DE69117965T2

DE69117965T2 - Peptide, welche hiv-retroviren-hemmende antikörper induzieren, sowie gegen diese peptide gerichtete antikörper

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Publication number: DE69117965T2
Application number: DE69117965T
Authority: DE
Inventors: Elmostafa Bahraoui; Danielle Berneman; Alain Blanchard; Solange Chamaret; Denise Guetard; Luc Montagnier; Rietschoten Jurphaas Van
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2011-09-28
Also published as: EP0550691B1; ES2087311T3; GR3020185T3; CA2092546A1; EP0736542A1; ATE135407T1; WO1992006199A3; WO1992006199A2; EP0550691A1; DK0550691T3; DE69117965D1

Description

Die Erfindung betrifft Peptide, die die Infektiosität eines Retrovirus des Typs HIV inhibieren oder verringern, und gegen diese Peptide gerichtete Antikörper. Im Folgenden umfaßt die Bezeichnung "Peptide" gleichermaßen sämtliche Peptide oder Polypeptide, natürliche oder synthetische, Protein oder Polypeptidfragmente, die gegebenenfalls Substitutionsgruppen tragen, die für diejenigen Substitutionen charakteristisch sind, die man bei bestimmten Strukturproteinen findet, beispielsweise Glykosylierungsgruppen, oder sämtliche Peptide, bei denen eine Aminosäuresubstitution in der Sequenz die Aktivität des Peptids, wie sie in der Erfindung beschrieben ist, im wesentlichen nicht modifiziert.
Von der Erfindung umfaßt sind sämtliche Peptide, deren Sequenzen von Aminosäuren (oder Aminosäuresequenzen) von Proteinen von Mycoplasmen abstammen, sowie die Aminosäuresequenzen, die die genannten Peptide enthalten und die in vivo oder in vitro (hinsichtlich der Verfahren zur in vitro-Produktion von Antikörpern kann Bezug genommen werden auf die Arbeiten von Pluckthun et al., beschrieben in Science 1988, 240, S. 1038) die Produktion von Schutzantikörpern induzieren können, die in vitro die Infektiosität von HIV inhibieren oder verringern können, insbesondere die Entwicklung der Infektion von T4-Lymphozyten durch HIV verringern können im Vergleich zu der Entwicklung der Infektion, die in Testkulturen in Abwesenheit dieser Peptide oder deren spezifischer Antikörper beobachtet wird, ja sogar diese unter den im weiteren beschriebenen experimentellen Bedingungen vollständig inhibieren können. Diese Verringerung der Infektion wird beispielsweise anhand der entsprechenden Verringerung der quantitativen Anteile an reverser Transkriptase oder von Protein p24/p25 gag, das im Falle einer Infektion mit HIV-1 synthetisiert wird, beurteilt.
Die Bezeichnüng HIV entspricht der Abkürzung des englischen Ausdrucks "Human immuno-deficiency virus" (humanes Immundefizienzvirus oder "H1V"), wie sie in Nature, 1988, Band 321, 5. 10 (COFFIN, J. et al.) definiert ist.
Mehrere Autoren haben gezeigt, daß die Peptide von Mycoplasma pneumoniae durch Antikörper von an Pneumonien erkrankten Patienten erkannt werden (J. din. Microbiology, 1990, 28(6), S. 1194-1197, Jacobs E. et al.), aber die beschriebenen Sequenzen geben keinerlei Hinweis auf eine Fähigkeit der gegen sie gerichteten Antikörper, die Infektion durch HIV zu inhibieren.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch Aminosäuresequenzen gekennzeichnet, die Sequenzen entsprechen, die in Proteinen von Mycoplasmen enthalten oder von diesen abgeleitet sind, wobei sämtliche davon ihre Fähigkeit beibehalten haben, die Synthese von Antikörpern zu induzieren, die in vitro die Infektion von T- Lymphozyten oder anderen für HIV permissiven zelltypen durch HIV-1 oder HIV-2 inhibieren.
Vorzugsweise weisen die Peptide einen Prozentsatz an Isologie (oder konservativer Substitution) von mindestens 60% zu Aminosäuresequenzen der aus HIV stammenden Proteine auf.
