＥＣを試験することができる。ＨＥＣ中に含まれる個々のペプチドを選択するために患者血清が使用されることがないということは、従来技術によるミノトープアプローチとの基本的な相違である。

本発明は、エピトープの可変性を説明するために開発された単純な方法を表す。固相ペプチド合成の間、アミノ酸は成長するペプチド鎖を形成する各サイクルにおいて、樹脂ビーズに「結合される」か又は付加される。特別なサイクルにおいて付加されるアミノ酸のパーセンテージは、アミノ酸がエピトープの特別な位置において見出される出現頻度に基づいて、本発明によって計算される。この情報は、研究室においてアミノ酸配列決定を通じて直接に得られたデータに由来する配列情報に基くか、又は配列データベースから得られたインビボの配列データ、及び／又は専門的な科学的文献に由来する。発明の免疫原性ペプチド混合物又はＨＥＣは、タンパク質エピトープ中に見出されるアミノ酸置換の並べ替えを表すペプチド混合物から成る。

図１に、ＨＥＣの製造方法の模式的ダイアグラムを例解する。すなわち、ステップ１において、病原体の免疫原性エピトープの配列が得られる。該エピトープは、多様な既知の配列中の異なるアミノ酸によって表される、少なくとも１の可変残基を有する。各異なるアミノ酸がエピトープ配列の可変残基において発生する出現頻度は、ステップ２において決定され、そして所定の頻度閾値と比較される。頻度閾値は、エピトープ配列中で比較的少量あらわされるアミノ酸が閾値以下に含まれ、したがって、得られるペプチド混合物中にはあらわされないように、設定される。頻度閾値を満たすアミノ酸は、ペプチド合成の間のステップ３において可変残基位置における付加のための候補である。頻度閾値以下の量で表されるアミノ酸はペプチド合成の間、可変残基位置では使用されない。最終的に、ペプチド混合物の合成は、可変残基位置において、頻度閾値を超えるアミノ酸が免疫原性エピトープ中での発生出現頻度に比例する量で付加されるように、いずれかの合成経路を用いて行われる。頻度閾値は、１０％〜３０％の範囲であることができ、得られた合成ペプチド混合物は約１００を超える異なる配列を含むような、あまり複雑のものであってはならない。

ＨＥＣの製造方法の模式的ダイアグラムを図２に例解する。すなわち、ステップ１においては、所定の病原体のインビボにおける単離物のタンパク質配列が、データベース又は専門的な刊行物のような適切な供給源から得られる。タンパク質配列は、特別には免疫原性Ｂ細胞中和、ＣＴＬ、又はもしあれば、ヘルパーエピトープに関して整列される。本発明において使用される所定のタンパク質配列中の特異的な免疫原性Ｂ細胞中和、ＣＴＬ、又はヘルパーエピトープを同定する必要のないことは注意すること。免疫システムのなんらかの側面が標的として選んだタンパク質の領域をエピトープが表すにもかかわらず、エピトープが本発明において使用されるために免疫システムが作用するメカニズムを同定することは必要でない。

ステップ２において、アミノ酸が着目のエピトープ内の各位置において現れる出現頻度が決定される。１を超えるアミノ酸が現れる位置については、該アミノ酸はステップ３〜６中に定義された特別な規則の組にしたがってペプチド混合物中に含まれる。特別には、可変残基位置における各アミノ酸の出現頻度は至近２５％に概数化される（ステップ３）。例えば、１３％の出現頻度が切り上げられて２５％とされる一方、１２％の出現頻度は切り下げられて０％とされる。

ステップ４において、可変残基において存在するが、出現頻度の概数が２５％未満である類似するアミノ酸については、出現頻度はプールされ、そしてプールされた出現頻度は最も高頻度で発生する類似するアミノ酸に割り当てられる。この値はその後至近２５％に概数化される。

類似するアミノ酸は、それらを保存的に交換可能とする、類似する化学構造又は性質を有すると考えられる。そのような類似するアミノ酸の例は、脂肪族アミノ酸（Gly、Ala、Val、Leu 、Ile、及びPro）、脂肪族ヒドロキシル側鎖を含むアミノ酸（Ser、Thr）、含流アミノ酸（Cys、Met）、芳香族アミノ酸（Phe、Tyr、及びTrp）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg 、及びHis）、酸性アミノ酸（Asp、Glu）及びアミドを含むアミノ酸（Asn、Gln）である。

このステップの例として、メチオニンが１０％の出現頻度で存在し、そしてシステインが８％の出現頻度で存在する場合、どちらのアミノ酸も単独では２５％と概数化されることはできない。しかしながら、メチオニンとシステインが類似するアミノ酸であるために（どちらも含硫アミノ酸である）、それらの出現頻度は一緒に加算されて、１８％のプールされた出現頻度を成し、それは２５％と概数化され、そしてこの出現頻度はその後、可変残基においてシステインよりも高頻度で発生するメチオニンに割り当てられる。

ステップ５において、可変残基において見出され、ゼロでない概数化された出現頻度（例えば、２５％、５０％、７５％又は１００％の出現頻度）を有するアミノ酸が、ペプチド合成の間にそれらの概数化された出現頻度に比例する量で付加される。もし、概数化された出現頻度の合計が１００％に満たない場合、概数化された出現頻度の合計は可変残基においてアミノ酸を付加するときに使用する比例パーセンテージに達するように、それによって各概数化された出現頻度が割られる分母として使用される。例えば、第１アミノ酸が６０％の出現頻度で可変残基に存在し、第２アミノ酸が３０％の出現頻度で可変残基に存在する場合、他のアミノ酸又はプールされたアミノ酸の組み合わせはゼロでない出現頻度で存在すると概数化されない。したがって、第１アミノ酸は５０％と切り下げられ、第２のアミノ酸は２５％と切り下げられる。第１及び第２の概数化された出現頻度の合計が７５％であるため、合成の間に付加される各アミノ酸の比率は、各概数化された出現頻度を合計である７５％で割ることによって計算されることができる。したがて、第１のアミノ酸が５０％割る７５％（又は６６．７％）の量で付加され、第２のアミノ酸は２５％割る７５％（又は３３．３％）の量で付加される。

ステップ４はまた、可変残基については４以下のアミノ酸が選ばれるという但し書きを含む。この場合、例えば、５の異なるアミノ酸が可変残基位置において約２０％の等しい出現頻度で発生する場合、各アミノ酸は２５％の概数化された出現頻度を有する。したがって、すべてのゼロでない概数化された出現頻度の合計は１２５％となる。しかしながら、４のアミノ酸の最大値がこのステップにおいて合算されることができるため、５の異なるアミノ酸のうちの最も高頻度で発生する４つが選択され、そしてゼロでない出現頻度の合計が１００％となる。この場合、４つの最も高頻度で発生するアミノ酸のそれぞれが、この可変残基において２５％の量で加えられる。

