JPH07505878A

JPH07505878A - Ｈｉｖエンベロープ糖タンパク質から誘導された合成ポリペプチド

Info

Publication number: JPH07505878A
Application number: JP5518145A
Authority: JP
Inventors: フィッシュリー，ロバート　ヴィンセント; ロブソン，バリー; アストン，ロジャー
Original assignee: プロチュース　モレキュラー　デザイン　リミテッド
Priority date: 1992-04-16
Filing date: 1993-04-16
Publication date: 1995-06-29
Also published as: EP0636145A1; WO1993021218A1; ZA932648B; GB9208428D0; KR950700933A; CN1082053A; AU3960493A; CA2118033A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質から誘導された合成ポリペプチド本発明は、合成ポリペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、ビールスエンヘローブタンパク質の特定領域の三次元構造および／または静電的表面および／または他の物理的、化学的および構造的特性と匹敵する合成ポリペプチドに関する。本発明は、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因となる因子として知られるヒト免疫不全ビールス（ＨＩＶ）に関するワクチン、免疫学的に活性な治療剤、診断剤、並びに他の医薬または科学的薬剤を設計するのに特に重要である。

最近の１０年の間に、ＡＩＤＳは、全世界的に重要な医療問題として浮かび上がってきており、現在、この疾患の原因となる因子であるＨＩＶによる感染の研究、診断、処置および／または予防のための薬剤に対して緊急の必要性がある。Ｈ工Ｖ１ビールスおよびＨＩＶ　２ビールスにより生産されるタンパク質のアミノ酸配列の入手可能性に伴って（例えば、Ｒａｔｎｅｒ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、。

エンベロープタンパク質の抗原特性と匹敵する合成ポリペプチドを案出することが可能となった。

本発明の目的は、Ｈ工Ｖビールスに対する抗体、最も好ましくは中和抗体、則ち、受動または能動免疫作用により、Ｈ工Ｖビールスの感染を防止し、および／またはＨ工Ｖビールスか広がるのを制限する抗体の産生を引き出すことか可能な合成ポリペプチドの開発にある。このような抗体を用いた受動免疫作用は、ＡＩＤＳ患者の効果的な処置手段を構成し、個体内あるいは個体間でビールスが広がるのを制御し、従ってこの疾患の進行を遅くするか、あるいは阻止するであろう。

本発明は、少なくとも１種のヒト免疫不全ビールス（Ｈ工Ｖ）における少なくとも１種の抗原特性を有する合成ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、実質的に、以下の式（１）のアミノ酸配列からなる：Ｘ−Ｒ，−Ｌｅｕ−Ｒ，− Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｒ３−Ｌｙｓ−Ｙここで、Ｒ，はＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｒａ　−Ｒ＋　、　Ｇｌｎ−レ−Ｒ１、＆−Ｒｓ、島から選択されるか、またはＲ１は存在せず：Ｒ１は、Ｇｉｎ　、　Ｌｙｓ　、　ＧｌｕまたはＡｒｑから選択されるアミノ酸残基であり７Ｒ，は、Ｉｌｅ　５ＴｈｒまたはＡｌａから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ，は、ＨｉｓまたはＧｌｕであり：Ｒ，は、し川またはＭｅｔ−でありｉＸおよびＹは、各々独立して存在しないか、あるいは独立して１個以上のアミノ酸残基である。

一般的に、Ｒ，がＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｒ，−丸であり、ＸおよびＹが存在する場合、ＸおよびＹは、天然エンベロープタンパク質配列とは対応しない。さらに詳しくは、Ｘおよび／またはＹか存在し、Ｒ，が上記定義のとおりである場合、ＸおよびＹは、少なくとも１種のヒト免疫不全ビールスのエンベロープタンパク質の抗原特性の一部を提供あるいは形成しない。

ＸおよびＹが存在しない上記式Ｉによるペプチドは、勿論、例えばＨ工Ｖに対する抗体の産生において有用であろう。このようなペプチドは、キャリアー分子と結合した場合に、特に効果的であろう。しかしながらＸまたはＹが存在する場合、これらはどのような長さであってもよいが、好ましくはアミノ酸残基２０未満、より好ましくは１０未満、例えば３〜６である。式Ｉによる配列は、例えば粒状タンパク賃上の露出ループの一部である抗原配列を有するタンパク質の主要部分がＸおよびＹであるタンパク質を構成しうることが、勿論認識されるであろう。

好ましくは、もしＲ３か存在する場合には、Ｒ，はＬｅｕまたはＭｅζより好ましくはＩ＋ｅｕであり、Ｒ４は、もし存在する場合にはＨｉｓまたはＧｌｕ　。

好ましくはＨ工Ｓである。Ｒ＋　は、好ましくはＧｉｎ　、　ＬｙｓまたはＧｌｕ　、より好ましくはＧｉｎであり、Ｒ１は、好ましくはＩｌｅである。

好ましくは、式（１）の配り旧こおいて、Ｒ，はＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｒａ−Ｒ５であるか、または存在せず、そして存在する場合は、Ｒ４は好ましくはＨｉｓであり、Ｒ１はＬｅｕである。また、Ｒ，はＬｅｕであり、Ｒ，はＧｌｎであることが好ましい。

本発明に係る式Ｉのポリペプチドの好ましい形態は、以下の配列を構成する。

５ａｑ−■−Ｄ−Ｎｏ：　ＩＸ−Ｇｌｎ−ＧＬｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌａｕ−Ｔｈｒ−−Ｖａｌ　−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｙ（工ａ）；および５ｅｑ−■、Ｄ、　Ｎｏ＝　２Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｙ（より）；およびここで、ＸおよびＹは上記定義のとおりであるが、もしＸおよびＹが存在する場合には、これらは比較的短い配列であることが好ましい。好ましくは、又は存在せず、かつＹは２または３残基長さ、例えばＧｌｙ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｃｙｓ−ＡＩａである。上記配列Ｉａおよびよりに関して、Ｘが存在せず、かつ配列工ａではＹかＧｌｙ−Ｃｙｓであり、配列ＩｂではＹがＧｌｙ−ＣｙｓまたはＧＩＹ−Ｃｙｓ−Ａｌａであることか好ましい。このようなＣ−末端延長はキャリアーへのカップリングのための交代（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）部位を提供する。

式■のポリペプチドは、ＨＩＶ１エンベロープタンパク質のあるエピトープ部分と類似している。

本発明に係るポリペプチドの他の好ましい形態は、実質的に式（Ｉ［）のアミノ酸配列を構成する。

Ｘ−Ｒ，−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｒ，− Ｌｙｓ−Ｙ　（エエ）ここで、Ｒ，は、Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｒｓ　５Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ＋　５Ｇｌｕ−Ｒ＋　、　Ｒｓから選択されるか、または存在せず：Ｒ，はＴｈｒまたはＡｌａであり；Ｒ，はＭｅｔまたはＬｅｕであり：かつＸおよびＹは、上記定義のとおりである。

