JPH07504409A - ウィルス因子のタンパク質に免疫学的に近縁するペプチド及びその生物学的利用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス因子のタンパク質に免疫学的に近縁するペプチド及びその生物学的利用 本発明はウィルス因子のタンパク質に免疫学的に近縁するペプチド、即ち、その 免疫学的性質の観点で、ウィルス性病理に関与するタンパク質の類似体又はこれ らのタンパク質に対して生成された抗体を構成するペプチドに関する。

更には、特に診断、予防及び治療目的のためのこれらのペプチドの生物学的利用 に関する。

免疫学的アプローチは主に、感染性因子、又は更には自己免疫にとって重要な生 体の細胞もしくは細胞外構成物が関与するヒト又は動物の病理の処置又は診断法 の確立に利用されていることが知られる。

本明細書及び請求の範囲の中で用いられている「感染性因子」なる表現はウィル ス性病原因子を意味し、この語はレトロウィルス因子又はこの因子により感染さ れた細胞をも包括する。

この免疫学的アプローチは感染性因子を特異的に認識することのできる、又は生 体の免疫応答を誘発することのできる、自己抗体をも含む抗体の利用を頼りとす る。

一般に抗体は、事前に不活性化された感染因子に対する、又はこの因子から精製 したタンパク質に対する動物の免疫により生産される。

しかしながら、このプロセスはしばしば費用がかさみ、そして感染因子の生産及 び単離、並びにタンパク質の精製のための精巧な技術の利用を必要とする。

更に、特定の毒性因子の場合、これらの手順は非常に厳密な安全規則に従わねば ならない実験理論を必要とし、このことはこの手順を更に費用のかさむものとす る。

治療法において有用となるため、抗体は感染因子に対するインビボでの中和作用 を有さねばならないとみなされる。

しかしながら、数多くの病理状況において、循環している又は誘発された抗体は 抗原性タンパク質に対するかかる作用を有さない。

この問題は、通常ＡＩＤＳ　（後天的免疫不全症候群）と呼ばれるヒトにおける ウィルスＨＩＶにより誘発された病理の場合において特に重要である。ＨＸＶに よる感染症の種々の臨床段階には、感染細胞の死を招くような、１４９２８球の レセプターＣＤ４に対するウィルスの極端な親和性に由来する、免疫系における 重大な変化が事実正続（。

更に、その他のタイプの細胞がＨＩＶにより感染される。

旧■は一般に、最近になってヒトから単離されたＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２型の レトロウィルス、並びにサルから単離され、ＨＩＶ−１及び旧Ｖ−２とは異なる ＳＩＶ型レ型口トロウィルスにはその重大な数の変異体を意味することを念頭に お（べきである。

旧■に対するワクチンの製造にかかわる研究は主にＨＩＭのタンパク質から単離 したウィルス抗原又はそのフラグメントの利用を目標とする。感心は、主に遺伝 子ＥＮＶによりコードされるウィルスのエンベロープの糖タンパク質ｇｐ１６０ 　（ｇｐ１２０／４１）又はそのフラグメントに当てられている。より近年、実 験的なワクチン化が遺伝子ＧＡＧ（及びＰＱＬ）によりコードされるタンパク質 のようなウィルスの内部構成物を用いることによりアプローチされている。

霊長類を含む様々な動物モデルがそれらの試験に用いられている。

ＨＩＶによる感染に対する一定の防御作用が、このウィルスの接種されたサルの ケースにおいて観察された。しかしながら、これらの結果は、これらの動物がＡ ＩＤＳを発症することがない事実を考慮した注意を考慮せねばならない。

ヒトにおける実質的なワクチン化は、主に遺伝子ＥＮＶに由来するタンパク質又 はペプチドにより現状試験されている。

しかしながら、かかるワクチンの効果は確立することからはかけ離れており、そ してＡＩＤＳに対するワクチンの開発は数多くの問題を有する。例えば、主たる 問題は血清陽性対象体及び患者におし）で、循環抗体のほとんどが、ウィルスを 中和できない及び／又は患者の身体の中でウィルスを運ぶ細胞を排除できないと いう事実にある。

一定の循環抗体はインビトロでは中和因子であるが、生体の中でのその防御作用 は有効とされていない。

他の免疫学的アプローチは、抗原の本質的なイメージ、即ち抗−イディオタイプ 抗体を作り上げ、次いでこの新たな構造体を抗原自体の代りとして利用すること より成る（本明細書の最後に挙げた参考文献の中の（１）及び（２）を参照のこ と）。

抗原の本質的なイメージを介するかかる免疫化は様々な段階を必要とする。

まず第一に、抗原により免疫化を誘導することを必要とする。これはこの抗原に 対する抗体Ａｃｔ、又はイディオタイプ抗体の生産を可能とするであろう。

次に、この第一抗原の本質的なイメージを有する抗イデイオタイプ抗体ＡＣ２を 誘発するためにイディオタイプ抗体ＡＣＩで免疫化しなくてはならない。抗原の この本質的なイメージは、この抗原の抗体ＡＣＩに結合する領域に対応する。

最後に、抗イデイオタイプＡＣ２による免疫化は抗−抗−イディオタイプ抗体Ａ Ｃ３の生産を可能とする。このような抗体ＡＣ３は第一抗原（１，２）と反応す ることができる。更に、この抗−イディオタイプＡＣ２はリンパ球を活性化する ことができ、これにより、この抗原によりこれらの細胞を直接活性化させた場合 、このリンパ球は第一抗原を認識することができるようになるであろう。

抗−イディオタイプＡＣ２の誘発は、細胞性免疫にとって重要な感作Ｔ細胞のレ セプターに対して獲得することもできつる。同時にＴリンパ球を作ることも事実 上可能であり、この場合そのレセプターはウィルス又は感染細胞の表層において 発現した外来性決定基、及びＭＢＣ（主要組織適合性複合体）型の細胞性決定基 を認識することができる。従ってこのケースは感作リンパ球に関連する。

この第一段階の際、これらのリンパ球のＲ１レセプターは、抗体ＡＣＩのそれと 類似の機能を事実１有するイディオタイプに相当する構造を示す。

次にこのようにして感作せしめたリンパ球（又はその膜レセプターＲ１）による 免疫は、抗−イディオタイプ抗体ＡＣ２と、この抗体ＡＣ２に類似し、且つ抗原 との結合に関与するＲ１リンパ球レセプターのドメインに対して特異的である又 は認識するレセプターＲ２を有するリンパ球との両者の生産を可能とする。最後 に、このＲ２リンパ球レセプター又はＡＣ２抗−イディオタイプ抗体は新たなリ ンノく球応答を誘発でき、そのＲ３レセプターは第一抗原を認識できる（１）。

抗原の本質的なイメージのこの利用はリンパ球感作のメカニズムに影響を及ぼす ことで特に興味深い。それに由来する主たる利点は、本質的なイメージを有する 感作リンパ球による抗原の認識が免疫宿主の遺伝的性質に依存しない事実にあり 、その理由は、感染標的細胞又はウィルスのＣＭＨの同定の限定されたコントロ ールはその破壊に対して何らの妨げをも示さないからである（２）。

結局、第一抗原と交差反応することのできる、抗−イデイオタイプに対して特異 的な抗体は、８９２３球及び１９２８球がかかわる免疫を誘発することができる 。

ところで、免疫欠陥障害の予防又は処置における抗原の本質的なイメージのベク ターとしての抗体又は抗−イディオタイプリンパ球レセプターの利用は危険がな いわけではない。

事実、生体を利用するうえで、抗−イディオタイプの注射を抱括する処置のとき 、特に注意が払われる（２）。例えば、ギニアビッグにおいて、抗−イディオタ イプ抗体（ＡＣ２）の一定の両分、例えば補体を捕捉することのできるサブ−ク ラスＩｇＧ２の存在は、補体を捕捉することのできないＩｇＧ１による抗−抗− イディオタイプ（ＡＣ３）抗体の生産にやや抑制的な作用を及ぼす。このＩｇＧ の両サブユニットは同じ血清の中に存在している。ＡＣ２抗体の免疫抑制作用に かかわる不都合さの他に、免疫障害を避けるために抗体の非常に弱い用量（マウ スにおいては１０ｎｇ程度）を、静脈内ではなく、皮下的に投与せねばならない 。

ワクチン及び治療法の問題に対する伝統的な免疫学的アプローチ理数学的処理を 基礎とする免疫分子を獲得するための別の方法について探索した。

タンパク質の情報分析、略してＩＡＰ（ｒ共鳴認識モデル（ＲｅｓｏｎａｎｔＲ ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｍｏｄｅｌ）Ｊ　ＲＲＭ）の技法を基礎とする、フーリ エ変換法（略してＭＦＴ）を用いる、特に「迅速フーリエ変換」　（略してＦＦ Ｔ）を用いる研究は、同一のレセプターと相互作用するタンパク質の群が、この 群及びレセプターに共通する周波数又は周期を示すことを事実上手した。

以下の説明及び請求の範囲に省けるフーリエ変換及びフーリエスペクトルについ ての全ての言及はＦＦＴ及びＦＦＴスペクトルを包括している。

参考文献３の中に詳しく説明されているこのＩＡＰ技法は数多くの配列を用いて のタンパク質の一次構造のモデルを基礎とし、各アミノ酸に、タンパク質の生物 活性にかかわる物理化学特性を表わす特定のパラメーターを授けることによる。

最良の関係は、各アミノ酸の非局在電子エネルギーにかかわるパラメーターを用 いて得られた。このエネルギーはアミノ酸の特徴である様々な物理化学パラメー ター、例えば非局在電子の擬ポテンシャル電子イオン相互作用（ＰＥＩＩ）に従 って算定されうる（４．５）。

これらの値にフーリエ変換を適用することにより、オリジナルの数値配列と同じ 情報を保有するスペクトルを獲得することが可能である。

この理論的アプローチは、巨大分子の一次構造伝いの非局在電子エネルギー分布 と、その生物学及び生物認識機能との間にある関係を分析するうえでそれ自体が 大いに感心かもたられるようにする。

従って、かかる技術を利用し、数百種のタンパク質を比較することにより、フー リエスペクトルにおける種々の周波数がその種々の生物機能に関連すること、及 び同一の生物機能にかかわっている配列が同一の周期的な特徴を示すこと、が示 された。

同一の生物機能を有するタンパク質のフーリエスペクトルを掛は合わせることに より、ｌもしくは複数のピークにより認められる、その生物活性の特徴である、 ｌもしくは複数の共通の周期的要素、又はｌもしくは複数の共通の周波数が観察 できつる。

かかる周波数は、例えばペプチドホルモン及びそのレセプターにおいて検出され た。

本発明者による、ヒト又は動物の生体にとって外来性であるが、ウィルス抗原を 認識する抗体を誘発せしめることのできる新たな分子の探索のためのこの理論的 アプローチの利用は、複数のタンパク質に共通する特徴的な、又は主要な周期的 要素を、この認識反応に関して免疫学的に活性なペプチドの生産のための基礎と して利用できうることを示した。

従って、本発明の目的はかかるペプチド、即ちウィルス因子のタンパク質の類似 体、又はこれらのタンパク質に対して生成された抗体の類似体、即ち免疫原性の 見地からタンパク質及び抗体を擬態することのできるペプチドを生産することに ある。

特に、本発明は、このような因子に対して抗原性であり、抗体との結合性部位に 相当する又はそれを含むタンパク質の本質的なイメージの類似体であるペプチド を製造することにある。