ステップ６においては、ステップ５において選択されたアミノ酸を含むペプチド混合物が合成される。特別な残基におけるアミノ酸の選択的配置を可能とする、いずれかの許容可能なペプチド合成法を使用してこのステップは実施されることができる。Fmoc化学のような、知られたペプチド合成法が使用されることができる。このステップは、１００以下の異なるペプチドが混合物中に見出されるという但し書きを含む。混合物中に存在するであろう異なるペプチドの数を計算するために、以下の式が使用されることができる。

ペプチドの各可変残基について、存在することのできる異なるアミノ酸の数が決定される。これらの数は、ステップ６において形成された異なる可能なペプチドの数に達するまえ、かけ合わせられる。

例えば、３の可変残基位置を有する１１-merが作製される。３の可変位置のうちの１番目は４の異なるアミノ酸選択肢を有するが、残りの２の可変位置はそれぞれ２の異なるアミノ酸の選択肢のみを有する。形成される異なる可能なペプチドの合計数は以下の：４×２×２＝１６のように計算される。非可変残基（１１-merのうちの残りの８のアミノ酸）については、１のアミノ酸のみが使用されることができる。したがって、非可変アミノ酸によって導入されるさらなる可変性はない。

ステップ６のさらなる例として、１６残基のエピトープに基づくペプチド混合物が、６の可変残基及び１０の非可変残基を有するものとして形成される。各可変残基は２のアミノ酸の選択肢を有する。ステップ６において形成される異なるペプチドの総数は、２×２×２×２×２×２（又は２⁶）＝６４と、計算されることができる。

ステップ７においては、ステップ６において形成されたペプチド混合物がいずれかの許容可能な方法によって精製される。例えば、凍結乾燥及び透析が実施されることができ、そしてペプチドの純度を確実にするのに必要な回数繰り返される。ゲル精製又は他のペプチド分離方法が使用されることができる。

ステップ８は、ペプチド混合物の組成の確認を含む。これは、そのためのルーチンの精製が未だ開発されていない、新しいペプチド混合物について行う場合、重要であることのできる質のコントロールステップである。特別な免疫原性ペプチド混合物についての完全な手順がいったん作られ、完成されると、このステップは任意であることができる。混合物の期待されたアミノ酸がHEC中に含まれることを確認するために、アミノ酸分析が使用されることができる。さらに、HECのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）が、HECが期待された分子量の範囲内のペプチドを含むことを確認するために使用されることができる。

ステップ９において、ペプチド混合物の免疫原性が確認される。また、そのようなHECが最初に形成される場合にも、このステップは有益である。しかしながら、HECの免疫原性がわかった後は、各合成の効率を再確認する必要はない。免疫原性を試験するために、精製されたHECは適切な医薬担体、及びヒトへの使用の認められたアジュバントと混合される。免疫原性の確認のため、又は多様な異なるHECが形成される場合には、特別に免疫原性であるHEC組成物を同定するために、この組成物はマウス及び／又はアカゲザルに投与されることができる。この時点で、抗原性の確認のために、次にHECに対する反応性について試験されることのできる血清を、病原体に感染した対象から得ることが望ましいかも知れない。

一般的に、HECの形成方法の概念は、免疫原性のエピトープ（例えば、Tヘルパー、CTL、及び／又は抗体応答を誘導するもの）に対応する所定の病原体のインビボにおける単離においては、多くの異なるタンパク質が見出されるという原理に基づく。これらの配列は、データベース及び／又は専門的な科学的刊行物から得ることができ、そして整列化される。可変のアミノ酸位置は、各可変残基位置を占める異なるアミノ酸とともに、可変残基として同定される。可変位置は通常、存在する可能な２０の天然アミノ酸のうちのほんの２，３の異なるアミノ酸によって占められる。

本発明の１の実施態様において、固相ペプチド合成及びFmoc化学を用いて、合成反応の所定のステップにおいて付加されるべきアミノ酸が、以下のガイドライン：１）４以下のアミノ酸の混合物が合成中のいずれかのアミノ酸結合ステップにおいて使用される；２）いずれかの結合ステップにおいて使用される各アミノ酸量が、至近２５％に概数化される、可変残基位置中に現れる各アミノ酸の出現頻度に基づいて決定される；３）２以上のアミノ酸が所定の位置において２５％未満の出現頻度で発生し、その化学構造又は性質において類似する場合、これらのアミノ酸の出現頻度は合算され、至近２５％に概数化され、これらのアミノ酸の中の最も高頻度に発生するアミノ酸のみが付加され；そして４）数学的計算が、所定のエピトープの１００以下の変異体が前記混合物中に含まれると予想する；に沿って決定される。

各可変位置において、新しく入るアミノ酸は、統計的に偏ったアミノ酸混合物を添加することによって、初期の鎖上の先のアミノ酸と連結される。インビボで発生する既知の配列の調査から比率が決定された。したがって、１の合成方法により、全範囲の可変エピトープが得られる。HEC中のペプチド混合物がすべての変形を表すことを立証するために、適切なアミノ酸が存在することを立証するためのアミノ酸配列決定がバルクのアミノ酸について実施されることができる。

病気に対する予防接種におけるそれらの使用に加えて、所定の病原体の超可変エピトープも、ルーチンの血清学によっては容易に検出されない病原体による個体感染の診断に使用されることができる。これは、病原体の系統にかかわらず、個体に感染する病原体に感染したすべての個体から得られた抗血清によって認識されることのできる、「普遍的」抗原を欠くことによって起こるのかも知れない。

本発明はまた、ヒト、霊長類、又は他の動物のような対象の免疫化において使用される場合に、防御抗体を誘導する組成物（又はワクチン）を製造するのに使用されることもできる。これらの抗体をコードする遺伝子を同定及び単離した上で、今度は、該遺伝子及び遺伝子産物が、該組成物がそれに基づくところの病原体に感染した生物の治療のための治療剤として使用されることができる。

CTL応答又は粘膜の免疫応答のような免疫システムの異なるエフェクターアームを発生させるために、多様な免疫調節剤によってHECが形成されることができる。

本発明は、インビボにおいて観察されるタンパク質エピトープの配列異形を表す、HECの製造方法に関する。本発明の実施態様によれば、所定の病原体のインビボにおける単離物のタンパク質配列は、文献及び／又はデータベースから得られる。配列は、特に免疫原性エピトープを含むタンパク質の領域について、整列化される。アミノ酸が着目のエピトープ内の各位置に現れる出現頻度は、頻度閾値を越える出現頻度で発生するアミノ酸のみが混合物中に含まれるように計算される。頻度閾値は、典型的には、約１０〜約３０の値である。頻度閾値を超えて表れるアミノ酸の数にかかわらず、４以下の異なるアミノ酸が、合成中のアミノ酸結合ステップにおいて使用される。

