JPH03503539A - 抗マラリヤワクチンとして有用な多重抗原ペプチドの樹木状ポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗マラリャワクチンとして有用な多重 ペプチドの　　　ボ１マー ワクチンはしばしば抗原を蛋白質、炭水化物、脂質又はリボゾームのような担体 に担持して含む、断るワクチンは有用なもので、多年の間使用されてきた。しか し、それらワクチンに間して多数の問題があることはこの技術分野で認められて いる。これら問題の幾つかは担体に関係する。担体は天然源から単離されるので 、それらは往々にして品質が均一でない、更に、費用がかさみ、しかも骨の折れ る精製についての努力にもかかわらず、天然の汚染物質を完全に含まない生成物 を提供することは困難で、しばしば不可能である。このような汚染物質はそれら 自体抗原性となることがある。それら汚染物質はワクチンの使用としばしば結び 付いた望ましくない副作用、特に発熱と組織膨化を引き起こす、更に、抗原の濃 度は、担体と反応し、あるいは担体の表面に吸着される抗原の量が均一でないた めにバッチ毎に変化することがある。この問題は対マラリャ防御に適したワクチ ンを製造することの困難を著しく増加させた。

マラリャは世界中で２億人もの人に影響を及ぼすものであるため合成ワクチンの 特に重要な標的であるが、免疫予防は今だに開発されていない、げっし類、猿及 びヒトマラリャのスポロゾイトに対する防御免疫性は照射済みスポロゾイトによ る免疫化によって誘発させ得ることは知られている。このスポロゾイトの主要蛋 白質はサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　：　Ｃ５） 蛋白質であるが、このＣ３蛋白質に対して向けられる抗体は寄生体の感染力を中 和し、抗体が肝細胞に入るのを抑制することが知られている。かくして、Ｃ３蛋 白質はマラリャのスポロゾイト段階に対する合成ワクチンの開発の１つの重要な 標的となった。Ｃ３蛋白質の免疫優勢Ｂ−細胞エビトーブは全てのマラリャ種の ｃｓ蛋白質に共通の１つの特徴であるＣ３蛋白質の繰返ドメイン内に含まれる。

このＢ−細胞エピトープの蛋白質担体としての破傷風トキソイドに結合させた合 成ペプチドを用いて免疫化したマウスは１０　”個のスポロゾイトにより高い抗 体力価と耐チャレンジ性を発現させることが見い出された。しかし、同様の方法 を用いてヒトに接種する試みがなされているが、良好な抗体力価は誘発されてぃ なＣ３蛋白質の幾つかのＴ−ヘルパー細胞エピトープも同定された〔ロメロ（Ｒ ｏｍｅｒｏ）等のＥｕｒ、Ｊ、　Ｉ＋ｍｍｕｎｏ１．．１旦、１９５１　（１９ ８Ｂ）を参照されたい〕。ビー・バーゲイのＣ５蛋白質のＢ及びＴヘルパー細胞 エピトープの同定は今や、Ｊ、　ＢＩＯｌ、Ｃｈｅｗ、＋　　２６３　、’１７ １９　（１９８８）に記載される、タム（Ｔａｎ　）とその共同研究者によって 開発された方法を用いてエピトープを規定された樹木状ポリマーに結合させるＭ ＡＰ法を用いる特定の、明確なやり方でこれらエピトープを１つの分子の中に組 み込むことを可能にした。加えて、他のマラリャ種のＴ−細胞エピトープが同定 された０例えば、シニガグリア・エフ（Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ、　Ｆ、）等のＮ ａｔｕｒｅ。

３３６．７７Ｂ　　（１９８８）（ビー・ファルシバラム（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａ ｒｕａ＋）　）　　；クリサンティ’ニー（Ｃｒ１ｓａｎｔｊ、　Ａ）等の５ｃ ｉｅｎｃｅ。

２４０．１３２４　（１９８８）（ビー・ファルシバラム、血液段階）；クマー ・ニス（Ｋｕｎａｒ、　Ｓ）等のＮａｔｕｒｅ、　３３４．２５８（１９８Ｂ） （ビー・ファルシバラム　スポロゾイト）等；グツｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、８５ ．１１９９−１２０３　（１９８Ｂ）；シニガグリア・エフ等Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．１　Ｂ、６３３−６３６　（１９ＢＢ）；及びグッティンガ ー・エム（Ｇｕｔｔｉｎｇｅｒ、　Ｍ）等のＥＭＢＯＪ、。

７．２５５５−２５５７　（１９８８）を参照されたい。

樹木状ポリマーは新しいポリマ一群である。これらポリマーは分子量の単位当り の官能基濃度が通常のポリマーより高いことに特徴がある。それらポリマーは一 般に少なくとも２個の官能基を有するコア分子に由来する２本以上の同−分枝鎖 に基づく、このようなポリマーは米国特許第４．２８９，８７２号明細書におい てデンケワルター（Ｄｅｎｋｅｗａｌｔｅｒ　）等により、米国特許第４．５９ ９．４００号及び同第４．５０７，４６６号明細書を含めて幾つかの米国特許明 細書においてトマリア（Ｔｏ■ａｌｉａ）等により述べられている。これらのポ リマーは、それらの構造がコアとしての１本の幹と数本の枝を持つ的に同じであ る。

本発明の生成物は斯る樹木状ポリマー系に基づくもので、この系において抗原は コア分子から放射状に延びている技に共有結合されている。この系に多重（ｍｕ ｌ　ｔｉｐｌｅ）抗原ペプチド系という名称が付けられているが、本明細書では 時にはＭＡＰＳとも称される。後記の説明から明らかであるように、本発明の生 成物を形成するのに用いられる担体、即ちコア分子のあるものはそれらコア分子 が通常ではポリマーとはみなされないかもしれないような分子量を持つものであ る。しかし、それらの基本的構造は樹木状ポリマーと同様であるので、それらを そのように述べるのが便利ではポリマーと見なされるほど十分に大きい担体分子 だけでなく、３個程度の少数のモノマーを含むものも包含される。

樹木状ポリマーには広範囲の抗原の担体として有効に機能する能力があることが ここに発見された。

本発明は樹木状ポリマーの構造についての簡単な説明から更によく理解できるで あろう。

樹木状ポリマーは少なくとも２官能性のコア分子に作られる。

コア分子にある官能基の各々は少なくとも２つの分枝鎖を形成し、その主単位も 少なくとも２官能性である０分枝鎖中お各２官能性単位は更に生長するためのベ ースとなる。

この系は特定の分子を参照すると更によく視覚化することが可能である０例えば 、２個のアミノ基を持つリシンをそのカルボキシル基を介してペプチド結合でア ラニン又はグリシン（これらは順次結合して樹脂となり得る）のアミノ基に結合 させる場合、得られる分子は２個の遊離のアミノ基を有することとなる。このジ ペプチドは第一世代と見なすことができる。ジペプチドは２個の追加リシン分子 にペプチド結合を形成させることにより結合させて４個の遊離アミノ基を持つ第 二世代分子を生成させることができる。この方法を繰り返すことによって第三、 第四又は更に高次の世代の生成物を形成することが可能である。各世代の共に遊 離アミノ基の数は幾何学的に増加する。この数はｎを世代数とすると、２′１で 表わすことができる。

この化合物には特に高分子量のものはないけれども、これらを樹木状ポリマーと 称するのが便利である。

第１図はりシンに基づく３世代の樹木状ポリマーのコア分子を示すもので、８個 の有効アミノ基は各々グリシン結合体分子を介してペプチド抗原に結合されてい る。

同じタイプの反応をアスパラギン酸又はグルタミン酸を用いて実施することが可 能である。これら両アミノ酸は２”個の遊離カルボキシル基を有するポリアスパ ラギン酸又はポリグルタミン酸を生成させる２個のカルボキシル基と１個のアミ ノ基を有する。

これらタイプの合成を遂行するのに必要な化学は公知でかつ利用可能である。ア ミノ酸に関し、反応すべきでない官能基を封鎖し、またそれら官能基が反応すべ きことが望まれるときにそれら封鎖基を脱離させるための化学は多数の特許明細 書及び技術文献中の雑文に詳細に記載されている。

樹木状ポリマーは周知のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）合成における ように樹脂上に生成させ、次いでそのポリマーから取り外すことが可能である。