Bevorzugte Peptide der Erfindung umfassen 5 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 8 bis 15 Aminosäuren, die vorzugsweise den obengenannten Prozentsatz an Isologie zu von einem HIV-Protein, insbesondere dem gag-Protein, den Glykoproteinen der Hülle oder ferner dem nef-Protein eines HIV (Tabelle 1) stammenden Aminosäuresequenzen aufweisen.
In Anbetracht der genetischen Variabilität der HIV ist es unmittelbar einleuchtend, daß die bevorzugten Peptide diejenigen sind, die einen Prozentsatz an Isologie von mindestens 60%, sogar von 70%, zu konservierten Bereichen der Glykoproteine oder Proteine von HIV, insbesondere HIV-1 und HIV-2, aufweisen. Durch den Ausdruck "konservierter Bereich" von Glykoproteinen oder Proteinen oder Peptiden von HIV sind sämtliche Peptidsequenzen von mindestens 10 Aminosäuren mit umfaßt, die einander in Varianten von HIV entsprechen und einen Prozentsatz an Homologie von mindestens 30% zu den Proteinen von Mycoplasmen aufweisen entsprechend der Definition, die im Folgenden für diesen Ausdruck gegeben wird.
Unter den bevorzugten Peptiden der Erfindung können diejenigen aufgeführt werden, die Aminosäuresequenzen enthalten, die Strukturproteinen von Mycoplasma entsprechen, und vorzugsweise die Sequenzen, die aktive Stellen von Adhäsinen von Mycoplasma, insbesondere von M. pneumoniae, M. genitalium (bevorzugter Stamm G37) oder M. pirum u.s.w., enthalten. Unter den Peptiden nach der Erfindung sind gleichfalls die Peptide enthalten, die Strukturproteinen von Mycoplasma entsprechen, wie die Adhäsin-Proteine, und die die obengenannten Prozentsätze an Isologie zu den Sequenzen gp 160 env, gp 120 env, gp 41 env, p 27 nef und p 55 gag von HIV-1 oder gp 300 env, gp 140 env, p 31 nef, p 55 oder gp 36 env von HIV-2 aufweisen. Man bezeichnet hier mit dem Ausdruck "Adhäsin" einen Membranbestandteil der Mycoplasmen, der für die Adhäsion desselben an inerte Träger oder an Zellen verantwortlich ist.
Man spricht in dieser Patentanmeldung von Sequenzhomologie oder -isologie zwischen einer von einem HIV-Protein stammenden Aminosäuresequenz und einer von einem Protein eines Mycoplasma stammenden Sequenz, wenn man, wenn die symbolischen Darstellungen in Abfolgen von von den beiden Proteinen stammenden Aminosäuresequenzen eine unter der anderen angeordnet sind, feststellt, - gegebenenfalls um den Preis einer Verschiebung bestimmter Untersequenzen innerhalb einer dieser Sequenzen gegeneinander auf eine Weise, daß Abstände zwischen diesen Untersequenzen zugelassen werden, die jeweils nicht die Länge (dargestellt durch einen "Gedankenstrich": "-") einer einer einzelnen Aminosäure entsprechenden Stelle überschreiten,
- entweder im Falle der Homologien eine Identität zwischen zwei Aminosäuren, die eine senkrecht bezüglich der anderen (oder eine über der anderen) angeordnet sind,
- oder im Falle der Isologien ein Auftreten zweier Aminosäuren aus derselben Familie eine senkrecht bezüglich der anderen in den zwei jeweiligen Sequenzen oder untersequenzen, wobei diese Familie unter einer der folgenden sieben Familien (isologe Familien) ausgewählt ist:
(1) R K
(2) A G W
(3) L F P M V I
(4) H
(5) S T Q N C
(6) E D
(7) Y.
Beispielsweise besteht eine Isologie, wenn sich senkrecht bezüglich einer Aminosäure A in der symbolischen Darstellung der ersten Sequenz (oder untersequenz dieser ersten Sequenz) eine Aminosäure G oder W (Familie (2) s.o.) in der symbolischen Darstellung der zweiten Sequenz befindet.
Man bezeichnet zwei Peptide, die von einem Mycoplasma- Protein bzw. von einem HIV-Protein stammen, daß sie eine "Isologie" oder eine "Homologie" von 30% aufweisen, wenn 30% ihrer jeweiligen Aminosäuren in der vorstehend definierten Isologieoder Homologie-Beziehung zueinander stehen.
Andere bevorzugte Peptide werden noch in der folgenden Beschreibung bevorzugter Beispiele angegeben.