好ましくは、Ｒ，は、もし存在する場合にはＭｅｔであり、Ｒ，ＩＬ、好ましくはＴｈｒである。また、Ｒ２はＧｉｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔであるか、存在しな（〜ことが好ましい。

式■のポリペプチドの好ましい形態は、以下の配列を構成する。

Ｓｅｑ、工、Ｄ、Ｎｏ：　４Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｙ　（工Ｔｏ）好ましくは、Ｘは存在せず、かつＹは２または３残基長さ、伊１えＩｆ　Ｇｌｙ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａである。

式■のポリペプチドは、）ＴＩＶ　２エンベロープタンパク質のあるエピトープ部分と類似している。

本発明に係る好ましいポリペプチド配列は、Ｈ工Ｖエンベロープタンパク質の１つ以上の抗原決定基に対する局所的な類似性に基づいて選択された。

例えば、与えられたポリペプチドが抗原決定基の類似体となるように独創的に設計された場合の抗原決定基は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の１つ以上の他の領域と局所的な類似性を示すことができる。これは、多分、原型となる遺伝子の復製によるか、ポリペプチドが不連続決定基の類似体であるためか、あるいはポリペプチドが多価となるように設計されていたためである。不連続エピトープは、近接して対向する連続（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｌエピトープから構成されると見てもよく、このエピトープはそれ自身の資質として抗原的に重要である。また、多価ポリペプチドは、２以上の（連続または不連続）決定基類自体を、単一のポリペプチド鎖中に含んでいてもよく、このようにして、ＨＩＶエンベロープタンパク質上賃上以上の決定基を認識するある範囲の抗体の産生を同時に誘発する手段を提供する。

本発明のペプチドは、例えば標準的９・フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ− Ｍｏｃ）化学（例えばＡｔｈｅｒｔｏｎ、　Ｅ、　ａｎｄ　５ｈｅｐｐａｒｄ、　Ｒ，Ｃ，（１９８５）　Ｊ。

ＣＣ１１ｅ、　Ｓｏｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、　１６と参照）、または標準的ブチルオキシカーボネート　（Ｔ−ＢｏＣ）化学を用いて合成することができる。構造の正確さおよび純度のレベル（これは通常は８５隻を超える）は、注意深く検討すべきである。この目的のために、例えば、高速液体クロマトグラフィーを含む種々のクロマトグラフィー分析、および分光分析を採用できる。

本明細書において、全ての配列は、以下のような、アミノ酸残基のための工、Ｕ、Ｐ、Ａ、Ｃ規格３文字コード略語：　Ｇｌｙ−グリシン、Ａｌａ−アラニン、Ｖａｌ−バリン、ｒ、ｅｕ−ロイシン、工ｌｅ−イソロイシン、５ｅｒ−セリン、Ｔｈｒ−ｈレオニン、Ａｓｐ−アスパラギン酸、Ｇｌｕ−グルタミン酸、Ａｓｎ−アスパラギン、Ｇｌｎ−グルタミン、Ｌｙｓ−リジン、Ｈｉｓ−ヒスチジン、Ａｒｇ−アルギニン、Ｐｈｅ−フェニルアラニン、Ｔｙｒ−チロシン、Ｔｒｐ −）リブトファン、Ｃｙｓ−システィン、Ｍｅｔ−メチオニンおよびＰｒｏ−プロリン、を用いて述べられている。

治療の用途には、本発明に係るポリペプチドまたはそれに対する抗体は、単独で、あるいは、他の薬剤、例えば３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）　（シトプシン：ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ　）などのようなビールスの遺伝物質の復製を阻害することにより異なったレベルで作用する薬剤、および／またはＨＩＶプロテアーゼインヒビターのようなビールスの成長に基本的な酵素の活動をブロックする薬剤などとともに投与してもよい。

本発明に係るポリペプチドは、広範囲のＨＩＶ　１株および／またはＨＩＶ　２株によって産生されるエンベロープタンパク質と交差反応する抗体を誘導するのに用いることができる。我々の分析により、本発明に係るポリペプチドの構造的／局在的／静電的特性か、これらか幾つかの、あるいは多くの株からのＨ工Ｖエンベロープタンパク質と交差反応する抗体の産生を高い確立で誘発する特性であるため、幾つかの変異ポリペプチドをより大きなポリペプチド内に組み込むことから、更なる利益を得ることができるということが判った。このようなポリペプチドは、以下の一般式（■）：［Ｌ、−Ｆ］、−［Ｌ、、−Ｇ］、−Ｌｃ（Ｉエエ）（式中、ＦおよびＧは、各々独立して、式１〜ｍｂのいずれかで表されるポリペプチドであってよく、Ｌは結合配列であり、ａ、ｂおよびＣは、各々独立して、０または１であり、ｍおよびｎは、各々正の数、例えば１〜１０である）で表すごとかできる。Ｌは、好ましくはポリペプチド鎖の配座的に自由な短い部分、例えば、（Ｓｅｑ、■、Ｄ、　Ｎｏ：　ｓｌ　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　、　ｌ５ｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　６）　Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏまたは（Ｓｅｑ、　１．Ｄ。

Ｎｏ：　７１　Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ等であるが、これらに限定されるものではない。各々の繰り返し部分が、所望により、本発明に係るポリペプチドの異なる変異体を持ち得ることは、明らかである。

式■で定義されるような多価の抗原決定基類似体は、本質的に同一な抗原決定基類似体の変異体が、１つのポリペプチド鎖内で繰り返されるプソイドホモポリバレントと称されるものである。加えて、式１〜Ｉｌｂの何れかで表される１つの抗原決定基類似体の同一変異体の複製を複数含む単純なホモポリバレントポリペプチド免疫原もまた、効果的であると考えられ、本発明の範囲に包含される。

プソイドホモポリバレント抗原ポリペプチドは、ワクチンとして特に価値があると予想され、この場合、類似するが同一ではない基本的特異性を有する、ある範囲の（中和）抗体の産生を誘発するに違いない。これら抗体は、互いにより広範囲なＨＩＶ株からのエンベロープタンパク質と交差反応するであろうし、したがって防御免疫を授けるのにより効果的であろう。

本発明に係るポリペプチドの１つの複製を任意の順序で１個以上含み、かつ、決定基類似体のポリペプチド類自体を１個以上含むヘテロポリバレントポリペプチドを構成することにも利点があるであろう。本発明において提供されるこのようなポリペプチドは、以下の一般式（■）：Ｌ、−［Ｇ−Ｌ］、−Ｆ−［Ｌ−Ｇ］Ｉ、−Ｌや　（工Ｖ）（式中、Ｆは、式１〜ｍｂのいずれかで表されるポリペプチドであり、Ｇは、弐Ｉ〜ｍｂのいずれかで表されるポリペプチドまたは他の配列であり、ｍおよびｎは、各々正の数、例えば１〜１ｏであり、ｄおよびｅは、各々独立して、０または１である）で表すことができる。“Ｌ”は、好ましくはポリペプチド鎖の配座的に自由な短い部分、例えば、（Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：５）　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　、（Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　６）　Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏまたは（Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　７）　Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−５ｅｒ− Ｇｌｙ−Ａｌａ等であるが、これらに限定されるものではない。

