【発明の詳細な説明】
ヒト免疫不全ウイルス感染の予防用合成ワクチン
本出願は、1995年10月20日に出願された米国特許出願第08/546,515号の一部継
続出願である。この親出願もまた、経時的に順次出願された先の米国特許出願、
即ち、1987年９月８日出願の第07/093,854号、1990年10月１日出願の第07/591,1
09号、1992年２月10日出願の第07/832,849号、1992年３月27日出願の第07/858,3
61号、1994年４月29日出願の第08/235,305号に基づく利益を享有するものであり
、より具体的には、上記の各出願は全てその直前の出願の一部継続出願である。
これら先の出願の内容は、参照文献として、全て本明細書に取り込まれる。
発明の背景
技術分野
本発明は、包括的には免疫原調製物、具体的にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）のエンベロープタンパク質の領域に相当するアミノ酸配列を具備するペプチ
ドに関し、該エンベロープタンパク質に対して中和抗体が産生される。さらに、
本発明は、ヒトの予防接種に適したワクチンであって、直接またはスペーサー分
子を介して担体分子に結合したペプチドを具備するワクチンに関する。
背景に関する情報
ヒトのレトロウイルスＨＩＶは、現段階では治療法がない病気である後天性免
疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす因子であることが実証されてきた。ＡＩ
ＤＳ関連患者の疫学的パターンは、それが伝染病であることを示している。該ウ
イルスは、しばしば、男性の同性愛者、静脈内薬物の使用者、血液製剤を与えら
れている患者、並びにハイチおよび中央アフリカ出身者を含むハイリスクグルー
プの人の唾液、精液、全血および血漿に見出される。ハイリスクグループの人の
血清陽性率の急上昇、該疾病の重篤性、および世界規模の蔓延の拡大のため、非
感染者に完全な感染防御免疫を引き起こし得るワクチンの必要性は非常に強く、
差し迫ったものである。生物試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を調べるために使用さ
れる診断薬の
必要性も明らかである。
これまでの研究から、ＨＩＶはＴリンパ球表面上のＣＤ4(Ｔ4)分子に、自己の
外部エンベロープ糖タンパク質（gp120）を付着させることによって免疫系のＴ
リンパ球に感染し、このようにＴ細胞に侵入および感染するための受容体として
ＣＤ4(Ｔ4)分子を用いることが明らかとなってきた。細胞に感染した後、該ウイ
ルスは、Ｔ細胞のウイルス防御能を破壊する。
抗エンベロープ抗体を含む血清が、インビトロでＨＩＶ感染を阻止できること
が明らかとなったように、レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、ウイ
ルスを中和する抗体の応答を誘発する上で重要であることが示されてきた。すな
わち、ＨＩＶの外部エンベロープ糖タンパク質gp120は、ヤギおよびヒトに中和
抗体を生じさせ得ることが示された(Ｒobeyら、Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．(
ＵＳＡ)83: 7023，1986)。ＨＩＶ感染患者において免疫原となる、または中和抗
体を生じさせるgp120のエピトープの正確な位置については殆ど知られていない
。しかし、gp120分子全体のおよそ1/3をコードする組換えタンパク質ＰＢ1（Ｐu
tneyら、Ｓcience，234:1392，1986）は、該エンベロープタンパク質の、中和抗
体の形成を引き起こす部分を含んでいることが示された。
現在までに蓄積されたデータは、ＰＢ1および手を加えていないgp120が何れも
、ＨＩＶ感染に対するワクチンに用いるには適切でないということを示唆してい
る。ヤギおよびチンパンジーを用いた研究により、両分子はともに、高力価の中
和抗体の産生を引き起こし得ないということを実証した。さらに、手を加えてい
ないgp120分子は、正常なＴ細胞のＴ4分子に結合し、正常な免疫機能を崩壊させ
得ることが示されてきた。すなわち、完全なgp120エンベロープ分子は、正常な
ＣＤ4(Ｔ4)機能を妨害し、インビトロでＴ細胞の活性化を抑制する（Ｍannら、
Ｊ．Ｉmmunol．138:2640，1987）。このため、外部エンベロープ糖タンパク質の
大きい断片を含むワクチンを投与すると、実際に正常な免疫系が悪影響を受ける
かもしれない。
gp120の主要な中和ドメイン（neutralizing domain）（gp120エンベロープＶ3
ループ領域）におけるＨＩＶ配列の多様性およびＶ3ループ配列の突然変異速度
の速さが、ワクチンを開発する上で克服すべき主要な障害であることが明らか
となっている(Ｍyersら、Ｈuman Ｒetroviruses and ＡＩＤＳ 1991; Ｌa Ｒosa
ら、Ｓcience，249:932-935，1990; およびＨolleyら、ＰＮＡＳ(ＵＳＡ)，88:6
800-6804，1991)。それにもかかわらず、研究は、抗ＨＩＶ中和抗体の生成にお
いてgp120 Ｖ3領域が果たす極めて重要な役割を示し続けている（Ｊiangら、Ｊ
．Ｅxp．Ｍed．174:1557-1593，1990）。さらに、現在のＨＩＶ分離株の約50％
は、ＨＩＶのＭＮ分離株に類似するＶ3配列共通部分を共有しており、アメリカ
のＨＩＶ分離株の約80％は、４つの最も一般的なＨＩＶ配列のうちの１つを共有
していることが最近示された（Ｍyersら、Ｈuman Ｒetroviruses and ＡＩＤＳ
1991;Ｌa Ｒosaら、Ｓcience，249:932-935，1990;およびＨolleyら、ＰＮＡＳ(
ＵＳＡ)，88:6800-6804，1991）。さらにこれらの配列のうちの２つ、ＧＰＧＲ
ＡＦおよびＩＨＩＧＰＧＲＡは、広く交叉反応するＨＩＶ中和抗体を動物に生じ
させた（Ｊahaverianら、Ｓcience，250:1590-1593，1990およびＨaynesら、Ａ
ＩＤＳ Ｒes．Ｈumans．Ｒetroviral，6:38.39，1990）。
このように、ＨＩＶに対するワクチンの開発に不可欠なのは、gp120とＣＤ4(
Ｔ4)分子との相互作用を阻止するが、正常なＣＤ4(Ｔ4)とクラスII主要組織適合
分子との相互作用（多くの段階の正常なＴ細胞応答を仲介する上での、ＣＤ4(Ｔ
4)分子の主な正常機能）を阻止しないgp120に対する抗体応答の生成である。さ
らに、ＨＩＶに対する効果的なワクチンは、霊長類およびヒトに感染防御免疫応
答を引き起こし、すなわちその後のＨＩＶ感染の発症を防ぐであろう。
約80％のＨＩＶ株に対して、予防的（salutory）抗ＨＩＶ免疫応答を引き起こ
す免疫原は、少なくとも３つの状況において、臨床上非常に有用となろう。第１
に、ＨＩＶに感染するリスクが高いと考えられるＨＩＶ陰性の静脈内（ＩＶ）薬
物の使用者、在監者、および同性愛者集団を上手く免疫すれば、ＡＩＤＳの蔓延
が進行するのが有意に鈍るであろう。第２に、もし妊娠して最初の３ヶ月の間に
、ＨＩＶに感染した母親を免疫すれば、予防的抗ＨＩＶウイルス応答を強化して
、ＨＩＶの伝達を80％減少させることができ、そのためＨＩＶに感染した母親か
ら生まれた子供の母子間ＨＩＶ伝達が30％から6％へと減少するであろう。第３
に、予防的であるが、発病させない抗ＨＩＶ応答を引き起こした抗ＨＩＶ免疫原
は、不顕性ＨＩＶ感染者を免疫して、抗ＨＩＶ免疫応答を強化し、不顕性のＨＩ
Ｖ感染状態の維持を促進するのに有用であろう。
発明の目的
担体分子に結合させたとき、および／または分子凝集体を形成するために多量
体化したとき、哺乳類に高力価の抗ＨＩＶ中和抗体を産生させることが可能であ
り、正常な免疫機能を妨害しないペプチドを提供することが本発明の目的である
。
哺乳類にＨＩＶに対する感染防御免疫を引き起こし得るＨＩＶのエンベロープ
タンパク質の抗原決定基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを具備する合
成ワクチンを提供することは、本発明の別の目的である。
哺乳類に様々な形態のＨＩＶに対する感染防御免疫を引き起こし得るワクチン
を提供することは、本発明のさらなる目的である。
生物試料中の抗gp120抗体の存在を検出する方法を提供することは、本発明の
別の目的である。
発明の概要
本発明は、免疫原調製物および該免疫原調製物から作られたワクチンに関する
。ＨＩＶのエンベロープタンパク質の抗原決定基に相当するアミノ酸配列を有す
るペプチドは、共有結合によって、直接またはスペーサー分子を介して適切な担
体分子に結合している。このようなペプチドを１以上具備する合成ワクチンを開
示する。
ある実施態様では、本発明は、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質の抗原決定
基に相当するアミノ酸配列を有する、本質的に純粋な形態のペプチドであって、
担体分子に共有結合したとき、哺乳類に高力価の抗ＨＩＶ感染防御抗体を生じさ
せ得るペプチドを具備してなる。例えば、該ペプチドは、ＨＴＬＶ-IIIB分離株
のエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸303-321に相当する配列ＣＴＲＰＮＮＮ
ＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧ（Ｒatnerら、Ｎature 313:277，1985）またはその任
意の一部分を有し得る。
別の実施態様では、本発明は、哺乳類に高力価の抗ＨＩＶ感染防御抗体を生じ
させ得る免疫原抱合体であって、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質の抗原決定
基に相当するアミノ酸配列を具備するペプチド(ii)に、共有結合で付着している
担体分子(i)を具備する前記抱合体を具備してなる。
さらに別の実施態様において、本発明は、哺乳類に上述の抱合体を投与するこ
とを具備する、ＨＩＶに対する免疫を産生する方法を具備してなる。
別の実施態様において、本発明は、生物試料中の抗gp120抗体の存在を検出す
る方法を具備する。
図の簡単な説明
図１：組換えタンパク質、および合成ペプチドとの関係
図２：合成ペプチドに対するＡＩＤＳ患者の抗体の反応性
図３：合成ペプチドのアフィニティーカラムで精製した、ＨＩＶ＋患者からの
抗体のgp120反応性
図４：ヤギ抗ＳＰ-10抗血清によるＨＴＬＶ-IIIBの中和
図５：分離株特異的なＨＩＶの中和
図６：ヤギ抗ＳＰ-10血清は、ＨＴＬＶ-IIIBに感染したＨ9Ｔ細胞に結合する
が、ＨＴＬＶ-IIIRFに感染したＨ9Ｔ細胞には結合しない。
図７：ＨＩＶ ＭＮのエンベロープからの様々なＴ1-ＳＰ10ペプチドが、Ｂalb
/cマウスに抗Ｔ1-ＳＰ10ＭＮペプチド抗体を誘導する能力の比較。各点は、プレ
ート上の抗原としてペプチドＴ1-ＳＰ10ＭＮを用いて、96穴のプレート中でＥＬ
ＩＳＡアッセイにより決定した、４〜５匹のマウスの血清抗Ｔ1-ＳＰ10抗体の平
均レベルを表している。データは、採血前（対照）の光学密度(ＯＤ)に対する、
採血後の免疫(Ｅ)の光学密度の比（Ｅ/Ｃ）として表されている。データは、２
度免疫した後に、Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)、Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10ＭＮおよびＦ-Ｔ1-ＳＰ10
ＭＮ(Ａ)ペプチドが、Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ自体に比べて、さらに高レベルの抗Ｔ1-Ｓ
Ｐ10ＭＮ抗体を誘導することを示している。
図８：ＨＩＶ ＭＮのエンベロープからの様々なＴ1-ＳＰ10ペプチドが、イン
ビトロ合胞体阻害アッセイ（syncytium inhibitium assay）において、ＨＩＶ
ＭＮを中和する抗体をＢalb/cマウスに誘導させる能力の比較。各バーは、表記
の形態のＴ1-ＳＰ10で免疫した、あるマウスからの採血３（bleed 3）の血清の
結果を示している。バーの高さは、1:10に希釈した採血によって阻害された合胞
体形成のパーセントを同様に希釈した採血前の血清と比較を示す。
図９は、ＨＩＶ env合成ペプチドで繰り返し免疫したチンパンジー中の抗免疫
原ペプチド抗体力価のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
図１０は、７日間にわたるトリチウムラベルしたチミジンの取込みアッセイに
おける、Ｔ1-ＳＰ10IIIＢ(Ａ)ペプチドに対する末梢血液の単核細胞の増殖応答
を示す。
図１１は、Ｔ1-ＳＰ10ペプチドおよびＦ-Ｔ1-ＳＰ10ペプチドで免疫したチン
パンジーの、ＰＨＡに対するＰＢＭＣ増殖応答を示す。
図１２は、チンパンジー884、1028、1045および1070を免疫するのに用いたも
のと同一バッチのペプチドで免疫したヤギを示す。該ペプチドは、ヤギに対して
免疫原性があり、高力価の抗ＨＩＶIIIＢ中和抗体を誘導した。
図１３は、Ｔ1-ＳＰ10-ＭＮペプチドで免疫したアカゲザル中の抗ＨＩＶＭＮ
中和抗体を示す。データは合胞体阻害アッセイにおける、90％の中和力価を表し
ている。
図１４は、Ｔ1-ＳＰ10-ＭＮ(Ａ)ペプチドで免疫したアカケザル中の、免疫原
ペプチドに対する抗体を示す。
図１５は、合胞体阻害アッセイにおける、Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドで
免疫したアカケザルの血清中の中和抗体レベルを示す。
図１６は、Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドで免疫したアカゲザル中の、免疫
原ペプチドに対する血清抗体の力価を示す。
図１７は、ＧＰＧＲＡＦ配列を含有するペプチドによる、Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)
ペプチドによってアカゲザル18987に誘導された交叉中和抗体（cross neutraliz
ing antibody）の吸収を示す。示されているように、Ｔ1を含有するペプチドは
、中和抗体およびＴ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)に存在しない配列を有するペプチドを何れ
も吸収しない。ＧＰＧＲＡＦを有するペプチドのみが、中和活性を吸収し、該動
物がＶ3ＨＩＶgp120ループのＧＰＧＲＡＦ領域を免疫原として選択的に認識し、
該領域に対する交叉反応性抗体を作ったことを証明している。
図１８：Ｔ1-ＳＰ10IIIＢまたはＦ-Ｔ1-ＳＰ10IIIＢ(Ａ)ペプチドで免疫して
、次にＴ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドで免疫した４匹のチンパンジーの血清中のＨ
ＩＶIIIＢ/ＬＡＩ（実線）およびＨＩＶ ＭＮ（破線）に対する中和抗体の力価
。中和抗体の力価は、合胞体阻害アッセイで決定した。
図１９：詳細は、図９の注釈参照。実線はＴ1-ＳＰ10IIIＢペプチドに対する
抗体
力価を示す。破線はＴ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドに対する抗体の応答を示す。
図２０：ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドによるＨＩＶ ＭＮ分離株に対する、チンパ
ンジー1070の血清中和抗体のＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドによる吸収およびＤＰ2ペ
プチドによる部分的吸収。
図２１：Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドによる、アカゲザルへの抗ＨＩＶ ＭＮ
中和抗体の高レベルの誘導。
図２２：Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドによる、アカゲザルへの抗Ｔ1-ＳＰ10Ｍ
Ｎ(Ａ)ペプチド抗体の誘導。
図２３：Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドによる、高レベルの抗ＨＩＶ ＭＮ中和
抗体の誘導。
図２４：免疫原としてＦ-Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチドを用いる、アカゲザル
への抗Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ(Ａ)ペプチド抗体の誘導。図２２、２４で用いたアッ
セイは、免疫原ペプチドに対するエンドポイントＥＬＩＳＡであった（Ｅ/Ｃは2
.9より大きい）。
図２５：ＳＰ10ＭＮ(Ａ)およびＤＰ2ペプチドによる、血清の抗ＨＩＶ IIIＢ
分離株中和抗体の吸収。
図２６：パネルＡは、ＨＩＶ分離株ＭＮから得られる、Ｔ1-ＳＰ10(Ａ)と呼ば
れるＣ4-Ｖ3ペプチドの一般的モデルのデザインであって、該ハイブリッドペプ
チド中には、２つのヘルパーＴ決定基（１つはＢ7に拘束されるＭＨＣクラスＩ
のＣＴＬエピトープ、もう１つはＨＬＡ-Ａ2に拘束されるＣＴＬエピトープ）が
ある。パネルＢは、シミアン免疫不全ウイルスのエンベロープおよびシミアン免
疫不全ウイルスのgagタンパク質からデザインされたＴh-ＣＴＬペプチドを示す
。このペプチドは、Ｙasutomiら（Ｊ．Ｉmmunol．151:5096(1993)）に述べられ
ているように、霊長類において、該ペプチドがクラスＩに拘束された抗ＳＩＶ
ＣＴＬを生産できることを示すために用いられた。
図２７：ヒトを免疫するためのＴ1-ＳＰ10(Ａ)Ｔh-Ｂ-Ｔcの配列。
図２８：Ｍab 48dは、Ｃ4-Ｖ3ペプチドＴ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)に結合するが
、モノクローナル抗体17bは結合しない。Ｈaynesら（Ｊ．Ｉmmunol．151:1646(1
993)，Ｊ．Ｅxp．Ｍed．177:717(1993)）に詳述されているように、Ｔ1-ＳＰ10
ＣＡＮＯ(Ａ)Ｃ4-Ｖ3ペプチドをコートした（2μg／ウェル）ＥＬＩＳＡプレー
トに、モノクローナル抗
体を増量しながら添加した。図２８は、mab48dがＴ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)ペプチ
ドに結合したこと、および17b抗体が結合しなかったことを示す。該プレートを8
Ｍの尿素でストリップして（以前、プレート上のペプチドの直線Ｖ3決定基への
抗体の結合に影響を与えないことが示された処理）、8Ｍの尿素で該ペプチドを
処理すると該ペプチドが変性し、その後ペプチドに対する48dの結合が妨害され
ることを実証した。これらのデータは、48d抗体がＣ4-Ｖ3ペプチドＴ1-ＳＰ10Ｃ
ＡＮＯ(Ａ)上のコンフォメーション決定基に結合することを強く示唆していた。
図２９：mab 48dに対して、ペプチドが最大の結合をするには、Ｔ1-ＳＰ10Ｃ
ＡＮＯ(Ａ)ペプチド全体が必要である。Ｔ1ペプチド（Ｃ4領域のみ）、Ｖ3ペプ
チド［ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)］、Ｃ4-Ｖ3ペプチド［Ｔ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)］ま
たは同量のＣ4(Ｔ1)とＶ3[ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)]ペプチドの混合物を総濃度２μg
/ウェルで、ＥＬＩＳＡプレート上においてインキュベートした。図２９から、
対照モノクローナル抗体ＤＵ.ＨＰ20はこれらのペプチドを何れも結合しないが
、48d mabはＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)ペプチドに結合し、Ｔ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)ペ
プチドのＣ4-Ｖ3バージョンにはさらに非常によく結合することが分かる。Ｔ1と
ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)ペプチドを共に混合しても48dの結合は増大しなかった。
図３０：ＨＬＡベースのＡＩＤＳ用ワクチンに対する一般的な模式図。
図３１：機能的なネイティブＨＩＶ-1エンベロープ領域の相互作用の推定模式
図。図は、ウイルス表面上のＨＩＶ-1エンベロープタンパク質gp41が、ＨＩＶ-1
のgp120エンベロープタンパク質のＶ3ループおよびＣ5領域と相互作用すると思
われることを示している。アミノ酸は１文字コードで示されており、数字はＨＩ
ＶＢＡＬエンベロープタンパク質gp160中のアミノ酸の位置を表している。
図３２：ＨＩＶgp120およびタンパク質に対するモルモットの抗血清のウェス
タンブロット分析。組換えgp120、gp41-ＭＢＰ融合タンパク質（0.1μg/レーン
）、ＨＩＶＬＡＩ/IIIＢを感染させた、または何も感染させないＣＥＭ細胞（0.
