CN1745094A

CN1745094A - 肽,其抗体,以及它们在中枢神经系统损伤的治疗中的用途

Info

Publication number: CN1745094A
Application number: CNA2003801095329A
Authority: CN
Inventors: 肖志诚
Original assignee: SINGAPORE GENERAL HOSPITAL Pte
Current assignee: SINGAPORE GENERAL HOSPITAL Pte
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2006-03-08
Also published as: KR20050092366A; US7408028B2; DE60332481D1; EP1567545A2; CA2508847A1; JP2006526382A; WO2004052922A3; EP1567545B1; US20060205668A1; WO2004052922A2; AU2003288434A1; AU2003288434B2; ATE466870T1

Abstract

本申请提供了与髓磷脂蛋白Nogo，TNR和MAG的抑制性结构域发生相互作用的肽。这些肽可用于治疗CNS损伤，并用于开发进一步的治疗。还提供了针对所述髓磷脂蛋白的抑制性结构域来免疫受试者以便治疗CNS损伤的方法和物质。

Description

肽，其抗体，以及它们在中枢神经系统损伤的治疗中的用途

本发明涉及可用于CNS损伤例如脊髓损伤或卒中的治疗或开发所述治疗的物质和方法。

背景

身体内的许多组织，诸如皮肤，肝和外周神经，具有显著的损伤后自我修复的能力。反之，中枢神经系统(CNS)-包括脑和脊髓，几乎没有先天性修复能力。当轴突连接在成年人的脑或脊髓中被破坏时，它们显示极其有限的再生能力，但轴突可在胚胎CNS中以及成年人外周神经系统中生长并有效再生。导致CNS轴突不能再生的因素可分成两组：导致其不能再生的CNS神经元内在性质；以及可抑制轴突延伸的CNS环境中的外部因素。

CNS环境中的因素可阻止再生的观点来自20世纪早期。Ramon yCajal观察到成人CNS神经元的轴突突起延伸不能可通过给予它们外周神经的容许性环境而克服。约20年以后，David和Aguayo显示，视网膜神经元可在外周神经移植物中形成长的突出。随后，Schwab发现，培养物中的背根神经元可延伸其轴突穿过雪旺细胞，但避开寡突细胞以及富含脂肪的髓鞘(Schwab et al 1993)。

这些结果显示，再生不能不仅仅是CNS神经元的先天缺陷，CNS环境中的抑制因子也起重要作用。这些抑制因子主要位于白质束中损伤区处、由形成轴突的鞘的髓磷脂形成的胶质疤痕中。

CNS损伤后，坏死的中央区由胶质细胞和其它非神经元细胞浸润，并形成纤维疤痕。轴突不延伸通过疤痕，并且它们的生长似乎由疤痕抑制。有助于该抑制活性的分子成分包括细胞外基质糖蛋白腱生蛋白-R(TN-R)以及髓磷脂相关的神经突生长抑制物(myelin-associated neuriteoutgrowth inhibitor)髓磷脂相关的糖蛋白(MAG)和Nogo。

TN-R

TN-R见于多种细胞基质相互作用，其参与CNS发育和再生过程中的轴突引导的分子控制和神经细胞迁移(reviewed by Erickson，1993；Chiquet-Ehrismann et al.，1994；Pesheva et al.，2000；2001)。TN-R是腱生蛋白家族的最小成员，并由四种结构基序组成：N末端的富半胱氨酸片段，然后是4.5EGF-样重复。该区后面是9个连续的III型纤连蛋白-样结构域，并且在C末端TN-R与纤维蛋白原的β链和γ链相关。

TN-R主要由寡突细胞在髓磷脂形成开始和早期表达，并且在成年人中仍由一些寡突细胞表达。TN-R也在脊髓、视网膜、小脑和海马的一些神经元以及中间神经元中表达(Fuss et al.，1991；1993)。TN-R与其它胶质细胞来源的分子(即髓磷脂相关的糖蛋白和phosphacan-相关的分子)以高密度在CNS有髓轴突的郎维耶结(Ranvier node)中共定位(Xiaoet al.，1997：Yang et al，1999)。

TN-R可抑制或促进神经突生长，有赖于神经元细胞类型以及其存在的环境。当提供TN-R，作为明确的底物界限，背根神经节(DRG)，小脑和视网膜神经节神经元生长锥避免在这些分子上生长，但不会经诱导而受到破坏(collapse)。另一方面，当在与层粘连蛋白(强烈促进胚胎和成人轴突生长)的混合物(作为均一基质)中提供TN-R时，DRG生长锥显示受破坏的形态，并能够以比利用单独的层粘连蛋白时更快的速度前进。

利用与腱生蛋白分子上的不同表位结合的数种单克隆抗体，表皮生长因子样(EGF-L)重复和III型纤连蛋白同源性重复4-5被鉴定为导致生长锥排斥(growth cone repulsion)。

在体外，胚胎和成人视网膜神经节细胞轴突自小鼠视网膜外植体的生长在腱生蛋白-R或细菌表达的含EGF-L结构域的腱生蛋白-R片段的均质底物上明显减少。当两种分子都存在时，作为明确的底物界限，再生长的成人轴突不穿入含有腱生蛋白-R或EGF-L的区域。所有体外试验都是在层粘连蛋白存在的条件下进行的，提示腱生蛋白-R和EGF-L活跃地抑制轴突生长。神经突和生长锥在由含TN-R的GFG-L(氨基末端富半胱胺酸结构域加上EGF-样重复)，FN(纤连蛋白)1-2，FN3-5和FG(纤维蛋白原)结构域的片段包被的区域中受到排斥，并且EGF-L阻止海马神经元的神经突生长。

TN-R还通过EGF-L结构域在体外诱导轴突解束(Taylor et al.，1993；Xiao et al.，1996，1997，1998；Becker et al，1999；Becker et al，2000)。

成人大鼠橄榄小脑系统的3-乙酰吡啶诱导的损伤之后，含TN-R转录物的细胞密度在下橄榄核以及小脑皮质的白质中明显增加。免疫组织化学研究证实了这些在蛋白质水平的观察。

大鼠脊髓机械损伤以后，TN-R mRNA也发生上调(Wintergerst at al，1997；Deckner et al，2000)。

这些发现提示TN-R在受损CNS中的持续过表达可能导致成人轴突在体内的再生不能。

腱生蛋白-R是腱生蛋白家族成员，其在发育的神经系统中对细胞相互作用起重要作用，诸如神经元迁移，神经突生成(neutritognensis)，以及神经元再生。腱生蛋白-R主要由寡突细胞在髓磷脂形成开始以及早期表达，并在成人中继续由一些寡突细胞表达(Pesheva et.al.，1989；Fuss et al.，1991，1993；Wintergerst et.al.，1993；Ajemian A.et.al.，1994)。TN-R是多功能分子(Lochter和Schachner，1993；Pesheva et.al.，1993；Taylor et.al.，1993；Xiao et.al.，1996，1997，1998)，并且提示其为髓磷脂提取物的抑制成分。Xiao发现，TN-R的EGF-L结构域可抑制神经突生长。

MAG

MAG是免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，其由中枢和外周神经系统的成髓鞘胶质细胞表达，其中MAG分别占总髓磷脂蛋白的1和0.1％(Heape at al，1999)。MAG是轴突再生的有效抑制物，并且还可根据神经元的年龄和类型促进轴突生长。MAG抑制所有出生后年龄的视网膜神经元，上颈部神经节(superior cervical ganglion)神经元，脊神经元，以及海马神经元和背根神经节(DRG)神经元的神经突生长，但可促进胚胎脊髓神经元和新生儿DRG神经元的神经突生长(DeBellard at al，1996；Turnley et al，1998；Shen et al，1998；Yang et al，1999)。

MAG也可诱导生长锥萎陷(collapse)。60％的生后1天海马神经元的轴突生长锥在遭遇包被的重组MAG(rMAG)时萎陷。所述萎陷不能在用变性的rMAG时观察到(Li et al，1996)。可溶性dMAG(MAG细胞外结构域的蛋白水解片段，其从髓磷脂大量释放并可在体内发现)，以及嵌合的MAG-Fc可有效抑制神经突从P6DRG神经元的生长。这种抑制在MAG单克隆抗体被包括时受到阻断。

这些结果表明，在体内检测到的可溶性dMAG可导致受损后的哺乳动物CNS中的再生缺乏(Tang et al，1997；2001)。

MAG具有两个神经元识别位点，R118的唾液酸结合位点以及自前三个Ig结构域缺失的独特抑制位点(Tang et al，1997)。

MAG是免疫球蛋白基因超家族的确定成员，并且其显示对青年人小脑神经元以及成人背根神经节(DRG)神经元的神经突生长的稳定抑制作用(Mukhopadhyay et al.，1994)。MAG是具有626氨基酸的膜蛋白。已有报道称可溶性MAG(由胞外结构域组成)具有对神经突生长的抑制作用(Mckerracher et.al.，1994)。MAG的结构域由5个Ig-样结构域组成，并且证实前两个Ig-样结构域对于MAG与神经元膜之间的相互作用是重要的，而其它三个Ig-样结构域可能参与抑制作用(Collins et al.，1997)。

Nogo

Nogo是定位于CNS髓磷脂的高分子量整合膜蛋白，但不定位于PNS髓磷脂。Nogo具有三种同种型，命名为Nogo-A，-B和-C，其是通过可选拼接产生的。NI-250和NI-35首先被鉴定，并命名为Nogo的两种同种型；现在确定NI-250是Nogo-A，NI-35是Nogo-B。Nogo由CNS白质中的寡突细胞表达，并见于髓磷脂内片(leaflet)、外片以及内质网中。

Nogo的体外定性证实了其作为轴突延长的有效抑制物的功能。Nogo活性的体内中和导致轴突再生增强，CNS损伤后的功能恢复以及未受损CNS纤维中的可塑性增加。当将单克隆抗体mAb IN-1用于脊髓损伤的成年大鼠时，可促进体内的长距离再生以及功能恢复(Chen et al，2000；GrandPre et al；Merkler et al)。

这些发现提示，Nogo可作为导致CNS环境的非容许性质的主要因素。鉴定了Nogo的两种不同的抑制性结构域：Nogo-A的细胞内氨基末端结构域(NogoN)以及位于三种同种型Nogo-A，Nogo-B和Nogo-C的两个疏水结构域之间的短66残基区(Chen et al，2000；GrandPre et al，2000；Fournier et al，2001；Filbin，2003)，这些结构域显示在Science，Vol297(5584)，16 Aug 2002，p.1132-1134中。

Nogo-A由寡突细胞而非雪旺(schwann)细胞表达。其可抑制轴突延伸并破坏背根神经节生长锥(GrandPre et.al.，2000)。Nogo的神经突生长抑制活性可通过单克隆抗体IN-中和，所述抗体允许脊髓损伤以后的轴突再生以及功能性恢复(Chen et.al.，2000)。Nogo是具有1163个氨基酸的膜蛋白。C末端尾含有两个疏水跨膜结构域，所述两个结构域由66-残基疏水性细胞外结构域分离。该66残基细胞外结构域可抑制轴突生长(Fournier et.al.，2001)。

Huang等(1999)公开了刺激成人脊髓中的轴突再生的治疗性疫苗方法。

本发明的目的是提供通过克服髓磷脂对轴突再生的抑制效应对CNS损伤例如脊髓损伤的治疗或开发所述治疗的所用物质和方法。

发明内容

第一个总体方面，本发明人建议利用与主要髓磷脂蛋白的抑制性结构域相互作用的分子作为CNS损伤治疗的辅助治疗，以及用于开发进一步的治疗。

第二个总体方面，本发明人建议利用主要髓磷脂蛋白的抑制性结构域免疫受试者作为CNS损伤的辅助治疗。

用髓磷脂抗原免疫受试者而言似乎不可行，这是由于该方法诱导自身免疫性脱髓鞘疾病，导致不可接受的副作用。此外，一些髓磷脂抗体促进髓鞘再生(Rodriguez et al.，1987)，这对于轴突再生过程不利。但发明人的方法是，将主要髓磷脂蛋白的特异性抑制部分而不是整个髓磷脂蛋白作为疫苗的基础。针对所述抑制性部分激发的抗体将阻断髓磷脂对轴突再生的抑制效应。

第一方面

因此，本发明提供一种肽，其氨基酸序列由选自下组的氨基酸序列组成：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7).