本発明の更なる目的は、標的抗原に対する所望の免疫原性に従ってペプチド配列 を増やすため及び合成によりペプチドを容易に獲得するための、これらのペプチ ドを獲得する手順を供することにある。

本発明はまた、これらのペプチドの生物学的利用、特にその診断、予防及び治療 の補助における利用に向けられている。更に、本発明は一般に、抗体を誘発する ことのできるペプチド、又は自己免疫抗体及びそれらを破壊することにより自己 免疫リンパ球を認識できるリンパ球を作ることにより、自己免疫の処置を可能と する。

ウィルス因子のタンパク質に免疫学的に近縁する本発明にかかわるペプチドは、 それらが、 標的抗原であってそれに対する抗体又は特異的なリンパ球を作り出すことが所望 されている抗原のアミノ酸配列に関してＩＡＰ数値技法により決定された、 ウィルス因子のタンパク質の配列とは異なる、フーリエスペクトルにおいて、こ の標的抗原の特徴である周波数と事実上位た値の１又は複数の周波数を示す、ア ミノ酸配列を含んで成る、又はそれらより構成されることを特徴とする。

ＩＡＰ技法により決定されたペプチドは人工ペプチドであり、その配列は標的抗 原のそれと、その抗原に共通して存在している一定の生物学的活性の特徴的な（ 複数の）周波数を基礎として確立されていることを強調すべきである。

「標的抗原」なる表現は、ウィルス因子により発現されるタンパク質、又はその タンパク質のフラグメント、そのタンパク質にもしくはそのタンパク質のフラグ メントに対して作った抗体、又は更には自己免疫病理のケースにおいて保護すべ き抗原、又は更にはペプチドであってそのアミノ酸配列がＩＡＰ数値法から逆に 決定されたものを意味する。

「特徴的な周波数」なる表現は、分析したフーリエスペクトルの中での主要な（ 複数の）周波数を意味し、それは標的抗原又は保護すべき抗原との免疫反応性に 結び付いており、そして抗原性特性の観点に関連する情報を育することが認めら れる。

明細書及び請求の範囲の中で用いているが如きの共通周波数についての言及は、 調べた配列の周波数が同−又は似た値を育することを意味する。

本発明は特に、そのフーリエスペクトルにおける（複数の）周波数が、標的抗原 の特徴的な（複数の）周波数のそれと逆相（ｉｎｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅ）とな っているペプチドの群を狙いとする。

本発明は更に、そのフーリエかスペクトにおける（複数の）周波数が、標的抗原 の特徴的な（複数の）周波数のそれと同じ相（ｉｎｐｈａｓｅ）となっているペ プチドの別の群を狙いとする。

同じ科のペプチドはそれらの間で、同じ（複数の）周波数及び同異なり、同様に それの標的抗原との関係も互いに異なる。

標的抗原はウィルスタンパク質又は少な（とも−の抗原部位を有しているかかる タンパク質のフラグメントより成りうる。

群Ａのペプチド、例えばウィルスタンパク質に関して決定されたものは、そのペ プチドが、フーリエスペクトルにおいて、ウィルスタンパク質に共通するが、逆 相であるそのタンパク質の特徴的な周波数を示すこと、及びそれらが同じ群のメ ンバーと交差反応する抗体を誘発できることを特徴とする。

これらの抗体は、実施例の中で詳しく開示したようなＥＬＩＳＡ又はウェスタン プロット技術を利用することにより、それらの形成のもととなるものとは異なる が、スペクトル特徴を共有するペプチド構造体を認識することができることが認 められた。

逆に、ペプチド科の一定のペプチド構造体は、別のペプチドの科に対して生成さ れた抗体と、抗原−抗体型複合体を供することができる。

群Ａのペプチドにより誘発された抗体はウィルスタンパク質の本質的なイメージ 、より正確には抗原−抗体型の反応にかかわるこのタンパク質のドメインの類似 体であることに注目すべきである。

本明細書及び請求の範囲の中で用いているような「タンパク質の本質的なイメー ジの類似体」なる表現は、本発明にかかわるモデル化手段として用いたＩＡＰ法 により獲得したデーターを意味する。

本発明の別の観点において、標的抗原（それによりペプチド配列を決定する）は 群Ａのペプチドより成る。

群Ａのペプチドに対して決定された群Ｂのペプチドは、前記ペプチドが、そのフ ーリエスペクトルにおいて、ペプチドＡの特徴に共通する１又は複数の周波数を 、ペプチドＡのうちのいづれかに対して逆相であるが、標的抗原（これに対して 群Ａのペプチドが決定された）のそれと同じ相において示すことを特徴とする。

群Ｂのペプチドは、ペプチドＡを決定するための対照として用いた標的抗原の本 質的なイメージの類似体であることに注目すべきである。

本明細書及び請求の範囲の中で用いた類似体なる語は、関与する産物が免疫学的 に近縁していることを意味することを念頭に置くべきである。

生物学的用途を考慮する限り最も興味深い見地の一つは、群Ｂのこのようなペプ チドは、例えばウェスタンプロット技術により示されるように、感染因子により 示されるものと同一の（複数の）周波数のタンパク質との免疫複合体をできる抗 体を誘発することができる事実にある。これらの抗体はＡ型ペプチドにより誘発 された抗体に対応しつる。

群Ｂのペプチドは更に、ＣＤ４に対して特異的な、自己抗体又は自己免疫リンパ 球を認識する抗体又はリンパ球をも誘発できる。

本発明の態様に従うと、上記のペプチドＢはより詳しくは、陰性ＲＮＡを有する ウィルス、陽性ＲＮＡを有するウィルス、二本鎖ＲＮＡを有するウィルス、又は 更にはＤＮＡウィルス、例えばヘルペスもしくはサイトメガロウィルス、及びそ れらの変異体により発現されるタンパク質の類似体を構成する。

本発明は特に上記のペプチド、レトロウィルスのタンパク質の類似体又はこれら のタンパク質に対して生成した抗体を狙いとする。

レトロウィルスとしては、細胞病理力を有するレンチウィルス、そして特に旧ｖ １特にＨｎ−１及びＨＩＶ−２（ヒトにおける病因）、ＳＩＶ　（サルニおける ）、ｖＩＳＮＡ（ヒツジにおけル）　、　ＣＡＥＶ　（ヤギにオケル）、ＥＩＡ ■（ウマニオケル）、ＦＩＶ　（ネコニおける）、ＢＩＶ（ウシにおける）、並 びにそれらの変異体が挙げられつる。

その他のレトロウィルスにはオンコウィルス、例えばＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ −２（ヒトから単離）、並びに白血球及び癌にかかわる動物レトロウィルスが挙 げられる。

最も興味深いことには、本発明は、ＨＩＶ−１により発現されたタンパク質の中 で選ばれたタンパク質の配列に対するＩＡＰ技法により決定されたようなアミノ 酸配列を含んで成る、又はそれより構成されるペプチドを特徴とする 特別に考慮されるタンパク質は、レトロウィルスに共通する遺伝子ＧＡＧ、　Ｐ ＯＬ及びＥＮＶによりコードされるもの、そしてより特別にはｇｐ１６０　（工 ：／　ヘｏ−ブＥＮＶ（７）前駆体）　；　ｇｌ）１１０／１２０　（ＥＮＶ） 　；　ｐ６６／６８（逆転写酵素ＰＯＬ）　、ｐ　５５　（前駆体内部タンパク 質ＧＡＧ）　；ｐ　５１／　５２（ＰＯＬ−プロテアーゼ）　；　ｇｐ４１（Ｅ ＮＶ）　；　ｐ４０（ＧＡＧ、前駆体内部タンパク質）　、ｐ３１／３４（ＰＯ Ｌエンドヌクレアーゼ）　、り２４／２５（ＧＡＧ、前駆タンパク質）　；　ｐ １７／１８（ＧＡＧ、内部タンパク質）である。

通常の表示に従い、ｇｐは糖タンパク質を意味し、ｐはタンパク質なる語のため に用い、そして数字はゲルの中でのこれらのタンパク質の泳動により確立され、 且つ対応の遺伝子の配列分析により確認された分子量に対応する。

本発明によれば、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、前記のＨＩＶのタンパク 質の配列のうちの一つに対するＩＡＰ法による決定に従い、これらのタンパク質 に共通する少なくとも−の特徴的な周波数を示す。

多大に注目されるペプチドは、ＨｒＶ−１の遺伝子ＥＮＶ及びＧＡＧによりそれ ぞれ発現される標的タンパク質ｇｐ１６０／１２０及びｐ５５（並びにタンパク 質ＰＯＬ、　ｐ６６／６８、例えば科ＬＡＶｂｒｕのそれ）、又はそれらより誘 導されたタンパク質及びそのフラグメントにより共通して示されるものに対応す る、０．１８５５に相当するか又はそれに近い値の少なくとも一周波数を有する フーリエスペクトルを示すアミノ酸配列を有する。

他のペプチドは、例えばレセプターＣＤ４への結合に関与するｇｐ１２０のフラ グメント（以降、フラグメントｇｐ１２０ｃＤ４と称する）により示されるよう な、０．２１８８に相当する又は事実上相当する周波数を示す。

特に、本発明は実施例に例証する通り、このフラグメントの配列に対するＩＡＰ 技法により決定されたようなアミノ酸配列を有するペプチドを狙いとする。

有利なペプチドは上記の群Ａのペプチドであり、それらはフラグメントｇｐ１２ ０ｃＤ４の特徴的な周波数を育するフーリエスペクトルを示すか、又は必要なら ば２つの周波数を示すが、それらはそのフラグメントの相とは逆相となっている 。

その他の好都合なペプチドは群Ｂのそれであり、これは群Ａのペプチドの（複数 の）周波数と逆相である特徴的な（複数の）周波数のフーリエスペクトルを示す 。

かかるペプチドはフラグメントｇｐ１２０ｃＤ４の特徴的な（複数の）周波数と 同じ相を示す。

更に、それらは同じ群のメンバーと交差反応する抗体を誘発できることが認めら れた。

詳しくは、それらは下記の実施例に記載の如きのＥｌｉｓａ試験及び／又はウェ スタンプロットの条件においてフラグメントｇｌ）１２０ＣＤ４の領域の一定の 部分を認識する抗体を誘発することができる。

本発明の実施のその他の態様は、その免疫学的認識が所望されるウィルス因子の 基礎として、当業者により容易に実施できつる。前記ウィルス因子は例えばネコ 白血病ウィルス（略してＦＬＹ）　、エンベロープポリプロティンの前駆体（１ ０）、　（１４）　、このポリプロティン（１１）、　（１２）、　（１３）、 　（１５）もしくはフラグメント、又は更にはＴ細胞白血病ウィルス、ＨＴＬＶ −１もしくはＨＴＬＶ−ＩＦ、前記ウィルスのエンベロープポリプロティン（１ ６）、　（１７）　、もしくはそのフラグメント、又はビスナウィルス、特にエ ンベロープポリプロティン、その前駆体（１８）　、もしくはそのフラグメント でありうる。

そこで、本発明は、上記のウィルス因子のいづれかのタンパク質又はフラグメン トの一定の配列に対するＩＡＰ技法に従って決定された、群Ａの人工ペプチド、 及びペプチドＡに対して決定された群Ｂの人工ペプチド、並びにこのペプチドに 対して特異的な抗体を提供する。