5×106細胞/レーン）の細胞ライセートを4-20％のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離
せしめて、ニトロセルロースフィルターに転写した。4℃で、一晩10％のドライ
ミルクで該フィルターをブロックし、1:400に希釈した免疫前または免疫後のモ
ルモット血清とともに、室温で１時間インキュベートした後、西洋ワサビペルオ
キシダーゼでラ
ベルしたヤギ抗モルモットＩgＧとともに、室温で１時間インキュベートした。
結果は、化学発光技術を用いることによって可視化した。パネルＡ：ＨＩＶ-1ペ
プチドＧＴＨ1ＳＰ10ＭＮ(Ａ)で免疫したモルモットからのブタ血清を用いたウ
ェスタンブロット。同一のモルモットからの免疫前血清を対照として用いた。パ
ネルＢ：ＨＩＶ-1ペプチド、ＨＩＶ-1gp41ペプチドＳＰ400-ＢＡＬで免疫したモ
ルモットの血清を用いたウェスタンブロット。同一のモルモットからの免疫前血
清を対照として用いた。パネルＣ：ＨＩＶ-1ペプチド、ＨＩＶ-1gp120ペプチド
ＳＰ410-ＢＡＬで免疫したモルモットの血清を用いたウェスタンブロット。同一
のモルモットからの免疫前血清を対照として用いた。
図３３：ＨＩＶＬＡＩ/IIIＢを感染させたＣＥＭ細胞上のＨＩＶペプチドに対
するモルモット抗血清の間接免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析。4℃で4
5分間ＨＩＶＬＡＩ/IIIＢを感染させた、または何も感染させないＣＥＭ Ｔ細胞
（106細胞）とともに、ＨＩＶエンベロープペプチドで免疫する前および免疫し
た後のモルモットの血清をインキュベートした後、4℃でさらに45分間ＦＩＴＣ
でラベルしたヤギ抗モルモットＩgＧとともにインキュベートした。次に、細胞
を洗浄し、1％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリープロファ
イラーによって分析した。結果は、蛍光強度を反映する平均蛍光チャンネル数と
して表した。データは２つの実験の平均値を表している。
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶの免疫原性エピトープに対応するペプチド及びこれらから作
成される合成ワクチンに関する。これらの新規な免疫原性剤は、抗原決定基をＨ
ＩＶのエンベロープタンパクと共用する化学的に合成したペプチドによって調製
される。該ペプチドは、これらをワクチンとして適切にしうるキャリアー分子に
結合される（及び／又は重合される。）。これらのワクチンは、動物に、例えば
非経口経路で投与される場合、ＡＩＤＳ対する免疫化に有用である。
免疫原性の可能性を試験されるペプチドは、ＨＩＶエンベロープ糖タンパクの
親水性で荷電した領域に対応するものを誘導することが決定された。このような
ペプチドのうち、予想されたベータ回転を有するものが特に重要であるように思
われることが決定された。ペプチド内ジスルフィド結合の形成が天然配置の決定
因子を確立するのに有用であろうことが認識された。また、鎖内ジスルフィド結
合が、より大きくより免疫原性なペプチド集合体を形成するようにペプチド分子
を重合するのに有用であろうことが認識された。
ＨＩＶのＨＴＬＶ-IIIB及びＡＲＶ-2単離物のエンベロープタンパクの予想さ
れるアミノ酸配列のコンピュータ分析で、二次構造及び親水性領域の位置が確立
された。二次構造を、Ｃhou及びＦasman(Ｂiochemistry 13:211及び13:222，197
4; Ａdvances in Ｅnzymology 47:45，1978)の方法を用いてコンピュータ分析で
決定した。ベータ回転の可能な領域を、Ｒose(Ｎature 272:586，1978)の方法に
よって位置決定した。エンベロープタンパクの親水性領域を、Ｒose及びＲoy(Ｐ roc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ
77:4643，1980)の手法で同定した。
本発明のペプチドは、ＨＩＶ単離物ＨＴＬＶ-IIIBエンベロープタンパク、又
は関連したＨＩＶ単離物のエンベロープタンパクの中心領域内に存在するＢ−細
胞エピトープに対応するか、又はこれらと相同性である。本発明のペプチドは、
約３５のアミノ酸（ユニット）以下の長さであり、親水性であり、適切なキャリ
アー分子と複合体を形成した場合、ＨＩＶに対する抗体を特異的に中和するタイ
プ（又は単離物）の高タイターの動物中において産生を引き起こす（これは、有
利には、１：６００希釈の血清で、in vitroにおいて、約８０％の１００感染単
位の感染性の減少である。）。完全なgp120分子とは逆に、ペプチド自身は、Ｔ
リンパ球の表面のＣＤ4
（Ｔ4）分子とＨＬＡクラスII分子との間の相互作用を阻害することができず、
従って、正常な免疫機能を妨害しない。即ち、抗体を中和する抗ＨＩＶを誘導す
ることができる本発明のペプチドは、in vitroで抗原特異的正常Ｔ細胞の成長応
答を阻害しない。
本発明のペプチドは、ＨＴＬＶ-IIIBエンベロープ糖タンパクgp120（Ｒatner
et al.、Ｎature 313:277，1985）のアミノ酸３０３〜３２１に対応する、配列
ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧ（ＳＰ-10と称される。）又はその配
列のいくつかの部分を有しうる。本発明のペプチドはまた、ＨＴＬＶ-ＩＩＩB以
外のＨＩＶ単離物、又はこれらの部分の類似のＳＰ-10領域に対応する配列を有
することができ、これらの配列を、「ＳＰ-10様」と表した（例えば、表Ｉの配
列参照）。
表示「ＳＰ-10様」は、ＳＰ-10配列自身をその意味の範囲に含む。
本発明のペプチドが共有結合される（複合体形成される）キャリアー分子は、
有利には、非毒性で薬学的に許容でき、哺乳動物で免疫応答を起させるのに十分
なサイズである。適切なキャリアー物質の例には、破傷風トキソイド、キーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及び非ＡＩＤＳウイルスから誘導されたキ
ャリアー分
子（Ｃease，Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)84:4249，1987; Ｋennedy
et al.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem. 262:5769，1987）に置換しうるgp120エンベロープ
糖タンパクのＴ細胞エピトープ（即ち、Ｔ1及びＴ2）に対応するペプチドが含ま
れる。ペプチドはまた、薬学的に許容しうるアジュバント、例えばalum、ととも
に投与されうるか、又は破傷風トキソイドよりも免疫原性である他のキャリアー
分子と複合体を形成して投与されうる。
本発明のペプチドへのキャリアー分子の結合は直接であるか、又はスペーサー
分子を介する。スペーサー分子は、有利には、非毒性で反応性である。ペプチド
のアミノ末端に付加された２つのグリシン残基は、ＳＰ-10様配列又はその一部
をキャリアー分子に結合するのに適切なスペーサー分子である。このほかには、
例えばＳＰ-10様配列、又はその一部は、例えば他の免疫原性ＨＩＶエンベロー
プ配列、例えばＴ1又はＴ2に隣接して、直接に合成されうる。システインは、Ｓ
Ｐ-10様ペプチドのＮ又はＣ末端で、キャリアー分子に、又は両末端に複合体を
形成させるために付加され、ジスルフィド結合を介した鎖内重合を促進し、より
大きな分子集合体を形成する。
キャリアー分子のペプチドへの複合体形成は、カップリング剤を使用して達成
される。有利には、Ｇreenら(Ｃell、28:477; 1982)及びＰalkerら（Ｐroc．Ｎa t'l Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)
84:2479，1987）により開示された異種官能基カップ
リング剤、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル（
ＭＢＳ）、又は水溶性化合物、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホ琥珀酸イミドエ
ステル（スルホ−ＭＢＳ）を使用する。
本発明のワクチンは、１以上のＳＰ-10様ペプチド、又はこれらの一部を含有
し、各ＳＰ-10様ペプチドは、異なったＨＩＶ株から誘導され、これらのペプチ
ドは、キャリアー分子と複合体形成している。合成ペプチドの混合物、有利には
、例えば表Ｉに定義した単離物に配列が対応するものの約２から約１０を含有す
る多価ワクチンは、ＨＩＶの種々の形態に対して人に免疫性を付与するのに使用
されうる。
有利には、ＨＴＬＶ-IIIB(表Ｉ参照)のＳＰ-10配列は、gp120エンベロープＴ
細胞エピトープＴ1（gp120のアミノ酸４２８〜４４３）、ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶ
ＧＫＡＭＹＡ、又はＴ2エピトープ（ＨＴＬＶ-IIIBgp120のアミノ酸１１２〜１
２４）、
ＨＥＤＩＩＳＬＷＮＱＳＬＫ（Ｃeaseら、Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci(ＵＳＡ)
84:4249，1987）と複合体形成されるか、又はこれで合成され、単一ペプチドを
形成する(Ｔ1-ＳＰ-10の場合、ＨＩＶのＨＴＬＶ-IIIB単離物、ＫＱＩＩＮＭＷ
ＱＥＶＧＫＡＭＹＡＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧから)。同様に、
他のＨＩＶ単離物からのＴ1又はＴ2配列は、対応する単離物（表Ｉ参照）のＳＰ
-10領域から誘導される合成ペプチドに、有利には、ＳＰ-10様ペプチドのＮ末端
で結合され、ＨＩＶの特異的な株に対する中和抗体タイターを誘導することがで
きるＴ1（又はＴ2-）-ＳＰ-10様ペプチドを作成する。ＳＰ-10様ペプチドのＣ末
端での結合も可能である。
ＳＰ-10様ペプチドのより小さな部分、例えばＳＰ-10 ＲＦ(Ａ)及びＳＰ-10Ｃ
（表II）もキャリアー分子に共有結合でき、gp-120Ｔ細胞エピトープを誘導し、
ワクチンに使用されうる。
本発明はまた、ＨＩＶの株に対する効果的な保護ワクチンであって、ＳＰ-10
様配列及び適切なキャリアー分子に加えて、gp120エンベロープ分子からの追加
の配列を含有するものに関する。表ＩでＳＰ-10様と命名されたペプチドに対し
てはカルボキシ末端である主超可変領域があり（エンベロープアミノ酸３２２〜
３３３、Ｒatnerら、Ｎature 313:277，1985）、該超可変領域がＳＰ-10様ペプ
チドの能力を高める役割をし、タイプ特異性中和抗体を出現させるので、ＨＩＶ
単離物の超可変領域に対応するアミノ酸配列（ほぼ、アミノ酸３２２〜３３３）
は、他のＳＰ-10様ペプチド（例えば、表IIの配列参照）に対して開示されてい
るように、一部又は全部がワクチンの成分として含まれうる。超可変領域の配列
は、ＳＰ-10様ペプチドに、有利にはＣ末端で結合される。ＳＰ-10様ペプチドの
Ｎ−末端での結合も可能である。
本発明はまた、ＨＩＶの株に対して効果的な保護ワクチンであって、ＳＰ-10
様配列及びキャリアー分子に加えて、ウイルスで誘導される細胞融合に関連する
ＨＩＶgp41膜内外領域に対応するペプチド、ＦＬＧＦＬＧ（Ｇallagher，Ｃell
50:327，1987）を含有するものに関する。ＦＬＧＦＬＧ配列は、有利には、ＳＰ
-10様ペプチドのＣ末端に加えられる。ＳＰ-10様ペプチドのＮ末端での付加も可
能である。
本発明はまた、システイン-Ｔ1-(又はＴ2-)ＳＰ-10様、システイン-Ｔ1-(又は
Ｔ2-)ＳＰ-10様超可変領域又はシステイン-Ｔ1-（又はＴ2-）ＳＰ-10様-ＦＬＧ
ＦＬＧポリペプチド；及び／又はＳＰ-10様-システイン又はＳＰ-10様-超可変領
域-システインポリペプチドから形成される、ＨＩＶに対する効果的なワクチン
に関する。これらのポリペプチドは酸化剤で処理され、ポリペプチド鎖のシステ
イン間にジスルフィド結合を導入し、重合を行い、これによって高い免疫原性の
抗原を誘導することができる。このように形成された分子集合体は、有利には、
少なくとも２つのＨＩＶ単離物か
ら誘導される（これに対応する）ＳＰ-10様ペプチドを含有する。
本発明の多価ＨＩＶワクチンは、有利には、２以上のＨＩＶ単離物から誘導さ
れるＳＰ-10様配列、又はこれらの一部（例えば表Ｉの配列参照）を含有する２
以上の複合体、及び破傷風トキソイドのようなキャリアー分子、又は２以上のＴ
1-又はＴ2-ＳＰ-10様ペプチド複合体（但し、Ｔ1（又はＴ2）及びＳＰ-10様配列
は特異的なＨＩＶ単離物に存在する配列に対応する。）を含有する。
キャリアー物質として、ヘルパーＴ細胞により認識されるgp120のタンパクを
反映する合成ペプチドを使用する利点は、破傷風トキソイドのような他のキャリ
アー分子が全く必要ないであろうこと、及びＨＩＶに応答するＢ及びＴ細胞が特
異的であろうことである。多価ワクチンで、異なった単離物のＳＰ-10領域から
の配列を反映する幾つかのペプチドと、可能性としてgp120エンベロープのＴ細
胞認識領域を組み合わせることで、単離物特異的な中和の問題が回避される。
本発明はまた、上記の超可変配列（例えば表II参照）に結合されるＳＰ-10様
ペプチドを含有する多価ワクチンに関連する。適切なキャリアー分子に結合され
た、及び／又はジスルフィド結合形成を介して重合された、このようなポリペプ
チドの混合物（Ｈarington，Ｃ.Ｒ．ら、Ｂiochem．Ｊ.，30:1598，1930; Ｈari
ngton，Ｃ.Ｒ．ら、Ｂiochem．Ｊ．38:417，1944; Ｗeygandら、Ｚ．Ｎaturfors ch.