抗原的に重要なサブフラグメントおよび／または抗原的に重要な変異体が、親ベブヂドの全般的形態および機能を保持していれば、これらのものは何れも本発明の範囲内に包含されると理解されるべきである。特に、特定残基の何れかが、匹敵する配座的特性および／または物理的特性を有する残基により置換されたもの、例えば稀少アミノ酸（例えばＤ−立体異性体）類似体または合成アミノ酸類似体により置換されたものが、本発明に包含される。例えば、１つの残基が、以下に示す同一セット内で他の残基により置換されたものは、本発明の範囲内である：セットｌ　−Ａｌａ　５Ｖａｌ、Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ　、　Ｐｈｅ　、　Ｔｙｒ　５ＴｒｐおよびＭｅｔ　ｒセット’ｌ　−９ｅ）ｒ　５Ｔｈｒ　、　ＡｓｎおよびＧｉｎ　；セット３−ＡｓｐおよびＧｌｕ；セット４−　Ｌｙｓ　５ＨｉｓおよびＡｒｇ　；セット５−ＡｓｎおよびＡＳｐｉＳルミセットｌｕおよびＧｉｎ　；セット７−Ｇｌｙ　５Ａｌａ　、　Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒ、全てのアミノ酸タイプのＤ−立体異性体、例えばＤ−Ｐｈｅ　、　Ｄ−ＴｙｒおよびＤ −Ｔｒｐは置換されていてもよい。

本発明の好ましい態様において、ＸおよびＹは、もし存在する場合は、各々独立して、Ｔ細胞エピトープとして作用する能力を有するタンパク質配列のセグメントを１個または２個以上含んでいてもよい。例えば、一般式１−２−３−４　［式中、１はＧｌｙまたは荷電アミノ酸（例えばＬＹＩＩＩ。

Ｈｉｓ　ＳＡｒｇ　、ＡＳＰまたはＧｌｕ）であり、２は疎水性アミノ酸（例えば、１１ｅ　、　Ｌｅｕ　、　Ｖａｌ　、Ｍｅｔ　、　Ｔｙｒ　、　ｐｈｅ　５ＴｒｐまたはＡｌａ）であり、３は疎水性アミノ酸（上述したとおり）または無荷電極性アミノ酸（例えば、Ａｓｎ　、　Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ｐｒｏ　、ＧｉｎまたはＧｌｙ　）であり、４は極性アミノ酸（例えばＬｙｓ　ＳＡｒｇ　、Ｈｉｓ　５Ｇｌｕ　、　Ａｓｐ　、　Ａｓｎ　５Ｇｉｎ　５Ｓｅｒ　１ＴｈｒまたはＰｒｏ）であるコのアミノ酸配列のセグメントは、少なくとも幾つかの場合に、Ｔ細胞エピトープとして作用するようである（Ｒｏｔｈｂａｒｄ、　Ｊ、Ｂ、　＆Ｔａｙｌｏｒ、　Ｗ、Ｒ，（１９８８）　Ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｉｎ　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｏ　Ｔ−ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　７（１）：　９３−１００参照）。同様に、セグメントは、配列１°−２°−３°　−４°−５゛（式中、１°は前述した１と同様であり、２゛　は２と、３゛および４′は３と、かつ５′は４と各々同様である）であり得る（同書参照）。両方の形態は本発明の範囲内に包含され、そして１個または２個以上のＴ−細胞エピトープ（好ましくは５個未満）が本発明に係る式Ｉ〜■ｂの何れのポリペプチドに組み込まれていてもよい。したがって、各々のエピトープは、前記で定義したタイプのものでも他の構造のものであってもよく、そして任意の長さまたは組成（好ましくは５個未満のアミノ酸残基の長さ）を有するスペーサセグメントによって隔てられてもよく、かつ例えばＧｌｙ、　Ａｌａ　５Ｐｒｏ　、　Ａｓｎ　、　ＴｈｒおよびＳｅｔから選ばれた残基、または非−α−アミノ酸のような多官能性リンカ−を含んでいてもよい。Ｃ− 末端またはＮ−末端のリンカ−は完全なタンパク質を表すことが可能であり、従って、担体タンパク質への結合の必要性がないようにする。

本発明の範囲にはまた、式Ｉで表され、式中のＸまたはＹが”レトロ−逆位（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）”アミノ酸、即ち、アミノ酸に対応する官能性基を有する２官能性アミンであるか、あるいはこれを含むポリペプチドの誘導体も包含される。例えば、本発明に従い、かつレトロ−逆位アミノ酸を含有する類似体は、下記式：％式％（式中、Ｒは任意の官能性基、例えばグリシン側鎖であり、ＡｌおよびＡ２は各々好ましくは、本明細書で定義した類似体（必ずしも同一でなくてもよい）の１つであってそのＮ−末端またはＣ−末端によって結合したもののコピーである）の構造を有しつる。先に論じたように、所望により、Ｔ−細胞エピトープか含まれていてもよい。

ペプチドのレトロ−逆位修飾は、１個または数個のペプチド結合を逆転して含み、元の分子よりも酵素分解に対する耐性が優れた類似体を生成させ、かつ中程度ないし大きな免疫原性物質のためのエピトープを高濃度で含有している分岐した免疫原性物質を生成させるのに便利な経路を提供する。生物学的に活性な短鎖ペプチドのしドロー逆位類似体の大規模な溶液合成において、これらの化合物を使用することは、大いに可能である。

類似体である挿入用レトロ−逆位アミノ酸誘導体は、組み換えＤＮＡシステムを用いて直接に作成することはできないことに注目すべきである。

しかしながら、基礎的な類似体を作成することができ、次いでこれらのものを精製し、そして標率的なペプチド／有機化学を用いてレトロ−逆位アミノ酸に化学的に結合することかできる。ポリアミド型樹脂上でレトロ−逆位ペプチドを固相合成するための実用的かつ好都合な新規な手順が、最近記載された［Ｇａｚｅｒｒｏ、　Ｈ，、Ｐｉｎｏｒｉ、　Ｍ、　＆　Ｖｅｒｄｉｎｉ、　Ａ、Ｓ、　（１９９０）、　Ａｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｉｎ　”工ｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　５ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ″　、Ｅｄ、Ｒｏｇｅｒ　ＥＰｔＯｎｌ　５ＰＣＣ（ＵＫ）　Ｌｔｄ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ｔｌＫ］　。