这些序列每一个都代表数种肽的推定的氨基酸序列，所述肽已经由噬菌体展示鉴定为可与一或多种神经元生长抑制分子Nogo(具体地，Nogo-66结构域)，MAG和TN-R(具体地，TNR-EGFL)结合。

SEQ ID NO.1代表能与Nogo66结合的43种相同肽的序列，以及能与MAG结合的19种相同肽的序列。

SEQ ID NO.2代表能与Nogo66结合的8种相同肽的序列。

SEQ ID NO.3代表能与TNR-EGFL结合的18种相同肽的序列。

SEQ ID NO.4代表能与TNR-EGFL结合的3种相同肽的序列。

SEQ ID NO.5代表能与TNR-EGFL结合的1种相同肽的序列。

SEQ ID NO.6代表能与TNR-EGFL结合的1种相同肽的序列。

SEQ ID NO.7代表能与MAG结合的5种相同肽的序列。

其中，SEQ ID NO.1已经由噬菌体显示，其可在体外试验中结合Nog66和MAG以阻断Nog66和MAG对神经元细胞粘附的抑制效应。类似地，SEQ ID NO.3已经显示阻断TNR-EGFL的抑制效应。因此，优选的多肽由SEQ ID NO.1构成；另一优选的多肽由SEQ ID NO.3构成。

本发明提供了可多至60个氨基酸长的肽，其包含选自下组的氨基酸序列：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，

其中所述肽能够与Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合。

优选，所述肽的长度多至50个氨基酸，更优选多至40，多至30，多至25，多至20，多至19，多至18，多至17，多至16，多至15，多至14，多至13，多至12，多至11，多至10，多至9，或多至8个氨基酸。

优选的肽包含SEQ ID NO.1；另一优选的肽包含SEQ ID NO.3。

本发明还提供了长度多至60个氨基酸的肽，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的相应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，

其中，所述肽能够与Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合。

所述肽的优选大小如前所述。优选这样的肽，其具有至少5个与SEQ ID NO.1的相应残基相同的残基，或至少5个与SEQ ID NO.3的相应残基相同的残基。

优选相同残基的最小数目是6。

本发明还提供了组合物，其包含本发明的一或多种肽以及一或多种可药用的成分。

优选所述组合物配制成用于体内注射，优选用于直接注射入CNS。

本发明还提供了本发明的肽，其用于治疗方法中。所述应用可以用于CNS损伤，具体是脊髓损伤或卒中的治疗中。

本发明还提供了本发明的多肽在制备用于治疗CNS损伤，具体是脊髓损伤或卒中的药物中的用途。

本发明还提供了治疗CNS损伤的方法，所述方法包括将本发明的肽给药到患者中的CNS损伤处或其附近。具体地，本发明提供了治疗SCI或卒中的方法，所述方法包括给药患者具有氨基酸序列SEQ ID NO.1或3的肽，所述给药通过直接注入患者体内的SCI或卒中损伤位点进行。

本发明还提供了本发明的肽和/或其计算机生成的模型在设计能够与一或多种神经元生长抑制分子Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合的模拟物中的用途。

类似地，本发明提供设计本发明肽的模拟物的方法，所述模拟物可与一或多种神经元生长抑制分子Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合，所述方法包括：

(i)分析能与一或多种神经元生长抑制分子Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合的本发明的肽，确定对于定义药效基团的活性而言必不可少且重要的氨基酸残基；和

(ii)模拟(model)所述药效基团以设计和/或筛选具有所述生物活性的候选模拟物。

优选所述方法和/或用途包括体外测定候选模拟物与Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)的结合。在鉴定了能够进行所述体外结合的候选模拟物以后，优化候选模拟物用于体外应用。所述优化后，将所述优化的模拟物与一或多种可药用的成分配制在一起。

本发明还提供了表达由肽和噬菌体外壳蛋白组成的融合蛋白的噬菌体，使得所述肽显示在噬菌体病毒粒的表面，其中所述肽长度多至60个氨基酸，并包含这样的氨基酸序列，其具有至少4个与选自下组的氨基酸序列中的相应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。

优选本发明的肽的长度多至50氨基酸，更优选多至40，多至30，多至25，多至20，或多至15氨基酸。更优选，本发明的肽的长度多至8-12氨基酸，更优选6-10。优选相同残基的最小数目为5或6。

本发明还提供了筛选能够与Nogo(优选Nogo-66)，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合的肽的方法，包括以下步骤：

提供本发明的噬菌体，其分别表达不同的肽；和

筛选具有与Nogo，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合的能力的噬菌体。

可随后在体外试验中筛选被鉴定为能够与Nogo，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)结合的噬菌体，或者它们显示的多肽阻断Nogo，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)对神经元细胞粘附(adhesion)的抑制效应的能力。鉴定能够在体外试验中阻断Nogo，MAG和/或TN-R(优选TNR-EGFL)对神经元细胞粘附的抑制效应的肽以后，所述肽优选与一或多种可药用的成分配制在一起用于体内给药。

本发明还提供了搜索很可能减少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法包括询问数据库以鉴定多肽，或者编码多肽的核酸，所述多肽包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的对应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7).

所述数据库优选是cDNA数据库。其可为EST数据库。优选它是在哺乳动物CNS中表达的序列的数据库。特异性较低的数据库可以使用，但其产生较多的假阳性结果。

本发明还提供了搜索很可能减少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法利用能在严谨条件下与一种核酸序列杂交的寡核苷酸探针搜索cDNA文库，所述核酸序列编码具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的对应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。

所述cDNA文库优选哺乳动物文库，更优选人文库。所述文库优选来自CNS组织。

前两种方法中的每一种优选还包括这样的步骤，在鉴定了候选多肽或编码该候选多肽的核酸以后，检测所述多肽降低TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的能力。

第二方面

该方面，本发明提供了核酸载体，其包含编码选自下组的一或多种结构域的核酸：

(a)Nogo-A的N-末端(NogoN)结构域；

(b)Nogo-B的细胞外环(Nogo66)(也存在于Nogo-A和Nogo-C中)；

(c)MAG的第三到第五个免疫球蛋白样重复；和

(d)TN-R的EGF-样结构域。

TN-R EGF-L结构域已经在Xiao et al.(1996)中鉴定为能够抑制神经元细胞系和原代神经元的神经突体外生长。

所述载体包括所述核酸在哺乳动物细胞中表达所需的控制序列。优选所述载体是可购得的疫苗载体，其中插入了所述核酸。适宜且优选的可购得的疫苗载体包括pcDNA 3.1载体家族，具体是pcDNA 3.1⁺，以及pVAX 1(all from Invitrogen，San Diego，California，US)。

通常所述核酸将是DNA。

优选所述核酸编码至少两种结构域，更优选至少三种结构域，更优选它编码所有四种结构域。所述核酸可编码一或多个所述结构域的多个拷贝。

如果所述核酸编码一个以上的结构域，所述结构域优选作为融合多肽表达。优选所述结构域通过柔性接头(优选聚-Ala接头，例如Ala₃接头)相互分离，从而促进所述结构域的正确折叠。

对于Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG(和/或优选Nogo-C)蛋白，所述载体优选基本上仅能够表达所述的结构域。NogoN是Nogo A同种型的结构域.Nogo 66所有三种同种型Nogo-A，Nogo-B和Nogo-C中的结构域。具体地，所述载体优选不能表达该蛋白质的其它含表位部分。对于蛋白质Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG(和/或优选Nogo-C)，所述载体优选表达不超过20％，更优选不超过15％，不超过12％，不超过10％，不超过8％，不超过6％，不超过5％，不超过4％，不超过3％，不超过2％or不超过1％位于上述结构域以外的蛋白质。这对于含有仅仅所述蛋白之一的一或多种结构域的载体尤其如此。

Nogo A，Nogo B，Nogo C，TN-R和MAG的氨基酸序列可得自GenBank，例如根据以下登录号：

MAG-X05301(GI 56611)

TN-R-Z67996(GI 1261914)

Nogo B-AJ251384(GI 9408097)

Nogo A-AF320999(GI 11878297)

Nogo C-CAB99250(GI 9408100)

所述结构域优选具有下文显示的氨基酸序列，即对于结构域(c)，MAG(1-508)的508残基氨基酸序列；对于结构域(d)，TNR(125-329)的205残基氨基酸序列；对于结构域(a)，NogoN(1-185)的185氨基酸序列；和对于结构域(b)，Nogo66(823-888)的66氨基酸序列。

MAG(1-508)

MIFLTTLPLF WIMISASRGG HWGAWMPSSI SAFEGTCVSI PCRFDFPDEL

RPAVVHGVWY FNSPYPKNYP PVVFKSRTQV VHESFQGRSR LLGDLGLRNC

TLLLSTLSPE LGGKYYFRGD LGGYNQYTFS EHSVLDIINT PNIVVPPEVV

AGTEVEVSCM VPDNCPELRP ELSWLGHEGL GEPTVLGRLR EDEGTWVQVS

LLHFVPTREA NGHRLGCQAA FPNTTLQFEG YASLDVKYPP VIVEMNSSVE

AIEGSHVSLL CGADSNPPPL LTWMRDGMVL REAVAESLYL DLEEVTPAED

GIYACLAENA YGQDNRTVEL SVMYAPWKPT VNGTVVAVEG ETVSILCSTQ

SNPDPILTIF KEKQILATVI YESQLQLELP AVTPEDDGEY WCVAENQYGQ

RATAFNLSVE FAPIILLESH CAAARDTVQC LCVVKSNPEP SVAFELPSRN

VTVNETEREF VYSERSGLLL TSILTLRGQA QAPPRVICTS RNLYGTQSLE LPFQGAHR

(SEQ ID NO：8)

TNR(125-329)

CPCASS AQVLQELLSR IEMLEREVSV LRDQCNANCC QESAATGQLD

YIPHCSGHGN FSFESCGCIC NEGWFGKNCS EPYCPLGCSS RGVCVDGQCI

CDSEYSGDDC SELRCPTDCS SRGLCVDGEC VCEEPYTGED CRELRCPGDC

SGKGRCANGT CLCEEGYVGE DCGQRQCLNA CSGRGQCEEG LCVCEEGYQG

PDCSAVAPP (SEQ ID NO：9)

NogoN(1-185)

MEDLDQSPLV SSSDSPPRPQ PAFKYQFVRE PEDEEEEEEE EEEDEDEDLE

ELEVLERKPA AGLSAAPVPT APAAGAPLMD FGNDFVPPAP RGPLPAAPPV

APERQPSWDP SPVSSTVPAP SPLSAAAVSP SKLPEDDEPP ARPPPPPPAS

VSPQAEPVWT PPAPAPAAPP STPAAPKRRG SSGSV (SEQ ID NO：10)

Nogo66(823-888)

RIYKGVIQ AIQKSDEGHP FRAYLESEVA ISEELVQKYS NSALGHVNCT

IKELRRLFLV DDLVDSLK (SEQ ID NO：11)

所述载体优选编码具有氨基酸序列MAG(1-508)-Ala_n-TNR(125-329)-Ala_n-NogoN(1-185)-Ala_n-Nogo66(823-888)(SEQ ID NO：12)的多肽，其中Ala_n表示聚丙氨酸接头。n优选3。

所述结构域优选由以下序列编码：即对于结构域(c)，MAG(126-1649)的508密码子核酸序列；对于结构域(d)，TNR(454-1068)的205密码子核酸序列；对于结构域(a)，NogoN(1-555)的185密码子核酸序列；和/或对于结构域(b)，Nogo66(2467-2664)的66密码子核酸序列：