，176:807，1962）は、ＨＩＶの複数の単離物に応答する保護抗体を惹起する
ワクチンとして使用しうる。
ＳＰ-10様ペプチドは、固相ラジオイムノアッセイ（Ｐalkeら、Ｊ．Ｉmmunol ．
136:2393，1986;ibid.，Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci.(ＵＳＡ)84:2479，1987
）に使用でき、（ｉ）ＨＩＶの中和抗体の存在及びタイターを検出すること、及
び（ii）患者が感染されているＨＩＶの株を決定することができる。従って、ワ
クチン又はワクチンの成分として使用されるＳＰ-10様ペプチドに加えて、上記
のペプチドを診断の目的に使用しうる。本発明のペプチドはまた、標準的な酵素
結合免疫吸着検定法に使用でき、ＨＩＶ抗体の存在を検出できる。
上記の特徴的な側面のまとめ及び補足として、本発明は、少なくとも部分的に
は、ＨＩＶタンパクの少なくとも２つの領域、Ｂ細胞(Ｐalkerら、Ｊ．Ｉmmunol .
142:3612，1989)及びヘルパーＴ細胞（Ｃaasaら、Ｐroc．Ｎatl.，Ａcad.．Ｓ ci.(ＵＳＡ)
84:4249，1987）の両方によって認識されると報告されているＴ1 gp
120 env領域、及びＳＰ-
10様gp120 env領域であって、該領域がヘルパーＴ細胞並びにＢ細胞によっても
認識され、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を中和することができる抗体を誘導
するものを含有する合成ペプチドに関する（すぐ上に示した、Ｐelkerらの参照
文献参照；Ｐalkerら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)85:1932，1988；
及びＲuscheらＰroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)85:3198-3202，1988；並び
にＧoudsmitら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)85:4478，1988も参照）
。（表III及びIV参照。）
Ｍeyersら、ヒトレトロウイルス及びＡＩＤＳ、１９８８年、ロスアラモス国立
研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ、Ｐ１１ ６８〜９２からの配列。
Ｒatnerら、Ｎature，313:277，1985からの配列。
Ｔ1-ＳＰ-10様ペプチドにより産生される中和抗体であって、これらの抗体が
ＨＩＶ ＨＴＬＶIIIＢ（IIIＢ）単離物に対して生じるものは、ＨＩＶ ＨＴＬＶ
ＩＩＩＭＮ（ＭＮ）又はＨＴＬＶＩＩＩＲＦ（ＲＦ）ＨＩＶ単離物を中和しない
（Ｐalkerら、Ｊ．Ｉmmunol．142:3612，1989）。同様に、ＭＮ及びＲＦ ＨＩＶ
単離物からの配列を含有するＴ1-ＳＰ10様ペプ
チドに対して生じる中和抗体は、相同の単離物を中和するが、他の２つのＨＩＶ
単離物のいずれも中和しない。しかし、ヤギ抗-Ｔ1-ＳＰ10様抗血清を、ノース
カロライナの９のＨＩＶ地域の単離物に対して試験した場合、抗-Ｔ1-ＳＰ10III
Ｂ血清が観測され、９のＨＩＶ単離物のうち１を中和し、抗-Ｔ1-ＳＰ10ＲＦ血
清は、９のＨＩＶ単離物のうち３つを中和し、抗-Ｔ1-ＳＰ10ＭＮ血清は９のＨ
ＩＶ単離物のうち６を中和した（Ｈaynesら、ＡＩＤＳ Ｒes．Ｒetrol．6:38，1
990）。（表Ｖ参照）
Ｌa Ｒosaら（Ｓcience 249:932，1990）は、ＨaynesらによってＡＩＤＳ Ｒe s．Ｒetrol．
（上記）で開示したＨＩＶ ＭＮモチーフが、合衆国周辺のＡＩＤ
Ｓ患者から培養したＨＩＶ単離物の有力なモチーフの１つであることを示した。
Ｐalkerら（Ｊ．Ｉmmunol. 142:3612，1989）は、ウイルス単離物からのペプ
チドを混合する戦略が、ＨＩＶエンベロープの３０３〜３３７領域の発散性アミ
ノ酸でＨＩＶの多くの株に対して抗体を生じさせる問題に対して好結果のアプロ
ーチとなることを最初に報告した。更に、Ｐalkerらは、Ｔ1-ＳＰ10-様ペプチド
が、ＫＬＨ又は破傷風トキソイドのようなキャリアー分子にカップリングされた
合成ペプチド以上に有利であることを報告した。ペプチドにカップリングされた
キャリアーのみが、ペプチドの多価混合物中のキャリアーに対して大量の抗体を
誘導するが、ＨＩＶ IIIＢenv(アミノ酸４２９〜４４３)のＴ1配列がＳＰ10配列
(アミノ酸３０３〜３２１)へＮ−末端で共有結合された場合、このキャリアーを
含まない免疫原は、３つのすべてのＨＩＶ単離物（その配列は、Ｔ1-ＳＰ10ペプ
チドに存在する。）に対する抗体を中和する高いタイターを誘導する。更に、Ｈ
artら（Ｊ．Ｉmmunol. 1990）は、Ｔ1-ＳＰ10ペプチドがアカゲザルの細胞を免
疫するのに非毒性であり、これらの霊長類においてin vivoで高タイターの中和
抗体及びＴヘルパー細胞を誘導できることを最近示した。従って、Ｔ1-ＳＰ10様
合成ペプチド構築物は、高タイターの抗−ＨＩＶ
中和抗体応答及びＴ−ヘルパー細胞応答をヤギ及び霊長類で誘導するための、シ
ンプルで、非毒性で、且つ高効率の分子である。
ＡＩＤＳに対するワクチンを開発する際の主要な問題の１つは、抗体応答が単
独で、細胞フリーのＨＩＶ及びＨＩＶに感染した細胞の両方に対して個体を保護
することができるかどうか、又は細胞媒介性免疫応答（抗原特異的細胞障害性Ｔ
細胞）が更に必要であるかどうかの疑問である。確かに、多くの他のウイルス性
感染は、保護免疫性の発生に、抗体及び細胞性抗−ウイルス性免疫応答の両方を
必要とする（Ｌongら、Ｉmmunol．Ｔoday 10:45，1989）。加えて、ＩgＧ及びＩ
gＡ抗体応答からなる粘膜表面での局所免疫性、及び粘膜表面に関連した細胞障
害性Ｔ細胞活性が、性的な接触を介するか又は粘膜表面が感染血液へさらされる
ことを介したＨＩＶの伝染を防御するのに必要である。従って、中和抗体及びＴ
ヘルパー細胞応答を誘導するのに加えて、ＨＩＶに対する細胞障害性Ｔ細胞（Ｃ
ＴＬ）を誘導する合成ペプチド免疫原が開示される。上で開示され、まとめられ
た態様に加えて、本発明はこのような免疫原に関する。
Ｆ領域（例えば、ＢＨ10/IIIＢ ＨＩＶ単離物のアミノ酸５１９〜５３０及び
他のＨＩＶ-1、ＨＩＶ-2及びサルの免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）単離物の相同性
領域）は、パラミクソウイルスのＦ1（融合）ペプチドに配列相同性を有する（
Ｇallaher Ｃell 50:327，1987）。Ｆ領域は、細胞膜の脂質二重層に挿入し、細
胞融合を誘導することができる疎水性らせん構造を形成するのに必要とされてい
る。Ｂoschら(Ｓcience 244:694，1989)は、ＳＩＶのＦ領域（即ち、ＢＨ10/III
Ｂ ＨＩＶ単離物の５１９〜５３０env gp41領域に相同的な領域）が、ＳＩＶに
感染した細胞の細胞融合を実際に媒介することを示した。
Ｆ−派生ペプチドは、多くのウイルス性感染の制御に必要である、同じタイプ
の細胞障害性Ｔ細胞の応答、即ちＨＬＡ−拘束性ＣＤ8+細胞障害性Ｔ細胞の生成
を誘導するように免疫細胞中でインターナリゼーションされることが示された。
Ｆ−派生ペプチドは免疫系の細胞と相互作用し、これによって哺乳動物に注射さ
れた場合に、これらは抗−ＨＩＶメモリーＴヘルパー細胞活性、抗−ＨＩＶ中和
抗体、及びメモリー抗−ＨＩＶ ＣＤ8+、ＨＬＡ−クラスＩ拘束性細胞障害性Ｔ
細胞応答を誘導する。
従って、本発明は、好ましい態様では、下記一般式のペプチドに関する。
Ｆ-Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)
Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)
Ｔh-ＳＰ10
及び
Ｆ(Ｘ)
但し、Ｆの配列は、ＨＩＶ env gp41の推定フソジェニック（fusogenic）ドメ
イン（例えば、ＨＩＶ単離物ＢＨ10/IIIＢのアミノ酸５１９〜５３０又は他のＨ
ＩＶ-1、ＨＩＶ-2又はＳＩＶ単離物の相同性領域、又はこれらの機能的に等価な
配列）からのものである。
Ｔh配列は、Ｔ1又はＴ2の何れかのＴヘルパーエピトープであるか、又はこの
他には表Ｘ（以下）に挙げたＴヘルパー細胞エピトープの何れか、又は列挙して
いないが、Ｔヘルパーエピトープとして機能するＨＩＶタンパクの他の領域から
のアミノ酸配列である。
ＳＰ10様配列は、表Ｉ又はII（以下の表VIIIも参照）から、又はＨＩＶ地域の
単離物からの何れかのＳＰ10様配列からのものである（例えば、ＬaＲosaら、Ｓ cience
249:932，1990参照）。
更に、(Ｘ)配列は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスII拘束性細胞障害性Ｔ細胞によ
って認識されるＨＩＶタンパク配列である。(Ｘ)領域の配列の例は、以下の表VI
II及びIXに示されている。
この他には、Ｆ配列は、例えばＴh-ＳＰ10(Ｘ)配列に対してＣ−末端にありう
る。更に、Ｔh、ＳＰ10及び(Ｘ)配列は、ペプチド構築物中で任意の順序で配列
されうる。
本発明のこの態様の合成ペプチド免疫原は、抗−ＨＩＶ中和抗体、抗−ＨＩＶ
ヘルパーＴ細胞、及び抗−ＨＩＶ細胞障害性（キラー）Ｔ細胞を誘導することが
できる。当業者は、この免疫原（これは融合タンパクである。）が当分野で公知
の、化学的又は組換え手段によって合成されうることを認識するであろう。
免疫原は、例えば構造：Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10-(Ａ)を有しうる。このような免疫原の
例は、表III及びIVに示されているが、当業者は、地域又は実験室のＨＩＶ単離
物からの何れかのＳＰ10様配列（例えば、ＬaＲosaら、Ｓcience 249:932，1990
）が表III及びIV（表Ｉ及びIIも参照）に示されたＳＰ10配列に対して置換され
うることを認
識するであろう。
Ｔ1様配列は、表VIに示されたものを含めた何れかの配列決定されたＨＩＶ単
離物からの相同性配列から選択されうる。
ＢＨ10に対する配列は、Ｒatner，Ｌ．ら、Ｎature 313:277-284，1985からのア
ミノ酸４２８〜４４３である。
Ｍyersら、Ｈuman Ｒetroviruses and ＡＩＤＳ，1988、ロスアラモス国立研究
所、ロスアラモス、ニューメキシコ、p.II-89からのＨＩＶ-1及びＨＩＶ-2単離
物の残余に対する配列。
：＝アミノ酸なし。
Ｆ様配列は、表VIIに示されたものを含めた何れかの配列決定されたＨＩＶ単
離物からのＦ−相同性配列から選択されうる。
ＢＨ10に対する配列は、Ｒatner，Ｌ．ら、Ｎature 313:277-284，1985からのア
ミノ酸５１９〜５３０である。Ｍyersら、Ｈuman Ｒetroviruses and ＡＩＤＳ
，1988、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ、p.II-90か
らのＨＩＶ-1及びＨＩＶ-2単離物の残余に対する配列。ＷＭＪ1配列は、Ｂrasse
urら、ＡＩＤＳ Ｒes．Ｈum．Ｒetrovirol. 4:83-90，1988からのものである。
：＝アミノ酸なし。
(Ａ)領域様の配列は、表II及び表VIIIに示されるものを含めた何れかのＨＩＶ
単離物からの(Ａ)−相同性配列から選択されうる。
ＢＨ10（IIIＢ）からの配列は、Ｒatnerら、Ｎature 313:270-284，1985からの
配列である。
本発明は更に、生じた構築物が、ＨＩＶに対する中和抗体及び細胞障害性Ｔ細
胞を誘導しうるような、ＨＩＶ gp41置換された（共有結合）Ｎ末端から、地域
単離物からの何れかのＨＩＶ配列（例えば表II参照）からのＢＨ10又はＢＨ10様
領域までのＦ領域を含有するペプチド(即ち、例えばＢＨ10/IIIＢ単離物又は他
のＨＩＶ-1、ＨＩＶ-2又はＳＩＶ単離物の他の相同性領域)に関する。
当業者は、本発明の開示を読むことによって、以下のことを認識するであろう
。即ちそれは、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞が、例として１２のアミ
ノ酸：ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ(Ｆ)よりなるＨＩＶ gp41の５１９〜５３０の
アミノ酸領域、又は、例えば３から５０のアミノ酸の長さの範囲の何れかの他の
ペプチドに共有結合された単離物ＢＨ10／IIIＢ（表VII）の５１９〜５３０アミ
ノ酸配列に相同性である他のＨＩＶ-1、ＨＩＶ-2又はＳＩＶ単離物のＦ−領域配
列(例えば、表VII参照)をin vivoで投与することによって誘導されるということ
である。この場合、Ｆ−に結合したペプチドが、Ｆに共有結合された合成ペプチ
ドをプロセッシング及び提示を行うような形式で抗原提示細胞と結合し、その結
果ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に関連してＴ細胞に提示され、in vivoでＣＤ8
+細胞障害性Ｔ細胞の発達を起こさせるのであろう。高い効果を有するエイズワ
クチンの関係では、in vivoで細胞障害性Ｔ細胞
を誘導することができるＨＩＶタンパクのアミノ酸配列にＮ又はＣ末端でカップ
リングされたＦアミノ酸配列（例えば、表VII参照）を含有する幾つかのＦ−派
生ハイブリッドＨＩＶペプチドが構築されうる。ＨＬＡクラスＩ細胞障害性Ｔ細
胞によって認識されうる説明したＨＩＶペプチドの例を表IXに示す。
この後者の戦略は、細胞障害性Ｔ細胞エピトープを特異的多形ＨＬＡクラスＩ又
はクラスII分子によって認識するということにおいて重要である。１のみのこの
ようなエピトープ［(Ａ)ペプチドのようなペプチドの一本鎖配列によって表され
る。］がワクチンに存在すれば、ペプチドを細胞障害性Ｔ細胞に提示するのに使
用する特異的ＨＬＡ抗原を有するこれらの個体のみがＨＩＶに対する細胞障害性
Ｔ細胞を発達させるであろう。しかし、非常に多くのＦ−派生ペプチドであって
、各々が細胞障害性Ｔ細胞によって明瞭なＨＬＡクラスＩ及びクラスII分子に関
連して認識されうるペプチドを含有するものが、免疫原に含まれる場合、ＨＬＡ
型の広いスペクトルを有する個体は、ＨＩＶに対する細胞障害性Ｔ細胞を作成す
るであろう。
従って、集団の多くの人に抗−ＨＩＶ細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ
る免疫原は、有利には、ペプチドの混合物であって、この各々が、明確なＨＬＡ
クラスＩタイプ（例えば）によって認識されるものを含有する。従って、全体と
して、該混合物は、免疫原であり、ひとまとめにして考えても、与えられた集団
内の多くの個体により発現されるクラスＩタイプの分子によって認識されるペプ
チドを含有する。表IXは、説明した細胞障害性Ｔ細胞エピトープ及び、公知であ
れば、これらのＨＬＡ拘束性要素であって、Ｆ−配列により派生されうるペプチ
ドのタイプであり、Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10(Ａ)ペプチドとの混合物として使用されるも
のの例を示す。この他には、表IXの配列は、(Ａ)配列の代わりにＦ-Ｔ1-ＳＰ10
ペプチド内のＳＰ10配列及びエイズワクチンとして使用されるＦ-Ｔ1-ＳＰ10(Ｘ
)ペプチド（Ｆ-Ｔ1-ＳＰ10(Ｘ)の形態で、Ｘは(Ａ)配列（表II及びVIII参照）又
は表IXに列記されたような他の細胞障害性Ｔ細胞を誘導する配列の何れかである
。）にＣ−末端で共有結合されうる。
Ｔ細胞障害性エピトープに応用するＭＨＣ拘束性の同様の考え方をＴヘルパー
エピトープにも応用する。即ち、Ｔヘルパー細胞による抗原の認識は、ＨＬＡ拘
束性であり、個体群コーホートの非常に多数の構成要素が免疫原に応答し、免疫
原に対してＴヘルパー細胞の応答を生じさせるには、十分なＴヘルパー細胞エピ
トープが存在する必要がある。これは、Ｔヘルパーエピトープ（この範囲内で、
各患者のＴ細胞がこれらの独特のＨＬＡクラスII分子に関連してプロセッシング
された抗原を判断することができる。）の十分な多様性を利用しうるためである