ポリペプチドは、任意に、ポリペプチドそれら自体中の化学基を介して、またはＣ−末端またはＮ−末端の何れかで付加された追加のアミノ酸を介して、担体分子に結合されていてもよく、この担体分子は、ポリペプチドをその免疫学的機能にとって最適にするために、１個または２個以上の追加のアミノ酸によってポリペプチドから隔てられていてもよく、またはこれら追加のアミノ酸によって取り囲まれていてもよい。多くの結合が好適であり、例えばＴｙｒＳＣｙｓおよびＬｙｓ残基の側鎖の使用が含まれる。好適な担体としては、例えばツベルクリン（ＰＰＤ）の精製タンパク質誘導体、破傷風トキソイド、コレラ毒素およびそのＢサブユニット、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、大豆トリプシン阻害物質、ムラミルジペプチドおよびその類似体、およびブラウンのりボタンバク質等が挙げられるが、他の好適な担体は、当業者に容易に明らかであろう。例えば、復仇原性ペプチド、例えばヘプタリジル等の反応性アミン末端を有するポリリジルコアを含むものを用いることができる。本発明に係るポリペプチド抗原は、アミノ末端と反応させるかまたはアミノ末端上で合成することができ、そして異なるペプチド抗原を同じコアまたは担体と反応させることができる。

本発明に係るポリペプチド抗原の担体としてｒ’ＰＤを用いる場合には、ポリペプチド−ＰＰＤ結合体のレシピエンドが、例えば以前のＢＣＧワクチン接種のために、既にツベルクリン感受性であるならば、より高い力価の抗体を得ることかできる。ヒトのワクチンの場合には、英国および他の多くの国において、市民は、ＢＣＧワクチン接種を決まりきって受（プるので、大いにｌ’ＰＤ感受性である。従って、ＰＰＤは、これらの国において使用するのに好ましい担体である。

ポリペプチドを担体に結合させる様式は、結合すべき物質の性質に依存するであろう。例えば、担体中のりジン残基を、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシーサクシンイミドで処理することにより、ポリペプチド中のＣ−末端または他のシスティン残基に結合させることができる　（Ｋｉｔａｇａｗａ、　Ｔ。

＆　Ａｃｋａｗａ、　Ｔ、　（１９７６１Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７９．２３３）。他の結合反応および試薬は、文献に記載されている。

ポリペプチドは、単独でまたは担体分子に結合して、従来のアジュバント（例えば水酸化アルミニウムまたは、人に投与しない場合には、フロイントの完全または不完全アジュバント）および／または他の免疫増強剤と共にまたはこれら無しで、任意の経路（例えば非経口、鼻内、経口、直腸内、膣内）により投与することができる。本発明は、例えばリボゾーム（Ａ１１ｉ、ｓｏｎ、　Ａ、Ｃ，＆　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｇ、　（１９７４）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２５２゜２５２）を含むか、または乳酸とグリコール酸との共重合体から製造された生体分解可能なマイクロカプセル（Ｇｒｅｓｓｅｒ、　Ｊ、　Ｄ、　ａｎｄ　５ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ、　Ｅ。

（１９８４１ｉｎ″’Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ″ｐｐ　１２７−１３８．　Ｅｄ。

Ｄ、　Ｌ−Ｗｉｓｅｌを含む皮下インブラントまたはデボ−剤のような徐放性形態の本発明に係るポリペプチドの製剤を包含する。

本発明のポリペプチドは、任意の従来法、前記のようなマニュアルまたは自動化ペプチド合成技術を用いて直接に、あるいはＲＮＡ合成もしくはＤＮＡ合成と、分子生物学および遺伝子工学の従来技術とにより間接的に、合成しうるちのと理解すべきである。このような技術を用いて、他のポリペプチド配列中に挿入された１個または２個以上のポリペプチドを含有するハイブリッドタンパク質を製造することができる。

従って、本発明のもう一つの態様は、本発明に係る少なくとも１つの合成ポリペプチドをコート化するＤＮＡ分子を提供し、この分子は、微生物細胞、哺乳動物細胞、昆虫、植物細胞、菌類細胞または他の細胞内で復製可能な好適な発現ベクター中に挿入されていることが好ましい。このＤＮＡは、より長い生成物のＤＮＡ配列の一部であってもよく、例えばポリペプチドは、これらか遺伝子工学によって挿入されている他のタンパク質の部分として発現されてもよい。このような技術についての一つの実用的な手引は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、にょる”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ１″（第２版、１９８９）である。

本発明に係るポリペプチドは、単独でまたは適切な担体分子に結合して、次のものとして使用することができる（ａ）　例えば１種以上のＨＩＶ株による感染を防止するために用いられるペプチドワクチン。

（ｂ）　例えば、ＨＩＶ陽性患者からの血清等のアッセイ用リガンド。

（ｃ）　例えばポリペプチドに対して生成した抗体の結合レベルを調べる際の質コントロール剤として。

（ｄ）　適正な動物の免疫によるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための抗原性物質として、これらの抗体は、（ｉ）　Ｈ工Ｖビールスの科学的研究のため、（１１）例えば組織化学的試薬の一部としての診断剤として、（ｉｊ、ｉ、）　Ｈ工Ｖ患者を受動免疫するためのＡＩＤＳの処置剤として、単独で、または、例えばＡＺＴおよび／またはＨ工Ｖプロテアーゼ阻害剤などの他の剤と組み合わせて、（１ｖ）他の物質（例えばＡＺＴまたはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤）を、表面上でＨ工Ｖエンベロープタンパク質を発現するＨｉＶ感染細胞に集中させる手段として（このような他の物質は、共有結合しているか、あるいは例えばこのような物質を含有し、かつ任意の抗原性ポリペプチドに対して生成した抗体を組み込んでいるリボゾーム内でのように会合している）。本発明は、本ポリペプチドに対して生成した抗体の遺伝子工学的に処理した形態またはサブ成分、特にＶＨ領領域並びに文献に記載された技術を用いて、他の動物内で本ポリペプチドに対して最初に生成した抗体のヒト化形態の前記のような遺伝子工学的処理形態またはサブ成分を提供し、および（ｅ）　Ｈ工Ｖビールスのヒト細胞または動物細胞への結合を置換するか、またはこのビールスのインビボでの３次元的構築を妨害することによる、ＨＩＶ感染処置１並びにＨＩＶビールスのインビトロでの科学的研究の補助手段を提供する。

ＨＩＶまたはＨＩＶに対して生成した抗体の検出および診断に関し、当業者には、この分野で公知の種々の免疫アッセイ技術、特にサンドイッチアッセイ、競合的アッセイ、非競合的アッセイ、直接および間接の標識の使用等が判明しているであろう。

本発明の更なる態様は、本発明に係る少なくとも１つの合成ポリペプチドを含む、ＨＩＶまたはＨＩＶに対して生成した抗体を検出するためのキットを提供する。

ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、このような抗体のヒト化形態（例えばＴｈｏｍｐｓｏｎ　Ｋ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８６）工ｒｎｍｕｎｏｌｏｇｙ　５８．１５７−１６０参照）、単一ドメイン抗体（例えばＷａｒｄ、　Ｅ、　Ｓ、、　Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ、。