MAG(126-1649)

atgatattccttacc accctgcctctgttttggat aatgatttcag cttctcgag

gggggcactg gggtgcctgg atgccctcgt ccatctcagc

cttcgagggc acgtgtgtct ccatcccctg ccgtttcgac ttcccggatg

agctcagacc ggctgtggta catggcgtct ggtatttcaa cagtccctac

cccaagaact acccgccagt ggtcttcaag tcccgcacac aagtggtcca

cgagagcttc cagggccgta gccgcctgtt gggagacctg ggcctacgaa

actgcaccct gcttctcagc acgctgagcc ctgagctggg agggaaatac

tatttccgag gtgacctggg cggctacaac cagtacacct tctcggagca

cagcgtcctg gacatcatca acacccccaa catcgtggtg cccccagaag

tggtggcagg aacggaagta gaggtcagct gcatggtgcc ggacaactgc

ccagagctgc gccctgagct gagctggctg ggccacgagg ggctagggga

gcccactgtt ctgggtcggc tgcgggagga tgaaggcacc tgggtgcagg

tgtcactgct acacttcgtg cctactagag aggccaacgg ccaccgtctg

ggctgtcagg ctgccttccc caacaccacc ttgcagttcg agggttacgc

cagtctggac gtcaagtacc ccccggtgat tgtggagatg aattcctctg

tggaggccat tgagggctcc cacgtcagcc tgctctgtgg ggctgacagc

aacccgccac cgctgctgac ttggatgcgg gatgggatgg tgttgaggga

ggcagttgct gagagcctgt acctggatct ggaggaggtg accccagcag

aggacggcat ctatgcttgc ctggcagaga atgcctatgg ccaggacaac

cgcacggtgg agctgagcgt catgtatgca ccttggaagc ccacagtgaa

tgggacggtg gtggcggtag agggggagac agtctccatc ctgtgttcca

cacagagcaa cccggaccct attctcacca tcttcaagga gaagcagatc

ctggccacgg tcatctatga gagtcagctg cagctggaac tccctgcagt

gacgcccgag gacgatgggg agtactggtg tgtagctgag aaccagtatg

gccagagagc caccgccttc aacctgtctg tggagtttgc tcccataatc

cttctggaat cgcactgtgc agcggccaga gacaccgtgc agtgcctgtg

tgtggtaaaa tccaacccgg aaccctccgt ggcctttgag ctgccttccc

gcaacgtgac tgtgaacgag acagagaggg agtttgtgta ctcagagcgc

agcggcctcc tgctcaccag catcctcacg ctccggggtc aggcccaagc

cccaccccgc gtcatttgta cctccaggaa cctctacggc acccagagcc

tcgagctgcc tttccaggga gcacaccga (SEQ ID NO：13)

该序列开始于起始密码子；如果任何其它序列用于该核酸的5’末端，将需要起始密码子。当然可常规地改造它成为任何目的核酸序列，但注意到Nogo(1-555)也开始于起始密码子。

TNR(454-1068)

tgtccat gtgccagttc agcccaggtg ctgcaggagc tgctgagccg

gatcgagatg ctggagaggg aggtgtcggt gctgcgagac cagtgcaacg

ccaactgctg ccaagaaagt gctgccacag gacaactgga ctatatccct

cactgcagtg gccacggcaa ctttagcttt gagtcctgtg gctgcatctg

caacgaaggc tggtttggca agaattgctc ggagccctac tgcccgctgg

gttgctccag ccggggggtg tgtgtggatg gccagtgcat ctgtgacagc

gaatacagcg gggatgactg ttccgaactc cggtgcccaa cagactgcag

ctcccggggg ctctgcgtgg acggggagtg tgtctgtgaa gagccctaca

ctggcgagga ctgcagggaa ctgaggtgcc ctggggactg ttcggggaag

gggagatgtg ccaacggtac ctgtttatgc gaggagggct acgttggtga

ggactgcggc cagcggcagt gtctgaatgc ctgcagtggg cgaggacaat

gtgaggaggg gctctgcgtc tgtgaagagg gctaccaggg ccctgactgc

tcagcagttg cccctcca (SEQID NO：14)

NogoN(1-555)

atggaagacc tggaccagtc tcctctggtc tcgtcctcgg acagcccacc

ccggccgcag cccgcgttca agtaccagtt cgtgagggag cccgaggacg

aggaggaaga agaggaggag gaagaggagg acgaggacga agacctggag

gagctggagg tgctggagag gaagcccgcc gccgggctgt ccgcggcccc

agtgcccacc gcccctgccg ccggcgcgcc cctgatggac ttcggaaatg

acttcgtgcc gccggcgccc cggggacccc tgccggccgc tccccccgtc

gccccggagc ggcagccgtc ttgggacccg agcccggtgt cgtcgaccgt

gcccgcgcca tccccgctgt ctgctgccgc agtctcgccc tccaagctcc

ctgaggacga cgagcctccg gcccggcctc cccctcctcc cccggccagc

gtgagccccc aggcagagcc cgtgtggacc ccgccagccc cggctcccgc

cgcgcccccc tccaccccgg ccgcgcccaa gcgcaggggc tcctcgggct cagtg

(SEQ ID NO：15)

Nogo66(2467-2664)

agga tatacaaggg tgtgatccaa gctatccaga aatcagatga

aggccaccca ttcagggcat atctggaatc tgaagttgct atatctgagg

agttggttca gaagtacagt aattctgctc ttggtcatgt gaactgcacg

ataaaggaac tcaggcgcct cttcttagtt gatgatttag ttgattctct

gaag(SEQ ID NO：16)

然而，认为这些特异性结构域的片段，衍生物或变体将产生出有效疫苗。因此，本发明意义内的多肽结构域可以是上文给出的四种氨基酸之一的片段，所述片段优选由来自所述序列的至少15个连续氨基酸，更优选至少17，更优选至少20，25，30，40，50或60个氨基酸组成。对于MAG，NogoN和TNR，所述片段的大小为更优选至少80个氨基酸，更优选100，120，140，160或180氨基酸。对于TNR和MAG，所述长度更优选200氨基酸。对于MAG，所述长度更优选250，300，350，400或450个氨基酸。所述片段将包括一或多个具体结构域的表位(所述结构域的序列在上文给出)，并将保留所述结构域在体内激发抗体反应的能力。因此，所述片段将能够在体内激发与相应结构域交叉反应的抗体。线性表位绘图是本领域技术人员的常规技术。

类似地，本发明意义内的多肽结构域可以是上文给出的氨基酸序列之一(参照氨基酸序列)的变体。其中，所述变体是具有这样的序列的多肽，所述序列与参照氨基酸序列不同，但包括至少15个氨基酸的部分，该部分与参照序列的相应部分有至少65％氨基酸同一性。优选同一性水平至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％。优选所述部分的长度至少17氨基酸，更优选的长度是前一段给出的片段的长度。另外，所述变体通常包括一或多个上文给出其序列的具体结构域的表位，并将保留所述结构域在体内激发抗体反应的能力。因此，所述变体将能够在体内激发与相应结构域的交叉反应的抗体。

本发明还提供包含本发明载体的组合物，其与一或多种可药用的成分配制在一起用于作为(治疗性)疫苗。优选所述组合物被配制成用于通过注射给药。

本发明还提供了本发明的载体，其用于治疗方法中。所述治疗可以是CNS损伤，具体是SCI或卒中的治疗。

本发明还提供了本发明的载体在制备用于CNS损伤，具体是SCI或卒中的治疗的药物中的用途。

本发明还提供了治疗患者体内的CNS损伤的方法，所述方法将本发明的载体作为治疗性疫苗给药患者。

本发明的载体通常通过注射给药，但本领域已知其它疫苗递送方法(诸如口服或透皮递送以及“无针(needle-free)”注射)。注射通常是肌内的。虽然血脑屏障通常成为抗体通过的屏障，CNS损伤(具体是损伤，例如外伤)将通常允许抗体在损伤部位通过血脑屏障。因此认为无需特别措施来允许应答于本发明载体的免疫接种而激发的抗体通过血脑屏障。

该方面，本发明提供了多肽，其基本上由一或多种选自下组的多肽结构域组成：

(a)Nogo-A的N-末端(NogoN)结构域；

(b)Nogo-B的细胞外环(Nogo66)(也存在于Nogo-A和Nogo-C中)；

(c)MAG的第三到第五个免疫球蛋白样重复；和

(d)TN-R的EGF-样结构域。

所述多肽的优选特征是上文中所述载体所编码多肽的特征。

本发明提供包含本发明多肽的组合物，其与一或多种可药用的成分配制在一起用作(治疗性)疫苗。优选，所述组合物配制成用于通过注射给药。

本发明还提供了本发明的多肽，用于治疗方法中。所述治疗可以是CNS损伤，具体是SCI或卒中的治疗。

本发明还提供了本发明的多肽在制备用于治疗CNS损伤，具体是SCI或卒中的药物中的用途。

本发明还提供了治疗患者中的CNS损伤的方法，所述方法包括将本发明的多肽作为治疗性疫苗给药患者。

给药优选如上文对载体所述那样进行。

本发明还提供了类似的方法以及能够与结构域(a)-(d)之一特异性结合的抗体的用途，或优选能够与结构域(a)-(d)中的两个，三个或所有四个结构域结合的抗体混合物，在治疗CNS损伤，具体是SCI或卒中之中的用途。所述抗体将直接给药患者(优选如对于第一方面的肽，例如通过直接注入CNS，注入损伤位点或注入脑脊液)，而不是给药核酸或多肽疫苗以产生抗体反应。能够特异性结合的抗体片段被认为是用于该目的的抗体。

发明内容

肽

术语“肽”意图指由数个氨基酸组成的分子，相邻的氨基酸对由肽键相连。肽键具有结构-CO-NH-。氨基酸可天然存在或非天然存在。末端氨基酸可包括末端修饰。天然存在的手相氨基酸(即除了非手相甘氨酸以外的氨基酸)是L-同种型。然而，本发明的肽可包括或由D-同种型氨基酸组成。所述D-氨基酸可以是天然存在的L-氨基酸的D-同种型，或者可不具有天然存在的L-同种型。D-氨基酸包括在本发明的肽中可支持肽在体内被清除的减少。

肽的合成

肽可通过化学合成完全或部分产生。本发明的肽可通过已经确定的，标准液相或优选固相肽合成方法制备，其常规描述广泛可得(见例如，J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd edition，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，in M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984)；和Applied Biosystems 430A Users Manual，ABI Inc.，Foster City，California)，或它们可在溶液中制备，通过液相方法或任何固相、液相以及溶液化学的组合制备，例如通过首先完成各个肽部分，然后如果需要并且适宜，在去除任何存在的保护性基团以后，通过使分别的碳酸或硫酸或其反应衍生物发生反应而引入残基X。

噬菌体展示

噬菌体展示是生物工程领域中最近且有希望的技术，其可测定成千万的短肽与抗体受体或其它结合蛋白的紧密结合。噬菌体展示首先在1985(Smith et al，1985)描述，并且是其中肽或蛋白作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白而表达的选择技术，导致融合的蛋白在病毒粒的表面显示，而编码所述融合物的DNA位于病毒粒内。噬菌体展示产生了大量随机肽序列与编码各个序列的DNA之间的物理联系，允许通过称为panning的体外选择法快速鉴定大量靶分子的肽配体(Scott et al，1990；Arap et al 1998)。

涉及具体蛋白结构域的相互作用(蛋白/蛋白或蛋白/非蛋白相互作用)通常仅需要8-12氨基酸，其中5-8氨基酸起重要作用。展示6-10氨基酸残基的肽的噬菌体展示文库已经成功用于多种应用中，包括表位绘图，绘图型蛋白-蛋白接触(mapping protein-protein contact)，非肽配体的肽模拟物鉴定，以及新疫苗和新药物的设计(Scott et al，1990；Cwirlaet al，1990；Devlin et al 1990 Felici et al，1991；Motti et al，1994；Hong et al，1995；Arap et al，1998；Nilsson et al，2000)。

最近的工作通过竞争性分析显示，利用较广范围的酶作为靶分离的一系列肽含有对于每种靶而言类似的氨基酸序列，每个靶结合一或两个位点。17种受试肽中，13种被发现是酶功能的特异性抑制物。利用噬菌体展示鉴定的肽替代配体优先靶向可抑制酶功能的有限数目位点(Hyde-DeRuyscher et al 2000)。

模拟物

非肽“小分子”通常为用于体内药用的肽所优选的。因此，本发明的肽的模拟物可被设计成用于药用。

已知的药物活性化合物的模拟物的设计是基于“前导(lead)”化合物的已知药物开发方法。这对于活性化合物的合成较困难或昂贵或不适合具体的给药方法时是理想的，例如肽为不适合口服组合物的活性剂时，这是由于所述肽倾向于较快地由蛋白酶在消化道内代谢。模拟物设计，合成，以及检测通常用于避免随机筛选大量具有靶性质的分子。

有数个步骤通常用于由具有给定靶性质的化合物设计模拟物。首先，确定对于确定靶性质而言关键和/或重要的所述化合物的具体部分。对于肽，这可通过系统性改变肽中的氨基酸进行，例如通过依次取代每个残基。肽的丙氨酸扫描通常用于定义所述肽基序。构成化合物的活性区的这些部分或残基已知为“药效基团”。

一旦药效基团被发现，可根据其物理性质，例如立体化学，键合，大小和/或电荷，利用各种来源的数据，例如分光镜技术，X-射线衍射数据和NMR来模拟药效基团的结构。计算机分析，类似性作图(模拟药效基团的电荷和/或体积，而不是原子间的键合)以及其它技术可用于该模拟方法。

