JPH02502637A

JPH02502637A - 合成抗むしばワクチン

Info

Publication number: JPH02502637A
Application number: JP63502025A
Authority: JP
Inventors: レーナー，トマス; ハロン，ジエイ; フリードマン，ナダブ
Original assignee: ジヨンソン・アンド・ジヨンソン・コンシユーマー・プロダクツ・インコーポレーテツド
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1990-08-23
Also published as: EP0280576A3; ZA881337B; EP0280576A2; KR890700604A; GB8704647D0; AU1349588A; WO1988006594A1; NZ223624A; EP0346370A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】合成杭むしばワクチン本発明は、むしばの抑制御；おいて興味ある、部分的にまｊ；は完全に合成由来の、ペプチドの免疫原ｔ：関する。この明細書に８いて、用語「連鎖球菌（Ｓｔｒｅ　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ）」は連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　５ｏｂｒｉｎｕｓ）を包含するものとして理解すべきである。なぜなら％　Ｓ、ｍｕｔａｎｓの血清型ｄおよびｇは、現在、この分野における研究者らにより、旦、５ｏｂｒｉｎｕｓと表示される別の種として見なされているからである。

むしばは被検体を殺しに連鎖球菌（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、またはバクテリアの細胞壁からの精製した免疫原で免疫化することにより減少することができる（Ｔ、レーナー（Ｌｅｈｎｅｒ）、　「むしばに対する免疫化（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　　Ａｇａｉｎｓｔ　　Ｄｅｎｔａｌ　　Ｃａｒｉｅｓ）Ｊ、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、［スチンソン（Ｓｔ　１ｎｓｏｎ）、Ｍ、Ｗ、、アルビニ（Ａｌｂｉｎｉ）、Ｂ、およびナイセンガード（Ｎｉｓｅｎｇａｒｄ）、Ｒ，Ｊ、、「宿主組織への連鎖球菌抗原の悪い作用（Ａｄｖｅｒｓｅ　　Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ　　Ａｎｔｉｇｅｎｓｏｎ　　Ｈｏ５ｔ　　Ｔｉ５ｓｕｅｓ）Ｊ、連鎖球菌の分子微生物学および免疫学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａＳｃｉｅｎｃｅ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　　Ｂ、Ｖ、、オランダ国アムステルダム（１９８６）］。本発明は、Ｓ、ｒｎｕｔａｎｓの望ましさに劣る抗原成分による潜在的汚染がない、免疫原の産生へのアプローチを提供する。

本発明および一般に合成ワクチンの第２の利点は、保護的抗体のｔ；めの結合部位ならびに１９２８球および関連する分子と反応するドメインを含有する、比較的小さい分子（または小さい数の分子）を合成できるということである［Ｊ、プルシフスキー（Ｂｒｚｏｆｓｋｙ）、ｒＭＨＣ−制限へルンバーＴ細胞の認識のための抗原構造の要件（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　　Ｒｅｑｕｉｒｅｒｎｅｎｔｓ　　ｆｏｒＭＨＣ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　　Ｈｅ１ｐｅｒ　　Ｔ−Ｃｅｌｌ　　Ｒｅｃｇｎｉｔｉｏｎ）Ｊ、ワクチンへの現代のアプローチ（ＭｏｄｅｒｎＡｐｐｒｏａｃｈ　　ｔｏ　　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、２１ −２３、ＲｏＣｈａｎｏｃｋｔ　Ｒ，ＬｅｒｎｅｒおよびＦ、ＢｒｏｗｎＪＬコールド−スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８５）］。このアアブローは、制限した組の合成ペプチドに適用するとき、大きい集団における抵抗性を提供し、そして遺伝子制限に関連する問題を最小にすることができる［ミリチ（Ｍｉ＋１ｃｈ）、Ｄ、Ｒ，ら、ｒＢ、Ｈ肝炎表面抗＊　（Ｈｂ　Ｓ’Ａ　ｇ）のＰｒｅ−５（１）領域への免疫応答：Ｐｒｅ−５（１）−特異的Ｔ細胞の応答はＨｂＳＡｇのＰｒｅ−５（２）およびＳ領域への非応答をバイパスすることができる（Ｉｍｍｕｎｅ　　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　　ｔｏ　　ｔｈｅ　　Ｐｒｅ−５（１）Ｒｅｇｉｏｎ　　　ｏｆ　　　ｔｈｅ　　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ｂ　　５ｕｒｆａｃｅ　　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨｂＳＡｇ）：Ａ　　Ｐｒｅ−５（２）−３ｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｔ　　Ｃｅ１ｌ　　　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　　Ｃａｎ　　ＢｙｐａｓｓＮｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ　　　ｔｏ　　　ｔｈｅ　　Ｐｒｅ−３（２）　　ａｎｄ　　Ｓ　　Ｒｅｇｉｏｎｓ　　ｏｆ　　ＨｂＳＡｇ）Ｊ、＊＋　二ナル−オブ・イム１０ジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、上主ヱ、３１５−３２２　（１９８６）］　。

本発明のペプチドは、タンパク質抗＊Ｉ／Ｉ　Ｉの誘導体と見なすことができる［ラッセル（Ｒｕｓｓｅ　ｌ　ｌ）、Ｍ、Ｗ、およびレーナー（Ｌｅｈｎｅｒ）、Ｔｏ、’連鎖球菌の血清型Ｃの細胞および培養流体から抽出した抗原の特徴づけ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆＡｎｔｉｇｅｎｓ　　Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　　ｆｒｏｍ　　Ｃｅ１ｌｓ　　ａｎｄＣｕｌｔｕｒｅ　　Ｆｌｕｉｄｓ　　ｏｆ　　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ　　５ｅｒｏｔｙｐｅ　　Ｃ）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆＯｒａｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３．７ −５　（１９７８）］、このタンパク質は、また、文献においてＢ、ＩＦ、ＰＩおよび５ｐａＡと呼ばれている［ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、Ｒ，Ｒ，Ｂ、ら、「連鎖球菌の表面抗原の特徴づけ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ　　５ｕｒｆａｃｅ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｓ）　Ｊ　、連鎖球菌の（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｒｎｕｔａｎｓ）１−７０、Ｈａｍａｄａ％　Ｓ、ら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　　５ｃｉｅｎｅｅ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　　Ｂ、Ｖ、％オランダ国アムステルダム（１９８６）］。抗抗原／ＴＩは分子量１７５Ｋｄ〜１９５Ｋｄの物質であり、そして２つの関係する抗原物質、分子量１４６−１５５Ｋｄの抗原！および分子量４７Ｋｃｌ〜４９Ｋｄの抗１［１１を含有すると考えられる。

これらの抗原は英国特許比１１（ＧＢ−Ａ）２，０６０．２４７号に記載されている。３．８Ｋｄの分子量の抗Ｋｌ／Ｉ　Ｉの断片は、また、むしばの抑制において有用であることが知られている。［ギアスジン（Ｇｉａ　５ｕｄｊｉ　ｎ）Ａ、Ｓ、Ｍ、　、レーナー（Ｌｅｈｎｅ　ｒ）　、Ｔ、およびエバンス（Ｅｖａｎｓ）、Ｒ，Ｗ、、「分子量３８００の速鎖球菌のタンパク質抗原の同定、精製および特性うけ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａ　　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　　ＰｒｏｔｅｉｎＡｎｔｉｇｅｎ　　ｗｉｔｈ　　ａ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｗｅｉｇｈ。

ｆ　　３８００）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｓｏ、６５１−６５８　（１９８３）および欧州特許出！［（ＥＰ−Ａ）０１１６４７２号。抗ｆｉｌ／ＩＩおよび抗ＷＸの両者はワクチンきしてを効であることが示されており、抗［Ｘは歯肉に適用したときでさえ有効である［レーナー（Ｌ　ｅ　ｈ　ｎ　ｅｒ”）、Ｔ−、メラー）　（Ｍｅｈｌｃｒｔ）、Ａ、およびカルドウエル（Ｃａ　ｌ　ｄｗｅ　ｌ　１）、Ｊ、、Ｉｂ１ｄ、］、この明細書において、ペプチドまＩ；はタンパク質の分子量についての言及は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより計算しｔ；分子量を意味する。

本発明は、抗［１または抗原Ｔ／１１または抗原ｘの断片と同一であるか、あるいは寅質的ｔ：同一であるアミノ酸配列を有するペプチドからなる合成ペプチドであって、抗［１または抗［Ｉ／Ｉ　Ｉまたは抗ｙＫＸの断片と同一であるか、あるいは寅質的に同一であるアミノ酸配列を有する前記ペプチドはＳ、ｍｕｔａｎｓ抗原（ＳＡ）を認識する抗体の形成を生体内で誘発することができることを特徴とする、合成ペプチドを提供する。１つの実施態様において、抗原ｌまたは抗原１／Ｉ　Ｉまｔ；は抗ｗＸの断片と同一であるか、あるいは寅質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドは３、ＢＫｄより小さい分子量を有する。

