JP4036895B2 - 細胞内相を有する感染性病原体に対するワクチン、ｈｉｖ感染の治療および予防用組成物、抗体と診断方法 - Google Patents
細胞内相を有する感染性病原体に対するワクチン、ｈｉｖ感染の治療および予防用組成物、抗体と診断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4036895B2 JP4036895B2 JP50486697A JP50486697A JP4036895B2 JP 4036895 B2 JP4036895 B2 JP 4036895B2 JP 50486697 A JP50486697 A JP 50486697A JP 50486697 A JP50486697 A JP 50486697A JP 4036895 B2 JP4036895 B2 JP 4036895B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- composition
- composition according
- hiv
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims description 7
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 title claims description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 title claims description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 13
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title description 11
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 29
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 abstract description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 40
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 35
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 9
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 230000017960 syncytium formation Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTRHYDMWPCTCKN-UHFFFAOYSA-N 2-phosphonooxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(CC(O)=O)(OP(O)(O)=O)C(O)=O XTRHYDMWPCTCKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100026926 60S ribosomal protein L4 Human genes 0.000 description 1
- 101100527655 Arabidopsis thaliana RPL4D gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100469270 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) RPL10A gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100304908 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPL5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010086652 phytohemagglutinin-P Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150060526 rpl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150009248 rpl4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079275 rplA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、新タイプのワクチン、特にＨＩＶ症状の治療、予防および診断用の組成物に関する。
更に詳しくは、本発明は哺乳動物、特にヒトでＨＩＶウイルスを直接または間接的に中和しうる免疫反応を生じさせることができるペプチドに関する。
ＨＩＶ-１複製の阻害においてβ2-ミクログロブリン（β２ｍ）に対するモノクローナル抗体の重要性は、特に特許ＥＰ-Ｂ-０，４７０，９８９と様々な文献で既に記載されている。
特に、これらの抗体は２つのメカニズムで、即ち直接ウイルスで、およびβ２ｍを伴う細胞で作用することを証明することが可能であった。
本発明はこれらの予備的な要素を発展させたものであり、ＨＩＶウイルスを完全にまたは部分的に中和する抗体を作ることができる、β２ｍから得られるかまたは等価構造を有する、ペプチド配列の同定に基づいている。
用いられるメカニズムの複雑さからみて、“ＨＩＶウイルスの中和”とは、ウイルスを破壊するおよび／またはその増殖を妨げるin vivo効果を有したメカニズムを意味すると理解される。
in vitroにおいて、これらの中和抗体は、血清反応陰性の女性の授精のために、ＨＩＶに血清反応陽性の男性の精液のような、ヒトに再接種または再導入させるべき体液を中和する上で用いることができる。
しかしながら、更に一般的には、本発明は高い変異力を有した寄生体またはウイルスタイプの感染性病原体に対して特に使用できる、新規なワクチンアプローチに基づいている。伝統的予防接種の関係においては、感染性病原体の成分に対する中和抗体を作ることが求められているが、例えばＨＩＶのような病原体が高い変異力を示すときには、この戦略では、変異体および耐性単離体へと非常に急速に変遷していく特定の単離体について、せいぜい限られた結果を出せるだけである。
新規なワクチンアプローチは異なる考え方に基づいており、周期中に細胞内相を有するいくつかの感染性病原体に適用しうる。
宿主の感染細胞から感染性病原体の増殖中に、感染性病原体が宿主細胞の決定基の成分を運び去ることは、ある病原体で知られているか、または特に本発明の一部を構成するＨＩＶの場合にはそれを証明することが可能である。
本発明の主題の１つは、感染性病原体自体ではなく、それが運び去る決定基の成分をターゲットとして取り上げることにあり、たとえ病原体自体が変異していたとしても一定のままであるこれらの細胞決定基に対して予防接種を行うことができる。
このタイプのアプローチは、抗原が宿主細胞に結合されていること、という直接的制限をもちろん有しており、細胞外感染性病原体により運び去られたときだけさらされる細胞決定基の潜在エピトープ、あるいは細胞によるその自然提示に非免疫原性であって、ビリオンの表面に現れたときに修飾されるエピトープに関し、このような予防接種を行うことだけが可能である。
例えば、ＨＩＶの場合には、β2-ミクログロブリンがＨＩＶウイルスの増殖中とその細胞外継代中にさらされるいくつかの潜在エピトープを有していることを証明することができた。したがって、予防接種の場合に、一方で自己免疫反応と、他方で試験された異なるＨＩＶ単離体に結合されているエピトープがないため、その予防接種は有効であり、これはウイルス自体の変異と無関係である。
このタイプの予防接種は、特に細胞内寄生体と、例えばＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶおよびＨＩＶのようなエンベロープウイルスについて選択することができる。
このタイプの予防接種はすべての場合に用いることはできないが、より伝統的なアプローチに抵抗する感染性病原体にとって非常に有用な代替法となりうることは、はっきり理解されるであろう。
したがって、本発明は、細胞外継代中に細胞内感染性病原体により運ばれて、感染性病原体によりさらされる細胞要素の少くとも１つの潜在エピトープを含んでなることを特徴とする、感染性病原体に対するワクチンに関する。
好ましくは、この感染性病原体は寄生体またはエンベロープウイルスであり、潜在エピトープは細胞の表面近くに位置している。
“潜在エピトープ”とは、隠されているかまたは修飾されていて、そのため免疫系により外来であると認識され、このため対応決定基の破壊で自己免疫反応を生じずに、予防接種に使用できる、宿主の細胞決定基のエピトープを表す意味である。
潜在エピトープは、明らかにさらされて、即ち感染性病原体により運ばれたときに免疫系により接近および認識されるべきである（潜在しているままだと、予防接種は不可能であろう）。
β2-ミクログロブリンの場合には、このタイプのエピトープの存在を証明することができ、尿路によるβ2-ミクログロブリンの排出中に実際に天然形でみられる。
したがって、本発明は、配列番号１〜２２または等価配列に相当する少くとも１つのペプチドを活性成分として含んでなることで特徴付けられる、ＨＩＶ感染の治療または予防用の組成物に関する。“等価配列”とは、in vitroでモノクローナル抗体Ｂ１Ｇ６またはＢ２６２．２によるＨＩＶウイルスの中和を行わせる配列を表した意味である。
これらのペプチドは、上記のようなβ2-ミクログロブリンの潜在エピトープを構成している。
本発明によるペプチドは以下である：
０１-Ｐ１ ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡ
（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ-Ｓｅｒ-Ａｒｇ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ａｌａ）
０２-Ｐ４ ＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＤＧＥ
（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ-Ａｓｐ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ）
０３-Ｐ９ ＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶ
（Ａｌａ-Ｃｙｓ-Ａｒｇ-Ｖａｌ-Ａｓｎ-Ｈｉｓ-Ｖａｌ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ）
モノクローナル抗体Ｂ１Ｇ６またはＢ２Ｇ２．２によるウイルスの中和を行わせる、これら１５アミノ酸のより小さな部分（７アミノ酸）を用いることも可能である：
０４-Ｒ-７-Ｖ ＲＴＰＫＩＱＶ
（Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）
０５-Ｓ-７-Ｋ ＳＱＰＫＩＶＫ
（Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ）
０６-Ｆ-７-Ｅ ＦＨＰＳＤＩＥ
（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
共通構造ＰＫＩ（３アミノ酸）が、関与している単位であるらしい；このため下記アミノ酸修飾がある：
０７-ＴＬＳＲＴＰＫＩＱＶ（Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）Ｎｏ．１８５
０８-ＩＹＬＴＱＰＫＩＫＶ（Ｉｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｔｈｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｌｙｓ-Ｖａｌ）Ｎｏ．１８６
０９-ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹ（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ）Ｎｏ．１８７
１０-ＴＬＳＱＰＫＩＶＫＮ（Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ａｓｎ）Ｎｏ．１８８
１１-ＩＱＲＴＰＱＩＶＫＷ（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ｔｒｐ）Ｎｏ．１８９
１２-ＩＱＲＴＰＮＩＶＫＷ（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ａｓｎ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ｔｒｐ）Ｎｏ．１９０
システインおよびグリコシル化部位を導入することも可能である：
１３-ＣＹＮＰＳＤＩＥ（Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
１４-ＹＣＮＰＥＳＴ（Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｇｌｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ）
１５-ＮＦＬＮＣＹＶＳ（Ａｓｎ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ）
１６-ＬＮＣＹＶＳＰＳＤ（Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ）
最後に、種（マウス、霊長類、ウサギ、モルモット）により異なるバリエーションを用いたペプチドを用いることが可能である：
１７-ＫＴＰＱＩＱＶ（Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）
１８-ＦＨＰＰＱＩＥ（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
１９-ＦＨＰＰＨＩＥ（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
２０-ＡＥＰＫＴＶＹ（Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ）
２１-ＳＱＰＫＴＶＹ（Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ）
２２-ＩＬＳＲＴＰＫＩＱＶ（Ｉｌｅ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）
配列番号１〜２２のこれらペプチドは優先的選択のみを含んでいる；上記されたようにして、等価ペプチドをみつけることが可能である。
例５は、等価ペプチドを同定することを可能にする方法について記載している。