所定のアミノ酸結合ステップにおいて付加されるアミノ酸の出現頻度は、概数化されることができ、又はそのままで使用されることができる。概数化される場合、計算の容易のために、出現頻度は例えば、至近５％、１０％、又は２５％であることができる。２以上のアミノ酸が所定の位置において２５％未満の出現頻度で発生し、その化学的構造または性質において類似する場合、これらのアミノ酸の出現頻度はプールされ、そして場合により概数化されることができる。そのような場合、プールされたアミノ酸のなかで最も高頻度で発生するアミノ酸のみが、プールされた出現頻度に比例して付加される。得られたペプチド混合物は、約１００以下のペプチド異形を有すると計算されることができる。

混合物の合成は、頻度閾値を超える出現頻度（又は概数化された出現頻度）を反映する量のアミノ酸を含ませることによる、各アミノ酸結合ステップを実施することによって行われることができる。この方法で、ペプチド混合物が、１回の合成経路において製造される。該混合物は、組成、抗原性、及び免疫原性を確認するために、分析されることができる。該混合物は、ペプチドがそれに由来しそして混合物中の各ペプチドが混合物の基礎となるエピトープのアミノ酸置換の並べ替えに対応する配列を有するところのタンパク質による広く反応性である免疫性を作り出すことができる。

本発明によるペプチド混合物は、ペプチドを内部でお互いにクロスリンクさせることによって形成されることができる。或いは、該混合物中のペプチドは、合成又はタンパク質担体のような自然のポリマー材料のいずれであることもできる支持体ポリマーに連結されることができる。支持体ポリマーの一例は、ペプチド混合物が由来するタンパク質である。有益には、ペプチドをクロスリンクさせること、又はペプチド混合物を支持体ポリマーに結合させることは、それによってペプチド混合物の免疫原性を増加させる、免疫システムの関心をペプチド混合物に引き寄せる効果を有することができる。結合形成又はクロスリンク形成が有効なレベルまで免疫原性を増加させることができるため、そのようなアプローチは、ペプチド混合物がそれ自身充分に免疫原性でない場合にも有益である。本分野において知られた標準的な方法は、ペプチドのそのような担体へのクロスリンク形成又は結合形成に使用されることができる。

本発明による診断キットは、HECがそれに由来するところの病原体に感染した生物からの抗体と免疫反応することのできるHECの有効量を含む。ペプチド混合物中の各ペプチドは、病原体に由来するタンパク質と共通する免疫原性エピトープについてのアミノ酸置換の並べ替えに対応する配列を有する。

治療用の免疫原性組成物は、本発明によって、HECを製造し、霊長類のような動物をHECで免疫化し、抗体およびHECによる免疫化によって誘導された抗体をコードする遺伝子を得ることによって製造されることができる。そのような免疫原性組成物又は免疫化によって生じる抗体をコードする遺伝情報は、対象に投与されることができる。

本発明とともに使用されるタンパク質エピトープは、ヒト免疫不全症候群ウイルス１又は２型（HIV-1／２）、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルス（HPV）、マラリア、デングウイルス又はトリパノゾーマ症に由来するタンパク質中に存在するものであることができる。他の病原体に由来するエピトープも使用されることができる。

HEC又はペプチド混合物は、いずれかの薬剤として許容可能な担体中に懸濁されることができる。例えば、HECは生理食塩水溶液中に懸濁されることができる。さらに、HECは、アジュバントと混合されることができる。

本発明は、ペプチド混合物が由来する１以上のエピトープを含む単一の病原体からの１以上のタンパク質に基づく２以上のHECの量を含むことのできるワクチンに関する。上記HECの量は、等モルであることができる。等モル量の上記ペプチド混合物は内部でクロスリンクさせられ、又は支持体ポリマーに連結される。

上記のペプチド混合物の所定の位置に付加されるアミノ酸の出現頻度は、タンパク質配列又は単離物の構造又は長さによってではなく、その単一の位置におけるアミノ酸の出現頻度のみから決定される。例えば、もし、長さが顕著に可変である１０個の配列のエピトープが利用可能である場合、上記ペプチド混合物中の所定の位置において付加されるアミノ酸の出現頻度の決定において考慮されるのは、上記ペプチド混合物がそれに基づくところのエピトープ中の所定の位置における異なるアミノ酸の総数のみである。いったん配列が整列化されると、若し10個の配列すべてが第２位置に単一のアミノ酸を有する場合、該１０個の各配列の配列長にかかわらず、そのアミノ酸の１００％がペプチド混合物の合成に使用されるであろう。

出現頻度が至近２５％（或いは５％、１０％、又は他の選ばれた値）に概数化される場合、中間値未満のいずれの値も低いほうの整数に繰り下げられる一方、２の特定された整数のちょうど中間値であるいずれの値も次に高い整数に繰り上げられるということが当業者に知られた約束事である。例えば、タンパク質エピトープについて整列化されたすべての配列の３０％において、エピトープ中の第３位置に現れたアミノ酸は、その位置において２５％の概数化された出現頻度を有する。しかしながら、あるアミノ酸がそのエピトープについての整列化された配列の３８％において存在する場合、それは、該ペプチド混合物中で、その位置において５０％の出現頻度で存在するということになる。１２％の出現頻度で存在するアミノ酸は至近２５％に概数化された場合、０％に繰り下げられ、そしてしたがって、それによって１２％の出現頻度がプールされることのできる類似するアミノ酸がない場合には、混合物中に含まれないこととなる。

HIV-1、HCV、及びインフルエンザに対する潜在的な使用のために、特別に設計されたHECが本明細書中で実施例として開示される一方、本発明は、エピトープの変異を有する他のいずれかのヒト又は動物の病原体によって引き起こされる病気に対するワクチン接種のために使用されることもできる。本発明は、顕著なエピトープの変異のために、診断及びそれに対する防御が困難であることが明らかとなった病原体に対する使用について特に有益である。これらは、HIV-2、HPV、マラリア、デング、及びトリパノゾーマ症を含むが、これらに限定されない。

本発明の上記の実施態様は、例示のみを意図するものである。特別な実施態様に対する、当業者による変更、改変及び変異は、本明細書に添付された請求項のみによって定義される本発明の範囲を離れることなく、行われることができる。

一般的な方法論
以下の方法論は、本発明とともに、特別には以下に提供される実施例に関して使用された。

ペプチド合成
ペプチド混合物を、１％ジビニルベンゼンクロスリンカーを有する高容量（０．７mmol/g）Knorr樹脂を利用する、９−フルオロエニルメトキシカルボニル（Fmoc）化学によって合成する。樹脂を５０％(v/v）ピペリジン；N',N'-ジメチルホルムアミド（DMF）を２回添加することによって中和する。続いて、樹脂をDMF及びメタノールで洗浄する。所定の位置についての出現頻度に基づく適切なモル量のアミノ酸を添加する。室温で２時間、結合を起こさせる。樹脂を再びDMF及びメタノールで洗浄する。結合の確認に続いて、樹脂をDMFで洗浄し、５０％ピペリジン：DMFで９分間、脱保護する。最後のアミノ酸の結合後、樹脂をDMF及びメタノールで洗浄する。９０％トリフルオロ酢酸（TFA）、５％１，２−エタンジチオール（EDT）、５％水の溶液を樹脂に添加することによって、ペプチド混合物を分割し、脱保護する。樹脂を室温で６〜１２時間インキュベートする。樹脂はその後、TFA及びメタノールで洗浄する。ペプチドを含むTFA洗浄液を集める。