。表Ｘは、Ｆ-Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)構築物中のＴ1又はＴ2配列に対して置換され、該
構築物中に、この他
のＴヘルパー細胞エピトープを提供しうるＨＩＶタンパクのＴヘルパー細胞エピ
トープを示す。
上記の最初の２０のペプチドの配列は、Ｓchrierら(Ｊ．Ｉmmunol. 142:1166-11
76，1989)からのものであり、配列Ｔ1、Ｔ2、Ｔh4及びp18は、Ｃlericiら(Ｎatu re
339:383-
385，1989)からのものである。
研究により、同じＴヘルパー細胞エピトープが複数のＨＬＡクラスII特異性に
関連したＴ細胞により認識され、従って、わずかなＴヘルパーエピトープのみが
効果的な合成ペプチドをベースとしたエイズワクチンを調製するのに必要である
ことが示された。Ｃlericiら（Ｎature 339:383-385，1989）は、研究した集団
の８５％のＴ細胞がＴ2又はＴ1の何れかのＴヘルパー細胞エピトープ（表Ｘ参照
）を認識しうるというデータを示した。Ｓchrierら（Ｊ．Ｉmmunol. 142:1166-1
176，1989）は、ＨＩＶタンパク内の多くのヘルパーＴ細胞エピトープを同定し
、試験した集団の９３％のＴ細胞が、４つのＴヘルパー細胞エピトープ（表Ｘ参
照）の少なくとも１つに応答するということを示した。
従って、好ましい態様では、本発明のエイズワクチンは、下記一般構造及び下
式のペプチドの混合物の組成物を有する。
Ｆ-Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)
Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)
Ｔh-ＳＰ10
及び
Ｆ(Ｘ)
但し、上記式において、Ｆ配列はＨＩＶenv gp41の推定フソジェニックドメイ
ン（例えば、ＨＩＶ単離物ＢＨ10/IIIＢ内のアミノ酸５１９〜５３０又は他のＨ
ＩＶ-1、ＨＩＶ-2又はＳＩＶ単離物内の相同性領域、又はこれらの機能的に等価
な配列）（例えば表VII参照）からのものである。Ｔh配列は、Ｔ1又はＴ2の何れ
かのＴヘルパー細胞エピトープであるか、又はこの他には、表Ｘに列記した何れ
かのＴヘルパー細胞エピトープ又は列記されていないがＴヘルパー細胞エピトー
プとして機能するＨＩＶタンパクの他の領域からのアミノ酸配列であり、ＳＰ10
様配列は、表Ｉ、II又はIII、又はＨＩＶ地域単離物からの何れかのＳＰ10様配
列からのもの（例えば、ＬaＲosa，Ｇ．ら、Ｓcience 249:932-935，1990参照）
である。更に、(Ｘ)配列は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスII拘束性細胞障害性Ｔ細
胞によって認識されるＨＩＶタンパク配列である。(Ｘ)領域配列の例は、表VIII
及びIXに示されている。
本発明のエイズワクチンを構成するＦ-Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)、Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)、Ｔh
-ＳＰ10及びＦ(Ｘ)ペプチド、及び多くの他のペプチドに含まれる実際の配列は
、与えられた個体群コーホートの多数の対象内の細胞障害性Ｔ細胞及びＴヘルパ
ー細胞応答を誘導することが必要な多くの細胞障害性Ｔ細胞(Ｘ)及びＴhエピト
ープによって決定される。当業者は、Ｆ、Ｔh、ＳＰ10及び(Ｘ)が各々の上記の
機能を維持する限り変化しうるということを認識するであろう。保護抗-ＨＩＶ
中和抗体の誘導に対しては、Ｆ-Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)ペプチドに存在する必要のある
特異的ＳＰ10様配列は、所定の時に与えられた集団での種々のＨＩＶ単離物の変
異体に依存する。当業者は、この情報が、該集団で積極的に及び連続的にモニタ
ーされ、上記変異しうるものの変化に依存して、時々、エイズワクチンの処方を
変化する必要があることを認識するであろう。
多くの異なったＨＩＶ単離物を含む集団での保護抗−ＨＩＶ中和抗体の誘導は
、上記のワクチン戦略を使用して、及び／又はgp120の保存配座決定子を模倣し
た少なくとも１つのペプチド構築物を使用して行うことができ、これによって、
広範な交差反応性抗−ＨＩＶ抗体を誘導することができる。このような構築物の
１つは、天然のＨＩＶ gp120 Ｃ4-Ｖ3領域の配座決定子のミメオトープ（mimeot
ope）の形態をとり、Ｔ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)(表XXIII参照)によって例示される
。ＣＡＮＯエンベロープの一次Ｖ3配列は、他のＨＩＶエンベロープＶ3配列（再
度表XXIIIを参照）とは全く異なっているが、Ｔ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)ペプチド
は種々のＨＩＶ Ｖ3モチーフに対する交差反応性抗−Ｖ3抗体を誘導する（例１
１参照）。この交差結合性の誘導は、ＨＩＶ gp120の広範な中和決定子をミラー
リングするＴ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(Ａ)Ｃ4-Ｖ3ハイブリッドを生じるＨＩＶ ＣＡＮ
Ｏ単離物のＶ3ループの二次及びより高次の構造による。これは、ヒト抗−gp120
モノクローナル抗体48d（これは、gp120へ結合するＣＤ4を妨害するマウスモノ
クローナル抗体をブロックするが、これ自身は、gp120-ＣＤ4結合をブロックし
ない（Ｔhaliら、Ｊ．Ｖirol．67:3978-3988(1993)。）がＴ1-ＳＰ10ＣＡＮＯ(
Ａ)を結合するという事実によって示される。
他の態様（戦略）として、効果的なワクチンは、例えばポリメラーゼ連鎖反応
分析又は従来のＨＬＡ組織型別分析の何れかによって個々の個体に対するＨＬＡ
クラスＩ及びクラスIIタイプを決定することによって処方されうる。このような
処方に基づいて、Ｆ-Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)、Ｔh-ＳＰ10(Ｘ)、Ｔh-ＳＰ10及びＦ(Ｘ)
製剤に含められる必要
のある特異的免疫原が決定されうる。従って、この後者の態様では、対象に与え
られるペプチドは、所望の抗−ＨＩＶ Ｂ及びＴ細胞応答を顕在化させるために
必要なものである。
上記の解釈から、当業者は、これが何れかの感染性疾患に対するワクチンの開
発に対する一般的な戦略であることを認識するであろう。更に、ＨＩＶ g41エン
ベロープからのＦ領域を細胞障害性Ｔ細胞により認識されうる何れかの配列と複
合体形成させる能力（これによって注射に適した直鎖状ペプチドを創製し、ＭＨ
ＣクラスＩ分子に関連した細胞障害性Ｔ細胞により認識されうる。）により、細
胞障害性Ｔ細胞エピトープを有する何れかのペプチドに対してＭＨＣクラスＩ拘
束性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する簡単で効果的な方法が提供される。これは、細
胞障害性Ｔ細胞エピトープの配列が襲来する微生物のタンパクから誘導されるか
どうか、又は細胞障害性Ｔ細胞エピトープ配列が宿主タンパクから誘導されるか
どうかに関わらないケースである。
宿主タンパクからの配列を含めたＦ派生ペプチドの使用の例として、Ｎ−又は
Ｃ−末端の何れかでＭＨＣクラスＩ又はクラスIIに関連した細胞障害性Ｔ細胞に
よって認識されうるペプチドに複合体形成されるＨＩＶ gp41Ｆ配列(例えば、Ｂ
Ｈ10/IIIＢＨＩＶ-1単離物がらのアミノ酸５１９から５３０又は他のＨＩＶ-1、
ＨＩＶ-2又はＳＩＶ単離物の相同性領域から、又はこれらに対して機能的に等価
な配列）を含有するＦ派生ペプチドが、使用されうる。このようなペプチドに対
する配列は、種々の自己免疫疾患、感染性疾患及び臓器移植のセッティングにお
いて宿主組織の破壊を媒介する、自己反応性Ｔ細胞の表面に発現される抗原分子
に対するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)の可変領域から誘導される。
Ｓunら（Ｎature 332:843，1988; Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol. 18:1993，1988）は、
脳炎誘発性Ｔ細胞上のイディオタイプ決定子に特異的であり、実験的な自己免疫
性脳脊髄炎に対する耐性を好んで伝達する細胞障害性Ｔ細胞クローンの単離を報
告した。Ｔ細胞の自己免疫クローンに対する免疫応答を誘導するであろう免疫原
で、自己免疫疾患を有する対象を免疫化するという概念は、重要な実験的アプロ
ーチであると認識されている（Ｃohenら、Ｉmmunol．Ｔoday 332，1988; Ｈowel
lら、Ｓcience 246:668，1989; Ｗralthら、Ｃell 57:709，1989に概説されてい
る。）。従って、本発明は、
宿主抗原に対してＭＨＣ拘束性クラスＩ又はクラスII細胞障害性Ｔ細胞を誘導す
るための簡単で効果的な方法を提供し、これによって、自己免疫疾患に対するワ
クチンの開発における主要な利点が示される。
標準的な組換えＤＮＡ技術を使用し、ＴＣＲ分子抗原結合領域に対するプロー
ブ及び配列を存在させて、ＴＣＲ分子の独特な領域から配列を得ることができる
（Ｂarnsら、Ｊ．Ｅxp．Ｍed. 169:27，1989）。Ｆ派生ペプチドは、上記疾患の
範疇で、抗原特異的Ｔ細胞で媒介される宿主組織のダメージに応答しうるＴＣＲ
sを有するＴ細胞の特異的クローンにターゲッティングされた細胞障害性Ｔ細胞
免疫応答を誘導するのに使用されうる。一度誘導されると、このようなＦ−ペプ
チド誘導性抗−ＴＣＲ標的化細胞障害性Ｔ細胞応答は、自己反応性クローン又は
Ｔ細胞を放出し、これによってＴ細胞で媒介される組織破壊の制御に対する新た
な高特異性戦略を提供することができる。
Ｆ派生宿主ペプチドの使用の第二の例は、自己免疫疾患、感染性疾患に関連し
て、及び臓器移植のセッティングで起こる抗体で媒介される組織ダメージを同様
に制御することである。抗原に対するＢ細胞表面受容体（表面免疫グロブリン）
も、抗体を作成するＢ細胞のクローンに対して特異的である領域を含有する。上
記の疾患の範疇の環境で組織特異的ダメージに応答しうる抗体を産性するＢ細胞
のクローンを同定することによって、抗体を結合するＢ細胞免疫グロブリン分子
の領域からのペプチド配列は、例えば組換えＤＮＡ技術を用いて同定されうる。
更に、ＭＨＣクラスＩ及びクラスII細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導しうる配列が同
定されうる。Ｆ配列を有するこのような免疫グロブリン抗体結合性領域のペプチ
ドを派生させ、Ｆ派生ペプチドを、抗体を作成する対象に注射することにより、
自己抗体産性Ｂ細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導することができ、これ
によって上記範疇の疾患に関連して起こる組織障害性自己抗体応答を除去するこ
とができる。
Ｆ派生非ＨＩＶタンパクの使用の第三の例は、クローンＢ及びＴ細胞悪性腫瘍
であって、これらの表面クローン免疫グロブリン又はＴＣＲ分子上で発現される
ものの治療のための、自己反応性Ｔ及びＢ細胞タイプの特異的除去のための上記
原理の使用である。抗腫瘍治療戦略では、細胞表面免疫グロブリン分子の可変領
域に対する抗体（ＨamblinらＢrit．Ｊ．Ｃancer 42:495，1980; ＭillerらＮ． Ｅng．Ｊ．Ｍed．
306:517，1982）、又はＴ細胞腫瘍の治療の場合には可変ＴＣＲ領域に対する抗
体（Ｋanagawa，Ｏ．Ｊ．Ｅxp．Ｍed. 170:1513-1519，1989）の何れかを使用す
ることが開示されている。従って、Ｔ又はＢ細胞腫瘍細胞の表面にそれぞれ発現
されるＴＣＲ又は免疫グロブリン分子の可変領域の配列を含むＦ派生性合成ペプ
チドが、腫瘍を有する宿主に注射され得、腫瘍細胞を殺す抗−ＴＣＲ又は抗−免
疫グロブリン特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する。
Ｆ派生非ＨＩＶタンパクの使用の第四の例は、病原体に感染した細胞を殺し、
これによって宿主から病原体に感染した細胞を除去するのを促進する免疫原の創
製である。例えば、Ｃ型肝炎（非Ａ、非Ｂ型肝炎）は、細胞内又は血清内のウイ
ルス粒子が、一個体から他へ伝えられることによって起こる疾患である。Ｃ型肝
炎ウイルスタンパクの細胞障害性Ｔ細胞エピトープ配列をＦで派生させること、
及び個体にこのような配列を注射することによって、生きたＣ型肝炎ウイルスで
の感染から個体を保護するメモリー抗Ｃ型肝炎特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を誘
導し、これによって新規なＣ型肝炎ワクチンを提供することができる。このよう
な戦略はまた、他の感染性病原体に対するワクチンを創製するのに使用されうる
。
上記の開示の多くは、ＨＩＶ gp120の非連続領域から誘導されるＴヘルパー細
胞エピトープ(Ｔh)−Ｂ細胞エピトープ(Ｂ)ペプチドのデザインに集中している(
Ｐalkerら、Ｊ．Ｉmmunol．142:3612-3619(1989); Ｈaynesら、Ｊ．Ｉmmunol．1
51:1646-1653(1992)）。gp120 Ｃ4領域からのＴ1エピトープは、Ｔh-Ｂ合成ペプ
チドのデザインにおいて強力なＴhエピトープとして供される(Ｐarlkerら、Ｊ．
Ｉmmunol．142:3612-3619(1989); Ｃeaseら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ 84:4249-4253(1987)）（表XXVIII参照）。ＨＩＶ p24コアタンパクからのａ
ａ２６２〜２８１、ＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳ（表XXVIIIでＧＴＨ1
と表記）からの領域は、強力な細胞障害性Ｔ細胞決定子（Ｊohnsonら、Ｊ．Ｉmm
unol．147:1512-1521(1991); Ｎixonら、Ｎature 336:484-486(1988); Ｍeyerha
nsら、Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．21:2637-2640(1991)）及びＴh決定子（Ｍillsら、
Ｖaccines 90:213(1990)）であると報告されている。今回開示した態様は、高い
免疫原性であり、天然のＨＩＶ gp120又はgp41に対する抗体を誘導する合成ペプ
チドの多価混合物に関する。
この態様は、ＨＩＶ gp120とgp41の間の接触点（「gp120/gp41タッチポイント」
と呼ぶ）をともに反映する免疫原ペプチドが、天然のgp120及びgp41の複数部位
に対する抗体を生じさせ、これによってgp41及びgp120の分離を促進するという
理解から、少なくとも部分的に生じる。gp41及びgp120の分離は、これらの抗体
によるＨＩＶ一次単離物の中和を促進する。
多くの部位が、gp120とgp41の相互作用に関連、又は調節するgp120又はgp41に
関して同定されている（図３１、表XXVIII参照）。これらの部位には以下のもの
が含まれる：gp120 Ｖ3ループ領域（Ｗilley，Ｒ.Ｌ.及びＭartin，Ｍ.Ａ.，Ｊ
．Ｖirol．67:3639-3643(1993)）、ａａ２６７のアスパラギンの周りに集中した
gp120 Ｃ2領域（Ｗilley，Ｒ.Ｌ.及びＭartin，Ｍ.Ａ.，Ｊ．Ｖirol．67:3639-3
643(1993)）、gp120のＣ末端（Ｎeurath et al，Ｖirology 188:1-13(1992); Ｓ
chulzら、Ａids Ｒes．Ｈuman Ｒetrovirol．8:1571-1580(1992); Ｌopalcoら、
Ａids Ｒes．Ｈuman Ｒetrocirol．9:33-39(1993); Ｌopalcoら、Ｅur．Ｊ．Ｉm
munol．23:2016-2021(1993)）、及び配列ＡＶＥＲＹの周りに集中したgp41の領
域(Ｒeitzら、Ｃell 54:57-63(1988); ＮeurathらＶirology 188:1-13(1992);