该方法的变体中，配体的三维结构以及其结合配偶体被模拟。这具体可用于配体和/或结合配偶体在结合时改变构型，允许在模拟物设计的模拟中考虑到这一点。

随后选择模板分子，其上移植了模拟药效基团的化学基团。所述模板分子和移植到其上的化学基团可方便地选择，使得所述模拟物易于合成，很可能是可药用的，并且不在体内降解，同时保持前导化合物的生物活性。可选，当模拟物是以肽为基础时，可通过使所述肽发生环化获得进一步的稳定性，增加其刚性。通过这种方法发现的模拟物可随后被筛选以发现它们是否具有靶性质，或它们显示所述性质的程度。可实施进一步的优化或修饰以实现一或多种终模拟物用于体内或临床检验。

序列同一性

与参照序列的百分比(％)氨基酸序列同一性被定义为候选序列中与参照序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，所述定义是在对所述序列进行比对并引入缺口以(如果有必要)以实现最大百分比序列同一性、而不考虑任何保守取代作为部分序列同一性之后。％同一性值可通过WU-BLAST-2(Altschul et al.，Methods in Enzymology，266：460-480(1996))确定。WU-BLAST-2利用数种搜索参数，其中大多数被设定为默认值。可调节的参数可定为如下值：重叠跨度(overlapspan)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字符阈值(wordthreshold)(T)＝11。A％氨基酸序列同一性值如下确定：通过如WU-BLAST-2测定的匹配的相同残基数目，除以参照序列残基总数(由WU-BLAST-2引入参照序列的缺口以最大化被忽略的比对得分)，乘以100。

严谨性条件

严谨性条件可通过以下确定：(1)利用低离子强度和高温度洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠、50℃；(2)杂交过程中利用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液、pH 6.5，以及760mM氯化钠，75mM柠檬酸钠、42℃；或(3)利用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸盐钠，5x Denhardt′s溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡萄糖、42℃，在42℃、0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺、55℃洗涤，然后由含EDTA的0.1xSSC、55℃进行高严谨度洗涤。

受试者

本发明组合物和/或治疗所给药的受试者是哺乳动物，优选试验动物诸如啮齿类动物(例如兔，大鼠或小鼠)，狗，猫，猴或猿，或饲养动物诸如母牛，马，绵羊，猪或山羊。更优选，所述受试者是人。

通常，所述受试者将患有CNS损伤，通常是CNS外伤，例如头部外伤。但更优选，所述损伤是脊髓损伤，例如SCI。在试验动物中，所述损伤是试验性的。CNS损伤可由例如癫痫，卒中或神经变性病，学习记忆相关的疾病和/或痴呆诸如阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease)或帕金森氏症(Parkinson’s disease)。

本发明的治疗将通常与其它治疗联用，诸如手术和/或康复。

配制

优选将本发明的肽，模拟物和载体作为药物配制剂(例如组合物，制备物，药物)，其包含一种活性化合物，如上所述，以及本领域技术人员已知的一或多种其它可药用的成分，包括但不限于，可药用的载体，佐剂，赋形剂，缓冲液，防腐剂和稳定剂。所述配制剂还可包括其它活性药剂。

因此，本发明还提供了制备如前所述的药物组合物的方法，所述方法包括将至少一种本发明的肽或载体以及本领域技术人员已知的一或多种可药用的成分混合，例如，载体，佐剂，赋形剂等。

本文术语“可药用的”指化合物，成分，物质，组合物，剂型等，其在合理医学判断范围内，适合用于接触目的受试者(例如人)的组织而没有过多的毒性，刺激，过敏反应，或其它问题或并发症，并具有合理的益处/风险比。每种载体，佐剂，赋形剂等必须在与其它配制剂成分相容的意义上而言是“可接受的”。

适宜的载体，佐剂，赋形剂等可见于标准药物教科书，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，2ndedition，1994。

配制剂可适宜地是可注射的配制剂，例如以液体、等张、无致热源、无菌溶液的形式，其中溶解有活性化合物。所述液体可还含有其它可药用的成分，诸如抗氧化剂，缓冲液，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，稠化剂，以及使得所述配制剂与血液或脑脊液等张的溶剂。用于所述配制剂的适宜的等张载体的实例包括氯化钠注射剂，林格氏(Ringer′s)溶液，或乳酸盐化的林格氏注射液。通常，液体中活性化合物的浓度为约1ng/ml-约10μg/ml，例如约10ng/ml-约1μg/ml。所述配制剂可位于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓿和小药瓶，并可以储存于冷冻-干燥(冻干)条件中而仅需要在用前加入无菌液体载体例如水用于注射。即配即用注射溶液和悬液可从无菌粉末，颗粒和片剂制备。

给药

本发明肽的给药通常通过注射，优选直接注入CNS。注射可直接注入损伤位点，例如注入损伤位点。可选，可注射入脑脊液，通常在损伤附近。

本发明的支持性试验工作以及本发明的实施方案将在现在描述，仅通过实例，并参考附图1，该图显示用于从蛋白MAG，TN-R和Nogo分离抑制性结构域的引物。编码序列(或互补链)以粗体显示。起始(Met)和终止(^***)密码子加双下划线。限制位点加下划线。SEQ ID NOS如下：

引物 SEQ ID NO

MAG1 17

MAG2 18

TNR1 19

TNR2 20

NogoN1 21

NogoN2 22

Nogo66-1 23

Nogo66-2 24

还图示了产生的构建体(SEQ ID NO：25)，其通过消化并依次(sequentially)连接产生的PCR产物获得。限制位点加下划线。Ala-编码密型码子加标记。每个抑制性结构域的编码序列通过括号内所示结构域的名称表示。终止密码子加标记^***。

方面1，实施例1

鉴定负责具有抑制性质的Nogo结构域

排斥试验

将NG108细胞(小鼠神经母细胞瘤-大鼠胶质细胞瘤杂合细胞，可购自美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，USA，ATCC HB-12317)铺于利用Nogo1-25，Nogo1-50，Nogo1-66和GST-Nogo-66以及对照GST包被的底物。Nogo的重组结构域单独或者作为与GST的融合蛋白的产生和纯化，如前所述进行(Xiao ZC et al，1996)。

NG108细胞明显受Nogo1-50，Nogo1-66，和GST-Nogo-66排斥，而不是Nogo1-25和GST的排斥。

神经突生长试验

NG108细胞被铺于用Nogo1-25，Nogo1-50，Nogo1-66，和GST-Nogo-66以及对照GST包被的底物上。

NG108细胞的神经突生长明显受Nogo1-50，Nogo1-66，和GSTNogo-66抑制，而不受Nogo1-25和GST抑制。

方面1，实施例2

通过噬菌体展示技术筛选针对神经元生长抑制分子TN-R，MAG和Nogo的新短肽

TN-R，MAG和Nogo从成人小鼠脑的纯化通过免疫亲和层析如前所述进行(Pesheva，P et al，1989)。TN-R，MAG，Nogo的重组结构域作为与GST的融合蛋白的产生和纯化如前所述(Xiao ZC et al，1996)。所有这些蛋白用作噬菌体结合靶用于快速筛选，其利用Ph.D-7TM噬菌体展示肽文库试剂盒(New England Biolabs，Ltd)根据生产商的说明进行。

简而言之，使显示不同肽序列的噬菌体文库，暴露于用靶蛋白包被的板。未结合的噬菌体通过洗涤去除，而特异性结合的噬菌体通过降低pH洗脱。洗脱的噬菌体集合经扩增，并重复所述方法3-4次。

3-4轮亲和选择以后，从7-mer随机肽噬菌体展示的文库分离数种特异性噬菌体克隆，并通过ELISA鉴定。特异性噬菌体克隆的肽编码序列通过自动测序确定。获得与被靶向蛋白特异性结合的肽的序列。

噬菌体外壳蛋白的框架序列，其中的每个噬菌体中都插入了7-mer肽编码序列，所述框架序列如下：

TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT TCT CACTCT(SEQ ID NO：26)...GGT GGA GGT T AA ACT GTT GAAAGT TGT(SEQ ID NO：27)

...代表7-mer肽编码序列的插入位点。Kpn1位点加下划线，Eag1位点加双下划线。

示例性7-mer肽编码序列如下所示。

“n”指分离的噬菌体的数目，所述噬菌体显示具有所示序列的肽(尽管编码核酸序列当然地有一些变异，这是由于遗传密码简并性所致)。“SIN”是“SEQ ID NO.”缩写，并表示肽序列。核酸序列的SEQ ID NOS为28-35。

靶	示例性核酸							肽	SIN
靶	示例性核酸							肽	SIN	Nogo-66Nogo-66TNR-EGFLTNR-EGFLTNR-EGFLTNR-EGFLTNR-EGFLMAGMAGMAG	TATGGTACGCATCATGGTTATTATCAGACG	CTGTCTCAGTCTCATTCTACGCTGCTTCAG	ACGCTGCTGATTATGCTGACGACGCCGCTG	CAGCCTTTTCCTCCTCCTCCTCAGCTTTTT	CCTCATCCTGATCATCATCCGCCTATGCCT	CAGTCGCCTAATGATTCGAGTCAGCCTCCT	TCGCTGTAGATTAAGCTGCCTTCGCGTCAG	YLTQPQS (n＝43)GSLPHSL (n＝8)TQLFPPQ (n＝18)HSIPDNI (n＝3)HHMPHDK (n＝1)GSLPHSL (n＝1)YTTPPSP (n＝1)YLTQPQS (n＝19)QLPLMPR (n＝5)TQLFPPQ (n＝7)	1234526173

方面1，实施例3

展示肽的噬茵体的体外实验，所述肽可降低Nogo，MAG和TN-R对神经元粘附的抑制效应

直径3.5cm的组织培养petri皿(Becton Dickinson)用甲醇溶解的硝化纤维素根据Lagenaur和Lemmon(1987)所述的方法包被，并在无菌加盖条件下风干。将petri皿和含有5μg/ml聚-DL-乌氨酸的PBS在37℃保温2小时。随后用PBS洗涤所述皿三次，并在无菌加盖条件下风干。

将蛋白样品(1.5μl 5μM GST，5μM GST-Nogo66，100μM Nogo66，100μM Nogo1-50或100μM Nogo1-25)点样于硝化纤维素包被的表面petri皿，并在37℃、潮湿环境中保温2小时。随后，用PBS洗涤所述点三次。用含有2％热灭活的无脂肪酸BSA(Sigma)的PBS冲洗所述皿，并保温过夜以阻断残余的非特异性蛋白结合位点。

然后，用PBS洗涤所述皿，并以密度2.5×10⁵细胞/ml将NGl08细胞置于2ml含10％肽牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中，在37℃潮湿环境中保温。12小时后，用PBS轻柔洗涤所述皿三次，并通过用含2.5％戊二醛的PBS冲洗来固定细胞。固定后，用0.5％甲苯胺蓝(Sigma)在2.5％碳酸钠中染色。所述经染色的培养物随后用水洗涤三次并风干。

对附着于各个点的细胞进行照相和计数。所有试验都实施至少3次。统计学分析通过Student检验实施。显著性水平选择为p＜0.05。

GST-Nogo66，Nogo66和Nogo1-50与GST相比都显示明显的降低的NG108细胞计数；但Nogo1-25并非如此。

NG108细胞被置于聚-DL-鸟氨酸-处理的组织培养petri皿中作为单细胞悬液。显示上述鉴定的Nogo66-，MAG-和TNR结合肽的具体噬菌体被加入细胞培养物。细胞在固定前维持24小时，并用甲苯胺蓝染色。细胞粘附如前述测定。

展示肽YLTQPQS(SEQ ID NO.1)的噬菌体能够阻断Nogo-66和MAG对NG108细胞结合的抑制效应；展示肽TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)的噬菌体能够阻断TNR-EGFL对NG108细胞结合的抑制效应。

方面1，实施例4

降低Nogo，MAG和TN-R对神经元粘附的抑制效应的肽的体外试验

所有经筛选的共有序列肽利用固相方法通过Peptide SynthesizerModel1000合成。神经突生长和生长锥排斥试验如上所述进行(Xiao ZCet al，1997)。经纯化的完整TN-R，MAG和Nogo以及TN-R，MAG和Nogo的重组结构域可被包被作为底物，以允许鉴定TN-R，MAG和Nogo的抑制性结构域。其它试验中，合成的肽与相关蛋白/结构域在包被前混合，以鉴定可在体外中和TN-R，MAG和/或Nogo的抑制效应的肽。