本発明のペプチドは、有機合成、組み換えＤＮＡ技術により生成することができるか、あるいはＳ、ｍｕｔａｎｓから、例えば、抗［１／ＩＩまたは抗ＷＸの劣化により、精製することができる。ペプチドは担体に結合することができるか、あるいは結合しないことができる。ペプチドの免疫原性は、アジュバントまたは他の免疫変調剤との組み合わせにより増大することができる。ペプチドの配列は抗［１／Ｉ　Ｉまたは抗原Ｘ中に存在するものに類似するアミノ酸配列を含有するばかりでなく、かつま１；ペプチドの構造または免疫原性を修飾する配列を含有することができる。

本発明はワクチンの製造のためのペプチドを提供し、ペプチドは好ましくは合成ペプチドであり、特異的抗連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ）抗体の産生を支配し、そしてヘルパー１９２３球の増殖を刺激させてむしばを防除する。本発明のペプチドは、連鎖法１ｆｔ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ）からの天然に産出する抗［１／Ｉ　Ｉの全体を含有しない。その代わり、それは免疫原性を増大する機能する他の配列をもっていてもよい、抗Ｗ１／Ｉ　Ｉの領域まｔ；はある数の領域に相当する、ｌまたは２以上のポリペプチド領域から成る。本発明のペプチドに基づくワクチンは、通常天然に産出するＳ、ｍυｔａｎｓ分子を含まないが、これは必須ではない。本発明のペプチドは、また、他のｇｉＩＫ性物質の領域、それから誘導された、またはその合成類似体、例えば、テタヌストキソイド、Ｂ型肝炎ウィルスなどを含有することができる。

本発明のペプチドは、その産生の方法ｌ；依存して、異なる分子量を有することができる。例えば、化学的合成により産生されたペプチドは好ましくは５０またはそれ以下のアミノ酸に限定される。同一のペプチドは、組み換えＤＮＡ法により産生ずるとき、より大きいペプチドの一部として産生ずることができる。この接合体タンパク質の実施態様において、ペプチドは通常抗原１／Ｉ　Ｉまたは抗Ｗ、Ｘより小さいが、後者より大きくあることができる。

１つの面において、本発明のペプチドは、好ましくは３．８Ｋｄより小さい分子量の、合成ペプチドの配列、例えば、約６〜約５０アミノ酸単位を含有し、そして抗Ｗｘ中に存在する抗原決定基を含む合成ペプチドの配列からなり、それゆえ、本発明のペプチドの配列は、Ｓ、ｍｕｔａｎｓを認識し、それを中和し、そしてそれに対して保護する抗体の形成を生体内で誘発することができる。本発明のペプチドの配列は約２５以下のアミノ酸単位からなることがとくに好ましく、そしてわれわれの研究は、現在、必要な抗原決定基を含む約１０〜約２４アミノ酸からなるアミノ酸配列を同定することができる段階まで到達した。抗原Ｘについての引き続く研究は、それが多分法の配列■を有することを示す：Ｇａｙ：　　Ａｌａ：　　Ｖａｌ：　　Ａｓｐ：　　Ｓｅｒ：　　ｌｉｅ：　　Ｌｅｕ：　　Ｇｌｙ：Ｇａｙ：　　Ｖａｌ：　　Ａｌａ：　　Ｔｈｒ：　　Ｔｙｒ：　　Ｇｌｙ：　　Ａｌａ：　　Ａｌａ＝位位置はＡｌａであることができる。位置２はＧｌｙであることができる。位置１４はＡｈａまたはＩｃｅであることができる。

位＃Ｌ１５はＳｅｔであることができる。位置１６はＧｌｕであることができる。

本発明の合成ペプチドは配列！であるかまたはそれを含むことができるか、あるいは配列Ｉの免疫学的に有効な分画を含むか、あるいは配列Ｉｊ；免疫学的に同等の配列またはその分画であるかまたはそれを含むことができる。例えば、配列ｌの免疫学的性質は、ＡｓｐがＧｌｕにより置換されたとき、ＬｅｕがＶａｌまたはＩｌｅで置換されたとき、ＴｙｒがＰｈｅまたはＴｒｐで置換されたとき、ＩＩｅまたはＡｈａまたはＬｅｕがＶａｌまたはＬｅｕで置換されたときで、ＶａｌがＩｌｅで置換されツ；とき、あるいはＴｈｒがＳｅｒで置換されたときでさえ、保持されることができる。

下に説明する、ように、配列ｌまたはその断片または配列ｌの免疫学的同等体またはその断片は、本発明に従い、カルボキシ末端またはアミン末端の両者を、増殖が要求されるとき、末端へのシスティン結合を経て、結合することによって、より大きい分子に構成することができる。この技術は本発明のペプチドを追加のアミノ酸配列へ結合させることができるので、例えば、それは溶液中で抗原１／Ｉ　Ｉにより密接に似るフン７オメーシ！ンを取る。

あるいは両者の末端へのシスティンへの結合はこの分子を環化することができる。

本発明のペプチドが説明する技術により結合することができるアミノ酸配列の他のタイプは、Ｓ、ｍｕｔａｎｓからか、あるいは多価ワクチンを製造することができるように他の病原体からの他の抗原決定基を含む配列である。

上に示したように、本発明の合成ペプチドをそれ以上のペプチドの配列と接合して、本発明の合成ペプチドを免疫原性とすることが望ましいことがしばしばある。この接合はそれ自体既知の方法によって実施し、そして、接合を化学的方法により実施すべき場合、抗原決定基を含む本発明のペプチドの配列は、普通のペプチド形成方法により、より大きいペプチドの配列、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンベットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　　Ｉｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎＬテタヌストキソイドまたはジフテリアトキソイドおよび結核ＣＭ。

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の精製タンパク質誘導体（ＯＯＤ）または合成アジュバント、例えば、ムラミルジペプチドに結合することができる。

本発明の合成ペプチドの配列を上に示す方法で担体分子に結合するとき、得られる分子は「半合成」として見なすことができ、ここでこの分子の抗原決定基含有部分は合成であるが、この合成断片は天然由来のより大きい断片に合成的に結合されている。

あるいは、全接合体を遺伝子工学の技術により調製するとき、所望の抗原決定基およびざらに担体ペプチドを含む多分５０アミノ酸単位までの所望の「合成」断片をエンコードするＤＮＡをクローニングすることが可能であり、こうして、クローニングしたＤＮＡ断片が形質転換した宿主ｍ胞から発現されるとき、発現され！；ペプチドは抗原決定基を含有する小さい合成断片を天然由来のより大きい断片と化学的に接合することにより、前述のように調製したペプチドと同一であることができるが、上に記載する場合におけるように、接合体が遺伝子工学の技術によるか、あるいは化学的接合体Ｉ；より調製されるかどうかに無関係に、それは本発明ｌ；従い「合成」として見なされる。

抗原決定基を含む本発明の比較的小さいアミノ酸配列を結合する別法として、本発明によるより大きい分子量の分子は、抗原決定基を含む七ツマ−のペプチドの配列を重合することによって生成することができる。

このような重合は、抗原決定基を含む２まｌ；はそれ以上の、例えば、２〜１００のペプチドの配列を結合することができ、そしてそれ自体既知の方法において達成することができ、そして、例えば、ペプチドの環化において、あるいは担体へのペプチドの架橋において使用することができる。便利には、重合は過当な緩衝液中で、グルタルアルデヒドを使用するか、あるいはシスティン残基の間のスルフィジル架橋の形成（これは、必要に応じて、七ツマ−の末端に加えることができる）により実施される。

本発明のペプチドの配列は、抗原決定基を組み込んでおり、むしばの抑制のためのワクチンの調製において使用することができる。このようなワクチン組成物は、本発明のペプチドを有効量で適当な不活性担体と一緒に含むことができる。本発明のペプチドは前述の形態で、例えば、モノマーの分子、ペプチドの担体分子または免疫変調剤と接合しｔ；ポリマーの分子として使用することができる。透過性剤および他の化合物（例えば、プロテアーゼ阻害剤）を、また、本発明の一部として配合することができる。

合成ペプチドのワクチンの配合において追加の化合物を含めることがしばしば必要である。例えば、本発明は、その形態の１つにおいて、その免疫原性を増大する担体のタンパク質、例えば、テタヌストキソイドｌこ結合する。担体、例えば、テタヌストキソイドはヒトの使用において有効でありかつ承認されている。さらに、免疫原を配合して、また、免疫応答を増大するアジュバントを含有させる。アジュバントは、単に水酸化アルミニウムであり、そしてタンパク質を単にそれに吸着させる。

１つの他のものは合成アジュバントのムラニルジペプチドである。アジュバントは多数存在し、そして本発明は担体まｌ；はアジュバントの性質により限定されない。

本発明のペプチドまたはそれらを含有するワクチン組成物は、本発明のペプチドまＩ；はそれを含有する組成物を宿主に投与することによってむしばの抑制に８いて使用することができる。種々の投与方法、例えば、非経口的投与または経口的または局所的投与を使用することができる。