ＳchulzらＡids Ｒes．Ｈuman Ｒetrovirol．8:1571-1580(1992); Ｌapalcoら、
Ａids Ｒes．Ｈuman Ｒetrovirol．9:33-39(1993))。gp41の「ＡＶＥＲＹ」領域
はgp120のＣ5Ｃ末端領域と相互作用することが示されており（Ｎeurathら、Ｖir
ology 188:1-13(1992); Ｓchulzら、Ａids Ｒes．Ｈuman Ｒetrovirol．8:1571-
1580(1992); Ｌopalcoら、Ａids Ｒes．Ｈuman Ｒetrovirol．9:33-39(1993)）
、Ａ．Ｂerettaは、Ｃ5 gp120領域に対する抗体が、gp41/gp120相互作用を「ゆ
るめ」、これによってＨＩＶを不活性化することができることを報告している（
Ｆustら、Ｉmmunol．Ｔoday 16:167-169(1995)）。gp120のＣ末端が、独自に抗
−ＨＩＶ中和抗体を誘導するかどうがは議論がある。何人かの研究者は、ＨＩＶ
を中和する抗−gp120Ｃ末端抗体を見いだしている（Ｂrohdenら、Ｐroc．Ｎatl
．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:461-465(1992); Ｋennedyら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．26
2:5769-5774(1987); Ｃhanhら、ＥＭＢＯ Ｊ．5:3065-3071(1986)）が、他の研
究者は、該抗体を見いだしていない（Ｐalkerら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
ＵＳＡ 84:2479-2483(1987); Ｌaalら、Ｊ．Ｖirol．68:4001-4008(1994); Ｋar
wowskaら、ＡＩＤＳ Ｒes．Ｈuman Ｒetrovirol．8:1099-1106(1992); Ｖahlne
ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 88:10744-10748(1991)）。
研究室用に適合したＨＩＶ単離物及び一次ＨＩＶ単離物の両方を中和するため
の重
要な新たな領域が、配列ＥＬＤＫＷＡＳ（Ｍusterら、Ｊ．Ｖirol．67:6642.664
7(1993); Ｃonleyら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 91:3348-3352(1994)
）を含有する膜貫通領域近辺のgp41に位置される。gp41のこの領域に対するヒト
モノクローナル抗体が、噂では、一次ＨＩＶ単離物を中和するが、この領域はヒ
ト及び動物では免疫原性に乏しい（Ｃonleyら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ 91:3348-3352(1994)）。Ｍusterら（Ｊ．Ｖirol．69:6678-6686(1995)）は
、キメラインフルエンザウイルスのＥＬＫＤＫＷＡＳ配列を発現した後、生じた
ウイルスを免疫化に使用した場合のみであるが、抗−ＥＬＤＫＷＡＳ抗体を生じ
させるのに成功した。
表XXVIIIに列記されたペプチドは、特定のＨＩＶ株（ＨＩＶ ＭＮ又はＢＡＬ
）に対するものである。ＨＩＶ一次単離物を効果的に中和するには、各ペプチド
特異性に対して、示されたエピトープの公知の変異体を反映するペプチドを構築
することも有利である。このような一覧表は、最新のロスアラモスデータベース
（Ｇ．Ｍyers及びＢ．Ｋorber編、１９９３年、ロスアラモス国立研修所、ロス
アラモス、ＮＭ）、その情報の一部は、ジーンバンク(Ｇenbank)を介してアクセ
スすることもできる。）に見いだすことができる。表XXIXは、ＨＩＶ研究室及び
臨床の単離物を中和するのに合成された、抗−ＨＩＶ抗体応答を誘導するペプチ
ドの組み合わせを示す。
以下の例は、本発明を更に詳細に説明するものであり、本発明を制限するもの
ではない。
例１
ペプチドの合成および複合体の作製
HTLV-IIIBエンベロープの糖タンパクであるｇｐ１２０由来の親水性アミノ酸
配列を含む本質的に純粋な合成ペプチド(Ratnerら、Nature、３１３：２７７，
１９８５)を、アプライド・バイオシステムズ・４３０A ペプチド・シンセサイ
ザー(Applied Biosysytems 430A peptide synthesiser)により、製造業者により
供給された化学薬品およびプログラムサイクルにより合成した。合成ペプチドの
配列を表１１に示した。
aレイトナーら（Ratner、Nature、313:177，1985）に従う。b
括弧内のアミノ酸は、ペプチドのヨード化(Y)、キャリア蛋白質への結合（ｃ）
のために付加されたものである。。
合成されたペプチドと公知の組替えタンパクPE3、PBIおよびPENV９との関連を
、図１に示した（Putneyら、Science、234：1392、1986：Pettewayら、Viruses
and Human Cancer：UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 1987）
。
ペプチド類を、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはMBSを伴った破傷風菌トキソ
イド(TT)等のキャリア分子に結合させた。これはグリーンらにより記述されてい
るようにして行った。(Green et al.,Cell,28：477,1982；Palker et al.，Proc
．Natl．Acad.Sci．(USA)84：2479,1987)。結合方法では、例えば、０．５ｍｌ
りん酸緩衝塩水中の２４ｍｇ破傷風菌トキソイド(pH7.2)を、100μｌのジメチル
ホルムアミドに溶解した１ｍｇのMBSと共に１時間、２３℃でインキュベートし
た。それから、MBSで処理した破傷風菌トキソイド(TT−MBS)を、PD-10カラム（
ファルマシア）上での分離用クロマトグラフィーに供し、TT-MBSから未反応のMB
Sを取り除き、280nmの光学濃度での分光光度測定分析により決定したTT−MSBを
含有する画分を、空の容器に回収した。そして、TT-MBSを、PBS中のカルボキシ
末端またはアミノ末端の何れかを還元されたシステインを含有する合成ペプチド
（モル比３０：１、ペプチドキャリアタンパク）６−９ｍｇと共に２３℃３時間
、揺動させながらインキュベートした。TT-ペプチド複合体を４℃でPBSに対して
一晩透析し、PD-10カラムで再度透析し、免疫原として使用した。
ペプチドのBSAまたは破傷風トキソイドに対する結合は、当該複合体を非還元
条件下でのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE
)にかけることにより、更に、BSAおよびMBSで処理したTTの分子量よりも見かけ
上の分子量が増加していることを測定することによりモニターした。また、結合
効率は、ペプチドに応じて１０から３０％と様々なペプチドのヨード化を追跡す
ることによって測定した。
例２
AIDS 患者からの抗体の合成ペプチドに対する反応性
BSAに結合た合成ペプチド（ｇｐ１２０の親水性領域に由来する）を、HIV+患
者の血清（N=12）および正常者のコントロール血清（N=4）とのラジオイムノア
ッセイ（RIA）において抗原として使用し、ｇｐ１２０のエピトープに対するAID
S患者の抗体反応を評価した（図２；Palker et al,.J.Immunol．136；2393，198
6,ibid,Proc.Natl.Acad.Sci(USA),84：2479,1987）。HIV+患者の血清の多くは、
２つの合成ペプチド、即ちsp-10(9/12、75％)およびsp-22(8/12、67％)と反応し
た。
結果は、被験(E)AIDS血清サンプルおよびコントロール(C)血清サンプルで得ら
れたデュプリケートのcpm値の割合（E/C）として現した。E/C＞3.0のものが陽性
である。
例３
合成ペプチドアフィニティカラム上で精製した
HIV+ 患者からの抗体に対するgp120の反応性
アフィニティカラムの準備として、HTLV-IIIBgp120に由来するアミノ酸配列を
含む合成ペプチド(SP-10、10A、11、14、15、22、図１参照)を、BSAに結合させ
、次いで CNBr活性化セファロースに共有結合させた。それから、HIV血清陽性患
者からの血清アリクオート(2ml)のそれぞれをカラムに通し、アフィニティカラ
ムに結合した抗体について精製した125I-ラベルHTLV-IIIBgp120に対する反応性
（図３A）をRIPアッセイで検査し、HTLV-IIIBに感染させたH-9細胞の表面に対す
る反応性（図３B）を間接免疫蛍光法アッセイで検査した。
A) RIPアッセイ（Palker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci(USA)84:2479,1987；ib
id,J.Immunol.136：2393、1986）において、SP-10(レーン１)、SP-10A(レーン２
)、SP-11(レーン３)、およびSP-22(レーン６)のアフィニティカラムから得た結
合した抗体を、RIPアッセイにおいてgp120-IIIBと反応させたところ、SP-10カラ
ムから得た抗体は、gp120-IIIBに対して最も強い反応性を示した。
B) FACS分析で試験したとき(Shapiro,Praciced Flow Cytometry,Alan R．Lis
s Pub.,NY,NY,1985)、合成ペプチドSP-10と反応性のある抗体は、HIV感染細胞の
表面に結合したのに対して、アフィニティ精製抗体についてはSP-14またはSP-10
A、11、15若しくは22(データは示していない)に対する結合は検出されなかった
。これらのデータは、ｇｐ１２０がHIV+細胞の表面に存在しているとき
に、SP-10により定義される抗原性部位(単独または複数)が、抗体の結合に使用
され得るものであることを示している。
例４
ヤギ抗sp-10抗血清によるHIVの中和
ヤギを、フロイント完全アジュバント中の２８ｍｇの破傷風菌トキソイドSP−
10複合体(SP-10-TT)の皮下注射により免疫し(0日目)、続いて、フロイント不完
全アジュバントを隔週で接種した(14日目および28日目)。２回目の免疫の後に血
清サンプルを、採取し、インビトロにおけるH-9 T細胞のHIV感染を阻害する能力
について、細胞培養上清における逆転写酵素(RT)活性の存在を測定することによ
り試験した（図4）。10日間のウイルスと細胞の共同培養の後で、RTアッセイに
おいて得られた減少したｃｐｍ値は、減少したHIVレベルを反映している。
１００感染単位のHTLV-IIIBとプレインキュベーションをしたとき、ヤギ抗SP-
10抗血清は、HIV分離株であるHTLV-IIIBのH-9 T細胞を感染させる能力を中和し
た（●-●、50%中和力価＝１／１４５）。それと比較して、免疫前に同じヤギか
ら採取した血清は、評価できるほどには、HTLV-IIIB（０−０、５０％中和抗体
＝１／１６）を中和しなかった。
SP-10-TTを注射したオリジナル動物に（その血清は逆転写酵素アッセイにおい
てHTLV-IIIBを中和した）に対して、引き続いてSP-10-TTの追加の投与量を注射
した（0.5mg/kg体重）。２回の注射の後、５０％中和力価は１：1600まで上がっ
た。SP-10様ペプチドを用いたこれらの実験および他の実験による中和に関する
データを表１２に示した。このとき、血清の希釈はHIVの５０％の中和よりも寧
ろ８０％の中和を得るように行った。
加えて、第２のヤギに投与量０．５ｍｇ／ｋｇのSP-10-TTを２回注射した。こ
の第２のヤギからの血清は、１：１００の力価で、HTLV-IIIBを中和した。また
、重要なことに、ヤギにおいて産生されたSP-10-TTに対する両方の血清は、シン
シチウム（融合細胞）阻害アッセイにおけるT細胞のHTLV-IIIB感染をも阻害した
（表１２）。
該シンシチウム阻害アッセイ（Lifson et al.,Nature 323:725,1986）は、HIV
-感染T細胞（それらは細胞表面においてHIV gp120エンベロープタンパクを発現
している）と、CD4(T4)＋の未感染T細胞との融合を阻害する抗体の能力を測定す
るものである。CD4(T4)分子は、AIDSウイルスのための受容体として機能する（M
addon et al.,Cell 47:333,1986）。これら２タイプの細胞の融合の結果として
、HIVに感染した巨大細胞が形成される。多くの例において、細胞のHIV感染と巨
大細胞の形成の結果、感染細胞は死に至る（Zagary et al.,Science 231: 850,1
986）。
それ故に、シンシチウム阻害アッセイおよび逆転写酵素アッセイにおける、HT
LV-IIIBの感染力を阻害に対する上述したヤギ抗SP-10血清の能力によって、抗SP
-10抗体がT細胞のCD4(T4)分子にHIVgp120タンパクが結合するのを阻害できるこ
とが示された。加えて、ペプチド［SP-10RF(A)］（HIV分離株HTLV-IIIRFからのS
P-10様配列を含む）に対して産生されたヤギ抗血清は、HTLV-IIIRFによるシンシ
チウム形成は阻害するが、HTLV-IIIBによるシンシチウム形成は阻害しない。こ
のことは、SP-10 RF(A)に含まれるタイプ特異的抗原が、HTLV-IIIRFgp120とT細
胞CD4（T4）分子との相互作用を阻害する抗体を産生するためのワクチン成分と
して適当であることを示している。
例５
HIV gp120-CD4(T4) 相互作用を阻害できる抗体の誘導
一連の研究は、１）ウシアルブミンまたは破傷風菌のどちらかに対して結合し
たSP-10ペプチドが、インビトロでの抗原特異的で且つ、CD4(T4)依存的であるT
細胞応答に対して少しでも阻害効果を発揮したかどうか、２）抗SP-10抗血清（
例４に記載）が、HIV未感染のヒト白血球細胞集団に対して結合したかどうか、
を決定するために行われた。
SP-10ペプチドを、破傷風菌トキソイドで刺激されたヒト未感染末梢血リンパ
球にインビトロで直接添加したとき、正常T細胞の破傷風菌トキソイドに対する
反応の阻害は観察されなかった（表１３）。
ＴＴ＝破傷風菌トキソイド（Wyeth Laboratories，Philadelphia，Pa.）
BSA＝ウシ血清アルブミン
CPM＝トリチウムチミジン取り込みの分当たりカウント数（Denningら、J.lmmuno
l．138:680，1987に記述された通り）
表１３に示したように、SP-10-TT単独は、TT単独と同様に良好な抗原特異的T
細胞アクチベーターであった。更に、SP-10-TTおよびSP-10-BSAは、TT単独に添
加したとき正常T細胞のTTで誘導された増殖を阻害しなかった。加えて、フロー
サイト蛍光測定法を使用した間接的免疫蛍光法測定においても、抗SP-10ヤギ血
清は、末梢血リンパ球または単球に対して結合しなかった。
これらのデータは、SP-10ペプチドが機能的なCD4(T4)分子に依存する正常ヒト
T細胞の機能を阻害することはしないが、逆転写酵素阻害アッセイにおいてHIV g
p120-CD4(T4)相互作用を阻害できる抗体およびHIVを中和できる抗体を誘導する
ことを示している。
従って、小型の合成SP-10様ペプチド（長さが約３５アミノ酸以下）を具備し
たワクチンは、組み替えｇｐ１２０またはその大きなサブユニットを具備したHI
Vワクチンよりも明らかな利点を持つ（後者は、正常な免疫機能をも阻害してし
まうからである）。
例６
分離株に特異的なHIVの中和
合成ペプチドSP-10は、HIV分離株であるHTLV-IIIBおよびLAVのgp120エンベロ
ープタンパクに由来しのユニークなアミノ酸配列を有しているが、一方、他のHI
V分離株は、それらのSP-10様gp120エンベロープタンパクにおいて、様々に程度
で異なったアミノ酸配列を有する。HIVのHTLV-IIIB分離株に由来する合成ペプチ
ドSP-10（即ちそれは、SP-10−IIIBである）が、破傷風菌トキソイドに結合され
、そしてヤギにおける抗体を産生させるために使用されたこと（ヤギのｋｇ体重
当たり0.5mgの複合体）が、パルカーらにより記述されている（Proc.Natl.Acad.