方面1，实施例5

可缓解脊髓损伤的肽的体内试验

可在体外中和TN-R，MAG和/或Nogo抑制效应的共有序列短肽可用于体内以确定它们缓解脊髓损伤(Bregman et al，1995)。这些肽被注入脊髓受损伤的成年大鼠。轴突的再生通过免疫组织化学，通过与未经处理的对照比较进行检测。还分析了功能改进。

方面1，实施例6

筛选可消除TN-R，MAG和/或Nogo的抑制效应的候选因素

测定简并寡核苷酸序列，搜索可在体外和/或体内(优选在两种条件下均可)中和TN-R，MAG，和/或Nogo抑制效应的肽。EST数据库(优选CNS-来源的EST数据库)利用简并寡核苷酸序列搜索。CNS cDNA文库利用标记的简并寡核苷酸探针筛选。选中(Hits)表示候选因子可消除TN-R，MAG和/或Nogo的抑制效应。这些候选因子作为GST融合蛋白纯化，并如上述检测对所述肽的中和效应。

作为检测体内中和效应的可选方法，将候选因子转染的神经元移植到受试动物中的受损脊髓并观察中和结果。

可消除TN-R，MAG，和/或Nogo抑制效应的新的因子由此获得，并用于治疗CNS损伤，具体是脊髓损伤，或所述治疗的开发。

方面2，实施例1

载体构建

编码以下结构域的核酸可通过PCR获得：N-末端和Nogo-A的66-Aa细胞外结构域，MAG的第三到第五个Ig样结构域和人TNR的EGF样结构域。

PCR引物被设计为包括限制酶位点并编码位于亚克隆的序列末端的Ala接头(见图1)。因此，当PCR产物由限制酶双重消化并随后依次连接时，编码Ala接头的DNA位于每对相邻结构域(参见图1)之间。所述Ala接头促进所述结构域的正确折叠。

随后，依次连接的DNA经BamH I和XbaI双重消化，并随后插入pcDNA 3.1载体(Invitrogen)，以产生重组载体。所述重组载体通过琼脂糖凝胶和序列分析证实。

方面2，实施例2

在体外证实重组载体的抑制功能

DNA疫苗注入受试动物体内以前，必须进行体外试验以保证所述疫苗可由哺乳动物细胞表达并分泌到细胞外以刺激宿主的免疫系统。

为检测，用重组载体转染COS-1细胞。瞬时表达之后，分别收集所述细胞和培养基，并利用所述抑制型分子的抗体实施Western-印迹(Xiao et al，1996)，以证实所述载体作为疫苗体内给药时，所述重组蛋白被分泌出细胞，并作为抗原刺激宿主免疫系统。

经检测发现，与未经转染的细胞相比，经转染的细胞为MAG和TNR抗体阳性。在经转染的和未经转染的细胞中检测Nogo的免疫反应性。

利用重组质粒瞬时转染48小时以后，收集培养基并用抗-NogoN抗体或抗-TNR--EGFL抗体利用蛋白质A-琼脂糖进行免疫沉淀。所述沉淀物通过10％和6％SDS-PAGE分离，并分别用于检测Nogo和TNR。每种沉淀显示相应抗体的免疫反应性，表明所述蛋白可被分泌。

方面2，实施例3

GST融合蛋白与预免疫血清和抗血清的斑点印迹

用重组质粒免疫接种2个月以后，从Lewis大鼠收集抗血清。将GST-Nogo66，GST-NogoN，GST-TNR/EGFL，GST-MAG Ig3-5和GST的连续稀释物点样作为底物，并随后点上血清。抗血清特异性识别GST融合蛋白，但不是GST。预免疫血清既不识别融合蛋白，也不识别GST。

方面2，实施例4

重组载体作为DNA疫苗的试验

为检验用DNA疫苗免疫以后受损脊髓的再生，将重组DNA载体注入受试动物。对经免疫的动物的抗血清进行实验以验证注入DNA疫苗以后的免疫反应。

利用脊髓损伤的半横断模型。一段时间以后，研究受损脊髓的神经元/轴突的形态，以及动物的行为。

(1)免疫和脊髓损伤

6周龄雌性Lewis大鼠每周一次利用来自前述实施例的100μg重组载体免疫。缺乏所述插入的pcDNA3.1载体用作对照。所述载体注入大鼠的背部。大鼠产生抗血清后，损伤其脊髓。所述大鼠继续接受每周两次的免疫，再持续6个月。

大鼠用Somnitol(1mg/20g体重)麻醉，并进行低胸段锥板切除术(lower thoracic laminectomy)(T9)。随后用显微解剖剪(microscissor)剪切脊髓的背侧部分，以便切断皮质脊髓束。每处损伤的深度(约1mm)通过位于显微解剖剪尖端的标记估计。损伤后存活6周以后，麻醉所述大鼠并将5％WGA-HRP(小麦芽凝集素辣根过氧化物酶)溶液注入所述感觉运动皮质(Li et al.，1996)。注射WGA-HRP48小时后，通过心内灌注处死动物，并如所述使脊髓纵向恒冷箱切片发生HRP组织化学反应(Liet al.，1996)。

(2)证实经免疫的动物的免疫反应

为证实经免疫的动物的抗血清具有阻断抑制性结构域对神经突生长的抑制效应，利用神经突生长试验检测经免疫的动物的血清。4孔盘首先用溶解的硝化纤维素包被，并与5μg/ml聚-L-赖氨酸一起预保温。GST融合抑制性结构域或肽被置于孔中作为2μl的液滴，并随后在37℃保温4hr。这些孔随后在4℃与来自对照小鼠或用DNA疫苗免疫的小鼠的血清一起保温过夜。去除血清，通过Percoll密度梯度离心纯化的生后10日龄大鼠小脑神经元以1×10⁶细胞每孔铺板。所述细胞培养在无血清化学方法定义的培养基中24hr，用4％多聚甲醛固定，用考马斯兰染色。神经突长度利用Universal Image I image分析系统测定。利用Student-Newman-Keul检验分析结果，以确定统计学显著的差异(Li et.al.，1996)。

(3)受损脊髓的形态学研究

为了检验横断的轴突的再生，用4％多聚甲醛灌注大鼠，将脊髓的10μm厚纵向冷冻切片置于凝胶包被的载玻片上。这些切片用生物素化的山羊抗大鼠抗体保温过夜，并用链霉抗生物素偶联的荧光素保温1小时，检测循环抗体。

(4)动物的功能检验

还实施了试验大鼠的功能恢复。接触(Contact placing)反应通过轻触后腿背侧而不导致关节位移来检测。动物提高足并将其置于支持表面的能力在随后的3-6次重复中进行评估。超过30％的反应被评分为阳性(Kukel-Bagden et.al.，1993)。

(5)安全检验

本免疫接种方法的安全通过以下方法评估：将疫苗给药受试动物(未受损伤的和受损伤的)并发现不利事件，具体是感觉或运动功能丧失以及行为或认知障碍。

CNS组织通过组织学方法检查以发现自身免疫性损伤，例如利用单克隆抗-CNPase(Sigma C5922，lot 71k4889)的免疫染色。CNPase是寡突细胞表达的蛋白质，2’，3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶。

尽管前述发明已经通过举例和实例为清楚和理解详细描述，对于本领域技术人员很明显，根据本发明的教导，可进行具体的改变和修饰而不偏离所附权利要求的精神和范围。

本文引用的所有文件都为所有目的以全文包含在本发明内。

对比文件

Ajemian A，Ness R，David S.Tenascin in the injured rat optic nerve and innon-neuronal cells in vitro：potential role in neural repair.J Comp Neurol.1994Feb 8：340(2)：233-42

Altschul SF，Gish W.Local alignment statistics.Methods Enzymol1996；266：460-80.

Arap W，Pasqualini R，Ruoslahti.Cancer treatment by targeted drugdelivery to tumor vasculature in a mouse model.Science 1998 Jan16；279(5349)：377-80.

Becker CG，Becker T，Meyer RL，Schachner M.Tenascin-R inhibits thegrowth of optic fibers in vitro but is rapidly eliminated during nerveregeneration in the salamander Pleurodeles waltl.：J Neurosci 1999 Jan15；19(2)：813-27.

Becker T，Anliker B，Becker CG，Taylor J，Schachner M，Meyer RL，Bartsch U.Tenascin-R inhibits regrowth of optic fibers in vitro and persists inthe optic nerve of mice after injury.Glia 2000Feb 15；29(4)：330-46.

Bregman BS，Kunkel-Bagden E，Schnell L，Dai HN，Gao D，Schwab ME.Recovery from spinal cord injury mediated by antibodies to neurite growthinhibitors.Nature 1995Nov 30；378(6556)：498-501.

Chen MS，Huber AB，Van der Haar ME，Frank M，Schnell L，SpillmannAA，Christ F，Schwab ME.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowthinhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1.Nature.2000Jan 27；403(6768)：434-9

Chiquet-Ehrismann R，Tannheimer M，Koch M，Brunner A，Spring J，Martin D，Baumgartner S，Chiquet M.Tenascin-C expression by fibroblasts iselevated in stressed collagen gels.J Cell Biol 1994Dec；127(6Pt 2)：2093-101.

Collins BE，Yang JS，Mukhopadhyay G，Filbin MT，Kiso M，Hasegawa A，Schnaar RL.Sialic acid specificity of myelin-associated glycoprotein binding.JBiol Chem.1997 Jan 10；272(2)：1248-55

Cwirla SE，Peters EA，Barrett RW，Dower WJ.Peptides on phage：a vastlibrary of peptides for identifying ligands.Proc Natl Acad Sci U S A 1990Aug；87(16)：6378-82.

DeBellard ME，Tang S，Mukhopadhyay G，Shen YJ，Filbin MT.Myelin-associated glycoprotein inhibits axonal regeneration from a variety ofneurons via interaction with a sialoglycoprotein.Mol Cell Neurosci 1996Feb；7(2)：89-101.

Deckner M，Lindholm T，Cullheim S，Risling M.Differential expressionof tenascin-C，tenascin-R，tenascin/J1，and tenascin-X in spinal cord scar tissueand in the olfactory system.Exp Neurol 2000Dec；166(2)：350-62.

Devlin JJ，Panganiban LC，Devlin PE.Random peptide libraries：a sourceof specific protein binding molecules.Science 1990Jul 27；249(4967)：404-6.

Erickson HP.Tenascin-C，tenascin-R and tenascin-X：a family of talentedproteins in search of functions.Curr Opin Cell Biol.1993 Oct；5(5)：869-76.Review.

Felici F，Castagnoli L，Musacchio A，Jappelli R，Cesareni G.Selection ofantibody ligands from a large library of oligopeptides expressed on amultivalent exposition vector.J Mol Biol 1991Nov 20；222(2)：301-10.

Filbin，MT.Myelin-associated inhibitors of axonal regeneration in theadult mammalian CNS.Nature Reviews (Neuroscience).September 2003；Vol.4：1-11

Fournier AE，Grandpre T，Strittmatter SM.Identification of a receptormediating Nogo-66inhibition of axonal regeneration.Nature.2001 Jan 18；409：341-46

Fuss B，Pott U，Fischer P，Schwab ME，Schachner M.Identification of acDNA clone specific for the oligodendrocyte-derived repulsive extracellularmatrix molecules J1-160/180.J Neurosci Res.1991Jul；29(3)：299-307

Fuss B，Bartsch U，Wintergerst ES，Pesheva P，Schachner M.Characterization of the neural recognition molecule janusin (J1-160/180).Schweiz Arch Neurol Psychiatr.1993；144(3)：197-8

GrandPre T，Nakamura F，Vartanian T，Strittmatter SM.Identification ofthe Nogo inhibitor of axon regeneration as a reticulon protein.Nature.2000Jan27；403：439-44

Heape AM，Lehto VP，Kursula P.The expression of recombinant largemyelin-associated glycoprotein cytoplasmic domain and the purification ofnative myelin-associated glycoprotein from rat brain and peripheral nerve.Protein Expr Purif 1999 Apr；15(3)：349-61.

Hong SS，Boulanger P.Protein ligands of the human adenovirus type 2outer capsid identified by biopanning of a phage-displayed peptide library onseparate domains of wild-type and mutant penton capsomers.EMBO J 1995Oct 2；14(19)：4714-27.