この物質を非経口的に投与するとき、それは、例えば、筋肉内注射により投与することができ、この場合において、生理的塩類溶液中の０．　１〜ｌ　ｍ　ｇ　ｓ例えば、約０．５ｍｇの投与量および水酸化アルミニウムアジュバントを使用する、反復した回数は適当であろう。好ましい投与方法は、局所的投与により、とくに歯肉上皮または口腔粘膜を通す局所的投与によるか、あるいはペプチドの飲み込みによる。この目的で、本発明のペプチドは簡単な溶液であるいは乳濁液、分散液、ペースト、ゲルまたはエアゾールとして配合することができる。理想的には、投与の容易なｔ；め、本発明のペプチドは練り歯磨き、チューイングガムまたはロゼンジなどの歯の清浄または塗布用物質中に、あるいは口を洗浄するうがい薬などの物質中に配合することができる。

本発明のペプチドは、また、抗体の調製に使用することができる。このような抗体は、診断の目的で、あるいは宿主の受動免疫化のために使用して、Ｓ、ｍｕｔａｎｓの感染Ｌ；対する保護の手段を提供することができる。それらは、また、ペプチドの精製において、例えば、親和クロマトグラフィー！＝よ＃ｌｌ使用することができる。

本発明のペプチドは、ポリクローナル抗体まｔ；はモノクローナル抗体の産生に使用することができる。ポリクローナル抗体は、抗体の産生に普通に使用される太きいまＩ；は小さい動物のいずれであるすることもできる、宿主動物の免疫化を本質的に含む、抗体の産生の普通の方法により調製することができる。通常、本発明のペプチドは免疫原の形態で、例えば、それらを大きい担体ペプチド分子と接合した形態で使用することが必要であり、そして、宿主動物の免疫化後、血液まＩ；は他の体液を宿主動物から取り出し、そして抗体をそれ自体既知の方法において血液または血漿から回収することができる。

モノクローナル抗体を必要とするとき、本発明のペプチドの免疫原性の形態を適当な宿主の生体内免疫化にあるいは８９２３球の生体外刺激において使用することができ、次いで宿主から取った牌細胞または刺激した８９２３球を骨髄性細胞とそれ自体既知の方法においてノ１イブリダイゼーシテンして、ハイブリドーマの集団を形成し、これから適当なノ＼イブリドーマを選択し、そしてモノクローナル抗体の産生のために維持することができる。１つの過当な宿主の種はマウスである。

本発明の合成ペプチドに対するモノクローナル抗体、ことに下の実施例１の２１で−（ｍｅｒ）に対するモノクローナル抗体は、本発明の特定の面を構成する。

この明細書において使用する定義および略語アミノ酸の１つの文字または３文字のコードＡ　　Ａｌａ　　アラニン　　　　　Ｌ　　Ｌｅｕ　　ロイシンＲＡｒｇ　　アルギニン　　　　Ｋ　　Ｌｙｓ　　リジンＮ　　Ａｓｎ　　アスパラギン　　　Ｍ　　Ｍｅｔ　　メチオニンＤ　　Ａｓｐ　　アスパラギンＨＦ　　Ｐｈｅ　　フニニルアラニンＣＣｙｓ　　システィン　　　　Ｐ　　Ｐｒｏ　　プロリンＱ　　Ｇｉｎ　　グルタミン　　　　Ｓ　　Ｓｅｒ　　セリンＥ　　Ｇｌｕ　　グルタミンｒａＴ　　Ｔｈｒ　　スレオニンＧ　　ｃｒｙ　　グリシン　　　　　Ｗ　　Ｔｒｐ　　トリプトファンＨＨｉｓ　　ヒスチジン　　　　Ｙ　　Ｔｙｒ　　チロシン１　１１ｅ　　イソロイシン　　　Ｖ　　Ｖａｌ　　バリン合成ペプチド　−（ａ）化学的方法により合成されたアミノ酸配列、すなわち、より小さいアミノ酸配列または単一のアミノ酸から構成される、参照、例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら、ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、８５．２１４９　（１９６３）、ケント（Ｋｅｎｔ）、Ｓ、Ｂ、Ｂ、生物化学のポリ？−（Ｂｉｃｈｅｒｎｉｃａｌ　　Ｐ。

Ｉ　ｙｍｅ　ｒ　ｓ）　ＩＩ、　Ｅ、　Ｐ、ゴールドバーブ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）およびＡ、ナカジマ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ）ニューヨーク、２１３−２４２　（１９８０）、または（ｂ）　　−配列（ａ）化学的手段により他のアミノ酸配列に結合されており、後者のアミノ酸配列は、また、タイプ（ａ）配列であるか、あるいは天然に産出するかまたは生物合成された配列またはその断片、または（ｃ）形質転換しｔ；宿主細胞から遺伝子工学の技術により産生された配列。

免疫変調剤　−１９７８球または８９２３球への直接または間接の作用ｌ；よりペプチドへの免疫応答を変更する分子。

図面の説明第１図および第２図は、本発明の合成ポリペプチドの免疫属性を実証する、下の実施例において詳細に説明するアッセイの結果を示す。

第１図は、本発明によるペプチドで免疫化しｔ；ウサギへの血清アッセイの結果を示す。縦軸は、ペプチドと反応する抗血清の最高希釈の対数の逆数である（参照、実施例５）。横軸は、−次免疫化後の週の数である。矢印は、担体に結合したアジュバント化ペプチドの注射を意味する。

Ｍ２図は、１８マー（上）および２１７−（下）に対する抗血清の特異性を実証するためのアッセイの結果を示す。縦軸は、ＡＢＴＳをＥＬＩＳＡのウニルに添加しｌ；ときの色の変化により決定した、免疫グロブリンの結合の程度である。

横軸は、抗血清−ペプチド混合物の希釈の逆数である。

第３図は、１８５Ｋｄの連鎖球菌の抗原（横軸）または合成ペプチド（１３７− −環化した）（縦軸）で刺激したとき、ヒトＴ４細胞のリンパ性増殖の応答の間の統計的に有意の（ｒ＝０．５０１８、ＤＮＡ断片２６、ｐ＜０−０１）相関関係を示すグラフである。結果は刺激指数（ＳＩ）として表されている。

第４図〜第６ｒｇＪは、下の実施例１３および】４に記載す実験において得られた結果を示す。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例１２１？−（ＳＦ３１）　のＧＡＧＡＧＡＶＤＳ　ＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣの合成および特性づけフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂にエステル化したＢｏｃ−（４ＭｅＢｚ）−システィンを、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。２１アミノ酸ペプチドの合成は、古典的なメリフィールドの固相合成化学の対称無水物の応用を使用して達成した［）！ａｇｅｎｍａｉｅｒ％Ｈ０，およびＦｒａｎｋ、Ｈ，［１９７２］、Ｈｏｐｐｅ− ３ｅｙｙｌｅｒ’　　ｓ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３５３．１９７３−６、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ。

Ｒ，Ｂ、　、［１９６３］　、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ−（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、ＳＯＣ，）、８５．２１４９−５４〕。ペプチドの配列ＧＡＧＡＧＡＶＤＳ　Ｉ　ＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣはアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、４３０Ａ型の自動化された合成装置で対称無水物カップリングプログラムを使用して合成した。０．５モルのＢｏａ−（４ＭｅＢｚ）−システィンを、対称無水物アミノ酸と反応性アミノ基より２倍過剰でカップリングした。

アミノ酸誘導体Ｂｏａ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　Ｂｏｃ−ＡｌａＢｏａ−Ｖａ　Ｉ　　　　　　　　　　　Ｂｏｃ−（０−Ｂｚ　Ｉ）−ＡｓｐＢｏｃ−（０−Ｂｚｌ）− ５ｅｒ　　Ｂｏｃ−１ｉｅＢｏｃ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　ＢｏＣ−（０− Ｂｚ　１）−Ｔｈ　ｒＢｏｃ−（０−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ　　Ｂｏａ−（４−ＭｅＢｚ）−Ｃｙｓペプチドを８１Ｎから１０％のアニソールを含有するフッ化水素酸で切断し、そして５０％の酢酸で抽出した。フッ化水素酸の処置は、また、保護基を除去した。これらの基は、次のとおりである：Ｂｏｃニアミノ酸上のアルファアミン基のｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基。それは、アミノ酸が成長するペプチドへカップリングした後、５０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；　５０％のジクロロメタン中の加水分解により除去される。これは第一アミンを遊離して、引き統く縮合において反応させる。

０−Ｂｚｌ：ペンシルエステル、セリン、スレオニン、およびアスパラギン酸に結合して、ヒドロキシルまたはカルボキシル側鎖を合成の間保護する。

０−Ｂｒｚ：オルトブロモベンジルオキシカルボニル、チロシンのフェノールのヒドロキシル基に結合して、それを合成の間アルキル化がら保４−ＭｅＢｚ：４ −メチルベンジル：システィンのスルフヒドリル基に結合して酸化を防止する。

