JPH09512561A

JPH09512561A - ヒト免疫不全ウイルス感染に対する防御用合成ワクチン

Info

Publication number: JPH09512561A
Application number: JP7528495A
Authority: JP
Inventors: ヘインズ，バートン・エフ; パルカー，トーマス・ジェイ
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1997-12-16
Also published as: AU2372695A; EP0762895A4; DK0762895T3; EP0762895B1; PT762895E; CA2189045A1; ATE221786T1; DE69527708T2; EP0762895A1; DE69527708D1; ES2177648T3; AU707894B2; WO1995029700A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物のワクチン接種に適した担体分子に直接もしくはスペーサー分子を介して共有結合した、ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を含むペプチドの免疫原製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト免疫不全ウイルス感染に対する防御用合成ワクチン本出願は、１９９２年３月２７日出願の出願番号第０７／８５８，３６１号の一部継続（ＣＩＰ）であり、それは１９９２年２月１０日出願の出願番号第０７／８３２，８４９号のＣＩＰであり、それは１９９０年１０月１日出願の出願番号第０７／５９１，１０９号のＣＩＰであり、それは１９８７年９月８日出願の出願番号第０７／０９３，８５４号のＣＩＰである。発明の背景技術的分野本発明は、概して、免疫製剤、そして特に、中和抗体が生産されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ蛋白質の部分に対応するアミノ酸配列を含むペプチドに関する。本発明は、更に、担体分子に対して直接的にかまたはスペーサー分子を介して結合したペプチドを含む、ヒトのワクチン接種に適したワクチンに関する。背景情報ヒトレトロウイルスＨＩＶは、現在のところ治療法のない疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であると実証されている。ＡＩＤＳ関連症状の中での疫学的パターンは、それが伝播性疾患であることを示している。ウイルスは、しばしば、男性同性愛者、静脈注射用薬物使用者、血液製剤受容患者を含む高危険率部類の個体並びにハイチおよび中央アフリカ出身の個体からの唾液、精液、全血および血漿中で見出される。高危険率部類の個体の中での血清陽性の急速な上昇、疾患の病原性およびその世界中に広がりつつある分布は、未感染個体において完全な防御免疫を引き起こすことができるワクチンに対して圧倒的に強い且つ緊急な要求を強くしている。生物試料中のＨＩＶに対する抗体の存在について検査するのに用いるための診断用試薬に対する要求もまた明らかである。従来の研究は、ＨＩＶが、その外側エンベロープ糖蛋白質（ｇｐ１２０）をＴリンパ球の表面上のＣＤ４（Ｔ４）分子に対して付着させ、それによってＣＤ４（Ｔ４）分子を受容体として用いてＴ細胞に入り且つ感染することによって免疫系のＴリンパ球に感染することを実証してきた。細胞に感染後、ウイルスは、ウイルスに抵抗するＴ細胞の能力を破壊する。レトロウイルスエンベロープ糖蛋白質は、インビトロでＨＩＶ感染を阻止する抗エンベロープ抗体含有血清の能力によって決定されるように、ウイルス中和抗体反応を引き起こすのに重要であることが分かっている。具体的に、ＨＩＶ外側エンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０は、ヤギおよびヒトにおいて中和抗体を誘導しうることが分かっている（ロビー（Ｒｏｂｅｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：７０２３，１９８６年）。ＨＩＶ感染患者において免疫原性であるかまたは中和抗体を生じるｇｐ１２０上のエピトープの正確な位置はほとんど知られていない。しかしながら、ｇｐ１２０分子全体の約３分の１をコードする組換え体蛋白質ＰＢＩ（プトニー（Ｐｕｔｎｅｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３９２，１９８６年）は、中和抗体の生成を引き起こすエンベロープ蛋白質の部分を包含することが分かった。これまでに蓄積されたデータは、ＰＢＩも自然のままのｇｐ１２０も、ＨＩＶ感染に対するワクチンとして用いるには不適当であることを示唆している。ヤギおよびチンパンジーの使用を含む研究は、どちらの分子にも中和抗体の高力価の産生を引き起こす能力がないことを実証している。更に、自然のままのｇｐ１２０分子は正常なＴ細胞のＴ４分子に対して結合し且つ正常な免疫機能を破壊しうることが分かった。具体的には、ｇｐ１２０エンベロープ分子全体が、正常なＣＤ４（Ｔ４）機能を妨げ且つインビトロでのＴ細胞活性化を抑制する（マン（Ｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２６４０，１９８７年）。したがって、外側エンベロープ糖蛋白質の大部分を含むワクチンの投与は、実際に、正常な免疫系に対して有害でありうる。ｇｐ１２０の本質的中和ドメイン（Ｖ３ｇｐ１２０エンベロープループ部分）のＨＩＶ配列多様性および急速なＶ３ループ配列突然変異率は、ワクチン開発のために克服すべき主な障害であることが明らかになった（マイアーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ１９９１；ラ・ロサ（ＬａＲｏｓａ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：９３２〜９３５，１９９０年；およびホリー（Ｈｏｌｌｅｙ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８８：６８００〜６８０４，１９９１年）。それにもかかわらず、ｇｐ１２０Ｖ３部分が抗ＨＩＶ中和抗体の生成において決定的な役割を果たしていることを示すために研究が続けられている（ジャン（Ｊｉａｎｇ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５５７〜１５９３，１９９０年）。更に、最近になって、現在のＨＩＶ単離物の約５０％が、ＨＩＶＭＮ単離物に似ているＶ３配列の一致を共有していること、および米国でのＨＩＶ単離物の約８０％が４種類の最も一般的なＨＩＶ配列の一つを共有していることが分かった（マイアーズら、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ１９９１；ラ・ロサら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：９３２〜９３５，１９９０年；およびホリーら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８８：６８００〜６８０４，１９９１年）。更に、これらの配列の内の二つ、ＧＰＧＲＡＦおよびＩＨＩＧＰＧＲＡは、動物において広範囲に交差反応性のＨＩＶ中和抗体を生じた（ジャハベリアン（Ｊａｈａｖｅｒｉａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１５９０〜１５９３，１９９０年およびヘインズ（Ｈａｙｎｅｓ）ら、ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍａｎｓ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ，６：３８〜３９，１９９０年）。したがって、ＨＩＶに対するワクチンの開発にとって重要なのは、ＣＤ４（Ｔ４）分子とのｇｐ１２０相互作用を妨げるが、正常なＴ細胞応答の極めて多数の段階が仲介するＣＤ４（Ｔ４）分子の主要な正常機能であるクラスＩＩ主要組織適合性分子との正常なＣＤ４（Ｔ４）相互作用を妨げないｇｐ１２０に対する抗体反応を生じさせることである。更に、ＨＩＶに対する有効なワクチンは、霊長類およびヒトにおいて防御免疫応答を引き起こす、すなわち、後にＨＩＶ感染が起こるのを防止する。ＨＩＶ株の約８０％に対して健全な（防御的）抗ＨＩＶ免疫応答を引き起こした免疫原は、少なくとも３種類の状況において大きな臨床的用途を有するであろう。第一に、高危険率でＨＩＶに感染すると考えられるＨＩＶ陰性ＩＶ薬物使用者、在監者および同性愛者の免疫感作に成功すれば、ＡＩＤＳ蔓延の進行を有意に遅らせるであろう。第二に、妊娠３か月までのＨＩＶに感染した母親の免疫感作が健全な抗ＨＩＶウイルス応答を引き起こし且つＨＩＶの伝播を８０％まで減少させることができた場合、母体−胎児ＨＩＶ伝播は、ＨＩＶに感染した母親に対して生まれた子供の３０％から６％に減少するであろう。第三に、健全な且つ病原性でない抗ＨＩＶ応答を引き起こしたＨＩＶに対する免疫原は、ＨＩＶに感染した無症候性個体を免疫感作して抗ＨＩＶ免疫応答を引き起こし、且つ無症候性ＨＩＶ感染状態の持続を促すのに有用であろう。発明の目的本発明の目的は、担体分子に対して結合したおよび／または重合して分子凝集体を生成した場合に、哺乳動物中においてＨＩＶに対する中和抗体の高力価の生産を引き起こすことができるペプチドであって、正常な免疫機能を妨げない上記ペプチドを提供することである。本発明のもう一つの目的は、哺乳動物中においてＨＩＶに対する防御免疫を引き起こすことができるＨＩＶエンベロープ蛋白質の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを含む合成ワクチンを提供することである。本発明のもう一つの目的は、哺乳動物中において種々の型のＨＩＶに対する防御免疫を引き起こすことができるワクチンを提供することである。本発明のもう一つの目的は、生物試験試料中の抗ｇｐ１２０抗体の存在を検出する方法を提供することである。発明の概要本発明は、免疫原性製剤およびそれから製造されたワクチンに関する。ＨＩＶのエンベロープ蛋白質の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、適当な担体分子に対して直接的にかまたはスペーサー分子を介して共有結合している。１種類またはそれ以上のこのようなペプチドを含む合成ワクチンを開示する。一つの実施態様において、本発明は、ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を有する本質的に純粋な形のペプチドであって、担体分子に対して共有結合した場合に、哺乳動物中において高力価のＨＩＶに対する防御抗体を生じることができる上記ペプチドを包含する。ペプチドは、例えば、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B単離物のエンベロープ糖蛋白質のアミノ酸３０３〜３２１に対応する配列ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧ（ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７，１９８５年）またはその任意の部分を有することができる。もう一つの実施態様において、本発明は、哺乳動物中において高力価のＨＩＶに対する防御抗体を生じることができる免疫原性複合体であって、（ｉ）担体分子を、（ｉｉ）ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を含むペプチドに対して共有結合したものを含む上記複合体を包含する。更にもう一つの実施態様において、本発明は、ＨＩＶに対する免疫を引き起こす方法であって、哺乳動物に対して上記複合体を投与することを含む上記方法を包含する。もう一つの実施態様において、本発明は、生物試験試料中の抗ｇｐ１２０抗体の存在を検出する方法を包含する。図面の簡単な説明図１。組換え体蛋白質および合成ペプチドとの関係。図２。合成ペプチドに対するＡＩＤＳ患者抗体の反応性。図３。合成ペプチドアフィニティーカラムで精製されたＨＩＶ＋患者からの抗体へのｇｐ１２０の反応性。図４。ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清によるＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bの中和。図５。ＨＩＶの単離物特異的中和。図６。ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清はＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B感染Ｈ９Ｔ細胞に対して結合するが、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RF感染Ｈ９Ｔ細胞に対しては結合しない。図７。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて抗Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮペプチド抗体を生じる、ＨＩＶＭＮのエンベロープからの種々のＴ１−ＳＰ１０ペプチドの能力の比較。各点は、９６ウェルプレート中においてプレート上の抗原としてペプチドＴ１−ＳＰ１０ＭＮを用いるＥＬＩＳＡ検定によって決定される４〜５匹のマウスでの抗Ｔ１−ＳＰ１０血清抗体の平均濃度水準を表わす。データは、免疫感作後採血（Ｅ）光学濃度（ＯＤ）対前採血（対照）ＯＤの比率（Ｅ／Ｃ）として表わされる。データは、２回の免疫感作後のＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮおよびＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドが、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮそれ自体よりも高水準の抗Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ抗体を生じることを示す。図８。インビトロのシンシチウム阻害検定においてＨＩＶＭＮを中和する抗体をＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生じるＨＩＶＭＮのエンベロープからの種々のＴ１−ＳＰ１０ペプチドの能力の比較。各棒は、指定された形のＴ１−ＳＰ１０によって免疫感作されたマウス１匹からの採血３による血清の結果を示す。棒の高さは、１：１０希釈での前採血血清と比較した同一の希釈の血清によって阻害されたシンシチウム生成の百分率を示す。図９は、ＨＩＶｅｎｖ合成ペプチドによって免疫感作されたチンパンジーにおけるＥＬＩＳＡ検定での経過時間にわたる免疫感作用ペプチドに対する抗体力価を示す。図１０は、７日目トリチウム化チミジン取込み検定におけるＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドに対する末梢血単核細胞増殖応答を示す。図１１は、Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドおよびＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドによって免疫感作されたチンパンジーのＰＨＡに対するＰＢＭＣ増殖応答を示す。図１２は、チンパンジー８８４、１０２８、１０４５および１０７０を免疫感作するのに用いられた同一バッチのペプチドによって免疫感作されたヤギを示す。ペプチドはヤギにおいて免疫原性であり且つ高力価の抗ＨＩＶＩＩＩＢ中和抗体を生じた。図１３は、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮペプチドによって免疫感作されたアカゲザルにおける抗ＨＩＶＭＮ中和抗体を示す。データは、シンシチウム阻害検定における９０％中和力価を示す。図１４は、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによって免疫感作されたアカゲザルにおける免疫感作用ペプチドに対する抗体を示す。図１５は、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによって免疫感作されたアカゲザルの血清中のシンシチウム阻害検定における中和抗体水準を示す。図１６は、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによって免疫感作されたアカゲザルにおける免疫感作用ペプチドに対する血清抗体力価を示す。図１７は、アカゲザル１８９８７においてＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによって誘導された交差中和抗体の、ＧＰＧＲＡＦ配列含有ペプチドによる吸収を示す。示されたように、Ｔ１含有ペプチドは中和抗体を吸収せず、またＴ１− ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）中でない配列を有するペプチドも吸収しなかった。ＧＰＧＲＡＦを含むペプチドのみが中和活性を吸収し、このことは、この動物がＶ３ＨＩＶｇｐ１２０ループのＧＰＧＲＡＦ部分を免疫原性として選択的に認識し且つこの部分に対する交差反応性抗体を生成したことを実証する。図１８。Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢまたはＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドによって免疫感作された後にＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによって免疫感作された４頭のチンパンジーの血清中の、ＨＩＶＩＩＩＢ／ＬＡＩ（実線）およびＨＩＶＭＮ（点線）に対する中和抗体力価。中和抗体力価はシンシチウム阻害検定で測定された。図１９。詳細については図９の説明を参照されたい。実線はＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢペプチドに対する抗体力価を示し；点線はＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドに対する抗体反応を示す。図２０。ＨＩＶＭＮ単離物に対するチンパンジー１０７０血清中和抗体のＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによる吸収およびＤＰ２ペプチドによる部分吸収。図２１。アカゲザルにおけるＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによる高水準のＨＩＶＭＮに対する中和抗体の誘導。図２２。アカゲザルにおけるＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによる抗Ｔ１ −ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチド抗体の誘導。図２３。Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによる高水準の抗ＨＩＶＭＮ中和抗体の誘導。図２４。アカゲザルにおいて免疫原としてＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドを用いるＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドに対する抗体の誘導。図２２、２４で用いられた検定は、免疫感作用ペプチドに対する終末点ＥＬＩＳＡであった（２．９を越えるＥ／Ｃ）。図２５。ＨＩＶＩＩＩＢ単離物に対する血清中和抗体のＳＰ１０ＭＮ（Ａ）およびＤＰ２ペプチドによる吸収。図２６。パネルＡは、ＨＩＶ単離物ＭＮからのＴ１−ＳＰ１０（Ａ）と称するＣ４−Ｖ３ペプチドの全体の原型設計図であり、ハイブリッドペプチド中に２個のＴヘルパー決定基、Ｂ７拘束性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）の１個のＭＨＣクラスＩＣＴＬエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２拘束性の第二ＣＴＬエピトープがある。パネルＢは、サル免疫不全ウイルスエンベロープおよびサル免疫不全ウイルスｇａｇ蛋白質から設計されたＴｈ−ＣＴＬペプチドを示す。このペプチドを用いて、ヤストミ（Ｙａｓｕｔｏｍｉ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５０９６（１９９３））に記載されたように、霊長類においてクラスＩ拘束性抗ＳＩＶＣＴＬを生成するペプチドの能力を示した。図２７。ヒト免疫感作用Ｔ１−ＳＰ１０（Ａ）Ｔｈ−Ｂ−Ｔｃペプチドの配列。図２８。単クローン性抗体４８ｄはＣ４−Ｖ３ペプチドＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）に対して結合するが、単クローン性抗体１７ｂは結合しない。増加量の単クローン性抗体を、ヘインズら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１６４６（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：７１７（１９９３））に詳細に記載のようにＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）Ｃ４−Ｖ３ペプチドで被覆された（２μ ｇ／ウェル）ＥＬＩＳＡプレートに加えた。図２８は、単クローン性抗体４８ｄはＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドに対して結合したが、１７ｂ抗体は結合しなかったことを示す。このプレートは８モル尿素によって剥され（プレート上のペプチドの直鎖状Ｖ３決定基に対する抗体結合に影響を与えないことが予め分かった処理）、ペプチドの８モル尿素処理がペプチドおよびペプチドに対する予防の引き続きの４８ｄ結合を変性したことを実証した。これらのデータは、４８ｄ抗体がＣ４−Ｖ３ペプチドＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）上の立体配座決定基に対して結合したことを強く示唆した。図２９。単クローン性抗体４８ｄに対する最大限のペプチド結合には、全部のＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドが必要とされる。Ｔ１ペプチド（Ｃ４部分のみ）か、Ｖ３ペプチド［ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）］か、Ｃ４−Ｖ３ペプチド［Ｔ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）］かまたは等量のＣ４（Ｔ１）＋Ｖ３［ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）］ペプチドの混合物を、ＥＬＩＳＡプレート上において全濃度２μｇ／ウェルでインキュベートした。図２９において、対照単クローン性抗体ＤＵ．ＨＰ２０はこれらのペプチドのいずれに対しても結合しなかったが、４８ｄ単クローン性抗体はＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドに対して結合し且つＴ１ −ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドのＣ４−Ｖ３タイプに対して有意によく結合したことが分かる。Ｔ１＋ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドの混合は４８ｄ結合を増加させなかった。図３０。ＡＩＤＳ用のＨＬＡ系ワクチンの全体図。発明の詳細な説明本発明は、ＨＩＶの免疫原性エピトープに対応するペプチドおよびそれから製造された合成ワクチンに関する。これらの新規の免疫原性剤は、ＨＩＶのエンベロープ蛋白質と抗原決定基を共有するペプチドを化学的に合成することによって製造される。ペプチドは、それらをワクチンとして適当にする担体分子に対して結合している（および／または重合している）。これらのワクチンは、例えば、非経口経路によって哺乳動物に対して投与された場合、ＡＩＤＳに対する免疫感作に有用である。免疫原としての可能性について研究されるべきペプチドは、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質の親水性荷電部分に対応するペプチドを包含することが確認された。更に、このようなペプチドの内、予測されるβターンを含むものは特に重要であるらしいということが確認された。ペプチド内ジスルフィド結合の生成は、自然の立体配座決定基を確定するのに有用であろうということが確認された。更に、鎖間ジスルフィド結合の生成は、更に大きい、更に免疫原性のペプチド凝集体を生成するようにペプチド分子を重合させるのに有用であろうということが確認された。ＨＩＶのＨＴＬＶ−ＩＩＩ_BおよびＡＲＶ−２単離物のエンベロープ蛋白質の予想のアミノ酸配列のコンピュータ分析は、親水性部分の二次構造および位置を決定した。二次構造は、チョウ（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：２１１および１３：２２２，１９７４年；ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４７：４５，１９７８年）の方法を用いてコンピュータ分析から決定された。βターンの可能性のある部分は、ローズ（Ｒｏｓｅ）（Ｎａｔｕｒｅ２７２：５８６，１９７８年）の方法を用いて位置決定された。エンベロープ蛋白質の親水性部分は、ローズおよびロイ（Ｒｏｙ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４６４３，１９８０年）の技法によって同定された。本発明のペプチドは、ＨＩＶ単離物ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bエンベロープ蛋白質または関連ＨＩＶ単離物のエンベロープ蛋白質の中心部分中に存在するＢ細胞エピトープに対応するまたはこれと相同である。本発明のペプチドは、長さが約３５アミノ酸（単位）またはそれ未満であり、親水性であり、そして適当な担体分子とコンジュゲートさせた場合、哺乳動物中においてＨＩＶに対する種類（または単離物）特異的中和抗体の高力価（すなわち、好都合には、１００感染単位の感染力が１：６００希釈の血清においてインビトロで約８０％減少）の生産を引き起こす。自然のままのｇｐ１２０分子とは異なり、ペプチド自体は、Ｔリンパ球の表面上のＣＤ４（Ｔ４）分子と、マクロファージＨＬＡクラスＩＩ分子との間の相互作用を阻害することができないし、したがって正常な免疫機能を妨げない。すなわち、抗ＨＩＶ中和抗体を誘導しうる本発明のペプチドは、インビトロで抗原特異的正常Ｔ細胞増殖応答を阻害しない。本発明のペプチドは、例えば、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０のアミノ酸３０３〜３２１に対応する配列ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧ（ＳＰ−１０と称する）（ラトナーら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７，１９８５年）またはその配列のある部分を有することができる。本発明のペプチドはまた、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B以外のＨＩＶ単離物の類似のＳＰ−１０部分に対応する配列またはそれらの部分を有することができ、これらの配列を「ＳＰ −１０様」と称する（例えば、表Ｉの配列を参照されたい）。「ＳＰ−１０様」という表現は、その意味の中にＳＰ−１０配列自体を包含する。本発明のペプチドが共有結合（コンジュゲート）している担体分子は、好都合に、無毒性で、薬学的に許容しうる、しかも哺乳動物において免疫応答を引き起こすのに十分な大きさである。適当な担体分子の例としては、破傷風トキソイド、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、および非ＡＩＤＳウイルス由来担体分子に代わりうるｇｐ１２０エンベロープ糖蛋白質のＴ細胞エピトープ（すなわち、Ｔ１およびＴ２）に対応するペプチド（シース（Ｃｅａｓｅ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：４２４９，１９８７年；ケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５７６９，１９８７年）がある。ペプチドはまた、薬学的に許容しうるアジュバント、例えば、ミョウバンと一緒に投与することができるし、または破傷風トキソイドよりも免疫原性の他の担体分子とコンジュケートさせることができる。本発明の担体分子の結合は、直接的でもよいしまたはスペーサー分子を介してもよい。スペーサー分子は、無毒性および反応性であるのが好都合である。ペプチドのアミノ末端に加えられる２個のグリシン残基は、ＳＰ−１０様配列またはそれらの部分を担体分子に結合するのに適当なスペーサー分子を与えることができるし；或いは、ＳＰ−１０様配列またはそれらの部分を、例えば、別の免疫原性ＨＩＶエンベロープ配列、例えば、Ｔ１またはＴ２などに直接隣接して合成することができる。システインは、担体分子と結合するためにＳＰ−１０様ペプチドのＮ若しくはＣ末端かまたは両末端に加えられて、更に大きい分子凝集体を生成するようにジスルフィド結合生成による鎖間重合を促進することができる。ペプチドに対する担体分子の結合は、カップリング剤を用いて達成される。好都合に、異機能性カップリング剤Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＥＳ）または水溶性化合物ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＥＳ）を、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（Ｃｅｌｌ，２８：４７７；１９８２年）およびパルカー（Ｐａｌｋｅｒ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：２４７９，１９８７年）によって記載のように用いる。本発明のワクチンは、１種類またはそれ以上のＳＰ−１０様ペプチドまたはそれらの部分を含み、それぞれのＳＰ−１０様ペプチドは異なるＨＩＶ株に由来し、該ペプチドは担体分子に結合している。表Ｉで示された単離物などに対して配列が対応する合成ペプチドの、好都合には約２〜約１０種類の混合物を含む多価ワクチンは、ヒトにおいて種々の型のＨＩＶに対する免疫を与えるのに用いることができる。好都合に、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_BのＳＰ−１０配列（表Ｉを参照されたい）は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B ｇｐ１２０エンベロープＴ細胞エピトープＴ１（ｇｐ１２０のアミノ酸４２８〜４４３）ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡまたはＴ２エピトープ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B ｇｐ１２０のアミノ酸１１２〜１２４）ＨＥＤＩＩＳＬＷＮＱＳＬＫ（シースら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：４２４９，１９８７年）と結合させるか若しくはこれと一緒に合成して、単一ポリペプチドを生成することができる（ＨＩＶのＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B 単離物からのＴ１−ＳＰ−１０の場合、ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧ）。同様に、他のＨＩＶ単離物からのＴ１またはＴ２配列を、対応する単離物のＳＰ−１０部分に由来する合成ペプチド（表Ｉを参照されたい）に対して、好都合にはＳＰ−１０様ペプチドのＮ末端で結合して、特定のＨＩＶ株に対する中和抗体力価を誘導しうるＴ１（またはＴ２）−ＳＰ−１０様ペプチドを生成することができる。ＳＰ−１０様ペプチドのＣ末端での結合もまた可能である。ＳＰ−１０様ペプチドの更に小さい部分、例えば、ＳＰ−１０ＲＦ（Ａ）およびＳＰ−１０Ｃ（表ＩＩ）もまた、ｇｐ１２０Ｔ細胞エピトープを含む担体分子に対して共有結合することができるし且つワクチン中で用いることができる。本発明は、更に、ＳＰ−１０様配列および１種類または複数の適当な担体分子の他にｇｐ１２０エンベロープ分子からの追加の配列を含む、ＨＩＶ株に対する有効な防御ワクチンに関する。表ＩでＳＰ−１０様と示されたペプチドに対してカルボキシ末端である主な超可変領域が存在するので（エンベロープアミノ酸３２３〜３３３、ラトナーら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７，１９８５年）、および該超可変領域は、種特異的中和抗体を生じさせるＳＰ−１０様ペプチドの能力を増大させるのにある役割を果たしうるので、ＨＩＶ単離物の超可変領域に対応するアミノ酸配列（およそアミノ酸３２２〜３３３）は、他のＳＰ−１０様ペプチド（例えば、表ＩＩの配列を参照されたい）について記載のように、ワクチン成分として一部分または全部包含されうる。超可変配列は、好都合には、ＳＰ −１０様ペプチドのＣ末端に結合させる。ＳＰ−１０様ペプチドのＮ末端への結合もまた可能である。本発明は、更に、ＳＰ−１０様配列および担体分子の他に、ウイルス誘導細胞融合に関与しているＨＩＶｇｐ４１貫膜部分に対応するペプチド、ＦＬＧＦＬＧを含む、ＨＩＶ株に対する有効な防御ワクチンに関する（ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）、Ｃｅｌｌ５０：３２７，１９８７年）。配列ＦＬＧＦＬＧは、ＳＰ−１０様ペプチドのＣ末端に加えられるのが好都合である。ＳＰ−１０様ペプチドのＮ末端での付加もまた可能である。本発明は、更に、システイン−Ｔ１−（またはＴ２−）ＳＰ−１０様、システイン−Ｔ１−（またはＴ２−）ＳＰ−１０様−超可変領域若しくはシステイン− Ｔ１−（またはＴ２−）ＳＰ−１０様−ＦＬＧＦＬＧポリペプチド；および／またはＳＰ−１０様システイン若しくはＳＰ−１０様−超可変領域−システインポリペプチドから生成される、ＨＩＶに対する有効なワクチンに関する。ポリペプチドを酸化剤によって処理してポリペプチド鎖システイン間にジスルフィド結合を生じさせて、重合し且つそれによって極めて免疫原性の抗原を生じることができる。このようにして生成された分子凝集体は、好都合に、少なくとも２種類のＨＩＶ単離物に由来する（に対応する）ＳＰ−１０様ペプチドを含む。本発明の多価ＨＩＶワクチンは、好都合に、２種類若しくはそれ以上のＨＩＶ単離物に由来するＳＰ−１０様配列若しくはその部分（例えば、表１の配列を参照されたい）および破傷風トキソイドなどの担体分子を含む２種類若しくはそれ以上の複合体、またはＴ１（若しくはＴ２）およびＳＰ−１０様配列が特定のＨＩＶ単離物中に存在する配列に対応している２種類若しくはそれ以上のＴ１−若しくはＴ２−ＳＰ−１０様ペプチド複合体を含む。ヘルパーＴ細胞によって認識されるｇｐ１２０分子の部分を反映した合成ペプチドを担体分子として用いる利点は、破傷風トキソイドなどの他の担体分子を必要としないであろうし且つＨＩＶに対するＢおよびＴ細胞応答が特異的であろうということである。種々の単離物のＳＰ−１０部分からの配列を反映したいくつかのペプチド、およびおそらくはｇｐ１２０エンベロープのＴ細胞認識部分を多価ワクチン中に組合わせることは、単離物特異的中和の問題を克服する。本発明は、更に、上記の超可変配列に対して結合したＳＰ−１０様ペプチド（例えば、表ＩＩを参照されたい）を含む多価ワクチンに関する。適当な担体分子に結合したおよび／またはジスルフィド結合生成によって重合したこのようなポリペプチドの混合物（ハリントン（Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ），Ｃ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０：１５９８，１９３０年；ハリントン，Ｃ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３８：４１７，１９４４年；ウェーガン（Ｗｅｙｇａｎｄ）ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１７６：８０７，１９６２年）は、ワクチンとして用いてＨＩＶの多数の単離物に対して防御抗体反応を引き起こすことができる。ＳＰ−１０様ペプチドは、固相ラジオイムノアッセイ（パルカーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１３６：２３９３，１９８６年；同書中、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：２４７９，１９８７年）において用いて、（ｉ）ＨＩＶの中和抗体の存在および力価を検出し；そして（ｉｉ）患者が感染しているＨＩＶ株を決定することができる。したがって、ＳＰ−１０様ペプチドをワクチンまたはワクチンの成分として用いることに加えて、上記のように、ペプチドを診断目的に用いることができる。本発明のペプチドはまた、標準的な酵素結合イムノソルベント検定法で用いて、ＨＩＶ抗体の存在を検出することができる。前述の具体的な態様を要約し且つ補足すると、本発明は、少なくとも一部分は、ＨＩＶ蛋白質の少なくとも二つの部分、すなわち、Ｂ細胞（パルカーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３６１２，１９８９年）およびヘルパーＴ細胞（カーサ（Ｃａａｓａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：４２４９，１９８７年）の両方によって認識されると報告されたＴ１ｇｐ１２０ｅｎｖ部分と、ヘルパーＴ細胞によってもＢ細胞によっても認識され且つヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を中和することができる抗体を誘導するＳＰ −１０様ｇｐ１２０ｅｎｖ部分（すぐ上で引用されたパルカーらの参考文献；パルカーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：１９３２，１９８８年；そして更に、ラシュ（Ｒｕｓｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：３１９８〜３２０２，１９８８年およびゴーズミット（Ｇｏｕｄｓｍｉｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：４４７８，１９８８年を参照されたい）（表ＩＩＩおよびＩＶを参照されたい）とを含む合成ペプチドに関する。マイアーズら、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ，１９８８年，ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリー（ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ），ロス・アラモス，ニューメキシコ，１１６８〜９２頁からの配列。ラトナーら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７，１９８５年からの配列。Ｔ１−ＳＰ１０様ペプチドによって生産された中和抗体は、ＨＩＶＨＴＬＶＩＩＩＢ（ＩＩＩＢ）単離物に対して生じた抗体がＨＩＶＨＴＬＶＩＩＩＭＮ（ＭＮ）またはＨＴＬＶＩＩＩＲＦ（ＲＦ）ＨＩＶ単離物を中和しないという点で種特異的である（パルカーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３６１２，１９８９年）。同様に、ＭＮまたはＲＦＨＩＶ単離物からの配列を含むＴ１−ＳＰ１０様ペプチドに対して生じた中和抗体は、相同の単離物を中和するが、他の２種類のＨＩＶ単離物のいずれも中和しない。しかしながら、ヤギ抗Ｔ１−ＳＰ１０様抗血清をノース・カロライナでの９種類のＨＩＶ現場単離物に対して試験した場合、抗Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ血清は、９種類のＨＩＶ単離物の内１種類を中和することが観察され、抗Ｔ１−ＳＰ１０ＲＦ血清は９種類のＨＩＶ単離物の内３種類を中和し、そして抗Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ血清は９種類のＨＩＶ単離物の内６種類を中和した（ヘインズら、ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｒｅｔｒｏｌ．６：３８，１９９０年）（表Ｖを参照されたい）。ラ・ロサら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２，１９９０年）は、ヘインズらによってＡＩＤＳＲｅｓ．Ｒｅｔｒｏｌ．（上記）に記載されたＨＩＶＭＮモチーフが、米国じゅうのＡＩＤＳ患者から培養されたＨＩＶ単離物の顕著なモチーフの一つであることを示した。パルカーら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３６１２，１９８９年）は、種々の単離物からのペプチドを混合する計画が、ＨＩＶエンベロープの３０３〜３３７部分に異なるアミノ酸配列を有する多数のＨＩＶ株に対して抗体を生じる問題への成功したアプローチでありうるということを最初に報告した。更に、パルカーらは、Ｔ１−ＳＰ１０様ペプチドが、ＫＬＨまたは破傷風トキソイドなどの担体分子に結合した合成ペプチドより有利であることを報告した。担体に結合したペプチドは、単にペプチドの多価混合物中の担体に対する多量の抗体を生じるだけであるが、ＨＩＶＩＩＩＢｅｎｖのＴ１配列（アミノ酸４２９〜４４３）をＳＰ１０配列（アミノ酸３０３〜３２１）に対してＮ末端に共有結合した場合、この無担体免疫原は、Ｔ１−ＳＰ１０ペプチド中に配列が存在する３種類のＨＩＶ単離物全部に対して高力価の中和抗体を生じた。更に、ハート（Ｈａｒｔ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０年）は、最近になって、Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドが、アカゲザルの免疫細胞に対して無毒性であり且つこれらの霊長類においてインビボで高力価の中和抗体およびヘルパーＴ細胞を生じることができることを示した。したがって、Ｔ１−ＳＰ１０様合成ペプチド構築物は、ヤギおよび霊長類において高力価の抗ＨＩＶ中和抗体反応およびＴヘルパー細胞応答を引き起こすための簡単な、無毒性の且つ極めて有効な分子である。ＡＩＤＳ用のワクチンを開発する場合の主要な問題の一つは、抗体反応だけが無細胞ＨＩＶおよびＨＩＶ感染細胞両方に対して個体を防御することができるのかどうか、または細胞性免疫応答（抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞）も同様に必要とされるのかどうかという疑問であった。明らかに、多数の他のウイルス感染は、防御免疫を生じるために抗体も細胞性抗ウイルス免疫応答も必要とする（ロング（Ｌｏｎｇ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１０：４５，１９８９年）。更に、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体反応並びに粘膜表面に関係した細胞障害性Ｔ細胞活性から成る粘膜表面の局所免疫は、性的接触によるまたは粘膜表面が感染血液にさらされることによるＨＩＶの伝播に対して防御するのに必要とされうる。したがって、中和抗体およびＴヘルパー細胞応答を引き起こすことに加えてＨＩＶに対する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を引き起こした合成ペプチド免疫原は望ましいと考えられる。上記に開示され且つ要約された実施態様に加えて、本発明はこのような免疫原に関する。Ｆ部分（例えば、ＢＨ１０／ＩＩＩＢＨＩＶ単離物のアミノ酸５１９〜５３０並びに他のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）単離物の相同部分）は、パラミクソウイルスのＦ１（融合）ペプチドに対して配列相同性を有する（ガラハ（Ｇａｌｌａｈｅｒ）、Ｃｅｌｌ５０：３２７，１９８７年）。Ｆ部分は、細胞膜の脂質二重層中に挿入することができるし且つ細胞融合を引き起こすことができる疎水性らせん構造を生成すると仮定された。ボッシュ（Ｂｏｓｃｈ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：６９４，１９８９年）は、ＳＩＶ中のＦ部分（すなわち、ＢＨ１０／ＩＩＩＢＨＩＶ単離物の５１９〜５３０ｅｎｖｇｐ４１部分に対して相同な部分）が、ＳＩＶに感染した細胞の細胞融合を実際に媒介することを実証した。Ｆ誘導体ペプチドは、多数のウイルス感染の制御に必要な同様の種類の細胞障害性Ｔ細胞応答、すなわち、ＨＬＡ拘束性ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の生成を引き起こすような方法で免疫細胞中に取り込まれることが確認された。Ｆ誘導体ペプチドは、哺乳動物に注射された場合、それらが抗ＨＩＶ記憶Ｔヘルパー細胞活性、抗ＨＩＶ中和抗体、および記憶抗ＨＩＶＣＤ８＋、ＨＬＡクラスＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こすように免疫系の細胞と相互作用する。したがって、本発明は、好ましい実施態様において、一般式Ｆ−Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）Ｔｈ−ＳＰ１０およびＦ（Ｘ）［式中、配列Ｆは、ＨＩＶｅｎｖｇｐ４１の推定上の融合誘導ドメイン（例えば、ＨＩＶ単離物ＢＨ１０／ＩＩＩＢ中のアミノ酸５１９〜５３０または他のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２若しくはＳＩＶ単離物中の相同部分、或いはそれらと機能的に同等の配列）に由来し；配列Ｔｈは、Ｔ１またはＴ２Ｔヘルパーエピトープであるか、或いは、表Ｘ（下記）に挙げられたＴヘルパー細胞エピトープのいずれかまたは挙げられていないがＴヘルパーエピトープとして機能するＨＩＶ蛋白質の他の部分からのアミノ酸配列であり；ＳＰ１０様配列は、表ＩまたはＩＩ（下記の表ＶＩＩＩも参照されたい）によるまたはＨＩＶ現場単離物からの任意のＳＰ−１０様配列（例えば、ラ・ロサら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２，１９９０年を参照されたい）により；そして配列（Ｘ）は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるＨＩＶ蛋白質配列である］を有するペプチドに関する。（Ｘ）部分の配列の例は、下記の表ＶＩＩＩおよびＩＸに記載されている。或いは、配列Ｆは、例えば、配列Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）に対してＣ末端でありうる。更に、配列Ｔｈ、ＳＰ１０および（Ｘ）は、ペプチド構築物中においていすれの順序でも配列されうる。本発明のこの実施態様の合成ペプチド免疫原は、抗ＨＩＶ中和抗体、抗ＨＩＶヘルパーＴ細胞および抗ＨＩＶ細胞障害性（キラー）Ｔ細胞を生じることができる。当業者は、この（融合蛋白質である）免疫原を化学的にかまたは当該技術分野において知られている組換え手段によって合成することができることを理解するであろう。免疫原は、例えば、構造：Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０−（Ａ）を有することができる。このような免疫原の例は表ＩＩＩおよびＩＶで与えられるが、当業者は、現場または実験室ＨＩＶ単離物からの任意のＳＰ１０様配列（例えば、ラ・ロサら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２，１９９０年）を表ＩＩＩおよびＩＶで示されたＳＰ１０配列に置き換えうることを理解するであろう（表ＩおよびＩＩＩも参照されたい）。Ｔ１様配列は、表ＶＩで示されたものを含めた任意の配列決定されたＨＩＶ単離物からのＴ１に相同な配列から選択することができる。ＢＨ１０の配列は、ラトナー，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７〜２８４，１９８５年からのアミノ酸４２８〜４４３である。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ− ２単離物の残りの配列は、マイアーズら、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ，１９８８年，ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリー，ロス・アラモス，ニューメキシコ，ＩＩ−８９頁による。：＝アミノ酸なし。Ｆ様配列は、表ＶＩＩで示されたものを含めた任意の配列決定されたＨＩＶ単離物からのＦに相同な配列から選択することができる。ＢＨ１０の配列は、ラトナー，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７７〜２８４，１９８５年からのアミノ酸５１９〜５３０である。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ− ２単離物の残りの配列は、マイアーズら、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ，１９８８年，ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリー，ロス・アラモス，ニューメキシコ，ＩＩ−９０頁による。配列ＷＭＪ１は、ブラスー（Ｂｒａｓｓｅｕｒ）ら、ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．４：８３〜９０，１９８８年による。：＝アミノ酸なし。（Ａ）部分様配列は、表ＩＩおよびＶＩＩＩで示されたものを含めた任意のＨＩＶ単離物からの（Ａ）に相同な配列から選択することができる。ＢＨ１０の配列（ＩＩＩＢ）は、ラトナーら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：２７０〜２８４，１９８５年による。本発明は、更に、得られた構築物がＨＩＶに対して中和抗体および細胞障害性Ｔ細胞を生じることができるような、現場単離物からの任意のＨＩＶ配列（例えば、表ＩＩを参照されたい）からのＳＰ１０またはＳＰ１０様部分に対してＮ末端に位置した（共有結合した）ＨＩＶｇｐ４１からのＦ部分配列（すなわち、例えば、ＢＨ１０／ＩＩＩＢ単離物のアミノ酸５１９〜５３０または他のＨＩＶ −１、ＨＩＶ−２若しくはＳＩＶ単離物中の他の相同部分）を含むペプチドに関する。当業者は、本開示を読むことにより、一例として、長さが例えば３〜５０アミノ酸である任意の他のペプチドに対して共有結合した、１２アミノ酸：ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ（Ｆ）から成るＨＩＶｇｐ４１の５１９〜５３０アミノ酸部分または単離物ＢＨ１０／ＩＩＩＢの５１９〜５３０アミノ酸配列（表ＶＩＩ）に対して相同な他のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２若しくはＳＩＶ単離物のＦ部分配列（例えば、表ＶＩＩを参照されたい）をインビボ投与することによって、Ｆに対して共有結合している合成ペプチドのプロセッシングおよび提示が行われるような方法でＦ結合ペプチドが抗原提示細胞と連結した結果としてペプチドがＭＨＣクラスＩ分子の状況においてＴ細胞に対して提示され且つインビボでＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を生じるように、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞を誘導しうるということを理解するであろう。有効なＡＩＤＳワクチンの状況において、いくつかのＦ誘導体ハイブリッドＨＩＶペプチドは、インビボで細胞障害性Ｔ細胞を誘導しうるＨＩＶ蛋白質のアミノ酸配列に対してＮまたはＣ末端に結合したＦアミノ酸配列（例えば、表ＶＩＩを参照されたい）を含むように構築されうる。ＨＬＡクラスＩ細胞障害性Ｔ細胞によって認識されうる記載のＨＩＶペプチドの例を表ＩＸに示す。この後者の計画は、細胞障害性Ｔ細胞エピトープが特定の多形性ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子によって認識されるという点で重要である。ワクチン中にこのような［（Ａ）ペプチドのように、ペプチドの１本の直鎖状配列によって示される］エピトープが１種類だけ存在する場合、細胞障害性Ｔ細胞に対して提示されるように（Ａ）ペプチドが用いろ特定のＨＬＡ抗原を有する個体だけがＨＩＶに対して細胞障害性Ｔ細胞を生じるであろう。しかしながら、異なるＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子の状況において細胞障害性Ｔ細胞によって認識されうるペプチドをそれぞれが含んでいる多数のＦ誘導体ペプチドが免疫原中に含まれている場合、広範囲のＨＬＡ種を有する個体は、ＨＩＶに対して細胞障害性Ｔ細胞を生じるであろう。したがって、集団の中の大多数のヒトにおいて抗ＨＩＶ細胞障害性Ｔ細胞を生じることができる免疫原は、好都合に、異なるＨＬＡクラスＩ型（例えば）によってそれぞれ認識されるペプチドの混合物を含み、同時に、該混合物は、免疫原性であり且つ総合すれば、ある与えられた集団の中の大多数の個体によって発現されるクラスＩ型の分子によって認識されるペプチドを含む。表ＩＸは、Ｆ配列によって誘導体化することができ且つＦ−Ｔ１−ＳＰ１０（Ａ）ペプチドとの混合物として用いることができるペプチドの種類である記載された細胞障害性Ｔ細胞エピトープおよび知られている場合はそれらのＨＬＡ拘束性要素の例を示す。或いは、表ＩＸの配列は、配列（Ａ）の代わりにＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ペプチド中のＳＰ１０配列に対してＣ末端に共有結合し、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０（Ｘ）ペプチドの混合物（式Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０（Ｘ）中において、Ｘは配列（Ａ）（表ＩＩおよびＶＩＩＩを参照されたい）かまたは表ＩＸに挙げられているような他の細胞障害性Ｔ細胞誘導配列である）をＡＩＤＳワクチンとして用いることができる。細胞障害性エピトープに対して適合するＭＨＣ拘束性の同様の考察は、Ｔヘルパーエピトープに対しても適合する。すなわち、Ｔヘルパー細胞による抗原の認識はＨＬＡ拘束性であり、そして集団の大多数のメンバーが免疫原に対して応答し且つ免疫原に対するＴヘルパー細胞応答を生じるためには、Ｔヘルパーエピトープの利用可能な十分な変異型を有して、その中にそれぞれの患者のＴ細胞が患者自身のＨＬＡクラスＩＩ分子の状況においてプロセッシングされた抗原を見つけることができるように十分なＴヘルパー細胞エピトープが提示される必要がある。表Ｘは、Ｆ−Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）構築物中のＴ１またはＴ２配列に代わって該構築物中に代わりのＴヘルパー細胞エピトープを提供することができるＨＩＶ蛋白質のＴヘルパー細胞エピトープを示す。上記の初めの２０種類のペプチドの配列は、シュリアー（Ｓｃｈｒｉｅｒ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１１６６〜１１７６，１９８９年）により、配列Ｔ１、Ｔ２、Ｔｈ４およびｐ１８は、クレリシ（Ｃｌｅｒｉｃｉ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３３９：３８３〜３８５，１９８９年）による。研究は、同一のＴヘルパー細胞エピトープが多数のＨＬＡクラスＩＩ特異性の状況においてＴ細胞によって認識されることができ、したがって、有効な合成ペプチド系ＡＩＤＳワクチンを処方するためにはいくつかのＴヘルパーエピトーブだけが必要とされることを示している。クレリシら（Ｎａｔｕｒｅ３３９：３８３〜３８５，１９８９年）は、研究された集団の８５％のＴ細胞がＴ２かまたはＴ１Ｔヘルパー細胞エピトープを認識できたというデータを提供した（表Ｘを参照されたい）。シュリアーら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１１６６〜１１７６，１９８９年）は、ＨＩＶ蛋白質中の多数のヘルパーＴ細胞エピトープを同定し、そして研究された集団の９３％のＴ細胞が４種類のＴヘルパー細胞エピトープ（表Ｘを参照されたい）の内の少なくとも一つに対して応答したことを実証した。したがって、好ましい実施態様において、本発明のＡＩＤＳワクチンは、式Ｆ−Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）Ｔｈ−ＳＰ１０およびＦ（Ｘ）［式中、上記のように、配列Ｆは、ＨＩＶｅｎｖｇｐ４１の推定上の融合誘導ドメイン（例えば、ＨＩＶ単離物ＢＨ１０／ＩＩＩＢ中のアミノ酸５１９〜５３０または他のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２若しくはＳＩＶ単離物中の相同部分、或いはそれらと機能的に同等の配列）に由来し（例えば、表ＶＩＩを参照されたい）；配列Ｔｈは、Ｔ１またはＴ２Ｔヘルパーエピトープであるか、或いは、表Ｘに挙げられたＴヘルパー細胞エピトープのいずれかまたは挙げられていないがＴヘルパーエピトープとして機能するＨＩＶ蛋白質の他の部分からのアミノ酸配列であり；ＳＰ１０様配列は、表Ｉ、ＩＩ若しくはＶＩＩＩによるかまたはＨＩＶ現場単離物からの任意のＳＰ−１０様配列（例えば、ラ・ロサ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２，１９９０年を参照されたい）に由来し；そして配列（Ｘ）は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるＨＩＶ蛋白質配列である］を有する一般的な構造およびペプチドの混合物の組成物を有する。（Ｘ）部分の配列の例は表ＶＩＩＩおよびＩＸに与えられる。Ｆ−Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）、Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）、Ｔｈ−ＳＰ１０およびＦ（Ｘ）ペプチド中に含まれるべき正確な配列並びに本発明のＡＩＤＳワクチンを含む別個のペプチドの数は、ある与えられた集団の大多数の被験者において細胞障害性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞応答を生じるのに必要な細胞障害性Ｔ細胞（Ｘ）およびＴｈエピトープの数によって決定される。当業者は、Ｆ、Ｔｈ、ＳＰ１０および（Ｘ）の順序が、それぞれの上記機能が維持される限りは変更しうろということを理解するであろう。防御的抗ＨＩＶ中和抗体の誘導に対して、Ｆ− Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）ペプチド中に存在する必要がある具体的なＳＰ１０様配列は、ある与えられた集団における一定の時点のＨＩＶ単離物の変異数に依るであろう。当業者は、この情報が集団において積極的に且つ連続的に監視されなければならないこと、およびＡＩＤＳワクチンの処方が上記変数の変化に応じて時とともに変更されることを理解するであろう。多数の異なるＨＩＶ単離物を含む集団における防御的抗ＨＩＶ中和抗体の誘導は、上記のワクチン計画を用いておよび／またはｇｐ１２０の保存立体配座決定基を模擬することによって広く交差反応性の抗ＨＩＶ抗体を生じることができる少なくとも１種類のペプチド構築物を用いることによって行うことができる。一つのこのような構築物は、自然のままのＨＩＶｇｐ１２０Ｃ４−Ｖ３部分の立体配座決定基のミメオトープの形をとり、Ｔ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）によって例示される（表ＸＸＩＩＩを参照されたい）。ＣＡＮＯエンベロープの一次Ｖ３配列は他のＨＩＶエンベロープＶ３配列（再度表ＸＸＩＩＩを参照されたい）と広範囲にわたって異なるが、Ｔ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドは、様々なＨＩＶＶ３モチーフに対して交差反応性抗Ｖ３抗体を生じる（実施例１１を参照されたい）。この交差反応性の誘導は、ＨＩＶｇｐ１２０の広い中和決定基を反映したＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）Ｃ４−Ｖ３ハイブリッドを生じるＨＩＶＣＡＮＯ単離物のＶ３ループの二次および高次構造に依る。これは、ヒト抗ｇｐ１２０単クローン性抗体４８ｄ（ｇｐ１２０に対するＣＤ４結合を妨げるマウス単クローン性抗体を阻止するが、それ自体ｇｐ１２０−ＣＤ４結合を阻止しない（タリ（Ｔｈａｌｉ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８〜３９８８（１９９３））がＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）を結合するという事実によって実証される。別の実施態様（計画）として、有効なワクチンは、特定の個体のためのＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ型を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応分析によってかまたは慣用的なＨＬＡ組織型決定分析によって決定することにより配合することができる。その情報に基いて、式Ｆ−Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）、Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）、Ｔｈ−ＳＰ１０およびＦ（Ｘ）中に含まれるべき具体的な免疫原を決定することができる。したがって、この後者の実施態様において、被験者に与えられるペプチドは、所望の抗ＨＩＶＢおよびＴ細胞応答を引き起こすのに必要なものである。前述の解釈により、当業者は、これが何等かの感染症に対するワクチンの開発のための一般的な計画であることを理解するであろう。更に、ＨＩＶｇ４１エンベロープ蛋白質からのＦ部分を細胞障害性Ｔ細胞によって認識されうる任意の配列に結合する（それによって、注射に適した且つＭＨＣクラスＩ分子の状況において細胞障害性Ｔ細胞によって認識されうる直鎖状ペプチドを生成する）能力は、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞を細胞障害性Ｔ細胞エピトープを含有する任意のペプチドに対して誘導する簡単で且つ有効な方法を提供する。これは、細胞障害性Ｔ細胞エピトープの配列が侵入した生物中の蛋白質に由来するのかどうか、または細胞障害性Ｔ細胞エピトープ配列が宿主蛋白質に由来するのかどうかにかかわらず当てはまる。宿主蛋白質からの配列を含むＦ誘導体ペプチドの使用の例として、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの状況において細胞障害性Ｔ細胞によって認識されうるペプチドのＮ−かまたはＣ末端に結合したＨＩＶｇｐ４１Ｆ配列（例えば、ＢＨ１０／ＩＩＩＢＨＩＶ−１単離物からまたは他のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２若しくはＳＩＶ単離物の相同部分からのアミノ酸５１９〜５３０、或いはそれと機能的に同等の配列）を含むＦ誘導体ペプチドを用いることができると考えられるが、このようなペプチドの配列は、種々の自己免疫疾患、感染症においておよび臓器移植の状態において宿主組織破壊を媒介する自己反応性Ｔ細胞の表面上で発現される抗原分子のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変領域に由来する。サン（Ｓｕｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３３２：８４３，１９８８年；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１９９３，１９８８年）は、起脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃ）Ｔ細胞上のイディオタイプ決定基に特異的である細胞障害性Ｔ細胞クローンの単離を報告したが、それらは実験的自己免疫脳脊髄炎に対する抵抗性を選択的に伝達する。Ｔ細胞の自己免疫クローンに対して免疫応答を引き起こすと考えられる免疫原による自己免疫疾患を有する被験者の免疫感作の概念は、最近、重要な実験的アプローチとして認識されてきている（コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ３３２，１９８８年；ハウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：６６８，１９８９年；ラルス（Ｗｒａｌｔｈ）ら、Ｃｅｌｌ５７：７０９，１９８９年において論評された）。したがって、本発明は、宿主抗原のペプチドに対してＭＨＣ拘束性クラスＩまたはクラスＩＩ細胞障害性Ｔ細胞を生じるための簡単で且つ有効な方法を提供し、それによって自己免疫疾患に対するワクチンの開発を大きく進歩させる。標準的な組換えＤＮＡ技術並びにＴＣＲ分子抗原結合部分に対する既存のプローブおよび配列を用いて、ＴＣＲ分子の独特の部分からの配列を得ることができる（バーンズ（Ｂａｒｎｓ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：２７，１９８９年）。Ｆ誘導体ペプチドは、上記疾患種類における抗原特異的Ｔ細胞に媒介された宿主組織損傷に関与するＴＣＲを有するＴ細胞の特定のクローンを標的とした細胞障害性Ｔ細胞免疫応答を引き起こすのに用いることができる。いったん引き起こされると、このようなＦ−ペプチドに誘導された抗ＴＣＲ標的化細胞障害性Ｔ細胞応答は自己反応性クローンまたはＴ細胞を排除し、それによって、Ｔ細胞に媒介された組織破壊を制御するための新規の極めて特異的な方法を提供することができる。Ｆ誘導体宿主ペプチドの使用の第二の例は、自己免疫疾患、感染症の状況においておよび臓器移植の状態において起こる抗体に媒介された組織損傷を同様に制御することである。抗原に対するＢ細胞表面受容体（表面免疫グロブリン）もまた、抗体を産生するＢ細胞のクローンに特異的な部分を有する。上記疾患種類の状態において組織特異的損傷に関与する抗体を産生するＢ細胞のクローンを同定することにより、抗原を結合するＢ細胞免疫グロブリン分子の部分からのペプチド配列を、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて同定することができる。更に、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる配列を同定することができる。このような免疫グロブリン抗原結合部分ペプチドをＦ配列で誘導体化し、且つ自己抗体を生産する被験者にそのＦ誘導体化ペプチドを注射することにより、自己抗体生産性Ｂ細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こすことができ、それによって、上記疾患種類の状況において起こる組織損傷性自己抗体反応を排除することができる。Ｆ誘導体化非ＨＩＶ蛋白質の使用の第三の例は、クローン性免疫グロブリンまたはＴＣＲ分子が細胞表面上で発現されるクローン性ＢおよびＴ細胞悪性疾患の治療に対して自己反応性ＴおよびＢ細胞種を特異的に排除するために上記の理論を使用することである。Ｂ細胞表面免疫グロブリン分子の可変領域に対する抗体（ハンブリン（Ｈａｍｂｌｉｎ）ら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４２：４９５，１９８０年；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０６：５１７，１９８２年）かまたはＴ細胞腫瘍を治療する場合には可変ＴＣＲ領域に対する抗体（カナガワ（Ｋａｎａｇａｗａ），Ｏ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：１５１３〜１５１９，１９８９年）を用いる抗腫瘍治療計画が記載されている。したがって、ＴまたはＢ細胞悪性細胞の表面上でそれぞれ発現されるＴＣＲまたは免疫グロブリン分子の可変領域の配列を含むＦ誘導体化合成ペプチドを腫瘍を有する宿主に注射して、腫瘍細胞を死滅させる抗ＴＣＲまたは抗免疫グロブリン特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる。Ｆ誘導体化非ＨＩＶ蛋白質の使用の第四の例は、病原体に感染した細胞を死滅させ、そして病原体に感染した細胞を宿主から排除する免疫原の生成である。例えば、Ｃ型肝炎（非Ａ非Ｂ型肝炎）は、細胞中または血清中のウイルス粒子が個体から個体へと伝播することによって引き起こされる疾患である。Ｃ型肝炎ウイルス蛋白質の細胞障害性Ｔ細胞エピトープ配列をＦ誘導体化し且つこのような配列を個体に注射することにより、生Ｃ型肝炎ウイルスによる感染から個体を防御する記憶抗Ｃ型肝炎特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる。すなわち、新規のＣ型肝炎ワクチンを与えることができる。このような計画はまた、他の伝染性病原体に対するワクチンを生成するのに用いることができる。以下の非制限実施例は、本発明を更に詳細に例証する。実施例１ペプチドの合成およびコンジュゲートの調製ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０由来の親水性アミノ酸配列（Ｒａｔｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：２７７，１９８５）を含む本質的に純粋な合成ペプチドを、アプライド・バイオシステムズ４３０Ａペプチド合成装置により、製造業者が提供する化学物質およびプログラムサイクルを用いて合成した。合成ペプチドの配列を表ＸＩに挙げる。合成ペプチドと既知の組換え蛋白質ＰＥ３、ＰＢＩおよびＰＥＮＶ９の関係を図１に示す（Ｐｕｔｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３９２，１９８６；Ｐｅｔｔｅｗａｙら，ＶｉｒｕｓｅｓａｎｄＨｕｍａｎＣａｎｃｅｒ：ＵＣＬＡＳｙｍｐｏｓｉａｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１９８７）。ペプチドをキャリヤー分子、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド（ＴＴ）およびＭＢＳにより、Ｇｒｅｅｎら（Ｃｅｌｌ，２８：４７７，１９８２；Ｐａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：２４７９，１９８７）の記載に従って結合させた。結合処理のために、０．５ｍｌのリン酸塩緩衝食塩液（ｐＨ７．２）中における２４ｍｇの破傷風トキソイド（一例）を、１００μｌのジメチルホルムアミドに溶解した１ｍｇのＭＢＳと共に２３℃で１時間インキュベートした。ＭＢＳ処理した破傷風トキソイド（ＴＴ−ＭＢＳ）を、次いでＰＤ−１０（ファルマシア）カラム上でふるい分けクロマトグラフィー処理して未反応ＭＢＳをＴＴ−ＭＢＳから分離し、２８０ｎｍの光学濃度で分光光度法により測定してカラムの空隙内にＴＴ−ＭＢＳを回収した。次いで、ＴＴ−ＭＢＳをカルボキシル末端またはアミノ末端に還元システインを含む６−９ｍｇの合成ペプチド（ペプチドとキャリヤー蛋白質のモル比３０：１）と共に、ＰＢＳ中で揺動しながら２３℃で３時間インキュベートした。ＴＴ−ペプチドコンジュゲートを４℃で一夜、ＰＢＳに対して透析し、または再びＰＤ−１０カラム上で脱塩し、免疫原として用いた。ＢＳＡまたは破傷風トキソイドへのペプチドの結合は、コンジュゲートを非還元性条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）処理し、ＭＢＳ処理ＢＳＡおよびＴＴの場合より見掛け分子量が増大するのを測定することにより監視された。ペプチドの追跡ヨウ素化により同様に監視した結合効率は、ペプチドに応じて１０％から３０％まで変動した。実施例２合成ペプチドに対するエイズ患者抗体の反応性ＢＳＡに結合したｇｐ１２０の親水性領域由来の合成ペプチドを、ＨＩＶ＋患者血清（Ｎ＝１２）および正常血清対照（Ｎ＝４）についてのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）における抗原として用いて、ｇｐ１２０上のエピトープに対するエイズ患者抗体の応答を評価した（図２）（Ｐａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２３９３，１９８６；同，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：２４７９，１９８７）。大部分のＨＩＶ＋患者血清が２種類の合成ペプチド、ＳＰ−１０（９／１２，７５％）およびＳＰ−２２（８／１２，６７％）と反応した。結果は、被験（Ｅ）エイズ血清および対照（Ｃ）血清試料について得た二重試験のｃｐｍ値の比率（Ｅ／Ｃ）として表わされる。Ｅ／Ｃ＞３．０＝陽性。実施例３合成ペプチドアフィニティカラム上で精製したＨＩＶ＋患者由来の抗体に対するｇｐ１２０の反応性アフィニティカラムを調製するために、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B ｇｐ１２０由来のアミノ酸配列を含む合成ペプチド（ＳＰ−１０、１０Ａ、１１、１４、１５、２２、図１参照）をＢＳＡに結合させ、次いでＣＮＢｒ活性化セファロースに共有結合させた。次いでＨＩＶ血清学的陽性患者に由来する血清のアリコート（２ｍｌ）を各カラムに導通し、次いでアフィニティカラムに結合した抗体を、精製した¹²⁹Ｉ-標識ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B ｇｐ１２０に対する反応性につきＲＩＰアッセイ法により（図３Ａ）、またＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bに感染したＨ−９細胞の表面に対する反応性につき間接免疫蛍光アッセイ法により（図３Ｂ）試験した。Ａ）ＲＩＰアッセイ（Ｐａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：２４７９，１９８７；同，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２３９３，１９８６）の場合、ＳＰ−１０（列１）、ＳＰ−１０Ａ（列２）、ＳＰ−１１（列３）、およびＳＰ−２２（列６）アフィニティカラムからの結合抗体がＲＩＰアッセイにおいてｇｐ１２０−ＩＩＩ_Bと反応し、その際ＳＰ−１０カラムからの抗体がｇｐ１２０−ＩＩＩ_Bに対して最大の反応性を示した。Ｂ）ＦＡＣＳ分析（Ｓｈａｐｉｒｏ，ＰｒａｃｔｉｃｅｄＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ出版社、ニューヨーク州ニューヨーク，１９８５）で試験した場合、合成ペプチドＳＰ−１０と反応性である抗体はＨＩＶ感染細胞表面に結合したが、ＳＰ−１４、またはＳＰ−１０Ａ、１１、１５もしくは２２へのアフィニティ精製抗体の結合は検出されなかった（図示せず）。これらのデータは、ＳＰ−１０が決定する抗原性部位（１または２以上）はｇｐ１２０がＨＩＶ＋細胞の表面に存在する場合に抗体の結合が可能であることを示唆する。実施例４ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清によるＨＩＶの中和ヤギを、２８ｍｇの破傷風トキソイド−ＳＰ−１０コンジュゲート（ＳＰ−１０−ＴＴ）を完全フロイントアジュバント中において皮下投与し（０日目）、次いで２週目毎に不完全フロイントアジュバント中において接種する（１４および２８日目）ことにより免疫化した。２回目の免疫化後に血清を採取し、細胞培養上清中の逆転写酵素（ＲＴ）の存在により測定したインビトロでのＨ−９Ｔ細胞のＨＩＶ感染阻止（すなわち中和）能につき試験した（図４）。ＲＴアッセイにおいて得られるｃｐｍ値の低下は、ウイルスと細胞を１０日間同時培養したのちＨＩＶ水準が低下したことを反映する。１００感染単位のＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bと共にプレインキュベートした場合、ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清はＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_BがＨ−９Ｔ細胞に感染する能力を中和した（●−●、５０％中和力価＝１／１４５）。これに対し、同じヤギから免疫化前に採取した血清は評価しうるほどにはＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B を中和しなかった（○−○、５０％中和力価＝１／１６）。ＳＰ−１０−ＴＴを注射した元の動物（その血清は逆転写酵素アッセイにおいてＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bを中和した）に、次いで追加量のＳＰ−１０−ＴＴを注射した（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）。２回の注射後に、５０％中和力価は１：１６００に上昇した。ＳＰ−１０様ペプチドを用いたこれらおよび他の実験で得た中和データを、表ＸＩＩにＨＩＶの５０％中和ではなく８０％中和を生じる血清希釈度として示す。さらに、２匹目のヤギに０．５ｍｇ／ｋｇ量のＳＰ−１０−ＴＴを２回注射した。２匹目のヤギから得た血清は、１：１００の力価でＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bを中和した。重要なことは、ヤギにおいてＳＰ−１０−ＴＴに対して産生された血清は両方とも、シンシチウム阻害アッセイにおいてもＴ細胞のＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B 感染性を阻害したということである（表ＸＩＩ）。シンシチウム阻害アッセイ（Ｌｉｆｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３２３：７２５，１９８６）は、細胞表面にＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ蛋白質を発現しているＨＩＶ感染Ｔ細胞とＣＤ４（Ｔ４）＋非感染Ｔ細胞との融合を抗体が阻害する能力を測定するものである。ＣＤ４（Ｔ４）分子はエイズウイルスに対する受容体として作用する（Ｍａｄｄｏｎら，Ｃｅｌｌ４７：３３３，１９８６）。これら２細胞タイプの融合の結果、ＨＩＶに感染した巨細胞が形成される。多くの場合、細胞のＨＩＶ感染および巨細胞形成の結果、感染細胞は死滅する（Ｚａｇａｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３１：８５０，１９８６）。したがって、上記のようにヤギの抗ＳＰ−１０血清がシンシチウム阻害アッセイおよび逆転写酵素アッセイにおいてＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B感染性を阻害しうることは、抗ＳＰ−１０抗体はＴ細胞ＣＤ４（Ｔ４）分子へのＨＩＶｇｐ１２０蛋白質の結合を遮断しうることを意味する。さらに、ＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RF由来のＳＰ−１０様配列を含むペプチド［ＳＰ−１０ＲＦ（Ａ）］に対して産生されたヤギ抗血清はＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RFによるシンシチウム形成を阻害したが、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bによろシンシチウム形成は阻害しなかった。これはＳＰ −１０ＲＦ（Ａ）に含まれるタイプ特異性抗原は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RF ｇｐ１２０とＴ細胞ＣＤ４（Ｔ４）分子の相互作用を阻害する抗体を産生するワクチン成分として適切であることを示す。実施例５ＨＩＶｇｐ１２０−ＣＤ４（Ｔ４）相互作用を阻害しうる抗体の誘導下記の点を判定するために一連の研究を行った：１）ウシアルブミンまたは破傷風トキソイドに結合したＳＰ−１０ペプチドがインビトロで抗原特異性、ＣＤ４（Ｔ４）依存性のＴ細胞応答に対して何らかの阻害作用を及ぼすか否か；および２）抗ＳＰ−１０抗血清（実施例４に記載）がＨＩＶに感染していないヒト白血球集団に結合するか否か。ＳＰ−１０ペプチドを破傷風トキソイドで刺激した非感染ヒト末梢血リンパ球培養物にインビトロで直接に添加した場合、破傷風トキソイドに対する正常なＴ細胞応答の阻害は見られなかった（表ＸＩＩＩ）。表ＸＩＩＩに見られるように、ＳＰ−１０−ＴＴ単独はＴＴ単独と同様に良好な抗原特異性Ｔ細胞活性化物質であった。さらに、ＳＰ−１０−ＴＴおよびＳＰ −１０−ＢＳＡをＴＴ単独に添加した場合、正常Ｔ細胞によるＴＴ誘導増殖を阻害しなかった。さらに、抗ＳＰ−１０ヤギ血清はフローサイトメトリーによる間接的免疫蛍光アッセイにおいて末梢血リンパ球または単球に結合しなかった。これらのデータは、ＳＰ−１０ペプチドが機能性ＣＤ４（Ｔ４）分子依存性の正常なヒトＴ細胞の機能は混乱させないが、ＨＩＶｇｐ１２０−ＣＤ４（Ｔ４）相互作用を阻害する、かつ逆転写酵素阻害アッセイにおいてＨＩＶを中和する抗体を誘導することを示す。このように、小型の合成ＳＰ−１０様ペプチド（長さ約３５アミノ酸以下）を含むワクチンが、組換えｇｐ１２０またはその大型サブユニットを含むＨＩＶワクチンにまさる利点をもつ。後者は正常な免疫機能を阻害する可能性があるからである。実施例６ＨＩＶの単離体特異性中和合成ペプチドＳＰ−１０は、ＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_BおよびＬＡＶのｇｐ１２０エンベロープ蛋白質に由来し、これにユニークなアミノ酸配列をもち、一方、他のＨＩＶ単離体はそのＳＰ−１０様ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質中に種々の程度の異なるアミノ酸配列をもつ。ＨＩＶのＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B単離体に由来する合成ペプチドＳＰ−１０（すなわちＳＰ−１０−ＩＩＩ_B）を破傷風トキソイドに結合させ、これをＰａｌｋｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：２４７９，１９８７）の記載に従って用いてヤギに抗体を産生させた（コンジュゲート０．５ｍｇ／ｋｇヤギ）。合成ペプチドＳＰ −１０に対して産生されたヤギ抗体を、４種類のＨＩＶ単離体（図５Ａ：ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B、図５Ｂ：ＨＴＬＶ−１ＩＩ_RF、図５Ｃ：ＨＴＬＶ−Ｉ１Ｉ_MN、図５Ｄ：ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_sc）の中和能につき試験した。ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清（●）、免疫前ヤギ血清（○）およびエイズ患者血清（■）（すべて１／１０希釈）をまず各ウイルス単離体の希釈液（１０^-1、１０^-2、１０^-3）と共にインキュベートした。次いでこれらのウイルス単離体を、Ｈ−９Ｔ細胞感染能につき、ウイルスと細胞をインビトロで１０日間同時培養することにより試験した。１０日間の培養後に細胞培養上清中に存在するＨＩＶの水準を、上清のＲＴ活性測定により推定し、結果をＲＴアッセイで得たｃｐｍ値として表す、。ＲＴアッセイにおいてｃｐｍ値の増大は培養におけるＨＩＶ水準の増大を反映する。図５Ａに示すように、ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清はＨ−９細胞のＨＴＬＶ−III_B 感染をウイルス希釈度１０^-2で阻害した（すなわち中和した）。免疫前ヤギ血清は同じウイルス希釈度でＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B感染を阻害しなかった。これに対しヤギ抗ＳＰ−１０抗血清は他のＨＩＶ単離体を中和しなかった（図５Ｂ−Ｄ）。エイズ患者抗体は４種類すべてのＨＩＶ単離体を中和した（図５Ａ−Ｄ）。これらのデータは、合成ペプチドＳＰ−１０に対するヤギ抗血清が、そのｇｐ１２０エンベロープ蛋白質中にＳＰ−１０中に存在するアミノ酸配列を含むＨＴＬＶ− ＩＩＩ_B単離体を中和することを示す。これらのデータは表ＸＩＩのデータと共に、種々のＨＩＶ単離体由来のＳＰ−１０様アミノ酸配列を含むワクチンが広域のＨＩＶ単離体に対して有効であろうということを示す。実施例７ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B感染したＨ９Ｔ細胞には結合するが、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RF感染したＨ−９細胞には結合しないヤギ抗ＳＰ−１０抗血清ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清および前採血（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）した自己対照血清を、非感染Ｈ９Ｔ細胞、ＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bに感染したＨ９Ｔ細胞、またはＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RFに感染したＨ９Ｔ細胞につき、フローサイトフルオロメトリーおよびコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＥＰＩＣＳＶサイトフルオログラフにより比較した（Ｈａｙｎｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．５７：１２７，１９８１；Ｈａｙｎｅｓら，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０４：３１９，１９８１）。ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清（１：２００）は、対照（前採血）ヤギ血清（１：２００）とともにインキュベートしたＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B感染Ｈ９Ｔ細胞と比較して、４０％のＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B感染Ｈ９Ｔ細胞と反応した（図６Ａ）。ヤギ抗ＳＰ−１０抗血清も対照（前採血）血清（１：５０）も、非感染Ｈ９Ｔ細胞とは反応しなかった（図６Ｂ）。対照（前採血）血清も抗ＳＰ−１０抗血清（１：５０）も、ＨＩＶのＨＴＬＶ−ＩＩＩ_RF単離体に感染したＨ９Ｔ細胞とは結合しなかった（図６Ｃ）。実施例８インビボでＴヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＢ細胞による中和応答を誘導する、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープの複数領域を含む合成免疫原の開発中和抗体およびＴヘルパー細胞応答を誘導するほかにＨＩＶに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する合成ペプチド免疫原を開発するために、特定の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含むＨＩＶＭＮ単離体領域を反映する一連のペプチドを調製した（表ＩＩＩ参照）。これらの研究をＭＮＨＩＶ単離体を用いて行ったのは、現在これが米国で最も一般的な基本型ウイルスであると思われるからである（ＬａＲｏｓａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２，１９９０）。Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１１８，１９８９）は、ＭＮＨＩＶ単離体由来のアミノ酸３２２−３２６（ＦＹＴＴＫ）を含み、かつＨＩＶＩＩＩＢ単離体由来のアミノ酸３２３−３２９を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ（表ＩＶ参照）を決定した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：２０２３，１９８９）。たとえば調製された１つのＴ１− ＳＰ１０変異体ペプチドはＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドであり、ここで（Ａ）はアミノ酸３２２−３２６を既存のＭＮＳＰ１０領域のアミノ酸３０３− ３２１に付加したことを意味する（表ＩＩＩ参照）。次いで、抗原提示細胞の細胞膜内へ侵入することができ、したがってＭＨＣクラスＩ分子によりプロセシングおよび発現され、したがってＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される可能性のある合成ペプチドを形成するために、ｇｐ４１ＨＩＶエンベロープ蛋白質の最初の１２アミノ酸（ＨＩＶ単離体ＢＨ１０／ＩＩＩＢ中のアミノ酸５１９−５３０ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ）をＴ１−ＳＰ１０ペプチドのＮ−末端に共有結合させた。ＨＩＶｇｐ４１のこれらのアミノ酸（５１９−５３０）は疎水性が高い。それらは脂質膜内へ侵入して、ＨＩＶが細胞融合を誘導する能力に役割を果たしうる一次アミノ酸であると仮定されている（ＢｒａｓｓｅｕｒらＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．４：８３，１９８８）。この１２アミノ酸ｇｐ４１配列を含むペプチドはペプチドの名称の前に接頭辞Ｆ−をもつ（融合誘導領域、［ｕｓｏｇｅｎｉｃｒｅｇｉｏｎのＦ）（表ＩＩＩおよびＩＶ参照）。Ｂｏｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：６９４，１９８９）は、ＨＩＶのＦ領域（ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ）に相同なＳＩＶの領域（ＧＶＦＶＬＧＦＬＧＦＬＡＴＡＧ）が実際にＳＩＶ融合エンベロープペプチドであることを証明した。したがってＦ−誘導体化ペプチドにより免疫化したのちには、Ｆ−誘導体化ペプチドも抗原提示細胞の細胞膜内へ侵入することができ、Ｆ−誘導体化ペプチドは取り込まれ、そしてＣＤ８＋ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬがインビボで産生されると仮定された。Ｄｅｒｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ３４２：５６１，１９８９）は、合成ペプチドへの脂肪酸トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン部分の結合によりインビボで合成ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子に関するプロセシングおよび提示が促進され、したがってＣＤ８＋ＣＴＬが産生されることを示した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＭＮ系列のＴ１−ＳＰ１０ペプチド（表ＩＩＩ）を用いて一連の研究を行い、インビボでマウスに注射した場合にそれらが抗ペプチド抗体を誘導する能力を比較し（図７参照）、それらが抗ＨＩＶ中和抗体を誘導する能力を比較し（図８参照）、かつこれらのペプチドのうちいずれかがＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８ＣＴＬを誘導しうるか否かを判定した（表ＸＩＶおよびＸＶ）。 PBS中の可溶性F-T1-SP10MN(A)ペプチド(10μg)をBalb/cマウスに完全フロイントアジュバント中において注射し(１回目の注射)、次いで不完全フロイントアジュバント中において注射した(2-5回目の注射)。エフェクター細胞は、インビトロで完全Ｔ細胞培地中において25μg/mlのF-T1-S P10MN(A)ペプチドと共に7日間増殖させた免疫化動物脾細胞であった(Takahashi ら,J.Exp.Med.170:2023,1989)。培養3日目に10％v/v ConA上清を添加した。ConA 上清は完全Ｔ細胞培地中において10μg/mlのコンカナバリンAで4日間刺激したBa lb/c脾細胞由来のものであり(Takahashiら,J.Exp.Med.170:2023,1989)、上清を取り出して脾臓の細胞傷害性Ｔ細胞の活性化に用いた。^* 捕体(C)を含む実験は、F-T1-SP10MN(A)で免疫化した3匹のマウス由来のプールした脾細胞から得た結果を表す。リポソームは、7%(0.7g/10ml PBS)L-αジオレオイルレシチンオクチルグルコシド、20mg/ml T1-SP10MN(A)ペプチドおよびコレステロール3.1mg/mlを用いて、標準法により調製された(Mimmsら,Biochemistry 20:833,1981;Liposome Technology Vol.III,G.Gregoriadis編,14章,205-224頁,1984)。 T1-SP10MN(A)ペプチドを含有するリポソームをBalb/cマウスに、リポソーム中の T1-SP10MN(A)ペプチドの全投与量10μgで皮下2カ所に、完全フロイントアジュバント中において注射し(1回目の投与)、次いで不完全フロイントアジュバント中において投与した(2-5回目の投与)。エフェクター細胞は表ＸＩＶに提示および記載したと同様に調製した免疫化動物脾細胞であった。^* 実験1はRL-12標的細胞を使用し、実験2はEL4標的細胞を使用した。種々のＴ１−ＳＰ１０ペプチドがＢａｌｂ／ｃマウスにおいて抗ペプチド抗体を誘導する能力の比較：図７は、種々のペプチド１０μ／ｍｌで１、２および３回免疫化した後のＢａｌｂ／ｃマウスの血清中に産生された抗ペプチド抗体の水準の比較を示す。図７は、（Ａ）領域またはF領域の付加によって２回目の免疫化後にＥＬＩＳＡアッセイにおいてＴ１−ＳＰ１０ＭＮペプチドに対する抗ペプチド抗体の水準が上昇したことを示す。種々のＴ１−ＳＰ１０ペプチドがＢａｌｂ／ｃマウスにおいて抗ＨＩＶ中和抗体を誘導する能力の比較：図８は、ブリード３からの抗血清をＨＩＶシンシチウム阻害アッセイに添加した場合の、インビトロでのＨＩＶシンシチウム形成阻害率％を示す。シンシチウム形成を５０％以上阻害する血清抗体をもっていたのはＴ１−ＳＰ１０注射群では１匹だけ、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０群およびＴ１−ＳＰ１０（Ａ）群では０匹であったのに対し、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）を注射した動物群では５匹中３匹がシンシチウム形成を５０％以上中和する抗体水準をもっていた（図８）。種々のＴ１−ＳＰ１０ペプチドがインビボでＣＤ８＋ＣＴＬを誘導する能力：Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射した場合、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮペプチドもＦ−Ｔ１ −ＳＰ１０ＭＮペプチドもＢａｌｂ／ｃマウスにおいて測定可能なＣＴＬを誘導しなかった。しかし可溶性Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチド（表ＸＩＶ）およびリポソーム中のＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチド（表ＸＶ）は、インビボで注射した場合に、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）コーティングしたＤ′標的細胞をインビボで殺す抗−ＨＩＶＣＴＬを誘導することができた。表ＸＩＶは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてインビボで可溶性Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞はＴｈｙｌ＋、Ｌｙ２（ＣＤ８）＋であったことを示す。ＣＤ８＋抗Ｔ１−ＳＰ１０（Ａ）細胞傷害性Ｔ細胞はＨ２′標的のみを殺し、Ｈ２′標的を殺さなかった。表ＸＶは、リポソーム中のＴ１−ＳＰ１０（Ａ）ペプチドにより誘導された抗−Ｔ１−ＳＰ１０（Ａ）細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８＋およびＭＨＣクラスＩ拘束性であったことを示す。このようにＴ１−ＳＰ１０ＭＮ配列にＦ配列および（Ａ）配列（表ＩＩＩ）を付加することにより、中和抗体およびヘルパーＴ細胞応答だけでなくＣＤ８＋抗ＨＩＶＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞をも誘導しうろ５２アミノ酸ペプチド［Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）］を構築することができた。さらに、ＭＨＣクラスＩ拘束性−抗ＨＩＶ細胞傷害性Ｔ細胞は、リポソームに取り込まれた４０アミノ酸ペプチドであるＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）によりインビボで誘導された。実施例９以上に示したように、ＨＩＶｇｐ１２０Ｖ３ループのアミノ酸３０３−３２７［ＳＰ１０（Ａ）］およびＨＩＶｇｐ１２０のアミノ酸４２８−４３（Ｔ１）を含む合成ペプチドＴ１−ＳＰ１０（Ａ）の構築体は、インビボで抗ＨＩＶメモリーＴヘルパー細胞の活性化を誘導するのに有効なＴ細胞免疫原、および抗ＨＩＶ中和抗体を得るためのＢ細胞免疫原として作用する（Ｐａｒｋｅｒら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８５：１９３２−１９３６，１９８８；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２−３６１９，１９８９；Ｈａｒｔら，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７−２６８５，１９９０、およびＨａｒｔら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８８：９４４８−９４５２，１９９１）。Ｔ１−ＳＰ１０（Ａ）ペプチドは、マウス、ヤギおよびアカゲザルにおいて抗ＨＩＶ中和抗体を誘導し（Ｐａｒｋｅｒら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８５：１９３２−１９３６，１９８８；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２−３６１９，１９８９；Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７−２６８５，１９９０、およびＨａｒｔら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８８：９４４８−９４５２，１９９１）、マウスにおいて抗ＨＩＶＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬを誘導し（Ｈａｒｔら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８８：９４４８−９４５２，１９９１）、かつマウス、ヤギ、アカゲザルおよびチンパンジーにおいて抗ＨＩＶＴヘルパー細胞応答を誘導する（Ｐａｒｋｅｒら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８５：１９３２−１９３６，１９８８；Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２−３６１９，１９８９；Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７−２６８５，１９９０、およびＨａｒｔら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８８：９４４８−９４５２，１９９１）。マウスにおいて最近完成した研究では、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢａｌｂ／ｃマウスはＴ１ＳＰ１０ＩＩＩＢペプチドに対して高力価の抗ペプチド抗体を産生するが、これらのマウス系統は中和決定基ＨＩＶＩＩＩＢＶ３ループに対しては中和抗体を産生しないことが見出された。これに対しＣ５７ＢＬ／６およびＢａｌｂ／ｃマウスは、ＨＩＶＭＮＶ３ループ由来の配列を含むＴ１ＳＰ１０ペプチドで免疫化した場合には良好な抗ＨＩＶ中和抗体を産生する。合成ペプチドを試験するために、チンパンジーにおいて免疫化実験を行った。以下に述べる結果は、ニューメキシコＨｏｌｌｏｍａｎＡＦＴのチンパンジーがＴ１ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドに対して良好な抗体およびヘルパーＴ細胞応答を形成したが、Ｂａｌｂ／ｃマウスと同様に、ＨＩＶＩＩＩＢＶ３ループ上の中和抗体決定基に対しては中和抗体を産生しないことを示す。図９においては、チンパンジーを合成ＨＩＶエンベロープペプチドで免疫化し、それらの抗体力価をＥＬＩＳＡアッセイ法により試験した。動物８８４および１０２８をペプチドＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢで免疫化し、ＥＬＩＳＡアッセイにも用いた。動物１０４５および１０７０については、ペプチドＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）を免疫化およびＥＬＩＳＡアッセイに用いた。免疫化はすべてＩＰＡ＋ＰＢＳ（１：１）中で行われた。ただし動物１０２８は３回目の免疫化後にＩＭ膿瘍を発生し、１回の免疫化をやめた。その後の免疫化はＰＢＳ単独の中で行われた。分かるように、Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドは動物８８４および１０２８においては優れた免疫原であったが、Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドのＮ−末端に合成されたＨＩＶｇｐ４１融合（Ｆ）ドメインを含むＴ１−ＳＰ１０ペプチドは、Ｆドメインを含まないペプチドの場合ほど高い、またはそれほど長期持続性の抗体を誘導しなかった。以下の点に注目すべきである：動物８８４および１０２８において良好な抗体力価を誘導した免疫原Ｔ１ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）で、動物１０４５および１０７０を１６カ月目に攻撃した。動物１０４５および１０２８はＩＦＡ中のＴ１ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）に応答しなかった。したがってこれは、それらがＦ−Ｔ１ −ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドでの以前の免疫化からＴ１−ＳＰ１０（Ａ）ペプチドに対して寛容であることを証明する。動物８８４を１４週目に追加免疫化した場合にはＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドに対する力価が上昇したが、同時に動物１０２８を追加免疫化しても力価は上昇しなかった点に注目することも重要である。動物８８４はＩＦＡで追加免疫化されたが、動物１０２８の追加免疫化はアジュバントなしにＰＢＳのみで行われた。免疫作用ペプチドに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖応答についても研究を行った（図１０参照）。ペプチドＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢおよびＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）は、動物８８４および１０２８において高水準の循環ＰＢＭＣ増殖を誘導した。動物８８４および１０２８においてこれらの水準は６カ月後（１４月目）には検出不可能な水準にまで低下したが再上昇した。動物１０２８の増殖応答は、免疫化がアジュバントなしにＰＢＳのみで行われたにもかかわらず、６カ月の休止後の各追加免疫化に伴って上昇した。Ｂ細胞応答については、Ｆ−Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドで免疫化した動物１０４５および１０７０はＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドに対して増殖応答しなかった。これら後２者の動物を、動物８８４および１０２８において良好な抗原であったＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドで免疫化した場合、動物１０４５および１０７０のいずれもＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドに対して増殖応答を発現しなかった。これは、Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドのＮ−末端にＦドメインを付加すると寛容原が形成され、これが動物１０４５および１０７０をｇｐ１２０のＴ１およびＳＰ１０領域に対して寛容化したことを証明する。表ＸＶＩに示すように、動物８８４および１０２８は両者とも天然ｇｐ１２０に対する増殖アッセイに応答したが、動物１０４５および１０７０は天然ｇｐ１２０ならびに免疫作用ペプチドに対して寛容であった。合成ペプチドで免疫化したチンパンジーのＰＨＡに対するＰＢＭＣ増殖応答についても研究した（図１１参照）。これらのデータは、動物１０４５および１０７０はＨＩＶｇｐ１２０のＴ１およびＳＰ１０領域に対して寛容ではあるが、これらの動物のＰＢＭＣＰＨＡ応答は免疫化期間中正常であったことを示す。チンパンジーの研究に用いたものと同一のＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢペプチドバッチを同様にヤギにおいて免疫原として用い、ヤギにおいて良好な抗ＨＩＶ中和力価を得た（図１２参照）。Ｔ１−ＳＰ１０ペプチドはチンパンジーにおいてＩＦＡと共に用いた場合に優れた免疫原であり、＞１：１０２，４００という顕著な抗ペプチド血清抗体力価（図９参照）、ならびにＴ１−ＳＰ１０および天然ＨＩＶｇｐ１２０に対するＴ細胞応答の誘導（図１０および下記の表ＸＶＩ参照）を生じた。チンパンジーに用いたものと同一のＴ１−ＳＰ１０ペプチドバッチに対してヤギが高い中和抗体応答を示したことは、チンパンジーは選択的に中和Ｖ３配列を免疫原として認識せず、一方、他の非中和Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢペプチド配列はチンパンジーにおいて免疫原であったことを証明する。したがってＨＩＶＩＩＩＢＶ３ループの選択的蛋白質分解がインビボでチンパンジーおよびマウスの単核細胞において起こる可能性があるか、またはより可能性が高いのはＶ３ループの中和決定基に対する抗体応答の遺伝子限定がチンパンジーおよびマウスに存在することである。アカゲザルにおいては、５００μｇの精製Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドの注射により４／４の動物に著しく高い水準の抗ＨＩＶＭＮ中和抗体が産生されることが示された（図１３−１５参照）。さらに、４匹のサルのうち１匹において免疫化によりＨＩＶＩＩＩＢおよびＨＩＶＭＮウイルスを中和する交差反応性抗ＨＩＶ中和抗体が産生した（前記の表ＸＶＩＩＩ参照）。したがって２５％のチンパンジーおよびヒトがＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドに応答して交差中和性抗ＨＩＶエンベロープ抗体を形成した場合、非ＭＮ様ＨＩＶ単離体で攻撃された被験体のさらに５％をＨＩＶ攻撃から防御することができる。サルのデータについてはさらに図１６および１７を参照されたい。Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドは動物８８４および１０２８において抗ＨＩＶＩＩＩＢ中和抗体を誘導しなかったので、またＦ−Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドは動物１０４５および１０７０において寛容を誘導したので、すべてのチンパンジーは、１６カ月目（動物８８４、１０２８）または１７カ月目（動物１０４５、１０７０）にＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドで免疫化された。この場合妥当なことは、Ａ）Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドが動物１０４５および１０７０における寛容を破壊しうるか否か、およびＢ）いずれの動物もＴ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢペプチドにより提示されたＨＩＶＩＩＩＢの決定基を認識し得ないように思われたので、いずれかの動物がＨＩＶＭＮＶ３ループの中和決定基Ｖ３を遺伝的に認識しうるか否かを判定することであった。図１８は、４匹すべてのチンパンジーを０．１ｍｇ／ｋｇのＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドで免疫化したのち、４匹中３匹（８８４、１０２８および１０４５）が弱い血清抗ＨＩＶＭＮ中和抗体の出現を示し（点線）、一方動物１０７０は１：２０で＞８０％の中和率に及ぶ高い水準の抗ＨＩＶＭＮ中和抗体を発現し、かつＨＩＶＩＩＩＢを交差中和したことを示す（表ＸＩＸ、図１８実線）。この寛容の破壊は、動物８８４、１０４５および１０７０の血清中のＴ１− ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドに対する力価の上昇にも見られる（図１９）。動物１０２８は免疫化に伴って初期膿瘍を発生し、４カ月間の研究後にはＩＦＡを受容せず、ＩＦＡによるペプチドの初期免疫化後にＨＩＶのペプチドに対する抗体の上昇を示さなかった。チンパンジー１０７０の中和抗体がＨＩＶＭＮおよびＩＩＩＢ両方の単離体を中和したという所見は、ＨＩＶＭＮおよびＨＩＶＩＩＩＢ両ペプチドにより誘導されたタイプ特異性中和抗体の存在に起因する（Ｒｕｓｃｈｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３１９８（１９８８））か、またはＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドによる交差中和性−抗ＧＰＧＲＡ抗体の誘導に起因すると思われる。トランケートしたＳＰ１０ＩＩＩＢペプチドであるＳＰ１０Ｄ（ＩＲＩＱＲＧＰＧＲ）に対する抗体力価をチンパンジー１０７０から得た血清と共にＥＬＩＳＡアッセイに用いた。このペプチドに対する終末点ＥＬＩＳＡ力価は１９９０年１０月２３日から１９９１年１２月３日までは（研究３カ月目から１７カ月目まで）１：８００以下であった。動物１０７０をＴ１ −ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）で１９９２年１２月３日に１回目の免疫化したのち、ＳＰ１０Ｄペプチドに対する抗体の力価は１９９２年１月７日には１：８００から１：３２００に、そして１９９２年２月４日には１：１２，８００に上昇した。同一期間で、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドに対する１０７０の抗体力価は１：１２，８００から１：１０２，４００に上昇し、一方Ｔ１−ＳＰ１０ＩＩＩＢペプチドに対する力価は１：３２００から１：２５，６００に上昇した。動物１０７０の血清中の中和抗体を吸収する吸収研究により、すべての抗ＨＩＶＭＮ中和抗体活性をＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドで吸収することができ、ＨＩＶＭＮおよびＨＩＶＩＩＩＢの両方に共通であるＶ３ループ先端由来の配列のみを含む配列ＩＧＰＧＲＡＩＧＰＧＲＡＩＧＰＧＲＡＣ（ＤＰ２）（Ｊａｈａｖｅｒｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１５９０（１９９０））をもつペプチドでＨＩＶＭＮ中和活性の一部を吸収することができた（図２０）。したがってＴ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドにより誘導されたチンパンジー抗体応答の一部はＨＩＶＭＮおよびＨＩＶＩＩＩＢを交差中和し、ＨＩＶｇｐ１２０Ｖ３ループ先端の保存配列に対して産生されたものである。重要なことは、アカゲザルに５００μｇの精製Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドを注射したところ、４匹中４匹が極めて高い水準の抗ＨＩＶＭＮ中和抗体を産生し（図２０−２４）、４匹中１匹のアカゲザルがＨＩＶＩＩＩＢおよびＨＩＶＭＮウイルスを中和する交差反応性の抗ＨＩＶ中和抗体を産生した（表ＸＶＩＩＩ−ＸＸ）ことである。図２５は、ＤＰ２（ＩＧＰＧＲＡＩＧＰＧＲＡＩＧＰＧＲＡＣ）ペプチドがアカゲザル１８９８７から得た血清中の抗ＨＩＶＩＩＩＢ中和活性を吸収することを示す。表ＸＸＩは、本明細書に記載するチンパンジーおよびアカゲザルの研究に用いたペプチドの配列を示す。実施例１０以下は、ヒト患者免疫化のためのブロトコールである。ＨＩＶ血清陰性被験者を、米国内で現在流行しているＨＩＶの単離体のうち約８０％に対して中和抗体を産生するように設計されたＴ１ＳＰ１０（Ａ）ペプチドの多価混合物（表ＸＸＩＩおよびＸＸＩＩＩ）で免疫化する。実験プロトコールＨＬＡ２Ａ＋およびＨＬＡ２Ａ−両方のヒト患者につき最高２年間研究する。処置期間中、ＨＩＶＭＮおよび他のＨＩＶ単離体に対する中和抗体の産生、ならびにＴヘルパーおよび／またはクラスＩ拘束性−抗ＨＩＶＣＴＬの産生を測定する。使用する免疫原はロス・アラモス・データ・セット（ＬｏｓＡｌａｍｏｓＤａｔａＳｅｔ）（Ｍｙｅｒｓら，ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ１９９１）中のＨＩＶ単離体のうち８０％に対して抗体を産生すると予想されるＴ１ＳＰ１０（Ａ）ペプチドである。ある患者には表ＸＸの免疫原を投与し、ある患者には表ＸＩＸの免疫原を投与する。各患者に免疫原として約０．０５ｍｇ／ｋｇのペプチド、または各１ｍｇの用量のペプチドを投与する。当初の投与計画に対して応答が得られない場合、３カ月の休止後に用量を倍増してこの投与方式を反復する。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を免疫原と１：１（ｖ／ｖ）混合物として混合する（Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７−２６８５，１９９０）。各免疫化のための全容量は２ｃｃとすべきである。免疫原を筋肉内投与する。免疫原を全容量２ｃｃに混合し、１ｃｃずつ２カ所に筋肉内投与する（右または左上腕、右または左大腿）。免疫化は０カ月、１カ月および３カ月目に行う。患者を各免疫化後４週間監視する。３回目の免疫化後に、ＨＩＶに対する応答の力価を試験し、より大量のペプチドによる免疫化を３カ月の休止後に行うか否かを決定する。患者につきルーティンな血液および尿試験を実施する。以下の血液試料が必要である。血清（１０ｍｌ）（血液約２０ｃｃ）を、ＲＩＡにおけるＴ１ＳＰ１０およびＳＰ１０ペプチドの結合およびＲＩＰ／ウェスタンブロットアッセイにおけるＨＩＶｇｐ１２０結合の研究に用いる。血清は、逆転写酵素および／またはシンシチウム阻害アッセイにおけるＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、ＨＴＬＶ−ＩＩＭＮおよび現場ＨＩＶ単離体の中和力価の測定にも用いられる。毒性に関するルーティンの血清化学的試験（肝機能検査、腎機能およびｃｈｅｍ１８パネル）、および全血計数（１０ｃｃのヘパリン添加血）を行う。末梢血球（血液６０ｍｌ）を、ＰＨＡ、ＴＴ結合Ｔ１ＳＰ１０およびＳＰ１０ペプチド、ｇｐ１２０およびＯＫＴ３に対するＴ細胞増殖応答の研究に用いる（約３０ｍｌのヘパリン添加血）。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８の細胞数も測定する（約５ｍｌのヘパリン添加血）。最後に、ＣＴＬアッセイを、自己もしくはＨＬＡ同一のＥＢＶトランスフォームＢ細胞系、または自己ＥＢＶトランスフォームＢ細胞系につき、ワクシニアｇｐ１６０感染した標的およびペプチドコーティングした標的を用いて行う。実施例１１ＨＩＶ天然蛋白質またはＨＩＶ蛋白質発現標的細胞に対するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞、中和抗体、およびＭＨＣクラスＩ拘束性−細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するための実験的合成ペプチド免疫原を設計する方法は開発されている（Ｐａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１９３２（１９８８）、Ｐａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２（１９８９）、Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７（１９９０）、Ｈａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９４４８（１９９１）、Ｈａｙｎｅｓら，ＡＩＤＳＲｅｓ．＆ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ６：３８（１９９０）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.,１５１：１６４６（１９９３）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：７１７（１９９３）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｔｒａｎｓ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ１０６：３１（１９９３）、Ｙａｓｕｔｏｍｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：５０９６(１９９３)）。（エイズに対するＨＬＡ系ワクチンに関する一般経路を図３０に示す。Ｔｈ₁---_n−Ｂ₁---_n には構築体Ｔｈ−ＳＰ１０、およびたとえばＣ４−Ｖ３が含まれる。Ｔｈ₁---_n −Ｔｃ₁---_nはＴｈ−ＣＴＬ（ＣＴＬ＝Ｘ）に等しい。）中和抗体を誘導するための一般的免疫原の設計には、ｇｐ１２０エンベロープＶ３ループ中和ドメインに対してＮ−末端にある、ＨＩＶ蛋白質のＴｈエピトープ(Ｔｈ−Ｂ、図２６)１または２以上の合成が必要である。ＭＨＣクラスＩ拘束性−抗ＨＩＶまたは抗ＳＩＶＣＴＬ誘導のために、Ｔｈ−Ｂ−ＣＴＬおよびＴｈ−ＣＴＬペプチドの設計に共に成功した（図２６）（Ｈａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９４４８（１９９１）、Ｙａｓｕｔｏｍｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：５０９６（１９９３））。ＨＩＶＩＩＩＢ、ＭＮまたはＲＦエンベロープｇｐ１２０のＴｈ−Ｂ−ＣＴＬエピトープからなる基本型の合成ペプチド免疫原は以下のものを誘導した：ａ）マウス、ヤギ、アカゲザルおよびチンパンジーにおいて天然ｇｐ１２０に対するＴｈ応答（Ｐａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１９３２（１９８８）、Ｐａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２（１９８９）、Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７（１９９０）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ.，１７７：７１７（１９９３））、ｂ）ヤギ、アカゲザルおよびチンパンジーにおいて、実験室ＨＩＶ単離体をタイプ特異的様式で中和するＢ細胞中和抗体応答（Ｐａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１９３２（１９８８）、Ｐａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２（１９８９）、Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：２６７７（１９９０）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：１６４６（１９９３）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：７１７（１９９３）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｔｒａｎｓ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ１０６：３１（１９９３））、ならびにｃ）マウスおよびアカゲザルにおいて、ＨＩＶまたはＳＩＶ蛋白質を発現している標的細胞を殺す抗ＨＩＶまたは抗ＳＩＶＭＨＣクラスＩ拘束性−ＣＴＬ（Ｈａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９４４８（１９９１）、Ｙａｓｕｔｏｍｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：５０９６（１９９３））。アカゲザルにおいては、Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドが特定の動物にＶ３ループの先端にあるＩＧＰＧＲＡＦ配列と主に反応する抗体を誘導し、かつＨＩＶＩＩＩＢ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶＲＦならびにＣＥＭ細胞中で増殖させたＨＩＶ−次単離体をも交差中和することが示されている（Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：１６４６（１９９３））。基本型多価ＨＩＶ免疫原の設計地域的にも患者間でもＨＩＶ単離体中には著しい変異性があるので、効果的な予防用免疫原および治療用ＨＩＶ免疫原には、特定の地域のＨＩＶ単離体に合わせた多価ＨＩＶ免疫原の設計が必要であると思われる（Ｐａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２（１９８９）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｔｒａｎｓ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ１０６：３１（１９９３））。このために、ＣｌａｖｅＥ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶＲＦ、ＨＩＶＥＶ９１およびＨＩＶＣＡＮＯ中の４つの共通ＨＩＶ単離体モチーフを反映するＴｈ−Ｂ−ＣＴＬエピトープを含む基本型の多価ＨＩＶ免疫原を設計した（図２６および２７）。これらの基本型ペプチドそれぞれには少なくとも以下のものが存在する：２つのＴｈ決定基；２つのクラスＩ拘束性ＣＴＬ決定基、すなわち、一方はＨＬＡＡ２およびＡ３拘束性（Ｃｌｅｒｉｃｉら，Ｎａｔｕｒｅ３３９：３８３（１９８９））であり、他方はＢ７拘束性（Ｓａｆｒｉｔら，急性セロンバージョン（ｓｅｒｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）中の２患者から単離した第３可変領域ＨＩＶｇｐ１２０に特異的なＨＬＡ−Ｂ７拘束性−細胞傷害性Ｔリンパ球クローンの解明。１９９３年１０月３０日−１１月４日の第６回ＮＣＶＤＧ会合で発表）である；ならびに抗ＨＩＶ中和抗体により認識される３つ以上のエピトープ（Ｐａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１９３２（１９８８）、Ｒｕｓｃｈｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３１９８（１９８８）、Ｊａｈａｖａｒｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１５９０（１９９０）（図２６および２７）。この基本型ペプチド混合物をマウスにおいて前臨床試験することにより、２成分［Ｔ１−ＳＰ１０ＲＦ（Ａ）およびＴ１−ＳＰ１０ＥＶ９１（Ａ）］がタイプ特異的な抗−Ｖ３ペプチド［抗ＳＰ１０（Ａ）］応答を誘導し（表ＸＸＩＶ）、一方、２成分［Ｔ１−ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）およびＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）］が広範に交差反応性の抗−Ｖ３ペプチド抗体応答を誘導することが示された（表ＸＸＩＶ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＩＦＡ（ＳｅｐｐｉｃＩＳＡ５１）中において５０μ ｇの１価ペプチドで３回皮下に免疫化した。動物を免疫化の２週間後に採血し、終末点ＥＬＩＳＡアッセイにより抗体力価を測定した（Ｅ／Ｃ３．０）。データは各点につき３匹のマウスの血清抗体の算術平均力価を表す。ＥＬＩＳＡ法はＨａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.，１５１：１６４６（１９９３）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：７１７（１９９３）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｔｒａｎｓ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ１０６：３１（１９９３）に記載されている。ＨＩＶエンベロープペプチドがアフリカ（ＣｌａｖｅＡ）およびタイ（ＣｌａｖｅＥ）ＨＩＶ単離体Ｖ３ループペプチドに対する交差反応性ペプチド応答を誘導する能力さらに、４種類のペプチド（表ＸＸＶ）すべての混合物で免疫化したヤギおよびマウスから得た血清は、Ｔ１−ＳＰ１０（Ａ）Ａ．ｃｏｎ．ペプチド（アフリカのＣｌａｖｅＡの共通Ｖ３ループ配列を反映したＴｈ−Ｂ−ＣＴＬペプチド）とも交差反応し、かつより低い程度にＴ１−ＳＰ１０（Ａ）Ｅ．ｃｏｎ．ペプチド（タイのＣｌａｖｅＥの共通Ｖ３ループ配列を反映したＴｈ−Ｂ−ＣＴＬペプチド）とも交差反応する抗体を含有していた（表ＸＸＶ）。多価混合物の４成分それぞれ１種類のみを用いて免疫化したマウスから得た血清を、それらがアフリカＴ１−ＳＰ１０（Ａ）Ａ．ｃｏｎ．ペプチドに結合する能力につき試験した場合、Ｔ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドがアフリカＣｌａｖｅＡ共通配列に対するすべての交差反応性抗体の産生に関与することが見出された。したがって、ＣＡＮＯエンベロープの一次Ｖ３配列は他のＨＩＶエンベロープＶ３配列と大幅に異なる（図２７）が、ＨＩＶＣＡＮＯ単離体のＶ３ループの二次または恐らくそれより高い次数の構造が多様なＨＩＶＶ３モチーフに対する交差反応性抗Ｖ３抗体を誘導する能力をもつと思われる。データは、多価Ｔｈ−ＢＨＩＶエンベロープペプチド混合物を注射したマウス３匹またはヤギ２匹の算術平均力価を表す。用いた方法はHaynesら,J.Immunol.,151:1646(1993)、Haynesら,J.Exp.Med.,177: 717(1993)、Haynesら,Trans.Amer.Assoc.Physician 106:31(1993)に記載される。アフリカ（Ａ．ＣＯＮ）および東南アジア（Ｅ．ＣＯＮ）ＨＩＶ単離体に対するＴ１−ＳＰ１０（Ａ）配列 Human Retroviruses and AIDS 1993 G.Myers,J.A.Berzofsky,B.Korber,R.F.Smith,およびG.N.Pavlakis編 Theoretical Biology and Biophysics Group T-10発行 Mail Stop K710,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM 87545 多価ＨＩＶエンベロープ免疫原により生じた中和抗体応答中和抗体応答につき、多価免疫原（図２７）で免疫化した動物から得た血清は放射免疫沈降アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＩＶｇｐ１２０ＩＩＩＢおよびｇｐ１２０ＳＦ２と結合する。これらの動物から得た血清は、シンシチウム阻害アッセイにおいてＨＩＶＭＮおよびＲＦ単離体を中和した。ＨＩＶｇｐ１２０の中和ＣＤ４−Ｖ３配座決定基の証明１７ｂおよび４８ｄヒト抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を、ＨＩＶ感染患者由来のヒトＰＢＭＣＢ細胞から単離した（Ｔｈａｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８−３９８８（１９９３）；Ｍｏｏｒｅら，ＡＩＤＳＲｅｓ．ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒａｌ．９：１１８５（１９９３））。１７ｂおよび４８ｄモノクローナル抗体は、ｇｐ１２０へのＣＤ４結合を遮断するマウス−モノクローナル抗体を交差遮断し、異なるＨＩＶ単離体を広範に中和するが、基本的にそれ自体はｇｐ１２０−ＣＤ４結合を遮断しない（Ｍｏｏｒｅら，私的報告，１９９４；Ｔｈａｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８（１９９３））。むしろ天然ｇｐ１２０への４８ｄモノクローナル抗体の結合が、ｇｐ１２０へのＣＤ４の連結後にアップレギュレーションされる。１つのペプチド、すなわちＴ１ −ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）が４８ｄモノクローナル抗体に結合し（図２８）、ＨＩＶエンベロープハイブリッドペプチドＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）へのモノクローナル抗体４８ｄの最適結合はＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）に対してＮ−末端にあるＣＤ４ペプチドであるＴ１の存在に依存することが見出された（図２９）。したがってＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ハイブリッドＣ４−Ｖ３ペプチドは、有効かつ広範な中和作用をもつヒト−モノクローナル抗体により認識されるＨＩＶｇｐ１２０の配座決定基を反映している。Ｗｙａｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９９７（１９９２）およびＭｏｏｒｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４７８５（１９９３）がＶ３ループ［ＳＰ１０（Ａ）］とＣ４であるＴ１領域とが天然ｇｐ１２０において互いに物理的に近接することを示唆しているのは興味深い。したがってこのデータは、Ｔ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）合成ペプチドが広範な中和作用をもつ天然ｇｐ１２０のＣ４−Ｖ３配座決定基を模倣しうることを直接に示す。他のＨＩＶ単離体のＣ４−Ｖ３配座決定基を反映する多数のＣＤ４−Ｖ３［Ｔ１ −ＳＰ１０（Ａ）］ペプチドを同定するための一般法ＨＩＶＶ３ループ自体は主としてタイプ特異性の抗ＨＩＶ中和抗体を誘導するが、Ｔ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）ペプチドにより規定されるＣ４−Ｖ３決定基はより広範に交差反応性の中和抗体を誘導するであろう。これは、ＨＩＶ血清陽性患者から得た４８ｄヒト−モノクローナル抗体がｇｐ１２０の表面にある複雑な配座決定基に結合し、広範なＨＩＶ単離体に結合し、かつ異なるＨＩＶ単離体、たとえばＨＩＶＩＩＩＢおよびＨＩＶＭＮを中和するという事実から分かる（Ｔｈａｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８（１９９３）；ＭｏｏｒｅＪ．ら，私的報告（１９９４））。したがって多数のＣ４−Ｖ３ペプチドを同定するための一般法は以下の方法であろう：ＳＰ１０またはＳＰ１０（Ａ）領域のＮ−末端（たとえばＨＩＶＭＮのアミノ酸３０１−３２７、および他のＨＩＶ単離体中の相同な領域に由来するもの）に結合したＣ４配列（たとえばＨＩＶＭＮ由来のアミノ酸４１９−４２８、および他のＨＩＶ単離体中の相同な領域に由来するもの）に由来する多数のＣ４−Ｖ３ペプチドを、ロス・アラモス・データベースに挙げられた配列（ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡＩＤＳ１９９１，１９９２，１９９３，Ｇ．Ｍｙｅｒｓ，Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｂ．Ｋｏｒｂｅｒ，Ｒ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，およびＧ．Ｎ．Ｐａｖｌａｋｉｓ編，ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃＧｒｏｕｐＴ−１０発行，ＭａｉｌＳｔｏｐＫ７１０，ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬｏｓＡｌａｍｏｓ，ＮＭ８７５４５）から構築する（他の例については表ＸＸＶＩを参照されたい）。次いでこれら種々のＣ４−Ｖ３ペプチド約４０−１００を、ファージ表面に発現したＨ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン可変遺伝子の組合わせライブラリーに対してスクリーニングする(Ｂｏｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７９７８(１９９１))。Ｂｏｒｂａｓらの研究は、ＨＩＶ感染患者から得た多数の（１０⁷−１０⁸）ヒト−モノクローナル抗体をスクリーニングする方法を提供し、ｇｐ１２０上の複雑な配座決定基に対する抗体種を探査するための広域抗体応答のスクリーニングを可能にする。この方法で、組合わせライブラリー中のファージ表面に発現したＨ鎖およびＬ鎖ヘテロ二量体の可変領域のＦａｂノッチ内へ適合する配座であるＣ４−Ｖ３ペプチドを同定することができる。これらのＦａｂモノクローナル抗体を単離し、クローン化することができる（Ｂｏｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７９７８（１９９１））。極めて重要なことは、多様なＨＩＶ系統の天然ｇｐ１２０Ｃ４−Ｖ３配座決定基を反映するＣ４−Ｖ３ペプチドのデザインを同定しうることである。蛋白質に基づくこの種類の選択を世界中の種々のＨＩＶ感染地域の多数のＨＩＶ感染個体に由来する組合わせライブラリーにつき実施すると、天然ｇｐ１２０のＣ４−Ｖ３領域に由来する広範に反応性の中和性決定基を模倣するＣ４−Ｖ３ペプチドを広範に選択し、そしてたとえばＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）の基本型Ｃ４−Ｖ３ペプチドと組み合わせて、多数のＨＩＶ系統のＣ４−Ｖ３配座決定基に対して交差反応性の高い広域中和抗体を誘導するための多価Ｃ４−Ｖ３ペプチド免疫原となすことができる。配列は下記に由来する配列より得た：ロス・アラモス・データベース，Human Re troviruses and AIDS 1991,G.Myers,J.A.Berzofsky,B.Korber.R.F.Smith.および G.N.Paviakis編,Theoretical Biology and Biophysic Group T-10発行,Mail Sto p K710,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM 87545。引用した文献はすべてそれらの全体が本明細書に参考として含まれる。以上、本発明を明確にし、理解するために、例を用いて詳細に記載した。この記載を読むことにより、本発明の合成ペプチドはそのアミノ酸配列が個々のＨＩＶ単離体のＳＰ−１０領域の配列とわずかに異なっても本発明の範囲から逸脱しないことが当業者には自明であろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．最大約３５単位までの長さのアミノ酸配列から本質的に成り且つＢリンパ球によって認識されるＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の少なくとも一つの抗原決定基に対応する本質的に純粋な形の親水性ペプチドであって、担体分子に対して共有結合した場合に、哺乳動物中においてＨＩＶに対する防御的種特異的抗体の高力価の生産を引き起こすことができることを特徴とするペプチド。２．前記アミノ酸配列が、ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質のＳＰ−１０部分またはその一部に対応する請求項１に記載のペプチド。３．前記アミノ酸配列が、ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧまたはその一部から本質的に成る請求項２に記載のペプチド。４．哺乳動物中においてＨＩＶに対する防御的種特異的抗体の高力価の生産を誘導しうる免疫原性複合体であって、（ｉ）（ｉｉ）に共有結合した担体分子；および（ｉｉ）最大約３５単位までの長さのアミノ酸配列から本質的に成り且つＢリンパ球によって認識されるＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の少なくとも一つの抗原決定基に対応する親水性ペプチドを含むことを特徴とする複合体。５．前記担体分子が、ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の部分に対応するアミノ酸配列を含み、該部分はＳＰ−１０部分から隔てられていて且つＴ細胞によって認識される請求項４に記載の複合体。６．前記ＳＰ−１０部分から隔てられた前記部分がＴ細胞エピトープＴ１若しくはＴ細胞エピトープＴ２またはそれらの一部である請求項５に記載の複合体。７．前記担体分子が破傷風トキソイドである請求項４に記載の複合体。８．前記担体分子が前記ペプチドに対して少なくとも一つのスペーサー分子を介して共有結合している請求項４に記載の複合体。９．前記スペーサー分子がジペプチドグリシン−グリシンから成る請求項８に記載の複合体。１０．前記アミノ酸配列が、ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質のＳＰ−１０部分またはその一部に対応する請求項４に記載の複合体。１１．前記アミノ酸配列が、ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧまたはその一部から本質的に成る請求項１０に記載の複合体。１２．ＳＰ−１０様ペプチドまたはＳＰ−１０様ペプチドの一部に対して共有結合したアミノ酸配列ＦＬＧＦＬＧを更に含む請求項４に記載の複合体。１３．ＳＰ−１０部分のＣ末端に位置し、ＨＩＶ単離物のエンベロープ蛋白質の超可変領域に対応するアミノ酸配列を更に含む請求項４に記載の複合体。１４．前記超可変領域に対応する前記配列がＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮであり且つＳＰ−１０のＣ末端に直接結合している請求項１３に記載の複合体。１５．哺乳動物中においてＨＩＶに対する免疫を引き起こす方法であって、該哺乳動物に対して請求項４に記載の少なくとも１種類の複合体を投与することを含むことを特徴とする方法。１６．哺乳動物中においてＨＩＶに対する免疫を引き起こす方法であって、該哺乳動物に対して少なくとも２種類の複合体が共有結合した少なくとも１つの凝集体を投与することを含み、該複合体のそれぞれは、（ｉ）（ｉｉ）に共有結合した担体分子；および（ｉｉ）少なくとも１種類のＳＰ−１０様ペプチドまたはその一部を有することを特徴とする方法。１７．前記凝集体が少なくとも２種類のＳＰ−１０様ペプチドまたはそれらの一部を含み、それらがそれぞれＨＩＶの異なる単離物に対応する請求項１６に記載の方法。１８．前記凝集体中の前記複合体が、少なくとも１個のジスルフィド結合によって互いに共有結合している請求項１６に記載の方法。１９．哺乳動物中においてＨＩＶに対する防御免疫応答を引き起こすことができる免疫原性共有結合凝集体であって、少なくとも２種類の複合体を含み、それぞれの該複合体は、（ｉ）（ｉｉ）に共有結合した担体分子；および（ｉｉ）最大約３５単位までの長さのアミノ酸配列から本質的に成り且つＢリンパ球によって認識されるＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の少なくとも一つの抗原決定基に対応する親水性ペプチドから成り、該複合体は少なくとも１個のジスルフィド結合によって互いに結合していることを特徴とする凝集体。２０．哺乳動物血清中における特定のＨＩＶ株に対する中和抗体の存在および力価を決定する方法であって、（ｉ）ＳＰ−１０様ペプチドまたはその一部を哺乳動物血清からの抗体と接触させ；そして（ｉｉ）ＳＰ−１０様ペプチド−抗体複合体の生成をラジオイムノアッセイまたは酵素結合イムノソルベント検定法によって測定する工程を含む方法。２１．一般式Ｆ−Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）Ｔｈ−ＳＰ１０（Ｘ）Ｔｈ−ＳＰ１０またはＦ（Ｘ）（式中、Ｆは、ＨＩＶｅｎｖｇｐ４１の推定上の融合誘導ドメインに由来しうるアミノ酸配列またはそれと機能的に同等の配列を表わし；Ｔｈは、Ｔヘルパーエピトープを含むアミノ酸配列を表わし；ＳＰ１０は、請求項１に定義のペプチドを表わし；そして（Ｘ）は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ拘束性細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるＨＩＶ蛋白質配列に対応するアミノ酸配列を表わす）を有するペプチド。２２．霊長類においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を中和する抗体を誘導する方法であって、該霊長類に対して自然のままのＨＩＶｇｐ１２０Ｃ４− Ｖ３部分の立体配座決定基のミメオトープを投与することを含む方法。２３．前記ミメトープがＴ１−ＳＰ１０ＣＡＮＯ（Ａ）である請求項２２に記載の方法。２４．請求項２１に記載の前記ペプチドを、２種類以上のＨＩＶ単離物に対する中和抗体を生産する能力についてスクリーニングする方法であって、（ｉ）該ペプチドの一つと、自然のままのＨＩＶｇｐ１２０Ｃ４−Ｖ３部分の立体配座決定基を認識する単クローン性抗体とを、結合が起こりうるような条件下で接触させ、そして（ｉｉ）該ペプチドが該単クローン性抗体に対して結合するかどうかを確認することを含む方法。