これらのペプチドは、好ましくはキャリア系に結合される；これは特に免疫反応を行わせるために上記ペプチドのＮおよび／またはＣ末端に連結された１以上のタンパク質断片であってもよい；それらは“複合化タンパク質”と称される。使用できるタンパク質の中では、特に免疫原性の知られたアルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）、ＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）または他のタンパク質が挙げられる。ジスルフィド架橋のような非ペプチド結合でまたはカルシウムイオンによる結合で連結されたタンパク質またはタンパク質断片を考えることも可能である。
本発明による様々なペプチドの研究中に、これは本発明をいずれかに制限するはずがない理論にすぎないが、ＰＫＩ構造が必須の役割を果たしていることがわかった。プロリンは立体配座を決めて、四級ペプチド立体配置の可能性を制限するアミノ酸である。これらの条件下において、ＫＩ（Ｌｙｓ、Ｉｌｅ）は抗体と反応するとさらされる位置に付いている。
これらの条件下において、キャリアタンパク質の構築に際して、接近しうるＰＫＩ構造を残しておける構造を好ましくは用意しておくことが勧められる。
Ｐ１、Ｐ９およびＰ１０で選択された領域の構造の分析は、可能なアミノ酸を決めるために、特にＲＴＰＫＩＱＶ領域で、アラニンを用いて各アミノ酸を別々に置換する選択のような方法により行える。各ペプチドのビオチニル化と、その後で結合の喪失を調べるために抗体でのＥＩＡによる選択を用いた技術を用いることも可能である。
このため、高い予防接種活性を有するリポタンパク質を作るために、問題のエピトープと非タンパク質成分、例えば多糖および／または脂質との複合化を考えることが可能である；ここでも、共有結合またはその他を考えることが可能である。
これら様々なタイプの化合物は、化学合成によるか、または組換えタンパク質の生産分野で知られる技術を用いた組換えルートにより得られる。
組換え技術の柔軟性は、複数の同一または異なるエピトープを有して、最終産物の活性を高めうるタンパク質を生産することを可能にする。本発明による組成物中に入った様々な成分の同時発現を考えることも可能である。
本発明の面の１つによれば、ペプチドがＨＩＶの公知構造タンパク質中に導入されることが可能であろう；特に、対象のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループの超可変領域中に挿入されたコンストラクト（construct）が使用できる。
ｇｐ１２０のＶ３領域は、主要ＨＩＶ-１中和ドメインであって、ウイルストロピズムの主決定基の１つである。結果的に、このタイプの変異体はＲ７Ｖに連結されたＨＩＶ-１の中和とその宿主スペクトルの変更を研究する上で有用である。ＨＩＶ-１の単離体の中におけるｇｐ１２０のＶ３領域の高い変異性が、この領域の優先性のもう１つの理由である。Ｖ３領域における７アミノ酸の配列の置換は、ＨＩＶ-１ゲノムの別なより保存性の領域における変異よりも、存在しうる組換体を生じる大きなチャンスを有していると思われた。組換体タンパク質ｇｐ１２０／Ｒ７Ｖは、多量の免疫原Ｒ７Ｖを得るために、タンパク質の発現に適した系で並行して発現させることができる。
キャリアタンパク質の使用は必須でない；場合により他のキャリア系を用意することが可能である。“キャリア系”とは、問題のペプチドに対する免疫反応を生じる単位に導くことができるか、または排除、特に速やかなタンパク質分解からペプチドを保護することができる成分を表した意味である。
本発明による組成物は、ペプチドおよび／またはタンパク質の免疫原性を増加させる成分、特に特異的なまたはそうでない免疫アジュバント、例えばフロイントアジュバント、多糖または相当化合物も含んでいてよい。
これらは予防接種分野で公知の方法である。
本発明による組成物は、選択される投与経路、特に注射経路に適合した形で用いることができる。しかしながら、本発明による組成物では、粘膜の保護を誘導するために、他の経路、特に経口またはエアゾール経路により用いられることが可能であろう。
本発明は、上記されたペプチドおよび／またはタンパク質をその場で発現させるように投与される組成物にも関する。
特に、本発明は、上記のような少くとも１つの潜在エピトープ、特に配列番号１〜２２を有するペプチドおよび／またはこれらのペプチドを有するタンパク質、あるいは上記のような問題のペプチドとカップリングできるかまたは等価配列を有するタンパク質を発現することができるＤＮＡ発現カセットに関する。
“等価配列”とは、上記されたような等価ペプチドをコードする配列を表した意味である。
これらのＤＮＡ発現カセットは、もちろん、その場での発現向けに直接用いても、あるいは上記されたように使用できるペプチドまたはタンパク質を生産させるために用いてもよい。
ＤＮＡ配列を用いる予防接種系は公知であって、文献で既に広く記載されている。
それらは本質的にヒトで抗原性タンパク質の発現または細胞で抗原性タンパク質の発現を行わせる系であって、それが予防接種に用いられる；形質転換細胞が外部で治療される宿主細胞であるとき、治療はex vivoであると言われる。
発現系は高度に多様的である；それらは特にVICAL社の特許および特許出願、ＷＯ９０／１１０９２に記載されているような、特に“むきだしのＤＮＡ”タイプ系であってもよい。この場合に、ペプチドまたはそのペプチドを含むタンパク質をコードするＤＮＡはそのまま注入される；この注入はコードされたタンパク質の発現をいくつかの場合において導く。
これらの文献に含まれた情報は、参考のため本記載に明らかに含まれる。
特に発現を高めるために、“むきだしのＤＮＡ”系を、それら自体の発現系を含めて用いることも可能であろう。
特にプラスミドまたはウイルスタイプの系の組込みまたは自律複製により発現を促進させる系を用いることも可能であろう。
挙げられたペプチド配列の発現用の系の中では、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスタイプウイルス、または他の更に最近の系、例えばポリオウイルスを用いる系が挙げられるべきだ。
ベクターの中では、体液性応答を生じる、粘膜のためのベクターが好ましくは用いられる。
特に下記の他のウイルスも、ワクチンを得るために使用できる：
-N.R.Rabinovich et al.,Science,1994,265,1401-1404および引用文献に記載されているようなアデノウイルス
-Sue E.Crowford,Journal of Virology,Sept.1994,p.5945-5952に記載されているようなロタウイルス
-ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、更にPaoletti and Mossによる論文に記載されているようなカナリアポックスのような動物ポックスウイルス
-N.R.Rabinovich et al.（1994）に記載されているようなインフルエンザウイルス
様々な抗原用の予防接種ベクターとしてポリオウイルスを用いることを可能にした技術は、特にRaul Andino et al.,Science,265,1448-51に記載されている。
本発明の関係で使用できるこのタイプのコンストラクトは、経口で使用できるワクチンを得ることを可能にする；これをするために、ペプチド、場合によりキャリアタンパク質をコードする配列は、ポリオウイルス、例えば弱毒化Sabinウイルス中にクローニングされる；様々なエピトープをコードするウイルスのカクテルを用いることも可能である。
宿主、特にヒト宿主の細胞でタンパク質の発現用にプラスミドまたはウイルスの使用は公知であり、詳細には説明しない。具体的な構築物は、選択される宿主、エピトープおよびベクターに明らかに依存している。
例えば遺伝子療法の関係で提案されているような細胞ワクチンを用いること、患者から細胞を集めること、上記のようなベクターでそれらを形質転換すること、更にはタンパク質をその場で発現させるためにそれらを再移植することも可能である。
しかしながら、予防接種の場合には、この方法は非常に便利というわけではない。例えば表面で問題のタンパク質を発現させて、一部の場合にタンパク質の免疫原性を増加させる、多数で得られる細胞、例えば細菌または酵母細胞を用いることが好ましいであろう。
例えば、印刷中のT.R.Fouts et al.,Vaccine（1995）13、Tacket C.O.et al.,Infect.Immun.（1992）60,536-541およびHone et al.,J.Chim.Invest.（1992）90,412-420に（ワクチンサポートとしてヒトでその評価について）記載されているようなSalmonellaを発現系として含んでなるワクチンを用いることが可能である。
このタイプのワクチンは、本発明によるペプチドを生産する細胞、特に細菌細胞、またはChad P Muller,Immunology Today,vol.15,No.20,1994,p.458-459に記載されているある株の他の予防接種ベクターの使用を要する。
本発明によるペプチドまたはタンパク質を生産する細胞は、特にタンパク質が細胞の表面で発現されるとき、および細胞が無毒性かつ非病原性（弱毒化されたまたは死んだ株）であるが、精製後に用いられるペプチドおよび／またはタンパク質を生産するためにも使用できるときには、そのまま用いることができる。
このため、細菌細胞と、更に酵母またはそれより高等の細胞、特に動物、植物または昆虫細胞も得ておくことが有利かもしれない。
本発明の場合には、特にC.J.Arntzel et al.,Vaccine 94に記載された技術を用いて植物源のワクチンの使用を行うことが可能である。
細胞系によりペプチドまたはタンパク質の発現を行わせる技術と、精製技術は公知である。
既に記載されているように、ＤＮＡ配列の活性を高めるアジュバント、特にＤＮＡと複合体を作る成分、例えばカチオン性脂質またはリポソームもしくは微粒子タイプの構造と共に、本発明による組成物を用いることが可能である。
本発明は、本発明によるペプチドに対する抗体を含有した組成物、または本発明によるペプチドに対する抗体をコードする配列を含有した組成物にも関する。
もちろん、抗体をベースにした組成物の使用は、前者がヒトへの投与に適合していることを要する；それらは特に公知技術によりヒト化された抗体であるか、またはＤＮＡ配列からその場で直接発現される。
本発明は、本発明のペプチドに対する、ＨＩＶウイルスを中和できる抗体の使用にも関し、特に本発明は、このタイプの抗体を含む抗血清、または例えば免疫精製により上記血清から得られる抗体に関する。
本発明は、本発明によるエピトープの１つに対する抗体の存在が患者の血清で検出されることを特徴とする、診断方法にも関する。
この方法は、抗体を同定するいずれか公知の方法、特にＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法と、それから派生するすべての方法により行える。
これらすべての方法は、好ましくは、上記された抗原性ペプチドへの問題の抗体の結合と、その後でこの結合の視覚化に基づいている。この診断にはかなり関心がある；実際に、例では、血清反応陽性の個体が、本発明による抗体を有するＨＩＶの場合に、非常に多くの場合で進行せず、即ち彼らはエイズを発症させないことを示している。この場合に、その診断は非常に好ましく、高価な治療を避けることが可能である。これは妊娠の場合に特に当てはまり、母親でこれら抗体の存在（ＨＩＶ＋）は新生児の非感染に至るらしい。
本発明による組成物の生産は、公知の技術、化学的ルートによるタンパク質の合成、化学的ルートによるＤＮＡの合成またはＰＣＲタイプ増幅による増殖によって行える。タンパク質の場合、これらは適切な合成を用いた組換えルートにより得ることもできる。
下記例は、本発明の他の特徴および利点を証明することを可能にするであろう。
添付図面において、
-図１Ａおよび１Ｂは、様々な抗原についてＲ７Ｖ-ＫＬＨで免疫されたウサギの血清の反応性を示したＥＬＩＳＡについて表し、
-図２は、特にβ２ｍで免疫されたウサギの抗血清の反応性を示したＥＬＩＳＡについて表し、
-図３Ａ〜３Ｄは、異なる抗血清と選択されたペプチドとのＥＬＩＳＡについて表し、
-図４は、異なる抗β２ｍ抗体でのＲ７Ｖに関するＥＬＩＳＡについて表し、
-図５は、抗β２ｍ抗体およびウサギ血清でのＲ７Ｖ-ＢＳＡおよびβ２ｍに関するＥＬＩＳＡについて表し、
-図６〜１３は、ＭＴ４およびＰＢＬにおいてＨＩＶウイルスの異なる単離体の中和に対する異なる患者の血清の効果を示した図について表す。
例１
この例では、キャリアタンパク質にカップリングされた選択ペプチドに対するウサギの免疫反応を証明することを可能にしている。
ペプチド抗原７ＡＡをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）にカップリングさせ、完全フロイントアジュバントの存在下でウサギに注入する。
動物をＤ０、Ｄ１４、Ｄ２８、Ｄ４２に完全フロイントアジュバントの存在下で免疫し、試験採血を免疫の３５、４９、５６および７９日前に行う。
用いられたペプチドはＲＶ７-ＫＬＨ、Ｓ７Ｋ-ＫＬＨおよびＦ７Ｅ-ＫＬＨである。
ペプチドＲ７Ｖ（ＲＴＰＫＩＱＶ）は、カップリングを行うために、２アミノ酸で伸長させた。免疫原として用いられた構造はＲＴＰＫＩＱＶＧＹである。
免疫されたウサギ６１８の抗体をＥＬＩＳＡで測定し、様々なキャリアタンパク質にカップリングされた（ＫＬＨ、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）またはＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）にカップリングされた）ペプチドをウェルの底で用いた。
図は、血清の２つの希釈液ｄ１００およびｄ１０００、即ち１／１００および１／１０００希釈液で、または異なる時間で得られた結果を表している。
ＥＬＩＳＡ法は下記のように適用する：
ＥＬＩＳＡ法
１）９６ウェルプレート（Immulon IV-Dynatech）への抗原の付着
・炭酸緩衝液ｐＨ９．６で抗原を希釈する
→（Ａｇ）最終＝１μg/ml
・１００μl／ウェル、即ち１００ｎｇ／ウェルで分配する
・３７℃で２時間または４℃で一夜インキュベートする（湿気雰囲気）
２）洗浄
・０．０５％ＰＢＳ／Tween２０の溶液で５回洗浄
３）ウェルの飽和
・１０％ＰＢＳ／ウマ（またはウシ）血清の溶液３００μl／ウェルで分配する
・３７℃で１時間インキュベートする（湿気雰囲気）
４）洗浄（２）と同一）
５）特異的抗血清とのインキュベート
・１０％ＰＢＳ／ウマ血清で血清を（１／５０、１／１００、１／１０００）希釈する
・１００μl／ウェルで分配し、３７℃で１時間インキュベートする
（湿気雰囲気）
６）洗浄（２）と同一）
７）第二抗体（ペルオキシダーゼにカップリングされたヒツジＩｇ〜ヒトＩｇ）とのインキュベート
・１０％ＰＢＳ／ウマ血清で第二抗体を２／１０００希釈する
・１００μl／ウェルで分配し、３７℃で１時間インキュベートする
（湿気雰囲気）
８）洗浄（２）と同一）
９）ＯＰＤによる視覚化
・ホスホクエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）２５ｍｌにＯＰＤ１０ｍｇを溶解させる