アニソール（メチルフェニルエーテル）は、ＨＦ切断の間および保護基がペプチドから除去された後、親核物質のスカベンジャーとして働く。

溶液を濾過して樹脂を除去し、そして７ラクトゲルＴＳＫ　　ＨＷ−４０Ｆゲル濾過カラムのクロマトグラフィーにかけ、５０％の水性酢酸の移動相を使用した。１０ｍΩの分画を集め、そして２８０ｎｍの紫外線を吸収するものを凍結乾燥した。ペプチドはアミノ酸分析によりベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）６３００アミノ酸分析器で特性づけ、そして上に示す２１マーであることが示された。分析用高圧液体クロマトグラフィーを２５０Ｘ４．５ｍｍＶｙｄａｃ　　Ｃ−４逆相カラムで実施し、２０分にわたって０．１％の水性ＴＦＡ中の１０−５０％のアセトニトリルの勾配を使用した。流速は１．Ｏｍ＋／分であつＩ；。ペプチドの溶離は２１４ｎｍの波長で監視し、そして物質のすべての調製物は、〉６０％の紫外線吸収物質を含有する主要なピークを示した。

罠１町１ＣＶＤＳＩ　ＬＧ（１，ＶＡＴＹｃ環状１３マーの合成および特性づけこのペプチドの合成は、実施例１におけるのと同一の手順により実施した。出発物質はＰＡＭ樹脂へエステル化したＢｏａ−（４ＭｅＢｚ）−Ｃｙｓであり、そしてアミノ酸はペプチド鋼へ同一の対称無水物の化学を使用して付加した。付加の順序はＹＴＡＶＧＧＬＩ　５ＤＶＣであっｔ；。

クロマトグラフィーおよび凍結乾燥後、ペプチドを次のようにして環化した：Ｏ，Ｉｍｇのペプチドを０．１モルの重炭酸アンモニウム（ｐＨ−７，８）中に溶解し、そして室温において一夜撹拌した。インキュベーションの前後の物質は、遊離システィン残基について、エルマンの分光光度測定方法［Ｅｌｌｍａｎ、Ｇ、Ｌ、［１９５９］アーチーブス。

オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、８２．７０］により試験した。次いで、ペプチドを凍結乾燥し、そしてフラクトゲルＴＳＫ　　ＨＷ−４０Ｆのクロマトグラフィーにかけて塩を除去しｔ；。ペプチドを凍結乾燥し、そしてアリコートを０．４ｍｇの脱イオン蒸留水中に再懸濁した。この溶液を１．２５％の２−メルカプトエタノール（Ｖ／Ｖ）にし、そして１モルの重炭酸アンモニウムでｐＨ−７，８７こした。次いで、この還元した物質および出発物質をＨＰＬＣにより分析して、ペプチドが環化し、そして引き続いて線状になったことが確証された。

実施例３ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹ線状１１７−の合成および特性づけ実施例１の一般手順を従い、そして次の試薬を使用した。Ｂｏｃ（。

−ブロモカルボベンゾキシ）−チロシン−ＰＡＭはアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、から購入し、そしてアミノ酸ＴＡＶＧＧＬ　Ｉ　ＳＤＶを実施例１と同一手順により段階的に付加した。０−ブロモカルボベンゾキシル（ＢｒｏｍｏＣＢｚ）　基を、実施例１および２におけるＢｏｃ−（ｏ−Ｅｚ）基の除去と類似の方法でフッ化水素酸中でで除去した。

ある研究のため、凍結乾燥したペプチドを５０％の酢酸中に再懸濁し、そしてざらに逆相ＨＰＬＣにより精製した。クロマトグラフィーの条件は実施例１および２に記載する分析実験と同一であり、多数回の実験を行い、そして主要なピークをプールした。プールした物質を再クロマトグラフィーにかけ、そして主要なピークは、９分（２８％のアセトニトリル）で溶離され、９３％の紫外線吸収物質を含有した。

叉産五土担体へのペプチドの結合実施例１，２および３において調製したペプチドを２つの理由でより大きいタンパク質へ結合し、こうしてタンパク質が免疫原性担体として働き、ワクチン接種した宿主がペプチドに対する適当な免疫応答を発生し、そしてペプチドが免疫学的アッセイのため定量的！二マイクロタイタープレートへ吸着できるようにした。

架橋のための手順ｌこれはアブラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ、Ｉｍｒｎｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　［１９８６］　６，４３−５２）の手順の応用に基づく。５．０ｍｇのペプチドおよび５．０ｍｇの担体タンパク質を０．７ｒｏＱの０．２５モルのリン酸カリウム緩衝液％　ｐＨ−８，０中に溶解した。４μｇの２５％のグルタルアルデヒドを添加し、そしてこの溶液を室温において３０分間インキュベージコンした。

遊離ペプチドおよび塩を広範な透析により４．０００または６．０００の分子量のカットオフの膜を使用して除去した。

透析緩衝液は０．０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ　Ｈ−６，０であり、そしてアリコートをアミノ酸分析のために取り出した。

架橋の手順２これはリウ（Ｌｉｕ％Ｆ−Ｔら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）［１９７９］％上８，６９０−７）の手順の応用に基づ〈。０．２５ｍ１２の０．０１モルのリン酸ナトリウム緩衝液中に溶解しｆ：　４　ｍ　ｇの担体タンパク質を、ジメチルホルムアミド中の０−０８５ｍＱの６ｍｇ／ｍ１２のｍ− マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）と混合した。撹拌しながらインキュベーションを室温において３０分間実施した。次いで、それをｌ（イオゲルＰ３０の２−５Ｘ２５ｃｍのカラムのクロマトグラフィーにかけ、０．０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ−５，０を移動相として使用し、そして空隙体積から溶離される物質を集めた。

この物質をＢ、ＯｍＱの最終の体積にし、そして５ｍｇのペプチドを含有するする同一緩衝液の１ｍｇを添加した。このペプチドはまず遊離システィン基について上のエルマンの手順により試験した。この溶液のｐＨを水酸化ナトリウムで中性に調節し、そして架橋を室温番；おし１て３時間発生させｔ；。粒体および凝集物を遠心により除去し、モしてタンノ（り質のｓＥ度を孫準の寅験室の手順ｔ：より決定した。架橋の程度をエルマンのアッセイにより、架橋の前後に、決定することができる。

実施例５抗ペプチド抗体を測定する手順手順１−ＥＬＩＳＡアッセイ下に記載するアッセイの系は、クルスタフ（Ｋｕｒｓ　ｔａｋ、Ｂｕ　１１ｅｔｉｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｗｏｒｌｄ　　Ｈｅａｌｔｈ　　Ｏｒｇａｎｉｓａｔ　ｉｏｎ　　［１９８５］　、５３，７９３−８１１）のガイドラインの応用である。アッセイのプロットを９６ウエルのマイクロタイタープレートのウェルの各々に、０．１ｍｇのリン酸塩緩衝液中の５００ｎｇのオバルブミン結合ペプチド（手順ｌによる）を充填することによって冥造した。タンパク質をプレートを３７℃ｔ：おいて一夜乾燥することにより吸着させた。プレートをリン酸塩緩衝液で洗浄し、そして使用するまで一２０℃において貯蔵し！；。免疫グロブリンの非特異的粘着を、ウェルを０．２ｍｆｆのｍＴ−洗浄液で１加熱３７℃において処置することによって防止した。ｍＴ−洗浄液を除去し、そしてプレートをブロッティングして乾燥した。ウェルを０．１ｍＱのｍＴ−洗浄液で充填し、そして抗血清を系統的にｍＴ−洗浄液を含有するウェル中に希釈した。抗体を吸着した抗原に１時間３７℃において結合させた。この時、ウェルを吸引し、そして０．５％のツイーン２０を含有するＰＢＳで５回洗浄した。プレートをブロッティングして乾燥し、そしてホースラディシュペルオキシダーゼと接合したヤギ抗ウサギＩ　ｇ　（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）の１＝４０００希釈物を含有するＯ、１ｍＱのｍＴ−洗浄液で再充填した。第２抗体を抗原結合免疫グロブリンと１時間３７℃において反応させた。プレートを吸引し、そしてウェルをＰＢＳ＋ンイーン２０で５回洗浄し、そしてブロッティングして乾燥した。ペルオキシダーゼ結合免疫グロブリンの結合の程度を２．２′−アジド−ジー［３−エチルーベンズチアゾリンスルホネー）］　　（ＡＢＴＳ）で製造業者（Ｋｊｒｋｅｇａａｄ　　＆Ｆｅｒｒｙ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ％　Ｉｎｃ、、米国マリ−ランド州ガイサーバーグ）が推奨する条件下に定量し、モして４９５ｎｍにおいてバイオチク（ＢｉｏＴｅｋ）ＥＬ−３１０ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国ベルモント州パーリントン）で読んだ。力価は最大の希釈の逆数であり、滴定において正の読みを明瞭に与えた。

リン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ’）０．１５モルの塩化ナトリウム０．０１モルのリン酸ナトリウムｐＨ−７，２ｍＴ−洗浄液５％の新生子ウシ血清１％のウシ血清アルブミン０．５％のツイーン２０リン酸塩緩衝液中５ｉ！施例１〜３に記載する合成ペプチドを、架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用して、テタヌストキンイドに接合した。この物質をＰＥＳ中に溶解し、そして１００μｇを０．５ｍＱにし、そして等しい体積の完全７０インドアジニバン）　（ＣＦＡ）と混合した。この混合物を乳化し、直ちに、ニューシーラント自ウサギの背中の４部位に皮下注射した。