Die bevorzugten Peptide sind einerseits diejenigen, die von einem Strukturprotein eines Mycoplasma stammen oder von einem solchen abgeleitet sind, die die Synthese von Antikörpern induzieren, die die Infektion durch HIV inhibieren, und andererseits diejenigen, deren Sequenz eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise eine Homologie von mindestens 70% zu den entsprechenden, von HIV-Proteinen stammenden Sequenzen aufweisen. Es kann noch festgehalten werden, daß die bevorzugte Länge der Sequenz - innerhalb jener, die der vorstehend angegebenen Bedingung entsprechen, Schutzantikörper gegen ein HIV zu induzieren - gleichfalls von dem Prozentsatz an Isologie und gegebenenfalls mehr noch durch den Prozentsatz an Homologie bestimmt sein kann.
Wie weiter unten ausgeführt wird, betrifft die Erfindung insbesondere kurze Peptidsequenzen (mit 5 bis 25 Aminosäuren) von Proteinen von Mycoplasmen, die Prozentsätze an Homologie über 70% untereinander aufweisen. Natürlich sind die Peptide, die aus den Sequenzen bestehen, die in den entsprechenden Proteinen der HIV enthalten sind, gleichfalls Teil der Erfindung und müssen aus diesem Grunde als von den Ansprüchen umfaßt angesehen werden.
Die Erfindung ergibt sich aus zwei Hypothesen, die aufgestellt wurden, wobei eine darauf abzielt, den Kontakt zwischen Zellen und Mycoplasmen, die als Cofaktor des HIV während einer Infektion einer Zelle durch dieses Virus wirken können, zu stören, und die zweite Hypothese auf der Wechselwirkung der Mycoplasmen mit HIV-1 in einem infizierten Patienten basiert, die Peptidsequenzen dieser zwei Mikroorganismen ins Spiel bringen könnte, die ein gewisses Ausmaß an Isologie, wenn nicht an Homologie, aufweisen. In der Tat sind die Infektionen durch Mycoplasmen sehr häufig. Mehrere Veröffentlichungen der Gruppe von LO haben die Anwesenheit von Mycoplasmen in intrazellulärer Lokalisierung in Geweben, die aus mit HIV-1 infizierten Patienten isoliert wurden, gezeigt (1) (2) (3) ohne jegliche Korrelation der Infektion durch HIV und der Anwesenheit von Mycoplasma fermentans in intrazellulärer Lokalisierung in diesen Veröffentlichungen. Die cytopathogene Wirkung des Virus kann in vitro durch gegen Mycoplasmen wirksame Antibiotika verringert werden; daraus resultiert die Hypothese einer Wechselwirkung hinsichtlich einer Kooperation zwischen HIV und einer Population von Mycoplasmen während der in vitro-Infektion von Kulturen von T- Lymphozyten und anderen für HIV permissiven Zellen (4), obwohl die Verwendung solcher Antibiotika nicht zu einer vollständigen Beseitigung der Mycoplasmen, die die T-Lymphozyten infizieren, führt.
Die Erfindung hat zur Bestimmung der Struktur von Peptiden geführt, die von Proteinen von Mycoplasmen stammen und die die Synthese von Antikörpern induzieren können, die eine Infektion durch HIV in einer Kultur von T-Lymphozyten oder anderen für HIV permissiven Zellen inhibieren. Eine der Kategorien von erfindungsgemäßen Peptiden wird definiert durch die Zusammenfassung der Peptide zu einer Gruppe, die neben ihrer Fähigkeit, die Synthese von Antikörpern zu induzieren, die eine Infektion durch HIV inhibieren oder verringern, die Fähigkeit haben, eine Homologie oder eine Isologie zu Proteinen von HIV zu haben. Zu diesem Zweck wurde eine Homologierecherche zwischen den Sequenzen der aktiven Stellen der Adhäsine von zwei Mycoplasmen (M. pneumoniae und M. genitalium) und den Aminosäuresequenzen, für die die Gene env, nef und gag von HIV-1 und HIV-2 kodieren, vorgenommen.