・最後にＨ2Ｏ2１０μlを加える
・１００μl／ウェルで分配し、暗所下室温で３０分間インキュベートする（４０５ｎｍで読取る）
・１２．５％Ｈ2ＳＯ4５０μlで反応を停止させる
１０）４９２ｎｍで読取る
図１Ａおよび１Ｂは、Ｒ７Ｖ-ＫＬＨで免疫されたウサギ６１８で得られた結果を示す。
抗Ｒ７Ｖ反応性は、Ｒ７Ｖ-ＢＳＡおよびＢＳＡ間の差異を、抗Ｒ７Ｖ反応性が血清の抗ＫＬＨ応答により遮蔽されているＲ７Ｖ-ＫＬＨおよびＫＬＨと比較してみると、明らかに現れている。抗Ｒ７Ｖ反応性はＤ１３２よりもＤ６８の方が強いことに、留意されるべきだ。
反応の特異性は、ＢＳＡタンパク質が用いられると大きい。
図２も、オリジナルタンパク質β２ｍの良好な認識を示している。
免疫されたウサギの抗血清は、Ｒ７Ｖ-ＢＳＡと、たとえＰ１との反応性が弱いとしても、Ｒ７Ｖを選択するために用いられたＰ１、Ｐ４およびＰ９と称されるオリジナルペプチドとで、高い反応性を証明している（図３Ａ〜３Ｄ）。
図４は、Ｂ１Ｇ６およびＢ２Ｇ２．２によるＲ７Ｖの認識が用量に依存して、Ｃ２１．４８の認識が良くないことを証明している；したがって、ｍＡｂ Ｂ１Ｇ６およびＢ２Ｇ２．２が相当ペプチドを選択するために用いられることが好ましい。
これらの結果は、ＢＳＡにカップリングされたＲ７Ｖエピトープが良好な免疫反応を生じうることを証明している。
例２
ＨＩＶ-１ ＬＡＶ ｇｐ１２０のＶ３ループ中へのＲ７Ｖの導入
組換えプロウイルスの構築
この例の目的は、ＨＩＶ-１ ＬＡＶ ｇｐ１２０の第三可変領域Ｖ３中にＲ７Ｖ配列を導入することである。
方法
キメラ組換えウイルスをＰＣＲ特異性変異誘発により構築した。Ｒ７Ｖ配列と、ｇｐ１２０のＶ３領域の７アミノ酸がＲ７Ｖ配列で置換されたＨＩＶ-１ ＬＡＶとをベースにした２つのコンストラクトを得た。変異配列の位置は下記表に示されている：
ベクターBluescript中にクローニングされたＨＩＶ-１ ＬＡＶのＥｃｏＲＩ5278-ＸｈｏＩ8401断片を、後のコンストラクトのための鋳型として用いた。第一段階では、一端でＢｇｌII制限部位を含むプライマーと、他端でＲ７Ｖをコードするヌクレオチド配列とに隣接するＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅によりＲＰＬおよびＰＬＧコンストラクトについて合成した。用いられる変異誘発オリゴヌクレオチドは、ＲＰＬコンストラクトの場合に（＋）プライマーＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＡＣＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡおよび（−）プライマーＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡＣＴＴＴ、ＰＬＧコンストラクトの場合に（＋）プライマーＣＧＴＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡおよび（−）プライマーＧＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＡＣＧＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＴＣＴからなっていた。第二段階では、各コンストラクトについて２つのＰＣＲ産物を混合し、ＢｇｌII制限部位を含むプライマーを用いて増幅させた。ＲＰＬおよびＰＬＧ断片を酵素ＢｇｌIIで開裂させ、ＢｇｌIIで開裂されたＨＩＶ-１ ＬＡＶのＥｃｏＲＩ5278-ＸｈｏＩ8401断片を含むベクターBluescript中に挿入した。Ｒ７Ｖ配列に加えて、増幅プライマーはヌクレオチド配列に修飾を含んでおり、それはアミノ酸配列の追加修飾なしにＲＰＬおよびＰＬＧコンストラクトに各々新たなＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩ制限部位を出現させる。新たな制限部位を用いて、変異配列をスクリーニングした。最後に、ＲＰＬおよびＰＬＧコンストラクトを含んだＨＩＶ-１ ＬＡＶのＥｃｏＲＩ5278-ＸｈｏＩ8401断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いた相同的組換えによりプラスミドｐＮＬ４-３中に挿入した。コンストラクトを制限酵素分析によりチェックした。
真核細胞のトランスフェクション
E.coli ＴＧ１ ２００ｍｌのプラスミドＤＮＡをQiagenミディプレパレーションキットにより抽出および精製した。ＣＯＳ細胞
の半集密培養物をカルシウム共沈降技術によりプラスミド７μｇでトランスフェクトした。翌日、細胞の単層をグリセロールで処理し、ＣＥＭ細胞系または健常者ドナーから得られるＰＨＡにより活性化された一次血液リンパ球（ＰＢＬ、１０6細胞／ｍｌ）との共培養物中にいれた。ＣＥＭまたはＰＢＬ細胞を２日後に単層のＣＯＳ細胞から分離して、別に培養した。
ウイルスの生産
ＣＯＳまたはＰＢＬ細胞から得られた遊離細胞上澄１ｍｌを超遠心し、沈降したウイルスを標準逆転写酵素反応によりチェックした。一部の実験では、細胞上澄１００μlをｐ２４ｇａｇタンパク質の生産について試験した。
４×１０6のＣＯＳ細胞をカルシウム共沈降技術によりプラスミド７μｇでトランスフェクトした。次いで、ＣＥＭ細胞を最終用量５ｍｌで４×１０5細胞／ｍｌの量で加えた。共培養の２日後に、懸濁状態のＣＥＭ細胞を単層のＣＯＳ細胞から分離した。ＣＥＭ培養上澄の逆転写酵素活性はcpm/mlで示されている。
２．５×１０6のＰＢＬを、５０００cpm/１０6ＰＢＬの量でトランスフェクション後に得られた１９９４年１２月１９日の無細胞上澄で感染させた（表１）。トランスフェクション後１７日目に、２×１０6の新たに単離されたＰＢＬを２×１０6の感染ＰＢＬに加えた（ＲＰＬ１＋ＰＢＬ、ＰＬＧ２＋ＰＢＬ）。培養上澄の逆転写酵素活性はcpm/mlで示されている。
４×１０6のＣＯＳ細胞をカルシウム共沈降技術によりプラスミド７μｇでトランスフェクトした。次いで、ＰＨＡで刺激されたＰＢＬ細胞を最終用量５ｍｌで１０6細胞／ｍｌの量で加えた。共培養の２日後に、懸濁状態のＰＢＬを単層のＣＯＳ細胞から分離した。ＰＢＬ培養上澄の逆転写酵素活性はcpm/mlで示されている。
例３
この例の目的は、ＨＩＶのインヒビターでありうる抗体（抗β2ミクログロブリン抗体）を患者の血清で検出するために、特に進行していない患者の血清で保護抗体の存在を証明するために、選択されたペプチドを用いることである。“進行していない患者”または“ＮＰ”とは、１０年間以上も血清反応陽性であって、エイズを発症していない、特にＴ４細胞レベルが正常である患者を表す。
物質および方法
１／用いられるペプチドを合成して、Neosystem（フランス）によりＢＳＡにカップリングさせた。
２／患者の血清はＥＬＩＳＡで使用前に−２０℃または−８０℃で貯蔵する。
３／ヒトまたはウサギＩｇに対する第二抗体はAmersham（フランス）から得た。ＯＰＤはSigma（フランス）から得る。
血清反応陽性患者の血清でのＥＬＩＳＡ
１／患者の血清中における抗Ｒ７Ｖ抗体の存在（力価１／１００および１／１０００）
２／進行していない（培養でウイルス複製のない）人々の試験血清４６例のうち、血清１６例はＲ７Ｖに陽性であり（３７％）、２７例は１／１００に陰性のままであり（６３％）、血清３例は調べることが不可能である（表１）。
３／進行していない患者４６例のうち、３４例を抗ペプチド抗体：Ｒ７Ｖ、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ９の検出について試験した。血清１４例は少くとも１つのペプチドに陽性であり（５１．８％）、１３例は１／１００に陰性のままである。血清４例は陽性または陰性に分類することができなかった（表２）。
例４
下記試験では、抗Ｒ７Ｖ抗体を有するものの進行していない患者で、様々なＨＩＶ単離体、特にＢＲＵおよびＮＤＫを中和する抗体を検出することを可能にした。これは、本発明による治療で生じる抗体のＨＩＶに対する保護特徴と中和との間で良好な相関を示すことができる。
物質および方法
ＭＴ４細胞の培養
ＭＴ４細胞は不死細胞（ＣＤ４＋）であって、成人のＴ白血病に本来由来するＨＩＶ-１の細胞病原性効果に対して非常に感受的である。その細胞を１０％牛胎児血清、１％グルタミンおよび１％抗生物質で補充されたＲＰＭＩ培地の存在下で培養する。
ＰＢＬの培養
リンパ球を、１０％牛胎児血清、１％グルタミン、１％抗生物質、２μg/mlポリブレン、２０IU/mlインターロイキン２（ＩＬ-２）を含む完全ＲＰＭＩ培地中において、フィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ Ｐ）で３日間刺激する。次いで細胞を洗浄し、完全ＲＰＭＩ培地中１０6細胞／ｍｌの量で培養する。
中和試験
血清を試験で用いる前に、補体除去およびロ過する。
ＭＴ４の中和
血清を０．８ｍｌの全容量で２４ウェルプレート（Costar）で希釈する。ＨＩＶ-１ ＢＲＵウイルス（ストック溶液の１０-1希釈液１００μl）またはＨＩＶ-１ ＮＤＫウイルス（ストック溶液の１０-3希釈液１００μl）を加え、混合液を３７℃および５％ＣＯ2で１時間３０分にわたりインキュベートする。次いで細胞を２００μl／ウェルおよび１．５×１０6細胞／ｍｌの量で分配する。感染の３日後に、培養物を１０％ＲＰＭＩ培地で（１／３）希釈する。ＨＩＶ-１ウイルスによる細胞の感染は、シンシチウム（多核巨細胞）の形成を観察することにより、顕微鏡下で毎日モニターする。異なる血清によるウイルスの中和は、（＋）原型ＨＩＶにより誘導されるシンシチウムの形成と比較して、シンシチウムの不在（−）またはほんのわずかなシンシチウム（＋／−）により決める。
ＰＢＬの中和
血清（５０μl）を９６ウェルプレートでＨＩＶ-１ ＢＲＵウイルス（ストック溶液の２×１０-1希釈液５０μl）と混合し、３７℃で５％ＣＯ2に１時間３０分おく。次いで混合液を２４ウェルプレート（Costar）中の１０6ＰＢＬに加え、培養物を３７℃および５％ＣＯ2で３日間維持する。次いで細胞を洗浄し、２５ｃｍ2培養フラスコ中１０6細胞／ｍｌの量で培養する。ウイルスの生産は、“逆転写酵素”活性をアッセイすることにより、３または４日毎にモニターする。
“逆転写酵素”（ＲＴ）活性のアッセイ
遠心培養上澄（１５００ｒｐｍ、ＲＴ、１０分間）１ｍｌをＴＬ１００ローター（Beckman）で超遠心（９５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により１００倍濃縮する。得られたペレットをＮＴＥ緩衝液-０．１％ Triton Ｘ１００ １０μlに溶解する。酵素反応は下記反応混合液：５０ｍＭ Tris ｐＨ７．８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭジチオトレイトール、オリゴｄＴ１２-１８ ０．２５ OD/ml、ポリｒＡ ０．２５OD/mlおよび3ＨｄＴＴＰ ２．５μCi ５０μl中で行う。３７℃で１時間インキュベート後、反応産物を２０％トリクロロ酢酸で沈降させ、Millipore膜でロ過し、β放射能を測定する。結果はCMP/mlで表示している。
中和実験のレポート
ペプチドＲ７Ｖに対する抗体は、出願人により開発された特異的ＥＬＩＳＡにより、ＨＩＶ＋患者の血清で検出した。サーチは、２つの原型ウイルス株ＨＩＶ-１ ＢＲＵおよびＮＤＫに対する中和活性の存在について、これらの血清で行った。２種の中和試験を、一方ではＭＴ４細胞系（シンシチウムの形成で追跡する）、他方では健常末梢血リンパ球、ＰＢＬ（“逆転写酵素”活性で追跡する）で行った。
ＭＴ４で得られた結果
試験された患者１３例において、中和血清活性は彼らのうち６例で検出された（表３〜５）：
-血清２例はＨＩＶ-１ ＮＤＫを中和する：
ＺＵＭ ＡＭ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＣＯＣ ＰＨ（ＥＬＩＳＡ陰性）
-血清２例はＨＩＶ-１ ＢＲＵを中和する：
ＭＥＣ ＥＶ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＯＵＡ ＶＥ（ＥＬＩＳＡ陰性）
-血清２例はＨＩＶ-１ ＢＲＵおよびＨＩＶ-１ ＮＤＫを中和する：
ＳＡＵ ＣＨ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＢＵＢ ＪＥ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＰＢＬで得られた結果
実験は、ＭＥＣ ＥＶ、ＳＡＵ ＣＨおよびＢＵＢ ＪＥの血清（１／５０）と、血清反応陰性個体の血清とで行った。中和活性はＳＡＵ ＣＨ血清と血清反応陰性の血清で検出されなかった。他方、２つの原型ウイルス株ＨＩＶ-１ ＢＲＵおよびＮＤＫに対する中和活性は、血清ＭＥＣ ＥＶおよびＢＵＢ ＪＥで検出された（図６〜１３）。
例５
相当ペプチドを検出することができる方法
抗Ｂ１Ｇ６ β２モノクローナル抗体によるＨＩＶ-１ ＮＤＫの中和に関する選択ペプチドの効果
プロトコール
濃度１００μg/mlまたは５０μg/ml（ストック溶液４０μlまたは２０μl、５mg/ml）のペプチドを、静かに撹拌しながら、３７℃で水浴上のチューブ中で２時間にわたり、１１０μlの全容量でＢ１Ｇ６ ５μg/ml（１mg/mlのストック溶液１０μl）と共にプレインキュベートする。次いで、ＨＩＶ-１ ＮＤＫ（ストック溶液の２×１０-4希釈液１００μl）を加え、チューブを水浴上３７℃で１時間インキュベートする。次いで、チューブを２つに分け、各１００μlを２４ウェルプレートで１０6ＰＢＬに加える。細胞を５％ＣＯ2の雰囲気下３７℃で３日間培養する。３日目に細胞を洗浄し、培地に入れて、２５ｃｍ3丸底フラスコで少くとも２０〜２５日間増殖させる。ウイルスの生産は逆転写酵素（ＲＴ）のアッセイで３または４日毎にモニターする。
結果
ペプチドＲ７ＶおよびＦ７Ｅは、ＰＢＬによるＨＩＶ-１ ＮＤＫの生産について、モノクローナル抗体Ｂ１Ｇ６の中和効果を打消すことができる。Ｒ７Ｖペプチドの配列を修飾したところ、６つの新たなペプチド（１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０）のうち３つのペプチド１８５、１８９および１９０はＲ７Ｖの打消し効果を失った。
例６
抗Ｒ７Ｖ抗体の存在と疾患の進行との相関
ＨＩＶに感染した患者９０例の血清サンプルを用いる。彼らは下記のように分けられる：３年間以上無症状の患者２８例、長期生存者２４例およびエイズにかかった患者３８例。血清反応陰性ボランティアドナー６９例からなるコントロール群も血液バンクから得た。
リンパ球を間接免疫蛍光法によりカウントし、Epic Profile（Coultronics,Margency,France）により分析した。β２ｍ血清レベルを免疫拡散法（El Nanorid Kit）により測定した。ｐ２４抗原レベルをCoulter ｐ２４検出キット（Coultronics,Margency,France）により試験した。
抗Ｒ７Ｖ抗体の血清濃度をＥＬＩＳＡにより検出する。結果はＢ１Ｇ６モノクローナル抗体相当物の濃度としてμg/mlで表示されている。
中和試験