引き続く注射は同様な方法で、半分の量のみのタンパク質および不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）で投与した。

２羽のウサギをペプチドの各々で免疫化した。１２マー（ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹ）を除外する、すべての場合において、担体はテタヌストキソイドであった。

１２マーについて、担体はキーホールリンベットのヘモシアニンに結合したＭＢＳであった。１Ｍ期的に、血清をウサギの各々から採取し、そして、ＥＬＩ　ＳＡによりアッセイして、抗ペプチド抗体の産生を決定した。

アッセイのプレートのウェルは、ウサギを免疫化したのと同一のペプチドを含有した。各ペプチドはＥ、Ｌ　Ｉ　ＳＡプレートへの取り付は前にオパルブミンに結合したグルタルアルデヒドであり、すべてのペプチドがプラスチック１：等しいよく結合するようにし！；。結果を第１図に示す。

最も劣った免疫原は１１７−および１２マーであった。１２マーハヨり長く応答を誘導したが、最終の応答は１１マーのそれより強いように思われた。環状１３７−はよりすぐれた応答を示し、第４の注射後〉１ｏ、ｏｏｏの力価をもっていた。２つの最大のペプチド、１８マー（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＡＡＡＬＣ）８よび２ｌ−Ｆ−は、ｌ小すｕ％ペプチドより高い持続性の力価を示した。

実施例７ペプチド抗体の特異性の決定抗ペプチド免疫応答の特異性は、ＥＬＩＳＡのウェルへ吸着する抗原Ｘと結合する抗ペプチド抗体の能力を測定することによって実証された。

特異性は、抗ペプチド抗体をまず抗Ｗ（抗Ｊｌ（Ｘまたは合成ペプチド）と結合させ、次いでそれを抗Ｗｘを含有するＥＬＩＳＡプレート中でインキュベージ１ンすることによって確証された。合成ペプチドが抗Ｗ、Ｘの有効な１ｌｉＩ仁体（ｖａｌｉｄ　　ｒｎｉｍｉｃ）である場合、この結合は抗血清を抗原Ｘまたは合成ペプチドで予備処置することによって遮断されるであろう。

予備処置は最終体積０．２ｍＱの５または２５μｇの抗原Ｘを含有するｒｎＴ− 洗浄液中で実施した。予備処置は４＠において１６加熱であった。次いで、この混合物を系統的に５００ｎｇの抗ＫＸ／ウェルを含有するＥＬＩ　ＳＡプレート上に希釈した。アッセイは実施例５に記載する方法と同一の方法で実施した。結果を第２図に示す。

第２図の上のグラフが示すように、抗ペプチド抗血清はプレート上で抗原Ｘと結合するが、抗原Ｘとの予備インキ二ベーシ！ンはこの過程を阻止する。合成１８マーの場合において、結合は大きく減少する。これが示すように、抗体は抗原Ｘを認識するより合成ペプチドをかなりよく認識する。下部のパネルは、抗２１マーを使用するときの結果を示す。

この場合において、プレート上の抗原ｘへの結合は、抗原ｘまたは合成ペプチドのいずれかとの予備インキュベージ１ンにより阻止される。これが示唆するように、２１マーを使用する免疫化は高度に特異的な方法で抗［Ｘを認識する抗体を産生させる。

実施例８ヒト７４ｍ胞を１８５に！鎖球菌の抗原または実施例１２の１３マーで刺激し、そしてリンパ性増殖の応答を測定した。結果は第３図にグラフで示されている。

第３図の結果が示すように、１８５に一３ａおよび１３マーによるＴ細胞の刺激において有意の陽性の相関関係が存在する（Ｐｒｏ、　０１）　。

実施例９アカゲザルをＤＭＳＯ中で投与した抗原Ｘまたは９μ施例２の】３マーに対して免疫化した。唾液、歯肉、歯肉溝の流体および血清中の抗体力価を測定し１；。

結果を表１に記載し、そしてこれらが示すように、環状１３７−を使用する免疫化は、唾液および歯肉流体の両者中の特異的抗体の存在により実証されるように免疫応答を誘導する。　゛ｌ嵐町上立二量体］　５−−−　（ＳＰｌ　５−２）の合成および特性づけこのペプチドの合成は実施例１のそれに類似する手順によっｔ；。ＰＡＭ樹脂へエステル化した出発物質はＢｏｃ−（４ＭｅＢｚ）−Ｃｙｓであり、そして引き続くアミノ酸はペプチド鎖へ同一の対称無水物化学を使用して付加した。使用したアミノ酸のすべて上の保護基は実施例１に記載されており、そして同一方法で除去した。アミノ酸の付加の順序はＡＡＧＹＴＡＶＧＧＬ　ｌ５ＤＶであツタ。

クロマトグラフィーおよび凍結乾燥後、ペプチドを次のようにして二量体としｔ；。ペプチドをペプチドモノマーの１．Ｏｍｇごとに１．０ｍｇの０．１モルの重炭酸アンモニウム（ｐＨ−７，８中に溶解し、そして室温において一夜撹拌した。インキニベーシ１ン前後の物質を、実施例２に記載するエルマンの方法により、遊離システィンについて試験しｔ；。次いで、ペプチドを凍結乾燥し、そして７ラクトゲルＴＳＫ　　ＨＷ−４０Ｆのカラムのクロマトグラフィーにかけて塩を除去した。ペプチドを凍結乾燥し、そしてアリコートを０．１ｍ１２の脱イオン蒸留水中に再懸濁させた。この溶液を１．２５％の２−メルカプトエタノール（Ｖ／Ｖ＞とじ、そしてｐＨ−７，８に１モルの重炭酸アンモニウムでしＩ；。

次いで、この還元した物質および出発物質を逆相ＨＰＬＣにより、実施例１と同一条件下に、分析して、ペプチドが二量体化され、そして引き統いて線状とされｔ；ことを確証した。

実施例１に量体１７マー（ＳＰ−１７−２）および二量体２１マー（ＳＰ２１−２　の合成および特性づけこのペプチドの合成は実施例１のそれに類似する手順によった。ＰＡＭ樹脂へエステル化した出発物質はＢｏｃ−（４ＭｅＢｚ）−Ｃｙｓであり、そして引き統〈アミノ酸はペプチド鎖へ同一の対称無水物化学を使用して付加した。使用したアミノ酸のすべて上の保護基は実施例１に記載されており、そして同一方法で除去した。アミノ酸の付加の順序は５Ｐ−１７−２についてＡＡＧＹＴＡＶＧＧＬＩＳＤＶＡであり、そして５Ｐ２１−２４：ついてＡＡＧＹＴＡＶＧＧＬＩ　５ＤＶＡＧＡＧＡＧであった。

クロマトグラフィーおよび凍結乾燥後、ペプチドは実施例１０と同一の方法で二量体化した。次いで、ペプチドを、前述のように、遊離システィンおよび還元および引き統＜ＨＰＬＣにより試験しｔ；。

このペプチドの合成は実施例１のそれに類似する手順によった。ＰＡＭ樹脂へエステル化した出発物質はＢｏａ−（４ＭｅＢｚ）−Ｃｙ　ｓであり、そして引き続くアミノ酸はペプチド鋼へ同一の対称無水物化学を使用して付加した。使用したアミノ酸のすべて上の保護基は実施例１に記載されており、そして同一方法で除去した。アミノ酸の付加の順序はＬＡＡＧＹＴＡＶＧＧＬＩ　５ＤＶＡＧＡＡＧＹＴＡＶＧＧＬ　Ｉ　５ＤＶＡＧであった。精製および特性づけは直線の２１マーと同一であった（実施例１）。

実施例１３ウサギを二量体１５マー（ＳＰｌ　５−２）　、二量体２１マー（ＳＰ２１−２）　！タハ３４マー（ＳＰ３４）に対して実施例６におけるように免疫化し！二が、ただしペプチドは担体に最初に結合しなかった。２羽のウサギをペプチドの各々で免疫化した。周期的に、血清をウサギの各々から取り、そして、ＥＬＩＳＡにより、アッセイして抗ペプチド抗体の産生を決定した。アッセイのプレートは免疫原として使用したのと同一のペプチドを含冑し、そしてｌｐｇ／ウェルのペプチドを使用した。

すべての３つのペプチドは免疫原性であり、５Ｐ１５−２および５Ｐ３４についての安定な力価は５Ｐ２１−２についてより有意に高かった。

５Ｐ１５−２および５Ｐ３４についての終点の希釈は１１５１．０００であり、そして５Ｐ２１−２について１／６．４００であった。結果は第４図にグラフで示し、これは合成ペプチドの二量体で免疫化したウサギについての相同性合成ペプチドに対する抗血清力価のプロットである。