トマリアはコア分子としてアンモニア又はエチレンジアミンを用いた。この方法 において、コア分子はアクリル酸エステルとミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ　）付加 により反応せしめられ、そのエステル基は加水分解により除去される。得られる 第一世代分子はアンモニアの場合３個の遊離カルボキシル基を含有し、またエチ レンジアミンを用いる場合は４個の遊離カルボキシル基を含有する。トマリアは その樹木状ポリマーをエチレンジアミンにより、続いてアクリル酸エステルモノ マーにより鎖延長し、そしてその配列を所望とされる分子量が得られるまで繰り 返している。しかし、当業者には容易に分かるだろうように、樹木状ポリマーの 各分枝鎖は多数の選択された方法のどれによってもその長さを伸ばすことができ る。例えば、各分枝鎖はリシン分子との多重反応により鎖延長することが可能で ある。

エリノクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　）は実質的に任意の所望分子量を持つポリペ プチドを固体樹脂支持体から生長させる古典的なメリフィールド法を利用した。

この方法を樹木状ポリマーの製造に用いるので、そのポリマーを樹脂支持体に結 合させる結合用分子は３官能性である。官能基の１個は樹脂に対する結合の中に 含まれ、他の２個の官能基はポリマー生長の出発点として役立つ、ポリマーは所 望とされる分子量が得られたときに樹脂から脱離される。１つの標準的な開裂法 は液体連化水素で０℃において１時間処理する方法である。もう１つの更に満足 すべき方法はタム等がＪ、ｌａ。

Ｓｏｃ、、１０５．６４４２　（１９８３）で述べているように連化水素とジメ チルフルフィトとの錯体（ＨＦ　：　ＤＭＦ）を利用するものである。この方法 は副反応及びペプチドの損失を著しく低下させる。

デンケウオルターはその方法の１例においてリシンをコア分子として利用してい る。このコア分子のアミノ基はウレタン基に転化することによって封鎖される。

カルボキシル基はベンズヒドリルアミンとの反応によって封鎖される。それらウ レタン基を加水分解すると、樹木状ポリマー生長の出発点として役立つ２個の遊 離アミノ基を持つリジンのベンズヒドリルアミドが生成する。

樹木状ポリマーを製造するのに利用可能な方法のうちの３方法についてのこの簡 単な概説は当業者に現在の技術の基本的原理を教示するのに十分なものであろう 、これら方法はまた当業者にポリマーの顕著な特徴を教示している。その最も重 要な特徴の１つは小さな分子量の中に非常に多数の利用可能な官能基を与えるこ とである。その結果は、抗原をこのような有効官能基に結合させることによって 小容積中に高濃度の抗原が達成可能となることである。更に、得られる分子生成 物は相対的に小さな担体上に抗原を高割合で含有する。このことはワクチンのベ ースとして使用された従来の生成物とはっきり違う点である。これら従来の生成 物はしばしば大量の担体上に担持された少量の抗原より構成される。

抗原の担体としての樹木状ポリマーの他の重要な特徴は、正確な構造が分かり； 自から抗原性となり、組織を刺激し、あるいは他の望ましくない反応をもたらす 汚染物質が存在せず；抗原の正確な濃度が分かり；抗原が担体上に対称的に分布 され；そして担体は１個より多くの抗原のベースとして利用することが可能で、 そのため多価ワクチンを製造することができる、ということである０本発明の具 体的ワク智チンのベースとしてのＭＡＰＳ法の主たる利点は、かぎ穴カサガイの ヘモシアニン、破傷風のトキソイ１−及び牛の血清アルブミン等の天然産担体を 使用する従来の系とは違って、本発明の担体は抗原が判明した濃度で分散される 、完全に定義される化学的に実存するものであることである。更に、その抗原は その分子の大部分を含み、天然産担体の場合のように比較的少ない、定義さｎな い割の分子ではない。

本発明のワクチンの場合、コア分子は通常の代謝経路に続いて体で取り扱いでき るようにリシン等の天然産のアミノ酸であるのが好ましい、しかし、後記におい て更に十分に説明されるように、天然のものではないアミ７ノ酸、更にはα−ア ミノ酸でないものでも使用することができる。コア分子を一つくる際に用いられ るこれら酸又は他の任意の非対称分子はＤｉでも、あるいはＬ態でもどちらでも よい。

上記では樹木状ポリマーをポリアミドポリマーとして主として説明したけれども 、本発明の担体は樹木状ポリ゛アミドに限定されないことは容易に分かるだろう 。少なくとも２個の利用可能な官能基を持つ広範囲の分のいずれもコア分子とし て役立ち得るのである０例えば、プロピレングリコールがポリエステル系樹木状 ポリマーのベースとして役立ち得る。こはく酸は選択されたグリコール又はアミ ンと共にポリエステル又はポリアミドを生成させるコア分子として役立てること ができる。ジイソシアネートはポリウレタンを生成させるために用いることがで きる０重要な点は、コア分子は少なくとも２個の利用可能の官能基を有し、それ ら官能基より、各分枝饋上に同様に少なくとも２個の利用可能の官能基又は係止 （ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　）基を有する追加の分子との逐次足場型反応により同一 の分枝鎖を生成させ得ることである。コア分子が２個の利用可能官能基を有し、 そして各後続世代のものが２個の利用可能官能基を有する最も単純な場合は、本 発明で用いられるマラリャ起源のＴ−細胞及びＢ−細胞の抗原が係止される得る 係止座位の数はｎを世代数として（２）”で表わされる。

樹木状ポリマー化学の更に完全な議論についてはタマリア等のＰｏ１ｙｓ＋ｅｒ 　Ｊｏｕｒｎａｌ　、　１７　（１）、１１７　（１９８５）、アカロニ−（Ａ ｋａｒｏｎｉ　）等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、　　１５．１０９３　（ １９８２）及び次の米国特許明細書： 第４，２８９．８７２号　　　第４．５５８．１２０号第４，３７６．８６１号 　　　第４，５６８．７３７号第４．５０７．４６６号　　　第４，５８７，３ ２９号第４，５１５，９２０号　　　第４，５９９．４００号第４．５１７．１ ２２号　　　第４，６００，５３５号に注意を向けられたい。

引用した全ての特許、特許出願及び文献はそれらの全体を本明細書で引用、参照 するものである。

生立ユ 本発明は、現在好ましい態様において、得られる構造がＴエピトーブペブチド及 びＢエビトーブペブチドの両者を有するように複数の係止憲位をＣ８蛋白質のよ うなマラリャ蛋白質の抗原性Ｔ−細胞エピトープ及びＢ−細胞エピトープに共有 結合して有する樹木状ポリマーベースを含んで成る多重抗原ペプチド系を提供す るものである。樹木状ポリマーは少なくとも２個の官能基を有する中心コア分子 を含み、そのコア分子には末端官能基を有する分子分枝鎖が共有結合されている ０分枝鎖上の末端官能基はエピトープペプチドに共有結合されている。抗原分子 は本明細書では主としてペプチド抗原として述べられるが、それらはペプチド抗 原、更には抗原に限定されるものではない。か（して、自らは抗原性でないペプ チドがそれがコア分子に結合されるとき抗原性となることがあるのである。

選択された抗原は別個に合成（この技術分野で周知のように組換えＤＮＡ法−こ れに限定されない−を含めて色々な合成法で）するか、他の方法で得、担体に結 合させることができる。抗原は担体ポリマーの各分岐鎖を公知のペプチド合成法 を用いて延長することによって担体上に合成してもよい。

第１図は本発明の実施に際して用いることができる樹木状ポリマーの構造を示す 、これより分かるように、そのポリマーは３世代の樹木状ポリリシン生成物であ る。このポリリシンは従来の固相法でパム（Ｐａｗ　）樹脂又はポツプ（Ｐｏｐ 　）樹脂上にそのポリマーを生成させることによって製造することができる。ミ ノチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）等のＪ、Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、、、土３，２８４ Ｂ　（１９７８）及びタム（Ｔａｇ　）等のＪ、　ＡＭ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ 、、　　１０２．６１１７（１９８０）を参照されたい。ポリマーを次に樹脂か ら、好ましくはＨＦ：ＤＭＳを用いて解裂させる。図示されるように、この樹木 状ポリリシンはベンジルリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）を介して樹脂に元々結合され ているグリシンリンカ−から作られたものである。