ヒト血清を補体除去して、Ｂ１Ｇ６相当物２００μg/mlまたは１００μg/mlまで希釈する。ＨＩＶ含有１００ＴＣＩＤ50５０μlを３７℃および５％ＣＯ2で９０分間にわたり９６ウェルプレートで希釈血清５０μl（全容量１００μl）と共にプレインキュベートする。ウイルスおよび血清を含有した反応混合液を、８×１０4ＭＴ４細胞の追加後に２回（血清の最終希釈倍率１／１２０から１／２０まで）、感染の３日後に更に３回希釈する。ＭＴ４系におけるＨＩＶの融合誘導効果、即ちウイルスによる感染の指標としてシンシチウムの形成は、培養ウェルで７日間モニターする。逆転写酵素活性は感染の７日後に無細胞上澄４００μlで測定する。
抗Ｒ７Ｖ抗体レベルの平均値を各患者および各グループについて計算する。ＨＩＶに感染した人々の血清は抗Ｒ７Ｖ抗体を含有しており、ＨＩＶ血清反応陽性の血清はＨＩＶ血清反応陰性の血清よりも有意に高い抗Ｒ７Ｖ抗体濃度を示す。抗Ｒ７Ｖ抗体レベルは、Ｂ１Ｇ６相当物として表示すると、ＨＩＶに感染したグループとＨＩＶに感染していないグループとで、各々３５〜２５５８μg/ml（ｎ＝９０）および２７〜１７９０μg/ml（ｎ＝６９）である。
次いで、ＨＩＶ患者のグループを彼らの臨床状態により３つのカテゴリーに分ける：長期間にわたりＨＩＶについて血清反応陽性であって、エイズ症状なしに３年間以上研究所でモニターされてきた患者からなる、進行していないもののグループ（ＮＰ）；長期間エイズにかかっている人々からなる、長期生存者のグループ（ＬＴＳ）；最後に、予後の悪いエイズにかかった人々からなる、進行しているグループ。
抗Ｒ７Ｖ抗体は進行しているグループ（３５〜６３０μg/ml）と比較して無症状グループ（９１〜２５５８μg/ml）で有意に増加しているが（Ｐ＝０．００１）、有意差はＬＴＳグループ（５９〜１８６４μg/ml）と比較して観察されない。同様に、ＬＴＳグループは進行しているグループよりも高い抗Ｒ７Ｖレベルを有している（ｐ＝０．００４）。健常者と比較して、進行しているグループでは抗Ｒ７Ｖ抗体レベルに差異がない。
進行しているグループにおいて、研究所へ最後に来てから間もなく亡くなった患者（３５〜５０８μg/ml、ｎ＝２３）と、病気だがなお生きている患者（７７〜５８６μg/ml、ｎ＝１４）との間で、抗Ｒ７Ｖ抗体レベルについて明らかに区別できる（ｐ＜０．０３）。
長期追跡研究では、抗Ｒ７Ｖ抗体レベルと、循環中における全リンパ球数、ＣＤ４およびＣＤ８細胞、ｐ２４およびβ２ｍのような他の生物学的パラメーターとの相関を確立することができなかった。
Ｒ７ＶレベルはＮＰ患者でずっと安定であるが、ＬＴＳ患者では変動しているようだ。
ＥＬＩＳＡ試験を患者血清の生物活性と関連付けるために、中和試験は、指標ＭＴ４細胞において、２種の非関連ウイルス、ＨＩＶ-１ ＬＡＶ株と、高度に細胞病原性のＨＩＶ-１ ＮＤＫ株で行った。血清希釈倍率は、中和混合物でＢ１Ｇ６相当物５μｇを得られるように調整した。この濃度は、Ｂ１Ｇ６抗体による感染を中和する上で最適と決められた。表５でみられるように、選択された血清１８例のうち１７例は、ＮＤＫおよびＬＡＶ双方によるＭＴ４細胞の感染を防いでいる。培養物中でＢ１Ｇ６相当物５μｇを得るために、試験された血清１８例のうち１３例は、１／５０以下の希釈倍率を要した。存在しうる血清成分による非特異的活性を排除するために、低Ｂ１Ｇ６相当物レベルのこれら血清を１／１００希釈して、中和試験に用いた。培養物中のＢ１Ｇ６相当物の量は５μｇ以下であった（２．５〜０．３μg/ml）。血清１４例のうち９例（６４％）は、１／１００希釈で双方のＨＩＶ株、ＬＡＶおよびＮＤＫをなお中和した。コントロールとして用いられた健常者ドナーからの血清３例は中和活性を示さない。
配列表
配列番号１
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１５アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号２
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１５アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号３
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１５アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号４
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号５
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号６
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号７
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号８
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号９
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１０
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１１
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１２
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１３
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：８アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１４
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１５
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：８アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１６
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：９アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１７
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１８
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号１９
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号２０
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号２１
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列番号２２
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
図面の説明
図１Ａの説明
図１Ｂの説明
図２の説明
Ｒ７Ｖまたはβ２ｍに対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ
ウサギ６１８（Ｒ７Ｖ-ＫＬＨで免疫）血清希釈倍率１／１００
図３Ａの説明
ペプチドでコートされたウェルにおけるウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ
図３Ｂの説明
免疫されたウサギの血清についてのＥＬＩＳＡ
図３Ｃの説明
免疫されたウサギの血清についてのＥＬＩＳＡ
図３Ｄの説明
免疫されたウサギの血清についてのＥＬＩＳＡ
図４の説明
Ｒ７Ｖに対するＢ１Ｇ６、Ｃ２１．４３、Ｂ２Ｇ２．２ ｍＡｂのＥＬＩＳＡ
図５の説明
Ｒ７Ｖ-ＢＳＡまたはβ２のＥＬＩＳＡ
図６の説明
ＰＢＬで血清ＭＥＣ ＥＶ（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＢＲＵ-１の中和
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図７の説明
ＰＢＬでＢＵＢ ＪＥの血清（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＢＲＵ-１の中和
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図８の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１ ＢＲＵ-１の生産に関する血清ＳＡＵ ＣＨ（１／５０）の効果
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図９の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１の生産に関するＨＩＶ患者の血清の効果
−△− ＳＮ５
−△− ＳＮ５′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図１０の説明
ＰＢＬで血清ＭＥＣ ＥＶ（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＮＤＫの中和
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
図１１の説明
ＰＢＬで血清ＢＵＢ ＪＥ（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＮＤＫの中和
−△− ＢＵＢ ＪＥ ５０
−△− ＢＵＢ ＪＥ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
図１２の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１ ＮＤＫの生産に関する血清ＳＡＵ ＣＨ（１／５０）の効果
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
図１３の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１ ＮＤＫの生産に関するＨＩＶ患者の血清の効果
−△− ＳＮ５ ５０
−△− ＳＮ５ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
更に詳しくは、本発明は哺乳動物、特にヒトでＨＩＶウイルスを直接または間接的に中和しうる免疫反応を生じさせることができるペプチドに関する。
ＨＩＶ-１複製の阻害においてβ2-ミクログロブリン（β２ｍ）に対するモノクローナル抗体の重要性は、特に特許ＥＰ-Ｂ-０，４７０，９８９と様々な文献で既に記載されている。
特に、これらの抗体は２つのメカニズムで、即ち直接ウイルスで、およびβ２ｍを伴う細胞で作用することを証明することが可能であった。
本発明はこれらの予備的な要素を発展させたものであり、ＨＩＶウイルスを完全にまたは部分的に中和する抗体を作ることができる、β２ｍから得られるかまたは等価構造を有する、ペプチド配列の同定に基づいている。
用いられるメカニズムの複雑さからみて、“ＨＩＶウイルスの中和”とは、ウイルスを破壊するおよび／またはその増殖を妨げるin vivo効果を有したメカニズムを意味すると理解される。
in vitroにおいて、これらの中和抗体は、血清反応陰性の女性の授精のために、ＨＩＶに血清反応陽性の男性の精液のような、ヒトに再接種または再導入させるべき体液を中和する上で用いることができる。
しかしながら、更に一般的には、本発明は高い変異力を有した寄生体またはウイルスタイプの感染性病原体に対して特に使用できる、新規なワクチンアプローチに基づいている。伝統的予防接種の関係においては、感染性病原体の成分に対する中和抗体を作ることが求められているが、例えばＨＩＶのような病原体が高い変異力を示すときには、この戦略では、変異体および耐性単離体へと非常に急速に変遷していく特定の単離体について、せいぜい限られた結果を出せるだけである。
新規なワクチンアプローチは異なる考え方に基づいており、周期中に細胞内相を有するいくつかの感染性病原体に適用しうる。
宿主の感染細胞から感染性病原体の増殖中に、感染性病原体が宿主細胞の決定基の成分を運び去ることは、ある病原体で知られているか、または特に本発明の一部を構成するＨＩＶの場合にはそれを証明することが可能である。
本発明の主題の１つは、感染性病原体自体ではなく、それが運び去る決定基の成分をターゲットとして取り上げることにあり、たとえ病原体自体が変異していたとしても一定のままであるこれらの細胞決定基に対して予防接種を行うことができる。
このタイプのアプローチは、抗原が宿主細胞に結合されていること、という直接的制限をもちろん有しており、細胞外感染性病原体により運び去られたときだけさらされる細胞決定基の潜在エピトープ、あるいは細胞によるその自然提示に非免疫原性であって、ビリオンの表面に現れたときに修飾されるエピトープに関し、このような予防接種を行うことだけが可能である。
例えば、ＨＩＶの場合には、β2-ミクログロブリンがＨＩＶウイルスの増殖中とその細胞外継代中にさらされるいくつかの潜在エピトープを有していることを証明することができた。したがって、予防接種の場合に、一方で自己免疫反応と、他方で試験された異なるＨＩＶ単離体に結合されているエピトープがないため、その予防接種は有効であり、これはウイルス自体の変異と無関係である。
このタイプの予防接種は、特に細胞内寄生体と、例えばＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶおよびＨＩＶのようなエンベロープウイルスについて選択することができる。
このタイプの予防接種はすべての場合に用いることはできないが、より伝統的なアプローチに抵抗する感染性病原体にとって非常に有用な代替法となりうることは、はっきり理解されるであろう。
したがって、本発明は、細胞外継代中に細胞内感染性病原体により運ばれて、感染性病原体によりさらされる細胞要素の少くとも１つの潜在エピトープを含んでなることを特徴とする、感染性病原体に対するワクチンに関する。
好ましくは、この感染性病原体は寄生体またはエンベロープウイルスであり、潜在エピトープは細胞の表面近くに位置している。
“潜在エピトープ”とは、隠されているかまたは修飾されていて、そのため免疫系により外来であると認識され、このため対応決定基の破壊で自己免疫反応を生じずに、予防接種に使用できる、宿主の細胞決定基のエピトープを表す意味である。
潜在エピトープは、明らかにさらされて、即ち感染性病原体により運ばれたときに免疫系により接近および認識されるべきである（潜在しているままだと、予防接種は不可能であろう）。
β2-ミクログロブリンの場合には、このタイプのエピトープの存在を証明することができ、尿路によるβ2-ミクログロブリンの排出中に実際に天然形でみられる。
したがって、本発明は、配列番号１〜２２または等価配列に相当する少くとも１つのペプチドを活性成分として含んでなることで特徴付けられる、ＨＩＶ感染の治療または予防用の組成物に関する。“等価配列”とは、in vitroでモノクローナル抗体Ｂ１Ｇ６またはＢ２６２．２によるＨＩＶウイルスの中和を行わせる配列を表した意味である。