ペプチド混合物を冷エタノールで抽出する。ペプチド／TFA溶液を、窒素ガス下での蒸発によって小容量（約１ml）に減少させる。（２５容量の）エーテルをペプチド溶液に添加し、混合する。ドライアイス上での５分間のインキュベーションに続いて、サンプルを１，０００×ｇで５分間遠心分離し、エーテルを除去する。この抽出方法を３回繰り返す。続いて、ペプチド混合物溶液を、エーテル抽出と同じやり方で酢酸エチル：エーテル（v/v）（１．５：１）で３回抽出する。最後のエーテル抽出に続いて、残留エーテルを窒素ガス下で蒸発させ、ペプチド混合物を水に再懸濁して凍結乾燥する。

HECのタンパク質担体への結合
合成に続いて、いくつかのHECをその免疫原性を高めるために、タンパク質担体に結合させることができる。そうした場合、HEC１００モル：タンパク質担体１モルの比（ペプチド：担体）を使用する。タンパク質及びHECの両方を０．５MのN-メチル-イミダゾール、ｐH６．０に、１mg/mlの濃度で溶解する。タンパク質及びHEC溶液を併合し、１モルのHEC／タンパク質溶液あたり、５０モルの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）を添加する。混合物を２０℃で３０分間攪拌し、そして５％酢酸緩衝液中でさらに透析（１０kDaカットオフ）する。二重蒸留水中での透析につづいて、ワクチンを凍結乾燥し、真空下、２０℃で保存する。

動物の免疫化
マウスはJackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から入手した。マウスは、KLHに結合する場合は１００μgの単一の配列のペプチド（SSP）又はHECで免疫化され、或いは担体を含まないペプチドで免疫化される場合は２００μgで免疫化される。使用のために、免疫原を滅菌PBS中に溶解した。一次免疫化は、尾の基部に皮下で、一方、二次免疫化は同様に、尾の基部に皮下で２週間後に投与した。

アカゲザルを、HEC又はHEC／タンパク質担体複合体で計２回免疫化した。各免疫化のために、各サルは２５０μｌPBS及び２５０μｌMontanide ISA-51に溶解した５００μgのHEC又はHEC／タンパク質担体を受容した。さらにボルテックスにかけた後、エマルジョンを三角筋に筋肉内注射した。最初の免疫化の８週間後に追加免疫した。

ELISAアッセイ
所定のHECに対する応答の試験を、標準的な方法を使用して、固相酵素結合免疫アッセイ（ELISA）によって実施した。すなわち、HEC、ペプチド、又はタンパク質を０．０５M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH９．５に溶解し、そして平底マイクロタイタープレート（Corning, NY）に適用した。ペプチド及びタンパク質を１μg／ウエルでプレートに加えた一方、ウイルスは５００μg／ウエルでプレートに加えた。試験血清とのインキュベーションに続いて、アルカリホスファターゼ標識二次抗体（抗マウス又は抗サル）（Fisher, Pittsburgh, PA）によって抗原結合一次抗体を検出した。光学密度を４０５nmにおいて、自動プレートリーダー（BioRad 3550）を使用して測定した。

ウイルス感染性の中和
ウイルスストックを、American Type Culture Collection(ATCC, Rockrille, MD)から入手したCEMｘ１７４細胞中で増殖させた。HIV-1単離物を、NIH, NIAID Repositoryから入手した。この系統からの細胞が、中和アッセイにおいてウイルス力価の決定及びウイルス感染性の指標として使用された。血清サンプルは連続的に希釈し（１：２０〜１：２５６０）、３連で９６ウエルプレートに添加した。陽性対照として、NIH Repositoryから入手したHIV-1中和抗体の熱で不活化した血清を使用した。陰性対照は、未処理サルの血清並びに、すべての試験動物の免疫化前の血清を含んだ。ウイルスを、５０TCID５０（５０％組織培養感染性量）で添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。インキュベーション後、CEMｘ１７４細胞を集め、（細胞のみの）対照ウエル並びにウイルス／抗体ウエルに１×１０⁵細胞／ウエルで添加した。プレートはCO₂インキュベーター中、３７℃でインキュベートし、毎日、融合細胞形成についてチェックした。血清の中和能は第８日に、上清の一部のリバーストランスクリプターゼ（RT）活性を試験することによってアッセイし、そして細胞は生存度を決定するために、XTT、２，３−ビス[２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル]−２H−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（Sigma, St. Louis, MO）に第１０日に露出した。免疫化前の血清はRT活性の低下を起こさなかった。５０％を超えるRT活性低下を達成した最も高い血清希釈度が、強力な中和抗体力価と決定された。最も高い血清希釈度とともに得られた３０〜５０％のRT活性の低下は、弱い中和力価であると考えた。

T細胞増殖反応
抗原及びマイトゲン（PHA-P、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を１〜１０μg／ウエルの濃度で３連で９６穴丸底プレートに入れた。全血を免疫化したサルから得て、PBS中１：２に希釈し、Ficollグラジエント（LSM, Organon Teknika Corp., Durham, NC）上へ重ね、室温で２００×ｇで３０分間遠心分離した。リンパ細胞を集め、洗浄し、計数し、そして１０％FCS,L-グルタミン及び抗生物質を含むRPMI-1640培地中、１×１０⁶生細胞／mlの濃度に調節した。０．１mlのリンパ細胞懸濁液を傾けて抗原を含む９６穴プレートの各ウエルに注いだ。プレートを３７℃、及び５％CO₂でインキュベートした。マイトゲンとともに３日間、抗原とともに６日間インキュベートした後、１μCiの³H-チミジンとともに１６〜１８時間インキュベートし、ただちにWallac（登録商標）セルハ−ベスタ−のグラスファイバーフィルターペーパー上へ採集した。水性シンチレーション液（Scintisafe, Fisher Scientific）の添加後、³H−チミジンの取り込みを、LKB Wallac 1209 Rackbeta（登録商標）液体シンチレーションカウンターによって測定した。結果を平均し刺激指数（SI）で表し、実験（抗原又はマイトゲン）の毎分の平均カウント（CPM）割る対照（細胞のみ）の平均cpmを計算した。２より高い平均SI値を顕著であるとみなした。