Die Erfindung umfaßt gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung von "hybriden Molekülen" oder "hybriden Peptiden", das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Konstruktion von Nukleinsäuremolekülen vornimmt, die zu einem Teil aus Nukleotidsequenzen, die für mindestens ein zu HIV gehöriges Peptid kodieren, und zu einem Teil aus einer Sequenz, die für mindestens ein Peptid eines Mycoplasma nach der Erfindung kodiert, bestehen. Die Erfindung umfaßt in gleicher Weise die Zusammensetzungen von miteinander auf kovalente Weise verbundenen hybriden Peptiden oder solche, die aus einer nicht kovalenten Mischung von Peptiden von HIV und Peptiden von Mycoplasmen nach der Erfindung bestehen, die miteinander nicht auf kovalente Weise direkt verbunden sind. TABELLE I Gen Kodiertes Protein (kD) Funktionen und charakteristische Eigenschaften VIF (oder SOR oder Gen A oder ORF Q) VPR (oder ORF R) REV (oder TRS oder ART) NEF (oder 3'ORF oder negativer Faktor) Interne Proteine ("Kernantigene ("core antigens") oder gruppenspezifisches Antigen" ("group specific antigen")) Polymerase Sich wiederholende Endsequenzen (long terminal repeats), die für die Integration des Virusgenoms in das Zellgenom und während der reversen Transkription erforderlich sind Nukleäre Zielsequenzwährend der Transaktivierung durch die MRNA von tat Myristylierter Vorläufer von 55 kD, der in drei Proteine gespalten wird Polyprotein von 110 kD, dessen Spaltung zu 3 Proteinen führt: - Protease P 10 - reverse Transkriptase P64 - Endonuklease/Integrase P 34 viraler Infektiositätsfaktor zwischen VIF und TAT gelegener kodierender Bereich Regulationsprotein (Transaktivierung sämtlicher Virusproteine) Regulationsprotein der Expression der Virusproteine Protein, beteiligt an der Reifung der Viruspartikel Äußeres virales Hüllprotein Transmembranprotein Myristyliertes Protein der negativen Regulation der Expression viraler Proteine
Anmerkung: VPU kommt bei HIV-2 und SIV nicht vor. Als Ersatz kommt ein Gen VPX vor, das für ein Protein P16 kodiert, das Einfluß auf das Replikationsniveaus des Virus hat.
Die Untersuchung wurde genauer an den Strukturproteinen und insbesondere an den Adhäsin-Proteinen von Mycoplasma genitalium und Mycoplasma pneumoniae ausgeführt.
Die Nukleotidsequenz des Gens für das Protein P1 von M. pneumoniae für die Anlagerung an das respiratorische Flimmerepithel wurde von Inamine et al. (6) und eine für die Anheftung essentielle Stelle von Dallo, S.F. et al. (5) beschrieben.
Die für das Adhäsin von M. genitalium kodierende Gensequenz wurde von Dallo et al. beschrieben (12) und es wurde von Mornson-Plummer et al. gezeigt (7), daß das Adhäsin von M. genitalium immunologische Determinanten trägt, die es mit M. pneumoniae gemein hat, zur Anheftung an die Zelle. Dieses Adhäsin wird bei M. genitalium als "MgPa" bezeichnet.
Die Tabelle II zeigt die Homologie der Sequenzen der Adhäsine im Bereich der mit der Zellanheftung in Zusammenhang stehenden Abschnitte. TABELLE II: Sequenz der Anheftungsstellen von zwei Adhäsin-Proteinen M. genitalium (Peptid A): M. pneumoniae (Peptid B):
Die Sternchen * symbolisieren die Homologie, die zwischen den zwei untereinander angeordneten Sequenzen besteht.
Die eingesetzte Datenverarbeitungsvorrichtung war ein DATA GENERAL MV/8000-Computer.
Die Sequenzen der Adhäsine von M. pneumoniae und von M. genitalium, die nicht direkt aus Datenbanken zugänglich waren, wurden manuell eingegeben.
Um Zugang zu den Sequenzen retroviraler Proteine zu haben, konnte gleichfalls auf die unter der Bezeichnung "Compilation and Analysis of nucleic acid and aminoacid sequences of human retroviruses and AIDS" (Zusammenstellung und Analyse von Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen humaner Retroviren und AIDS), 1988-1989, herausgegeben von Gerald Myers et al., Los Alamos, USA, "National Laboratory" (Nationales Laboratorium) bekannte Quelle zurückgegriffen werden.