これらのペプチドは、上記のようなβ2-ミクログロブリンの潜在エピトープを構成している。
本発明によるペプチドは以下である：
０１-Ｐ１ ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡ
（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ-Ｓｅｒ-Ａｒｇ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ａｌａ）
０２-Ｐ４ ＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＤＧＥ
（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ-Ｖａｌ-Ａｓｐ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｌｙｓ-Ａｓｐ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ）
０３-Ｐ９ ＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶ
（Ａｌａ-Ｃｙｓ-Ａｒｇ-Ｖａｌ-Ａｓｎ-Ｈｉｓ-Ｖａｌ-Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ）
モノクローナル抗体Ｂ１Ｇ６またはＢ２Ｇ２．２によるウイルスの中和を行わせる、これら１５アミノ酸のより小さな部分（７アミノ酸）を用いることも可能である：
０４-Ｒ-７-Ｖ ＲＴＰＫＩＱＶ
（Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）
０５-Ｓ-７-Ｋ ＳＱＰＫＩＶＫ
（Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ）
０６-Ｆ-７-Ｅ ＦＨＰＳＤＩＥ
（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
共通構造ＰＫＩ（３アミノ酸）が、関与している単位であるらしい；このため下記アミノ酸修飾がある：
０７-ＴＬＳＲＴＰＫＩＱＶ（Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）Ｎｏ．１８５
０８-ＩＹＬＴＱＰＫＩＫＶ（Ｉｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｔｈｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｌｙｓ-Ｖａｌ）Ｎｏ．１８６
０９-ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹ（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ）Ｎｏ．１８７
１０-ＴＬＳＱＰＫＩＶＫＮ（Ｔｈｒ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ａｓｎ）Ｎｏ．１８８
１１-ＩＱＲＴＰＱＩＶＫＷ（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ｔｒｐ）Ｎｏ．１８９
１２-ＩＱＲＴＰＮＩＶＫＷ（Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ａｓｎ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ｔｒｐ）Ｎｏ．１９０
システインおよびグリコシル化部位を導入することも可能である：
１３-ＣＹＮＰＳＤＩＥ（Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
１４-ＹＣＮＰＥＳＴ（Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｇｌｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ）
１５-ＮＦＬＮＣＹＶＳ（Ａｓｎ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ）
１６-ＬＮＣＹＶＳＰＳＤ（Ｌｅｕ-Ａｓｎ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ）
最後に、種（マウス、霊長類、ウサギ、モルモット）により異なるバリエーションを用いたペプチドを用いることが可能である：
１７-ＫＴＰＱＩＱＶ（Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）
１８-ＦＨＰＰＱＩＥ（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ-Ｇｌｎ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
１９-ＦＨＰＰＨＩＥ（Ｐｈｅ-Ｈｉｓ-Ｐｒｏ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｕ）
２０-ＡＥＰＫＴＶＹ（Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ）
２１-ＳＱＰＫＴＶＹ（Ｓｅｒ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ）
２２-ＩＬＳＲＴＰＫＩＱＶ（Ｉｌｅ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｉｌｅ-Ｇｌｎ-Ｖａｌ）
配列番号１〜２２のこれらペプチドは優先的選択のみを含んでいる；上記されたようにして、等価ペプチドをみつけることが可能である。
例５は、等価ペプチドを同定することを可能にする方法について記載している。
これらのペプチドは、好ましくはキャリア系に結合される；これは特に免疫反応を行わせるために上記ペプチドのＮおよび／またはＣ末端に連結された１以上のタンパク質断片であってもよい；それらは“複合化タンパク質”と称される。使用できるタンパク質の中では、特に免疫原性の知られたアルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）、ＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）または他のタンパク質が挙げられる。ジスルフィド架橋のような非ペプチド結合でまたはカルシウムイオンによる結合で連結されたタンパク質またはタンパク質断片を考えることも可能である。
本発明による様々なペプチドの研究中に、これは本発明をいずれかに制限するはずがない理論にすぎないが、ＰＫＩ構造が必須の役割を果たしていることがわかった。プロリンは立体配座を決めて、四級ペプチド立体配置の可能性を制限するアミノ酸である。これらの条件下において、ＫＩ（Ｌｙｓ、Ｉｌｅ）は抗体と反応するとさらされる位置に付いている。
これらの条件下において、キャリアタンパク質の構築に際して、接近しうるＰＫＩ構造を残しておける構造を好ましくは用意しておくことが勧められる。
Ｐ１、Ｐ９およびＰ１０で選択された領域の構造の分析は、可能なアミノ酸を決めるために、特にＲＴＰＫＩＱＶ領域で、アラニンを用いて各アミノ酸を別々に置換する選択のような方法により行える。各ペプチドのビオチニル化と、その後で結合の喪失を調べるために抗体でのＥＩＡによる選択を用いた技術を用いることも可能である。
このため、高い予防接種活性を有するリポタンパク質を作るために、問題のエピトープと非タンパク質成分、例えば多糖および／または脂質との複合化を考えることが可能である；ここでも、共有結合またはその他を考えることが可能である。
これら様々なタイプの化合物は、化学合成によるか、または組換えタンパク質の生産分野で知られる技術を用いた組換えルートにより得られる。
組換え技術の柔軟性は、複数の同一または異なるエピトープを有して、最終産物の活性を高めうるタンパク質を生産することを可能にする。本発明による組成物中に入った様々な成分の同時発現を考えることも可能である。
本発明の面の１つによれば、ペプチドがＨＩＶの公知構造タンパク質中に導入されることが可能であろう；特に、対象のペプチドがｇｐ１２０のＶ３ループの超可変領域中に挿入されたコンストラクト（construct）が使用できる。
ｇｐ１２０のＶ３領域は、主要ＨＩＶ-１中和ドメインであって、ウイルストロピズムの主決定基の１つである。結果的に、このタイプの変異体はＲ７Ｖに連結されたＨＩＶ-１の中和とその宿主スペクトルの変更を研究する上で有用である。ＨＩＶ-１の単離体の中におけるｇｐ１２０のＶ３領域の高い変異性が、この領域の優先性のもう１つの理由である。Ｖ３領域における７アミノ酸の配列の置換は、ＨＩＶ-１ゲノムの別なより保存性の領域における変異よりも、存在しうる組換体を生じる大きなチャンスを有していると思われた。組換体タンパク質ｇｐ１２０／Ｒ７Ｖは、多量の免疫原Ｒ７Ｖを得るために、タンパク質の発現に適した系で並行して発現させることができる。
キャリアタンパク質の使用は必須でない；場合により他のキャリア系を用意することが可能である。“キャリア系”とは、問題のペプチドに対する免疫反応を生じる単位に導くことができるか、または排除、特に速やかなタンパク質分解からペプチドを保護することができる成分を表した意味である。
本発明による組成物は、ペプチドおよび／またはタンパク質の免疫原性を増加させる成分、特に特異的なまたはそうでない免疫アジュバント、例えばフロイントアジュバント、多糖または相当化合物も含んでいてよい。
これらは予防接種分野で公知の方法である。
本発明による組成物は、選択される投与経路、特に注射経路に適合した形で用いることができる。しかしながら、本発明による組成物では、粘膜の保護を誘導するために、他の経路、特に経口またはエアゾール経路により用いられることが可能であろう。
本発明は、上記されたペプチドおよび／またはタンパク質をその場で発現させるように投与される組成物にも関する。
特に、本発明は、上記のような少くとも１つの潜在エピトープ、特に配列番号１〜２２を有するペプチドおよび／またはこれらのペプチドを有するタンパク質、あるいは上記のような問題のペプチドとカップリングできるかまたは等価配列を有するタンパク質を発現することができるＤＮＡ発現カセットに関する。
“等価配列”とは、上記されたような等価ペプチドをコードする配列を表した意味である。
これらのＤＮＡ発現カセットは、もちろん、その場での発現向けに直接用いても、あるいは上記されたように使用できるペプチドまたはタンパク質を生産させるために用いてもよい。
ＤＮＡ配列を用いる予防接種系は公知であって、文献で既に広く記載されている。
それらは本質的にヒトで抗原性タンパク質の発現または細胞で抗原性タンパク質の発現を行わせる系であって、それが予防接種に用いられる；形質転換細胞が外部で治療される宿主細胞であるとき、治療はex vivoであると言われる。
発現系は高度に多様的である；それらは特にVICAL社の特許および特許出願、ＷＯ９０／１１０９２に記載されているような、特に“むきだしのＤＮＡ”タイプ系であってもよい。この場合に、ペプチドまたはそのペプチドを含むタンパク質をコードするＤＮＡはそのまま注入される；この注入はコードされたタンパク質の発現をいくつかの場合において導く。
これらの文献に含まれた情報は、参考のため本記載に明らかに含まれる。
特に発現を高めるために、“むきだしのＤＮＡ”系を、それら自体の発現系を含めて用いることも可能であろう。
特にプラスミドまたはウイルスタイプの系の組込みまたは自律複製により発現を促進させる系を用いることも可能であろう。
挙げられたペプチド配列の発現用の系の中では、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスタイプウイルス、または他の更に最近の系、例えばポリオウイルスを用いる系が挙げられるべきだ。
ベクターの中では、体液性応答を生じる、粘膜のためのベクターが好ましくは用いられる。
特に下記の他のウイルスも、ワクチンを得るために使用できる：
-N.R.Rabinovich et al.,Science,1994,265,1401-1404および引用文献に記載されているようなアデノウイルス
-Sue E.Crowford,Journal of Virology,Sept.1994,p.5945-5952に記載されているようなロタウイルス
-ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、更にPaoletti and Mossによる論文に記載されているようなカナリアポックスのような動物ポックスウイルス
-N.R.Rabinovich et al.（1994）に記載されているようなインフルエンザウイルス
様々な抗原用の予防接種ベクターとしてポリオウイルスを用いることを可能にした技術は、特にRaul Andino et al.,Science,265,1448-51に記載されている。
本発明の関係で使用できるこのタイプのコンストラクトは、経口で使用できるワクチンを得ることを可能にする；これをするために、ペプチド、場合によりキャリアタンパク質をコードする配列は、ポリオウイルス、例えば弱毒化Sabinウイルス中にクローニングされる；様々なエピトープをコードするウイルスのカクテルを用いることも可能である。
宿主、特にヒト宿主の細胞でタンパク質の発現用にプラスミドまたはウイルスの使用は公知であり、詳細には説明しない。具体的な構築物は、選択される宿主、エピトープおよびベクターに明らかに依存している。
例えば遺伝子療法の関係で提案されているような細胞ワクチンを用いること、患者から細胞を集めること、上記のようなベクターでそれらを形質転換すること、更にはタンパク質をその場で発現させるためにそれらを再移植することも可能である。
しかしながら、予防接種の場合には、この方法は非常に便利というわけではない。例えば表面で問題のタンパク質を発現させて、一部の場合にタンパク質の免疫原性を増加させる、多数で得られる細胞、例えば細菌または酵母細胞を用いることが好ましいであろう。
例えば、印刷中のT.R.Fouts et al.,Vaccine（1995）13、Tacket C.O.et al.,Infect.Immun.（1992）60,536-541およびHone et al.,J.Chim.Invest.（1992）90,412-420に（ワクチンサポートとしてヒトでその評価について）記載されているようなSalmonellaを発現系として含んでなるワクチンを用いることが可能である。
このタイプのワクチンは、本発明によるペプチドを生産する細胞、特に細菌細胞、またはChad P Muller,Immunology Today,vol.15,No.20,1994,p.458-459に記載されているある株の他の予防接種ベクターの使用を要する。
本発明によるペプチドまたはタンパク質を生産する細胞は、特にタンパク質が細胞の表面で発現されるとき、および細胞が無毒性かつ非病原性（弱毒化されたまたは死んだ株）であるが、精製後に用いられるペプチドおよび／またはタンパク質を生産するためにも使用できるときには、そのまま用いることができる。
このため、細菌細胞と、更に酵母またはそれより高等の細胞、特に動物、植物または昆虫細胞も得ておくことが有利かもしれない。