CTLアッセイ
脾臓細胞をRPM1640組織培養培地中に懸濁する。特異的再刺激のために、３×１０⁷の反応細胞を１．５×１０⁶の同系の抗原パルスした脾臓細胞（２０，０００radで照射）と、５日間、直立２５ml組織培養フラスコ中の１０mlの培地中で同時培養した。非特異的再刺激のために、反応細胞をインターロイキン２（IL-2）を１０IU/mlで含む培地中で一夜培養した。抗原特異的に及び非特異的に刺激された脾臓細胞を５日間の培養後に採集し、培地で２回洗浄した；これらは、エフェクター細胞として働く。エフェクターの特異的細胞溶解活性を、９６丸底ウエル中の２００μlの培地中、エフェクター細胞の希釈液と２×１０³の⁵¹Cr-標識標的細胞（抗原で４時間パルスした同系の脾臓細胞）を使用して試験する。１００μlの上清を集め、ガンマカウンターで読み取った。特異的溶解を以下のように計算した。

自然の放出を、エフェクター細胞を加えない標的細胞から得られた値によって表し、一方、総放出を界面活性剤溶液で標識標的細胞を溶解した後に決定する。

実施例１：HIV-1に基づくHEC
Human Retrovirus and AIDS データベース（Los Alamos, 1998）からエピトープタンパク質配列を入手した。配列データに基づいて、HIV-1エンベロープ糖タンパク質（gp120）の５つの領域が超可変区域として認識可能である。これらの５つの超可変領域は、抗体中和、CTL、及び／又はTヘルパー細胞エピトープ（HIV Molecular Immunology Database, 1998）を含む。

中和エピトープに沿った各位置のために可能であるアミノ酸を、HIV-1クレードB系統のインビボ単離物の配列情報から決定し、各エピトープのための配列情報を整列化しそして評価した。続いて、中和エピトープの合成中のいくつかのアミノ酸結合ステップを、観察された配列データから決定した適切なアミノ酸混合物を用いて実施した。この過程を合成中の各アミノ酸結合ステップにおいて繰り返した。したがって、１回の合成において、中和エピトープのインビボにおいて観察されたすべての異形を表すペプチド混合物を作製した。

図３は、本発明によって製造された例示的なHECの集合物を例解し、５つのHIV-1HECの合成のために定常及び可変残基において使用されたアミノ酸置換を示す。HECは、HIV-1のエンベロープ糖タンパク質（gp120）の超可変領域のエピトープ配列において観察された可変性に基づく。対象の発明中のHIV-1に対するヒトワクチンにおける使用のためのこの合成HEC集合物は、５つの異なるHIV-1HECを含む。５つのHECのそれぞれは、１００未満の異なるペプチドの混合物を含む。５つのエピトープのそれぞれについて、可変性のパターン及び性質の両方を評価するために、HIV-1クレードB系統のgp120配列が整列化された。着目の超可変領域に沿った各位置において最も共通して観察されたアミノ酸を、対象の発明の不可欠な要素であるガイドラインに沿ってペプチド合成中の付加のために選択した。より特別には、合成中のFmoc化学を用いた所定の付加反応において付加されるアミノ酸の量を至近２５％に概数化し、４以下のアミノ酸を所定のアミノ酸結合ステップにおいて付加した。さらに、HEC合成において製造されたペプチド数の計算値は１００の異なるペプチドを超える事はなかった。例えば、６４、３２、６４、６及び４の異なるペプチドが、５のHIV-1HECのそれぞれの中に存在すると計算される。

図３は、「HIV-1 HEC 1」と呼ばれる上記ペプチド混合物が、アミノ酸位置３、７、１２、１３、１６及び１８において２のアミノ酸の混合物を含み、他のすべての位置において単一のアミノ酸を含むことを示す。２項乗算は、全部で６４の異形がこのペプチド混合物中に含まれることを示す。これは、単一のアミノ酸を含む各位置においては係数１による乗算、６の可変残基位置のそれぞれにおいては係数２による乗算によって得られる。エピトープの長さは、１００を超えない異なるペプチドが形成されるように制限される。したがって、例えば、いずれかのさらなるアミノ酸位置が１以上のアミノ酸を含む場合、HIV-1HECはさらに拡張することはできなかった。それは、１を超えるいずれかの係数によって乗算された６４の異形は１００を超える異形を含むペプチド混合物を生じるからである。

霊長類におけるHIV-1HECの免疫原性を試験するために、２匹のアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta））を、ヒトへの使用のために許可されたアジュバントと混合したHECで免疫化した。末梢血リンパ細胞（PBLｓ）を、５つのHIV-1HECによる動物の先の免疫化の７６週後に得た。HEC並びに異なるHIV-1系統からのエピトープを表すペプチドで刺激した場合、PBLｓは図４に示すように大規模に増殖した。図４はまた、HIV-1HECによる霊長類の免疫化が、５つの主要なHIV-1の異なるサブタイプ（クレードA〜E）からの高度に可変性のV3ループ配列に応答して増殖する、T細胞を誘導することを実証する。これらのデータは、強力な、持続性のそして広く反応性であるTヘルパー細胞の記憶応答（memory response）が、これらのHIV-1HECによる免疫化後に霊長類において誘導され得ることを示唆する。

図５は、HIV-1HECによる免疫化が、５つのHEC及びに対する持続性の抗体応答をひとまとめに起こすこと、そして５つのHECそれぞれについても同様であることを示す。HIV-1の異なる系統からのgp120に対する広く反応性であるT細胞ヘルパーの誘導は、異なるHIV-1のエピトープに結合する広く反応性である抗体と相関する。サルは、最初の免疫化後に、HIV-1HEC1、HEC3、HEC4及びHEC５に対する抗体を産生し、第2の免疫化後にすべてのHECに対する抗体を産生した。したがって、一度にすべてのHECで免疫化することは、各HEC対して免疫応答を引き出すことを妨げなかった。HIV-1HEC3は、最初の免疫化後、２週間以内に応答を誘導し、５つの構築物のなかで最も強力な抗体応答を構築した。追加免疫後、抗体力価は１：40,000より高くまで増加し、ゆっくりと低下したにもかかわらず、２２ヶ月間高く留まった。サルの免疫化後の健康評価は非常に良好で血液化学は常に正常であった。二次的又は行動的な症状は観察されなかった。免疫化されたサルからの（抗体を含む）血清を、広く反応性である抗体の存在について、HIV-1系統MN、RF、及びSF2のクレードBのgp120超可変領域（V1−V5）中に見出されるエピトープを用いて試験した。

図６は、HIV-1HECによる第2の免疫化の２週間後に、すべてのアナログに対する抗体反応性が観察されたことを示す。両方のサル（25705及び25598）からの血清は、３のHIV-1単離物すべてからのすべてのペプチドアナログに強力に結合した。より重要には、両方のサルからの抗体が精製HIV-1SF2組換えgp120タンパク質を認識し、そしてこれに結合することができた。

図７は、免疫化されたサルからの抗体を、異なる研究用のHIV-1系統（HIV-1 laboratory strains）及び主要単離物に対する中和活性について試験したことを示す。両方のサルからの抗体は、主要HIV-1単離物８９．６及びHIV-1のHIV-1IIIB研究適応系統を中和可能であった。知られた中和抗体血清を陽性対照として使用した。データは、HIV-1HECによる霊長類の免疫化がTヘルパー及び異なるHIV-1系統に対して広く反応性である抗体の応答を誘導することを示す。図８は、さらに、世界中からの異なるHIV-1系統（クレード）に感染した個体がHIV-1HECを認識する抗体を有することを示す。