Ｇｒｊ−ｆｆｊ、ｔｈｓ　Ｔ　八、Ｄｌ、Ｊｏｎｅｓ、Ｐ、ａｎｄ　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、（１９Ｂ９）Ｎａｔｕｒｅ　３４１゜５４４−５４６参照）、および血液−脳障壁を越えるかもしれず、本発明に係る合成ポリペプチドと特異的に結合する抗体の製造は、従来の手段により行なうことができ、このような抗体は、本発明の一部を形成するものと考えられる。本発明に係る抗体は、特に、哺乳動物の組織または体液のサンプルを、本明細書に記載した効果的量の抗体と共にインキュベートし、そして前記のサンプルと前記の抗体との間で交叉反応か起きるかどうかを測定し、そ（７て所望により、この交叉反応が起きる程度および／または速度を測定することからなる、哺乳動物の１（ＴＶ感染診断方法に使用される。前記の抗体の少なくとも１つを含む診断キットもまた、本発明の一部を形成する。

本発明のもう一つの態様は、哺乳動物のＨＩＶ感染の治療または予防および／または哺乳動物の免疫系の刺激および／またはＨＴ、Ｖビールスの細胞レセプターのブロッキングに使用するための合成ポリペプチド、並びにこのような用途に適する医薬を製造するための合成ポリペプチドを提供する。

また、活性成分として、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド−担体結合体の少なくとも１つを、１種または２種以上の製剤上許容されるアジ、バント担体および／または賦形剤と一緒に含有する製剤組成物も包含される。これらの組成物は、経口投与、直腸内投与、鼻内投与または特に非経口投与（中枢神経系内投与を含む）のために処方することができる。

本発明は更に、前記で定義した効果的量のポリペプチドを、単独でまたはＡＩＤＳを処置するための他の薬剤、例えばＡＺＴおよび／またはＨ工Ｖプロテアーゼ阻害剤等と組み合わせて投与することからなる、哺乳動物のＨ工Ｖ感染を治療または予防する方法および／または哺乳動物の免疫系を刺激する方法および／またはＨ工Ｖビールスの細胞レセプターをブロッキングする方法を提供する。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、何ら限定するものではない。

実施例１ペプチド比の配列（Ｆ、ｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ、：　８）のＣ−末端延長形態Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−ＧＥ、ｙ−工１ｅ−Ｌｙｓ− Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａを、標準的な固相Ｆ−ｍｏｃ方法を用いて合成した（Ａｔｈｅｒｔｏｎ、　Ｅ、　ａｎｄＳｈｅｐｐａｒｄ、　Ｒ，Ｃ−、１９８５；　Ｊ、Ｃｈ、ｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏｍｍ、　１６５−１６６　）　、　Ｃ−末端Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａを導入し、担体への選択的結合部位を形成した。このペプチドをトリフルオロ酢酸の存在下で樹脂から切り離し、次いでゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。得られたペプチドの純度は８５％以上であった。Ｃ−末端アラニンは、結合を補助するために含まれていた。このペプチドをリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　；　５　ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、最終濃度０．１％（ｗ／ｖ）となるグルタルアルデヒドの添加に先立って、同体積のオブアルブミン（５ｍｇ／ｍｌ）と混合した。この結合体混合物を、７０インドアジユバントを用いた乳化に先立って、３０分間放置した。各々のヒツジ（各グループで５個体）を、フロイント完全アジュバン１−（ＦＣＡ）中のペプチド２５０μ９等価量を用いて免疫した。２週間で１回、および５〜６週間で再度、各々の個体に、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中のペプチド同量を用いて追加免疫注射を行なった。最終追加免疫注射の後、７〜１０日で、血清サンプルを採取し、ＨＩＶ　ｇｐ１６０エンヘローブタンパク質への結合をアッセイした。

この研究には２種のＨＩＶ−１株が用いられた。これらの内の１種は、完全に特性決定され、よく認識され、かつ広く用いられているＧＢ８と命名されたＨＩＶ −１−株であり、Ｄｒ　Ｇ、　Ｆａｒｒａｒｒ、　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（ＣＡＭＲ１＋　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　ＵＫがら入手可能であり、ＡＩＤＳ　ｉ：　１４７−１５０　（１９８７＋で議論されている。他の株は、シンシチウム阻害アッセイで用いられるＨＩＶ−１のＲ，Ｆ株であった。

ＨＩＶ−１のＵ株は、５ｃｉｅｎｃｅ２２４＋　４９７−５００　（１９８４）から公知である。単一個体からの２以上のＨＩＶ（分離集団から複数の配列か得られ、試験材料かこれらビールス株の成長および復製を阻害する能力を比較してアッセイした。分離集団は、Ｄｒ。

ＦａｒｒａｒｒからＧＢ８Ａ、　ＧＢ８ＢおよびＧＢ８Ｄの名称で入手した。セルラインＨ９、Ｃ８１６６およびＪＭＩま、ＨＴＶ−１ｒ研究室法」（７）ＧＢ８またはＲＦに感染した場合に、復製を支え、シンンチウム形成を示すことが知られでいる。

（ａ）生体ＨＩＶ−１抗ペプチド抗血清の阻害アッセイ抗ペプチド抗血清による生体ＨＩＶ−１の阻害を、３つの標準的アッセイ方法を用いてアッセイした。

（１）中和アッセイこのアッセイでは、抗ペプチド抗血清か、細胞を含まない生体ビールスによる感受性細胞の結合および感染を阻害する能力が測定される。この測定値は、ンンンヂーウムをカウントすることで決定される。

試験抗血清を、５６°Ｃにて３０分間加熱することにより不活性化し、ＲＰＭＸ１６４０中で適宜希釈し、力価既知で同体積のＨ工Ｖ含有液体とともに、室温（ＲＴ）にて３０分間インキュベートした。濃度既知の、ＨＩＶ−１Ｃ８８株の感染に対して高感受性であるＣＤＡ＋セルライン（ＪＭ）を、ＨＩＶ−１抗血清混合物にさらし、３７°Ｃにて２時間放置し、洗浄し、細胞培養培地に再懸濁し、インキュベートし、特定時間でのシンシチウムカウントによってアッセイした。

抗血清の中和活性は、コントロールと比較したンンシチウムカウントの減少によって評価した。

各テストバッチに含まれるコントロールは、試験抗血清と交換した既知の陰性および陽性血清であり、その他の手順は同一であった。

（］１）阻害アッセイこのアッセイでは、細胞感染に引続き起こる抗ペプチド抗血清のＨｚＶ−１複製の阻害能力が決定され、細胞外および細胞内Ｈ工Ｖ−１ｐ２４抗原のレベルが測定される。加えて、シンシチウム検出および計数か行なわれる。

高感受性ＣＤ４→十ルラインを、既知の感染多重度でＨＩＶ−１にさらし、３７ °Ｃで２時間インキュベートした。次いで、細胞をＲＰＭＩ　１６４０で３回洗浄し、同量の適宜希釈された熱−不活性化試験抗血清を加えた。感染細胞血清サスペンションを３７°Ｃで１時間インキュベートし、顕微鏡下で検査し、次いでｐ２４抗原を測定するために、特定の時点（３日目および５日目）で培養液からサンプルを抜き出した。細胞内ｐ２４抗原レベルを同様の時点で決定した後、適当な細胞溶解緩衝液を用いて細胞を溶解した。ＥＬＩＳＡによりＨＩＶ−１ｐ２４抗原についてテストすべきサンプルは、アッセイを行なうまで貯蔵した。シンンチウム数は、５日目に測定した。