他のリンカ−１例えばアラニンも用いることができる。リンカ・−は勿論使用を 省いてもよいし、あるいは複数のリンカ−分子を用いてもよい。

第１図は各分子が８個のペプチドを持つ樹木状ポリマーを示す。

ここで、ペプチドの幾つかは、マラリャ、例えばプラスモジうム因ブラスジウム 種の、各末端リシン残基上の利用可能官能基の各々に直接結合したＴ−細胞エピ トープペプチドを表わし、他は同様に結合した原因プラスモジウム種のＢ−細胞 エピトープペプチドを表わす。ポリマー上のＢ−及びＴ−エピトープは同じマラ リャ種のものである０本発明は単一種からの１個だけのＴ−及びＢ−エピトープ の組み合せを有するポリマーに限定されない０例えば、ピー・ビバノク４のＣ８ 蛋白質からのＴ−及びＢ−エピトープとピー・ファルシパラムのＣ３蛋白質から のＴ−４びＢ−エピトープを同時に有するＭＡＰＳも本発明の範囲内である。更 に、存しない、従って、Ｔ−ヘルパーエピトープペプチドとＢ−細胞エピトープ ペプチドの交雑種（ｃｒｏｓｓ−ａｐｅｃｘｅｓ　）の組み合せも意図されるも のである０選択されたエピトープの構造が比較的短かのリンカ−で延長すること が最もよいことが観察されている。しかし、残基が１４個より多い抗原ペプチド についてはリンカ−は通常不要である。

本発明を、便宜上、主としてコア分子としてのりシンにつくった生成物に適用さ れる態様として説明した。事実、リジン、オルニチンのような分子に似たりシン 、ツルーリシン及びβ−アミノアラニンが本発明の生成物をつくるための好まし い分子である。

と言うのは、それらは入手が比較的容易であり、処理が容易であり、しかも良好 な収率を与えるからである。

このような分子は一般式 ％式％（ （式中、！、７及び２は０−１０、好ましくは０〜４の整数である。ただし、そ れらの少なくとも１つは１であり、かつそれらのアミノ基は同一炭素原子には結 合することができない、）で表わすことができる。最も好ましい分子においては 、ｘ、ｙ及びＺの総数は２〜６であり、アミノ基は少な（とも２個のメチレン基 で隔てられている。

他の好ましいコア分子にエチレンジアミン及びそれより長い鎖を持つ同様の分子 、例えばプロピレンジアミン及びブチレンジアミンがある。このような分子は一 最式 ％式％ （式中、ｎはＯ〜１０、好ましくはＯ〜３の整数である）で表わすことができる 。

勿論、アンモニアもコア分子として用いることができる。

非常に多数の病気に対する合成ワクチンの開発が、ワクチンは自然蛋白質に基づ く必要がなく、自然蛋白質の低分子量セグメントに基づくものでよいと言うこと が認められるようになったために、最近著しく促進された。これらのセグメント は、通常免疫原性の決定因子又はエピトープと称されるが、自然蛋白質の抗原を 有するスポロゾイトによる感染に対して防御する抗体の産生を刺激することがで き、そして順次蚊ベクターのかみ付きによって宿主哺乳動物に導入される。

本発明はロメロ（Ｒｏ■ｅｒｏ　）等がＬｏｃ、　ｅｆｔ、において述べるもの のようなマラリャ起源のＴ−及びＢ−細胞エピトープペプチドに関する。この文 献を本明細書において引用、参照するものとする。

限定される訳ではないが、ピー・バーゲー・のＴ−細胞エピトープペプチドの幾 つかを下記に例示する。

ｌ−丞 ＹＮＲＮＴＶＮＲＬＬＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ＮＥＫＩＥ ＲＮＮＫＬＫＱＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＮＤＤＳＹＩＰＳＡＥ ＸＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ＫＱＩＲＤＳＩＴＥＥＷＳ　　　 　　　　　　　　　　　　Ｂ　−４ＧＳＧＩＲＶＲＫＲＫＧＳＮＸ　　　　　　 　　　　　　　　　　５ＳＳＩＦＮＩＶＳＮＳＬＧ　　　　　　　　　　　　　 　　　　６３１７　　　３２Ｂ ＮＥＫＩＥＲＮＮドＬＫＱＰＤＰＰＰＰＮＰＮＤＰＰＰＰＮＰＮＤ　　　　　Ｎ ＋　１７．１にＱＩＲＤＳＩＴＥＥ賀５ＤＰＰＰＰＮＰＮＤＰＰＰＰＮＰＮＤ　 　　Ｂ　−４＋　１７．１最後の２つの抗原Ｎ　＋　１７．１とＢ　−４＋１７ ．１はＴ−細胞エピトープＮ又はＢ−４とＢ−細胞エピトープとの組合せを表わ す。

エピトープ１７．１とその製造に関してはここに引用、参照するものとするザバ ラ（Ｚａｖａｌａ）等のＪ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、、　１６６．１５９１（１９ ８７）に記載されている。サーカムスボロゾイト蛋白質の場合、Ｂ−細胞エピト ープ（これは偶然にも免疫優勢エピトープである）は事実上反復性で、例えばビ ー・バーゲイについては（ＤＰＰＰＰＮＰＮ）　ｘ　；ビー・くバヱ久スについ ては（ＤＲＡＡＧＱＰＡＧ）ｘ若しくは（ＤＲＡＤＧＱＰＡＧ）　ｘ又は両者の 組み合せ；ビー・ファルシバラムについては（ＮＡＮＰ）ｘ　；ビー・ノーレジ については（ＱＡＱＧＤＧＡＮＡＧＱＰ）　ｘ等である。ただし、Ｘは少なくと もある種のマラリャ種については少なくとも２である。これら最小繰返単位の環 状順列の繰返しでＢ−細胞エピトープペプチド、例えば（ＰＮＡＮ）χも生成す る。

現在商業的に、あるいは公知の合成法若しくは単離法で入手可能な抗原ペプチド の幾つかを以下の第１表に示す、この表には第２欄に示される病気又は病原体と 関係がある蛋白質のセグメントであるペプチドが示されている。参照数字はそれ らペプチド及びそれらを得る方法を述べている刊行物を確認するものである。ア ミノ酸については常用の略号が使用されている。

員上泉 放入り先吏肚り支−ム土ｉ魁ちＬ昼どフ１上■１Ｂ、　）Ｉ−（Ｇｕｙ−Ａｓｐ −Ａｒｇ−Ａｌａ−マクリャ、ビー・ビバンＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ− Ａｌａ）ｎ−’）　ＺのＣＳＷ白ｔ２０１１、ｎ　＞２ Ｃ，Ｇｌｕ、−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−マクリャ、ビー・ファルシＨ ｉｓ−＾５ｐ−Ａｌａ　　　　　　　バラムのＰｆ１５５　　　　　　　３Ｄ、 　Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−マクリャ、ビー・ファルシＧｌｕ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−バラムのマロゾイト表面　　　４Ａｓｐ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−蛋白質ｌｉｅ−Ｍａｔ Ｅ、　Ａｓｎ−＾１ａ−Ａｓｒ＋−Ｐｒｏ−Ａｓｒ＋−マクリャ、ビー・ファル シ　　５Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ａｌａ−バラムのＣＳ蛋白質Ａｓｎ −Ｐｒ。

１、　ザバラ等の５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２　Ｂ、１４３６　（１９８５）２　 マククツチャン（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ　）等の５ｃｉｅｎｃｅ　、２３０．１３ ８１　（１９８５）；デーノット・デー・イー−（Ａｒｎｏｔ、Ｄ。

Ｅ、　）等の５ｃｉｅｎｃｅ　、２３０．８１５　（１９８５）＆　ウドムサン グペッチ（υｄｏｍｓａｎｇｐｅｔｃｈ）等の５ｃｉｅｎｃｅ　ｓ　２３１．４ 、　ラベッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ　）等の５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２７．１５９３ ５、　ナーディン・イー・エーチ（Ｎａｒｄｉｎ、　Ｅ、　Ｈ）等の５ｃｉｅｎ ｃｅ　。

２４６．１６０３　（１９８９） 更に、マラリャＴ−ヘルパー細胞エビトーブペブチドは、シンニガクリア（Ｓｉ ｎｉｇａｇｌｉａ）等の文献等において前記した通り、同定することができる。