明細書中の図４〜６は、HIV-1エンベロープタンパク質に基づくペプチド混合物が免疫原性であることを実証する。図８はそれらの抗原性を実証し、図７はインビトロにおけるウイルス複製に対するそれらの防御効果を例解する。

実施例２：C型肝炎ウイルスエピトープに基づくHEC
C型肝炎ウイルス（HCV）の２の超可変領域に対する２のHECを本発明によって設計した。ウイルスのインビボ単離物から得られた配列を、データベース及び専門的な科学的文献から得て、着目のエピトープを整列化した。その後、可変残基において含めるアミノ酸を決定する時に対照の発明によって確立されたガイドラインにしたがって、アミノ酸出現頻度を至近２５％に概数化することによって、個々のアミノ酸結合ステップにおいて付加されるアミノ酸の割合を決定した。図９は、ペプチド混合物中の異なる位置に現れるアミノ酸を例解する。ペプチド混合物を、標準的なFmoc化学を用いて合成した。

特別には、図９のHCVHEC-1において、等量のチロシン（Y）及びヒスチジン（H）を残基４に、等量のロイシン（L）及びフェニルアラニン（F）を残基１７に、等量のアラニン（A)及び（T)を位置１８に、そして等量のセリン（S）及びアスパラギン（N）を位置１９に有する、24-merを形成したことがわかる。作り出された異なるペプチドの数は、したがって、２×２×２×２×（又は２⁴）＝１６と計算される。

実施例３：インフルエンザウイルスエピトープに基づくHEC
インフルエンザについての長年の研究により、インフルエンザウイルスの変化に基づくHECの設計を可能とする重要な情報が得られた。このデータは、WHO及びCDCのような機関が来年中に出現すると予想される異形を同定するために行う日常の手順に由来する。すなわち、インフルエンザの野生単離物を世界中の多様な宿主から得る。それらをタイプ（A又はB）によって同定した後、交差反応性であって、したがって最近のインフルエンザワクチンに対して保護される、系統を同定するために、それらをフェレット抗インフルエンザ抗血清に対してスクリーニングする。その後、反応性のパターンが同じであることを確認するために、それらをさらに、フェレット抗血清パネルに対してスクリーニングした。これは、点突然変異が起こらなかったことを確認する。毎年、大多数のインフルエンザ系統は抗原性において同一である。しかしながら、独自の反応性パターンを生じる僅かな系統が常にあり、これらは注意深く研究される。なぜなら、それらは、将来的に卓越した系統となるかもしれないからである。これらの独自のインフルエンザ系統についてアミノ酸配列決定を行う。

図１０は、インフルエンザAのヘマグルチニンエンベロープタンパク質上に見出される抗原性シフトコンビネーション部位（antigenic shift combination sites）をひとまとめに表す、本発明によって形成された４のインフルエンザHECを説明する。これらのHECは、先に記載され、それらがインフルエンザエンベロープタンパク質上の不連続なエピトープによって形成される超可変エピトープを表すことに特徴を有するものとは何らかの相違がある。これらの各インフルエンザHECの設計において選択されたアミノ酸は、ウイルス表面タンパク質上の単一の、連続的な超可変性のアミノ酸の範囲ではなく；むしろ、それぞれが、３次元で見た時に、お互いに密接した近傍に存在すると考えられる、ウイルスタンパク質の直線状のアミノ酸配列内のさまざまな部分からのアミノ酸に由来する。合成に使用したアミノ酸のパーセンテージは、Genebank及びthe Swiss Protein databaseから入手した（５つのブタインフルエンザA配列を含む）インフルエンザAの約６１のヒト単離物に基づく各位置のアミノ酸に由来する。

HIV-1HECによるサルの免疫化後に得られた結果と一致して、４つのインフルエンザHECによるマウスの免疫化は、強力なTヘルパー細胞及び抗体応答を引き起こした（それぞれ、図１１及び１２）。より重要には、HECによる免疫化によって誘導されたTヘルパー細胞は、完全な不活性化インフルエンザAウイルスによってインビトロで刺激した場合、応答した（図１１）。

エピトープの多くの僅かに異なる変化を表すHECは、MHC分子が高度に多型であるところの非近交系母集団において、免疫系への提示のために、いずれの個々の対象のMHC分子も適所に結合することができるエピトープ異形の亜群を含むHECが形成される、ということを確認する助けとなる。したがって、HECに基づくワクチンは、MHC拘束に打ち勝つ。実際に、図１３及び１４はこの原理を実証する。一方、図１３は、シミアン免疫不全ウイルス（SIV）エピトープ４１４−４３４を表す単一配列ペプチド（SSP）による近交系Balb/ｃマウスの免疫化が、このペプチドに結合する抗体の誘導へ導くことを実証する。対照的に、異なるMHC拘束を有する遺伝的に異なる系統のマウス（C57b1）を免疫化すると、該ペプチドに結合する抗体を産生することはできない。しかしながら、このエピトープに基づくHECによる、非応答性のマウス（C57b1）並びに応答性のBalb/cマウスの免疫化は、ウイルス並びにこのエピトープを含むウイルスタンパク質に結合することのできる抗体の誘導に導く。

実施例４：SIV由来HECと液体部分の結合
強力なTヘルパー細胞及び抗体の応答の誘導に加えて、液体部分に結合した場合、HECは、細胞障害性Tリンパ細胞（CTL）応答を誘導することもできる。CTLの誘導に使用するリポ-HECを、パム（Pam）を樹脂に結合した、SIVに基づくHECに結合させることによって調製する。これは、リポタンパクを作製するための標準的な方法である。マウスをリポーHEC及びアジュバント（リポーHEC）又はPBS及びアジュバント（A-PBS）で免疫化し、これらのマウス並びに未処理マウスからの脾臓細胞を、HECとともにインキュベートした標的細胞に対するCTL活性について試験した。図１５に示すデータは、非特異的バックグラウンド溶解を差し引いた後の特異的溶解のパーセントを示す。観察された特異的溶解は、２の免疫化を受けた動物からのみ得られた。一回の免疫化のみの後には溶解は観察されなかった（データは示さない）。図１５は、リポ−HECによる免疫化が顕著なCTL活性を誘導することを実証する。

リポ−HECはまた、パルミチン酸エステルが樹脂を含まないペプチドに結合される結合方法を用いて調製されることもできる。２のタイプのリポ−HEC結合体は免疫応答の誘導において等しく有効であり、結合方法は形成されるリポ−HECの免疫原生に影響しないという結論に導く。