開いた円、５Ｐ２１−２；充填した円、５Ｐ１５−２；開いた三角形、５Ｐ３４゜各点は２羽のウサギからの平均を表す。矢印は注射の日を意味する。

実施例１４．　　（ａ）環状１７？−−５Ｐ−１７環状Ｃ−ＧＡ−ＶＤＳ　Ｉ　ＬＧＧＶＡＴＹ−ＧＡ−Ｃ（ｂ）直線の３５７−５Ｐ３５ＧＡ−ＶＤＳ　Ｉ　ＬＧＧＶＡＴＹ−ＧＡ−ＧＡＧＡＧＡ−ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹ　　　　　　　−ＧＡＡの合成実施例１３に記載されているような５Ｐ−１１を、ＣＧＡ残基を各末端に付加し、そして得られる１７マーを塩化アンモニウム中でインキュページ目ンすることによって環化して５Ｐ−１７に転化した。環化した５Ｐ−１７を、実施例１において５Ｐ−２１について記載するようにして精製し、そして特性づけた。

５Ｐ−１１を、また、３ｔｕｎｏ反復ＧＡ単位をアミノ末端におよびＧＡＡＣ残基をカルボキシ末端に付加することによって５Ｐ−２１（そのｉ＋ｉｍはまた実施例１に記載されている）に転化し、次いでその末端のシスティン残基を欠く得られる５Ｐ−２１をその末端のシスティン残基を欠＜５Ｐ−１７の直線の変位型（ＳＰ−１５）とカップリングして、５Ｐ−３５を生成し、これを実施例１において５Ｐ−２１について記載する手順により精ｇａおよび特性づけした。

合成ペプチドのＳＰＩ　ｌ、ＳＰＩ　１−環状（実施例２参照）、５ＰＩ７−環状および５Ｐ３５を、２４週の期間にわたって、ヒト以外の霊長目の動物の歯肉に５または６回適用した。ラジオイムノアッセイにより３０週までの期間にわたる抗体の引き続く検査は、線状または環状の５Ｆｉｌが歯肉の流体１ｇＧまたは唾液のＩｇＡの抗体の有意の増加を誘導しなかつたこを明らかＩニジた。これと対照的に、５Ｐ１７．５Ｐ２１まｔ；は５Ｐ３５は、歯肉流体および唾液中で有意の抗ＳＰならびに抗自ＩｇＧおよび分泌のＩｇＡの免疫応答は、従来の血清抗体応答と関連しなかっｔ；。この免疫応答の機能的作用は、サルに、連銀法１ｆ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ）の着色に導Ｘヒト型の炭水化物に冨んだ食物を与えることにより試験した。対照動物は、ランダムペプチドＣ３ＬＦＶＰＳＥＦＳでにせもの免疫化されていたが、連銀法１！（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ）による脱落性の歯の着色の増大を示し、５Ｐ１７では着色は存在せず、そして５Ｐ２１または５Ｐ３５で免疫化しＩ；動物は着色の有意の減少を示した。これらの実験が示唆するように、連鎖球菌の着色壁の抗原（ＳＡＴ／ＩＪ）のアミノ酸配列から誘導した５ｙｐ（ＳＰ）による局所的免疫化は、合成ペプチドおよび自然連鎖球菌の抗ｊＦ’（ＳＡ）に対する歯肉ＴｇＧおよび唾液ＴｇＡ抗体の二重の局所的免疫応答を誘導する。これらの抗体は、むしばの発生において主要な因子である、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）の着色の防止に参加することができる。

歯肉流体および唾液ＩｇＡ抗体の引き続くラジオイムノアッセイは、５Ｐ１７．５Ｐ２１または５Ｐ３５二量体で免疫化したとき、抗ＳＰ。

ならびに自然抗ＳＡ抗体の有意の増加を明らかにした。抗体の発生は、〜ｌＯ週の最適レベルに到達した唾液のＩｇＡと、はとんど１０週後に現れ、最適レベルが２６週までに到達する、歯肉流体のＩｇＧ抗体との間で顕著に異なった（第５図および第６図）。より高い唾液ＩｇＡ抗体のレベルは、収集の洗浄法が流体をほぼ２００倍に希釈するので、より低い歯肉流体ＩｇＧ抗体に比較出来ない。ペプチド結合直線のＳＦ’１５および５Ｐ２０から成る５Ｐ３５　（システィン残基をもたない）は、構成成分５ＰＩ−７または５Ｐ２１のいずれ１つよりも明らかに免疫原性でなかった。しかしながら、コアＳＰは歯肉流体１ｇＧまたは唾液１ｇＡの抗体の有意の増加を誘導することができなかっｔ；。これは線状まＩ；は環状５ＰＩＩを使用して、ならびに後者をＰＰＤに共有結合するか、あるいはインターフェロンガンマと混合するとき発見された（第５（！ｌおよび第６図）。ランダム５ＰＩＩを使用するごまかし免疫化（ｓｈａｍ−４ｍｍｕｎｉｚａｔ　１ｏｎ）は、唾液ＩｇＡの初期の増加および引き続く減少を示したが、歯肉流体抗逼鎖球菌の抗ＷＩｇＧ抗体は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｕｔａｎｓ）により着色のための自然免疫応答を反映しうる、中程度の増加を示した（第７図）。

血清１ｇＧおよびＩｇＡ抗体の増加は、検出可能であるが、抗体レベルは前身の免疫化との比較により無視できた（表１）。

第６図および第６図の実験の詳細は次のとおりである：第５図および第６図は、４匹のごまかしで免疫化したサル［３フアシクラリス（ｆａｓｃｕｉｃｕｌａｒｉｓ）およびｌムラタ（ｍｕ　］　１　ａｔａ）］の対照群を、本発明の合成ペプチドと既知の相同性をもたない、１１アミノ酸残基のランダム合成ペプチドを使用して、局所的経口的道筋で免疫化したときの結果を示す。６つのマカッカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃｃａ　　ｆａｓｃｕｉｃｕｌａｒｉｓ）および８つのマカッカ・ムラツタ（Ｍａｃａｃｃａ　　ｍｕｌａｔｔａ）の免疫化群に、５ＰＩＩまたは１３（８匹のサル）、５Ｐ１７（２匹のサル）　、ＳＰ２１　（２匹のサル）Ｓよび５Ｐ３５（２匹のサル）を与えた。すべての動物は、ハミルトン注射器により、矢印で示すように６回の別々の場合に製剤学的に適用した合成ペプチド（Ｓ　Ｐ）を有した、ｔ；だし５ＰＩＩ免疫化しｔ；動物にはＳＰを週１，２．４．１６および２４に与えた。ＳＰの濃度は１５０μｇの蒸留および５０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水中の１０ｐｇであり、そしてこれは歯肉の溝に適用し、注意して歯肉への外傷を回避した。ＳＰをその場ｌ；保持するために、シリコーンゴムのトレーを調製し、そしてＳＰの各々の適用後５分に、歯および歯肉に適用した。自然３．８に一５Ａ、５ＰＩＩ、５Ｐ１７．５Ｐ２１，５Ｐ３５またはランダム１１マーに対する抗体は、歯肉流体中のＩｇＧ抗体（１：５希釈）についておよび唾液中のＩｇＡ抗体（１：２希釈）について、固相ラジオアッセイにより、ポリスチレンのウェルおよび４２＆　ｒ　復職親和精製したウサギ抗サル１ｇＧ（Ｎｏｒｉｃ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　　Ｌｔｄ、）またはウサギ抗サルＩｇＡおよび引き統いて１２５位標識抗ウサつＩｇＧ（Ｔａｇｏ　　ＩＮｃ、サンフランシスコ）を、それぞれ、使用して試験した。歯肉流体の洗浄液およびピロカルピン（０゜５ｍｇ／ｋｇ）刺激唾液を所定の間隔で、前述のように、集めた。結果は正味の平均計数７分として、免疫化を減する前に歯肉流体または唾液中で計数後、表す。

第７図は、第５図および第６＠に記載する動物の群（ＳＰＩＩの線状まｔ；は環状免疫化サルを除外する）に、免疫化の開始前２〜４月に、ヒト型の炭水化物に富んだ食物を与えたときの結果を示す。バクテリアのプラークを滅菌プローブで、免疫化の前、間および後に、顎骨の中央の切歯および左の第２脱落性臼歯の裂溝から集めた。試料を移送培地中に入れ、そしてトリプトン−酵母Ｌ−シスチン（ＴＹＣ）培地上で増殖させた。連鎖法ＩＩ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｒｎｕｔａｎｓ）のコロニー形成単位の数を、ＴＹＣ培地上の合計のコロニーの計数の百分率として表す。表されるデータは、示す（ｎ）ように、４〜１７試料の平均（±標準偏差）である。

実施例１５ＡＫＫＡＹＥＥＡＬＡＡＮＴＡＫＣ（ペプチド５２）ＡＫＡＤＹＥＡＫＬＡＱＹＥＫＤＬＡＡＣ（ペプチド６６）ＡＹＥＱＥＬＡＲＶＱＡＡＮＡＡＣ（ペプチド８７）ＡＱＹＥＫＤＬＡＡＡＱＡＧＮＡＣ（ペプチド９４）ＣＦＩＬＳＱＶＰＬＬＧＱＬＳＳＣ（ペプチド９９）ＫＰＲＰＩＹＥＡＫＬＡＱＮＱＫ　　　　　（ペプチド１８８）実施例１の保護および脱保護の方法、精製および特性づけの技術を包含するペプチド合成技術を使用して、ペプチドＡＫＫＡＹＥＥＡＬＡＡＮＴＡＫＣ１５６、ＡＹＥＱＥＬＡＲＶＱＡＡＮＡＡＣ％ＡＱＹＥＫＤＬＡＡＡＱＡＧＮＡＣ，９９および１８８を関連するアミノ酸を関連する順序で使用して調製した。