簡単に述べると、あるマクリャ蛋白質のアミノ酸配列が分かると、その蛋白質の フラグメントに相当するペプチドは合成可能で、かつ哺乳動物に注射することが できる６次いで、Ｔ−細胞を免疫化された哺乳動物の血液試料から収穫し、免疫 化に使用したペプチドの存在下、試験管内でインキュベートすることができる。

このようなペプチドは、Ｔ−細胞がそのようなペプチドの存在下でのそのような インキュベーシツン中に増殖するならば、Ｔ−ヘルパー細胞エピトープペプチド であると考えられる。これらのＴ−細胞ペプチドがＴ−ヘルパーペプチドである かどうかを証明するには、それらＴ−細胞ペプチドについて、−細胞エピトープ に対する抗体の誘発試験を行なう。

前記において、アルファベットの文字はペプチドの技術分野において当業者が使 いているものと同じ意味を有する。これらは次の通りである。

Ａ−アラニン　　　　　　　　Ｍ−メチオニンＣ−シスチン　　　　　　　　Ｎ −アスパラギンＤ−アスパラギン酸　　　　　Ｐ−プロリンＥ−グルタミン酸　 　　　　　Ｑ−グルタミンＦ−フェニルアラニン　　　　Ｒ−アルギニンＧ−グ リシン　　　　　　　　Ｓ−セリンＨ−ヒスチジン　　　　　　　Ｔ−スレオニ ンニーイソロイシン　　　　　　Ｖ−バリンに一リシン　　　　　　　　　　Ｗ −）リブトファンＬ−ロイシン　　　　　　　　Ｙ−チロシンワクチン（即ち、 １つより多いマラリャ種に対して向けられるワクチン）の製造に、及び／又はマ クリャ寄生体の異なる段階に対するワクチンの製造に特に有用である。マクリャ に関係するＴ−細胞抗原とＢ−細胞抗原との両者が第２図において非限定様式で 例証される様々な配置のいずれかで樹木状ポリマーに結合されている本発明の抗 原生成物から製造されるワクチンは極めて高い抗体力価をつくり出し得るので、 特に有用である。

本発明のＴ−及びＢ−細胞エピトープをＭＡＰ基質に共有結合させると、得られ る生成物は組換えＣ３Ｗ白質又は照射されたスポロゾイトにより過去において得 られたものより１０〜１００倍大きい抗体応答水準を引き出すことが発見された 。更に、マイスにおいてはＢ−ＴモノマーのジエピトーブはＭＡＰ基質に支持さ れなかったか、あるいはＢ−エピトープＭＡＰとＴ−エピトープＭＡＰの混合物 は非常に低い抗体応答をもたらし、防御機能を示さなかったことも観察されてい る０本発明の現在のところで最も好ましい態様はＴ−エピトープペプチドとＢ− エピトープペプチドとの両者が樹木状ポリマー基質の同−官能基上にタンデムで 結合されている場合の態様である。

本発明の具体的に選択されたＢ−エピトープとＴ−エピトープとは第２図に図示 される通り種々の異なる配置でＭＡＰ基質に置くことができる。第２図はビー・ バーｙ　二について、それぞれＰＰＰＰＮＰＤＰＰＰＰＮＰＮＤとＫＱＩＲＤＳ 　ＩＴＥＥＷＳを含むＢ−エピトープ（白抜きブロック）とＴ−エピトープ（黒 塗りブロック）との交互配置を示す。

第２図において、Ｔ−（４）とＢ−（４）とは４本の分枝鎖を持つがエピトープ は１つだけであるマノマーマツプである（再び、Ｃ３蛋白質の免疫優勢Ｂ−エピ トープは少なくとも２つの繰返番単位を同時に含む）、Ｔ−（８）とＢ−（８） とは同様であるが、分枝鎖は８本である。Ｔ　（８）Ｂ及びＢ（８）−Ｔにおい ては、樹木状ポリマーの分枝鎖上に８つのＴエピトープ又はＢ−エピトープが、 またポリマーの根に１つのＢ−エピトープ又はＴ−エピトープが存在する。ＢＴ −（４）、ＴＢ−（４）、ＢＴ−（８）及びＴＢ−１８）がエピトープがタンデ ムで配置されている本発明の現在のところ好ましい生成物を例示するものである 。

本発明ではマクリャＴ−エピトープ及び同日−エピトープの組み合せと数は多数 意図され、それらも完全に本発明の範囲内であることは当業者であれば当然分か るだろう。

Ｂ−エピトープとＴ−エピトープとが分枝鎖上に交互に配置されている、即ち一 方の分枝鎖がＢ−エピトープだけを有し、他方の分枝鎖はＴ−エピトープだけを 有している本発明の生成物をつくることも可能である１例えば、第２図において 、Ｔ／Ｂ（８）はＴ及びＢのマクリャ抗原を交互に配置して有する分枝鎖８本の 樹木状ポリマーベースを表わすもので、これも本発明の範囲内である。Ｔ／Ｂ　 （４）はポリマーベースの分枝鎖が４本だけである点を除けばＴ／Ｂ（８）と同 様である。

これは、アミノ基が異なるアミノ封鎖基で封鎖されており、封鎖基の一方は酸加 水分解に対して安定であり、封鎖基の他方がアルカリ加水分解に対して安定であ る、リシンのようなジアミン化合物に基づく樹木状ポリマーを用いることによっ て直交防御法を用いて達成することができる。（例えば、第２図、Ｅ及びＦの模 式図を参照されたい、） フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）は塩基に対して不安定な保護 基であって、酸性脱保護に対しては完全に安定である。ｔ−ブトキシカルボニル 封鎖基（Ｂｏｃ　）は５０％トリフルオロ酢酸のような緩和な酸性条件下で安定 である。　Ｂｏｃ　−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ） −０８，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−０Ｈ又はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ　　（Ｆｍｏ ｃ）−ＯＨを選択することによって、１組の抗原をリシンのα−アミノ基に対し て、もう１組の抗原をω−アミノ基に入れることが可能である。ペプチド合成の 当業者であれば、逆の封鎖基と他の樹木状ポリマーとを用いて同一タイプの生成 物を達成する方法を容易に案出することができる。

本明細書に示され、議論された構造について多くの変形が可能であることは当業 者には明白であろう０例えば、樹木状ポリマーはセグメントがジスルフィド橋を 介して結合されている構造を有してもよい、斯る構造は根が分子状沃素のような 緩和な酸化網で酸化される保護されたシスチンを含有している樹木状ポリマーか ら容易に形成することができる。

もう１つの例として、第１図を参照して説明すると、樹木状ポリマーの祖にある グリシン、即ち遊離のグリシンは樹木状ポリマー分子の分枝鎖上にあるペプチド 抗原と同一でもよいしあるいは異なるものであってもよいＴ−又はＢ−マクリャ ベプチド抗原に結合させるか、又はそのようなＴ−又はＢ−マクリャベブチド抗 原で置換することができる。Ｔ−及びＢ−ペプチド抗原自体は他のりシン又は同 様の分子を結合させて追加の分枝鎖を与えることができる残基として役立つ、こ こで、これら追加の分枝鎖には更に追加のペプチド抗原、抗生物質又は非ペプチ ド抗原を結合させてもよい。

本発明の生成物は当業者に公知の方法のｔどれかを用いてヒトを含めて哺乳動物 のマクリャ惑染に対して防御するのに有用なワクチンを製造するのに用いること ができる。これら生成物は、例えば、製剤上許容し得る媒質又は稀釈剤、例えば 不活性な油、適当には、ゴマ油、ビーナツツ油又はオリーブ油のような植物油に 懸濁させることができる。別法として、本発明の生成物はｐ）！約５．６〜７． ４の水性等張緩衝溶液に懸濁させてもよい、このような溶液は、典型的には、塩 化ナトリウムにより等張とされ、くえん酸ナトリウム−くえん酸により又は燐酸 塩により緩衝される。溶液はメチルセルロースのような増粘側を用いて増粘して もよい。

ワクチンはまたエマルジョン形態として調製してもよい、エマる。

上記組成物のどれにでもソルビトール又は加水分解ゼラチンのような安定剤を添 加することができる。ネオマイシンのような抗生物質又は感染を予防する他の抗 感染剤と配合することは異例なことではない。