Sci.(USA)84:2479,1987）。合成ペプチドSP-10に対して産生されるヤギ抗体を、
４つの異なるHIV分離株（図５A：HTVL-IIIB、図５B：HTLV-IIIRF、図５C：HTLV-
IIIMN、図５D：HTLV-IIISC）に対する中和能について試験した。ヤギ抗SP-10抗
血清（●）、免疫以前のヤギ血清（○）、AIDS患者血清（■）を、全て1/10希釈
で、各々のウイルス分離株の希釈液（１０-1、１０-2、１０-3）と共に最初のイ
ンキュベートを行った。次に、インビトロにおける10日間
のウイルスと細胞の共同培養を行って、これらのウイルス分離株のH-9 T細胞に
対して感染する能力を試験した。10日間後の培養系の細胞培養上清中のHIV存在
のレベルは、上清中のRT活性を測定することにより評価し、その結果を、RTアッ
セイで得られたｃｐｍ値として示した。RTアッセイにおいて増加したｃｐｍ値は
、培養系において増加したHIVのレベルを反映している。
図５Aに示したように、ヤギ抗SP-10抗血清は、１０-2のウイルス希釈でH-9細
胞のHTLV-IIIB感染を阻害した（即ち、中和した）。免疫前のヤギ血清は、同希
釈ウイルスによるHTLV-IIIB感染を阻害しなかった。これとは対照的に、ヤギ抗S
P-10抗血清は、HIVの他分離株は中和しなかった（図５B-D）。AIDS患者抗体は、
HIVの４分離株全てを中和した（図５A-D）。データは、合成ペプチドSP-10に対
するヤギ抗血清が、HTLV-IIIB分離株（そのgp120エンベロープタンパクのなかに
SP-10に存在するアミノ酸配列を含む）を中和することを示している。表12のデ
ータと共に、これらのデータは、HIVの多様な分離株に由来するSP-10様アミノ酸
配列を含むワクチンが、広スペクトルのHIV分離株に対して効果的であるだろう
ということを示している。
例７
HTLV-IIIB 感染H-9 T細胞（HTLV-IIIRF感染H-9 T細胞に対してではない）
に対するヤギ抗SP-10血清の結合
フローサイト蛍光測定法とコールターEPICS Vサイトフルオログラフ(Colter E
PICS V cytofluorograph:Haynesら,Immunol．Rev．57:127,1981; Haynesら,Now
Eng．J．Med．304:319，1981)用いて、未感染H-9 T細胞、HIV分離株HTLV-IIIB感
染H-9 T細胞、またはHIV分離株HTLV-IIIRF感染H-9 T細胞の何れかに対する、ヤ
ギ抗SP-10血清および前もって採血した同じヤギのコントロール血清（autologou
s prebleed control serum）の反応性を比較をした。
コントロール（前採血）ヤギ血清（1:200）と共にインキュベートしたHTLV-II
IB感染H9細胞と比較して、ヤギ抗SP-10血清（1:200）は、HTLV-IIIB感染H-9 T細
胞の40%と反応した（図６A）。ヤギ抗SP-10血清およびコントロール(前採血)血
清(1:50)の何れもが未感染H-9 T細胞とは反応しなかった（図６B）。コン
トロール（前採血）血清および抗SP-10血清（1:50）の何れもが、HIVの分離株で
あるHTLV-IIIRFに感染したH-9 T細胞と結合しなかった（図６C）。
例８
インビボにおけるTヘルパー細胞中和反応、CD8+細胞毒
性T細胞中和反応およびB細胞中和反応を誘導するヒト
免疫不全ウイルスエンベロープの複数領域を含む合成免
疫原の開発
HIVに対して細胞毒性T細胞反応を誘導する、並びに抗体およびTヘルパー細胞
反応の中和を誘導する、合成ペプチド免疫原を開発するために、限定された細胞
毒性T細胞エピトープ（表３参照されたい）をその中に含むHIV MN分離株の領域
を反映する一連のペプチドを製造した。これらの検討は、MN HIV分離株について
行われたが、これは、この分離株が現在の米国において最も一般的なプロトタイ
プウイルスであるからである（La RosaらScience 249:932,1990）。
タカハシら（Science 246:118,1989)は、MN HIV分離株に由来するアミノ酸322
-326（FYTTK）を含む細胞毒性T細胞（CTL）エピトープ、更にHIVIIIB分離株のア
ミノ酸323-329を含む細胞毒性T細胞（CTL）エピトープを定義した（表3参照）（
Takahashi et al.,J.Exp.Med．170:2023,1989）。このように、作成された一つ
のT1-SP10分離株ペプチドは、アミノ酸303-321にあるMN SP10領域にアミノ酸322
-326が加えられていること示す（A）を伴った、T1−SP10MN（A）ペプチドであっ
た（表III参照されたい）。次に、抗原を呈示している細胞の細胞膜に挿入でき
、その結果、MHCクラスＩ分子を介して加工され、そして発現され、その結果、C
D8+ CTLによって認識され得る合成ペプチドを作成するために、gp41 HIVエンベ
ロープタンパク（HIV分離株BH10/IIIBにおけるアミノ酸519−530 AVGIGALPLGFL
）の最初の１２アミノ酸を、T1-SP10ペプチドのN末端に共有結合した。HIV gp41
のこれらのアミノ酸(519-530)は、高度に疎水性である。それらは、脂質膜中に
挿入可能な主要なアミノ酸であること、および細胞融合を誘導するHIVの能力に
おいて、ある役割を担っていることが仮定されている(Brasseur et al.，AIDS R
es．Hum．Retroviol.4:83,1988)。この12アミノ酸
gp41配列を持つペプチドは、ペプチドの名前の前にF-の接頭語を持つ[Fはフーソ
ジェニック(fusogenic)領域]（表IIIとIVを参照されたい）。ボッシュら（Bosch
：Science 244:694,1989）は、HIVのF領域(AVGIGALFLGFL)に対して相同なSIVの
領域(GVFVLGFLGFLATAG)は、実際にSIV融合エンベロープペプチドであることを示
した。従って、F-由来ペプチドはまた、抗原存在細胞膜中に挿入し得ること、F-
由来ペプチドはインターナリゼーションされ得ること、CD8+ MHCクラスＩ制限CT
Lは、F-由来ペプチドによる免疫に続いてインビボで発生され得ることが仮定さ
れた。[デレスら（Deres：Nature 342:561,1989）は、脂肪酸トリパルミトール-
S-グリセリルシステイニル-セリル-セリン分子の合成ペプチドに対する複合体が
、MHCクラスＩ分子の状況において合成ペプチドの加工および呈示を助長し、イ
ンビボでのCD8+ CTLの発生を導くことが可能であることを示している。]
Balb/cマウスにおいてT1-SPペプチドのMNシリーズを用いて行い一連の研究を
行い、それらの抗ペプチド抗体を誘導する能力を比較し（図７参照されたい）、
それらの抗HIV中和抗体を誘導する能力を比較し（図８参照されたい）、更に、
インビボにおいてマウスに注入したときに、これらのうちの何れのペプチドによ
りMHCクラスＩ制限CD８CTLが誘導されるのかを決定した（表14、および15）。
PBS中の可溶性F-T1-SP10MN(A)ペプチド(10μg)を、Balb/cマウスに、完全フロイ
ントアジュバント中（第１回目の注射）それから不完全フロイントアジュバント
中（第２回目の注射）において皮下注射を行った。
エフェクター細胞は、インビトロで、完全なT細胞培地中における25μg/mlのF-T
1−SP10MN(A)ペプチドと共に７日間培養した、免疫された動物の脾細胞である（
Takahashiら,J.Exp.Med.170:2023,1989）。培養の３日目において、10%v/vのCon
A上清を添加した。Con A上清は、完全T細胞培地においてコンカナバリン A(10
μg/ml)で４日間刺激したBalb/c脾細胞から誘導された(Takahashiら,J.Exp.Med
．170:2023,1989)た。その上清を取り出し、脾細胞毒性T細胞の活性化に使用し
た。
＊補体(C)を用いた実験は、F-T1-SP10MN(A)で免疫した３匹のマウスからプール
された脾細胞を混ぜたものから得た結果を示す。
リポソームは、オクチルグルコシド７％(0.7g/10mlPBS)、L-アルファジオールレ
シチン、20mg/ml，T1-SP10MN(A)ペプチドおよびコレステロール３．１mg/mlを用
い、標準的な技術（Mimms ら,Biochemistry 20:833,1981;Liposome Technology
Vol.III Ed.G.Gregoriadis Chapter 14 pp.205-224,1984）を用いて製造した。
T1-SP10MN(A)ペプチドを含むリポソームを、ABalb/cマウスに対して、リポソー
ム中のT1-SP10MN(A)ペプチドで総投与量10μgの、２部位の皮下注射により、完
全フロイントアジュバント中で（第１の用量）、続いて不完全フロイントアジュ
バント中第２から（第５の用量）で投与した。エフェクター細胞は、表14に記述
した免疫化動物からの脾細胞であった。
＊Exp.１はRL-12標的細胞を使用し、Exp.２はEL4標的細胞を使用した。Balb/ ｃマウスにおいて、種々のT1-SP10ペプチドが抗ペプチド抗体を誘導する能 力の比較
：
10μ/mlの分離株ペプチドを用いて1、2、3回免疫した後の、Balb/cマウスの血
清中に産生された抗ペプチド抗体レベルの比較を図７に示した。2回目の免疫の
後、ELISAアッセイにおいて、（A）領域またはF領域の何れかの付加により、T1-
SP10MNペプチドに対する抗ペプチド抗体のレベルが増加したことを図7は示して
いる。Balb/ ｃマウスにおいて、種々のT1-SP10ペプチドが抗HIV中和抗体を誘導する能 力の比較
：
図８は、採血３からの抗血清をHIVシンシチウム阻害アッセイに対して添加し
たときの、インビトロでのHIVシンシチウム形成におけるパーセント阻害率を示
している。T1-SP10注入群ではただ1動物のみが、50%よりも強くシンシチウム形
成を阻害した血清抗体を有しており、また、F-T1-SP10群とT1-SP10(A)群におけ
る動物ではそのような血清抗体はなかったのに対して、F-T1-SP10MN(A)を注入し
た動物群では５動物のうちの３動物が、50%よりも強くシンシチウム形成を中和
する抗体レベルを有していた（図８）。インビボにおいて、種々のT1-SP10ペプチドがCD+8 CTLを誘導するの能力
：
Balb/cマウスに注入したとき、T1-SP10MNペプチドとF-T1-SP10MNの何れのペプ
チドも、測定可能なCTLをBalb/cマウスに誘導することはなかった。しかしなが
ら、インビボにおいて注射したときの可溶性F-T1-SP10MN(A)ペプチド（表14）お
よびリポソーム中T1-SP10MN(A)ペプチド（表15）は、インビボにおいて、T1-SP1
0MN(A)でコートされたD'標的細胞を死滅させる抗HIV CTLをBalb/cマウスにおい
て誘導することが可能であった。インビボにおいて、可溶性F-T1-SP10MN(A)をペ
プチドによりBalb/cマウスに誘導された細胞毒性T細胞は、Thy１+、Ly２(CD8)+
であったことを表14は示している。CD8+抗T1-SP10(A)細胞毒性T細胞は、H2’標
的のみを死滅させたが、H2'標的を死滅させなかった。リポソーム中のT1-SP10(A
)ペプチドにより誘導された抗T1-SP10(A)細胞毒性T細胞はCD
8+であり、MHCクラスＩ制限であることを表15は示している。
従って、T1-SP10MN配列にF配列および（A）配列（表３）を付加することによ
って、52アミノ酸ペプチド[F-T1-SP10MN(A)］（抗体およびヘルパーT細胞反応の
中和を誘導するだけでなく、同様にCD8+抗HIV MHCクラスＩ制限細胞毒性T細胞を
誘導することも可能である）を構成できる。加えて、MHCクラスＩ制限抗HIV細胞
毒性T細胞は、40アミノ酸ペプチド、即ちリポソーム中に組み込まれたT1-SP10MN
(A)により、インビボで誘導された。
例９
上記で示された通り、HIV gp120 V3ループ[SP10(A)]のaa303-327およびHIV gp
120(T1)のaa428-43を含む合成ペプチドT1-SP10(A)の構成は、インビボでの、抗H
IVメモリーTヘルパー細胞の活性を誘導するために有効なT細胞免疫原として、そ
して、抗HIV中和抗体のためのB細胞免疫原として働く［Palker et al.,PNAS(USA
),85,1932-1936,1988;Palker et al.，J．Immunol.，142:3612-3619.1989;Hart
et al.,J.Immunol.145:2677-2685,1990 and Hart et al.，PNAS(USA)，88:9448-
9452，1991]。TISP10(A)ペプチドは、マウス、ヤギ、およびアカゲザルにおいて
抗HIV中和抗体を誘導し(Palker et al.,PNAS(USA),85: 1932-1936,1988; Palker
et al.，J.Immunol.，142:3612-3619; Hart et al.，J．Immunol.,145:2677-26
85,1990 and Hart et al.,PNAS(USA),88:9449-9452,1991)、マウスにおいて抗HI
V MHCクラスＩ制限CTLを誘導し(Hart et al.，PNAS(USA),88:9448-9452,1991)、
マウス、ヤギ、アカゲザル、およびチンパンジーにおいて抗HIV Tヘルパー細胞
反応を誘導する(Palker et al.,PNAS(USA),85:1932-1936,1988;Palker et al.,J
.Immunol.,142:3612-3619，1989;Hart et al.,J.Immunol.,145:2677-2685,1990
and Hart et al.,PNAS(USA),88:9448-9452,1991)。マウスでの最近の比較検討に
おいて、C57BL/6およびBalb/cマウスがT1SP10IIIBペプチドに対する高力価の抗
ペプチド抗体を産生する一方で、これらのマウスの系統は、HIVIIIB V3ループの
中和決定基に対する中和抗体を産生しないことが分かった。これと比較して、C5
7BL6およびBalb/cマウスは、HIVMN V3ループからの配列を含むT1SP10ペプチドで
免疫されたとき、良好な抗HIV中和抗体を産
生する。
チンパンジーにおける免疫試験を、該合成ペプチドを試験するために行った。
以下に考察した結果は、ホローマンAFT（ニューメキシコ）でのチンパンジーは
、T1SP10IIIB(A)ペプチドに対する良好な抗体を産生し、良好なヘルパーT細胞反
応を行ったが、Balb/cマウスのように、HIVIIIB V3ループにおける中和抗体決定
基に対する抗体は作られなかったことを示している。
図９において、チンパンジーをHIV env合成ペプチドで免疫し、ELISAアッセイ
を用いてそれらの抗体力価を試験した。動物884と1028は、ペプチドT1-SP10IIIB
（ELISAアッセイでも使用された）で免疫された。ペプチドF-T1-SP10IIIB(A)は
、動物1045および1070の免疫化とELISAアッセイで使用した。動物1028を除いて
、全ての免疫はIFA+BSA(1:1)中で行った。動物1028では、3回目の免疫の後でIM
膿腫が形成され、1免疫が維持された。その後の免疫は、PBSのみで与えた。
上記から分かるように、T1-SP10ペプチドが、動物884および1028において優秀
な免疫原であったのに対して、合成したHIV gp41融合(F)ドメインをT1-SP10ペプ
チドのN末端に有するT1-SP10ペプチドは、Fドメインなしのペプチドが誘導する
ようには、高い抗体力価、または長い持続時間の抗体力価を誘導することはでき
なかった。
第16月で、動物884および1028において良好な抗体力価を誘導した免疫原T1-SP
10IIIB(A)を用いて、動物1045と1070に免疫性テストをしたことに注目してもら
いたい。動物1045と1070は、IFA中のT1-SP10IIIB(A)に対して反応しなかった。
従って、それらの以前のF-T1-SP10IIIB(A)ペプチドによる免疫故に、それらがT1
-SP10(A)ペプチドに対して寛容であることが証明された。第14週の動物884の二
次免疫は、T1-SP10IIIB(A)ペプチドに対する力価を上昇させるが、それに対して
、同時期の動物1028の二次免疫はそうではなかったことに注目することが重要で
ある。動物884をIFAで二次免疫したのに対して、1028の二次免疫はアジュバント
なしの、PBSだけで行った。
また、末梢血単核細胞(PBMC)の免疫化ペプチドに対する増殖反応も試験した（
図10を参照されたい）。ペプチドT1-SP10IIIBおよびT1-SP10IIIB(A)は、動
物884および1028において、循環PBMCの抗レベルの増殖を誘導した。これらのレ
ベルは、６ヶ月の休息の後(第14月)には検出不可能なレベルにまで落ちるが、動
物884および1028においては再び上昇する。動物1028における増殖反応は、アジ
ュバントを伴わないPBS単独で免疫したものであっても、６ヶ月の休息の後、そ
れぞれの二次免疫により上昇した。
B細胞反応に関しては、F-T-SP10IIIB(A)ペプチドで免疫した動物1045と1070に
おいて、T1-SP10IIIB(A)ペプチドのときのレベルにまでは増殖されなかった。こ
れら後者の２動物を、動物884および1028における良好な免疫原であるT1-SP10II
IB(A)ペプチドで免疫したとき、動物1045および1070の何れもが、T1-SP10IIIB(A
)に対する増殖反応を生じなかった。このことは、T1-SP10ペプチドN末端へのF-
ドメインの付加が、gp120のT1およびSP10領域に対して動物1045と1070を寛容に
する免疫寛容原を生じさせることが証明された。表16に見られるように、動物88
4および1028は両者共に、増殖アッセイにおいて本来のgp120に反応したが、動物
1045および1070は、免疫ペプチドに対するのと同様に本来のgp120に対しても寛
容であった。
また、PHAに対する合成ペプチドにより免疫されたチンパンジーのPBMC増殖反
応についても、検討した（図１１を参照されたい）。このデータは、動物1045と
1070が、HIVgp120のT1およびSP10領域に対して免疫寛容であるのに対して、これ
らの動物におけるPBMC PHA反応は、免疫期間を通じて正常であったことを示して
いる。
該チンパンジーによる検討に使用したT1-SP10IIIBペプチドの同じバッチを、
ヤギにおける免疫原としても使用し、ヤギにおける良好なヤギ抗HIV中和力価を
得た（図12を参照されたい）。このように、T1-SP10ペプチドは、チンパンジー
において、IFAと共に使用される素晴らしい免疫原であり、＞1:102,400の顕著な
抗ペプチド血清抗体力価を有し（図９を参照されたい）、更にT1-SP10に対するT
細胞反応の誘導と、本来のHIVgp120に対するT細胞反応の誘導を有した。
＊データは、免疫期間中に観察されたgp120反応のピークを示している。
動物884、1028および1045のデータは、2μg/mlから0.5μg/mlのHIVIIIB(LAI)組
み替えgp120を使用したときに反応のピークを示した。動物1070のデータは、1μ