各テストバッチのコントロールは、試験抗血清と交換した既知の陰性および陽性血清を含み、その他の手順は同一であった。

（ｉｉｉ）シンシチウムアッセイこのアッセイでは、抗−ペプチド抗血清が、感染細胞から非感染細胞への生体ＨＩＶ−１の拡散を防止する能力、およびビールス糖タンパク質（ｇｐｉ６０）とＣＤ４分子との間の反応性によって媒介される細胞間の融合を防止する能力が決定される。測定は、シンシチウム検出および計数によって行われる。

活性ビールス復製を維持するＨＩＶ−１産生（ＣＤ４＋１セルライン（慢性的にＨＩＶ−Ｉ　ＲＦ株に感染したＨ９細胞）を、３回洗浄し、特定希釈度で用いた試験抗血清と混合した。３７°Ｃで３０分間のインキュベーションの後、これら細胞を、ＨＩＶ（感染およびシンンチウム誘導に高度に感受性であるインディケータ−ＣＤ４＋セルライン（Ｃ８１６６）と、特定割合で混合した。これら細胞を、シンシチウム形成に関して、毎日観察した。

結果中和アッセイペプチドよりに対して得た多くの血清が、インビトロで、ＨＩＶ−１Ｇａ４株に対する中和活性を示した。表１は、全てのＧＢ８逐次単離物に対して、血清１７の活性かより高いことを示している。このアッセイは、血清が細胞を含まないビールスを中和することを実証している。

表１．Ｈ工Ｖ−１Ｇａ４株に対するインビトロでの中和活性を示す抗ペプチドヒツジ血清＊＝試験のシンリチウム平均数／コントロールのシンシチウム平均数（減少％）（−）−減少≦５０％復製阻害アッセイ血清１７および３７は、表２に示されるように、複製阻害アッセイにおいて５日目に、シンンチウム数の減少に関して同等の活性を示す。さらに、ｐ２４抗原の測定によって示されるように、復製が阻害される。このアッセイで用いられた血清は希釈されていないことに注目すべきである。

シンシチウム阻害アッセイ表３は、ンンシチウム阻害アッセイにおける血清１７に関するデータを示す。１ｎｌｏｏの希釈により、血清の阻害活性は５０％よりやや少なくなるまで減少した。この試験は、希釈しても、血清がどれだけ細胞融合を防止できるか、従って、生体Ｈ工Ｖの拡散を防止できるかを示唆する。

表３　：　ＨＩＶ−１（株Ｈ９−ＲＦ）に対する抗−ペプチドのインビトロでのシンシチウム阻害活性＊＝試験のシンリチウム平均数／コントロールのシンシチウム平均数（減少％）大員烈ユ式エエａおよｄ　Ｉｌｂのペプ−ｔｙとの、ＨＩＶ−２陽性ヒト血清のＥＬ工ＳＡ反応性下記配列（Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　９　）を有する式［ａのＣ− 末端延長ペプチド、Ｇｌ　ｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｑ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　（２Ａ）および下記配列（Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ；　１０）を有する式工よりのＣ− 末端延長ペプチドＬａｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ− Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　（２Ｂ）を、実施例１に説明されるように合成して精製した。

次いで、これらペプチドをＨＩＶ−２陽性ヒト血清とのＥＬ工ＳＡに用いた。ペプチド“ＩＯＡ”　（ＷＯ９１１００９０３として公開された本出願人の共に継続中の出願における実施例１に開示されている）は、Ｈ工Ｖエンベロープタンパク質に関連する免疫的に優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）なペプチドであること、および実質的に全てのＨＩＶ（ｉ染個体を認識することが知られている。このペプチドは、交差反応を調査し、かつプロトコールの適性を確認するために用いた。

ＥＬＩＳＡプロトコール１２０μ９７ｍ１のペプチドを含む１００μｍのコーティング緩衝液を、ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｔｅｃｈ）の各ウェルに加え、このプレートを４℃にて１昼夜インギユベートした。

２、プレートをトリス緩衝生理食塩水で１回洗浄し、完全に乾燥させた。

３２００μｍのブロッキング緩衝液を各ウェルに加え、３７°Ｃにて１時間インキュベートした。

４　試験すべき血清を、希釈緩衝液を用いて、ｌ／１００または１／２００に希釈した。０．論１を各ウェルに加え、このプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。これは、各サンプルに対して３回行った。

５、プレートを洗浄緩衝液で２秒間３回洗浄した。

６．１ｏｏμｍのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトエｑＧ（希釈緩衝液中で１７２０００）を各ウェルに加え、このプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。

７、プレートを（５）に示すように洗浄した。

８５０μｌのアルカリホスファターゼ緩衝液、次いで５０μｍの基質（水中で１０ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、このプレートを３７℃にて１５分間インキ試験されたヒト血清サンプルは、以下の通りである：Ｈ工Ｖ−１血清との交差反応を示さないことが前もって示されている、２０の既知ＨＩＶ−２陽性血清。２０人の患者の全てが、象牙海岸から来た。

ＨＩＶ−１血清との交差反応を示さないことか前もって示されている、５つの既知ＨＩＶ−２陽性血清。５人の患者の全てが、象牙海岸ではないアフリカから来た。

ＨＩＶ−２血清との交差反応を示さないことが前もって示されている、７つの公知！（工Ｖ−１陽性血清。

年齢及び性別が対応する被験者からの１０の既知ＨＩＶ陰性血清サンプル。

０．１ｕｌの希釈緩衝液の添加により全体積を維持した、血清を含まないコントロール。

以下の表４に示す結果から明らかなように：１）　ＨＩＶ−１ペプチドとＨＩＶ −２ペプチドとの交差反応性は観察されず、即ちＨＩＶ−２血清はＨＩＶ−１ペプチドを認識せず、かっＨＩＶ（血清はＨＩＶ−２ペプチドを認識し、なかった；２）　ＨＩＶ陰性サンプルにおいて、ペプチド特異的活性は見られなかった：３）象牙海岸から来た患者の血清の反応性と、アフリカ大陸の他の場所からきた患者の血清の反応性との間に違いかある：および４）　ＨＩＶ−１＋血清す′／プルは、ＨＩＶ−４＋ＩＯＡ＋ペプチドに対する検出可能な抗体を有していた。

表４：ペプチド２Ａ、　２ＢおよびＩＯＡとのＩ（ｍＶ陽性血清の反応性これらの結果は、多くの患者からのＨＩＶ−２→血清か、本発明の式１ＩａおよびＩＩｂによるＨＩＶ−２ペプチドと特異的に反応する抗体を含んでいることを示している。

担体タンパク質に結合された弐工ａによるペプチドを用いたマウスの免疫感作下記配列（Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：１１）を有するＣ−末端延長Ｇ１ｎ−Ｇ１ｎ−Ｈ１ｓ−レ＝ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＣｙＳ　（ＬＡ）を、実施例１で説明されたように合成して精製した。

結合カップリング剤としてグルタルアルデヒドまたはＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル）を用いて、ペプチドをオボアルブミンに結合した。