本発明の生成物は高い抗体力価を与えるので、多くの場合それら生成物はキャリ アー又はアジュバントなして使用される。しかし、アジュバントを用いる場合、 それは哺乳動物の免疫原性系を刺激するのに通常用いられるもののいずれからも 選択することができる。これには、例えばフロインドアジュバント（完全又は不 完全）、アジュバント６５（ビーナツツ油、マンナイド（ｍａｎｎｉｄｅ）モノ オレエート及びモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、及び燐酸アルミニ ウム又は明ばんのような鉱物質ゲル；死菌ボーデテラ（Ｘｆｌｌｅｄ　Ｂｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ　）　、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ムラミルジペ プチド、水酸化アルミニウム、サポニン等があるが、前記のように本発明のポリ マー基質を用いる場合はこのようなアジュバント又はキャリアーは必要がない。

フロインドアジュバントは、代謝されない鉱油を含有し、潜在的な発がん原であ るので、ヒト用又は食物に付く動物用のワクチン処方物には最早使用されない、 それは食物に付かない動物用のワクチンに用いることができる。鉱物質のゲルは 市販の家畜ワクチンに広（用いられている。

本発明のワクチンは上記の一般的な性質を持つ製剤上許容し得るキャリアーをあ る量の本発明の抗原性生成物、即ち免疫応答、即ち哺乳動物における防御抗体応 答をもたらすのに十分なある選択されたＴ−又はＢ−＄１６エピトープと共に含 んで成るものと定義することができる。有効量は非常に少ない、有効量は、公知 のように、抗原により変わる。有効量を組成する量はワクチンが第一治療として 意図されたものであるのか、それとも増強治療として意図されたものであるかに 依存して変わるだろう。

ＭＡＰの量は特定の免疫原、種々の被検対象において免疫原が引き出す応答、及 び異型キャリアー又はアジュバントの存在若しくは非存在に依存して変わる。一 般的に言えば、約１〜約１．０００マイクログラムの範囲内の量のＭＡＰが予定 される。最適量は、この技術分野で周知のように、抗体力価、その他補乳動物の 免疫応答の諸パラメーターの測定を含む日常的な実験により確かめることができ る。繰返免疫化が好ましい。

本発明の生成物は、使用直前に製剤上許容し得るキャリアーを用いて再構成され るだけの凍結乾燥粉末として提供するのが便利であるだろう。

ワクチンの調製と付随事項についての追加情報は周知である。

例えば、１９８６年８月２０日公開の、スミスクライン・ベックマン（Ｓｓｉｔ ｈｋｌｉｎｅ　Ｂｅｃｋｍａｎ）の欧州特許出願第Ａ、　１９１，７４８号、１ ９８６年８月２７日公開の、スミスクライン・ベックマン等の欧州特許出麗第Ａ 、　１９２，６２６号、米国特許第４，６９３．９９４号、同第４．７０７．３ ５７号、同第４，７３５．７９９号及び同第４，７６７．６２２号明細書を参照 されたい。

引用された特許、特許出願及び文献は全てその全体を本明細書において引用、参 照するものとする。

かくして、本発明はまたマクリャ細菌による感染に対して哺乳動物に免疫を与え る方法を提供するものである。この本発明の方法はマクリャＴ−及びＢ−ペプチ ド保有ＭＡＰを含んで成る化合物又は組成物を、好ましくは哺乳動物がマクリャ 細菌にさらされる前に哺乳動物にマクリャＴ−及びＢ−ペプチド保有ＭＡＰを含 んで成る化合物又は組成物を免疫学的に有効な量で投与することから成る。ここ で、上記有効量はマクリャ細菌による感染に続いて宿主哺乳動物に起こる寄生虫 血症を抑制するのに有効な量である。

マクリャ起源Ｔ−及びＢ−ペプチド保有ＭＡＰ及び任意成分としての製剤上許容 し得るキャリアー又は稀釈剤を含んで成る免疫原性化合物を有効量で含む、マク リャのスポロゾイト、その他の段階でのマクリャ感染を抑制するのに有用なワク チンも意図される。

当業者には明白なように、本発明の生成物は、その着想を理解してしまうと、当 業者には周知の方法で製造することができる。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８５．５４０９　（ １９８８）；ブロスネット（Ｐｒｏｓｎｅｔｔ）等のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　、２６３．１７１９（１９８Ｂ）、及びチェナグ（Ｃｈｅｎａｇ）等のＰｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８６．４９２９　（１９８Ｂ）に記載されタム（Ｔａｇ　）法はその例 である。これらの文献を全て本明細書において引用、参照するものとする。

ＭＡＰ合成に通用可能な若干の一般的観察結果は当業者にとって助けになるだろ う、これらは次の通りである：１、　この合成に要するカップリング時間は一般 に長い（２〜４時間）。

Ｚ　ジメチルホルムアミドが一般的には二塩化メチレンよりも適当な溶剤である 。

λ　ペプチド樹脂は再溶媒和が極めて困難であるので合成のいかなる段階でも乾 燥すべきでない。

４、　カップリングはその完結について定量的ニンヒドリン法でよ（監視すべき である。

５、ＭＡＰは改良酸保護法で、強酸触媒による場合の副反応を回避するためにジ メチルスルフィド中でＨＦか又はＴＦＭＳＡを用いて樹脂から一番良く解裂され る〔タム等のＪ、＾■、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、１０５、６４４２　　（１９ ８３）　　及び　Ｊ、　　Ａｓ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、　１０８．５２ ４２　（１９８６））。

６、ＭＡＰは樹脂支持体から解裂された後強（凝集する傾向がある。精製は、解 裂反応の望ましくない芳香族添加物、例えばＰ−クレゾール及びチオクレゾール を除去すべく、尿素及びメルカプトエタノール中８Ｍの透析媒体中、塩基性、強 力変性条件下での長時間透析で行うのが一番良い。所望によっては、高性能のゲ ル透過クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製 を行ってもよい、はとんどの場合、ＭＡＰは更なる精製なしで直接使用可能であ る。

表■はマウスに免疫応答を引き出す本発明生成物の効果を測定するために行った 幾つかの試験の結果を要約して示すものである。

これより、本発明のＭＡＰベース生成物は照射済みスポロゾイト、組換えＣ３蛋 白質又はモノマーＢＴのペプチドに比較して均一な高抗体力価を有することが認 められる。また、その応答はＢＴ免疫原の構造により変化することも認められる 。

表■：ビー・バーゲーの色々な免疫原により誘発され、組換えＣ３蛋白質とスポ ロゾイトを用いて検定された抗体力価の比較 応 ＩＦＡ力価　　　　ＲＩＡ力価 一朋と一一一二良−スポロシイ）　　　　ｒ旦旦ｍスポロゾイト”　　　　　　 　　２．０４８　　　　　　　Ｂ、　１９２組換えＣＳ蛋白質’　　　　　２． ０４８　　　　　　２．０４８モ／７−ＢＴペプチドｃ８００　　　　　　１， ０２４ＢＴ−ＭＡＰ（４）’　　　　１２８．０００　　　　　４０Ｂ、０００ ７Ｂ−ＭＡＰ　（４）　　　　　３２，０００　　　　　４００，０００ＢＴ− ＭＡＰ　（８）　　　　　２４．０００　　　　　１００．０００７Ｂ−ＭＡＰ 　（８）　　　　　６４，０００　　　　　４００．０００で２回、２週間間隔 で静脈注射した。血清を集め、最後の注射後ｌＯ日間プールして置いた。最高ポ ジティブの血清溶液の逆数として表わされる抗体力価を間接免疫蛍光検定法（Ｉ ＦＡ）ではグルグルアルデヒド固定ビー・バーゲースボロゾイトを、放射線免疫 検定法（ＲＩＡ）では組換えＣ８蛋白質を用いて得た。

ｂ、Ｈ−２”ハロタイプのマウス４匹（Ａ／Ｊ菌株）に日数ＯではＣＦＡ中に乳 化させた組換えＣ３（ｒｃＶｓ）ピー・バーゲ二蛋白質２５μｇをｉ、　　ｐ、 注射し、また日数１５日ではＩＦＡでｒＣＳ蛋白質２５μｇをＳ、　Ｃ，注射し た。１０日後に血清を集−Ｃ３蛋白質誘導Ｔ−細胞エビトーブペブチドが１画境 われるペプチド免疫原を各５０マイクログラムｉ、Ｐ、注射した。免疫化の計画 及び検定方法は組換えＣ３蛋白質についてのものと同様であった。