実施例５：HIV1エンベロープ糖タンパク質に基づく組成物の形成
図１６は、本発明によって形成された５つのペプチド混合物（又は組成物）の配列を例解する。配列は、HIV-１エンベロープ糖タンパク質（gp120）の５の超可変領域に基づく。より特別には、該混合物は、以下の参考HIV-1系統B.US.SF2中のアミノ酸配列：gp120-1、アミノ酸130-155；gp-120-2アミノ酸159-193；gp120-3アミノ酸307-333；gp120-4アミノ酸387-410；及びgp120-5アミノ酸456-471によって包含されるエピトープに対応する。可変領域においては、２以上のアミノ酸が２５％以上の出現頻度で出現し、至近２５％に概数化すると、２以上のアミノ酸がアミノ酸合成過程に対してそれらの概数化された出現頻度を表す量で添加される。

本発明によって形成されたペプチド混合物は、複数の異なるペプチドを含み、それは、文献中に報告されているように、HIV-1エンベロープ糖タンパク質（gp120）中に見出される、最も共通する可変アミノ酸を反映する。特別には、６４、６４、３２、３２、及び４８の異なるペプチドをそれぞれ含む、gp120-1〜gp120-5は別個のペプチド混合物である。

上記の本発明の実施態様は、例示のみのためのものである。当業者によって特別な実施態様について行われる変更、改変、及び変化は、本明細書に添付された請求項によってのみ定義される本発明の範囲を離れることなく行われることができる。

本発明の実施態様が、添付された図面を参考にして、例示のみによって記載される。
図１は、本発明の実施態様によるHECの合成のための単純化されたスキームである。 図２は、本発明の実施態様によるペプチド混合物の製造方法のダイアグラムによる表現である。 図３は、本発明による、1型ヒト免疫不全症候群ウイルス（HIV-1）に基づく５のHECの合成のために選ばれたアミノ酸を例解する。 図４は、HIV-1HECによる非ヒト霊長類（サル）の免疫化がTヘルパー細胞応答を誘導することを実証する。 図５は、HIV-1HEC１〜５による免疫化によってサルにおいて誘導された強力な抗体力価を例解する。 図６は、HIV-1HECによる免疫化によって誘導された抗体が、異なる系統のHIV-1からのエピトープに結合することを実証する。 図７は、HIV-1HEC1〜５によって免疫化したサルから得られた抗体が、ヒト末梢血リンパ細胞（PBLｓ）の異なる系統のHIV-1感染を中和することを示す。 図８は、異なるHIV-１サブタイプA、B、C、D、E、及びFに感染した血清陽性の患者からの抗体がHIV-1に基づくHEC１〜５を認識することを実証する。 図９は、C型肝炎ウイルス（HCV）に基づく２のHECの設計を説明する。 図１０は、インフルエンザAのヘマグルチニンエンベロープタンパク質上に見出される抗原シフトコンビネーション部位に基づく４のHECの設計を説明する。 図１１は、図１０のインフルエンザHECによって免疫化したマウスのTヘルパー細胞応答を実証する。 図１２は、図１０のインフルエンザHECによって免疫化したマウスの抗体応答と非関連ペプチドによる免疫化との比較を例解する。 図１３は、SIV由来HECで免疫化後のBalb/cマウスの免疫応答を例解する。この図は、それらの主要組織適合性（MHC）遺伝型によって、単一のSIV由来エピトープに対して免疫応答を引き起こすことのできないBalb/cマウスにおいては、同じエピトープに基づくHECによる免疫化が免疫応答を引き起こすことを実証する。 図１４は、マウスからの抗体とSIVとの結合を実証する。データは、SIV HECによる非反応系統のマウスの免疫化によって生じる抗体が、多様なHECがそれに基づくところのウイルスへ結合することができることを実証する。 図１５は、HECの液体部分への結合が細胞障害性Tリンパ細胞（CTL）応答を可能とすることを示す。 図１６は、本発明によって決定された多数のペプチドを含む、５のペプチド混合物の組成を例解する。

Claims (31)