更なる別の態様において、本発明は自己免疫抗体及び自己免疫リンパ球に対して 特異的な抗体を誘発することのできるペプチドを提供し、そして更にこれらの抗 体に類似するペプチドの配列を提供する。

このタイプのペプチドは、それらが、ＨＬＡ　−ＤＲの配列又は更にはインター ロイキン２のそれに類似なウィルス配列に対するＩＡＰ技法により決定されたア ミノ酸配列をそれらの配列の相に対して逆相において含んで成る又は構成される 事実、及びそれらが、ＨＬＡ−ＤＲ及びインターロイキン２のそれぞれの配列に 対して特異的な抗体（又はリンパ球）を認識する抗体（又はリンパ球）を誘発で きる事実を特徴とする。

本発明のペプチドは、第一因子により生ずる・感染症に基づく病気を発症せしめ ることのできる感染因子のタンパク質に対して特異的な免疫原性を供しうること に興味をもって注目すべきである。

これは、患者がいわゆる日和見感染に敏感となる。ＨＩＶ感染症においてよくあ るケースである。例えば、ヘルペス又はマイクロプラズマ（細胞壁のない細菌） の科に属する曲ｖ６ウイルスはＨＩＶにより感染した対象体において検出されつ る。

従って本発明は、上記した通り、かかる感染因子のタンパク質と免疫複合体を形 成することのできる抗体を誘発できる、又はこれらのタンパク質とそれ自身が反 応できるペプチドを特に狙いとする。

更に本発明は、上記した通り、感染因子のタンパク質と反応できるリンパ球を誘 発できる人工ペプチドを狙いとする。

別の観点より、本発明における他のペプチドは例えばＩＡＰ技法により決定され た特定のアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列により発現されるような ものである。

これらのヌクレオチド配列は、それも本発明の一部を構成する新規なる生成物で ある。

そこで、本発明は、上記のペプチドについてのコード配列を含んで成る又はそれ より構成されることを特徴とするポリヌクレオチドのフラグメントを狙いとする 。これらの配列は様々でありうることを強調すべきであり、特にその理由は、遺 伝コードの縮重、及び異なるコドンによる同一のアミノ酸のコード化にある。

本発明の他のポリヌクレオチドは、上記の配列に対して相補性の配列、又はペプ チド配列から推定した配列のヌクレオチドと相補性なヌクレオチド配列の一つと ハイブリダイズするヌクレオチド配列に相当する、又はそれらより構成される。

本発明において特に狙いとされるヌクレオチド配列は、群Ａのペプチド配列をコ ードするものに相当する。　゛本発明において特に狙いとされるその他のヌクレ オチド配列は、群Ａの配列をコードするものに相当する。特に、ＨＩＶのタンパ ク質に免疫学的に近縁な配列をコードするものが挙げられつる。

その他の好適な配列は、群Ａ又は群Ｂのペプチドをコードできる配列に相補性な ヌクレオチド配列に相当する。前記の相補性配列によりコードされるこのような ペプチドは新規の生成物であり、そしてこれも本発明の一部を構成する。

前記ペプチドは本明細書及び請求の範囲の中では文字ｃ、ｃＡ及びｃＢで表示さ れ、ここでそれぞれは、その配列が群Ａ又はＢのペプチドに対応するＡＲＮ配列 の一つに相補性なＡＲＮ配列から推定され、且つ遺伝コードを用いて決定されて いるペプチドを表示している。

ペプチドｃＡはペプチドＢのサブ群を構成し、そしてペプチドｃＢはペプチドＡ のサブ群を構成していることがわかるであろう。最後に、ペプチドｃＡ及びｃＢ のそれぞれをコードできるものに相補性な配列によりコードされるタイプＡ及び Ｂのペプチドも本発明の範囲に属する。この種のペプチドは実施例に挙げており 、そしてペプチドＡｌｌ及びＢｌｌで表示している。

非常に有利な態様において、上記のヌクレオチドフラグメントは、一定用途にと って特に注目されている生物活性を有するｌ又は複数のタンパク質をコードする ｌ又は複数の配列より更に構成されている。

本発明の中には、遺伝子工学の技術の中、で一般的に利用され、且つ上記のコー ドヌクレオチド配列を保有する、発現ベクター、即ちプラスミド又はファージ、 及び形質転換又はトランスフェクトされたその細胞宿主も含まれる。

上記した通り、本発明のペプチドは同一のグループのメンノく−と交差反応する 抗体を誘発できる。

これらの抗体は新規の生成物であり、そしてこれも本発明の一部を構成する。

本発明は上記のペプチドを獲得するための方法も狙いとする。

この手順に従うと、合成により、　ＩＡＰ技法により決定されるアミノ酸の鎖を 、標的抗原のアミノ酸配列の基礎として、及びノくラメ−ター、特に標的抗原の 特徴的なｌ又は複数の周期的な要素の基礎として獲得できうる。

特徴的なパラメーターとして、フーリエスペクトルにおけるいくつかのタンパク 質に共通する（複数の）主要周波数を好適に決定する。このために、標的抗原の アミノ酸配列の数値分析を、その配列の各アミノ酸を適当な数値に置き換えるこ とによって利用し、この一連の値のフーリエ変換を利用し、そしてそれらの間で 、標的抗原及び同一の群もしくは科の、又はその抗原と同じ生物活性のタンパク 質について獲得したフーリエスペクトルを掛は合わせ（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）、こ れによりタンパク質の群又は一定の生物活性の群に特徴的な１又は複数の共通周 波数を推定する。

数値として、好ましくは各アミノ酸残基の非局在化電子エネルギーの当量を示す 値、特に電子とイオンと間での相互作用のポテンシャルに対応する値を利用する 。

本発明の一観点に従うと、考慮されるペプチドの配列は、ウィルス因子のタンパ ク質又はタンパク質フラグメントの配列を基礎として、免疫反応性認識を決定し てしまうそのタンパク質又はそのフラグメントの特徴的な（複数の）周波数を考 慮しながら決定する。

別の態様において、対照として、上記で決定したペプチド配列を利用する。

原の（複数の）周波数のそれに対して反対にする。

新たな相の反転を、標的抗原のイメージ（その配列は群Ａのペプチドのそれに対 して決定されている）に類似な群Ｂのペプチドを作るために行う。

ありがたいことに本発明により、標的抗原に対して特異的なイデ抗−抗一イディ オタイプ抗体に類似なペプチドを製造することが可能である。別の面では、本発 明は標的抗原のイメージに類似なペプチド、即ち抗−イディオタイプ抗体の類似 体を供給する。

抗体の類似体を獲得するためのこの手順を利用することにより、前述のイディオ タイプ抗体ＡＣＩ及び抗−イディオタイプ（抗体）ＡＣ２の追尾生産を避けるこ とが可能となり、そしてその投与の際、抗体の注射にかかわる免疫抑制又はその 他の免疫障害についての不都合を避けることが可能となる。

ペプチド配列の合成は伝統的な技術に従って好適に実現される。

上記した通り、これらのペプチドは同一の群のメンバーと多差反応する抗体を誘 発できる。

このような抗体を獲得する方法も本発明の一部を構成する。伝統的な方法におい て、上記の人工ペプチドを用いて動物を免疫化し、次いでポリクローナル抗体を 保有する抗血清を回収できる。所望するならモノクローナル抗体を、Ｎａｔｕｒ ｅ　１９７５．　ｖｏｌ、２５６、頁２９５に記載のＫｏｈｌｅｒとＭｉ　１ｓ ｔｅｉｎの技術を好適により利用することにより獲得できつる。

本発明の核酸のフラグメントは好適に伝統的な合成法により、例えばホスホラミ ドの技術を用いる市販の合成装置を用いて獲得できつる。それらは適当な長さの 配列のプライマーを用いるＰＣＲ増幅技術により獲得することもできる。この遺 伝増幅の技術は米国特許第４、６８３．１９５及び４．６８３．２０２号に記載 しである。

本発明のヌクレオチドフラグメントより作られたこれらのプライマーは上記の人 工ペプチドの合成のために利用できつる。

例えば、本発明のペプチド合成のかかる手順はヌクレオチド配列の化学合成、又 はこれらの配列を少なくとも一組の適当なプライマーと接触させ、続いて増幅さ れた配列を翻訳する通常の方法による、一定のペプチドをコードできるヌクレオ チド配列の増幅を含んで成る。

この最後の工程は、増幅配列を含むベクターを用いて有用な宿主細胞を形質転換 させ、次いでその宿主細胞において生産されたペプチドを回収することにより好 適に成し遂げられる。

ＥＬＩＳＡ又はウェスタンプロットのような伝統的な免疫技術を利用する本発明 のペプチド及び抗体の分析は、同一の周波数及び相の分子の生物学的認識におい てその高い特異性を示す。

従って、本発明は、一方ではウィルス因子のタンパク質に対して生成された抗体 を特異的に認識することのできるペプチド及び抗体の科、そして他方では、ウィ ルス因子のタンパク質を特異的に認識することのできるペプチド及び抗体の科の 製造を可能とする。

第一の科は、群Ａのペプチド及び群Ｂのペプチドに対して誘発した抗体、ウィル ス因子のタンパク質の内部イメージに対する類似体である。前記第−科はペプチ ドＢのサブ群を構成するペプチドｃＡも含んで成る。

群Ａのペプチド（それに対して抗体が生成される）は例えば、研究すべき病理に 包括されるウィルス因子のタンパク質配列に関して上記の通りのＩＡＰ技法によ り決定されたものである。

感染因子の、その関連タンパク質と共通して示すその周波数は対立の相にある。

群Ｂのペプチドは上記の群Ａのペプチドの配列に対して決定されたようなアミノ 酸配列を示す。共通周波数はウィルス因子のタンパク質のそれの相と同じである 。

第一の科は、感染性タンパク質を認識できる抗体又はリンパ球の存在を示す病気 の診断のための試薬として好適に利用されうる。

かかる抗体の存在のインビトロ診断の方法はニー生物学的サンプル、例えば検査 すべき患者又は動物より採取した血清のような生物学的流体もしくは循環血液の リンパ球、又は更には生物学的組織の抽出物を、ペプチドｃＡのサブ群を含む、 上記の群Ａのペプチドに対して誘発せしめた抗体又は群Ｂのペプチドと接触させ 、そして 一抗原抗体型の反応、又はサンプルの抗体及びリンパ球と本発明のペプチド又は 抗体との間でのリンパ球反応のそれぞれを実施すること、 を特徴とする。

抗原と接触せしめるときのリンパ球反応のケースにおいて、サンプルのリンパ球 と、試薬として用いるペプチドもしくは抗体との反応、又はペプチドもしくは抗 体と、本発明のペプチドに事前免疫した患者のリンパ球との反応のいづれかを実 施できることが明らかであろう。従ってこのリンパ球は感作型試薬である。かか る免疫化は例えばペプチドｃＡにより実施する。

抗体又は人工ペプチドは接触工程の際、遊離であるか又は非免疫原性支持体に固 定されている。

複合体が事実上形成されたか、又はリンパ球の反応を証明するためには、免疫学 において伝統的に用いられている技術、例えばイムフルオレセンス、Ｅｌｉｓａ 、ウェスタンプロット又は更にはリンパ球反応及び事実上のＣＴＬ（ｒ細胞障害 性Ｔリンパ球」）の存在検査を頼りとする。