かくして免疫化されたマウスを各２０００スポロゾイトと対抗させると、ＢＴ− ＭＡＰ　（４）はマウスの８０％に完全防ｍ（すなわち、寄生虫血症の防止）を もたらし、ＴＢ−ＭＡＰ　（４）はマウスの６０％を護り、ＢＴ−ＭＡＰ　（８ ）はマウスの５０％を護り、ＴＢ−ＭＡＰ　（８）はマウスの６０％を護った。

本発明によるＭＡＰは次のようにして合成することができる。

次の略号の幾つかが合成例の中で用いられている：Ｂｏｃ−ｔ−ブトキシカルボ ニル ＴＦＡ−）リフルオロ酢酸 ＤＭＦ−ジメチルホルムアミド ＤＣＣ−ジシクロへキシルカルボジイミドＤｎｐ−ジニトロフェニル ２ＣＩｚ−２−クロロカルボベンゾキシＤＩＥＡ−ジイソプロボイルエチルアミ ンＴＦＭＳＡ−トリフルオロメチルスルホン酸ＢＳＡ−ウシの血清アルブミン ＨＰＬＣ−高性能液体クロマトグラフィーＴＢＲ−腫瘍保有ラビット ＡＴＰ−アデノシントリホスフェート Ｄｎｐ−ジニトロフェニル ＣＩＺ−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒＺ−ブロモベンジルオキシカルボ ニルＥＬＴＳＡ−酵素結合免疫吸着検定 ２隻班上 多重抗原ペプチド合成の一般的方法 ペブチドの抗原を持つ８分枝マドリンクスコアの合成をＢｏｃ−β−Ａｌａ　　 ０ＣＨｘ　　Ｐａｍ樹脂に対して、樹脂０．５ｇの典は前記レベルより若干低か った）で、段陽的固相法〔メリフィールド・アール・ビー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄ、　Ｒ，Ｂ、のＪ、Ａｍ、、　Ｃｈｅｓ、Ｓｏｃ、、＋−彰」−１（１９６３ ））に手動法で行−た、Ｂｏｃ蒸の５０％ＴＦＡによる脱離と得られた塩のＤＩ ＥＡによる中和後に、４モル過剰の、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｅ）（０，２ｍｍ ｏｊりの予しめ形成した対称無水物を用いてＤＭＦ中で担体−コアの第一レベル の合成を達成し、次いでＣＨｚＣｉ！、　ｚ中でＤＣＣにより再カップリングさ せた。

第二及び第三レベルを同じプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）でそれぞれ０．４ｍ ｍｏｆｆｉ及びＱ、１３　＋ｕ＋ｏｆ！、の前以って活性化したＢ　ｏ　ｃ　− Ｌ　ｙＳカップリングには１．５＋ｕ＋ｏｎ！の前以って活性化されたアミノ酸 が必要である。ペプチド−抗原の合成のための保護基は次の通りである：３官能 性アミノ酸のα−アミノ末端基Ｇ；、”ついではＢ　ｏ　ｃ、基、同アミノ酸の ほとんどの側鎖についてはヘンシルアルコール誘導体、即ちＡｒｇ　（Ｔｏｓ） 、ＡＳＰ　（ＯＢＺ７２）、Ｇｊ２ｕ　（ＯＢｚ、ｊ２）、Ｈｉ　ｓ　（Ｄｎｐ ）、Ｌｙｓ　（２ＣＩＺ）、Ｓｅｒ　（Ｂｚｆｆｉ）、Ｔｈｒ　（Ｂｚｆ）及び Ｔｙｒ　（ＢｒＺ）、重量と容量の幾何学的増加の故に、樹脂のｇ当り溶剤３０ ｍｊ！という新し、い容量比を用いた。ＴＦＡによる脱保護（２０分）をＴＦＡ で２回、各２分間予備洗浄することによって前以って行った。ＤＩＥＡによる中 和はＣＨｔＣｊ２に中で行い（５％Ｄ　Ｔ　ＥＡ）　、かつＤＭＦの追加中和も 行−ｄ：：（２％ＤＩＥＡ）、Ａｒｇ、Ａ、ｓｎ、、Ｇｊ２ｎ及びＧ　１　ｙを 除く全残基に・ついて第一カップリングを前以って形成した前記対称無水物を用 いてＣＲ１１ｆ中で行い、第二カップリングをＤＭＦ中で行ったや各カップリン グは２時間であった。Ｂｏｃ−ＡｓｎとＢｏｃ・−Ｇｌｙとのカップリングは予 じめ形成した１−ヒドロキシベンゾＩ・リアゾールエステルによりＤＭＦ中で実 現させた。Ｂｏｃ、−ＧｕｙとＢｏｃ−Ａｒｇとはジペプチドの形成及びラクタ ムの形成の危険をそれぞれ避けるためにＤＣＣ単独でカップリングさせた。カッ プリングは全て各サイクル後に定量的ニンヒドリンテスト〔サリン・ブイ・ケ・ −・　（Ｓａｒｉｎ、　Ｖ、　）［、）等の　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　、 上ニュー、１４７　（１９８１））でモニターし、そして必要ならばＤＭＦ中、 ５０°Ｃで２時間の対称性無水物の第三のカップリングを用いた〔りＪ・トジェ ー°ビー゛”Ｐｒｏｃ、　Ａ１１゜Ｐｅｐｔ、　Ｓｙ＊ｐｏ、、第９回”　（シ ー・エム・デーバー（Ｃ，Ｍ、　Ｄｅｂｅｒ）、ケー・ディー・コツベル（Ｌｌ ）Ｊｏｐｐｅｌ　）及びブイ’ジｓ　　（Ｖ。

Ｊ、）〕。この〕合成壱Ｎ、Ｎ−ジメチルピリジン０３ＩＩＩｌＯ２を含有する 無水酢酸／ＤＭＦ　（３ｓｉ＊ｏｆｆｉ）中でのアセチル化により停止させた。

ＭＡＰの完結後、保護されたベグチドー樹脂（０，３ｇ）をＨｉＳ（存在する場 合）のＮ　ｌ　ｍ−ジ、；トロフ、−ニル保護基を除くためにＤＭＦ中で８時間 １Ｍチオフェノールで処理しく反応を完結さセるのに必要ならば５０℃で３回） 、Ｎ−Ｂｏｃ基を除くために５０％ＴＦＡ／　ＣＨ２ＣＩ！ｚ　　（１，０ｍｆ ｆ１）で５分間処理し、そして粗ＭＡＰを得るために開裂に関する低７／高−・ ＨＦ法〔タム・ジ１−・ビー　・ヒース・ダブりニー・ニス（）ｉｅａｔｈ、　 Ｗ、　Ｆ　）及びメリフィ・−ルド・アール・ビーのＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｓ＋、Ｓ ｏｃ、　　１０ゴＬ、６４４２（１９８３））又は低−高ＴＦＭＳＡ法〔タム・ ジエー・ビー、ビー・ス・ダブりニー・エフ及びメリフィールド・アール・ビー のＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　　１０８．５２４２　（１９８６））により 処理した。この粗ペプチドを次に冷エーテル／メルカプトエタノール（９９：１ 、ｖ　／　ｖ、３０ｍｆ）で洗浄してｐ−チオクレゾールとｐ−クレゾールを除 去し、そして０，１．　Ｍ　）リス（Ｔｒｉｓ　）パンツｙ−（ｐＨ８）中８Ｍ 尿素、０，２Ｍジチオスレ＝ｆ　トールＸ００ｍ１に抽出した。開裂工程で生成 した全ての残留芳香族副生成物を除去するために、透析管材料中のペプチド（ス ペクトル・ポルＮ、パージされた溶液中で０．１Ｍのメルカプトエタノールと０ °Ｃで２４時間平衡させた。透析を次に全てｐＨ（８，０の０．１Ｍ　Ｎ）１． １（ＣＯｘ−（ＮＨ４）ｔ　ＣＯｉ緩衝液中８Ｍの、次いで２Ｍの尿素中で１２ 時間、続いて）ｌｔｏ及びＩ　Ｍ　ＨＯＡｃ中で逐次的に続けて尿素を全て除去 した。次いで、凍結乾燥したＭＡＰを高性能のゲル透過クロマトグラフィー又は イオン交換クロマトグラフィーでバ・ソチ式で精製した。精製された物質は全て 満足すべきアミノ酸分析を与えた。