1. 以下のステップ：
   病原体の免疫原性エピトープ配列を得ること、ここで、前記免疫原性エピトープ配列が共通残基領域、及び前記配列がそれによって相互に相違する、少なくとも１の可変残基を有する；
   上記免疫原性エピトープ配列の可変残基において見出される、異なるアミノ酸の出現頻度を決定すること；及び
   約１００以下の異なるペプチドを含むペプチド混合物を合成すること、ここで、各ペプチドは上記共通残基領域、及び上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において約１０％〜約３０％の頻度閾値よりも高い出現頻度で見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を、可変残基位置に有する；
   を含む、免疫原性ペプチド混合物の製造方法。
2. 上記頻度閾値が約１２％である、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、ここで、４以下の異なるアミノ酸が上記ペプチド混合物内の異なるペプチドの上記可変残基位置において出現する、という条件下で、上記ペプチド混合物が、上記免疫原性エピトープ配列中の上記可変残基として最も高頻度に見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を上記可変残基に有する配列を含む、前記方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、ここで、上記ペプチド混合物の合成ステップの間に、上記可変残基位置において現れる上記異なるアミノ酸が、上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において現れる各異なるアミノ酸の出現頻度に比例して、相互に相対的に存在するようにペプチドが形成される、前記方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、ここで、可変残基において見出されるアミノ酸の出現頻度が至近２５％に概数化され、そしてゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸のみが上記ペプチド混合物の上記ペプチド中の上記可変残基位置に含まれる、前記方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、ここで、上記ペプチド混合物の上記ペプチドが、上記可変残基位置において存在する所定のアミノ酸を、前記所定のアミノ酸の概数化された出現頻度に比例した出現頻度で有する、前記方法。
7. 請求項６に記載の方法であって、ここで、可変残基において見出される類似するアミノ酸の出現頻度がプールされ、そして上記プールされた出現頻度は、上記概数化された出現頻度を計算するときに、上記類似するアミノ酸のうちの最も高頻度に見い出されたアミノ酸に割り当てられる、前記方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、ここで、可変残基において見出された類似するアミノ酸の出現頻度が、上記類似するアミノ酸がそれぞれ、頻度閾値未満の出現頻度を有する場合にのみ、プールされる、前記方法。
9. 請求項７に記載の方法であって、ここで、類似するアミノ酸の出現頻度が、各類似するアミノ酸の出現頻度を至近２５％に概数化した上で、２５％以上の概数化された出現頻度を有するアミノ酸がない場合にのみ、プールされる、前記方法。
10. 請求項７に記載の方法であって、ここで、類似するアミノ酸が、以下の：芳香族アミノ酸；脂肪族アミノ酸；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸；塩基性アミノ酸；酸性アミノ酸；アミド含有アミノ酸；及び含硫アミノ酸から成る群に属するアミノ酸から選ばれる、前記方法。
11. 請求項５に記載の方法であって、ここで、上記合成ステップがアミノ酸結合を用いて実施され、且つ、アミノ酸をそれらの概数化された出現頻度に比例して付加することによって上記可変残基位置が結合される、前記方法。
12. 前記免疫原性エピトープ配列が、２〜７の可変残基を含む、請求項１に記載の方法。
13. 上記ペプチド混合物が２〜約６４の異なるペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
14. 少なくとも１のステップがバイオインフォマティックス方法論を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
15. 免疫原性ペプチド混合物の製造方法であって、以下のステップ：
    病原体の免疫原性エピトープ配列を得ること、ここで、前記免疫原性エピトープ配列が共通残基領域、及び前記配列がそれによって相互に相違する、少なくとも１の可変残基を有する；
    上記免疫原性エピトープ配列の可変残基において見出される、異なるアミノ酸の出現頻度を決定すること；
    アミノ酸が可変残基において見出される出現頻度を、至近２５％に概数化すること；及び
    約１００以下の異なるペプチドを含むペプチド混合物を合成すること、ここで、各ペプチドが、上記共通残基領域を有し、且つ、可変残基位置において、上記免疫原性エピトープ配列の可変残基において最も高頻度に見出されるアミノ酸から選ばれるアミノ酸を、前記アミノ酸がゼロでない概数化された出現頻度を有するという条件下で、有し、さらにここで、前記可変残基位置は、２〜４の異なるアミノ酸であって、該アミノ酸のそれぞれが前記ペプチド混合物中でその概数化された出現頻度に比例して表されるものから選ばれる；
    を含む、前記方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、さらに以下のステップ：
    ２５％未満の概数化された出現頻度を有する類似するアミノ酸の出現頻度をプールすること；
    上記プールされた出現頻度を、上記類似するアミノ酸の最も高頻度で発生したアミノ酸に割り当てること；
    上記プールされた出現頻度を至近２５％に概数化すること；及び
    ゼロでない概数化された出現頻度については、ペプチド混合物の合成ステップ中の類似するアミノ酸の最高出現頻度を含めること；
    を含む、前記方法。
17. 病原体に対して免疫原性であるペプチド混合物であって、約１００以下の異なるペプチドを含み、各ペプチドが共通残基領域、及び可変残基位置を有し、ここで、
    異なるペプチドの上記共通残基領域は、病原体の免疫原性エピトープ配列の可変残基に隣接する、上記病原体の免疫原性エピトープ配列の非可変アミノ酸であり；
    上記可変残基位置は、以下の：
    （ａ）４以下の異なるアミノ酸が、上記ペプチド混合物の上記異なるペプチドの上記 可変残基位置において存在し；且つ
    （ｂ）上記異なるペプチドの上記可変残基位置において存在するアミノ酸は、上記免 疫原エピトープ配列の上記可変残基において、約１０％〜約３０％の頻度閾値よりも高 い出現頻度で出現する；
    という条件下で、上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において最も高頻度で発生するアミノ酸から成る群から選ばれるアミノ酸によって占められる、前記ペプチド混合物。
18. 請求項１７に記載のペプチド混合物であって、ここで、アミノ酸が可変残基位置において現れる出現頻度が以下のスキーム：
    上記免疫原性エピトープ配列の上記可変残基において発生するアミノ酸の上記出現頻度が、至近２５％に概数化され；そして
    ゼロでない概数化された出現頻度を有するアミノ酸が、上記異なるペプチドの上記可変残基位置において、上記概数化された出現頻度に比例した出現頻度で見出される；
    によって決定される、前記ペプチド混合物。
19. 請求項１８に記載のペプチド混合物であって、ここで、概数化された出現頻度が２５％未満である類似するアミノ酸が、可変残基位置において現れる出現頻度が、以下のスキーム：
    類似するアミノ酸の上記出現頻度がプールされ、そして至近２５％に概数化される；
    ゼロでない概数化された出現頻度については、上記概数化された出現頻度は、上記類似するアミノ酸のうちの最も高頻度で発生するアミノ酸に割り当てられる；そして
    上記最も高頻度で発生する上記類似するアミノ酸は、上記異なるペプチドの上記可変残基位置において、上記概数化された出現頻度に比例した出現頻度で見出される；
    によって決定される、前記ペプチド混合物。
20. 液体部分に結合された請求項１７に記載のペプチド混合物を含む、結合ペプチド組成物。
21. タンパク質担体部分に結合された請求項１７に記載のペプチド混合物を含む、結合ペプチド組成物。
22. 請求項１７にしたがって形成された複数のペプチド混合物を含む、免疫原性組成物であって、ここで、前記ペプチド混合物のそれぞれが同じ病原体に対して免疫原性である、前記組成物。
23. 請求項２２に記載の免疫原性組成物であって、ここで、前記複数のペプチド混合物のそれぞれが、上記同じ病原体の異なる免疫原性エピトープ配列を目標としており、且つ上記異なる免疫原性エピトープ配列が上記病原体表面の密接した近傍の領域中に見出される、前記組成物。
24. 請求項１７に記載のペプチド混合物及び薬剤として許容可能な担体を含む、病原体に対する免疫応答を引き起こすためのワクチン。
25. 病原性の病気に対するワクチン接種の方法であって、対象に、請求項２４に記載のワクチンの有効量を投与するステップを含む、前記方法。
26. 病原体による対象の感染の診断方法であって、以下のステップ：
    抗体を含有する生物学的サンプルを前記対象から得ること；
    上記生物学的サンプルを、上記病原体の免疫原性エピトープ配列に基づく、請求項１に記載の免疫原性ペプチド混合物と接触させること；及び
    前記ペプチド混合物との前記サンプルの免疫原性の応答を評価すること；
    を含む、前記方法。
27. 病原体による対象の感染を決定するための診断キットであって、以下の：
    上記病原体の免疫原性エピトープ配列に基づく、請求項１に記載の免疫原性ペプチド混合物；及び
    上記免疫原性ペプチド混合物との、抗体を含有する対象の生物学的サンプルの免疫原性の応答を評価するための指示書；
    を含む、前記キット。
28. 病原体に対して免疫原性である抗体の単離方法であって、以下のステップ：
    請求項１７に記載のペプチド混合物を対象に投与すること；及び
    上記ペプチド混合物の投与によって誘導された抗体を対象から得ること；
    を含む、前記方法。
29. 病原体に対して免疫原性である抗体をコードする遺伝子の単離方法であって、以下のステップ：
    請求項１７に記載のペプチド混合物を対象に投与すること；
    上記ペプチド混合物の投与によって誘導された抗体を対象から得ること；及び
    上記抗体をコードする遺伝子を単離すること；
    を含む、前記方法。
30. 病原体と反応性である抗体のすべて又は部分をコードする遺伝子又は遺伝物質の部分の単離方法であって、以下のステップ：
    請求項１７に記載のペプチド混合物を対象に投与すること；
    上記ペプチド混合物の投与によって誘導された、上記病原体と反応性である抗体又はその部分を上記対象から得ること；及び
    上記病原体と反応性である抗体又はその部分をコードする遺伝子又は遺伝物質の前記部分を単離すること；
    を含む、前記方法。
31. 病原体に対する免疫療法であって、請求項３０に記載の方法によって得られた遺伝子又は遺伝物質の部分によってコードされるペプチド又はタンパク質を、対象に投与することを含む、前記免疫療法。

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