使用したサンプルの抗体と人工ペプチド又は誘発抗体との選択的な相互作用の検 出、又は更にはリンパ球の反応は病気の存在の証明である。

この検査方法により、生物学的サンプルの中の、ウィルス因子により発現された タンパク質に対して作られた抗体の迅速且つ高感度な存在が示されつる。

これは更に抗原性配列に対して作られた自己免疫抗体及び自己免疫リンパ球の存 在の実証も可能とする。

上記の第二科はｃＢペプチドを含む群Ａのペプチド、及び群Ｂのペプチドに対し て誘発された抗体又はリンパ球：より構成され、これらのペプチドの配列及びそ の周波数は上記した。

この科はウィルス因子のタンパク質の存在を検査するために簡単に利用できつる 。

ヒト又は動物におけるウィルス病理のインビトロ診断法は：生物学的サンプル、 例えば検査すべき患者又は動物から採取した血清のような生物学的流体もしくは 循環血液のリンパ球、又は更には生物組織の抽出物を、ペプチドｃＢのサブ群を 含む上記したような、群Ｂのペプチドに対して誘発させた抗体もしくはリンパ球 、又は群Ａのペプチドと接触させ、そして 抗原抗体型の反応、又はサンプル中に存在しているウィルス因子のタンパク質と 、試薬として利用した抗体もしくはペプチド又はリンパ球とのリンパ球性反応を 実施すること、を特徴とする。

好都合には、前記抗体又は前記人工ペプチドを、支持体上に固定されている感染 因子の抗原と接触させ、次いで検査すべき生物学的サンプルを加えることにより 、それがウィルス因子のタンパク質を含むとき、競合により反応の障害を誘発す ることができる。

複合体が実際に形成されたか、又はリンパ球の反応を証明するためには、抗体検 査のために現状利用されている技術のいづれか、又は群Ｂのペプチドに対して免 疫した動物のリンパ球を刺激する抗原の存在の確認を頼りとする。

サンプルのタンパク質と使用した誘発抗体（又は試験リンパ球）又は人工ペプチ ドとの選択的な相互作用の検出は病気の存在の指標となるであろう。

ウィルス因子により発現されるタンパク質はこれにより、例えば病理組織の生検 レベル又は末梢血液の細胞レベルにおいて、容易に検出、位置決め及び定量され つる。

本発明はヒト又は動物の中のウィルス病原のインビトロ診断のためのキットも狙 いとする。

例えば、本発明にかかわる診断キットはニー複数の感染症を検出するための、好 都合には支持体上に固定された、又は任意的に混合された、上記した、群への人 工ペプチドに対して誘発された抗体、又は群Ａの人工ペプチド、及び群Ｂの人工 ペプチドに対して誘発された抗体、 −反応が生じたかを示す、前記の誘発された抗体又は人工ペプチドと、これらの タンパク質及び抗原性タンパク質それぞれに対して形成された抗体との免疫反応 のための適当な試薬、及び他に、−コントロールとして対照の生物学的媒体、を 含んで成る。

リンパ球反応を検査するためには、本発明にかかわるキットは、一定のペプチド に対して免疫した動物に由来する、例えば深凍結形態のもとにあるリンパ球を好 適に含むであろう。

使用する抗体及びペプチドは伝統的な方法でビーズ上に、例えばラテックスビー ズ、マイクロタイタープレート又は更にはストリップの上に固定化されている。

更に、本発明は免疫原性組成物の製造のための上記のペプチドの利用を扱う。

好適な免疫原性組成物は、少なくとも−の群Ａのペプチドを含んで成り、そのフ ーリエスペクトルにおける特徴的な（複数の）周波数は、自己免疫病理にとって 重要な抗原性配列の相とは反対の相にある。群Ａのこのようなペプチドのアミノ 酸配列は例えば処置すべき抗体に対するＩＡＰ技法により決定されたものである 。

これは自己抗体を中和及び自己免疫リンパ球を破壊できる抗体を誘発することの できるペプチドを取り扱う。

その他の好適な免疫原性組成物は、それらが少な（とも−の群Ｂのペプチドを、 ワクチンの製造のための許容されている薬理学的媒体と共に含んで成ることを特 徴とする。伝統的な技術を通じて、こウィルスに含まれている対応のヌクレオチ ド配列により発現されもする。幅広く使用されているこのタイプのウィルスは生 存している、衰弱している、又は殺された株から作ったワクチンにより構築され る。

免疫原性組成物は、感染因子の抗原に対する免疫を宿主の中で誘発せしめるよう なプロトコール及び量に従って投与する。

かかる組成物は感染因に対して特異的な感作リンパ球及び抗体を誘発できるワク チンを製造するのに利用できうる。

特に狙いとする組成物は、群Ｂのペプチド、例えばウィルスのタンパク質に対し て決定された群へのペプチド自体に対して、特にレトロウィルス、即ち旧■のそ れに対してＩＡＰ技法により決定されたものを有する。

前記した通り、この群はペプチドｃＡを含んで成る。

非常に注目される一観点は、共通の有意義な周期的要素を示すウィルス因子のタ ンパク賃金てを認識する抗体を誘発できるペプチドが一つしかないことにある。

かかるＨＩＶに対する免疫原性組成物は、ｌＯ〜１００μｇ／ｋｇの用量の投与 を可能とするように抗原性ペプチドの観点で定量される。

群Ｂの人工ペプチド、標的タンパク質のイメージの類似体により感作されたリン パ球は、感染因子又はそれにより感染された細胞の破壊に関与するレセプターを 保有する免疫リンパ球のカテゴリーに該当し、なぜならこれらのレセプターは抗 原を認識できるからである。この場合、ＣＴＬ（ｒ細胞障害性リンパ球」）又は 抗体の媒介を必要としない抗−イディオタイプで感作されているその他のタイプ のリンパ球の活性は、ＭＢＣの遺伝同定（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の限定コントロー ルに委ねられず、その結果、感染標的細胞又は感染因子の破壊の妨げを示すべき でない（２）。

他方、本質的なイメージに類似なペプチドにより誘発された抗体は、補体の機能 に、及び抗原により取り込まれる抗体をその表層上に保存する細胞を破壊する細 胞障害性リンパ球（リンパ球Ｋ）の活性、いわゆるＡＤＣＣ（ｒ抗体依存性細胞 仲介細胞障害性」）に介在しつる。細胞仲介に対する免疫応答と異なり、リンパ 球には抗原に対して特異性を有さないが、しかしそれらはＩｇＧのＰｃフラグメ ントに対するレセプターを保有し、そしてそれらの溶解活性は補体を必要としな い。

本発明におけるペプチド及びこれらのペプチドに対する抗体は治療、特に薬剤又 は抗原ベクターとしても利用できうる。本発明のペプチドに抗原がカップルされ ている場合、任意の細菌性又はウィルス性抗原を、その生体がそれに対して事前 に免疫（又はワクチン）化されている限り、使用できつる。

それらのベクターは、ウィルス／細胞認識の過程において細胞要素と相互作用し ないよう、標的タンパク質（ウィルス抗原）の分子ドメインに関係してデザイン されねばならない。

その特徴は、標的タンパク質が相互作用する細胞構造を認識できる抗体のベクタ ーによる誘発を避けるために必須である。

本発明は、薬剤ベクターとしてのＡ型ペプチド及びＣＤ４に対して特異的な抗体 ／リンパ球を妨害できる抗体又は細胞障害性リンパ球の誘発剤としてのＢ型ペプ チドの利用に関する。

本発明のその他の特徴及び長所は下記の実施例及び図に示され、ここで図１　ａ −１ｆ　ｔ！　ＨＩＶタンパク質のフーリエスペクトルを示し、図２ａ〜２ｄは 本発明の人工ペプチドのそれを示し、図３ａ〜３ｅはＦＬＹタンパク質のそれを 示し、図４はプラスミドｐＧＥＸ　−２の制限地図を示し、そして図５は、ＨＩ Ｖ−１と、本発明の人工ペプチドに対して特異的な抗体との反応を示すイムノプ ロット図である。

実施例１： ＩＡＰ技法によるウィルス因子のタンパク質の分析・数値配列の確立 ＩＡＰ技法に従い、下記の一般式に従って一定のタンパク質配列の各アミノ酸の 見かけ上のポテンシャル、又は擬ポテンシャルを算定できうる（４）： Ｗ＝０．２５Ｚ”　５ｉｎ（１，０４πＺ”　）　／　２　ｒｒ　（１）（式中 、Ｚ８は により決定される準位（ｑｕａｓｉｖａｌｅｎｃｅ）の数値の平均を示し、ここ でＺｉは分子のｉ番目の原子の価電子の数を示し、モしてＮは分子の中の原子の 全数を示す）。

２０の天然アミノ酸について算定したＰＥＩＩ値（５）を表１に示す。

アミノ酸に寄与する値はタンパク質の配列の中のその位置にかかわりなく一定で あり続ける。

表１ アミノ酸　ＰＥＩＩ　ＣＲＹ”　’） Ｌｅｕ　（Ｌ）　０，００００ １ｉｅ　（１）　０．００００ Ａｓｎ　（Ｎ）　０．００３６ Ｇｌｙ　（Ｇ）　０，００５０ Ｖａｌ　（Ｖ）　０．００５７ Ｇｌｕ　（Ｅ）　０．００５８ Ｐｒｏ　（Ｐ）０．０１９８ Ｈｉｓ　（Ｈ）　０．０２４２ ＬＹＳ　（Ｋ’）　０，０３７１ Ａｌａ　（Ａ）　０．０３７３ Ｔｙｒ　（Ｙ）　０．０５１６ ’ｒｒｐ　（Ｗ）　０．０５４８ Ｇｉｎ　（Ｑ）　０，０７６１ Ｍｅｔ　（Ｍ）　０．０８２３ Ｓｅｒ　（Ｓ　）　０，０８２９ Ｃｙｓ　（Ｃ）　０，０８２９ Ｔｈｒ　（Ｔ）　０，０９４１ Ｐｈｅ　（Ｆ）　０．０９４６ Ａｒｇ　（Ｒ）　０．０９５９ ＡＳＩ）　（Ｄ）　０．１２６３ ”Ｒｙ”　＝リュードベリ一単位 ・フーリエ変換 フーリエ変換は下記のように行った： ここでｘ　（ｍ）は分析した数値配列のｍ番目のメンバーであり、Ｎは配列の中 の全点数であり、そしてＸ　（ｎ）はフーリエ変換のｎ番目の係数である（６） 。

従って、フーリエ変換のために用いた数列は一定の長さの独立の「決定基」信号 を表わす。フーリエ変換の係数の絶対値はスペクトルの振幅変を規定し、ここで それらの相は下記の通り相スペクトルを規定する： Ｘ（ｎ）＝ｌＸ（ｎ）ｌ＝ｅ−１＠”’　ｎ＝１．２−Ｎ／２　（４）従って、 オリジナルの配列の完全情報が２つのスペクトル関数の中に含まれている。

ところで、タンパク質配列の場合、その情報はこの２つのスペクトル関数のうち の一方にしか含まれていない。この場合、スペクトルのエネルギー密度、いわゆ る情報スペクトルを分析することがより現実的であり、それは下記の通りに定義 される：５（ｎ）　−、Ｘ（ｎ）Ｘ”（ｎ）　＝　Ｉ　Ｘ（ｎ）　Ｉ″　ｎ＝１ ．２−＝Ｎ／２　（５）独立信号の観点で分析した配列はｄ＝１の距離の等距離 点で決定され、この方法では最大周波数はＦ＝１／２ｄ＝０．５である。周波数 の度合いは配列の中の点の数とは独立している；この後者はスペクトルの解像度 のみに寄与している。配列の点Ｎで、解像度ｒはｌ／Ｎに相当しく６）、そして スペクトル関数のｎ番目の点は周波数ｆｎ＝ｎ／Ｎに相当する。分析にとって必 要とされる最少限の点数はスペクトルの所望の解像度に従う（即ち、示すべきピ ーク数に従う）。

・スペクトルの掛は算 同−の機能を有する２以上のタンパク質についての共通の特徴的な同期の実証は 、いわゆるクロス−スペクトル関数を得るために対応のフーリエスペクトル（合 成積）を相互に掛は合わせることにより行われる。このクロススペクトル関数（ それより両信号に共通する周波数がわかる）は下記の通りに定義する：５（ｎ） ＝Ｘ（ｎ）Ｙ”　（ｎ）　ｎ＝１．２−Ｎ／２　（６）ここでＸ　（ｎ）は列ｘ 　（ｍ）のフーリエ変換係数を示し、一方Ｙ　（ｎ）　”は列ｙ　（ｍ）のフー リエ変換の共役した複合係数を示す。

一定周波数についてのクロススペクトルにおけるピークの外形は両方化合物に共 通する周波数を規定する。他方、多重クロススペクトル関数は下記の配列群より 得られる： Ｍ（ｎ）＝Ｘ＋（ｎ）・Ｌ（ｎ）・ｘＭ（ｍ）　ｎ＝１．２−Ｎ／２　（７）実 施例２： 実施例１の中の技術のＨＩＶタンパク質の分析への応用：代数学手順を、Ｉ（Ｉ Ｖｇｐ１６０　（ＥＮＶ）タンパク質配列、旧Ｖｐ５５　（ＧＡＧ）、ＣＤ４認 識にかかわっている旧Ｖｇｐ１２０の４４量体フラグメント（７）、並びにネズ ミ及びヒトＣＤ４タンパク質に応用した。

実施例１の方法に従い、分析手順は下記の工程を含んで成る：１、各アミノ酸配 列を、各アミノ酸を電子イオン相互作用ポテンシャルの対応値で表わすことによ り関連の数列に変換する、２、その数列をＦＦＴを利用して数値スペクトルに変 換する；３、共通の周波数成分を抜粋することを狙いとして、クロススペクトル 分析を利用してスペクトルを相互に比較する。

４、次に多重クロススペクトル分析をタンパク質配列ｇｌ）１６０（ＥＮＶ）。

ｐ　５５（ＧＡＧ）、　ｇｐ１２０の４４個のアミノ酸フラグメントの各群に適 用して、タンパク質ｇｌ）１２０によるＣＤ４生物学的認識に関する共通の特徴 的な周波数成分を抜粋する。

ＨＩＶ−１タンパク質料に関する特徴的なフーリエスペクトルが見つけられたら 、反転手順を介して、この周波数に優先的に寄与し、且つ、観察されたタンパク 質パター宅製って重要であるようである特定の配列の中の特定のアミノ酸を推定 することが可能である。

ＣＤ４を認識する旧■−１及びｇｐ１２０の特徴的なフーリエ周波数により、同 一の所望のスペクトル特徴を有する様々な類似ペプチドを同定するために類似の 方法を利用することも可能である。これらのポリペプチドは新規なもの、又は旧 Ｖ−ＩＢＲＵ変異体タンパク質に近縁するフラグメントとしてデザインされる。

新規のデザインされたポリペプチドにより、名新規のポリペプチドが特徴的なフ ーリエ周波数及び相を有することを確実とするように厳しい基準を採用する。

これらのペプチドのデザインのための手順及び基準は下記の工程を含んで成る： ５、段階１−４に上記の通りに旧Ｖ−１タンパク質の分析群についての特徴的な 周波数を決定する。

６、ペプチドデザインのためのタンパク質として選んだｇｐ１２０ＨＩＶ−Ｉ　 ＢＲＵ単離体についての特徴的な周波数において特徴的な相を規定する； ７、反転独立フーリエ変換手順を利用してこれらの特徴的な周波数及び相の知識 から新規の数列を誘導する。

８、　ＥＩＩＰの値（表１参照のこと）からこの新たな数列の各要素にわるもの と同じスペクトル特徴を有し、そして類似のセットの機能的なパターン特性を示 すと推定できつる。例えば、これらの合成ペプチド類似体に対して作られたポリ クローナル（又はモノクローナル）抗体はＣＤ４結合の原因となるｇｐ１６０／ 　１２０タンパク質分子の表層領域と交差反応できつるであろう。

エンベロープｇＰ１６０／１２０の糖タンパク質及び遺伝子ＧＡＧｐ５５により コードされるもののアミノ酸配列により得られた結果を以降に示す。

様々な旧Ｖ−１の単離体から得られた糖タンパク質ｇｌ）１６０のクロススペク トルの分析より、フーリエスペクトルにおいて主となる特徴的な周波数を推定で きうる。

従って、図１ａにおいて示す通り、ＨＩＶの２１個の単離体から得られたｇｐ１ ２０のスペクトルをクロスさせることにより、ｆ　１　＝０．１８５５の共通の 周波数が推定できつる。

この周波数は旧Ｖの１１の単離体由来の遺伝子ＧＡＧのタンパク質ｐ５５にとっ て主たるスペクトル特徴である（図１６）。

このｆ１周波数は、図１０及びｌｄで見られるように、タンパク質ｇｐ１６０及 び単離体例えばＬＡＶｂｒｕに由来するｐ５５のスペクトルにおける平均信号で あることもわかりつる。

特徴的な周波数ｆｌは、様々なＨＩＶの単離体及び単離体ＬＡＶｂｒのＣＤ４の 捕捉にとって重要（７）なアミノ酸４１８〜４６１（番号はＮｅｏｓｙｓｔｅｍ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９９０．　ＨＩＶ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　５ＩＶ− ｐｅｐｔｉｄｅｓに従う）に相当するｇｐ１２０のフラグメントにおいて見い出 せうる。更に、周波数ｆ　２　＝０．２１８８も図Ｉ　Ｃ（ＨＩＶ（７）　８　 ｔ７）単離体）及びＩｆ（単離体ＬＡＶｂｒ）のそれぞれにおいて見い出せつる 。

ｇｐ１２０及びｇｐ１６０の完全配列のクロススペクトルの分析は特徴的な周波 数ｆｌは示すが、周波数ｆ２は強１１特徴的な振幅は示さないようである。

実施例３： ｇｐ１６０／１２０のフラグメントを参考とするＡ及びＢ型の人工ペプチドの製 造。

下記の実施例は、　［ＡＰスペクトル（図Ｉｆ）において特徴的な周波数ｆｌ及 びｆ２を示す、ＨＩＶ−１の単離体、即ちクローンｎ１４３ＬＡＶｂｒｕにより 製造したｇＰ１６０／１２０の４４個のアミノ酸のフラグメントを用いる、２０ 個のアミノ酸のペプチド配列の製造を取り扱う。

このフラグメントは以下のアミノ酸の配列Ｓに相当する（７）：Ｓ　＝　Ｔ　Ｉ ＴＬＰＣＲＩＫＱＦ　ＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰ　ｌ５ＧＱ　ＩＲＣ３Ｓ Ｎ　ＩＴＧＬＬＴＲ群Ａのペプチドの製造 一ペプチドＡｌ： 上記のフラグメントのＳ配列を基礎とし、しかしながら周波数ｆｌ及びｆ２の相 互反転させて、実施例１のＩＡＰ技法を利用してペプチドＡ１の配列を決定した 。

得られた配列は以下の通りである： 配列Ａ　Ｉ　＝ＫＱＱＹＹＷＹＡＷＣＱＰＰＱＤＱＬＩＭＤこのペプチドＡＩの フーリエスペクトルを図２ａに示す。

−ペプチドＡ２： 同様にして、ペプチドＡ２の配列を周波数ｆ１の相を反転することにより、しか しながらこの場合において周波数Ａ２を考慮することなく決定した。なぜならこ のペプチドは、周波数のみを考慮すると、ｆｌのみに関連して樹立されているか らである。

ペプチドＡ２のフーリエスペクトルは図２６に示す。

アミノ酸配列は下記の通りである： 配列Ａ　２　＝　ＬＫＲＤＱＥＰＭＤＦＨＩＷＤＤＹＬＫＲＤＡＩ及びＡ２はそ れらの配列を考慮する限り相同性を全つく示さないが、それらは共通して周波数 ｆｌを有することがわかる。

・群Ｂのペプチドの高揚。

一ペプチドＢｌ： このペプチドはペプチドＡ１と同一の周波数ｆｌ及びｆ２を、これらの周波数と は反対の相で示し、それ故配列Ｓのフラグメントの周波数ｆｌ及びｆ２と同一の 相で示されるように製造した。

ペプチドＢｌのＩＡＰスペクトルを図２０に示す。

その配列は下記の通りである： 配列Ｂ　１　＝ＤＤＡＬＹＤＤＫＮＷＤＲＡＰＱＲＣＹＹＱペプチドＡＩ又はＡ ２との相同性がないことがわかる。

−ペプチドＢ２： このペプチドをペプチドＡ１及びＡ２と同じように製造し、そしてＡＩおよびＡ ２の相と反応の相の固有周波数ｆｌを示す。ペプチドＢ２のＩＡＰスペクトルを 図２ｄに示す。

下記の配列を有するこのペプチド、 配列Ｂ　２　＝ＤＦＨＩＷＤＤＹＬＫＲＤＱＥＰＭＤＦＨ１は特徴的な周波数ｆ ｌを有するペプチドＢｌと同一の相を示す。

実施例４：実施例３からの人工ペプチドの合成。

保護ペプチドの樹脂を、ＨＯＵＧＨＴＥＮ　（８）により開発された多重ペプチ ド合成技術を利用し、Ｂａｃｈｅｍ　Ｉｎｃ　（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、（Ａ）より 市販のｐ−メチル−ベンズヒドリルアミンの樹脂（１００〜２００メツシユ、０ ．４〜ｏ、　８ｍｃｇ／　ｇ　）及びアミノ酸Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル （ｔ　−ｂｏａ）を用いて合成した。

このペプチドをその樹脂から、公知のフッ化水素及びアニソール技術（９）を利 用して分離せしめた。合成後、ペプチドの純度をＰｅｐＲＰＣＨＲ５のカラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での逆相ＨＰＬＣにより評価した。

クロマトグラフを０．１％のＣＦ、Ｃ０ＯＨ／Ｈ！０及びＣＦ、Ｃ０ＯＨ／ＣＨ ，ＣＮ（Ｖ／Ｖ）の勾配の中で展開させた。これらのペプチドはＯＤ、、、で吸 収性の約８５％の均質を示した。そのペプチド配列をチェックした。

実施例５ニレトロウイルスネコ白血病又はＦＬＹの分析への実施例１の方法の応 用： 様々な単離体から得たＦＶＬエンベロープポリプロティンの糖タンパク質、即ち いわゆるＫｎｏｂ糖タンパク質、Ｋｎｏｂｇｐ７０、いわゆる５ｐｉｋｅタンパ ク質（ｓｐｉｋｅｐ１５）及びＦＬＹ　Ｔ−細胞レセプタータンパク質を構成す るアミノ酸配列による分析から得られた結果は、フーリエスペクトルからの主た る特徴的な周波数の決定を可能とした。