前記側鎖のための追加の保護基は、次のとおりであった：Ｌｙｓ−Ｃ１ｚ　　２ −クロロベンジルオキシカルボニル（リジン）Ｇｌｕ−Ｂｚｌ　　ベンジル（グルタミン酸）Ａｒｇ−Ｔｏｓ　　４−）ルニンスルホニル（アルギニン）これらの保護基は、また、ペプチド側鎖をアルキル化または酸化から保護する。それらは実施例１に記載するのと同一の条件下に除去される。

５！施例１５のペプチドの特異性の決定寅施４Ａ１５からのペプチドを実施例１６におけるように使用してＢａＩｂ／ｃマウスを免疫化したが、ただしペプチドは担体に結合しなかった。６週にわｌ；る５回の注射後、動物を第７週で出血させ、そして得られる抗体を特異性および量（力価）について実施例７におけるようにＥＬＩＳＡにより試験した。表１は、免疫化に使用したペプチドに対して試験ペプチド当ｔ；９３匹の動物についての、力価の幾何学的平均として結果を示す。

Ｓ、ｍｕｔａｎｓ１０４４９およびＳ、５ｏｂｒｉｎｕｓ６７１５の全面生長の培養物を産生じ、モしてＯ，０１ｍｆｆのアリフートをニトロセルロースのフィルター上で乾燥した。フィルターをマウス血清の１＝１００希釈物とともに、ｍＴ−洗浄液中で、免疫化の前または後に、インキュベーションした。フィルターを洗浄し、そしてホースラディシュペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ネズミ抗体のｌ：２００希釈物とともにインキュベーションした。次いで、マウスの抗体を、ホースラディシュペルオキシダーゼを比色基質４−クロロｌ−す７トールと反応させた後、比色的に可視化することができた。

表１は結果を示す。第２欄は幾何学的平均の力価を記載し、これに対して第３欄は動物の免疫化に使用し！二のと同一のペプチドで刺激したとき、Ｂａ１ｂ／Ｃリンパ球が増殖するかどうかを記載する（参照、寅施ｆｌ１８、第３図）　ｏ　Ｓ　−ｍ−はバクテリアＳ、ｎｏｕｔａｎｓが抗ペプチド抗血清と結合するかどうかを示し、そしてＳ、ｓ、はＳ、５ｏｂｒｉｎｕｓについて同様なことを示す。免疫前の値に比較したとき、十十は最大の比色反応を示し、十は中間であり、そして＋／−はわずかであることをしめす。

表１ペプチド　　　力価　　　　　　Ｔｍ胞　　Ｓ、ｓ、　　Ｓ、ｍ。

５２　　　４０．０００　　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋６６　　　１０．０００　　　　　＋　　　十十　　　十十８７　　　　１００．０００　　　　　　　　＋　　　　　　　十　　　　　　　＋９４　　　　１５．０００　　　　　　＋　　　　十／−＋９９　　　１５．０００　　　　　＋　　　十＋　　　　十＋１８８　　１００．０００　　　　　＋　　　十＋　　　　十十遁Ｂ　　鮪、°２１−マー飢清１８５に一漣櫨琳面の誼厘　　（Ｓｌ）今双マプチドＮのつｆ可の庇否、じｅ＋ｊｔＪるで肖′νＪ庚体１１≦〒コブｔイ本ご欠に夕■ろ→１表ｆＡｊ庄イ黍含熱　３ｊ９に一５Ａ　　　　　　　　　　冶ソ沃ベクプチド補装置の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）Ｊ平成１年８月２５日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００１３７２、発明の名称合成杭むしばワクチン３、特許出願人住　所　イギリス国ロンドン　ニスイー１４、代理人　〒１０７住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補装置の提出年月日１９８９年１月４日６、添付書類の目録（１）　　補装置の写しくｉ１！訳文）　　　　　　　　　　１通用して、Ｓ、ｍｕｔａｎｓの感染に対する保護の手段を提供することができる。それらは、また、ペプチドの精製において、例えば、親和クロマトグラフィーにより使用することができる。

受動免疫化のためのワクチンは、抗体を担体または希釈剤と配合することに調製することができ、そして歯肉に適用することができる。

本発明のペプチドは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生に使用することができる。ポリクローナル抗体は、抗体の産生に普通に使用される大きいまたは小さい動物のいずれであるすることもできる、宿主動物の免疫化を木質的に含む、抗体の産生の普通の方法によりｍ製することができる。通常、本発明のペプチドは免疫原の形態で、例えば、それらを大きい担体ペプチド分子と接合した形態で使用することが必要であり、そして、宿主動物の免疫化後、血液または他の体液を宿主動物から取り出し、そして抗体をそれ自体既知の方法において血液または血漿から回収することができる。

モノクローナル抗体を必要とするとき、本発明のペプチドの免疫原性の形態を適当な宿主の生体内免疫化にあるいは８９７３球の生体外刺激において使用することができ、次いで宿主から取った牌細胞または刺激した８９７３球を骨髄性細胞とそれ自体既知の方法においてハイプリダイゼーシシンして、ハイブリドーマの集団を形成し、これから適当なハイブリドーマを選択し、そしてモノクローナル抗体の産生のために維持することができる。１つの適当な宿主の種はマウスである。

１６、前記ペプチドをマウスまたは他の宿主に注射し、前記マウスまたは他の宿主からの牌細胞を骨髄性細胞と融合してハイブリドーマを産生じ、そして前記ハイブリドーマから抗体を回収することを特徴とする請求の範囲第１３項記載の抗体を産生ずる方法。

１７、請求の範囲第１２まＩ；は１３項記載の抗体および担体または希釈剤を含有することを特徴とする、むしばの抑制のための受動ワクチン。

１８、歯肉への適用に適当な形態の請求の範囲第１７項記載のワクチン。

１９、前記抗体を担体または希釈剤と配合することを特徴とする請求の範囲第１７または１８項記載のワクチンを製造する方法。

２０、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペプチドあるいは請求の範囲第１２まｔ；は１３項記載の抗体あるいは請求の範囲第１０または１１または１７または１８項記載のワクチンを霊長口の動物に投与することを特徴とする、霊長口の動物におけるむしばを抑制する方法。

２１、前記ペプチド、抗体またはワクチンを歯肉へ適用する請求の範囲第２０項記載の方法。

補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年８月２５弔口特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００１３７２、発明の名称合成杭むしばワクチン３、特許出願人住　所　イギリス国ロンドン　ニスイー１アンド・セント・トマス・ホスピタルズ　　　（ほか１名）４、代理人　〒１０７住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正音の提出年月日１９８９年１月１６日６、添付書類の目録（１）補正音の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通されている。３．８Ｋｄの分子量の抗ｊｊ［Ｉ／Ｉ　Ｉの断片は、また、むしばの抑制において有用なであることが知られている。［ギアスジン（Ｇｉａｓｕｄｄ　１ｎ）Ａ、Ｓ、Ｍ、　、レーナー（Ｌｅｈｎｅｒ）、Ｔ、およびエバンス（Ｅｖａｎｓ）　、Ｒ，Ｗ、、「分子量３８００の連鎖球菌のタンパク質抗原の同定、精製および特性づけ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａ　　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　ｗｉｔｈ　　ａ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｗｅｉｇｈｏｆ　　３８００）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５０．６５１−６５８　（１９８３）および欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）０１１６４７２号。杭ｉｆ／ＩＩおよび抗原Ｘの両者はワクチンとして有効であることが示されており、抗ＷＸは歯肉！：適用したときでさえを効である［レーナー（Ｌｅｈｎｅｒ）、Ｔ−、メラート（Ｍｅｈｌｃｒｔ）、Ａ、ｂよびカルドウエル（Ｃａ　Ｉ　ｄｗｅ　Ｉ　１）、Ｊ６、Ｉｂ１ｄ、］、この明細書Ｉ；おいて、ペプチドまたはタンパク質の分子量についての言及は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより計算した分子量を意味する。

本発明は、杭［１または抗原１／Ｉ　Ｉまたは抗Ｗｘの断片と同一であるか、あるいは実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドからなる合成ペプチドであって、抗［１または抗原ｒ／Ｉ　Ｉまたは抗［Ｘの断片と同一であるか、あるいは実質的に同一であるアミノ酸配列を有する前記ペプチドはＳ、ｍｕｔａｎｓ抗１（ＳＡ）を認識する抗体の形成を生体内で誘発することができることを特徴とする、合成ペプチドを提供する。