Kriterien der Datensichtung und der gegenseitigen Ausrichtung (alignment) der Sequenzen

Es wurde der Algorithmus von Lipman und Pearson verwendet (9, 10).
a) Für die Untersuchungen strenger Homologien wurde als Sichtungskriterium herangezogen:
- das Vorliegen zweier aufeinanderfolgender homologer Aminosäuren ("K-tuple size" 2 oder minimale Größe der homologen Sequenzen), von denen ausgehend der Rechner seine Suche nach längeren Sequenzen, die einen minimalen, vom Bediener gewählten Prozentsatz an Homologie aufwiesen, aufnahm.
- ein "Lesen" von 20 mal 20 Aminosäuren (Größe des Fensters oder "window size"),
- eine Bestimmung eines maximalen Abstands zwischen Untersequenzen ("gap penalty") zu eins.
b) Für die gegenseitigen Ausrichtungen (alignment) hinsichtlich Isologie beträgt die "K-tuple size" 3. TABELLE III Symbolische Darstellung der Aminosäuren Alanin Arginin Asparagin Aspartat Asn + Asp Cystein Glutamin Glutamat Gln + Glu Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin

Homologieuntersuchungen zwischen den Adhäsinen von M. pneumoniae und M. genitalium und den Hüllproteinen von HIV-1 (BRU) und P55 gag HIV-1 (BRU) und P27 nef HIV-1 (BRU) (Ergebnisse)

Als Referenz wurde HIV1 (BRU) als HIV1 (LAI) in Science, 1991, WAIN-HOBSON et al., 252, S. 961-965, beschrieben; wir haben begonnen, eine direkte gegenseitige Ausrichtung (alignment) der Sequenz des Adhäsins von M. pneumoniae (1624 Aminosäuren) und der Sequenz jenes Adhäsins von M. genitalium (1444 Aminosäuren) vorzunehmen. Dieses Ergebnis hat 723 gemeinsame Aminosäuren ergeben, was 45% Homologie entspricht. Bei der Annäherung über Isologien zwischen M. pneumoniae und M. genitalium beträgt der Prozentsatz 59% (957 Aminosäuren/1624).