その結果を図３ａ〜３ｆに示す。

５ｐｉｋｅｐ１５（５個の単離体）は特徴的な周波数ｆ　＝０．１３７（図３（ ａ））を示し、一方、Ｋｎｏｂｇｐ７０　（６個の単離体）の主たる特徴的な周 波数はｆは０．４４３４である（図３　（ｂ））、そしてＦＬＹエンベロープポ リプロティン（５個の単離体）の主たる特徴的な周波数はｆ　＝　０．０３０３ （図３（ｃ））であることがわかりつる。

レトロウィルス　ポリプロティン及びそのレセプターに共通する特徴的な周波数 の振幅の増大は多重クロスベクトルより明らかとなるであろう概念に従い、ｆ　 ＝０．１２８９の主たる特徴的な周波数がＦＬＹポリプロティンエンペローブ（ ５個の単離体）、ＥＮＶフラグメント（３個の単離体）及びＴ−細胞レセプター タンパク質について観察され（図３　ｄ）　；　ｆ　＝０．０１３７の主たる特 徴的な周波数が５ｐｉｋｅｐ１５タンパク質（５個、の単離体）及びＴ−細胞レ セプタータンパク質について観察され、そしてｆ　＝０．１２８９の主たる特徴 的な周波数がＫｎｏｂｇｐ７０タンパク質（６個の単離体）及びＴ−細胞レセプ タータンパク質（図３ｆ）について観察された。

ＦＬＹエンベロープタンパク質、Ｋｎｏｂ　−ｇｐ７０及び５ｐｉｋｅ１５に免 疫学的に近縁するペプチドの製造。

ペプチドＦＬＹ　−Ｋｎ２０は、その成分の特徴を考慮すると、ペプチドＫｎｏ ｂ　−ｇｐ７０に相当する。換言すれば、それは下記の配列ＫＤＬＲＷＨＤＩＲ ＷＩＯＨＤＩＲＷＨＤＮＲＱ２０を有するＫｎｏｂｇｐ７０型の２０個のアミノ 酸のペプチドに相当することＫｎｏｂ　−ｇｐ７０と同一の配列（ｆ　１　＝０ ．３９８４）及び同一の相が、５ｐｉｋｅｐ１５の認識にかかわって見い出され た。

ペプチドＦＬＹ　−Ｋｎｏｂ２０は抗−ＫｎＯｂｇｐ７０型の２０個のアミノ酸 を有するペプチドに相当し、そして下記の配列を有する：ＲＮＤＨＷＲＩＤＫＷ ＩＯＲＩＤＫＷＤＬＤＫＹ２０その周波数はＫｎｏｂｇｐ７０　（ｆ　、　＝０ ．３９８４）で認められたものと同一であるが、Ｋｎｏｂｇｐ７０とは逆相とな っている。

ペプチドＦＬＹ　−５ｐ７３はその成分の特徴を考慮して５ｐｉｋｅ１５に相当 し、これは５ｐｉｋｅｐｌｓ型の７３個のアミノ酸ペプチドであり、下記の配列 を有する： ＰＰＰＥＥＧＮＮ［１１０ＬＩＩＮＮＥＥＥＰＰ２０　ＨＨＫＫＡＹＹＷＷＱ３ ０ＱＱＣＴＴＲＲＲＲＤ４０　ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤ５０　ＤＤＤＤＤＤＲＲＲ Ｒ６０ＴＣＭＱＱＱＷＷＹＹＡ７０　ＫＨＨ このペプチドは５ｐｉｋｅｐ１５と同一の相であり、そして同一の周波数を有す る（　ｆ　２　＝０．０１３７）。

配列の長さは周波数低値（ｆｒｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｏｗ　ｖａｌｕｅ）の直接的 な結果であることが理解されるであろう。

ポリペプチドＦＬＹ　−５ｐＯｐｓｏは５ｐｉｋｅ１５とは逆相となっている。

これは抗−５ｐｉｋｅｌｓ型の５０個のアミノ酸のペプチドであり、下記の配列 を有する： ＲＲＲＤＤＤＤＤＤＤＩＯＤＤＤＤＤＤＤＤＤＲ２０ＲＲＲＴＣＭＱＱＱＷ３０ ＷＹＹＡＫＨＨＰＰＰ４０　ＥＥＧＮ［ＩＩＬ［Ｉ５０その周波数はタンパク質 ５ｐｉｋｅｐ１５（ｆ　２　＝０．０１３７）と同じであるが、それとは逆相と なっている。この場合も、その配列の長さは周波数低値に由来する。

ペプチドＦＬＹ　−５ｐｋｎ９０はタンパク質５ｐｉｋｅｐｌｓ型とタンパク質 Ｋｎｏｂｇｐ７０との９０個のアミノ酸のペプチドである。

その配列は下記の通りである。

ＡＭＰＱＫＨＱＧＷＫＩＯＰＷＩＹＫＥＷＧＷＡ２０　ＰＱＰＱＷＫＴＫＭＱ３ ０ＹＲＹＲＴＷＤＷＲＲ４０ＱＤＱＲＲＱＤＷＦＦ５０　ＷＲＹＱＭＫＴＫＷＷ ６０ＰＱＰＡＹＥＷＥＫＹ７０　ＩＷＥＡＹＧＱＰＫＷ８０　ＰＭＫＷＭＫＲＷ ＱＲ９０このペプチドは５ｐｉｋｅｐ１５及びＫｎｏｂｇｐ７０と同一の相であ り、且つ同一の周波数を有する（　ｆ　１　＝０．３９８４及びｆ　２　＝０． ０１３７）。

ペプチドＦＬＶ−ｓｐ　Ｋｎｏｂ５０は５０個のアミノ酸のペプチドであり、そ の特徴は抗−５ｐｉｋｅｌｓ型及び抗−Ｋｎｏｂｇｐ７０のペプチドに対応する 。

このペプチドは下記の配列を有する： ＦＷＤＷＴＲＷＤＱＲＩＯＤＱＤＱＲＤＷＤＱＴ２０　ＲＷＤＷＱＲＡＲＹＷ３ ０　ＣＨＣＡＹＱＰＱＨＫ４０ＷＧＷＨＨＷＬＷＰＨ５０ これは５ｐｉｋｅ１５及びＫｎｏｂ、ｇｐ７０と同一の周波数を有するが、それ らの周波数はこの両者のタンパク質のそれとは逆相となっている。

実施例６： 旧■タンパク質に近縁の人工ペプチドをコードできるヌクレオチドフラグメント 及びこれらのペプチドの発現。

・ペプチドＡ１及びＢｌについてのコード情報を保有する配列：伝統的な技術を 利用し、ペプチド配列から推定したヌクレオチド配列を合成する。

コード配列の両側の接着末端を下記の通りに、ＢａｍＨｌ　（鎖の５′末端及び その相補鎖の３′）及びＥｃｏＲｌ　（各鎖のそれぞれ３′及び５′末端）につ いての制限部位を保有するように選んだ。

得られたヌクレオチドフラグメントをその相補鎖及びコード化ペプチド配列と共 に以下に示す。選ばれたコドンはとりわけ大腸菌において高く発現される遺伝子 のケースでより頻繁に用いられるものである。いくつかのコドンは同じアミノ酸 についてコードすることもでき、ペプチドＡ１及びＢｌから推定したヌクレオチ ド配列はそれぞれ下記の鎖に対応する。

ｉｌ　ｒ＋１は、塩基Ｔが塩基Ｕにより置き代わっているとき、メツセンジャー ＲＡＭを表わす。インビボにおいて、メツセンジャーＲＮＡは鎖「−」の転写の 結果物である（！Ｊｌｒ−Ｊの相補性ＲＮＡ）。

以下は、コード配列として用いた相補性ヌクレオチド配列、並びにその対応のペ プチドＣＡＩ、　ＣＡＩＩ、　ＣＢＩ及びＣＢＩＩである。

ベブ千ドＡ！１ｒＦＲ目の４廁１（１；ＪＴに示す）はペプチドｃＡｌ及びｃＢ ｌ（上記のかっこの間に示している）についてコードできるものの相補鎖から推 定した。

Ｆ引ト　耘ｇト 耘西Ｆ：＝−，耘ｇ督２ これらのヌクレオチドフラグメントを、ｐｈａｒｍａｃｉａ　（Ｕｐｐｓａｌａ 。

Ｓｗｅｄｅｎ）からのＧＳＴ遺伝子融合の手順を利用し、図３にその制限地図を 示すプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔに挿入した。

この系はプロモーターｔａｃ　、本質的な遺伝子１ａｃｉ　７、及びトロンビン による切断部位を有している。

末端において融合し、そしてグルタチオン５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂのカラム を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細菌リゼートから精製した。

実施例７：　人工ペプチドのペアーの免疫特性の研究。

一実施例３のペプチドを用いての抗体の製造。

生後２力月のウサギ（Ｎｅｗ　−Ｚｅａｌａｎｄ）を上記のようにして獲得した ペプチドで免疫した。０Ｂｌに完全フロインドアジュバント中の１００μｇのペ プチドでウサギを免疫した。次に、１０日毎に、各ウサギに不完全フロインドア ジュバント中の１００μｇのペプチドを再び投与し、少なくとも全部の６回の接 種を行った。

最後の注射から３日後に、接種ペプチドに対する抗体の存在を決定するためにＥ ＬＩＳＡ技術を利用して血清を検査した。血清の力価を抗原に対する有意を反応 性示す最も高い希釈率の血清の対数で表示する。

−ＥＬＩＳＡ検査における抗体の交差反応の研究：分析すべき様々な合成ペプチ ドを標準の９６穴マイクロタイターウエル上にコートした。

自由な結合部位をリン酸緩衝液、ｐ）１７．４中の１％（Ｗ／Ｖ）の牛血清アル ブミン（ＢＳＡ）溶液で４°Ｃで約１４時間ブロックした。そのプレートをよく 洗った。

免疫したウサギ及び免疫していないウサギの血清を、ＰＢＳ　Ｏ，ＯＩＭ　。

Ｈ７，４、ＮａＣ１０，１５Ｍ５ＢＳＡＩ％　及びシイーン２０　０．１％で希 釈した後にそのウェルに加え、次いでそのプレートを３７℃で１時間インキュベ ートした。

数回洗った後、西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合した抗−ウサギャギＩｇＧ抗 血清（希釈率１　／１０００）を加え、そしてそのプレートを更に３７°Ｃで１ 時間インキュベートした。

酵素活性を０−フェニレン−ジアミドを基質として用いて決定した。吸光度は４ ９２ｎｍで測定した。

得られた結果を表２に示す。

表２ 抗−Ａ１　抗−Ａ２　抗−Ｂｌ　抗−Ｂ２Ａｌ　５．１　３．３　２．４　０． ９Ａ２　３．６　５．１　２．１　２．７Ｂｌ　０　０　３．６　２．４ Ｂ２　０．９　３．６　３．９　５．４ｇｐ１２０　１．５　１．２　５．４　 １．８これらの値は、血清が有意義な反応性を示す最も高い希釈率の対数で示し ている。

これらの結果は、ペプチドＡＩにより免疫した動物がペプチドをＡと交差反応す るポリクローナル抗体を産生じ、一方、ペプチドＡ２により免疫した動物がペプ チドＡと交差反応する抗体を産生ずることを示す。