g/mlから0.5μg/mlの本来のHIVIIIB(LAI)gp120を使用したときに反応のピークを
示す。
チンパンジーで用いたのと同じT1-SP10ペプチドバッチに対するヤギの高い中
和抗体反応は、チンパンジー選択性は、中和V3配列を免疫原として認識してない
のに対して、その一方で、他の未中和性T1-SP10IIIBペプチド配列は、チンパン
ジーにおいて免疫原性であることを示した。従って、インビボのチンパンジーお
よびマウス単核細胞によって、HIVIIIB V3ループの選択的なタンパク分解がおこ
る可能性があり、または、より高い可能性として、チンパンジーとマウスにおい
て、V3ループ中和決定基に対する抗体反応の遺伝子による制限が存在する可能性
がある。
アカゲザルでは、500μｇの精製T1SP10MN(A)ペプチドの注入により、4/4動物
における抗HIVMN中和抗体が非常に高レベルで生じることが示された(図13-15)。
加えて、4動物のうちの1動物において、免疫は、交差反応性の抗HIV中和抗体（H
IVIIIBおよびHIVMNウイルスを中和した）を発生させた（以下の表18を参照され
たい）。従って、25%のチンパンジーとヒトがT1-SP10MN(A)ペプチドに対して反
応して、交差中和性の抗HIV env抗体を産生するならば、他の非MN様HIV分離株を
抗体投与された対象の追加の5%は、HIVの攻撃され得るであろう。追加のサルの
データについては図16および17を参照されたい。
T1-SP10IIIB(A)ペプチドは、動物884および1028において抗HIVIIIB中和抗体を
誘導せず、また、そして、F-T1-SP10III(B)Aペプチドは動物1045および1070の免
疫寛容を誘導したから、全てのチンパンジーは、第16月（動物884、1028）また
は第17月（動物1045、1070）の何れかで免疫されたことになる。動物の何れもが
、T1-SP10IIIBペプチドにより呈示させるようなHIV IIIBのV3決定基に遭遇しな
かったように見えたことから、ここで合理的なのは、A) T1-SP10MN(A)ペプチド
が動物1045および1070における寛容を崩壊できるかどうか、B) 何れかの動物が
、HIV MN V3ループのV3中和性決定基に遺伝子的に遭遇できるのかを決定するこ
とであった。図18は、4チンパンジーの全てを0.1mg/kgのT1-SP10MN(A)ペプチド
で免疫した後、４動物のうちの３動物（884、1028、1045）が、弱い血清抗HIV M
N中和抗体（点線）の出現を示し、それに対して動物1070では、高レベルの抗HIV
MN中和抗体[1:20で80%より強い中和力価を有し、そしてまた、HIV IIIBと交差
中和する(表19、実線、図18)]を発生した。この
寛容の崩壊は、動物884、1045および1070の血清におけるT1-SP10MN(A)ペプチド
に対する力価の増加においても見ることができた。動物1028は、免疫に関連した
早期の膿瘍を有しており、研究の第４月の後では、IFAを受容しなく、IFAを伴っ
たペプチドの初回免疫の後では、HIVのペプチドに対する抗体の増加はなかった
。
チンパンジー1070において、中和抗体がHIV MN分離株とHIV IIIB分離株の両方
を中和したことが観察されたのは、HIV MNペプチドとHIV IIIBペプチドの両方に
より誘導されたタイプ特異的中和抗体の何れかの存在のためであるか（Rusch et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3198(1988)）、またはT1-SP10MN(A)ペプチド
による交差中和抗GPGRA抗体の誘導のためである可能性があるか。切断したT1-SP
10MN(A)ペプチド、SP10D、IRIQRGPGRに対する抗体力価を、チンパンジー1070か
らの血清と共にELISAアッセイで使用した。このペプチドに対する終点ELISA力価
は、1:800以下であった[10-23-90から12-3-91まで(試験の第３月から第17月まで
)]。12-3-92のT1-SP10MN(A)での動物1070の最初の免疫に続いて、SP10Dペプチド
に対する抗体の力価は、1-7-92には1:800から1:3200に、2-4-92では1:12,800に
上昇した。同じ期間の間に、動物1070のT1-SP10MN(A)ペプチドに対する抗体力価
は、1:12,800から1:102,400に上昇したのに対して、T1-SP10IIIBペプチドに対す
る力価は、1:3200から1:25,600に上昇した。動物1070血清における中和抗体を吸
収除去するための吸収試験によって、抗HIV MN中和活性の全てがSP10MN(A)ペプ
チドで吸収除去され、HIV MN中和活性の一部分は、配列IGPGRAIGPGRAIGPGRAC(DP
2)[HIVとHIVIIIBの両方に対して一般的なV3ループの先端(Tip)に由来する配列を
含んでいるのみ]を有するペプチドで吸収除去され得ることが示された。こうし
て、T1-SP10MN(A)ペプチドにより誘導されたチンパンジー抗体反応の一部分は、
HIV MNおよびHIV IIIBと交差中和し、またHIV gp120 V3ループ先端で保存された
配列に対して向けられている。
重要なことに、アカゲザルでは、500μｇの精製TISP10MN(A)ペプチドの注入に
より、4/4動物において、非常に高いレベルの抗HIVMN中和抗体が回収されたこと
(図20-24)、そして、同様の注入により、4匹のアカゲザルのうちの１匹では、交
差反応性の抗HIV中和抗体（HIVIIIBおよびHIVMN分離株を中和した）が得られた(
表18および20)。図25は、アカゲザル18987からの血清における抗HIVIIIB中和活
性を、DP2(IGPGRAIGPGRAIGPFRAC)ペプチドが吸収することを示している。表21は
、記述したチンパンジーとアカゲザルの研究で用いたペプチドの配列を示す。
例10
以下は、ヒト患者を免疫するためのプロトコールである。HIV血清が陰性であ
る対象は、米国における最新のHIV分離株の約80%に対して中和抗体を産生するよ
うに設計された、TISP10(A)ペプチド（表22および23を参照されたい）の多価抗
体混合物により免疫されるであろう。
実験のプロトコール
ヒト患者（HLA 2A+およびHLA2A-の両方）を、2年に及んで試験した。治療に際
して、HIVMNおよび他のHIV分離株に対する中和抗体の産生、並びにTヘルパーお
よび/またはクラスＩ制限抗HIV CTLの産生が測定された。
使用するべき免疫は、ロス・アラモス・データ・セット[Los Alamos Data Set(M
yers et al.,Human Retroviruses and AISA 1991）]のHIV分離株の80％に対する
抗体に対して増加を得られることが期待されるTISP10(A)ペプチドである。何人
かの患者は、表20の免疫原を受け、また幾人かは、表19の免疫原を受けるであろ
う。
各患者は、免疫原用量として、約0.05ｍｇ/kg/ペプチドまたは１ｍｇの各ペプ
チドを受けることが可能である。もし、当初の投与量計画に対して反応が得られ
ないときは、該投与量を、2倍にすることが可能であり、3月の休止期間の後に、
該治療指針を繰り返すことも可能である。
フロイント不完全アジュバント(IFA)は、1:1v/v 混合物中で免疫原と混合して
よい(Hart et al.,J.Immunol.,145:2677-2685,1990)。各免疫のための総容量は
、2ccとすることが可能である。
免疫原は、IMにより投与することが可能である。該免疫原は、総容量2cで混合
し、２つの部位（右上腕若しくは左上腕、または右大腿若しくは左大腿）に各々
1ccでIMで投与することが可能である。
免疫は、0月、1月、3月で与えることが可能である。患者は、各免疫の後、4週
間モニターされるであろう。第3の免疫の後、HIVに対する反応の力価を試験し、
ペプチドの高用量での免疫を3月の休止後に開始することを決定する。
ルーチンの血液および尿検査が、該患者に対して行なわれる。以下の血液試料
が要求されるであろう。
血清(10ml)(約20ccの血液)を使用して、RIAにおけるTISP10およびSP10ペプチ
ド結合が試験され、また、RIP/ウエスタンブロットアッセイにおけるHIV gp120
結合がで試験される。また、血清を使用して、逆転写酵素および／またはシンシ
チウム阻害アッセイにおけるHTLV-IIIB、HTLV-IIMNおよび野生型のHIV分離株の
中和力価が決定される。毒性を試験するためのルーチンの血清についての化学試
験（肝機能試験、腎機能試験および化学的18パネル試験(chem 18 panel)）並び
に完全な血球算定(ヘパリン処理血液10cc)が行われた。
末梢血液細胞（60ml血液）を使用して、PHA、TT処理候補(TT candidate)T1SP1
0およびSP10ペプチド、gp120およびOKT3(ヘパリン処理血液約30ml)に対する
T細胞増殖反応を試験した。T細胞、B細胞、NK細胞、CD4およびCD8細胞数につい
ても算出した(ヘパリン処理血液約5ml)。最後に、自己由来若しくはHLAに同一の
EBV形質転換B細胞株または自己由来EBV形質転換B細胞株に対するCTLアッセイを
、ワクシニアgp160感染標的およびペプチドコート標的を用いて行うことが可能
である。
例11
HIV本来のタンパクまたはHIVタンパク発現標的細胞に対する、Tヘルパー(Th)
細胞、中和抗体、およびMHCクラスＩ制限細胞毒性Tリンパ球(CTL)を誘導するた
めの実験的な合成ペプチド免疫原を設計するための開発されている(Palker et a
l，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1932(1988),Palker et al,J.Immunol.142:3612(
1989),Hart et al,J.Immunol.145:2677(1990),Hart et al,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 88:9448(1991),Haynes et al,AIDS Res.& Human Retroviruses 6:38(1990),
Haynes et al，J.Immunol.151:1646(1993),Haynes et al,J.Exp.Med.177:717(19
93),Haynes et al,Trans Amer.Assoc.Physician 106:31(1993),Yasutmi et al,J
.Immunol.151:5096(1993))。［AIDSのためのHLAベースワクチンの一般的なスキ
ームを、図30に示した。Th1・・・n−B1・・・nは、構造Th-SP10(例えば、C4-V3)を含
む。Th1・・・n−Tc1・・・nは、Th-CTL（CTL=X）に等しい。］
中和抗体を誘導するための一般的な免疫原の設計には、gp120エンベロープV3
ループ中和ドメインのN末端におけるHIVタンパクの１以上のThエピトープの合成
が必要とされる(Th-B、図26)。MHCクラスＩ制限抗HIVまたは抗SIV CRL誘導のた
めの、Th-B-CTLおよびTh-CTLペプチド設計の両方が、首尾よく行われている(図2
6)(Hart et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9448(1991),Yasutomi et al.,J.Im
munol.151:5096(1993))。HIVIIIB、HIVMNまたはHIVRFのTh-B-CTLエピトープに含
まれるプロトタイプ合成タンパク免疫原は：Ａ）マウス、ヤギ、アカゲザル、お
よびチンパンジーにおける本来のgp120に対するTh反応を誘導し(Palker et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1932(1988),Palker et al,J.Immunol．142:3612(19
89),Hart et al,J.Immunol.145:2677(1990),Haynes et al,J.Exp.Med.177:717(1
993))、Ｂ）ヤギ、アカゲザルおよびチンパンジーにおいて、タ
イプ特異的な様式で実験室HIV分離株を中和するＢ細胞中和抗体反応を誘導し(Pa
lker et al,Proc.Natl.Acad.Scl.USA 85:1932(1988),Palker et al,J.Immunol.1
42:3612(1989),Hart et al,J.Immunol.145:2677(1990),Haynes et al,J.Immunol
.151:1646(1993),Haynes et al,J.Exp.Med.177:717(1993)，Haynes et al,Trans
.Amer.Assoc.Physician 106:31(1993))、そして、Ｃ）マウスおよびアカゲザル
において、HIV若しくはSIVタンパクを発現している標的細胞を死滅させる抗HIV
または抗SIV MHCクラスＩ制限CTLを誘導した(Hart et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 88:9448(1991),Yasutomi et al,J.Immunol.151:5096(1993))。アカゲザルに
おいて、T1-SP10MN(A)ペプチドは、選択された動物において、主にV3ループの先
端のIGPGRAFと反応し、且つHIVIIIB、HIVMN、HIVRF、並びにCEM細胞で生育したH
IV初代分離株を交差中和する抗体を誘導することが示された(Haynes et al,J Im
munol.151:1646(1993))。プロトタイプ多価HIV免疫原の設計
地理学的位置と患者間の両方における、HIV分離株に存在する極度の変異性の
ために、特定の地理学的位置におけるHIV分離株に合わせた多価HIV免疫原設計が
、結果の良好な予防的および治療的なHIV免疫原のために要求されるであろう(Pa
lker et al,J.Immunol.142:3612(1989),Haynes et al,Trans.Amer.Assoc.Physic
ian 106:31(1993))。このために、プロトタイプ多価HIV免疫原は、クレイブE(Cl
ave E)における4つの共通のHIV分離株モチーフである、HIVMN、HIVRF、HIVEV91
およびHIVCANOを反映したTh-B-CTLエピトープを含んで設計されている(図26およ
び27)。これらのプロトタイプペプチドの各々において、少なくとも２つのTh決
定基、2つのクラスＩ制限CTL決定基、HLA A2およびA3により制限される１つ(Cle
rici et al,Nature 339:383(1989))、並びにB7で制限される他の一つ［Safrit e
t al,第3可変領域HIV gp120（急性セロンバージョン（acute seronversion）中
の2患者から単離した）のためのHLA-B7制限細胞毒性Tリンパ球クローンの特徴付
け；6th NCVDG meeting Oct.30-Nov.4,1993にて発表された］、並びに抗HIV中和
抗体により認識される3以上のエピトープ(Palker et al,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 85:1932(1988),Rusche et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 85:3198(1988),Jahavarian et al,Science 250:1590(1990))(図26および27)
が存在する。このプロトタイプペプチド混合物のマウスにおける前臨床試験は、
2つの成分［T1-SP10RF(A)およびT1-SP10EV91(A)］がタイプ特異的な抗V3ペプチ
ド［抗SP10(A)］反応を誘導（表14）したのに対して、2つの成分［T1-SP10MN(A)
とT1-SP10CANO(A)］は、広範囲に亘って交差反応する抗V3ペプチド抗体反応を誘
導した(表14)ことを示した。
Balb/cマウスはIFA(Seppic ISA 51)における５０ugの単価ペプチドにより経皮的
に３度免疫した。動物は、免疫後２週採血し、抗体力価をエンドポイントＥＬＳ
Ａアッセイ（E/C 3.0）を用いて決定した。データは各点について３マウスの血
清抗体の幾何平均力価を示す。
アフリカ型(クレイブA)およびタイ型(クレイブE)のHIV分離株V3ループペプチド に対する交差反応性ペプチド応答を誘導する、HIV Envペプチドの能力
加えて、4ペプチド全ての混合物(表25)で免疫したヤギおよびマウスからの血
清は、T1-SP10(A)A.con.ペプチド(アフリカのクレイブAのコンセンサスV3ループ
配列を反映したTh-B-CTLペプチド)とも交差反応し、且つ、前記反応の程度より
は低いが、T1-SP10(A)E.con.ペプチド(タイのクレイブEのコンセンサスV3ループ
配列を反映したTh-B-CTLペプチド)とも交差反応する抗体を含んでいた。多価混
合物の4成分それぞれのうちの１つだけで免疫したマウスからの血清について、
アフリカ型T1-SP10(A)A.con.ペプチドに対して結合する能力を試験したとき、T1
-SP10CANO(A)ペプチドが、アフリカ型クレイブAコンセンサス配列に対して交差
反応する全ての抗体を産生することの原因であることが発見された。従って、CA
NOエンベロープのV3の一次配列は、他のHIV env V3配列からは大きく異なってい
るとはいえ(図27)、HIVCANO分離株のV3ループの二次構造恐らく高次構造が、多
くの異なるHIV V3モチーフに対して交差反応する抗V3抗体を誘導する能力を有し
ているようである。
データは多価Ｔｈ−Ｂ−ＨＩＶｅｎｖペプチド混合物を注入した３マウスまたは
２ヤギのいずれかの幾何平均力価を示す。
使用した方法はヘイネスらにより記述されている。
アフリカ(A.CON)及び南アジア(E.CON)HIV分離株のT1-SP10(A)配列
ヒトレトロウイルスとＡＩＤＳ １９９３
作成はG．Myers，J.A．Nerzofsky，B．Korber，R.F．Smith，及びG.N.Pablakis
による。
発行は理論生物学及び生物物理学グループＴ−１０による。
メイル・ストップ Ｋ７１０
ロス・アラモス国立研究所
ロス・アラモス，ＮＭ ８７５４５多価HIV Env免疫原により生じた中和性抗体反応
中和性抗体反応に関して、多価免疫原（図２７）で免疫された動物からの血清
は、放射性免疫沈降試験またはELISAアッセイの何れかにおいてHIV gp120IIIBお
よびgp120SF2に対して結合する。これらの動物からの血清は、シンシチウム阻害
アッセイにおいて、HIVMNおよびRF分離株を中和した。HIV gp120 における、中和CD4-V3コンホメーション決定基に対する中和の証明
17ｂおよび48ｄのヒト抗gp120モノクローナル抗体（mabs）が、HIVに感染した
患者からのヒトPBMC B細胞から単離された(Thali et al,J.Virol.67:3978-3988(
1993);Moore et al,AIDS Res.Human.Retroviral.9:1185(1993))。17bおよび48d