グルタルアルデヒド、ペプチドをＰＢＳ　（５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した後、オボアルブミンを加えて、１モルのペプチドに対し、担体の５０アミノ酸のモル比を得た。全体積を、ＰＢＳによって２ｍｌに調節した。グルタルアルデヒドの０．２％ＰＢＳ溶液２ｍｌを、攪拌混合物に徐々に加え、溶液を１時間室温で攪拌しながら放置した。混合物を、大体積のＰＢＳに対して一昼夜透析し、３週以内の間−２０℃で貯蔵した。

ＭＢＳ　、ＭＢＳの溶液（ＰＢＳ中、２５　ｍｇ、／ｍｌ）　０．１　ｍｌを、オボアルブミンの攪拌溶液（ＰＢＳ中、１．０　ｍｇ／ｍｌ）に加え、反応混合物を３０分間室温で攪拌した。

この活性化オボアルブミンを、ＰＢＳで平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムでのゲル濾過によって遊離ＭＢＳから分離した。ペプチドをＰＢＳに溶解し、活性化オボアルブミンに加えることにより、担体の５０アミノ酸毎に最終濃度１モルのペプチドという結果を得た。ｐＨを７〜７．５に調節し、反応物を室温にて３時間攪拌した。混合物を、大体積のＰＢＳに対して一昼夜透析し、３週以内の間−２０℃で貯蔵した。

ペプチド／担体タンパク質比を決定するためには、Ｈａｂｅｅｂにより説明された方法を用いることができる（Ｈａｂｅｅｂ、　Ａ、Ｆ、Ｓ、Ａ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１４゜３２８、１９６６）。この場合、遊離アミノ酸は、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９，０）を用いたトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法によって決定される。溶液の吸光度を３３５　ｎｍで測定し、修飾遊離アミノ酸基の割合を計算する。

Ｅｌｌｍａｎにより説明された遊離チオールアッセイも、結合効率を評価するために用いることができる（Ａｎｄａｒｓｏｎ、　Ｗ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｗｅｔｌａｕｆｅｒ、　Ｄ、Ｂ、、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６７、４９３　＋１９７５１）。

免疫感作Ｃ５７Ｂｌａｃｋマウスから、−次接種の２〜３日前に予め採血し、血清を分離し、−２０℃で貯蔵した。これは、陰性コントロールマウス血清である。

各マウスを、ＦＣＡ中の４０μ９のペプチドで免疫感作し、次いで２〜３週間後にＦＩＡ中の２０μ９のペプチドで免疫感作した。各々の場合、接種体積は０．１．ｍｌであり、全ての注射は、皮下に行った。動物から、追加免疫注射の直前、２週間後および４週間後に採血した。

匹Ｈ醍ＥＬＩＳＡプロトコールは、血清を希釈緩衝液中１１５０および１／１００に希釈し、用いた抗体がアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＸｑＧであった以外は、実施例２に説明されたのと同様であった。

結果１、三次採血後にコントロールと比較した場合、２／２４（８％）の動物がグルタルアルデヒドを用いて結合された式１ａによるペプチドに応答した。したがって、ペプチドを非特異的にキャリアに結合した場合、このペプチドに対する抗体を産生させることができる。

２、１４／２４　（５８％）のマウスが、ＭＢＳを用いた特異的架橋によりオボアルブミンに結合した式１ａのペプチドによるたった１回の免疫感作の後に、ペプチドに対する高レベルの抗体を有した。これは強力かつ特異的な応答である。

これらの結果は、式Ｉａによるペプチドが、ＭＢＳを用いてオボアルブミンに結合した場合に、単一の免疫感作後、非常に高レベルの抗体を誘導する強力な抗原であること、かつペプチドが非特異的にオボアルブミンに結合された場合であっても、抗体が産生され得るということを示している。

配列のリスト１１個の配列（１１Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ；　１の情報（１１）　分子の種類；　ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏｚ　ＩＧｉｎ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ工１ｅ　ＬＹＳｌ　５　１０（２）　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　ＮＯ：　２の情報（工１）　分子の種類：　ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：　ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　２Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌｙｓｌ５＋３）　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ＋　３の情報（３−１）　分子の種類：　ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、　工、Ｄ、　Ｎｏ：　３Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓｌ　５　１０（４）　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　４の情報（１１）　分子の種類＝　ペプチド（ｘｌ）　配列の記載＋　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　４Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓｌ　５（５）　ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　５の情報（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）長さ：　５個のアミノ酸ＣＢ１種類：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：　線状（エエ）　分子の種類：　ペプチド（ｘｉ）　配列の記載＋　ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　５ＧＩＹ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　ＧＩＹ（６）　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　６の情報（１１）　分子の種類：　ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　６Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

（７１Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　７の情報（１１）　分子の種類：　ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　７Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ（８）　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　８の情報（１１）　分子の種類：　ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ＋　８Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａ］、ａ１５１゜（９）　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ：　９の情報（１１）　分子の種類；　ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ；　９Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＧＩＹ　ＣＹ５１　５　１０　１．５（１０）　Ｓｅｑ、　１．Ｄ−Ｎｏ：　ｔｏの情報（ユ１）　分子の種類コ　ペプチド（ｘｉ）　配列の記載；　Ｓｅｑ、工、Ｄ、　Ｎｏ＋　１０Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＴＡｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｌ〕ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ１５１゜（１１）　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　１１の情報（１１）　分子の種類：　ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：　Ｓｅｑ、　１．Ｄ、　Ｎｏ：　１１国際調査報告、、、、ｌ＋−、Ａ＋、、、、、、へ、ＰＣＴ／ＧＢ９３１００８０８、、、Ｎ −、、、−Ｎ・ＰＣＴ／ＧＢ９３１００８０８フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１／１４Ｃ１２Ｎ　１５１０９Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５− ２Ｊ３３１５６９　Ｈ７０５５−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ。

ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮＦＩ（７２）発明者　ロブソン、バリー英国　エステ−６５ニーニー　チェシャー　マーブル　マーブル　ブリッジ　タウン　ストリート　２２ニー　ジ　オールドベーカリ− （７２）発明者　アストン、ロジャー英国　エスエヌ６９エイチダブリユーウイルトシエアー　ニア−マーメスベリー　イーストコート　イーストコート、コ