これらの結果はペプチドＡＩ及びＡ２のそれぞれに対して特異的であり、その構 造を考慮する限り相同性でなく、しかし共通の周波数を有し、且つ同一の相であ る抗−Ａｌ及び抗−Ａ２血清の交差反応性を示す。

ペプチドＡ２及びＡＩのそれぞれとの抗−ＡＩ及び抗−Ａ２血清の交差認識は従 って周波数ｆｌにかかわることが明らかである。

ペプチドＡ１及びＡ２のＥＬＩＳＡ検査により、ウサギ抗−Ｂ１ポリクローナル 抗体によって弱くしか認識されなかった。

ペプチドＢｌと同じ相の特徴的な周波数ｆ　１　＝０．１８５５を示すペプチド Ｂ２は抗−８１血清と交差反応し、そしてペプチドＢ２に対して特異的な血清の うちのポリクローナル抗体はペプチドＢｌを認識し、そして抗原−抗体型の複合 体を形成する。

従って、抗−Ｂｌ及び抗−８２血清中の交差反応の特異性は、ペプチドＡ２及び Ａｔそれぞれとの抗−Ａｌ及び抗−Ａ２血清の交差反応性について上記に実証し た通り、２つのペプチドＢ１及びＢ２についての共通の周波数の概念と一致する 。血清抗−Ａｔは反対の相を有するペプチドＢｌ又はＢ２とは顕著に交差反応せ ず、従ってこのパラメーターを生物分子認識にかかわっている。同様に、抗−Ｂ ２血清はペプチドＡ１と交差反応しない。

抗−８２血清はペプチドＡ２とは弱く交差反応し、一方、抗−Ａ２血清のポリク ローナル抗体はＥＬＩＳＡアッセイにおいてペプチドＢ２を有意義に認識した。

この交差反応性は共通の２つのフラグメント、即ちＤＦＨＩＷＤＤＹＬＫＲＤ　 及びＱＥＰＭＤＦＨＩを有する配列Ａ２及びＢ２の相同性にたとえ配列の位置が 逆となっていても寄与しつる。

同様に、ペプチドＢｌと抗−Ａｔ及び抗−Ａ２血清とでは交差反応性は認められ ず、ペプチドＢ１はペプチドＡ１及びＡ２とは共通の周波数とは逆相を示す。

最後に、血清抗−Ｂ１はＨＩＶ−１ｇｐ１２０組換糖タンパク質（バキュロウィ ルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）を認識し、一方、血清抗−ＡＩ、抗−Ａ２及び 抗−Ｂ２はこの実験条件ではｇ１１１２０と交差反応しなかった。

実施例８ニイムノブロツト検査でのＨＩＶタンパク質との血清の反応性の研究： 以下に報告するのは、市販のイムノプロットキット、例えばＤｉａｇ−ｎｏｓｔ ｉｃ　Ｐａ５ｔｅｕｒにより作られた。ＬＡＶｂｒｕのＨＩＶ−１タンパク質を 含むものを用いてのウサギ抗−Ｂｌ血清により得られた結果である。

その血清を希釈し、そしてアルカリホスファターゼでラベルされたヤギ抗−ウサ ギＩｇＧを有するイムノプロットストリップとインキュベートした。これらのス トリップをホスファターゼ基質（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰａｓｔｅｕｒ）を有す る系を用いて発色させた。得られた結果を図５に示す。

この図は、ペプチドＢｌにより誘発され、且つ抗−８１血清の中に存在している 抗体がいくつかのＨＩＶ−１タンパク質と交差反応できることを示す。事実、こ の血清の抗体はタンパク質ＰＯＬｐ６８　（ウィルスの逆転写酵素遺伝子により コード）により、タンパク質ＧＡＧｐ５５（ＧＡＧタンパク質の前駆体）により 、前駆体：ｐ１８、ｐ２４／２５及びｐ４０に由来するタンパク質により捕捉さ れる。同様に、４３ＫＤａにおいてシャープなバンドを示し、ｇｐ４１の膜融合 バンドに相当する領域に位置する化合物も交差反応した。

タンパク質ｐ１５が、抗−Ｂｌ血清により認識されないＧＡＧタンパク質のうち の唯一のタンパク質であった。最後に、ｇｐ１２０への抗−Ｂｌ抗体の結合はイ ムノプロット検査において有意に認められなかった。

抗−Ｂ１抗体によるいくつかのＨ［Ｖタンパク質（それらは遺伝子ＰＯＬ及びＧ ＡＧに由来する）の認識を叶ｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓよ り入手できるＨＩＶ−１１ｇＧウェスタンプロットキットを用いて確認した。

組換バキュロウィルスｇｐ１２０を用いる実験は、抗−８１血清がエンベロープ のタンパク質と有意に反応することを示した（　ＥＬＩＳＡ）。

更に、いくつかのＨＩＶ−タンパク質はｇｐｔｅｏ及びｇｐ１２０を含む抗−Ｂ ｌ血清の抗体により免疫沈殿した。

ペプチドＢｌについての情報を含む遺伝子を合成し、そしてプラスミドｐＧＥＸ −２Ｔに挿入しく実施例７に開示の通り）、次いで細菌の中に導入した。細菌性 タンパク質のうちで、ペプチドＢ１の存在（Ｓ−）ランスフェラーゼグルタチオ ンに融合されている）は、電気泳動ゲル上でのタンパク質の泳動及びそのニトロ セルロースへの転写を経て、イムノプロットを用いて抗−Ｂｌ血清により示され た。

実施例９：リンパ球成育刺激試験： ウサギを下記の反応のペプチドｃＡ１により免疫した：ＶＨＮＱＬＶＬＲＲＬＡ ＰＳＶＰＶＶＬＬＦ繰り返すが、ペプチドｃＡ１はペプチド８群に属し、なぜな らそのアミノ酸鎖はペプチドＡＩの一つに相補性なヌクレオチド配列から推定し たものであるからである。このペプチドＡＩは群Ａに属する（実施例５に開示） 。

プロトコールは下記の通りである： ｌ）ウサギの免疫 ３００μｇのペプチドをフロインドアジュバント（完全及び不完全）を伴うＩＤ 又はＳＣ注射によりウサギに投与した。

−回の注射を１０日毎に行い、最低８回の注射を行った。

抗体レベルを最後の注射の一週間後にＥＬＩＳＡ法により決定した。

２）リンパ球回収 サンプリングは免疫したウサギの耳で行った（２０ｎｌの血清が必要）。

同じサンプリングをコントロールのウサギ（免疫していない）で行った。

ｌ容量の全血を２容量のハンクス溶液で希釈し、次いでフィコールクッションの 上に載せ、そして１３００　ｔ　／ａｋｉｎで３０分遠心した。

リンパ球アニールを取り、次いで、ハンクス溶液で２回すすぎ、そしてｌｎｌ　 のＲＰＭ１１６４０培地の中に再懸濁した。

リンパ球をＭａｌｌａｓｓｅｓセルで計測し、そしてその数を少なくとも２５０ 、０００細胞／ウエルに調整した。

３）培養 培養は細胞培養のために処理しである平店の９６穴プレート上で行った（Ｆａｋ ｏｎ　ｎ’　３０７２）。

培養培地は抗生物質、グルタミン、並びに免疫前に採取し、且つ脱補体処理した １０％のウサギ血清を有するＲＰＭＩ培地とした。

各ウェルに２５０．０００細胞及び種々の量の免疫原ペプチドを加えた（１０〜 ７５μｇ／ウェル）。

５日間入れた。

４）トリチウム化チミジンの取込み ５日目に、ｌμＣｉの３Ｈチミジンをウェル（こより取込ませた。

５）取込まれた放射活性の回収及び計測−夜のインキュベーション後（１５時間 ）、そのウェル内容物を吸収用コレクターを用いてガラスファイバーフィルター の上に回収し、フィルターを乾かし、インチレーティング液の中で計測した。

ペプチドｃＡ１により免疫された動物のリンパ球増殖は前記ペプチドの存在下で 、及びＨＩＶ−１ｇｐ１２０糖タンパク質の存在下で刺激されることがこの実験 により示された。更に、ペプチドＢ１による同一のリンパ球の有意義な刺激が認 められた。