本発明の場合には、特にC.J.Arntzel et al.,Vaccine 94に記載された技術を用いて植物源のワクチンの使用を行うことが可能である。
細胞系によりペプチドまたはタンパク質の発現を行わせる技術と、精製技術は公知である。
既に記載されているように、ＤＮＡ配列の活性を高めるアジュバント、特にＤＮＡと複合体を作る成分、例えばカチオン性脂質またはリポソームもしくは微粒子タイプの構造と共に、本発明による組成物を用いることが可能である。
本発明は、本発明によるペプチドに対する抗体を含有した組成物、または本発明によるペプチドに対する抗体をコードする配列を含有した組成物にも関する。
もちろん、抗体をベースにした組成物の使用は、前者がヒトへの投与に適合していることを要する；それらは特に公知技術によりヒト化された抗体であるか、またはＤＮＡ配列からその場で直接発現される。
本発明は、本発明のペプチドに対する、ＨＩＶウイルスを中和できる抗体の使用にも関し、特に本発明は、このタイプの抗体を含む抗血清、または例えば免疫精製により上記血清から得られる抗体に関する。
本発明は、本発明によるエピトープの１つに対する抗体の存在が患者の血清で検出されることを特徴とする、診断方法にも関する。
この方法は、抗体を同定するいずれか公知の方法、特にＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法と、それから派生するすべての方法により行える。
これらすべての方法は、好ましくは、上記された抗原性ペプチドへの問題の抗体の結合と、その後でこの結合の視覚化に基づいている。この診断にはかなり関心がある；実際に、例では、血清反応陽性の個体が、本発明による抗体を有するＨＩＶの場合に、非常に多くの場合で進行せず、即ち彼らはエイズを発症させないことを示している。この場合に、その診断は非常に好ましく、高価な治療を避けることが可能である。これは妊娠の場合に特に当てはまり、母親でこれら抗体の存在（ＨＩＶ＋）は新生児の非感染に至るらしい。
本発明による組成物の生産は、公知の技術、化学的ルートによるタンパク質の合成、化学的ルートによるＤＮＡの合成またはＰＣＲタイプ増幅による増殖によって行える。タンパク質の場合、これらは適切な合成を用いた組換えルートにより得ることもできる。
下記例は、本発明の他の特徴および利点を証明することを可能にするであろう。
添付図面において、
-図１Ａおよび１Ｂは、様々な抗原についてＲ７Ｖ-ＫＬＨで免疫されたウサギの血清の反応性を示したＥＬＩＳＡについて表し、
-図２は、特にβ２ｍで免疫されたウサギの抗血清の反応性を示したＥＬＩＳＡについて表し、
-図３Ａ〜３Ｄは、異なる抗血清と選択されたペプチドとのＥＬＩＳＡについて表し、
-図４は、異なる抗β２ｍ抗体でのＲ７Ｖに関するＥＬＩＳＡについて表し、
-図５は、抗β２ｍ抗体およびウサギ血清でのＲ７Ｖ-ＢＳＡおよびβ２ｍに関するＥＬＩＳＡについて表し、
-図６〜１３は、ＭＴ４およびＰＢＬにおいてＨＩＶウイルスの異なる単離体の中和に対する異なる患者の血清の効果を示した図について表す。
例１
この例では、キャリアタンパク質にカップリングされた選択ペプチドに対するウサギの免疫反応を証明することを可能にしている。
ペプチド抗原７ＡＡをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）にカップリングさせ、完全フロイントアジュバントの存在下でウサギに注入する。
動物をＤ０、Ｄ１４、Ｄ２８、Ｄ４２に完全フロイントアジュバントの存在下で免疫し、試験採血を免疫の３５、４９、５６および７９日前に行う。
用いられたペプチドはＲＶ７-ＫＬＨ、Ｓ７Ｋ-ＫＬＨおよびＦ７Ｅ-ＫＬＨである。
ペプチドＲ７Ｖ（ＲＴＰＫＩＱＶ）は、カップリングを行うために、２アミノ酸で伸長させた。免疫原として用いられた構造はＲＴＰＫＩＱＶＧＹである。
免疫されたウサギ６１８の抗体をＥＬＩＳＡで測定し、様々なキャリアタンパク質にカップリングされた（ＫＬＨ、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）またはＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）にカップリングされた）ペプチドをウェルの底で用いた。
図は、血清の２つの希釈液ｄ１００およびｄ１０００、即ち１／１００および１／１０００希釈液で、または異なる時間で得られた結果を表している。
ＥＬＩＳＡ法は下記のように適用する：
ＥＬＩＳＡ法
１）９６ウェルプレート（Immulon IV-Dynatech）への抗原の付着
・炭酸緩衝液ｐＨ９．６で抗原を希釈する
→（Ａｇ）最終＝１μg/ml
・１００μl／ウェル、即ち１００ｎｇ／ウェルで分配する
・３７℃で２時間または４℃で一夜インキュベートする（湿気雰囲気）
２）洗浄
・０．０５％ＰＢＳ／Tween２０の溶液で５回洗浄
３）ウェルの飽和
・１０％ＰＢＳ／ウマ（またはウシ）血清の溶液３００μl／ウェルで分配する
・３７℃で１時間インキュベートする（湿気雰囲気）
４）洗浄（２）と同一）
５）特異的抗血清とのインキュベート
・１０％ＰＢＳ／ウマ血清で血清を（１／５０、１／１００、１／１０００）希釈する
・１００μl／ウェルで分配し、３７℃で１時間インキュベートする
（湿気雰囲気）
６）洗浄（２）と同一）
７）第二抗体（ペルオキシダーゼにカップリングされたヒツジＩｇ〜ヒトＩｇ）とのインキュベート
・１０％ＰＢＳ／ウマ血清で第二抗体を２／１０００希釈する
・１００μl／ウェルで分配し、３７℃で１時間インキュベートする
（湿気雰囲気）
８）洗浄（２）と同一）
９）ＯＰＤによる視覚化
・ホスホクエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）２５ｍｌにＯＰＤ１０ｍｇを溶解させる
・最後にＨ2Ｏ2１０μlを加える
・１００μl／ウェルで分配し、暗所下室温で３０分間インキュベートする（４０５ｎｍで読取る）
・１２．５％Ｈ2ＳＯ4５０μlで反応を停止させる
１０）４９２ｎｍで読取る
図１Ａおよび１Ｂは、Ｒ７Ｖ-ＫＬＨで免疫されたウサギ６１８で得られた結果を示す。
抗Ｒ７Ｖ反応性は、Ｒ７Ｖ-ＢＳＡおよびＢＳＡ間の差異を、抗Ｒ７Ｖ反応性が血清の抗ＫＬＨ応答により遮蔽されているＲ７Ｖ-ＫＬＨおよびＫＬＨと比較してみると、明らかに現れている。抗Ｒ７Ｖ反応性はＤ１３２よりもＤ６８の方が強いことに、留意されるべきだ。
反応の特異性は、ＢＳＡタンパク質が用いられると大きい。
図２も、オリジナルタンパク質β２ｍの良好な認識を示している。
免疫されたウサギの抗血清は、Ｒ７Ｖ-ＢＳＡと、たとえＰ１との反応性が弱いとしても、Ｒ７Ｖを選択するために用いられたＰ１、Ｐ４およびＰ９と称されるオリジナルペプチドとで、高い反応性を証明している（図３Ａ〜３Ｄ）。
図４は、Ｂ１Ｇ６およびＢ２Ｇ２．２によるＲ７Ｖの認識が用量に依存して、Ｃ２１．４８の認識が良くないことを証明している；したがって、ｍＡｂ Ｂ１Ｇ６およびＢ２Ｇ２．２が相当ペプチドを選択するために用いられることが好ましい。
これらの結果は、ＢＳＡにカップリングされたＲ７Ｖエピトープが良好な免疫反応を生じうることを証明している。
例２
ＨＩＶ-１ ＬＡＶ ｇｐ１２０のＶ３ループ中へのＲ７Ｖの導入
組換えプロウイルスの構築
この例の目的は、ＨＩＶ-１ ＬＡＶ ｇｐ１２０の第三可変領域Ｖ３中にＲ７Ｖ配列を導入することである。
方法
キメラ組換えウイルスをＰＣＲ特異性変異誘発により構築した。Ｒ７Ｖ配列と、ｇｐ１２０のＶ３領域の７アミノ酸がＲ７Ｖ配列で置換されたＨＩＶ-１ ＬＡＶとをベースにした２つのコンストラクトを得た。変異配列の位置は下記表に示されている：
真核細胞のトランスフェクション
E.coli ＴＧ１ ２００ｍｌのプラスミドＤＮＡをQiagenミディプレパレーションキットにより抽出および精製した。ＣＯＳ細胞
ウイルスの生産
ＣＯＳまたはＰＢＬ細胞から得られた遊離細胞上澄１ｍｌを超遠心し、沈降したウイルスを標準逆転写酵素反応によりチェックした。一部の実験では、細胞上澄１００μlをｐ２４ｇａｇタンパク質の生産について試験した。
例３
この例の目的は、ＨＩＶのインヒビターでありうる抗体（抗β2ミクログロブリン抗体）を患者の血清で検出するために、特に進行していない患者の血清で保護抗体の存在を証明するために、選択されたペプチドを用いることである。“進行していない患者”または“ＮＰ”とは、１０年間以上も血清反応陽性であって、エイズを発症していない、特にＴ４細胞レベルが正常である患者を表す。
物質および方法
１／用いられるペプチドを合成して、Neosystem（フランス）によりＢＳＡにカップリングさせた。
２／患者の血清はＥＬＩＳＡで使用前に−２０℃または−８０℃で貯蔵する。
３／ヒトまたはウサギＩｇに対する第二抗体はAmersham（フランス）から得た。ＯＰＤはSigma（フランス）から得る。
血清反応陽性患者の血清でのＥＬＩＳＡ
１／患者の血清中における抗Ｒ７Ｖ抗体の存在（力価１／１００および１／１０００）
２／進行していない（培養でウイルス複製のない）人々の試験血清４６例のうち、血清１６例はＲ７Ｖに陽性であり（３７％）、２７例は１／１００に陰性のままであり（６３％）、血清３例は調べることが不可能である（表１）。
３／進行していない患者４６例のうち、３４例を抗ペプチド抗体：Ｒ７Ｖ、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ９の検出について試験した。血清１４例は少くとも１つのペプチドに陽性であり（５１．８％）、１３例は１／１００に陰性のままである。血清４例は陽性または陰性に分類することができなかった（表２）。
下記試験では、抗Ｒ７Ｖ抗体を有するものの進行していない患者で、様々なＨＩＶ単離体、特にＢＲＵおよびＮＤＫを中和する抗体を検出することを可能にした。これは、本発明による治療で生じる抗体のＨＩＶに対する保護特徴と中和との間で良好な相関を示すことができる。
物質および方法
ＭＴ４細胞の培養
ＭＴ４細胞は不死細胞（ＣＤ４＋）であって、成人のＴ白血病に本来由来するＨＩＶ-１の細胞病原性効果に対して非常に感受的である。その細胞を１０％牛胎児血清、１％グルタミンおよび１％抗生物質で補充されたＲＰＭＩ培地の存在下で培養する。
ＰＢＬの培養
リンパ球を、１０％牛胎児血清、１％グルタミン、１％抗生物質、２μg/mlポリブレン、２０IU/mlインターロイキン２（ＩＬ-２）を含む完全ＲＰＭＩ培地中において、フィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ Ｐ）で３日間刺激する。次いで細胞を洗浄し、完全ＲＰＭＩ培地中１０6細胞／ｍｌの量で培養する。
中和試験
血清を試験で用いる前に、補体除去およびロ過する。
ＭＴ４の中和
血清を０．８ｍｌの全容量で２４ウェルプレート（Costar）で希釈する。ＨＩＶ-１ ＢＲＵウイルス（ストック溶液の１０-1希釈液１００μl）またはＨＩＶ-１ ＮＤＫウイルス（ストック溶液の１０-3希釈液１００μl）を加え、混合液を３７℃および５％ＣＯ2で１時間３０分にわたりインキュベートする。次いで細胞を２００μl／ウェルおよび１．５×１０6細胞／ｍｌの量で分配する。感染の３日後に、培養物を１０％ＲＰＭＩ培地で（１／３）希釈する。ＨＩＶ-１ウイルスによる細胞の感染は、シンシチウム（多核巨細胞）の形成を観察することにより、顕微鏡下で毎日モニターする。異なる血清によるウイルスの中和は、（＋）原型ＨＩＶにより誘導されるシンシチウムの形成と比較して、シンシチウムの不在（−）またはほんのわずかなシンシチウム（＋／−）により決める。
ＰＢＬの中和
血清（５０μl）を９６ウェルプレートでＨＩＶ-１ ＢＲＵウイルス（ストック溶液の２×１０-1希釈液５０μl）と混合し、３７℃で５％ＣＯ2に１時間３０分おく。次いで混合液を２４ウェルプレート（Costar）中の１０6ＰＢＬに加え、培養物を３７℃および５％ＣＯ2で３日間維持する。次いで細胞を洗浄し、２５ｃｍ2培養フラスコ中１０6細胞／ｍｌの量で培養する。ウイルスの生産は、“逆転写酵素”活性をアッセイすることにより、３または４日毎にモニターする。
“逆転写酵素”（ＲＴ）活性のアッセイ
遠心培養上澄（１５００ｒｐｍ、ＲＴ、１０分間）１ｍｌをＴＬ１００ローター（Beckman）で超遠心（９５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により１００倍濃縮する。得られたペレットをＮＴＥ緩衝液-０．１％ Triton Ｘ１００ １０μlに溶解する。酵素反応は下記反応混合液：５０ｍＭ Tris ｐＨ７．８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭジチオトレイトール、オリゴｄＴ１２-１８ ０．２５ OD/ml、ポリｒＡ ０．２５OD/mlおよび3ＨｄＴＴＰ ２．５μCi ５０μl中で行う。３７℃で１時間インキュベート後、反応産物を２０％トリクロロ酢酸で沈降させ、Millipore膜でロ過し、β放射能を測定する。結果はCMP/mlで表示している。
中和実験のレポート
ペプチドＲ７Ｖに対する抗体は、出願人により開発された特異的ＥＬＩＳＡにより、ＨＩＶ＋患者の血清で検出した。サーチは、２つの原型ウイルス株ＨＩＶ-１ ＢＲＵおよびＮＤＫに対する中和活性の存在について、これらの血清で行った。２種の中和試験を、一方ではＭＴ４細胞系（シンシチウムの形成で追跡する）、他方では健常末梢血リンパ球、ＰＢＬ（“逆転写酵素”活性で追跡する）で行った。
ＭＴ４で得られた結果
試験された患者１３例において、中和血清活性は彼らのうち６例で検出された（表３〜５）：
-血清２例はＨＩＶ-１ ＮＤＫを中和する：
ＺＵＭ ＡＭ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＣＯＣ ＰＨ（ＥＬＩＳＡ陰性）
-血清２例はＨＩＶ-１ ＢＲＵを中和する：
ＭＥＣ ＥＶ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＯＵＡ ＶＥ（ＥＬＩＳＡ陰性）
-血清２例はＨＩＶ-１ ＢＲＵおよびＨＩＶ-１ ＮＤＫを中和する：
ＳＡＵ ＣＨ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＢＵＢ ＪＥ（ＥＬＩＳＡ陽性）
ＰＢＬで得られた結果
実験は、ＭＥＣ ＥＶ、ＳＡＵ ＣＨおよびＢＵＢ ＪＥの血清（１／５０）と、血清反応陰性個体の血清とで行った。中和活性はＳＡＵ ＣＨ血清と血清反応陰性の血清で検出されなかった。他方、２つの原型ウイルス株ＨＩＶ-１ ＢＲＵおよびＮＤＫに対する中和活性は、血清ＭＥＣ ＥＶおよびＢＵＢ ＪＥで検出された（図６〜１３）。
例５
相当ペプチドを検出することができる方法
抗Ｂ１Ｇ６ β２モノクローナル抗体によるＨＩＶ-１ ＮＤＫの中和に関する選択ペプチドの効果
プロトコール
濃度１００μg/mlまたは５０μg/ml（ストック溶液４０μlまたは２０μl、５mg/ml）のペプチドを、静かに撹拌しながら、３７℃で水浴上のチューブ中で２時間にわたり、１１０μlの全容量でＢ１Ｇ６ ５μg/ml（１mg/mlのストック溶液１０μl）と共にプレインキュベートする。次いで、ＨＩＶ-１ ＮＤＫ（ストック溶液の２×１０-4希釈液１００μl）を加え、チューブを水浴上３７℃で１時間インキュベートする。次いで、チューブを２つに分け、各１００μlを２４ウェルプレートで１０6ＰＢＬに加える。細胞を５％ＣＯ2の雰囲気下３７℃で３日間培養する。３日目に細胞を洗浄し、培地に入れて、２５ｃｍ3丸底フラスコで少くとも２０〜２５日間増殖させる。ウイルスの生産は逆転写酵素（ＲＴ）のアッセイで３または４日毎にモニターする。