Huang DW，Mckerracher L，Braun PE，David S.A therapeutic vaccineapproach to stimulate axon regeneration in the adult mammalian spinal cord.Neuron.1999 Nov；24(3)：639-47

Hyde-DeRuyscher R，Paige LA，Christensen DJ，Hyde-DeRuyscher N，Lim A，Fredericks ZL，Kranz J，Gallant P，Zhang J，Rocklage SM，Fowlkes DM，Wendler PA，Hamilton PT.Detection of small-molecule enzyme inhibitors withpeptides isolated from phage-displayed combinatorial peptide libraries.ChemBiol 2000Jan；7(1)：17-25.

Kukel-Bagden E，Dai HN，Bregman BS.Methods to assess thedevelopment and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rat.Exp Neurol.1993；119：153-64

Lagenaur C，Lemmon V.An Ll-like molecule，the 8D9 antigen，is apotent substrate for neurite extension.Proc Natl Acad Sci USA.1987Nov；84(21)：7753-7

Li M，Shibata A，Li C，Braun PE，Mckerracher L，Roder J，Kater SB，David S.Myelin-associated glycoprotein inhibits neurite/axon growth andcauses growth cone collapse.J Neurosci Res.1996 Nov 15：46(4)：404-14

Li GL，Farooque M.Expression of ubiquitin-like immunoreactivity inaxons after compression trauma to rat spinal cord.Acta Neuropathol (Berl)1996；91(2)：155-60.

Lochter A，Schachner M.Tenascin and extracellular matrix glycoproteins：from promotion to polarization of neurite growth in vitro.J Neurosci.1993 Sep；13(9)：3986-4000

Mckerracher L，David S，Jackson DL，Kottis V，Dunn RJ，Braun PE.Identification of myelin-associated glycoprotein as a major myelin-derivedinhibitor of neurite growth.Neuron.1994Oct；13(4)：805-11

Merkler D，Metz GA，Raineteau O，Dietz V，Schwab ME，Fouad K.

Locomotor recovery in spinal cord-injured rats treated with an antibodyneutralizing the myelin-associated neurite growth inhibitor Nogo-A.J Neurosci2001May 15；21(10)：3665-73.

Motti C，Nuzzo M，Meola A，Galfre G，Felici F，Cortese R，Nicosia A，Monaci P.Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAgmimotopes selected from an M13phage display library.Gene 1994 Sep2；146(2)：191-8.

Mukhopadhyay G，Doherty P，Walsh FS，Crocker PR，Filbin MT.A novelrole for myelin-associated glycoprotein as an inhibitor of axonal regeneration.Neuron.1994 Sep；13(3)：757-67

Nilsson MT，Mossing MC，Widersten M.Functional expression andaffinity selection of single-chain cro by phage display：isolation of novelDNA-binding proteins.Protein Eng 2000Jul；13(7)：519-26.

Pesheva P，Spiess E，Schachner M.J1-160 and J1-180 areoligodendrocyto-secreted nonpermissive substrates for cell adhesion.J Cell biol.1989 Oct；109(4Pt 1)：1765-78

Pesheva P，Gennarini G，Goridis C，Schachner M.The F3/11 cell adhesionmolecule mediates the repulsion of neurons by the extracellular matrixglycoprotein J1-160/180.Neuron.1993Jan；10(1)：69-82

Pesheva P，Probstmeier R.The yin and yang of tenascin-R in CNSdevelopment and pathology.：Prog Neurobiol 2000Aug；61(5)：465-93.

Pesheva P，Gloor S，Probstmeier R.Tenascin-R as a regulator of CNS glialcell function.Prog Brain Res 2001；132：103-14.

Rodriguez M，Lennon VA，Benveniste EN，Merrill JE.Remyelination byoligodendrocytes stimulated by antiserum to spinal cord.J Neuropathol ExpNeurol 1987Jan；46(1)：84-95.

Schwab ME.Experimental aspects of spinal cord regeneration.Curr OpinNeurol Neurosurg.1993Aug；6(4)：549-53

Scott JK，Smith GP.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science 1990Jul 27；249(4967)：386-90.

Shen YJ，DeBellard ME，Salzer JL，Roder J，Filbin MT.Myelin-associatedglycoprotein in myelin and expressed by Schwann cells inhibits axonalregeneration and branching.Mol Cell Neurosci 1998Sep；12(1-2)：79-91.

Smith GP.Filamentous fusion phage：novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface.Science 1985 Jun14；228(4705)：1315-7.

Tang S，Woodhall RW，Shen YJ，deBellard ME，Saffell JL，Doherty P，Walsh FS，Filbin MT.Soluble myelin-associated glycoprotein (MAG)found invivo inhibits axonal regeneration.Mol Cell Neurosci 1997；9(5-6)：333-46.

Tang S，Shen YJ，DeBellard ME，Mukhopadhyay G，Salzer JL，CrockerPR，Filbin MT.Myelin-associated glycoprotein interacts with neurons via asialic acid binding site at ARG 118and a distinct neurite inhibition site.J CellBiol 1997 Sep 22；138(6)：1355-66.

Tang S，Qiu J，Nikulina E，Filbin MT.Soluble myelin-associatedglycoprotein released from damaged white matter inhibits axonal regeneration.Mol Cell Neurosci 2001Sep；18(3)：259-69.

Taylor J，Pesheva P，Schachner M.Influence of janusin and tenascin ongrowth cone behavior in vitro.J Neurosci Res.1993 Jul 1；35(4)：347-62

Turnley AM，Bartlett PF.MAG and MOG enhance neurite outgrowth ofembryonic mouse spinal cord neurons.：Neuroreport 1998 Jun22；9(9)：1987-90.

Wintergerst ES，Fuss B，Bartsch U.Localization of janusin mRNA in thecentral nervous system of the developing and adult mouse.Eur J Neurosci.1993Apr 1；5(4)：299-310

Wintergerst ES，Bartsch U，Batini C，Schachner M.Changes in theexpression of the extracellular matrix molecules tenascin-C and tenascin-Rafter 3-acetylpyridine-induced lesion of the olivocerebellar system of the adultrat.Eur J Neurosci 1997 Mar；9(3)：424-34.

Xiao ZC，Taylor J，Montag D，Rougon G，Schachner M.Distinct effects ofrecombinant tenascin-R domains in neuronal cell functions and identification ofthe domain interacting with the neuronal recognition molecules F3/11.Eur JNeurosci.1996；8：766-82

Xiao ZC，Hillenbrand R，Schachner M，Thermes S，Rougon G；Gomaz S.Signalling events involved following the interaction of the neuronal adhesionmolecule F3 with the EGF-L domain of tenascin-R.J Neurosci Res.1997；39：698-709

Xiao ZC，Revest JM，Laeng P，Rougon G，Schachner M，Montag D.Defasciculation of cerebellar neurons is mediated by tenascin-R and itsneuronal receptor，the immunoglobulin superfamily molecule F3/F 11.JNeurosci Res.1998；52：390-404.

Yang H，Xiao ZC，Becker B，Hillenbrand R，Rougon G，Schachner M.Role for myelin-associated glycoprotein as a functional tenascin-R receptor.JNeurosci Res 1999 Mar 15；55(6)：687-701.

序列表

<110>新加坡综合医院有限公司(Singapore General Hospital Pte Ltd)

Xiao，Zhi-Cheng

<120>肽，其抗体，以及它们在中枢神经系统损伤的治疗中的用途

<130>CMD/FP6186654

<150>US 60/431.620

<151>2002-12-06

<160>35

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>1

Tyr Leu Thr Gln Pro Gln Ser

1 5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>2

Gly Ser Leu Pro His Ser Leu

1 5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>3

Thr Gln Leu Phe Pro Pro Gln

1 5

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>4

His Ser Ile Pro Asp Asn Ile

1 5

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>5

His His Met Pro His Asp Lys

1 5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>6

Tyr Thr Thr Pro Pro Ser Pro

1 5

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自展示随机7-mer的噬菌体文库

<400>7

Gln Leu Pro Leu Met Pro Arg

1 5

<210>8

<211>508

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>8

Met Ile Phe Leu Thr Thr Leu Pro Leu Phe Trp Ile Met Ile Ser Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Gly Thr Cys Val Ser Ile Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp

35 40 45

Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His Gly Val Trp Tyr Phe Asn Ser Pro

50 55 60

Tyr Pro Lys Asn Tyr Pro Pro Val Val Phe Lys Ser Arg Thr Gln Val

65 70 75 80

Val His Glu Ser Phe Gln Gly Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Leu Gly

85 90 95

Leu Arg Asn Cys Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gly

100 105 110

Gly Lys Tyr Tyr Phe Arg Gly Asp Leu Gly Gly Tyr Asn Gln Tyr Thr

115 120 125

Phe Ser Glu His Ser Val Leu Asp Ile Ile Ash Thr Pro Asn Ile Val

130 135 140

Val Pro Pro Glu Val Val Ala Gly Thr Glu Val Glu Val Ser Cys Met

145 150 155 160

Val Pro Asp Asn Cys Pro Glu Leu Arg Pro Glu Leu Ser Trp Leu Gly

165 170 175

His Glu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Val Leu Gly Arg Leu Arg Glu Asp

180 185 190

Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg

195 200 205

Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ala Phe Pro Asn Thr

210 215 220

Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Leu Asp Val Lys Tyr Pro Pro

225 230 235 240

Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His

245 250 255

Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr

260 265 270

Trp Met Arg Asp Gly Met Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu

275 280 285

Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Ile Tyr Ala

290 295 300

Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Glu Leu

305 310 315 320

Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Val Val

325 330 335

Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn

340 345 350

Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ala Thr

355 360 365

Val Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Thr Pro

370 375 380

Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln

385 390 395 400

Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Ile Ile Leu

405 410 415

Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys

420 425 430

Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser

435 440 445

Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Thr Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu

450 455 460

Arg Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala

465 470 475 480

Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ser Arg Asn Leu Tyr Gly Thr

485 490 495

Gln Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg

500 505

<210>9

<211>205

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

Cys Pro Cys Ala Ser Ser Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg

1 5 10 15

Ile Glu Met Leu Glu Arg Glu Val Ser Val Leu Arg Asp Gln Cys Asn

20 25 30

Ala Asn Cys Cys Gln Glu Ser Ala Ala Thr Gly Gln Leu Asp Tyr Ile

35 40 45

Pro His Cys Ser Gly His Gly Asn Phe Ser Phe Glu Ser Cys Gly Cys

50 55 60

Ile Cys Asn Glu Gly Trp Phe Gly Lys Asn Cys Ser Glu Pro Tyr Cys

65 70 75 80

Pro Leu Gly Cys Ser Ser Arg Gly Val Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile

85 90 95

Cys Asp Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Leu Arg Cys Pro

100 105 110

Thr Asp Cys Ser Ser Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Glu Cys Val Cys

115 120 125

Glu Glu Pro Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Glu Leu Arg Cys Pro Gly

130 135 140

Asp Cys Ser Gly Lys Gly Arg Cys Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Glu

145 150 155 160

Glu Gly Tyr Val Gly Glu Asp Cys Gly Gln Arg Gln Cys Leu Asn Ala

165 170 175

Cys Ser Gly Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Leu Cys Val Cys Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Cys Ser Ala Val Ala Pro Pro

195 200 205

<210>10

<211>185

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro

1 5 10 15

Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu

20 25 30

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp

35 40 45

Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser

50 55 60

Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp

65 70 75 80

Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala

85 90 95

Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro

100 105 110

Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val

115 120 125

Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro

130 135 140

Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr

145 150 155 160

Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro

165 170 175

Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val

180 185

<210>11

<211>66

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly

1 5 10 15

His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu

20 25 30

Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr

35 40 45

Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser

50 55 60

Leu Lys

65

<210>12

<211>973

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合蛋白

<220>

<221>VARIANT

<222>(509)..(511)

<223>聚丙氨酸接头.

<220>

<221>VARIANT

<222>(717)..(719)

<223>聚丙氨酸接头.

<220>

<221>VARIANT

<222>(905)..(907)

<223>聚丙氨酸接头.