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オーストラリア国、ビクトリア　３１０３．パルウィン、ユニオン　ロード　２ ６３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウィルス因子により発現されるタンパク質に免疫学的に近緑するペプチドで あって、下記のアミノ酸配列それに対する抗体又は特異的なリンパ球を形成する ことが望まれている標的抗原のアミノ酸配列を対照とするフーリエ変換（ＭＦＴ ）方法を用いるタンパク質の情報分析（ＩＡＰ）技法を利用して決定され、・こ のウィルス因子により発現される（複数の）タンパク質とは異なり、そして ・フーリエスペクトルにおいて、この標的抗原の特徴的な（複数の）周波数と同 一の値を事実上有する１又は複数の周波数を示す。 アミノ酸配列を含んで成る又はそれより構成されることを特徴とするペプチド。 ２．前記のペプチドの（複数の）周波数がこの標的抗原の特徴的な（複数の）周 波数に対して逆相となっていることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。 ３．前記のペプチドの（複数の）周波数がこの標的抗原の特徴的な（複数の）周 波数と同じ相となっていることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。 ４．以下の事項 ・この標的抗原がウィルスタンパク質又はそのタンパク質のフラグメントである 、 ・対象のペプチドが、この標的抗原に共通するが、逆相となっている１又は複数 の特徴的な周波数を有する群Ａのペプチドである、それらが、同一の群のメンバ ーと交差反応する抗体を誘発することができ、これらの抗体が標的抗原の本質的 なイメージに類似する、 を特徴とする、請求項１〜３のいづれか１項に記載のペプチド。 ５．以下の事項 ・その配列を決定するのにかかわる標的抗原が請求項４のペプチドのＡ型である 、 ・対象のペプチドが群Ｂのペプチドであり、その特徴的な（複数の）周波数は請 求項４におけるようにペプチドＡに共通しているものと逆相であるが、しかしこ の標的ウィルス抗原のそれとは同じ相である、 ・それらはウィルス因子により発現される同一の特徴的な（複数の）周波数のタ ンパク質を認識することのできる抗体を誘発でき、これらの抗体は同一の群のメ ンバーと更に交差反応する、それらはこのウィルス標的ペプチドに類似の本質的 なイメージのベクターである、 ことを特徴とする請求項１〜３のいづれか１項に記載のペプチド。 ６．ＣＤ４又はＨＩＶの糖タンパク質もしくはタンパク質と交差反応するその他 の細胞性タイプの表層タンパク質に対して特異的な（自己）抗体もしくは自己免 疫リンパ球を認識する抗体もしくはリンパ球を誘発できることを特徴とする、請 求項５記載のペプチド。 ７．ウィルスタンパク質、即ち、レトロウイルスタンパク質、又はこれらのタン パク質に対して誘発された抗体及びリンパ球に類似することを特徴とする、請求 項１〜６のいづれか１項に記載のペプチド。 ８．このウィルスタンパク質がレトロウイルス、特にレンチウィルス、特別には ＨＩＶ、即ちＨＩＶ−１及びＨｌＶ−２、並びにその変異体により発現されたタ ンパク質であることを特徴とする、請求項７記載のペプチド。 ９．ＨＬＡ−ＤＲ又はインターロイキン−２の配列に相同性のウィルス配列を対 照とするフーリエ変換法を利用するＩＡＰ技術により決定されたようなアミノ酸 配列を含むか又はそれより構成され、これらの配列の相に対して逆相となってお り、ＨＬＡ−ＤＲ及び／又はインターロイキン−２の配列に対して特異的な抗体 又はリンパ球を認識する抗体を誘発できることを特徴とする、請求項１〜７のい づれか１項記載のペプチド。 １０．タンパク質ＣＤ４並びに遺伝子ＥＮＶ、ＰＯＬ及びＧＡＧによりそれぞれ 発現される標的タンパク質ｇｐ１６０〜１２０、ｐｐ６６〜６８及びタンパク質 ｐ５５、それらに由来するタンパク質及びそのフラグメント、特に単離体ｎ１４ ３ＬＡＶｂｒｕのそれに対応する少なくとも一の周波数が０．１８５５に相当す る又は比較的同等なフーリエスペクトルを示すこと特徴とする、請求項８又は９ のいづれかに記載のペプチド。 １１．タンパク質ＣＤ４、及びレセプターＣＤ４を認識するｇｐ１２０のフラグ メントにより示される、０．２１８８に相当する、又はその値に比較的近い値の 周波数を更に示すことを特徴とする、請求項１０記載のペプチド。 １２．ＣＤ４を認識するｇｐ１２０の配列Ｓに対するＩＡＰ技法により決定され たようなアミノ酸配列を含み、この配列Ｓが下記の配列【配列があります】 を示すことを特徴とする、請求項９又は１０記載のペプチド。 １３．ＣＤ４認識するフラグメントｇｐ１２０に共通する（複数の）周波数を有 し、逆相となっているフーリエスペクトルを有する群Ａのペプチドであることを 特徴とする、請求項１２記載のペプチド。 １４．以下の事項 −群Ｂのペプチドである、 −請求項１３にかかわるペプチドのそれら逆相の（複数の）周波数のフーリエス ペクトルを示す、 ′」 −その周波数は、ＣＤ４を認識するｇｐ１２０フラグメントの特徴であるそれと 同じ相である。 −同じ群のメンバーと交差反応する抗体を誘発できる。 −抗原−抗体型の反応を形成することにより、又はｇｐ１２０によりリンパ球を 刺激することにより、その領域又はｇｐ１２０フラグメントを認識できる抗体又 はリンパ球を誘発することができる。 を特徴とする、請求項１２記載のペプチド。 １５．配列Ａ１： 【配列があります】又は配列Ａ２： 【配列があります】 を有することを特徴とする請求項１３記載のペプチド。 １６．配列Ｂ１： 【配列があります】又は配列Ｂ２： 【配列があります】 を有することを特徴とする請求項１４記載のペプチド。 １７．ＨＬＡ−ＤＲ又はインターロイキン２に相同性な配列を示すウィルスタン パク質に対して決定された配列を有し、それと同一の（複数の）周波数であるが 逆相となっていることを特徴とする請求項２に記載のペプチド。 １８．ＦＬＶ、Ｖｉｓｎａ又はＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２により発現される タンパク質に類似であることを特徴とする、請求項７記載のペプチド。 １９．ＦＬＶエンベロープポリプロテインの糖タンパク質の配列、特にタンパク 質Ｋｎｏｂｇｐ７０の配列に対するＩＡＰ技法に従って決定されたようなアミン 酸配列を含んで成り、そのペプチドが：−０．３９８４に相当する、又は事実上 相当する、タンパク質Ｋｎｏｂｇｐ７０と同じ相の、タンパク質Ｋｎｏｂｇｐ７ ０と共通する周波数を有するペプチド【配列があります】２０； −Ｋｎｏｂｇｐ７０と同一の周波数だが逆相であるペプチド【配列があります】 ：−ｓｐｉｋｅＰ１５と同じ周波数及び相を有する【配列があります】 −タンパク質ｓｐｉｋｅ１５と同じ周波数だが逆相となっているペプチド【配列 があります】 −タンパク質ｓｐｉｋｅ１５及びＫｎｏｂｇｐ７０と共通の周波数で同じ相のペ プチド【配列があります】 −タンパク質ｓｐｉｋｅ１５及びＫｎｏｂｇｐ７０と共通の周波数だが両タンパ ク質に対して逆相の ペプチド【配列があります】 を含んで成る群から選ばれる、請求項１８記載のペプチド。 ２０．・請求項１〜１９のいづれか１項に記載のペプチドをコードする配列、及 び任意的に、発現すべきペプチドに授けることが望まれる活性を有するタンパク 質をコードする１又は複数の配列、又はこの配列に相補性の配列、又は このペプチドから推定した配列のそれに相補性のヌクレオチド配列の一つとバイ プリダイズすることのできるヌクレオチド配列、を含んで成る、又はそれらより 構成されることを特徴とするヌクレオチド配列のフラグメント、 特に下記の配列のフラグメント （５′）【配列があります】 （この配列は請求項１５記載のペプチドＡ１についてコードする情報を有する） ； 下記の配列 ５′【配列があります】 （この配列は請求項１６記載のペプチドＢ１についてコードする情報を有する） ； 相補性配列 【配列があります】 〔ここで、この相補性配列は、コード配列として用いたとき、ｃＡ型及びｃＢ型 のペプチドそれぞれ、特に、【配列があります】 の配列を有するペプチドｃＡ； 【配列があります】 の配列を有するペプチドｃＡＩＩ； 【配列があります】 の配列を有するペプチドｃＢＩ； 【配列があります】、及び の配列を有するペプチドｃＢＩＩ；の発現をもたらす〕、並びにこれらのコード 配列の相補性ヌクレオチド配列、即ち、ｃＡ型又はｃＢ型のペプチドをコードで きる配列。 ２１．請求項１〜１９のいづれか１項に記載の通りに決定されたアミノ酸配列か ら推定されるヌクレオチド配列、又は請求項２０に記載のこれらのヌクレオチド 配列の相補性配列により発現されたペプチド。 ２２．請求項２０記載のヌクレオチド配列のフラグメントを含むことを特徴とす る発現ベクター、即ちプラスミド又はファージ、及びこれらのベクターにより形 質転換された細胞。 ２３．請求項１〜１９及び２１のいづれか１項に記載のペプチドに対して特異的 な抗体。 ２４．ウィルス因子により発現されるタンパク質に免疫学的に近縁する請求項１ に記載のペプチドを獲得するための方法であって、アミノ酸の配列を、標的抗原 のアミノ酸配列より及びこの標的抗原の特徴的な（複数の）主要周波数に対応す る１又は複数の特徴的な周期的要素を基礎とするフーリエ変換法を利用するＩＡ Ｐ技法に従って決定される配列へと合成ルートにより構築する、ここでこのペプ チド配列はこのウィルス因子のタンパク質の配列の観点で決定されたものである か、又は請求項１〜１９及び２１のいづれか１項に記載のペプチドのそれにかか わる変異体である、並びに−群Ａのペプチドを製造するため、そのペプチドが示 さなければならない特徴的な（複数の）周波数の相がこの標的抗原の（複数の） 周波数のそれに対して逆相となっている、及び−群Ｂのペプチドを製造するため 、その（複数の）周波数がウィルス因子の（複数の）タンパク質のそれと同じ相 となる新たな相の反転が必要とされる、 ことを特徴とする方法。 ２５．ヒト又は動物におけるウィルス病理のインビトロ診断のための方法であっ て： −検査すべき患者から採取した生物学的サンプル、例えば血清のような生物学的 流体もしくは循環血液、又は生物学的組織の抽出物を、 ・検査すべきウィルス病理にかかわるタンパク質を認識できる抗体又はリンパ球 の存在を決定するため、請求項２１記載のペプチドｃＡのサブ群を含む、請求項 ４記載の群Ａのペプチドに対して誘発された抗体、又は請求項５記載のペプチド のいづれかと接触させ、この接触工程に続き、サンプルの抗体及びリンパ球と、 本発明のペプチド又は抗体との間での抗原−抗体反応型又はリンパ球との反応性 のそれぞれを表示させる、又はウィルス因子の存在を決定するため、 ペプチドｃＢを含む群Ａのペプチド、もしくは群Ｂのペプチドに対して誘発され た抗体もしくはリンパ球のいづれかと接触させ、この接触工程に、 −サンプルの中に存在しているウィルス因子のタンパク質と、試薬として用いた 抗体もしくはペプチド、又はリンパ球との抗原−抗体反応型又はリンパ球反応性 を表示させることが続く、ことを含んで成ることを特徴とする方法。 ２６．ウィルス因子による感染症のインビトロ診断のためのキットであって： 複数の感染症を検定するための群Ａの人工ペプチドに対して誘発された抗体又は サブ群ｃＡを含む群Ｂの人工ペプチド又はサブ群ｃＢを含む群Ａの人工ペプチド 、及び好都合には支持体に固定された、又は任意的に混合物の中にある群Ｂの人 工ペプチドに対する抗体、−前記の誘発抗体又は人工ペプチドと、これらのタン パク質に対して作った抗体又は誘発リンパ球及び抗原性タンパク質それぞれとの 間での免疫反応を実施するための適当な試薬、並びにコントロールとしての生物 学的対照媒体、及びリンパ球反応性を検出するための、請求の範囲に記載の人工 ペプチドに対して免疫した動物のリンパ球、 を含むことを特徴とするキット。 ２７．免疫原性組成物であって、 −少なくとも請求項５記載の群Ｂのペプチドに、特にウィルスのタンパク質に対 するＩＡＰ技法により決定された群Ｂのペプチドに、及びＨＩＶの如きのレトロ ウイルスと、ワクチンの製造にとって許容されている薬理媒体、 −少なくとも一種の請求項４に記載の群Ａのペプチド、を含むことを特徴とする 組成物。 ２８．請求項５に記載の群Ｂのペプチドの、これらのペプチドにより誘発される リンパ球又は抗体を活性化するための、及び抗−ＣＤ４抗体又はリンパ球を妨害 するための利用。 ２９．ヒト又は動物におけるウィルス病理の診断のための試薬としての、請求項 ２３に記載の抗体、又は請求項１〜１９及び２１のいづれか１項に記載のペプチ ドの利用。 ３０．標的細胞と相互作用する領域の外のウィルス抗原に対して決定された薬剤 又は抗原のためのベクターとしての請求項４に記載のＡ型ペプチドの利用。 配列表 （ｉ）出願人： （Ａ）宛先：【配列があります】 （Ｂ）通り：１５【配列があります】 （Ｃ）市：ＲＡＲＩＳ （Ｅ）国：ＦＲＡＮＣＥ （Ｆ）郵便番号：７５７００ （Ａ）宛先：【配列があります】 （Ｂ）通り：Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎｒｏａｄ（Ｃ）市：ＣＬＡＹＴＯＮＭＥしＢ ＯＵＲＮＥ（Ｄ）州：ＶＩＣＴＯＲＩＡ （Ｅ）国：ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ （Ｆ）郵便番号：３１６９ （ｉｉ）発明の名称：人工ペプチド及び抗体誘発剤（ｉｉｉ）配列の数：４８ （ｉｖ）コンピューター読み取り方式：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター：１ＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）作動システム：ＰＣ− ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：パテントインリリース＃１．０、 バージョン＃１．２５ （Ｖ）現出願のデーター： 出願番号：ＷＯＰＣＴ／ＦＲ９３／００１７１（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４４アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）形態：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：ペプチド （ｉｘ）追加の特徴 （Ａ）名称／キー：ペプチド （Ｂ）位置：１．．４４ 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