結果
ペプチドＲ７ＶおよびＦ７Ｅは、ＰＢＬによるＨＩＶ-１ ＮＤＫの生産について、モノクローナル抗体Ｂ１Ｇ６の中和効果を打消すことができる。Ｒ７Ｖペプチドの配列を修飾したところ、６つの新たなペプチド（１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０）のうち３つのペプチド１８５、１８９および１９０はＲ７Ｖの打消し効果を失った。
抗Ｒ７Ｖ抗体の存在と疾患の進行との相関
ＨＩＶに感染した患者９０例の血清サンプルを用いる。彼らは下記のように分けられる：３年間以上無症状の患者２８例、長期生存者２４例およびエイズにかかった患者３８例。血清反応陰性ボランティアドナー６９例からなるコントロール群も血液バンクから得た。
リンパ球を間接免疫蛍光法によりカウントし、Epic Profile（Coultronics,Margency,France）により分析した。β２ｍ血清レベルを免疫拡散法（El Nanorid Kit）により測定した。ｐ２４抗原レベルをCoulter ｐ２４検出キット（Coultronics,Margency,France）により試験した。
抗Ｒ７Ｖ抗体の血清濃度をＥＬＩＳＡにより検出する。結果はＢ１Ｇ６モノクローナル抗体相当物の濃度としてμg/mlで表示されている。
中和試験
ヒト血清を補体除去して、Ｂ１Ｇ６相当物２００μg/mlまたは１００μg/mlまで希釈する。ＨＩＶ含有１００ＴＣＩＤ50５０μlを３７℃および５％ＣＯ2で９０分間にわたり９６ウェルプレートで希釈血清５０μl（全容量１００μl）と共にプレインキュベートする。ウイルスおよび血清を含有した反応混合液を、８×１０4ＭＴ４細胞の追加後に２回（血清の最終希釈倍率１／１２０から１／２０まで）、感染の３日後に更に３回希釈する。ＭＴ４系におけるＨＩＶの融合誘導効果、即ちウイルスによる感染の指標としてシンシチウムの形成は、培養ウェルで７日間モニターする。逆転写酵素活性は感染の７日後に無細胞上澄４００μlで測定する。
抗Ｒ７Ｖ抗体レベルの平均値を各患者および各グループについて計算する。ＨＩＶに感染した人々の血清は抗Ｒ７Ｖ抗体を含有しており、ＨＩＶ血清反応陽性の血清はＨＩＶ血清反応陰性の血清よりも有意に高い抗Ｒ７Ｖ抗体濃度を示す。抗Ｒ７Ｖ抗体レベルは、Ｂ１Ｇ６相当物として表示すると、ＨＩＶに感染したグループとＨＩＶに感染していないグループとで、各々３５〜２５５８μg/ml（ｎ＝９０）および２７〜１７９０μg/ml（ｎ＝６９）である。
次いで、ＨＩＶ患者のグループを彼らの臨床状態により３つのカテゴリーに分ける：長期間にわたりＨＩＶについて血清反応陽性であって、エイズ症状なしに３年間以上研究所でモニターされてきた患者からなる、進行していないもののグループ（ＮＰ）；長期間エイズにかかっている人々からなる、長期生存者のグループ（ＬＴＳ）；最後に、予後の悪いエイズにかかった人々からなる、進行しているグループ。
抗Ｒ７Ｖ抗体は進行しているグループ（３５〜６３０μg/ml）と比較して無症状グループ（９１〜２５５８μg/ml）で有意に増加しているが（Ｐ＝０．００１）、有意差はＬＴＳグループ（５９〜１８６４μg/ml）と比較して観察されない。同様に、ＬＴＳグループは進行しているグループよりも高い抗Ｒ７Ｖレベルを有している（ｐ＝０．００４）。健常者と比較して、進行しているグループでは抗Ｒ７Ｖ抗体レベルに差異がない。
進行しているグループにおいて、研究所へ最後に来てから間もなく亡くなった患者（３５〜５０８μg/ml、ｎ＝２３）と、病気だがなお生きている患者（７７〜５８６μg/ml、ｎ＝１４）との間で、抗Ｒ７Ｖ抗体レベルについて明らかに区別できる（ｐ＜０．０３）。
長期追跡研究では、抗Ｒ７Ｖ抗体レベルと、循環中における全リンパ球数、ＣＤ４およびＣＤ８細胞、ｐ２４およびβ２ｍのような他の生物学的パラメーターとの相関を確立することができなかった。
Ｒ７ＶレベルはＮＰ患者でずっと安定であるが、ＬＴＳ患者では変動しているようだ。
ＥＬＩＳＡ試験を患者血清の生物活性と関連付けるために、中和試験は、指標ＭＴ４細胞において、２種の非関連ウイルス、ＨＩＶ-１ ＬＡＶ株と、高度に細胞病原性のＨＩＶ-１ ＮＤＫ株で行った。血清希釈倍率は、中和混合物でＢ１Ｇ６相当物５μｇを得られるように調整した。この濃度は、Ｂ１Ｇ６抗体による感染を中和する上で最適と決められた。表５でみられるように、選択された血清１８例のうち１７例は、ＮＤＫおよびＬＡＶ双方によるＭＴ４細胞の感染を防いでいる。培養物中でＢ１Ｇ６相当物５μｇを得るために、試験された血清１８例のうち１３例は、１／５０以下の希釈倍率を要した。存在しうる血清成分による非特異的活性を排除するために、低Ｂ１Ｇ６相当物レベルのこれら血清を１／１００希釈して、中和試験に用いた。培養物中のＢ１Ｇ６相当物の量は５μｇ以下であった（２．５〜０．３μg/ml）。血清１４例のうち９例（６４％）は、１／１００希釈で双方のＨＩＶ株、ＬＡＶおよびＮＤＫをなお中和した。コントロールとして用いられた健常者ドナーからの血清３例は中和活性を示さない。
配列番号１
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１５アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１５アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１５アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：８アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：８アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：９アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：７アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
配列の型：アミノ酸
配列の長さ：１０アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
図１Ａの説明
Ｒ７Ｖまたはβ２ｍに対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ
ウサギ６１８（Ｒ７Ｖ-ＫＬＨで免疫）血清希釈倍率１／１００
ペプチドでコートされたウェルにおけるウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ
免疫されたウサギの血清についてのＥＬＩＳＡ
免疫されたウサギの血清についてのＥＬＩＳＡ
免疫されたウサギの血清についてのＥＬＩＳＡ
Ｒ７Ｖに対するＢ１Ｇ６、Ｃ２１．４３、Ｂ２Ｇ２．２ ｍＡｂのＥＬＩＳＡ
Ｒ７Ｖ-ＢＳＡまたはβ２のＥＬＩＳＡ
ＰＢＬで血清ＭＥＣ ＥＶ（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＢＲＵ-１の中和
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図７の説明
ＰＢＬでＢＵＢ ＪＥの血清（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＢＲＵ-１の中和
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図８の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１ ＢＲＵ-１の生産に関する血清ＳＡＵ ＣＨ（１／５０）の効果
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図９の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１の生産に関するＨＩＶ患者の血清の効果
−△− ＳＮ５
−△− ＳＮ５′
−▲− ＢＲＵ
−▲− ＢＲＵ′
図１０の説明
ＰＢＬで血清ＭＥＣ ＥＶ（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＮＤＫの中和
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０
−△− ＭＥＣ ＥＶ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
図１１の説明
ＰＢＬで血清ＢＵＢ ＪＥ（１／５０）によるＨＩＶ-１ ＮＤＫの中和
−△− ＢＵＢ ＪＥ ５０
−△− ＢＵＢ ＪＥ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
図１２の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１ ＮＤＫの生産に関する血清ＳＡＵ ＣＨ（１／５０）の効果
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０
−△− ＳＡＵ ＣＨ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
図１３の説明
ＰＢＬでＨＩＶ-１ ＮＤＫの生産に関するＨＩＶ患者の血清の効果
−△− ＳＮ５ ５０
−△− ＳＮ５ ５０′
−▲− ＮＤＫ ５-４
Claims (20)
- 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを活性成分として含んでなることを特徴とする、ＨＩＶ感染の治療または予防用の組成物。
- ペプチドがキャリアタンパク質に結合されている、請求項１に記載の組成物。
- キャリアタンパク質がペプチド結合によりペプチドのＮまたはＣ末端に連結された１以上のタンパク質断片からなる、請求項２に記載の組成物。
- キャリアタンパク質が非ペプチド結合によりペプチドに連結されている、請求項１に記載の組成物。
- いくつかのペプチドを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
- キャリアタンパク質がアルブミン、ＫＬＨおよびＭＡＰから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
- 非特異的免疫アジュバントを更に含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
- 配列番号４に示される配列からなるペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする、ＨＩＶ感染の治療および予防用の組成物。
- ＤＮＡ配列が、配列番号４に示されるペプチド配列からなるペプチドをコードしている、請求項８に記載の組成物。
- ＤＮＡ配列が発現ベクターにより保持されている、請求項８または９に記載の組成物。
- 発現ベクターが自律複製状態におかれている、請求項１０に記載の組成物。
- 発現ベクターが染色体組込み用のベクターである、請求項１０に記載の組成物。
- 発現ベクターが細菌プラスミドである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
- 発現ベクターが欠陥および／または非病原性ウイルスから全部または一部なる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
- ペプチドまたはＤＮＡ配列が宿主細胞で発現される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞が動物または植物細胞である、請求項１５に記載の組成物。
- 配列番号４に示される配列からなるペプチドに対する抗体。
- 請求項１７に記載された少くとも１種の抗体を含んでなる組成物。
- 請求項１７に記載された抗体の存在が免疫試験により検出されることを特徴とする、エイズの発症を検出する方法。
- 免疫試験がＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ試験である、請求項１９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR95/07914 | 1995-06-30 | ||
| FR9507914A FR2735984B1 (fr) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | Vaccin contre des agents infectieux ayant une phase intracellulaire, composition pour le traitement et la prevention des infections a hiv, anticorps et procede de diagnostic |
| PCT/FR1996/001006 WO1997002344A2 (fr) | 1995-06-30 | 1996-06-28 | Vaccin contre des agents infectieux, composition pour le traitement et la prevention des infections a hiv |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11509407A JPH11509407A (ja) | 1999-08-24 |
| JP4036895B2 true JP4036895B2 (ja) | 2008-01-23 |
Family
ID=9480577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50486697A Expired - Fee Related JP4036895B2 (ja) | 1995-06-30 | 1996-06-28 | 細胞内相を有する感染性病原体に対するワクチン、ｈｉｖ感染の治療および予防用組成物、抗体と診断方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6113902A (ja) |
| EP (1) | EP0835309B1 (ja) |
| JP (1) | JP4036895B2 (ja) |
| CN (1) | CN1117148C (ja) |
| AT (1) | ATE206456T1 (ja) |
| AU (1) | AU6462396A (ja) |
| CA (1) | CA2223825A1 (ja) |
| DE (1) | DE69615685T2 (ja) |
| DK (1) | DK0835309T3 (ja) |
| ES (1) | ES2165510T3 (ja) |
| FR (1) | FR2735984B1 (ja) |
| PT (1) | PT835309E (ja) |