のモノクローナル抗体（mabs）は、gp120に対してCD4が結合するのをブロックす
るマウスモノクローナル抗体を交差ブロックし、異なるHIV分離株を広範囲に中
和するが、それら自身における、そしてそれら自身のgp120−CD4の結合について
はブロックしない(Moore et al,personal communication,1994;Thali et al,J.V
irol.67:3978(1993))。寧ろ、48d mabの結合は、CD4によるgp120の連結に続いて
、本来のgp120へとアップレギュレートされている。１つのペプチド(T1-SP10CAN
O(A))が48d mabに結合すること(図28)、およびmab48dのHIV envハイブリッドペ
プチドT1-SP10CANO(A)に対する最良の結合は、SP10CANO(A)ペプチドのT1 N末端
でのCD4ペプチドの存在に依存すること(図29)が発見された。従って、T1-SP10CA
NO(A)ハイブリッドC4-V3ペプチドは、ヒトmabの広範囲に有効な中和により認め
られるHIV gp120のコンホメーション決定基を反映している。V3ループ［SP10(A)
］とC4、T1領域は、本来のgp120おいて互いに物理的に近接していることをウィ
アットら（Wyatt et al,J.Virol.66:6997(1992)）、およびムーアら(Moore et a
l,J.Virlo.67:4785(1993))が示唆していたことは、興味深い。従って、本データ
は、T1-SP10CANO(A)合成ペプチドが、本来のgp120における広範囲の中和性C4-V3
コンホメーション決定基に類似している可能があることを直接的に示している。他のHIV分離株C4-V3コンホメーション決定基を反映した複合CD4-V3[T1-SP10
(A) ］ペプチドを同定するための一般的な戦略
HIV V3ループはそれ自身で、主としてタイプ特異的な抗IHV中和抗体を誘導す
るのに対して、T1-SP10CANO(A)ペプチドにより定義されるC4-V3決定基は、更に
広範囲に、交差反応する中和抗体を誘導することができる。このことは、HIV血
清陽性患者に由来する48dヒトモノクローナル抗体が、gp120の表面における複合
コンホメーション決定基に対して結合する事実、広い範囲のHIV分離株に対して
結合する事実、並びにHIVIIIBおよびHIVMNのような異なるHIV分離株を中和する
事実から知ることができる(Thali et al,J.Virol.67:3978(1993);Moore,J.perso
nal communication(1994))。従って、複合C4-V3ペプチドを同定するための一般
的な戦略は、ロス・アラモス・データベース(Los Alamos database)に列記され
た配列（Human Retrovirus and AIDS,1991,1992,1993 edited by G.Myers,J.A.B
erzofsky,B.Korber,B.F.Smith and G.N.Pavlakis,published by the Theoretica
l Biology and Biophysic Group T-10,Mail Stop K710,Los Alamos National La
boratory,Los Alamos,NM87545)に由来するSP10またはSP10(A)領域(例えば、HIVM
Nのアミノ酸301-327、および他のHIV分離株における相同する領域に由来するも
の)のN末端に結合した、C4配列に由来する非常に多くのC4-V3ペプチド(例えば、
HIVMN分離株からのアミノ酸419から428に由来するもの、および他のHIV分離株に
おける一致する領域に由来するもの)を構築することであろう。それから、ファ
ージの表面で発現する重鎖および軽鎖イムノグロブリン変異性遺伝子の組み合わ
せライブラリーに対してこれらの異なるC4-V3ペプチドの約40から100をスクリー
ニングすることであろう(Borbas et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978(1991)
)。ボーバスらの研究は、HIVに感染した患者に由来する多数(107から108)のヒト
モノクローナル抗体のスクリーニングの方法を提供しており、この方法は、gp12
0における複合コンホメーション決定基に対する抗体種を探索するために、広範
囲の抗体反応対するスクリーニングを可能にしている。この技術を用いて、ファ
ージ表面の組み合わせライブラリーに発現した重鎖および軽鎖ヘテロダイマーに
おける可変領域のFabノッチに適合したコンホメーションをとった、C4-V3ペプチ
ドを同定することが可能である。これらのFabモノクローナルは、単離し、クロ
ーニングすることができる(Borbas et al,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,88:7978(1991))。最も重要であるのは、HIV株の多種類の本来
のgp120 C4-V3コンホメーション決定基を反映しているC4-V3ペプチド設計を同定
できることである。このタイプのタンパクを基にした、選択を、世界中のHIV感
染の多くの地理学的に異なる位置からの、多数のHIVに感染した固体に由来した
組み合わせライブラリーを用いて行えば、本来のgp120のC4-V3からの反応性の中
和決定基に広く類似したC4-V3ペプチドを同定できる広い選択が可能であり、例
えば、多数のHIV株のC4-V3コンホメーション決定基に対して高い交差反応性を有
し、且つ、広範囲に亘り中和する抗体を誘導するための、T1-SP10CANO(A)プロト
タイプC4-V3ペプチドと一緒に多価C4-V3ペプチド免疫原へ結合された、Ｃ４−Ｖ
３ペプチドを選択することができる。
ロス・アラモス・データベースから得た配列
ヒトレトロウイルスとＡＩＤＳ １９９１
作成はG．Myers，J.A．Nerzofsky，B．Korber，R.F．Smith，及びG.N.Pablakis
による。
発行は理論生物学及び生物物理学グループＴ−１０による。
メイル・ストップ Ｋ７１０
ロス・アラモス国立研究所
ロス・アラモス，ＮＭ ８７５４５
例12
HLAベースのHIVワクチン(HLA-based HIV vaccine)の設計では、以下の可変要
素を考慮に入れた：ａ)免疫されるべき個体群またはコホートで発現されるHLA分
子、ｂ）免疫原およびそれらの反応性HLA制限エレメントに存在するCTLまたはT
ヘルパーエピトープ、Ｃ)ワクチン注射をされるべきコホートの地理学的位置に
おいて存在するHIV変異体。抗HIV T細胞の免疫性を誘導するためのHLAベースの
ワクチンは、地理学的な位置における最も一般的なHIV変異体を反映した免疫原
の多価混合物であり、ワクチン注射されるべきコホートの対象の抗原呈示細胞に
発現されたHLA分子に対して結合する免疫原性CTLおよびTヘルパーエピトープを
含んでいる。免疫原混合物は、HIVタンパクを発現している非HIVベクターの混合
物から、HIV組み替えタンパクおよび／または合成ペプチドの混合物までの範囲
に亘ることができる(Palker et al,J.Immunol.142:3612(1989);Hart et al,Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 88:9448(1991);Berzofsky,FASEB J.5:2412(1991);Haynes e
t al,Trans.Assoc.Amer.Phys.106:33(1993);Haynes et al,AIDS Res.Hum.Retrov
iral 11:211(1995);Cease et al,Ann.Rev.Immunol.12:923(1994);Walfield et a
l,Vaccines 92,Cold Spring Harbor Laboratory Press pp.211-215(1992))。
HLAベースのAIDSワクチンを開発するために使用することが可能なデータセッ
トには、１）入手可能な文献（特に、Nixon et al,Immunology 76:515(1992)を
参照されたい）から得ることが可能なHIVタンパク中のCD8+ CTLとCD4+ Tヘルパ
ーエピトープを収集すること、２）HIV CTLおよびTヘルパーエピトープを
与えるHLA制限抗原を列挙すること、３）入手可能な文献から得られる地理学的
な特定の位置に存在するHIV変異体を収集すること（特にHuman Retroviruses an
d AIDS 1993,Myers et al(eds)published by Theoretical Biology and Biophys
ics Group,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM87545)、４）地理学
的な位置による民族グループについてのHLAタイプを列挙すること（HLA 1991 Ts
uji et al(eds),Proceedings of the 11th International Histocompatibility
Workshop and Conference,Oxford Unv.Press,Oxford,England 1992）。
表26は、アフリカ系アメリカ人に対してCTLを誘導するためのHLAベースのHIV
ワクチン設計を示し、並びに、免疫すべきコホートに存在する最も一般的なHLA
タイプ、コホートにおける一般的なHLAタイプにより限定されるHLAクラスＩ CTL
エピトープ、および研究を行った地理学的な位置におけるHIV変異体についての
分析を示す。最も有益なHIV予防免疫原は、民族的な背景を考慮しないで地理学
的範囲内の免疫されるべきコホートを構成する全てのヒトのために設計されたも
のであろうし、更にそのような免疫原は、分析で使用したHLAタイプの数を広げ
ることにより、および幾つかの異なるHLA分子により与えられるHIV CTL免疫原性
エピトープを選択することにより設計され得る（Haynes et al,AIDS Res.Human
Retroviral.11:211(1995)を含む入手可能な文献を参照されたい）。多くのHIV C
TLエピトープは、HLAクラスＩ分子の２以上のアロタイプ(allotype)により与え
られ、９のCTLエピトープ（並びに、これらの部位での、HIV突然変異を反映した
変異体ペプチド）を使用することにより与えられたことから、アフリカ系アメリ
カ人の95%、カフカス系アメリカ人の97.5%、アメリカ原住民の97%およびタイ人
の99%が、そのようなHIV免疫原に対して反応することが予想され得る（以下の表
27を参照されたい）（Haynes et al,AIDS Res.Human Retroviral 11:211(1995)
）。
＊HLA分子により制限されるCTL-エピトープの性質の故に、特異的なCTLエピトー
プが含まれる(Palker et al，J．Immunol．142:3612(1989)，Berzofsky，FASEB
J.5:2412(1991)；Berzofsky，Sem．Immunol．3:203(1991))。免疫されたコホー
ト制限エレメントの発現を考慮しないでCTLを産生するためのT細胞の援助のため
に、最も一般的な免疫優性Tヘルパーエピトープのみが含まれる必要があり、こ
れは、多くのHIV Tヘルパーエピトープが複合的なHLAクラスIIタイプにより与え
られることによる(Berzofsky，FASEB J.5:2412(1991):Berzofsky,Sem.Immunol.3
:203(1991)で検討されている)。また、幾つかのレトロウイルスCTLエピトープも
、活性を刺激するTヘルパー細胞を有することを示唆されている(Berzofsky，FAS
EB J．5:2412(1991); Berzofsky，Sem．Immunol．3:203(1991)において検討され
ている)。
事実上のHIV変異性の程度が、現存するデータベースにおいて見られる変異性
の程度により反映されないかもしれないことは認識されるであろう。また、あら
ゆるHLAタイプのあらゆる変異体が、T細胞に対して同じように各々ペプチドを与
えるかどうかは不確かであることも認識されるであろう。その上、あらゆるHIV
CTLエピトープ変異体が、最良の抗HIV免疫反応に対する有効なアゴニストおよび
トリガーT細胞であろうことも、確かではない。しかしながら、今回のアプロー
チに従って設計されたワクチンは、顕著に臨床学的に有効であり得る。更に、抗
HIV T細胞反応と抗HIV中和抗体の両方を誘導するHLAベースのHIV予防免疫原の設
計のためには、HIVの主たる分離株のための広範囲に亘る中和抗体を誘導するHIV
B細胞免疫原を、多価HIV T細胞免疫原として加えることが可能である。
例証として以下に述べるのは、1994年の組織適合性試験で得られた国際組織適
合性ワークショップデータ[Albert et al eds Springer-Verlag,Berlin(1994)an
d HLA 1991,2 volumes,Tsuji et al(eds)Oxford University Press,Oxford Engl
and(1992)、さらに出版された多のデータにより補われるWilliams et al,HumanI
mmunol.33:39(1992)；Chandanayingyong et al,タイ人のHLA抗原，In Proceedin
gs of the Second Asia and Oceania Histocompatibility Workshop Confernce
，Simons and Tait(eds)Immunopublishing Toorak pp.276-87(1993)]を基に構成
された、HLAベースのHIVワクチンである。これらのデータおよびハーディ・ウエ
インバーグの定理（Hardy,Science 28:49(1908)）を用い、４個体群各々につい
て、その各個体群に特異的に設計されたワクチンの中に含まれた制限された数の
HIVエピトープが含まれているときに、その免疫システムに対してペプチドを呈
示することが予想される割合を評価した。同様な推定を、４群の全てに対して免
疫原性となるように設計したワクチンについて行った。これらの結果は、表27に
示されている。
ワクチン化のための研究で用いた個体群において最も頻繁な（または4個体群
に対して一般的な）制限エレメントが、最初に同定され、１よりも多いHLA対立
遺伝子によって与えられたペプチドが次に同定され、２つのリストの間の共通性
がその後に決定された。確率の計算には、共通対立遺伝子の頻度を利用すると共
に、個体群における付加的な高頻度の対立遺伝子の頻度を補助的に利用した。個
体群において、リストに挙げられた１以上の対立遺伝子を有する固体数の比率が
許容レベル、例えば90%よりも大きくなるまで、対立遺伝子が加えられた。こう
して、ＨＩＶ免疫原に含めるべき最小数の異なったＨＩＶペプチドを認識するＨ
ＬＡ遺伝子頻度の合計が最大かされた。次のステップは、制限対立遺伝子と関連
したペプチドを選択することである。幾つかの例においては、ただ１つのペプチ
ドが、対立遺伝子に関連しており、他の例においては、複合的なペプチドが同じ
対立遺伝子によって与えられている。
この分析において考究された４つの個体群コホートにとって、少なくとも90%
の理論上の防御レベルを達成するために、あるものは２つのエピトープだけしか
要求されず、あるものは５つものエピトープが要求される（表27）。要求される
エピトープの数が異なるのは、一部は、異なる民族グループにおいて観察された
HLAクラスＩの多形の相対的な量と複数のHLAクラスＩ分子によるペプチドの呈示
を反映している。
個々の個体群と組み合わせた個体群との間の比較（表27）は、低頻度の対立遺
伝子に関係するエピトープを含めることによって比較的少ないゲインしか得られ
ないことを示している。保護される固体の割合は漸近的に、100%へと近づき、そ
のために、このレベルに近づくとき、高頻度対立遺伝子に関連するエピトープに
対して更に加えても、該割合に対してはほとんど影響しない。これは、北アメリ
カインディアンの場合により例証されており、ここでは、組み合わせの理論的ワ
クチンにおいて、５つの非常に低頻度の対立遺伝子および１つの中間対立遺伝子
に関連した更に６つのエピトープを含めても、３％の補語をを追加するに過ぎな
い。
例13
本来のHIVエンベロープタンパクと反応する抗体の誘導
表28は、gp120(SP410-BAL)のC末端、gp41のAVERY領域(SP400-BAL)、gp41のELD
KWAS領域(GTH1-SP61)、gp120のC2領域(T1-SP420-BAL)に対する抗体を誘導するよ
うに設計されたペプチド配列を示している。加えて、T1-SP10(A)ペプチドまたは
GTH1-P10(A)ペプチドが、HIV envペプチド設計の混合物に含められた(T1-SP10(A
)およびGTH1-SP10(A)ペプチドは、HIV実験室適合株に対して有力な中和抗体を誘
導する)。
以下のペプチドを、モルモットにフロイントアジュバントと共に注入し、抗ペ
プチド抗体を誘導した：SP400-BAL、SP410-BAL、Th-B設計ペプチド、GTH1-SP61
、GTH1-SP10MN(A)、およびT1-SP10(A)-BAL。SP400-BAL、SP410-BALおよびGTH1-S
P10MN(A)ペプチドは、ウエスタンブロットアッセイにおいて、組み替えgp120III
B若しくは組み替えgp41に結合した抗体(図32A、B、C)、HIVIIIB/LAI感染CEM T細
胞の表面に結合した(図33)抗体を誘導した。ペプチドGTH1-SP61に対する抗体は
また、CEM T細胞に感染したHIVIIIB/LAIの表面に結合した(図33)。全ての抗ペプ
チド抗血清は、ELISAアッセイにおける免疫ペプチドに結合した（表33)。従って
、表28に列記したペプチド設計は、多価免疫原に組み込まれると、本来のHIV en
vタンパクに対して抗体を誘導し（これは、互いに増強しあう、特に、実験室で
適用されるＨＩＶ分離株および一次分離株中和における抗V3抗体を誘導する）。
上述において引用された全ての文献は、ここでの引用によって、それらの全体
が本明細書に組み込まれる。
上述の発明は、例として幾らかの詳細に記述しているが、これは発明を明瞭に
し、理解を得られるようにすることを目的としている。本明細書開示を読むこと
により、本発明の合成ペプチドが、本発明の範囲から外れることなく、特異的な
HIV分離株のSP-10領域の配列と多少異なるアミノ酸配列に変更することが可能で
あることは、当業者には明白なことであろう。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ
// Ｇ０１Ｎ 33/531 33/569 Ｈ
33/569 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ
(72)発明者 パルカー、トーマス・ジェイ
アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州
27712、ダーハム、ステッドウィック・プ
レイス 116