<400>12

Met Ile Phe Leu Thr Thr Leu Pro Leu Phe Trp Ile Met Ile Ser Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Gly Thr Cys Val Ser Ile Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp

35 40 45

Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His Gly Val Trp Tyr Phe Asn Ser Pro

50 55 60

Tyr Pro Lys Asn Tyr Pro Pro Val Val Phe Lys Ser Arg Thr Gln Val

65 70 75 80

Val His Glu Ser Phe Gln Gly Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Leu Gly

85 90 95

Leu Arg Asn Cys Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gly

100 105 110

Gly Lys Tyr Tyr Phe Arg Gly Asp Leu Gly Gly Tyr Asn Gln Tyr Thr

115 120 125

Phe Ser Glu His Ser Val Leu Asp Ile Ile Asn Thr Pro Asn Ile Val

130 135 140

Val Pro Pro Glu Val Val Ala Gly Thr Glu Val Glu Val Ser Cys Met

145 150 155 160

Val Pro Asp Asn Cys Pro Glu Leu Arg Pro Glu Leu Ser Trp Leu Gly

165 170 175

His Glu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Val Leu Gly Arg Leu Arg Glu Asp

180 185 190

Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg

195 200 205

Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ala Phe Pro Asn Thr

210 215 220

Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Leu Asp Val Lys Tyr Pro Pro

225 230 235 240

Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His

245 250 255

Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr

260 265 270

Trp Met Arg Asp Gly Met Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu

275 280 285

Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Ile Tyr Ala

290 295 300

Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Glu Leu

305 310 315 320

Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Val Val

325 330 335

Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn

340 345 350

Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ala Thr

355 360 365

Val Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Thr Pro

370 375 380

Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln

385 390 395 400

Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Ile Ile Leu

Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys

420 425 430

Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser

435 440 445

Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Thr Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu

450 455 460

Arg Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala

465 470 475 480

Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ser Arg Asn Leu Tyr Gly Thr

485 490 495

Gln Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg Ala Ala Ala Cys

500 505 510

Pro Cys Ala Ser Ser Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Ile

515 520 525

Glu Met Leu Glu Arg Glu Val Ser Val Leu Arg Asp Gln Cys Asn Ala

530 535 540

Asn Cys Cys Gln Glu Ser Ala Ala Thr Gly Gln Leu Asp Tyr Ile Pro

545 550 555 560

His Cys Ser Gly His Gly Asn Phe Ser Phe Glu Ser Cys Gly Cys Ile

565 570 575

Cys Asn Glu Gly Trp Phe Gly Lys Asn Cys Ser Glu Pro Tyr Cys Pro

580 585 590

Leu Gly Cys Ser Ser Arg Gly Val Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile Cys

595 600 605

Asp Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Leu Arg Cys Pro Thr

610 615 620

Asp Cys Ser Ser Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Glu Cys Val Cys Glu

625 630 635 640

Glu Pro Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Glu Leu Arg Cys Pro Gly Asp

645 650 655

Cys Ser Gly Lys Gly Arg Cys Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Glu Glu

660 665 670

Gly Tyr Val Gly Glu Asp Cys Gly Gln Arg Gln Cys Leu Asn Ala Cys

675 680 685

Ser Gly Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Leu Cys Val Cys Glu Glu Gly

690 695 700

Tyr Gln Gly Pro Asp Cys Ser Ala Val Ala Pro Pro Ala Ala Ala Met

705 710 715 720

Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro Pro

725 730 735

Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu Asp

740 745 750

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Leu

755 760 765

Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser Ala

770 775 780

Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp Phe

785 790 795 800

Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala Ala

805 810 815

Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro Val

820 825 830

Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val Ser

835 840 845

Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro

850 855 860

Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr Pro

865 870 875 880

Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys

885 890 895

Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Ala Ala Ala Arg Ile Tyr Lys Gly