| WO (1) | WO1997002344A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2235420A1 (en) | 1998-06-17 | 1999-12-17 | Paolo Renzi | Antisense oligonucleotides for treating or preventing atopic diseases and neoplastic cell proliferation |
| FR2836146B1 (fr) * | 2002-02-15 | 2005-01-07 | Urrma R & D | IMMUNOGLOBULINE IgG3 MARQUEUR DE PROTECTION CONTRE LES MALADIES VIRALES INFECTIEUSES ET SES UTILISATIONS |
| CN1745094A (zh) * | 2002-12-06 | 2006-03-08 | 新加坡综合医院有限公司 | 肽,其抗体,以及它们在中枢神经系统损伤的治疗中的用途 |
| TW200846363A (en) * | 2007-03-22 | 2008-12-01 | Urrma R & B | Novel human anti-R7V antibodies and uses thereof |
| EP2374470A1 (fr) * | 2010-04-08 | 2011-10-12 | Beta Innov | Utilisation thérapeutique de la protéine Beta2m |
| EP3512551A4 (en) * | 2016-09-16 | 2020-08-05 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | BLOCUS OF INTERACTIONS OF ALPHAF TOPROTEIN (AFP) WITH MOLECULES ASSOCIATED WITH MICROGLOBULIN BETA2 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK160944C (da) * | 1986-01-16 | 1991-10-21 | Novo Industri As | Modificerede beta2-mikroglobuliner og farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
| US5733550A (en) * | 1990-05-10 | 1998-03-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Method for enhancing the association of exogenous peptides with class I MHC molecules on the surface of antigen presenting cells with β-microglobulin |
| FR2675508A1 (fr) * | 1991-04-18 | 1992-10-23 | Tm Innovation | Compose comprenant une sequence peptidique neutralisant l'infection par le cytomegalovirus humain (hcmv) et composition le comportant. |
| GB9201023D0 (en) * | 1992-01-17 | 1992-03-11 | Medical Res Council | Vaccines |
| GB9214871D0 (en) * | 1992-07-13 | 1992-08-26 | Medical Res Council | Vaccines |
| US6696061B1 (en) * | 1992-08-11 | 2004-02-24 | President And Fellows Of Harvard College | Immunomodulatory peptides |
| GB9307371D0 (en) * | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Walls Alan J | Fusion proteins |
-
1995
- 1995-06-30 FR FR9507914A patent/FR2735984B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-28 DK DK96924033T patent/DK0835309T3/da active
- 1996-06-28 EP EP96924033A patent/EP0835309B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-28 US US08/973,551 patent/US6113902A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-28 AU AU64623/96A patent/AU6462396A/en not_active Abandoned
- 1996-06-28 CA CA002223825A patent/CA2223825A1/fr not_active Abandoned
- 1996-06-28 JP JP50486697A patent/JP4036895B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-28 PT PT96924033T patent/PT835309E/pt unknown
- 1996-06-28 AT AT96924033T patent/ATE206456T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-28 WO PCT/FR1996/001006 patent/WO1997002344A2/fr active IP Right Grant
- 1996-06-28 DE DE69615685T patent/DE69615685T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-28 CN CN96196335A patent/CN1117148C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-28 ES ES96924033T patent/ES2165510T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69615685D1 (de) | 2001-11-08 |
| WO1997002344A2 (fr) | 1997-01-23 |
| DK0835309T3 (da) | 2002-12-02 |
| ATE206456T1 (de) | 2001-10-15 |
| CN1193349A (zh) | 1998-09-16 |
| CN1117148C (zh) | 2003-08-06 |
| PT835309E (pt) | 2002-03-28 |
| AU6462396A (en) | 1997-02-05 |
| WO1997002344A3 (fr) | 1997-03-06 |
| DE69615685T2 (de) | 2002-08-08 |
| US6113902A (en) | 2000-09-05 |
| FR2735984A1 (fr) | 1997-01-03 |
| CA2223825A1 (fr) | 1997-01-23 |
| JPH11509407A (ja) | 1999-08-24 |
| EP0835309A2 (fr) | 1998-04-15 |
| FR2735984B1 (fr) | 1997-09-19 |
| EP0835309B1 (fr) | 2001-10-04 |
| ES2165510T3 (es) | 2002-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Induction of humoral and cellular immune responses to the human immunodeficiency type 1 virus in nonhuman primates by in vivo DNA inoculation | |
| Nara et al. | Persistent infection of chimpanzees with human immunodeficiency virus: serological responses and properties of reisolated viruses | |
| JP3871708B2 (ja) | 抗原的に標識した非感染性レトロウィルス様粒子 | |
| JP3851938B2 (ja) | 植物、動物、およびヒトのワクチンとして並びに免疫療法に有用な抗体の免疫優性エピトープの弱化 | |
| US8673307B1 (en) | HIV-1 anti-core neutralizing antibodies that target a conformational epitope within the ALPHA5-helix of GP120 | |
| US6544752B1 (en) | Anigenically-marked non-infectious retrovirus-like particles | |
| JPH0762031B2 (ja) | エイズウイルスおよびエイズウイルスのタンパク質に対する細胞性免疫を誘導する合成ペプチド | |
| US6518030B1 (en) | Antigentically-marked non-infectious retrovirus-like particles | |
| CZ362692A3 (en) | Expression of specific immunogens under the use of viral antigens | |
| EP0550599B1 (en) | Peptides for use in vaccination and induction of neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus | |
| WO1989006276A2 (en) | Hiv-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions | |
| JP2013520498A (ja) | 防御的抗ｈｉｖ−１抗体の産生を誘導する方法 | |
| HU214439B (hu) | Eljárás HIV-fertőzések kezelésére alkalmas monoklonális antitestek és peptidek, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények és vakcinák előállítására | |
| Choi et al. | Effects of natural sequence variation on recognition by monoclonal antibodies neutralize simian immunodeficiency virus infectivity | |
| JP4036895B2 (ja) | 細胞内相を有する感染性病原体に対するワクチン、ｈｉｖ感染の治療および予防用組成物、抗体と診断方法 | |
| Mitchell et al. | Antibodies to the putative SIV infection-enhancing domain diminish beneficial effects of an SIV gp160 vaccine in rhesus macaques | |
| JPH09512561A (ja) | ヒト免疫不全ウイルス感染に対する防御用合成ワクチン | |
| US20110262894A1 (en) | Vaccine against infectious agents having an intracellular phase, composition for the treatment and prevention of hiv infections, antibodies and methods of diagnosis | |
| JPH0570493A (ja) | ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）関連免疫調製物 | |
| JPH07504409A (ja) | ウィルス因子のタンパク質に免疫学的に近縁するペプチド及びその生物学的利用 | |
| WO1989005821A1 (en) | Hiv-related antigens and antibodies | |
| Sundaram et al. | Structural and immunogenicity analysis of chimeric B‐cell epitope constructs derived from the gp46 and gp21 subunits of the envelope glycoproteins of HTLV‐1 | |
| Palker et al. | The V3 domain of SIVmac251 gp120 contains a linear neutralizing epitope | |
| JPH02209889A (ja) | 合成親水性ペプチド | |
| WO1989005820A1 (en) | Hiv-related antigens and antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060926 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061226 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070219 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070316 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070522 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070808 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071002 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071031 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101109 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111109 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |