DE69615685T2

DE69615685T2 - Impstoff gegen krankheitserreger, zusammensetzung zur behandlung und vorbeugung von hiv infektionen

Info

Publication number: DE69615685T2
Application number: DE69615685T
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Chermann; Pascale Galea; Carole Le Contel
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: WO1997002344A3; EP0835309A2; CN1193349A; ES2165510T3; FR2735984B1; JP4036895B2; WO1997002344A2; FR2735984A1; EP0835309B1; US6113902A; DE69615685D1; ATE206456T1; CA2223825A1; AU6462396A; CN1117148C; DK0835309T3; PT835309E; JPH11509407A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Impfstoff-Typen und insbesondere Zusammensetzungen, die zur Behandlung, Vorbeugung und Diagnose von HIV-Infektionen bestimmt sind.
Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Peptide, die eine Immumantwort erzeugen können, welche direkt oder indirekt die HIV-Viren bei Säugern und insbesondere bei Menschen neutralisieren können.
Die Bedeutung von monoklonaren Antikörpern, die gegen das β2-Mikroglobulin (β2m) gerichtet sind, bei der Inhibierung der Replikation von HIV-1 wurde bereits beschrieben, insbesondere in dem Patent EP-B-0470989 sowie in verschiedenen Veröffentlichungen.
Insbesondere konnte nachgewiesen werden, daß diese Antikörper über zwei Mechanismen wirken, nämlich direkt bei dem Virus oder bei Zellen, die mit dem β2m assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Entwicklungen dieser vorläufigen Grundzüge und beruht auf dem Nachweis von Peptid-Sequenzen, die von β2m abstammen oder eine äquivalente Struktur aufweisen und fähig sind, Antikörper zu erzeugen, die völlig oder teilweise die HIV-Viren neutralisieren.
Unter Berücksichtigung der Komplexität der beteiligten Mechanismen versteht man unter "Neutralisation des HIV-Virus" jeden Mechanismus, der in vivo die Wirkung aufweist, die Viren zu zerstören und/oder ihre Vermehrung zu verhindern.
In vitro können diese neutralisierenden Antikörper verwendet werden, um jede Körperflüssigkeit zu neutralisieren, die dazu bestimmt ist, dem Menschen wieder verabreicht oder eingeimpft zu werden, wie das Sperma eines HIV-seropositiven Mannes für die Befruchtung einer seronegativen Frau.
Aber allgemeiner beruht die vorliegende Erfindung auf einem neuen Impfansatz, der insbesondere bei den infektiösen Agenzien vom parasitischen oder Virus-Typ mit starkem Mutationsvermögen nützlich ist. Im Rahmen der herkömmlichen Impfung strebt man nämlich danach, neutralisierende Antikörper zu erzeugen, die gegen Elemente des infektiösen Agens gerichtet sind, wenn dieses aber ein starkes Mutationsvermögen besitzt, wie beispielsweise das HIV, ergibt diese Strategie im besten Fall beschränkte Ergebnisse bei einem speziellen Isolat, das sehr schnell durch ein mutiertes und resistentes Isolat ersetzt sein wird.
Der neue Impfansatz beruht auf einem anderen Konzept und ist auf eine gewisse Zahl von infektiösen Agenzien anwendbar, die in ihrem Zyklus eine intrazelluläre Phase aufweisen.
Man weiß nämlich bei gewissen Agenzien, oder man kann es zeigen, insbesondere im Fall von HIV, welches einen Teil der vorliegenden Erfindung ausmacht, daß bei der Multiplikation der infektiösen Agenzien ausgehend von infizierten Zellen des Wirts die extrazellulären infektiösen Agenzien Determinantenelemente der Wirtszelle mit sich tragen.
Einer der Gegenstände der vorliegenden Erfindung besteht darin, als Ziel nicht das infektiöse Agens selbst, sondern die Elemente der Determinante zu nehmen, welche es mit sich trägt, und eine Impfung vorzusehen, die gegen diese zellulären Determinanten gerichtet ist, die konstant bleiben, selbst wenn das Agens selbst mutiert ist.
Diese Art von Ansatz weist natürlich eine unmittelbare Grenze auf; da das Antigen an die Wirtszellen gebunden ist, ist es nur möglich, mit einem kryptischen Epitop der zellulären Determinante, die erst enthüllt wird, wenn sie durch das extrazelluläre infektiöse Agens mitgetragen wird, oder einem in seiner natürlichen Präsentation durch die Zelle nicht-immunogenen Epitop, das modifiziert ist, wenn es auf der Oberfläche des Virions vorliegt, eine derartige Impfung durchzuführen.
Im Fall von HIV beispielsweise konnte man zeigen, daß das β2-Mikroglobulin mehrere kryptische Epitope präsentiert, welche bei der Multiplikation des HIV-Virus und seinem Durchtritt zum Äußeren der Zelle enthüllt werden. Es gibt deshalb einerseits im Fall der Impfung keine Autoimmunreaktion, und andererseits ist die Impfung wirksam, wobei der Epitop an verschiedene HIV- Isolate gebunden ist, welche getestet wurden, und dies unabhängig von Mutationen des Virus selbst.
Diese Art von Impfung kann insbesondere bei intrazellulären Parasiten und komplexen Viren, wie beispielsweise CMV, HPV, HSV und HIV, in Betracht gezogen werden.
Es sollte verstanden werden, daß, wenngleich diese Art von Impfung nicht für alle Fälle verwendbar ist, sie eine sehr interessante Alternative für infektiöse Agenzien darstellen kann, die gegen herkömmlichere Ansätze resistent sind.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff gegen ein infektiöses Agens, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen kryptischen Epitop eines zellulären Elements umfaßt, der von einem intrazellulären infektiösen Agens bei seinem Durchtritt zum Äußeren der Zelle mitgenommen wird und der durch das infektiöse Agens enthüllt wird.
Vorzugsweise ist dieses infektiöse Agens ein Parasit oder ein komplexes Virus und ist der kryptische Epitop in der Nähe der Oberfläche der Zelle angeordnet.
Mit "kryptischem Epitop" beabsichtigt man, einen Epitop einer zellulären Determinante des Wirts zu bezeichnen, die verborgen oder modifiziert ist und deshalb durch das Immunsystem als fremd erkannt wird und somit keine Autoimmunreaktion mit Zerstörung der entsprechenden Determinante hervorruft und für die Impfung verwendet werden kann.
Der kryptische Epitop muß offensichtlich enthüllt werden, d. h. für das Immunsystem zugänglich sein und von diesem erkannt werden, wenn er durch das infektiöse Agens mitgenommen wird (in dem Fall, in dem er kryptisch bliebe, wäre die Impfung nicht möglich).
Im Fall von β2-Mikroglobulin konnte man die Existenz dieser Art von Epitop zeigen, welcher sich im übrigen auch in natürlicher Form bei der Ausscheidung des β2-Mikroglobulins auf dem Harnweg enthüllt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Zusammensetzungen, die zur Behandlung oder Verhütung von HIV-Infektionen bestimmt sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff mindestens ein Peptid umfassen, das den Sequenzen 1 bis 22 oder einer äquivalenten Sequenz entspricht. Mit "äquivalenter Sequenz" beabsichtigt man, eine Sequenz zu bezeichnen, welche die Neutralisation des HIV-Virus durch die monoklonaren Antikörper B1G6 oder B2G2.2 in vitro aufhebt. B1G6 und B2G2.2 sind in Liabeufet al., (1981); The Journal of Imunology, Band 127, Nr. 4, 15k2-15k8 beschrieben. Diese Peptide stellen kryptische Epitope des β2-Mikroglobulins dar, wie vorstehend beschrieben. Die Peptide gemäß der Erfindung sind die folgenden:
01 - P1 IQRTPKIQVYSRHPA
(Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala)
02 - P4 FHPSDIEVDLLKDGE
(Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asp-Gly-Glu)
03 - P9 ACRVNHVTLSQPKIV
(Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val)
Man kann auch einen kleineren Teil (7 Aminosäuren) dieser 15 Aminosäuren verwenden, welcher die Neutralisation des Virus durch die monoklonaren Antikörper B1G6 oder B2G2.2 aufhebt:
04 - R-7-V RTPKIQV (Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val)
05 - S-7-K SQPKIVK (Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys)
06 - F-7-E FHPSDIE (Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu)
Eine gemeinsame Struktur PKI (3 Aminosäuren) scheint die verantwortliche Einheit zu sein; von daher die folgenden Aminosäuren-Modifikationen:
07 - TLSRTPKIQV (Thr-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val) Nr. 185
08 - IYLTQPKIKV (Ile-Tyr-Leu-Thr-Gln-Pro-Lys-Ile-Lys-Val) Nr. 186
09 - IQRTPKIQVY (Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr) Nr. 187
10 - TLSQPKIVKN (Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Asn) Nr. 188
11 - IQRTPQIVKW (Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Gln-Ile-Val-Lys-Trp) Nr. 189
12 - IQRTPNIVKW (Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Asn-Ile-Val-Lys-Trp) Nr. 190
Man kann auch ein Cystein und eine Glycosylierungsstelle einführen:
13 - CYNPSDIE (Cys-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu)
14 - YCNPEST (Tyr-Cys-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr)
15 - NFLNCYVS (Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser)
16 - LNCYVSPSD (Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Pro-Ser-Asp)
Schließlich kann man die Peptide verwenden, welche verschiedene Variationen als Funktion der Art (Maus, Primaten, Kaninchen, Meerschweinchen) verwenden:
17 - KTPQIQV (Lys-Thr-Pro-Gln-Ile-Gln-Val)
18 - FHPPQIE (Phe-His-Pro-Pro-Gln-Ile-Glu)
19 - FHPPHIE (Phe-His-Pro-Pro-His-Ile-Glu)
20 - AEPKTVY (Ala-Glu-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr)
21 - SQPKTVY (Ser-Gln-Pro-Lys-Thr-Val-Tyr)
22 - ILSRTPKIQV (Ile-Leu-Ser-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val)
Diese Peptide der SEQ ID 1 bis 22 enthalten nur die bevorzugte Wahl, es ist möglich, wie es vorstehend angegeben wurde, äquivalente Peptide zu finden.
Das Beispiel 5 beschreibt ein Verfahren, das es gestattet, die äquivalenten Peptide aufzuzeigen.
Diese Peptide sind vorzugsweise mit einem Trägersystem verbunden; es kann sich um ein oder mehrere Protein-Fragmente handeln, die an das N- und/oder C-terminale Ende der Peptide gebunden sind, um insbesondere eine Immunantwort zu gestatten; man spricht dann von "konjugierten Proteinen". Unter den verwendbaren Proteinen sind vor allem die Albumine, das KLH ("Keyhole Limpet Hemocyanin"), das MAP ("Multiple Antigenic Peptide") oder andere Proteine zu zitieren, die für ihr immunogenes Vermögen bekannt sind. Es ist auch möglich, Proteine oder Proteinfragmente vorzusehen, die durch Nicht-Peptid-Bindungen gebunden sind, wie durch eine Disulfid-Brücke oder Bindungen durch das Calcium-Ion.
Bei der Untersuchung von verschiedenen erfindungsgemäßen Peptiden schien es, obwohl es sich dabei nur um eine Theorie handelt, die auf keinerlei Weise die vorliegende Erfindung beschränken kann, daß die Struktur PKI eine wesentliche Rolle spielt. Prolin ist nämlich eine Aminosäure, die eine Konformation auferlegt und die die Möglichkeit einer quaternären Peptid-Konfiguration beschränkt. Unter diesen Bedingungen ist KI (Lys, Ile) in einer Position fixiert, die exponiert ist, um mit einem Antikörper zu reagieren.
Unter diesen Bedingungen empfiehlt es sich, bei der Konstruktion der Träger-Proteine vorzugsweise eine Struktur vorzusehen, welche die Struktur PKI zugänglich beläßt.
Die Analyse der Struktur der für P1, P9 und P10 selektierten Regionen kann durch Verfahren bewirkt werden wie die Selektion, die Alanin verwendet, um jede Aminosäure getrennt zu ersetzen, insbesondere in der Region RTPKIQV, um die eventuellen Aminosäuren aufzuzeigen. Man kann auch die Techniken verwenden, welche die Biotinylierung jedes Peptids, dann die Selektion durch EIA mit Antikörpern verwenden, um den Verlust der Fixierung aufzuzeigen.
Es ist auch möglich vorzusehen, die fraglichen Epitope mit Nicht-Protein-Verbindungen zu konjugieren, beispielsweise Polysacchariden und/oder Lipiden, um Lipoproteine zu bilden, die verbesserte Impfaktivitäten aufweisen; auch da ist es möglich, kovalente oder nicht-kovalente Bindungen vorzusehen.
Diese verschiedenen Arten von Verbindungen können entweder durch chemische Synthese oder auf rekombinanten Wegen erhalten werden, welche Techniken verwenden, die auf dem Gebiet der Herstellung von rekombinanten Proteinen bekannt sind.
Die Flexibilität der rekombinanten Technologien gestattet die Herstellung von Proteinen, die eine Mehrzahl von identischen oder verschiedenen Epitopen umfassen und die Aktivität des Endprodukts verbessern können. Es ist auch möglich, die Coexpression von verschiedenen Elementen vorzusehen, die in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingehen.
Gemäß einem der Aspekte der Erfindung kann das Peptid in ein Protein bekannter Struktur des HIV eingeführt werden; insbesondere können Konstruktionen, in denen das interessierende Peptid in die hypervariable Region der Schleife V3 von gp120 insertiert ist, verwendet werden.
Die Region V3 von gp120 ist die Hauptdomäne der Neutralisation von HIV-1 und eine der Hauptdeterminanten des viralen Tropismus. Folglich kann diese Art von Mutante für die Untersuchung der Neutralisation von HIV-1, die mit R7V verbunden ist, und die Modifikationen seines Wirkspektrums nützlich sein. Die hohe Variabilität der Region V3 von gp120 unter den HIV-1-Isolaten ist ein anderer Grund der Bevorzugung dieser Region. Es ist vermutet worden, daß der Ersatz der Sequenz von sieben Aminosäuren in der Region V3 höhere Chancen hat, zu einer lebensfähigen Rekominante zu führen als eine Mutation in einer anderen, konservierteren Region des Genoms von HIV-1. Das rekombinante Protein gp120/R7V kann parallel in einem zur Expression eines Proteins geeigneten System exprimiert werden, um eine große Menge an Immunogen R7V zu erhalten.
Die Verwendung von Träger-Proteinen ist nicht unerläßlich, es ist möglich, ggf. andere Trägersysteme vorzusehen. Mit "Träger-System" soll jedes Element bezeichnet werden, das es gestattet, zu einer Gesamtheit zu führen, die eine Immunantwort gegen das fragliche Peptid erzeugt oder auch gestattet, das Peptid vor einer Beseitigung insbesondere durch schnelle Proteolyse zu schützen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch Komponenten aufweisen, welche die Immunogenität von Peptiden und/oder Proteinen erhöhen, insbesondere spezifische oder nicht-spezifische Immunitätsadjuvantien, wie das Freund-Adjuvans, Polysaccaride oder äquivalente Verbindungen.
Es handelt sich um Verfahren, die auf dem Gebiet der Impfung bekannt sind.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können in irgendeiner Form verwendet werden, die mit dem gewählten Verabreichungsweg kompatibel ist, insbesondere dem injizierbaren Weg. Jedoch können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auf anderen Wegen verwendet werden, insbesondere per os oder auf Aerosol-Weg, um einen Schutz der Schleimhäute zu induzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die dazu bestimmt sind, verabreicht zu werden, um in situ die vorstehend beschriebenen Peptide und/oder Proteine zu exprimieren.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Expressionskassetten, welche es gestatten, mindestens einen kryptischen Epitop, wie vorstehend definiert, und/oder Proteine, welche diese Epitope aufweisen, oder Proteine, die sich an das fragliche Peptid, wie vorstehend definiert, kuppeln können oder äquivalente Sequenzen aufweisen, zu exprimieren.
Mit "äquivalenter Sequenz" soll eine Sequenz bezeichnet werden, die für ein äquivalentes Peptid kodiert, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Diese DNA-Expressionskassetten können natürlich direkt für eine Expression in situ verwendet werden oder verwendet werden, um ein verwendbares Peptid oder Protein zu erzeugen, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Die Impfsysteme, die DNA-Sequenzen verwenden, sind bekannt und sind bereits breit in der Literatur beschrieben.
Es handelt sich im wesentlichen um Systeme, welche die Expression des antigenen Proteins beim Menschen oder auch die Expression des antigenen Proteins in einer Zelle gestatten, welche anschließend für die Imfpung verwendet wird; wenn die transformierte Zelle eine Wirtszelle ist, die äußerlich behandelt wird, spricht man von einer Behandlung ex vivo.
Die Expressionssysteme können sehr verschiedenartig sein, es kann sich insbesondere um Systeme der Art "nackte DNA" handeln, wie sie insbesondere in den Patenten und Patentanmeldungen der Firma VICAL, WO 90/11092 beschrieben sind. In diesem Fall wird die DNA, die für das Peptid oder das Protein kodiert, welches das Peptid umfaßt, als solche injiziert; diese Injektion führt in einer gewissen Zahl von Fällen zur Expression des kodierten Proteins.
Die Informationen, die in diesen Dokumenten enthalten sind, werden ausdrücklich durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeschlossen.
Man kann auch Systeme mit "nackter DNA" verwenden, die aber ihr eigenes Expressionssystem umfassen, insbesondere um die Expression zu verbessern.
Man kann auch Systeme verwenden, die entweder durch Integration oder durch autonome Replikation die Expression begünstigen, insbesondere Systeme vom Plasmid- oder Virus-Typ.
Unter den Expressionssystemen der Peptid-Sequenz, die man erwähnen kann, sind die Systeme anzuführen, die Pockenviren, Adenoviren, Retroviren und Viren des Herpes-Typs oder andere, neuere Systeme, wie die Polioviren, verwenden.
Unter den Vektoren verwendet man vorzugsweise die Vektoren, die eine humorale Antwort und eine Antwort bei den Schleimhäuten erzeugen.
Andere Viren können verwendet werden, um Impfstoffe zu erhalten, insbesondere:
- Adenoviren, wie es in N. R. Rabinovich et al., Science, 1994, 265, 1401-1404 und den zitierten Literaturstellen beschrieben ist;
- Rotaviren, wie es von Sue E. Crowford im Journal of Virology, Sept. 1994, S. 5945-5952 beschrieben ist;
- Pockenviren, insbesondere das Kuhpocken-Virus, auch die tierischen Pockenviren, wie die Kanarienpocken, wie es in den Arbeiten von Paoletti und de Moss beschrieben ist;
- Influenza-Viren, wie es in N. R. Rabinovich et al. (1994) beschrieben ist.
Die Technologie, die es erlaubt, Polioviren als Impfvektor für verschiedene Antigene zu verwenden, ist insbesondere in Raul Andino et al., Science, 265, 1448-51 beschrieben.
Dieser Konstruktionstyp, der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, erlaubt es, Impfstoffe zu erhalten, die auf oralem Weg verwendbar sind; um dies zu bewerkstelligen, kloniert man die Sequenz, die für das oder die Peptid(e), gegebenenfalls die Trägerproteine kodiert, in einen Poliovirus, beispielsweise den abgeschwächten Sabin-Virus; es ist auch möglich, einen Virus-Cocktail zu verwenden, der für verschiedene Epitope kodiert.
Die Verwendung von Plasmiden oder Viren für die Expression von Proteinen in den Zellen eines Wirts, insbesondere eines Menschen, ist bekannt und wird nicht in Einzelheiten ausgeführt. Die speziellen Konstruktionen hängen offensichtlich vom Wirt, dem Epitop und dem in Betracht gezogenen Vektor ab.
Man kann auch zelluläre Impfstoffe verwenden, d. h., wie es beispielsweise im Rahmen der Gentherapie vorgeschlagen wird, Zellen des Patienten zu entnehmen, sie mit den Vektoren, wie vorstehend beschrieben, zu transformieren, diese dann zu reimplantieren, um die Proteine in situ zu exprimieren.
Jedoch ist dieses Verfahren im Fall einer Impfung wenig bequem. Man wird es vorziehen, Zellen zu verwenden, die in großer Zahl erhalten werden können, beispielsweise Bakterien- oder Hefezellen, die das fragliche Proteine exprimieren, beispielsweise in der Oberfläche, was in gewissen Fällen die immunogene Fähigkeit des Proteins erhöht.
Es ist beispielsweise möglich, Impfstoffe zu verwenden, die als Expressionssystem Salmonella umfassen, wie es in T. R. Fouts et al., Vaccine (1995) 13 im Druck; Tacket C. O. et al. Infect. Immun. (1992) 60, 536-541 und Hone et al., J. Chim. Invest. (1992) 90, 412-420 (für seine Bewertung beim Menschen als Impfstoff-Träger) beschrieben ist.
Dieser Impfstoff-Typ beinhaltet die Verwendung insbesondere von Bakterienzellen, welche die erfindungsgemäßen Peptide erzeugen, oder von gewissen Stämmen anderer Impfvektoren und ist in Chad P. Muller, Immunology Today, Band 15, Nr. 20, 1994, S. 458-459 beschrieben.
Die Zellen, welche die erfindungsgemäßen Peptide oder Proteine erzeugen, können als solche verwendet werden, insbesondere wenn die Proteine an der Oberfläche der Zellen exprimiert werden und wenn die Zellen nicht-toxisch oder nicht-pathogen sind (abgeschwächter oder getöteter Stamm), können aber auch verwendet werden, um die Peptide und/oder Proteine zu erzeugen, die nach Reinigung verwendet werden.
So kann es interessant sein, Bakterienzellen, aber auch Hefen oder höhere Zellen, insbesondere tierische, pflanzliche oder Insekten-Zellen, zu erhalten.
Im Fall der vorliegenden Erfindung kann man die Verwendung von Impfstoffen pflanzlichen Ursprungs vorsehen, indem man die Technologien verwendet, die insbesondere in C. J. Arntzel et al. in Vaccine 94 beschrieben sind.
Die Technologien, welche die Expression von Peptiden oder Proteinen durch zelluläre Systeme erlauben, sind bekannt, ebenso wie die Reinigungstechniken.
Wie bereits erwähnt, ist es möglich, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit Adjuvantien zu verwenden, welche die Aktivität der DNA-Sequenzen verbessern, insbesondere Komponenten, die Komplexe mit der DNA bilden, wie kationische Lipide, oder Strukturen des Liposomen- oder Mikropartikel-Typs.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, welche Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Peptide enthalten.
Natürlich erfordert die Verwendung von Zusammensetzungen auf der Basis von Antikörpern, daß diese mit der Verabreichung an ein menschliches Wesen kompatibel sind; es kann sich insbesondere um Antikörper handeln, die durch bekannte Techniken humanisiert oder direkt in situ von der DNA-Sequenz exprimiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Antikörpern, die gegen die Peptide der Erfindung gerichtet sind und das HIV-Virus neutralisieren können, insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Antiseren, die diesen Typ von Antikörpern oder Antikörper umfassen, die beispielsweise durch Immunreinigung ausgehend von den Seren erhalten wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnose, dadurch gekennzeichnet, daß man im Serum eines Patienten die Anwesenheit eines Antikörpers nachweist, der gegen einen der erfindungsgemäßen Epitope gerichtet ist.
Dieses Verfahren kann durch jede bekannte Methode zur Identifikation von Antikörpern durchgeführt werden, insbesondere den ELISA- und RIA-Methoden und allen Methoden, die davon abstammen.
Alle diese Methoden beruhen vorzugsweise auf der Fixierung der betreffenden Antikörpern auf den vorstehend beschriebenen antigenen Peptiden, dann auf dem Nachweis dieser Fixierung. Diese Diagnostik ist von beträchtlichem Interesse, in der Tat zeigen die Beispiele, daß im Fall von HIV die seropositiven Subjekte, die erfindungsgemäße Antikörper aufweisen, zu einer sehr großen Zahl nicht fortschreiten, d. h. daß sie nicht Aids entwickeln. In diesem Fall ist die Prognose sehr günstig, und man kann die schwerwiegenden Behandlungen vermeiden. Dies ist insbesondere im Fall einer Schwangerschaft wahr, wo die Anwesenheit dieser Antikörper bei der Mutter (HIV positiv) zu einer Nicht-Infektion des Neugeborenen zu führen scheint.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann durch Techniken bewerkstelligt werden, die bekannt sind, Proteinsynthese auf chemischem Weg, DNA-Synthese durch chemische Synthese oder Multiplikation durch Amplifikation vom PCR-Typ. Was die Proteine betrifft, können diese ebenfalls auf rekombinantem Weg erhalten werden, welcher die geeigneten Synthesen verwendet.
Die nachstehenden Beispiele erlauben, andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen.
In den beigefügten Figuren
- stellen die Fig. 1A und 1B die ELISAs dar, welche die Reaktivität des Serums von Kaninchen, das mit R7V-KLH immunisiert wurde, mit verschiedenen Antigenen zeigt,
- stellt die Fig. 2 den ELISA dar, der die Reaktivität des Antiserums von Kaninchen zeigt, das insbesondere mit β2m immunisiert wurde,
- stellen die Fig. 3A bis 3D den ELISA zwischen verschiedenen Antiseren und ausgewählten Peptiden dar,
- stellt die Fig. 4 den ELISA von R7V mit verschiedenen Anti-β2m-Antikörpern dar,
- stellt die Fig. 5 den ELISA von R7V-BSA und β2m mit den Anti-β2m-Antikörpern und Kaninchenseren dar.
- stellen die Fig. 6 bis 13 Diagramme dar, welche die Wirkung der Seren von verschiedenen Patienten auf die Neutralisation von verschiedenen Isolaten des Virus HIV auf MT4 und PBL zeigen.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel gestattet den Nachweis der Kaninchen-Immun-Antwort gegen ausgewählte Peptide, die mit einem Träger-Protein gekoppelt sind.
Das Peptid-Antigen 7AA wird an KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) gekuppelt und Kaninchen in Anwesenheit von komplettem Freund-Adjuvans injiziert.
Die Tiere werden in Anwesenheit von komplettem Freund-Adjuvans am Tag 0 (JO), 14 (J14), 28 (J28), 42 (J42) immunisiert, und Test-Blutentnahmen werden vor der Immunisierung an den Tagen 35, 49, 56 und 70 vorgenommen.
Die verwendeten Peptide sind: RV7-KLH, S7K-KLH und F7E-KLH.
Das Peptid R7V (RTPKIQV) ist um zwei Aminosäuren verlängert worden, um die Kupplung zu ermöglichen. Die Struktur, die als Immunogen verwendet wurde, ist RTPKIQVGY.
Die Antikörper der immunisierten Kaninchen 618 wurden durch ELISA gemessen, wobei das Peptid, das an verschiedene Träger-Proteine gekuppelt wurde, am Boden der Vertiefungen verwendet wurde (entweder an KLH, an BSA (Rinderserumalbumin) oder an MAP (Multiple Antigenic Peptide) gekuppelt). Die Diagramme stellen die erhaltenen Ergebnisse bei zwei Verdünnungen d100 und d1000, was eine Verdünnung der Seren zu 1/100 und 1/1000 ist, oder zu verschiedenen Zeiten dar.
Die ELISA-Methode wird auf die folgende Weise angewendet:

ELISA-Methode

(1) Fixierung des Antigens auf einer Platte mit 96 Vertiefungen (Immulon IV-Dynatech)

- Man verdünne das Antigen in einem Carbonat-Puffer, pH 9,6
End-(Ag) = 1 ug/ml
- Man verteile 100 ul/Vertiefung, was 100 ng/Vertiefung ist
- Man inkubiere 2 h bei 37ºC oder eine Nacht bei 4ºC (in feuchter Atmosphäre).

(2) Waschungen

- 5 Waschungen mit einer 0,05%igen PBS/Tween 20-Lösung

(3) Sättigung der Vertiefungen

- Man verteile 300 ul/Vertiefung einer 10%igen Lösung von PBS/Pferde- (oder Rinder-) Serum
- Man inkubiere 1 h bei 37ºC (in feuchter Atmosphäre).

(4) Waschungen (identisch mit Punkt (2))

(5) Inkubation mit spezifischen Antiseren

- Man verdünne das Serum (1/50, 1/100, 1/1000) mit PBS-10% Pferdeserum.
Man verteile 100 ul/Vertiefung und inkubiere 1 h bei 37ºC (in feuchter Atmosphäre).

(6) Waschungen (identisch mit Punkt (2))

(7) Inkubation mit zweitem Antikörper (Schafs-Ig-Anti-Human-Ig, gekuppelt an Peroxidase)

- Man verdünne den zweiten Antikörper zu 2/1000 in PBS/10% Pferdeserum.
- Man verteile 100 ul/Vertiefung und inkubiere 1 h bei 37ºC (in feuchter Atmosphäre).

(8) Waschungen (identisch mit Punkt (2))

(9) Entwicklung durch OPD

- Man löse 10 mg OPD in 25 ml Phosphocitrat-Puffer (0,1 M, pH 5,5)
- Man gebe im letzten Moment 10ul H&sub2;O&sub2; dazu
- Man verteile 100 ul/Vertiefung und inkubiere 30 min im Dunkeln bei Umgebungstemperatur (kann bei 405 nm abgelesen werden)
- Man beende der Reaktion mit 50 ul 12,5%iger H&sub2;SO&sub4;.

(10) Man lese bei 492 nm ab.

Die Fig. 1A und 1B zeigen die Ergebnisse, die mit dem Kaninchen 618, das mit R7V-KLH immunisiert worden war, erhalten wurden.
Eine Anti-R7V-Reaktivität trat klar als Unterschied zwischen R7V-BSA und BSA auf, im Vergleich R7V-KLH und KLH, wo die Anti-R7V-Reaktivität durch die Anti-KLH-Antwort des Serums maskiert ist. Man bemerke, daß die Anti-R7V-Reaktivität am Tag 68 (J68) stärker ist als am Tag 132 (J132).
Die Spezifität der Reaktion ist größer, wenn man das Protein BSA verwendet.
Die Fig. 2 zeigt noch ein gutes Erkennen des Ursprungsproteins, β2m.
Die Anti-Seren der immunisierten Kaninchen zeigen eine starke Reaktivität mit R7V-BSA sowie mit den Ursprungspeptiden, die als P1, P4 und P9 bezeichnet wurden und verwendet wurden, um R7V zu selektieren, auch wenn die Reaktivität mit P1 schwächer ist (Fig. 3A-3D).
Die Fig. 4 demonstriert, daß die Erkennung von R7V durch B1G6 und B2G2.2 eine Funktion der Dosis ist und daß die Erkennung von C21.48 weniger gut ist, weshalb man vorzugsweise die mAk B1G6 und B2G2.2 zur Selektion von äquivalenten Peptiden verwendet.
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß der Epitop R7V, der an BSA gekuppelt ist, eine gute Immunantwort erzeugen kann.

BEISPIEL 2

Einführung von R7V in die Schleife V3 von gp120 von HIV-1 LAV

Konstruktion des rekombinanten rovirus

Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Sequenz R7V in die dritte variable Region V3 von gp120 von HIV-1 LAV einzuführen.

Methoden

Es wurden chimäre rekombinante Viren durch Mutagenese konstruiert, die durch PCR gesteuert wurde. Zwei Konstruktionen auf der Basis der Sequenz R7V und HIV-1 LAV sind erhalten worden, in denen sieben Aminosäuren der Region V3 von gp120 durch die Sequenz R7V ersetzt worden sind. Die Positionen der mutierten Sequenzen sind der folgenden Tabelle gezeigt.
Das Fragment EcoRI&sub5;&sub2;&sub7;&sub8;-XhoI&sub8;&sub4;&sub0;&sub1; von HIV-1 LAV, das in den Vektor Bluescript kloniert ist, wird als Matrize für die späteren Konstruktionen verwendet. Im ersten Schritt wurden die DNA-Fragmente, die von Primern flankiert sind, welche die Restriktionsstelle BglII an einem Ende und die Nukleotidsequenz, die für R7V kodiert, am anderen Ende enthalten, für die Konstruktionen RPL und PLG durch PCR- Amplifikation synthetisiert. Die verwendeten Mutagenese-Oligonukleotide bestanden aus einem Primer (+) ACACCAAAGATACAAGTTGTTACAAATAGGAAAA und einem Primer (-) TTGTATCTTTGGTGTTCTCTGGATCCGGATACTTT für die Konstruktion RPL und einem Primer (+) CGTACACCAAAAATCCAGGTCCAGAGAGGACCA und einem Primer (-) GATTTTTGGTGTACGCGTATTGTTGTTGGGTCT für die Konstruktion PLG. Im zweiten Schritt wurden die beiden PCR-Produkte für jede Konstruktion gemischt und amplifiziert, indem man die Primer verwendete, welche die Restriktionsstellen BglII enthielten. Die Fragmente RPL und PLG wurden mit dem Enzym BglII gespalten und in den Vektor Bluescript insertiert, der das Fragment EcoRI&sub5;&sub2;&sub7;&sub8;-Xhol&sub8;&sub4;&sub0;&sub1; von HIV-1 LAV enthielt und mit BglII gespalten war. Außer der Sequenez R7V enthielten die Amplifikationsprimer Modifikationen in der Nukleotidsequenz, die zum Auftreten von neuen Restriktionsstellen BamHI und MluI in den Konstruktionen RPL beziehungsweise PLG ohne zusätzliche Modifikationen in der Aminosäure-Sequenz führten. Die neuen Restriktionsstellen wurden verwendet, um die mutierten Sequenzen zu durchmustern. Schließlich wurden die Fragmente EcoRI&sub5;&sub2;&sub7;&sub8;-XhoI&sub8;&sub4;&sub0;&sub1; von HIV- 1 LAV, welche die Konstruktionen RPL und PLG enthielten, durch homologe Rekombination in das Plasmid pNL4-3 insertiert, indem man die Restriktionsstellen EcoRI und XhoI verwendete. Die Konstruktionen wurden mittels Analyse durch Restriktionsenzym verifiziert.

Transfektion von eukaryontischen Zellen

Plasmid-DNA von 200 ml E. coli TG1 wurde mit dem Kit Midipreparation Qiagen extrahiert und gereinigt. Die semikonfluenten Kulturen von COS-Zellen (= 4 · 10&sup6;) wurden mit 7 ug Plasmid durch die Copräzipitationstechnik mit Calcium transfiziert. Am folgenden Tag wurden die Monoschichten der Zellen mit Glycerin behandelt und in Cokultur mit einer Zellinie CEM oder mit primären Blutlymphocyten gegeben, welche mit PHA (PBL, 10&sup6; Zellen/ml) aktiviert waren und von einem gesunden Donor abstammten. Die CEM- oder PBL-Zellen wurden zwei Tage später von den COS in Monoschichten abgetrennt und getrennt kultiviert.

Herstellung des Virus

1 ml freier zellulärer Überstand, der ausgehend von den COS- oder PBL-Zellen erhalten wurde, wurde ultrazentrifugiert, und das sedimentierte Virus wurde durch die Standardreaktion der Reversen Transcriptase kontrolliert. In gewissen Experimenten wurde 100 um Zell-Überstand auf die Produktion des Proteins p24gag getestet. Transfektion der COS-Zellen und Cokultur mit den CEM
4 · 10&sup6; COS-Zellen wurden mit 7 ug Plasmid mit der Copräzipitationstechnik mit Calcium transfiziert. Die CEM-Zellen wurden dann in einem Verhältnis von 4 · 10&sup5; Zellen/ml in einem Endvolumen von 5 ml dazugegeben. Nach zwei Tagen Cokultur wurden die CEM in Suspension von den COS in Monoschicht abgetrennt. Die Aktivität der Reversen Transcriptase in den Kulturüberständen der CEM ist in cpm/ml angegeben. Infektion von PBL
2,5 · 10&sup6; PBL wurden durch die Zellüberstände des 19. Dezembers 1994, die nach Transfektion erhalten wurden (Tabelle 1), im Verhältnis von 5000 cpm/10&sup6; PBL infiziert. Am Tag 17 nach der Infektion wurden 2 · 10&sup6; neu isolierte PBL zu 2 · 10&sup6; infizierte PBL gegeben (RPL 1 + PBL, PLG 2 + PBL). Die Aktivität der reversen Transkriptase in den Kulturüberständen ist in cpm/ml angegeben. Transfektion von COS-Zellen und Cokultur mit PBL
4 · 10&sup6; COS-Zellen wurden mit 7 ug Plasmid durch die Copräzipitationstechnik mit Calcium transfiziert. Die PBL-Zellen, die mit PHA stimuliert waren, wurden dann im Verhältnis von 10&sup6; Zellen/ml in einem Endvolumen von 5 ml dazugegeben. Nach zwei Tagen Cokultur wurden die PBL in Suspension von den COS in Monoschicht abgetrennt. Die Aktitivät der Reversen Transcriptase in den Kulturüberständen der PBL ist in cpm/ml angegeben.

BEISPIEL 3

Ziel dieses Beispiels ist es, ausgewählte Peptide zu verwenden, um im Serum von Patienten Antikörper, die potentielle Inhibitoren von HIV sind (Anti-β2-Mikroglobulin-Antikörper) nachzuweisen und insbesondere die Anwesenheit von schützenden Antikörpern im Serum von nicht fortschreitenden Patienten aufzuzeigen. Mit "nicht fortschreitenden Patienten" oder "NP" bezeichnet man Patienten, die seit mehr als 10 Jahren seropositiv sind und nicht Aids entwickelt haben, insbesondere diejenigen, deren T4-Zellen-Gehalt normal ist.

Material und Methode

1/Die verwendeten Peptide wurden synthetisiert und durch Neosystem (Frankreich) an BSA gekuppelt.
2/Die Seren der Patienten werden vor ihrer Verwendung in ELISA bei -20 oder -80ºC aufbewahrt.
3/Die zweiten Anti-Human- oder -Kaninchen-Ig-Antikörper wurden von Amersham (Frankreich) erhalten. OPD stammt von Sigma (Frankreich).

ELISA mit Seren von seropositiven Patienten

1/Anwesenheit von Anti-R7V-Antikörpern im Serum der Patienten (Titer 1/100 und 1/1000).
2/Unter 46 getesteten Seren von nicht fortschreitenden Personen (keine Virusreplikation in Kultur) sind 16 Seren für R7V positiv (37%), 27 bleiben bei 1/100 negativ (63%) und drei Seren sind nicht bestimmbar (Tabelle 1).
3/Unter 46 nicht fortschreitenden Patienten wurden 34 auf den Nachweis von Anti-Peptid- Antikörpern getestet: R7V, P1, P4, P9. 14 Seren sind für mindestens ein Peptid positiv (51,8%) und 13 bleiben bei 1/100 negativ. Vier Seren konnten nicht als positiv oder negativ klassifiziert werden (Tabelle 2). Tabelle 1: ELISA R7V mit NP-Seren
Pos. = Positiv; Neg. = Negativ Tabelle 2: ELISA von Peptiden mit NP-Seren
(?) Nicht bestimmt.
Pos. = Positiv; Neg. = Negativ

BEISPIEL 4

Die folgenden Experimente gestatteten, bei nicht fortschreitenden Patienten Antikörper nachzuweisen, die verschiedene Isolate von HIV, insbesondere BRU und NDK, neutralisieren, wobei dieselben Patienten Anti-R7V-Antikörper aufwiesen. Dies ermöglicht es, eine gute Korrelation zwischen dem neutralisierenden und gegen 111 V schützenden Charakter der Antikörper, die gemäß den erfindungsgemäßen Behandlungen erzeugt wurden, aufzuzeigen.

Material und Methoden

Kultur von MT4-Zellen

Die MT4-Zellen sind immortalisierte Zellen (CD4+), die gegenüber der cytopathogenen Wirkung von HIV-1 sehr empfindlich sind und vom Ursprung einer T-Leukämie bei Erwachsenen abstammen. Die Zellen werden in Anwesenheit von RPMI-Medium kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum, 1% Glutamin und 1% Antibiotikum ergänzt ist.

Kultur von PBL

Die Lymphozyten werden drei Tage lang mit Phytohämagglutinin P (PHA P) in vollständigem RPMI-Medium stimuliert, das 10% fötales Kälberserum, 1% Glutamin, 1% Antibiotikum, 2 ug/ml Polybrene, 20 IE/ml Interleukin 2 (IL-2) umfaßt. Die Zellen werden anschließend gewaschen und im Verhältnis von 106 Zellen/ml im kompletten RPMI-Medium kultiviert.

Neutralisationstests

Die Seren werden vor ihrer Verwendung in den Tests dekomplementiert und filtriert.

Neutralisation auf MT4

Die Seren werden in Platten mit 24 Vertiefungen (Costar) in einem Gesamtvolumen von 0,8 ml verdünnt. Die Viren HIV-1 BRU (100 ul einer 10&supmin;³-Verdünnung der Vorratslösung) oder HIV-1 NDK (100 ul einer 10&supmin;³- Verdünnung der Vorratslösung) werden dazugegeben, und die Mischung wird 1 h 30 bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Die Zellen werden anschließend im Verhältnis von 200 ul/Vertiefung und 1,5 · 10&sup6; Zellen/ml verteilt. Drei Tage nach der Infektion werden die Kulturen mit 10%igem RPMI- Medium verdünnt (1/3). Die Infektion der Zellen mit dem Virus HIV-1 wird jeden Tag unter dem Mikroskop durch Beobachtung der Bildung von Synzyten (mehrkernigen Riesenzellen) verfolgt. Die Neutralisation der Viren durch die verschiedenen Seren wird durch die Abwesenheit (-) von Synzyten oder sehr wenige Synzyten (+/-) im Vergleich zu der Bildung von Synzyten, die durch HIV-Urtypen (+) induziert werden, definiert.

Neutralisation auf PBL

Die Seren (50 ul) werden mit dem Virus HIV-1 BRU (50 ul einer 2 · 10&supmin;¹-Verdünnung der Vorratslösung) in Platten mit 96 Vertiefungen gemischt und 1 h 30 bei 37ºC und 5% CO&sub2; belassen. Die Mischung wird dann zu 106 PBL in Platten mit 24 Vertiefungen (Costar) gegeben, und die Kultur wird drei Tage bei 37ºC und 5% CO&sub2; gehalten. Die Zellen werden anschließend gewaschen und im Verhältnis von 106 Zellen/ml in 25 cm³-Kulturfläschchen kultiviert. Die Erzeugung des Virus wird alle drei oder vier Tage durch die Dosisbestimmung der enzymatischen Aktivität der "Reversen Transcriptase" verfolgt.

Dosisbestimmung der "Reverse Transcrintase" (RT)-Aktivität

1 ml zentrifugierter (1500 U/min. RT, 10 min) Kulturüberstand wird 100fach durch Ultrazentrifugation (95000 U/min. 4ºC, 5 min) auf einem Rotor TL 100 (Beckman) konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 10 ul NTE-0,1% Triton X100-Puffer wieder aufgenommen. Die enzymatische Reaktion wird in 50 ul der folgenden Reaktionsmischung durchgeführt: 50 mM Tris pH 7, 8; 20 mM MgCl&sub2;; 20 mM KCl; 2mM Dithiothreit; Oligo-dT 12-18, 0,25 OD/ml; Poly-rA, 0,25 OD/ml und 2,5 uCl ³HdTTP. Nach 1 h Inkubation bei 37ºC werden die Reaktionsprodukte mit 20%iger Trichloressigsäure gefällt, durch Millipore-Membranen filtriert, und die Radioaktivität β wird gemessen. Die Ergebnisse sind als CMP/ml ausgedrückt.

Bericht über Neutralisationsexperimente

Antikörper, die gegen das Peptid R7V gerichtet sind, wurden mittels eines spezifischen ELISA, der von der Anmelderin entwickelt wurde, in den Serien von HIV-positiven Patienten nachgewiesen. Man suchte in diesen Seren nach der Existenz einer neutralisierenden Aktivität, die gegen die beiden Stämme der Virus-Urtypen HIV-1 BRU und NDK gerichtet war. Es wurden zwei Neutralisationstests durchgeführt, einer auf einer Zellinie MT4 (gefolgt von der Bildung von Synzyten) und der andere auf gesunden Lymphozyten von peripherem Blut, PBL (gefolgt von der enzymatischen Aktivität "Reverse Transcriptase").

Ergebnisse, die auf MT4 erhalten wurden

Unter den 13 getesteten Patienten wurde bei sechs derselben eine neutralisierende Serumaktivität aufgezeigt (Tabellen 3 bis 5):
- zwei Seren neutralisieren HIV-1 NDK
ZUM AM (ELISA positiv)
COC PH (ELISA negativ)
- zwei Seren neutralisieren HIV-1 BRU:
MEC EV (ELISA positiv)
OUA VE (ELISA negativ)
- zwei Seren neutralisieren HIV-1 BRU und HIV-1 NDK:
SAU CH (ELISA positiv)
BUB JE (ELISA positiv)

Ergebnisse, die auf PBL erhalten wurden

Das Experiment wurde mit den Seren MEC EV, SAU CH und BUB JE (1/50) sowie mit einem seronegativen Serum durchgeführt. Bei dem Serum SAU CH sowie bei dem seronegativen Serum wurde keinerlei neutralisierende Aktivität nachgewiesen. Dagegen wurde eine neutralisierende Aktivität gegen die beiden Virus-Urtypen HIV-1 BRU und NDK bei den Seren MEC EV und BUB JE nachgewiesen (Fig. 6 bis 13)

BEISPIEL 5

Methode, die es gestattet, äquivalente Peptide aufzuzeigen.

Wirkung von ausgewählten Peptiden auf die Neutralisation von HIV-1 NDK durch den monoklonaren Anti-β2-Antikörper B1G6

Protokoll

Die Peptide werden bei einer Konzentration von 100 ug/ml oder 50 ug/ml (40 ul oder 20 ul der Mutterlösung zu 5 mg/ml) mit 5 ug/ml B1G6 (10 ul einer Mutterlösung zu 1 mg/ml) in einem Gesamtvolumen von 110 ul zwei Stunden in Röhrchen auf einem Wasserbad bei 37ºC unter sanftem Rühren präinkubiert. Dann wird HIV-1 NDK dazugegeben (100 ul einer Verdünnung zu 2 · 10&supmin;&sup4; einer Mutterlösung), und die Rörchen werden eine Stunde bei 37ºC auf einem Wasserbad inkubiert. Die Röhrchen werden anschließend auf zwei aufgeteilt und jeweils 100 ul werden zu 106 PBL auf einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Die Zellen werden drei Tage bei 37ºC unter einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; kultiviert. Am Tag 3 werden die Zellen gewaschen, und während mindestens 20-25 Tagen in einem 25 cm³-Kolben kultiviert und vermehrt. Die Erzeugung des Virus wird alle drei oder vier Tage durch Dosisbestimmung der Reversen Transcriptase (RT) verfolgt.

Ergebnisse

Die Peptide R7V und F7E können die Neutralisationswirkung des monoklonaren Antikörpers B1G6 auf die Erzeugung von HIV-1 NDK durch die PBL aufheben. Die Sequenz des Peptids R7V wurde modifiziert, und unter den sechs neuen Peptiden (185, 186, 187, 188, 189, 190) haben drei die Aufhebungswirkung von R7V verloren: Die Peptide 185,189 und 190. Tabelle 3 Tabelle 4a Tabelle 4b Tabelle 5a Tabelle 5b

BEISPIEL 6

Korrelation zwischen der Anwesenheit von Anti-R7V-Antikörpern und dem Fortschreiten der Krankheit

Es werden Serumproben von 90 mit HIV infizierten Patienten verwendet. Sie waren wie folgt aufgeteilt: 28 seit mehr als drei Jahren symptomlose Patienten, 24 Langzeit-Überlebende und 38 an Aids erkrankte. Eine Kontrollgruppe, die aus 69 freiwilligen seronegativen Donoren bestand, wurde von der Blutbank erhalten.
Die Zählung der Lymphozyten wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und Analyse durch Epic Profile (Coultronics, Margency, Frankreich) vorgenommen. Die Serumspiegel von β2m wurden durch Immundiffusion gemessen (El Nanorid Kit). Die Spiegel des Antigens p24 wurden durch das Kit zum Nachweis von p24 von Coulter (Coultronics, Margency, Frankreich) getestet.
Die Serumkonzentration an Anti-R7V-Antikörpern werden durch ELISA nachgewiesen. Die Ergebnisse sind als Konzentration des Äquivalents von monoklonalen Antikörpern B1G6 in ug/ml ausgedrückt.

Neutralisationstest

Die Humanseren werden dekomplementiert und auf 200 ug/ml oder 100 ug/ml an B1G6- Äquivalent verdünnt. 50 ul HIV, die 100 TCID&sub5;&sub0; enthalten, werden mit 50 ul verdünntem Serum (Gesamtvolumen 100 ul) in einer Platte mit 96 Vertiefungen bei 37ºC und 5% CO&sub2; 90 Mintuten lang präinkubiert. Die Reaktionsmischung, welche die Viren und das Serum enthält, wird nach Zugabe von 8 · 10&sup4; MT4-Zellen zweimal verdünnt (Endverdünnung der Seren 1/120 bis 1/20), und drei Tage nach der Infektion erneut dreimal. Die fusionserzeugende Wirkung von HIV in den Linien MT4, d. h. die Bildung von Synzyten als Indikator der Infektion durch das Virus, wird sieben Tage lang in den Kulturvertiefungen verfolgt. Die Reverse Transcriptase-Aktivität wird sieben Tage nach der Infektion in 400 ul Überstand gemessen, der keine Zelle aufweist.
Der Mittelwert der Anti-R7V-Antikörper-Spiegel wird bei jedem Patienten und bei jeder Gruppe berechnet. Die Seren von Personen, die mit HIV infiziert sind, enthalten Anti-R7V-Antikörper, und die HIV-seropositiven Seren zeigen signifikant höhere Konzentrationen an Anti-R7V-Antikörper als jene der seronegativen Seren. Die Anti-R7V-Antikörper-Spiegel, ausgedrückt als B1G6-Äquivalent, verteilen sich über 35 bis 2558 ug/ml (n = 90) und über 27 bis 1790 ug/ml (n = 69) in den mit HIV infizierten Gruppen beziehungsweise den nicht mit HIV infizierten Gruppen.
Anschließend wurde die Gruppe der HIV-Patienten gemäß ihrem klinischen Status in drei Kategorien eingeteilt: nicht-fortschreitende Gruppe (NP), die aus Patienten zusammengesetzt war, die seit einem langen Zeitraum seropositiv für HIV sind und seit mehr als drei Jahren ohne Aids-Symptome im Labor verfolgt wurden; die Gruppe der Langzeit-Überlebenden (LTS) ist aus Personen zusammengesetzt, die seit langer Zeit Aids haben, und eine fortschreitende Gruppe, die aus Personen zusammengesetzt ist, die mit einer schlechten Prognose an Aids leiden.
Die Anti-R7V-Antikörper sind in der symptomlosen Gruppe signifikant erhöht (von 91 bis 2558 ug/ml), verglichen mit der fortschreitenden Gruppe (von 35 bis 630 ug/ml) (p = 0,001), während man keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu der LTS-Gruppe beobachtet (59 bis 1864 ug/ml). Die gleiche LTS-Gruppe weist höhere Anti-R7V-Spiegel auf als die fortschreitende Gruppe (p = 0,004). Im Vergleich mit gesunden Subjekten gibt es keinen Unterschied des Anti-R7V-Antikörper-Spiegels in der fortschreitenden Gruppe.
In der fortschreitenden Gruppe kann eine deutliche Unterscheidung als Funktion des Anti-R7V- Antikörper-Spiegels zwischen den Subjekten, die kurze Zeit nach ihrem letzten Besuch im Labor verschieden (35 bis 508 ug/ml, n = 23), und jenen, die noch leben, aber krank sind (77 bis 586 ug/ml, n = 14) (p < 0,03) getroffen werden.
Eine Studie, die im Längsschnitt verfolgt wurde, konnte keine Korrelation zwischen den Anti- R7V-Antikörper-Spiegeln und anderen biologischen Parametern, wie der Gesamtzahl der Lymphozyten, den CD4-, CD8-Zellen, p24 und β2m, die zirkulieren, aufgestellt werden.
Es schien, daß der R7V-Spiegel im Laufe der Zeit bei NP-Patienten stabil ist, während er bei den LTS-Patienten schwankt.
Um den ELISA-Test mit einer biologischen Aktivität des Serums des Patienten zu verbinden, wurde ein Neutralisationstest mit zwei unähnlichen Viren, dem Stamm HIV-1 LAV und dem hoch cytopathogenen HIV-1 NDK, auf MT4-Zellen als Indikator durchgeführt. Die Verdünnungen des Serums sind so angepaßt worden, daß 5 ug B1G6-Äquivalent in der Neutralisationsmischung erhalten wurden. Diese Konzentration war als optimal für die Neutralisation der Infektion durch die Antikörper B1G6 bestimmt worden. Wie aus der Tabelle 5 ersichtlich ist, verhindern 17 der 18 ausgewählten Seren die Infektion der MT4-Zellen sowohl mit NDK als auch mit LAV. Um zu 5 ug BIG6-Äquivalent in der Kultur zu gelangen, erforderten 13 der 18 getesteten Seren eine Verdünnung auf weniger als 1/50. Um unspezifische Aktivitäten aufgrund von eventuellen Serum-Komponenten auszuschalten, wurden diese Seren mit einem geringen Gehalt an B1G6-Äquivalent auf 1/100 verdünnt und im Neutralisationstest verwendet. Die Menge an B1G6-Äquivalent in der Kultur lag dann unterhalb von 5 ug (von 2,5 ug/ml bis 0,3 ug/ml). Neun der 14 Seren (64%) neutralisierten noch bei einer Verdünnung auf 1/100 die beiden HIV-Stämme LAV und NDK. Drei Seren von gesunden Donoren, die als Kontrollen verwendet wurden, zeigten keinerlei neutralisierende Aktivität. Tabelle 5

LISTE DER SEQUENZEN

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) HINTERLEGER:
(A) NAME: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
(B) STRASSE: 101, RUE DE TOLBIAC
(C) STADT: PARIS
(D) STAAT ODER PROVINZ: 75013
(E) LAND: FRANKREICH
(F) POSTLEITZAHL: 75013
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: IMPFSTOFF GEGEN KRANKHEITSERREGER, ZUSAMMENSETZUNG ZUR BEHANDLUNG UND VORBEUGUNG VON HIV- INFEKTIONEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 22
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) TRÄGERART: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release#1.0,Version#1.30 (EPA)

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 1:

(1) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 2:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 3:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 4:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 5:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 6:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 7:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 8:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 9:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 10:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 11:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 12:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 13:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 14:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 14:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 15:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 16:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 16:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 17:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 17:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 18:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 18:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 19:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 19:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 20:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 21:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 21:

(2) INFORMATIONEN FÜR DIE SEQ ID NO: 22:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 22: LEGENDE DER FIGUREN LEGENDE DER Fig. 1A LEGENDE DER Fig. 1B

LEGENDE DER Fig. 2

ELISA mit Kaninchen-Antiserum gegen R7V oder β2m
Kaninchen 618 (Immunisierung mit R7V-KLH) Serum-Verdünnung 1/100

LEGENDE DER Fig. 3A

ELISA mit dem Kaninchen-Antiserum auf Vertiefungen, die mit Peptid ausgekleidet sind

LEGENDE DER Fig. 3B

ELISA mit Seren von immunisierten Kaninchen

LEGENDE DER Fig. 3C

ELISA mit Seren von immunisierten Kaninchen

LEGENDE DER Fig. 3D

ELISA mit Seren von immunisierten Kaninchen

LEGENDE DER Fig. 4

ELISA mit mAk B1G6, C21.43, B2G2.2 gegen R7V

LEGENDE DER Fig. 5

ELISA FÜR R7V-BSA ODER β2m

LEGENDE DER Fig. 6

NEUTRALISATION VON HIV-1 BRU-1 DURCH DAS SERUM MEC EV (1/50) AUF PBL
-Δ- MEC EV 50
-Δ- MEC EV 50'
-- BRU
-- BRU'

LEGENDE DER Fig. 7

NEUTRALISATION VON HIV-1 BRU-1 DURCH DAS SERUM BUB JE (1/50) AUF PBL
-Δ- BUB JE 50
-Δ- BUB JE 50'
-- BRU
-- BRU'

LEGENDE DER Fig. 8

WIRKUNG DES SERUMS SAU CH (1/50) AUF DIE ERZEUGUNG VON HIV-1 BRU-1 AUF PBL
-Δ- SAU CH 50
-Δ- SAU CH 50'
-- BRU
-- BRU'

LEGENDE DER Fig. 9

WIRKUNG EINES SERUMS EINES HIV-PATIENTEN AUF DIE ERZEUGUNG VON HIV-1 AUF
-Δ- SNS
-Δ- SNS'
-- BRU
-- BRU'

LEGENDE DER Fig. 10

NEUTRALISATION VON HIV-1 NDK DURCH DAS SERUM MEC EV (1/50) AUF PBL
-Δ- MEC EV 50
-Δ- MEC EV 50'
-- NDK 5-4

LEGENDE DER Fig. 11

NEUTRALISATION VON HIV-1 NDK DURCH DAS SERUM BUB JE (1/50) AUF PBL
-Δ- BUB JE 50
-Δ- BUB JE 50'
-- NDK 5-4

LEGENDE DER Fig. 12

WIRKUNG DES SERUMS SAU CH (1/50) AUF DIE ERZEUGUNG VON HIV-1 NDK AUF PBL
-Δ- SAU CH 50
-Δ- SAU CH 50'
-- NDK 5-4

LEGENDE DER Fig. 13

WIRKUNG EINES SERUMS EINES HIV-PATIENTEN AUF DIE ERZEUGUNG VON HIV-1 NDK AUF PBL
-Δ- SN5 50
-Δ- SN5 50'
-- NDK 5-4

Claims

1. Vakzine, bestimmt zur Behandlung und/oder Verhütung von Krankheiten infektiösen Ursprungs, wobei das infektiöse Agens bei seinem Multiplikationszyklus mindestens eine intrazelluläre Phase beim Wirt aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen kryptischen Epitop eines zellulären Elements umfasst, der von einem intrazellulären infektiösen Agens bei seinem Durchtritt zum Äußeren der Zelle mitgenommen wird und der durch das infektiöse Agens enthüllt wird.

2. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das infektiöse Agens ein intrazellulärer Parasit oder ein komplexes Virus ist.

3. Vakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus aus HIV, CMV und HPV ausgewählt ist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung, bestimmt zur Behandlung oder Verhütung von HIV- Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens ein Peptid umfasst, welches den Sequenzen ID Nr.: 1 bis 22 entspricht.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an ein Trägersystem geknüpft ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersystem aus einem oder mehreren Proteinfragmenten besteht, die durch eine Peptidbindung an das äußerste N- oder Cterminale Ende des Peptids geknüpft sind.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersystem durch eine nicht-peptidische Bindung an das Peptid gebunden ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die Sequenz R7V aufweist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie mehrere Peptide umfasst.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersystem aus Albuminen, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) und MPA (Multiple Antigenic Peptide) ausgewählt ist.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie darüber hinaus mindestens ein nicht-spezifisches Immunadjuvans umfasst.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, bestimmt zur Behandlung und Verhütung von HIV- Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine DNS-Sequenz umfasst, welche für ein Peptid gemäß einer der Sequenzen ID Nr.: 1 bis 22 kodiert.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Sequenz die Sequenz vorangeht, welche ihre Expression in einer Wirtszelle sicherstellt.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS-Sequenz durch einen Expressionsvektor getragen wird.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor in autonomer Replikation vorliegt.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor ein Vektor mit Chromosomenintegration ist.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor ein Bakterienplasmid ist.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor aus dem Ganzen oder einem Teil eines defekten und/oder nicht-pathogenen Virus aufgebaut ist.

19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid in einer Wirtszelle exprimiert wird.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine eukaryotische oder pflanzliche Zelle ist.

21. Verwendung eines Antikörpers, der gegen einen Peptid-Bestandteil einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 11 gerichtet ist, um ein Medikament herzustellen, das für die Behandlung von AIDS bestimmt ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Antikörper, der gegen einen Peptid-Bestandteil einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 11 gerichtet ist.

23. Verfahren zur Diagnostik von Patienten, deren Krankheit nicht fortschreitet, dadurch gekennzeichnet, dass man durch einen immunologischen Test die Anwesenheit eines Antikörpers nachweist, der gegen einen Peptid-Bestandteil einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 11 gerichtet ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologische Test ein ELISA- oder RIA-Test ist.