本発明のペプチドは、有機合成、組み換えＤＮＡ技術により生成する補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年８月２５１１特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００１３７２、発明の名称合成杭むしばワクチン３、特許出願人住　所　イギリス国ロンドン　ニスイー１４、代理人　〒１０７住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正音の提出年月日１９８９年２月３１：Ｉ６、添付書類の目録（１）補正音の写しく翻訳文）　　　　　　　　　１通に）本発明のペプチドは、その産生の方法に依存して、異なる分子量を有することができる。例えば、化学的合成により産生されｔ；ペプチド１１好ましくは３４またはそれ以下のアミノ酸に限定される。同−Ｃペプチドは、組み換えＤＮＡ法により産生ずるとき、より大きし１ペプチドの一部として産生ずることができる。

１つの面において、本発明のペプチドは、好ましくは３．８Ｋｄより小さい分子量の、合成ペプチドの配列、例えば、約６〜約５０アミノ酸単位を含有し、そして抗原ｘ中に存在する抗原決定基を含む合成ペプチドの配列からなり、それゆえ、本発明のペプチドの配列１ま、Ｓ、　ｍｕ　ｔａｎｓを認識し、それを中和し、そしてそれに対して保護する抗体の形成を生体内で誘発することができる。本発明のペプチドの配列１ま約２５以下のアミノ酸単位からなることがとくに好ましく、そしてわれわれの研究は、現在、必要な抗原決定基を含む約６〜約５０アミノ酸単）らなるアミノ酸配列を同定することができる段階まで到達しｔこ。抗ｙｘｔ；ついての引き絖く研究は、それが多分法の配列Ｉを有することを示す：Ｇｌｙ：　　Ａｌａ：　　Ｖａｌ：　　Ａｓｐ：　　Ｓｅｒ：　　ｌｉｅ：　　Ｌｅｕ：　　Ｇｌｙ：請求の範囲 ■、抗原Ｉまたは抗原１／Ｉ　Ｉまたは抗原Ｘの断片と同一であるか、あるいは寅質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドからなる３゜８Ｋｄより小さい分子量の合成ペプチドであって、抗原ｌまたは抗原Ｉ／ＩＩまたは抗ＪＸの断片と同一であるか、あるいは冥質的に同一であるアミノ酸配列を有する前記ペプチドはＳ、ｍｕｔａｎｓ抗原（ＳＡ）を認識する抗体の形成を生体内で誘発することができることを特徴とする、前記合成ペプチド。

２．６〜３４アミノ酸単位を含有し、そして抗原Ｘ中に存在する抗原決定基を含有する請求の範囲第１項記載のペプチド。

３．１０〜３４アミノ酸単位を含有する請求の範囲第１または２項記載のペプチド。

４、配列ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹまたはＧＧＧＶＤＳ　ＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣを含む請求の範囲第３項記載のペプチド。

５、配列ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣ”たはその二Ｊ１体；ＧＡＧＡＧＡＶＤＳ　ＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣを含む請求の範囲第１まｌｄ２項記載のペプチド。

６、配列：ＡＫＫＡＹＥＥＡＬＡＡＮＴＡＫＣ（ペプチド５２）ＡＫＡＤＹＥＡＫＬＡＱＹＥＫＤＬＡＡＣ（ペプチド６６）ＡＹＥＱＥＬＡＲＶＱＡＡＮＡＡＣ（ペプチド８７）ＡＱＹＥＫＤＬＡＡＡＱＡＧＮＡＣ（ペプチド９４）ＣＦＩＬＳＱＶＰＬＬＧＱＬＳＳＣ（ペプチド９９）ＫＰＲＰ　ＩＹＥＡＫＬＡＱＮＱＫ　　　　　　（ペプチド１８８）を有する請求の範囲第１項記載のペプチド。

７、得られる接合体が免疫原性であるように、追加のタンＩくり質ｔ；接合されている請求の範囲第１〜６項のいずれかＬ；記載のペプチド。

８、Ｎ保護アミノ酸またはそのペプチドを力Ｊレボキシ保護アミノ酸またはそのペプチドと順次に反応させてアミド結合を形成し、そして最後に残留する保護基を除去することによって、個々のアミノ酸まｔ；（＝そのペプチドからペプチド鎖を構成することを特徴とする請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペプチドを生成する方法。

９、所望のペプチドの配列をエンコードする宿主細胞のＤＮＡ力）ら発現することを特徴とする請求の範囲第１〜７項のｌ、％ずれ力１Ｌ；記載のペプチドを生成する方法。

１０、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペプチドおよび担体まｔ；は希釈剤からなることを特徴とする、むしばを抑制するｔ二めのワクチン。

１１、歯肉への適用に適当な形態の請求の範囲第１０項記載のワクチン。

１２、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペプチド１；対する抗体０１３、請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体。

１４、前記ペプチドを担体または希釈剤と配合することを特徴とする請求の範囲第１０または１１項記載のワクチンを製造する方法。

１５、前記ペプチドを宿主動物に注射し、そして前記宿主の血清まブ；は他の体の細胞または体液から抗体を回収することを特徴とする請求の範囲第１２項記載の抗体を産生ずる方法。

−一一−−Ｃテ（―＋−ｅ＋＋−ム＋＋ｓｂ＋ｉｗａｗａ、ＰＣＴ／ＧＥＥε１０１００Ｚ３７１−＾−ｍ１ｍ　Ｎ・？ＣＴ／ＧＢ　Ｂε／Ｃ０ｍ３７Ｓ＾　　　２０９４２

Claims

【特許請求の範囲】１、抗原Ｉまたは抗原Ｉ／ＩＩまたは抗原Ｘの断片と同一であるか、あるいは実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドからなる合成ペプチドであって、抗原Ｉまたは抗原Ｉ／ＩＩまたは抗原Ｘの断片と同一であるか、あるいは実質的に同一であるアミノ酸配列を有する前記ペプチドはＳ．ｍｕｔａｎｓ抗原（ＳＡ）を認識する抗体の形成を生体内で誘発することができることを特徴とする、合成ペプチド。２、６〜５０アミノ酸単位を含有する請求の範囲第１項記載のペプチド。３、抗原Ｘ中に存在する抗原決定基を含有する請求の範囲第１または２項記載のペプチド。４、１０〜３４アミノ酸単位を含有する請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のペプチド。５、配列ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹまたはＧＡＧＡＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣを含む請求の範囲第４項記載のペプチド。６、配列ＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣまたはその二量体；ＧＡＧＡＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＣの二量体；またはＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡＬＣを含む請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のペプチド。７、配列：ＡＫＫＡＹＥＥＡＬＡＡＮＴＡＫＣ（ペプチド５２）ＡＫＡＤＹＥＡＫＬＡＱＹＥＫＤＬＡＡＣ（ペプチド６６）ＡＹＥＱＥＬＡＲＶＱＡＡＮＡＡＣ（ペプチド８７）ＡＱＹＥＫＤＬＡＡＡＱＡＧＮＡＣ（ペプチド９４）ＣＦＩＬＳＱＶＰＬＬＧＱＬＳＳＣ（ペプチド９９）ＫＰＲＰＩＹＥＡＫＬＡＱＮＱＫ（ペプチド１８８）を有する請求の範囲第１項記載のペプチド。８、得られる接合体が免疫原性であるように、追加のタンパク質に接合されている請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のペプチド。９、Ｎ保護アミノ酸またはそのペプチドをカルボキシ保護アミノ酸またはそのペプチドと順次に反応させてアミド結合を形成し、そして最後に残留する保護基を除去することによって、値々のアミノ酸またはそのペプチドからペプチド鎖を構成することを特徴とする、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のペプチドを生成する方法。１０、所望のペプチドの配列をエンコードする宿主細胞のＤＮＡから発現することを特徴とする、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のペプチドを生成する方法。１１、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のペプチドおよび担体または希釈剤からなることを特徴とする、むしばを抑制するためのワクチン。１２、歯肉への適用に適当な形態の請求の範囲第１１項記載のワクチン。１３、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。１４、請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗体。１５、前記ペプチドを担体または希釈剤と配合することを特徴とする、請求の範囲第１１または１２項記載のワクチンを製造する方法。１６、前記ペプチドを宿主動物に注射し、そして前記宿主の血清または他の体の細胞または体液から抗体を回収することを特徴とする、請求の範囲第１３項記載の抗体を産生する方法。１７、前記ペプチドをマウスまたは他の宿主に注射し、前記マウスまたは他の宿主からの脾細胞を骨髄性細胞と融合してハイプリドーマを産生し、そして前記ハイプリドーマから抗体を回収することを特徴とする、請求の範囲第１４項記載の抗体を産生する方法。１８、請求の範囲第１３または１４項記載の抗体および担体または希釈剤を含有する二とを特徴とする、むしばの抑制のための受動ワクチン。１９、歯肉への適用に適当な形態の請求の範囲第１８項記載のワクチン。２０、前記抗体を担体または希釈剤と配合することを特徴とする、請求の範囲第１８または１９項記載のワクチンを製造する方法。２１、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のペプチドあるいは請求の範囲第１３または１４項記載の抗体あるいは請求の範囲第１１または１２または１８または１９項記載のワクチンを霊長目の動物に投与することを特徴とする、霊長目の動物におけるむしばを抑制する方法。２２、前記ペプチド、抗体またはワクチンを歯肉へ適用する請求の範囲第２１項記載の方法。