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１つのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）株のエンベロープタンパク質における少なくとも１つの抗原特性を有する合成ポリペプチドであって、実質的に、式（Ｉ）【配列があります】（から選択されるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｒｇから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ３は、Ｉｌｅ、ＴＨｒまたはＡｌａから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ４は、ＨｉｓまたはＧｌｕであり；Ｒ５は、ＬｅｕまたはＭｅｔであり；ＸおよびＹは、各々独立に存在しないか、あるいは独立に１個以上のアミノ酸残基である合成ポリペプチド。
２．Ｒ２が、Ｇｌｎ、ＬＹＳおよびＧｌｕから選択され、Ｒ３が、Ｉｌｅである請求項１記載の合成ポリペプチド。
３．配列（Ｓｅｇ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ：１）【配列があります】（Ｉａ）または配列（Ｓｅｇ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ：２）【配列があります】（Ｉｂ）（式中、ＸおよびＹは、請求項１で定義されたとおりである）からなる請求項１または２に記載の合成ポリペプチド。
４．実質的に、式（ＩＩ）：【配列があります】（ＩＩ）（式中、Ｒ１はＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ４、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｒ３、Ｇｌｕ −Ｒ５、Ｒ５から選択されるか、または存在せず；Ｒ２は、ＴｈｒまたはＡｌａであり；Ｒ５は、ＭｅｔまたはＬｅｕであり；ＸおよびＹは、請求項１で定義したとおりてちる）のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の合成ポリペプチド。
５．配列（Ｓｅｇ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ：３）【配列があります】（ＩＩａ）；または配列（Ｓｅｇ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ：４）【配列があります】（ＩＩｂ）からなる請求項４記載の合成ポリペプチド。
６．Ｘが存在せず、ＹがＧｌｙ−ＣＹｓまたはＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａである上記請求項のいずれかに記載の合成ポリペプチド。
７．一般式（ＩＩＩ）：【配列があります】（ＩＩＩ）（式中、ＦおよびＧは、各々独立して、式Ｉ〜ＩＩｂのいずれかで表されるポリペプチドであってよく、Ｌは結合配列であり、ａ、ｂおよびｃは、各々独立して、０または１であり、ｍおよびｎは各々正の数、例えば１〜１０である）で表される合成ポリペプチド。
８．一般式（ＩＶ）：第３１頁請求項８、第２行目の式（ＩＶ）（式中、Ｆは、式Ｉ〜ＩＩＢのいずれかで表されるポリペプチドであり、Ｇは式Ｉ〜ＩＩｂのいずれかで表される他のポリペプチドであり、ｍおよびｎは各々正の数、例えば１〜１０であり、ｄおよびｅは、各々独立して、０または１である）で表される合成ポリペプチド。
９．請求項１〜８に記載のポリペプチド配列のいずれかの抗原的に重要なサブフラグメントおよび／または抗原的に重要な変異体を含む合成ポリペプチド。
１０．更に、Ｔ−細胞エピトープを含む、請求項１〜５または請求項７〜９のいずれかに記載の合成ポリペプチド。
１１．レトロ−逆位（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）アミノ酸を含有する、請求項１〜５または請求項７〜１０のいずれかに記載の合成ポリペプチド。
１２．担体に結合された、前記請求項のいずれかに記載の合成ポリペプチド。
１３．請求項１〜１０のいずれかに記載の合成ポリペプチドの少なくとも１つをコードするＤＮＡ分子。
１４．請求項１〜１２のいずれかに記載の合成ポリペプチドの少なくとも１つを含む、ＨＩＶ感染に対する予防を促進するのに有効なワクチン。
１５．請求項１〜１２のいずれかに記載の合成ポリペプチドの少なくとも１つを含む、ＨＩＶまたはＨＩＶに対する抗体を検出するためのキット。
１６．活性成分として請求項１〜１２のいずれかに記載の合成ポリペプチドの少なくとも１つを、１種または２種以上の製剤上許容されるアジュバント、担体および／または賦形剤と一緒に含有する製剤組成物。
１７．更に、ＡＺＴおよび／またはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を含む請求項１６に記載の製剤組成物。
１８．請求項１〜１２のいずれかに記載の合成ポリペプチドの少なくとも１つとともにサンプルをインキュベートすること含む、ＨＩＶまたはＨＩＶに対する抗体あるいはその抗原結合フラグメントを検出する方法。
１９．請求項１〜１２のいずれかに記載の合成ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
２０．請求項１９に記載の抗体またはその結合フラグメントの少なくとも１つを含む、ＨＩＶまたはＨＩＶに対する抗体の診断用キット。
２１．請求項１９に記載の抗体またはその結合フラグメントの少なくとも１つとともにサンプルをインキュベートすること含む、ＨＩＶ、ＨＩＶに対する抗体またはその抗原結合フラグメントを検出する方法。
２２．活性成分として請求項１９に記載の抗体またはその結合フラグメントの少なくとも１つを、１種または２種以上の製剤上許容されるアジュバント、担体および／または賦形剤と一緒に含有する製剤組成物。
２３．更に、ＡＺＴおよび／またはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を含む請求項２２に記載の製剤組成物。
２４．哺乳類の組織または体液のサンプルを効果的な量の請求項１９に記載の抗体またはその結合フラグメントの少なくとも１つとともにインキュベートし、前記サンプルと前記抗体との交差反応が発生したかどうか、および所望により、その発生の程度および／またはその発生の速度を検出することを含む、ＨＩＶ感染を診断する方法。
２５．請求項１９に記載の抗体またはその結合フラグメントに対して産生された抗イディオタイプ抗体。
２６．哺乳動物のＨＩＶ感染を治療または予防し、および／または哺乳動物の免疫系を刺激し、および／またはＨＩＶビールスのための細胞レセプターをブロッキングする薬剤の調製における、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
２７．請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を投与することからなる、哺乳動物のＨＩＶ感染を治療または予防し、および／または哺乳動物の免疫系を刺激し、および／またはＨＩＶウィルスのための細胞レセプターをブロッキングする方法。
２８．少なくとも１つのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）株のエンベロープタンパク質における少なくとも１つの抗原特性を有する合成ポリペプチドであって、実質的に、式（Ｉ）：【配列があります】（Ｉ）（式中、Ｒ１はＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｒ４−Ｒ５、Ｇｌｎ−Ｒ４−Ｒ５、Ｒ４−Ｒ５、Ｒ５から選択されるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｒｇから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ３は、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＡｌａから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ４は、ＨｉｓまたはＧｌｕであり；Ｒ５は、ＬｅｕまたはＭｅｔであり；ＸおよびＹは、各々独立して存在しないか、あるいは独立して１個以上のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなる合成ポリペプチドを製造する方法でかて、従来公知の化学的技術、成物学的技または組換え技術を用いて残基をカップリングする工程、およびポリペプチドを単離する工程を含む、合成ポリペプチドの製造方法。
２９．少なくとも１つのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）株のエンベロープタンパク質における少なくとも１つの抗原特性を有する合成ポリペプチドであって、実質的に、式（Ｉ）：【配列があります】（Ｉ）（式中、Ｒ１はＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｒ４−Ｒ５、Ｇｌｎ−Ｒ４−Ｒ５、Ｒ４−Ｒ５、Ｒ５から選択されるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｒｇから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ３は、Ｉ１ｅ、ＴｈｒまたはＡｌａから選択されるアミノ酸残基であり；Ｒ４は、ＨｉｓまたはＧ１ｕであり；Ｒ５は、ＬｅｕまたはＭｅｔであり；ＸおよびＹは、各々独立して存在しないか、あるいは独立して１個以上のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなる合成ポリペプチドに特異的に結合する抗体を製造する方法であって、ヒト以外の哺乳類を上記ポリペプチドで免疫感作し、抗体を単離することを含む、抗体の製造方法。