900 905 910

Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala

915 920 925

Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr

930 935 940

Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg

945 950 955 960

Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys

965 970

<210>13

<211>1524

<212>DNA

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>13

atgatattcc ttaccaccct gcctctgttt tggataatga tttcagcttc tcgagggggg 60

cactggggtg cctggatgcc ctcgtccatc tcagccttcg agggcacgtg tgtctccatc 120

ccctgccgtt tcgacttccc ggatgagctc agaccggctg tggtacatgg cgtctggtat 180

ttcaacagtc cctaccccaa gaactacccg ccagtggtct tcaagtcccg cacacaagtg 240

gtccacgaga gcttccaggg ccgtagccgc ctgttgggag acctgggcct acgaaactgc 300

accctgcttc tcagcacgct gagccctgag ctgggaggga aatactattt ccgaggtgac 360

ctgggcggct acaaccagta caccttctcg gagcacagcg tcctggacat catcaacacc 420

cccaacatcg tggtgccccc agaagtggtg gcaggaacgg aagtagaggt cagctgcatg 480

gtgccggaca actgcccaga gctgcgccct gagctgagct ggctgggcca cgaggggcta 540

ggggagccca ctgttctggg tcggctgcgg gaggatgaag gcacctgggt gcaggtgtca 600

ctgctacact tcgtgcctac tagagaggcc aacggccacc gtctgggctg tcaggctgcc 660

ttccccaaca ccaccttgca gttcgagggt tacgccagtc tggacgtcaa gtaccccccg 720

gtgattgtgg agatgaattc ctctgtggag gccattgagg gctcccacgt cagcctgctc 780

tgtggggctg acagcaaccc gccaccgctg ctgacttgga tgcgggatgg gatggtgttg 840

agggaggcag ttgctgagag cctgtacctg gatctggagg aggtgacccc agcagaggac 900

ggcatctatg cttgcctggc agagaatgcc tatggccagg acaaccgcac ggtggagctg 960

agcgtcatgt atgcaccttg gaagcccaca gtgaatggga cggtggtggc ggtagagggg 1020

gagacagtct ccatcctgtg ttccacacag agcaacccgg accctattct caccatcttc 1080

aaggagaagc agatcctggc cacggtcatc tatgagagtc agctgcagct ggaactccct 1140

gcagtgacgc ccgaggacga tggggagtac tggtgtgtag ctgagaacca gtatggccag 1200

agagccaccg ccttcaacct gtctgtggag tttgctccca taatccttct ggaatcgcac 1260

tgtgcagcgg ccagagacac cgtgcagtgc ctgtgtgtgg taaaatccaa cccggaaccc 1320

tccgtggcct ttgagctgcc ttcccgcaac gtgactgtga acgagacaga gagggagttt 1380

gtgtactcag agcgcagcgg cctcctgctc accagcatcc tcacgctccg gggtcaggcc 1440

caagccccac cccgcgtcat ttgtacctcc aggaacctct acggcaccca gagcctcgag 1500

ctgcctttcc agggagcaca ccga 1524

<210>14

<211>615

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>14

tgtccatgtg ccagttcagc ccaggtgctg caggagctgc tgagccggat cgagatgctg 60

gagagggagg tgtcggtgct gcgagaccag tgcaacgcca actgctgcca agaaagtgct 120

gccacaggac aactggacta tatccctcac tgcagtggcc acggcaactt tagctttgag 180

tcctgtggct gcatctgcaa cgaaggctgg tttggcaaga attgctcgga gccctactgc 240

ccgctgggtt gctccagccg gggggtgtgt gtggatggcc agtgcatctg tgacagcgaa 300

tacagcgggg atgactgttc cgaactccgg tgcccaacag actgcagctc ccgggggctc 360

tgcgtggacg gggagtgtgt ctgtgaagag ccctacactg gcgaggactg cagggaactg 420

aggtgccctg gggactgttc ggggaagggg agatgtgcca acggtacctg tttatgcgag 480

gagggctacg ttggtgagga ctgcggccag cggcagtgtc tgaatgcctg cagtgggcga 540

ggacaatgtg aggaggggct ctgcgtctgt gaagagggct accagggccc tgactgctca 600

gcagttgccc ctcca 615

<210>15

<211>555

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

atggaagacc tggaccagtc tcctctggtc tcgtcctcgg acagcccacc ccggccgcag 60

cccgcgttca agtaccagtt cgtgagggag cccgaggacg aggaggaaga agaggaggag 120

gaagaggagg acgaggacga agacctggag gagctggagg tgctggagag gaagcccgcc 180

gccgggctgt ccgcggcccc agtgcccacc gcccctgccg ccggcgcgcc cctgatggac 240

ttcggaaatg acttcgtgcc gccggcgccc cggggacccc tgccggccgc tccccccgtc 300

gccccggagc ggcagccgtc ttgggacccg agcccggtgt cgtcgaccgt gcccgcgcca 360

tccccgctgt ctgctgccgc agtctcgccc tccaagctcc ctgaggacga cgagcctccg 420

gcccggcctc cccctcctcc cccggccagc gtgagccccc aggcagagcc cgtgtggacc 480

ccgccagccc cggctcccgc cgcgcccccc tccaccccgg ccgcgcccaa gcgcaggggc 540

tcctcgggct cagtg 555

<210>16

<211>198

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

aggatataca agggtgtgat ccaagctatc cagaaatcag atgaaggcca cccattcagg 60

gcatatctgg aatctgaagt tgctatatct gaggagttgg ttcagaagta cagtaattct 120

gctcttggtc atgtgaactg cacgataaag gaactcaggc gcctcttctt agttgatgat 180

ttagttgatt ctctgaag 198

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物MAG1

<400>17

cgggatccat gatattcctt accaccct 28

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物MAG2

<400>18

tccccgcggc tcggtgtgct ccctggaa 28

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物TNR1

<400>19

tccccgcggc atgtccatgt gccagttca 29

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物TNR2

<400>20

ttgcggccgc tggaggggca actgctga 28

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物NogoN1

<400>21

ttgcggccgc aatggaagac ctggaccagt ct 32

<210>22

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物NogoN2

<400>22

aaactgcagc cactgagccc gaggagcccc t 31

<210>23

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物Nogo66-1

<400>23

aaactgcagc aaggatatac aagggtgt 28

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物Nogo66-2

<400>24

gctctagatc acttcagaga atcaacta 28

<210>25

<211>2934

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>依次连接的PCR产物产生的构建体

<400>25

ggatccatga tattccttac caccctgcct ctgttttgga taatgatttc agcttctcga 60

ggggggcact ggggtgcctg gatgccctcg tccatctcag ccttcgaggg cacgtgtgtc 120

tccatcccct gccgtttcga cttcccggat gagctcagac cggctgtggt acatggcgtc 180

tggtatttca acagtcccta ccccaagaac tacccgccag tggtcttcaa gtcccgcaca 240

caagtggtcc acgagagctt ccagggccgt agccgcctgt tgggagacct gggcctacga 300

aactgcaccc tgcttctcag cacgctgagc cctgagctgg gagggaaata ctatttccga 360

ggtgacctgg gcggctacaa ccagtacacc ttctcggagc acagcgtcct ggacatcatc 420

aacaccccca acatcgtggt gcccccagaa gtggtggcag gaacggaagt agaggtcagc 480

tgcatggtgc cggacaactg cccagagctg cgccctgagc tgagctggct gggccacgag 540

gggctagggg agcccactgt tctgggtcgg ctgcgggagg atgaaggcac ctgggtgcag 600

gtgtcactgc tacacttcgt gcctactaga gaggccaacg gccaccgtct gggctgtcag 660

gctgccttcc ccaacaccac cttgcagttc gagggttacg ccagtctgga cgtcaagtac 720

cccccggtga ttgtggagat gaattcctct gtggaggcca ttgagggctc ccacgtcagc 780

ctgctctgtg gggctgacag caacccgcca ccgctgctga cttggatgcg ggatgggatg 840

gtgttgaggg aggcagttgc tgagagcctg tacctggatc tggaggaggt gaccccagca 900

gaggacggca tctatgcttg cctggcagag aatgcctatg gccaggacaa ccgcacggtg 960

gagctgagcg tcatgtatgc accttggaag cccacagtga atgggacggt ggtggcggta 1020

gagggggaga cagtctccat cctgtgttcc acacagagca acccggaccc tattctcacc 1080

atcttcaagg agaagcagat cctggccacg gtcatctatg agagtcagct gcagctggaa 1140

ctccctgcag tgacgcccga ggacgatggg gagtactggt gtgtagctga gaaccagtat 1200

ggccagagag ccaccgcctt caacctgtct gtggagtttg ctcccataat ccttctggaa 1260

tcgcactgtg cagcggccag agacaccgtg cagtgcctgt gtgtggtaaa atccaacccg 1320

gaaccctccg tggcctttga gctgccttcc cgcaacgtga ctgtgaacga gacagagagg 1380

gagtttgtgt actcagagcg cagcggcctc ctgctcacca gcatcctcac gctccggggt 1440

caggcccaag ccccaccccg cgtcatttgt acctccagga acctctacgg cacccagagc 1500

ctcgagctgc ctttccaggg agcacaccga gccgcggcat gtccatgtgc cagttcagcc 1560

caggtgctgc aggagctgct gagccggatc gagatgctgg agagggaggt gtcggtgctg 1620

cgagaccagt gcaacgccaa ctgctgccaa gaaagtgctg ccacaggaca actggactat 1680

atccctcact gcagtggcca cggcaacttt agctttgagt cctgtggctg catctgcaac 1740

gaaggctggt ttggcaagaa ttgctcggag ccctactgcc cgctgggttg ctccagccgg 1800

ggggtgtgtg tggatggcca gtgcatctgt gacagcgaat acagcgggga tgactgttcc 1860

gaactccggt gcccaacaga ctgcagctcc cgggggctct gcgtggacgg ggagtgtgtc 1920

tgtgaagagc cctacactgg cgaggactgc agggaactga ggtgccctgg ggactgttcg 1980

gggaagggga gatgtgccaa cggtacctgt ttatgcgagg agggctacgt tggtgaggac 2040

tgcggccagc ggcagtgtct gaatgcctgc agtgggcgag gacaatgtga ggaggggctc 2100

tgcgtctgtg aagagggcta ccagggccct gactgctcag cagttgcccc tccagcggcc 2160

gcaatggaag acctggacca gtctcctctg gtctcgtcct cggacagccc accccggccg 2220

cagcccgcgt tcaagtacca gttcgtgagg gagcccgagg acgaggagga agaagaggag 2280

gaggaagagg aggacgagga cgaagacctg gaggagctgg aggtgctgga gaggaagccc 2340

gccgccgggc tgtccgcggc cccagtgccc accgcccctg ccgccggcgc gcccctgatg 2400

gacttcggaa atgacttcgt gccgccggcg ccccggggac ccctgccggc cgctcccccc 2460

gtcgccccgg agcggcagcc gtcttgggac ccgagcccgg tgtcgtcgac cgtgcccgcg 2520

ccatccccgc tgtctgctgc cgcagtctcg ccctccaagc tccctgagga cgacgagcct 2580

ccggcccggc ctccccctcc tcccccggcc agcgtgagcc cccaggcaga gcccgtgtgg 2640

accccgccag ccccggctcc cgccgcgccc ccctccaccc cggccgcgcc caagcgcagg 2700

ggctcctcgg gctcagtggc tgcagcaagg atatacaagg gtgtgatcca agctatccag 2760

aaatcagatg aaggccaccc attcagggca tatctggaat ctgaagttgc tatatctgag 2820

gagttggttc agaagtacag taattctgct cttggtcatg tgaactgcac gataaaggaa 2880

ctcaggcgcc tcttcttagt tgatgattta gttgattctc tgaagtgatc taga 2934

<210>26

<211>42

<212>DNA

<213>M13大肠杆菌噬菌体(M13coliphage)

<400>26

ttattcgcaa ttcctttagt ggtacctttc tattctcact ct 42

<210>27

<211>33

<212>DNA

<213>M13大肠杆菌噬菌体(M13 coliphage)

<400>27

ggtggaggtt cggccgaaac tgttgaaagt tgt 33

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>28

tatctgacgc agcctcagtc g 21

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>29

ggttctctgc ctcattcgct g 21

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>30

acgcagctgt ttcctcctta g 21

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>31

cattctattc ctgataatat t 21

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>32

catcatatgc ctcatgataa g 21

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>33

tatacgacgc ctccgagtcc t 21

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>34

cagcttccgc ttatgcctcg t 21

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>示例性7-mer肽编码序列

<400>35

acgcagctgt ttcctcctca g 21

Claims

1.一种肽，其氨基酸序列由选自下组的氨基酸序列组成：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。

2.权利要求1的肽，其中所述氨基酸序列选自：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；或

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)。

3.长度可多至60个氨基酸的肽，其包含选自下组的氨基酸序列：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，

其中所述肽具有与Nogo，MAG和/或TN-R结合的能力。

4.权利要求3的肽，其包含氨基酸序列YLTQPQS(SEQ ID NO.1)或TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)。

5.长度可多至60个氨基酸的肽，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的相应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，

其中所述肽具有与Nogo，MAG和/或TN-R结合的能力。

6.权利要求5的肽，其具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的相应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；或

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3).

7.权利要求5或6的肽，其中相同的残基的数目为至少6个。

8.权利要求3-7之一的肽，其能够与Nogo-66和/或TNR-EGFL结合。

9.权利要求3-8之一的肽，其长度可多至40个氨基酸。

10.权利要求9的肽，其长度可多至20个氨基酸。

11.权利要求10的肽，其长度可多至10个氨基酸。

12.一种组合物，其包含根据前述任意权利要求的一或多种肽，以及一或多种可药用的成分。

13.权利要求1-11之一的肽，其用于治疗方法中。

14.权利要求1-11之一的肽在制备用于治疗CNS损伤的药物中的用途。

15.治疗CNS损伤的方法，所述方法包括将权利要求1-11之一的肽给药到患者中的CNS损伤位点或者所述位点附近。

16.治疗脊髓损伤或卒中的方法，所述方法包括将具有选自下组的氨基酸序列的肽给药患者：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；或

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)，

所述给药通过直接注入患者中脊髓损伤或卒中损伤的位点来进行。

17.权利要求1-11之一的肽和/或它的计算机产生的模型在设计能够与一或多种神经元生长抑制分子Nogo，MAG和/或TN-R结合的模拟物中的用途。

18.设计如权利要求1-11定义的肽的模拟物的方法，所述模拟物能够与一或多种神经元生长抑制分子Nogo，MAG和/或TN-R结合，所述方法包括：

(i)分析权利要求1-11定义的肽，所述肽能够与一或多种神经元生长抑制分子Nogo，MAG和/或TN-R结合，测定对于定义药效基团的活性而言必不可少且重要的氨基酸残基；和

(ii)模拟所述药效基团以设计和/或筛选具有所述生物活性的候选模拟物。

19.权利要求17或18的用途或方法，其包括在体外测定候选模拟物与Nogo，MAG和/或TN-R的结合的步骤。

20.权利要求17-19之一的用途或方法，其包括这样的步骤，鉴定能够进行所述体外结合的候选模拟物，优化该候选模拟物以用于体外应用。

21.权利要求20的用途或方法，其中所述经优化的模拟物与一或多种可药用的成分配制在一起。

22.噬菌体，其表达由肽以及噬菌体外壳蛋白组成的融合蛋白，使得所述肽能够在噬菌体病毒粒表面展示，所述肽为权利要求1-11之一定义约肽。

23.筛选能够与Nogo，MAG和/或TN-R结合的肽的方法，所述方法包括：

提供权利要求22的噬菌体，其分别表达不同的肽；和

筛选具有与Nogo，MAG和/或TN-R结合的能力的噬菌体。

24.权利要求23的方法，其中随后根据在体外实验中阻断Nogo，MAG和/或TN-R对神经元细胞粘附的抑制作用的能力，来筛选被鉴定为能够与Nogo，MAG和/或TN-R结合的噬菌体或者它们所展示的肽。

25.包括权利要求24中的所有步骤以及另外的步骤的方法，所述另外的步骤是在鉴定能够在体外实验中阻断Nogo，MAG和/或TN-R对神经元细胞粘附的抑制作用的肽或显示该肽的噬菌体以后，将所述肽与一或多种可药用的成分配制在一起用于体内给药。

26.搜索很可能减少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法包括搜索序列数据库以鉴定多种多肽，或者编码多肽的核酸，其包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的对应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。

27.搜索很可能减少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法包括利用能在严谨条件下与一种核酸序列杂交的寡核苷酸探针来筛选cDNA文库，所述核酸序列编码具有至少5个与选自下组的氨基酸序列中的对应残基相同的残基：

YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；

GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；

TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；

HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；

HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；

YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和

QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。

28.权利要求26或27的方法，其包括这样的步骤，在鉴定了候选多肽或编码该候选多肽的核酸以后，检测所述多肽降低TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的能力。

29.包括权利要求28中的所有步骤以及另外的步骤的方法，所述另外的步骤是在鉴定能够在体外实验中阻断Nogo，MAG和/或TN-R对神经元细胞粘附的抑制作用的多肽后，将所述多肽与一或多种可药用的成分配制在一起用于体内给药。

30.核酸载体，其含有编码选自下组的一或多个肽结构域的核酸：

(a)Nogo-A的N-末端结构域(NogoN)，或其变体或片段；

(b)Nogo-B的细胞外环(Nogo66)，或其变体或片段；

(c)MAG的第三到第五个免疫球蛋白样重复，或其变体或片段；和

(d)TN-R的EGF-样结构域，或其变体或片段，

其中所述片段包含来自所述结构域的至少15个连续的氨基酸，包括所述结构域的一或多个表位，并保持在体内激发抗体应答的能力，和

其中所述变体包括至少15个氨基酸的部分，其与所述结构域的相应部分具有至少65％的氨基酸同一性。

31.权利要求30的载体，其中所述核酸编码上述结构域中的至少两个结构域。

32.权利要求31的载体，其中所述结构域作为融合蛋白表达。

33.权利要求32的载体，其中所述结构域通过柔性接头互相分离。

34.权利要求30-33之一的载体，其中对于蛋白Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG，所述载体优选基本上仅能够表达权利要求30所述的结构域(a)，(b)，(c)和/或(d)。

35.权利要求34的载体，其中所述载体能够表达所述蛋白的其它含有表位的部分。

36.权利要求34或35的载体，其中对于蛋白Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG，所述载体优选表达不超过20％的位于权利要求30所述的结构域(a)-(d)之外的蛋白质。

37.权利要求30-36之一的载体，其中结构域(a)具有氨基酸序列NogoN(1-185)(SEQ ID NO：10)，结构域(b)具有氨基酸序列Nogo66(823-888)(SEQ ID NO：11)，结构域(c)具有氨基酸序列MAG(1-508)(SEQ ID NO：8)，和结构域(d)具有氨基酸序列TNR(125-329)(SEQ ID NO：9)。

38.权利要求的载体30，其编码具有氨基酸序列MAG(1-508)-Ala_n-TNR(125-329)-Ala_n-NogoN(1-185)-Ala_n-Nogo66(823-888)(SEQ ID NO：12)的多肽，其中Ala_n代表聚丙氨酸接头。

39.一种组合物，其包含权利要求30-38之一的载体，该载体与一或多种可药用的成分配制在一起用作治疗性疫苗。

40.权利要求30-38之一的载体，其用于治疗方法中。

41.权利要求30-38之一的载体在制备用于治疗CNS损伤的药物中的用途。

42.治疗患者中的CNS损伤的方法，所述方法包括将权利要求30-38之一的载体作为治疗性疫苗给药患者。

43.一种多肽，其基本上由权利要求30定义的一或多个多肽结构域组成。

44.权利要求43的多肽，其由权利要求30-38之一的载体编码。

45.一种组合物，其包含权利要求43或44的多肽，所述多肽与一或多种可药用的成分配制在一起用作治疗性疫苗。

46.权利要求43或44的多肽，其用于治疗方法中。

47.权利要求43或44的多肽在制备用于治疗CNS损伤的药物中的用途。

48.治疗患者中的CNS损伤的方法，所述方法包括将权利要求43或44的多肽作为治疗性疫苗给药患者。

49.能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)之一特异性结合的抗体，或能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)中的两种、三种或所有四种结构域结合的抗体混合物，所述抗体或抗体混合物用于治疗方法中。

50.能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)之一特异性结合的抗体，或能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)中的两种、三种或所有四种结构域结合的抗体混合物在制备用于治疗CNS损伤的药物中的用途。

51.治疗患者体内的CNS损伤的方法，所述方法包括给药患者以下抗体作为治疗性疫苗：能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)之一特异性结合的抗体，或能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)中的两种、三种或所有四种结构域结合的抗体混合物。

52.一种组合物，其包含能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)之一特异性结合的抗体，或能够与权利要求37中定义的结构域(a)-(d)中的两种、三种或所有结构域结合的抗体混合物，所述抗体或抗体混合物与一或多种可药用的成分配制在一起用作治疗性疫苗.

53.权利要求12，39，45或52之一的组合物，其被配制成用于通过注射给药的剂型。

54.权利要求13的肽，权利要求的载体40，权利要求46的多肽或权利要求49的抗体，其中所述治疗是对CNS损伤的治疗。

55.权利要求13的肽，权利要求的载体40，权利要求46的多肽或权利要求49的抗体，其中所述治疗是对脊髓损伤或卒中的治疗。

56.权利要求14，41，47或50之一的用途，其中所述治疗是对脊髓损伤或卒中的治疗。