ペプチドである（Ａｓｎ−Ａｆｆａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）ｓ　−ＭＡＰ（ＮＰ−１ ，６ＭＡＰ）の合成と精製 ペプチド−（Ａｓｎ−Ａ／ｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）ｓ　−Ｌｙｓａ−Ｌｙ　ｓ２− １−、ｙ　５−ＯＨを実施例１に記載の一般的方法で合成した。

この合成はＢｏｘ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）−０ＣＨｚ　−Ｐａｍ−樹脂（コーポリ （スチレン−１％−ジビニルベンゼン樹脂）を用いて置換度０．１１ｓｉｍｏｆ 　／　Ｅ−樹脂において開始させた。置換は３レベルのＢｏｃ−Ｘｌ、ｙｓ（Ｂ ｏｃ）の逐次添加後０．８８ｍ５ｏｆ／　ｇであることが見い出され、８分枝構 造の（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ａ）（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、−しｙｓ　（Ｂｏｅ ）−０ＣＨｚ　−Ｐａｍ樹脂を与えた。この合成を改良ベラクツ２９９０合成装 置〔カリフォルニア州、バロ・アルド（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　）のベックマン・ インストラクションズ（Ｂｓｅｋｍ？、ｎ　Ｉｎ５ｔｒｕｅｔｉｏｎｓ）中で樹 脂２．５ｇを用いて続けた。合成はカップリング工程を全て最適化したコンピュ ータ・−プログラムを用いて行った。例えば、Ｂｏｃ−ＡｌａとＢｏｃ−Ｐｒｏ とのカップリングは凝集と不完全力・ノブリングを最小限に抑えるｃｉｉ！ｃｐ 、２　　ニジメチルホルムアミドの溶剤比（１：３ｖ／■）で対称性無水物法に より実現させた。Ｂｏｃ−Ａｓｎのカップリングは予備形成した１−一ヒドロキ シベンゾトリアゾール活性エステルによ、って同−溶剤中で行った。各アミノ酸 はカップリング収率を最大となシ、１、かつ反応を＞９９．６％完結まで本質的 にもってゆ（ために二重カップリングプロトコルを受けた。

保護ペプチド−・樹脂を部分、部分に分けて脱保護した。最初の脱保護は乾燥済 みペプチド−樹脂１．５７　ｇを用いて反応容器中で実施し、ぞしてＢＯＣ−保 ｉｌ基及び他の外来物質を除去するために次の操作に付した：ＣＨｚＣｊ２＊　 　（３％１分洗浄）；ＣＨｓＣＯ□１ｌ−ＣＨｚＣ１，Ｚ（１：　１，３％２分 ）及びＣＦ＝ＣＯｚ）Ｉ　（３Ｘ　２分洗浄）、次いで次の脱保護試剤：Ｉ〜リ フルオロメタンスルボン酸ニトリフルオロ酢酸：テトラ上１゛ロチオフエン二ｍ −クレゾール（ｍｌで４＝２０：１２：４）を含有する４　’Ｃにおける３、５ 時間の反応、スルフィド補助解裂操作のアシドリシス解裂により放出されたペプ チドを集め、−３０°Ｃに予冷されたエチルエーテル（２３０ｍ１）で沈殿させ た。沈殿物を遠心分離してベレットとなし、そしてエチルエーテルを真空上除去 した。ペプチドを次に０゜０１　Ｍ　ＨＯＡｃに溶解し、そして１２１の０．Ｏ ＩＭ　ＨＯＡｃ中で透析した。ペプチドを次に凍結乾燥して６０ｍｇの（Ａｓｎ −ＡＩ！ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）ｓＯＭＡＰを得た。解裂後得られた樹脂を加水分 解すると、ペプチドの約９０％が樹脂支持体から解裂されていたことが示された 。この低収率はペプチドのエーテルによる沈殿が不完全であることによるもので あった。同じペプチド−樹脂（１，０ｇ）をＨＦ−アニソール（９：１ｖ／ｖ、 全部で１０ｍ１）によってもｏ　”ｃで１時間解裂させて、１０〜１００％のＨ ＯＡＣｃによる長い抽出後に２２０ｍｇのＭＡＰを得た。粗収率は３３％であっ た。透析を１０％０ＨＡＣを用いて行った。

透析後のペプチドを次にアミノ酸分析（６ＮＨＣｆｆｉによる加水分解後）でま ず分析した。見い出されたＭＡＰのモル比はＡｓｎ：Ａｊ！ａ　：　Ｐｒｏ　： 　Ｌｙｓ　−１，９７（２）　　：１．０３（１）　　：　１　（１）：　０． ２６　（０，２２）であった、これはカッコの中に示される予想理論値と一致す るものであった。

裏胤阻主 マクリャ起源のＴ−細胞抗原及びＢ−細胞抗原を含有するジ−エピトープ多重抗 原ペプチド合成の一般的方法（ａ）方法Ａ、２個のエピトープのタンデムでの結 合ジ−エピトープＭＡＰの合成は前記実施例に記載したモノ−エピトープＭＡＰ と同様のＢｏｃ−Ａｈａ−ＯＣＨｚ　−Ｐａｍ樹脂（Ｑ、１ｍｍｏｆｆｉのＡｌ ａが樹脂１ｇ中に存在する）に対する段階代置相法で手動式で達成した。５０％ ＴＦＡによるＢｏｃ基の脱離及びＤＩＥＡによる得られた塩の中和の後に、Ｂｏ ｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏ　ｃ）−Ａｊｌ！ａ−ＯＣＨ，−Ｐａｍ樹脂を形成する、担 体コアについての第一レベルの合成をＣ）ＩっＣｌ、中で４モル過剰のＢｏｃ− Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）を用い、ＤＣＣ単独により達成した。第二及び第三レベルの 合成を同一プロトコルにより行って８分枝Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）のコアマ トリックスを得た。この点から先きでは、ペプチド抗原又は２つのエピトープの 合成は、それらがタンデムで配列され、それらがあたかも１つの抗原であるかの ように処理されるので、ｔ−ブトキシカルボニル／ベンジル保護基の手法を使用 して前記実施の合成と同様に進めた。場合によっては、テトラペプチド・に１ｙ −Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのようなスペーサーを２つのペプチド抗原間に挿入し て柔軟性を出すようにする０合成の完結後、ＭＡＰ−樹脂をＴＦＡで処理してＮ 　　Ｂｏｃ基を除去し、次にＣＨｚＣｆ□中で１０％無水酢酸／１０％ＤＩＥＡ によりアセチル化し、最後に低−高ＨＦ法により開裂させてＭＡＰを樹脂支持体 から除去した。粗ペプチドを次に冷エーテル／メルカプトエタノール（９９：ｌ ｖ／ｖ）で洗浄してｐ−チオクレゾールとｐ−クレゾールを除去し、そして０． １Ｍ）リス、）Ｉｉ緩衝液（ｐＨ８，０）中８Ｍの尿素に抽出した。開裂工程で 生成した残留芳香族副生成物を除去するために、ＭＡＰを８Ｍの尿素中で透析し くスペクトル・ポル６、分子量のカットオフ１，０００　）　、次いで０．１Ｍ の酢酸中で２回５〜６時間透析して尿素を除去した。

これらのＭＡＰをＨｏから３回凍結乾燥して酢酸を除去した。

（ｂ）方法Ｂ、リシンのアミノ基の交互分枝による２以上のエピトープの結合 リシンには２個のアミノ基が存在するので、またこれら２個のアミノ基は選択的 に保護することができると思われるので、そのＮ−Ｈ！Ｎ基を酸に不安定なりｏ ｃ基で保護し、Ｎ−Ｎ２２基を塩基に不Ｂｏｃ基で保護するそのような製造法で コアマトリックスは合成できると思われる。この選択性を利用してこのコアマト リックスの合成を達成するために、Ｎ−ＮＨ！　’　　Ｂ　ｏ　ｃ及びＮ−Ｎ） ＋２−Ｆｗｒｏｃを含有するコアマトリックスを例証する。このコアマトリック スの合成は第−及び第ニレベルの分枝のためにＢｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）を用 いる前記実施例に記載したものと同様であった。第三レベルにおいては、コアの Ｌｙｓ分技分枝めにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ　（Ｂ。

Ｃ）を使用して各々についてＬｙｓ　（Ｂｏｃ）及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ末端基を 与えた。第一エピトープ（又はタンデム配置の２つのエピトープ）の合成では前 記実施例に記載したＢｏｃ／ベンジル化学を使用したが、この合成中に中和時間 をＦｍｏ　ｃｌｉの早期開裂を最小限に抑えるために１分に短縮した。第二エピ トープの合成ではＦｍｏｃ／ｌ−ブチルの化学を採用しく即ち、Ｎ−Ｎｕｔ基を Ｆｍｏ　ｃで保護し、側鎖をｔ−ブチルアルコール誘導保護基で保護する）、Ｂ ；ｃ−アミノ酸鎖を使用する第一エピトープを完結させた後その合成を開始させ た。Ｆｍｏｃ−アミノ酸を次の通りの３官能性アミノ酸用側鎖保護基と共に使用 した：Ｇｊ！ｕ（ＯＢｕｔ）、Ａｓｐ　（ＯＢｕｔ）、Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ）、Ｔ ｈｒ　（Ｂｕｔ）、Ｓｅｔ　（Ｂｕｔ）、Ｔｙｒ　（Ｂｕｔ）、Ａｒｇ　（Ｐｍ ｚ）、Ｈｉｓ　（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ　（Ｆｏｒ）及びＣ，ｙｓ　（Ｂｕｔ）、Ｎ −Ｆｍｏ　ｃの繰返脱保護はジメチルホルムアミド中２０％のピペリジンにより 行い、そしてピペリジンによる１回の予備洗浄に続いてＤＭＦ中でＤＣＣ：ＨＯ Ｂｕｔによりカップリングを試みた。

合成完結後、ＭＡＰ樹脂を低−高ＨＦにより処理してペプチド鎖を樹脂から脱離 させた。この処理と精製は前記実施例に記載のものと本質的に同じである。Ｆｍ ｏｃ、ｔ−ブチル化学を採用してこのペプチド鎖を組み立てる手順は次の通りで あった：（１）ＤＭＦ２０ｍｆ　（３ｙ１分）；　　（２）ピペリジン／ＤＭＦ 　（１：　１ｖ／ｖ）２０ｍｊ！　（１分）；　　（３）ピペリジン／ＤＭＦ　 （１：　１ｖ／ｖ）２０ｍｆ　（１０分）；　（４）ＤＭＦ２０ｍｊｌ！　（３ ｙ１分）；　（５）ＣＬ（ｆ！ｔ　２０ｍｊ！　（３ｙ１分）；　（６）ＤＭＦ ２０ｍｆ（２ｙ１分）；　（７）ＤＭＦ５ｍＡ！中アミノ酸（４当量）（５分） 、ＤＭＦ中ＨＯＢｔ　（４当量＞　、ＣＬＣＬ中ＤＣＣ（４当量）を２時間添加 ；　（８）ＤＭＦ２０ｍｌ（４ｙ２分）；　（９）ｃｏ、ｃｐ。

２０ｍｆ　（２ｙ２分）。

（ｃ）方法Ｃ１前以って形成した２つの異種ＭＡＰのジスルフィド結合を介して の２種以上のエピトープの結合ａのようなジペプチドを実施例３ａ又は３ｂに記 載されるようにしてそれら予備形成ＭＡＰのカルボキシ末端において付加させる 。

これは常法で達成することができ、次いでＢｏｃ−Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）をＢｏｃ −Ａｌａ−ＯＣＨ，−Ｐａｍ−樹脂に付加させることによるコアマトリックスの 合成を開始させた。ジペプチド・Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）−Ａｆａ−ＯＣＨ ｔ　Ｐａｎ−樹脂の形成、即ちコアマトリックスの合成の後、前記方法を使用す る１種以上のペプチド抗原の組み込みを進めてＣｙｓ　（Ａｃｍ）−ＡＩｉａジ ペプチドＣ００Ｈ−の尾を有する上記予備形成ＭＡＰを得た。Ｃｙｓ（Ａｃｍ） はＨＦ脱保護法に対して安定である。このＣｏ０ＨＣｙｓ　（Ａｃｍ）−Ａｌａ ジペプチドの尾を有する予備形成ＭＡＰを精製した。２つの異種予備形成ＭＡＰ の三量化は■２によるジスルフィドへの酸化により達成したが、これによりＡｃ ｍ−基のシステニル残基からの脱離も付随的に起こる。詳細な手順は次め通りで あった。１＋ｍ５ｏｆのＭＡＰに対して、Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）を有する異種の予 備形成ジ−エピトープＭＡＰを脱気されかつＮ８で精製された５０％酢酸溶液に 室温で溶解し、■、のＭｅＯＨ溶液（１Ｍ溶液）５０ｍｊ！をＯ″Ｃで１時間バ ッチ式で加えた。ＩＭの水性チオ硫酸ナトリウム（又はアスコルビン酸）を黄色 が除かれるまで加えることによって反応を停止させた。ＭｅＯＨを０．１酢酸中 での透析により除去し、そして所望とされたＭＡＰをゲル透過クロマトグラフィ ー、イオン交換クロマトグラフィー又は逆相高圧液相クロマトグラフィーで精製 した。

ＦＩＧ、２８　　　　　　ＦＩＧ、２ＣＦＩＧ、２Ｊ　　　　　ＦＩＧ、２に 手続補正書（自発） 平成５年３月５日。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂ−細胞エピトープ及びＴ−細胞エピトープの物質ペプチドより成る群から 選ばれる、複数のＴ−細胞エピトープ及びＢ−細胞エピトープの両分子が結合さ れている官能基を有する樹ホ状ポリマーを含んで成る、抗原生成物。
2. ２．少なくとも１種のＴ−細胞及びＢ−細胞のエピトープペプチドが縦１列で同 一官能基に結合されている請求の範囲第１項に記載の生成物。
3. ３．Ｔ−細胞及びＢ−細胞エピトープペプチドがピー・バーゲー、ピー・ノーレ シ、ピー・ヨエリ、ピー・マラリヤエ、ピー・オヤレ、ピー・ファルシパラム及 びピー・ビバックスより成る群から選ばれる少なくとも１種のマラリヤ種のサー カムポロゾイト蛋白質に由来するＴ−細胞及びＢ−細胞エピトープペプチドから 成る、請求の範囲第１項に記載の生成物。
4. ４．Ｂ−細胞エピトープペプチドが （ａ）（ＮＡＮＰ）ｘ； （ｂ）（ＤＲＡＺＧＱＰＡＧ）ｘ：ただしＺはＡ又はＤから独立に選ばれる； ＝ （ｃ）（ＱＡＱＧＤＧＡＮＡＧＱＰ）ｘ；（ｄ）（ＤＰＰＰＰＮＰＮ）ｘ； （ｅ）（ＹＡＡＡ（Ａ）ｎＧＧＧ（Ｇ）ｍＮ）ｘ：ただし、Ｙは独立にＤ又はＧ であり、ｎは０又は１であり、ｍは独立に０又は１である； （ｆ）上記シーケンスの組み合せ； （ｇ）繰返単位（ａ）乃至（ｅ）の各々の環状配列物よりなるペプチド（式中、 ｘは少なくとも１の整数である）より成る群から選ばれるアミノ酸シーケンスを 含んで成り；そしてＴ−細胞エピトープがＢ−細胞エピトープと同一の物質種の ＣＳ蛋白質に由来する１種以上のＴ−細胞エピトープである、請求の範囲第３項 に記載の生成物。
5. ５．樹木状ポリマーの官能基にＴ−細胞エピトープペプチドが垂下、結合されて おり、そして同一物質種に由来するＢ−細胞エピトープペプチドが、所望によっ て結合体を介して、前記Ｔ−細胞ペプチドの他端に垂下結合されている、請求の 範囲第４項に記載の生成物。
6. ６．同一物質種に宙来する１つより多いＴ−細胞エピトープペプチドが上記物質 種に由来する少なくとも１つのＢ−細胞エピトープペプチドと共に含まれている 、請求の範囲第４項に記載の生成物。
7. ７．請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の生成物を免疫原性的に有効な 量で含んで成る、マラリヤに対するワクチン。
8. ８．哺乳動物にマラリヤに対する免疫性を与える治療が必要とされるときに、請 求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の生成物を免疫原性的に有効な量で投 与することを含んで成る、哺乳動物に抗マラリヤ免疫性を与える方法。