A) Homologien zwischen gp 160 env (HIV-1 BRU) und Adhäsin P1 von M. pneumoniae

1) Die Ausrichtung (alignment) der Sequenz von P1 oberhalb der Sequenz des Hüllproteins ergibt 178 Homobgien ("Treffer" ("matches") oder "Übereinstimmungen" ("coincidences")). Dies ist nicht signifikant, da diese Homologien innerhalb der Sequenz dieser zwei Proteine weit verstreut sind. Vom Gesichtspunkt "Isobgie" aus sind die Ergebnisse ziemlich verschieden, da die Anzahl an Übereinstimmungen 328 beträgt, wobei insbesondere bestimmte Sequenzen Übereinstimmungen in Gruppierungen aufweisen, und die Verteilung weniger groß ist. Insbesondere werden mehrere Gruppen mit 8 bis 10 Übereinstimmungen beobachtet wie: M. pneumoniae: Glykoprotein der Hülle aus HIV-1: oder: M. pneumoniae: Glykoprotein der Hülle aus HIV-1:
2) Gegenseitige Ausrichtung (alignment) der aktiven Anheftungsstelle von P1 aus M. pneumoniae und der entsprechenden Sequenz des Hüllproteins aus HIV-1; es wurde kein signifikantes Ergebnis hinsichtlich Homologie erhalten, zumindest was die untersuchten Aminosäuresequenzen betrifft. Im Gegenzug erhielt man bei einer gegenseitigen Ausrichtung (alignment) hinsichtlich konservativer Substitution oder Isologie: env aus HIV-1: p1 (M. pneumoniae): Mg Pa (M. genitalium): env. aus HIV-1:
Die Ausrichtungen (alignments) zeigen 9/21 isologe Aminosäuren zwischen HIV-1 und M. genitalium und 13/21 zwischen den zwei Sequenzen der Adhäsine der vorstehend genannten Mycoplasmen. Eine andere geringfügige Isologie: env aus HIV-1: Aktive Stelle Mg Pa aus M. genitalium:
Die bei M. genitalium vermutete aktive Anheftungsstelle weist 9 Isologien auf, die sie mit einem Bereich des Transmembrabschnitts des Hüllproteins von HIV-1 (BRU) gemein hat.

B) Homologien zwischen p27 nef von HIV-1 (BRU) und P1 von M. pneumoniae

Es wurde kein signifikantes Ergebnis durch das verwendete Sichtungsverfahren bei der Untersuchung strenger Homologien und hinsichtlich der Isologien ausgehend von den genauer untersuchten Aminosäureketten erhalten.

c) Homologien zwischen p55 gag von HIV-1 (BRU) und P1 von M. pneumoniae

Es wurde kein signifikantes Ergebnis durch das verwendete Sichtungsverfahren erhalten.

D) Homologien zwischen gp160 der Hülle von HIV-1 (BRU) und Mg Pa von M. genitalium

Es wurden 165 Übereinstimmungen, die über die gesamte Länge verteilt waren, beobachtet. Es wurden Sequenzen von 8 Aminosäuren, von denen 6 Aminosäuren identisch sind, entsprechend einer Homologie von 75%, festgestellt. M. genitalium: gp 160 env von HIV-1:
Die Figuren 2 bis 9 führen die anderen Isologien und Homologien auf, die für HIV-1 und HIV-2 erhalten wurden.

E) Homologien zwischen p27 nef von HIV-1 und Mg Pa von M. genitalium

Eine bemerkenswerte Homologie von 90% besteht für einen Bereich von 9 konservierten aufeinanderfolgenden Aminosäuren. M. genitalium: p 27 nef:

F) Homologien zwischen p55 gag von HIV-1 (BRU) und Mg Pa von M. genitalium

Es konnte kein Bereich signifikanter Homologie unter den untersuchten Sequenzen ermittelt werden.
Die Erfindung betrifft demnach genauer die Peptide, die hinsichtlich jener vorstehend angegebenen, aus HIV oder Mycoplasmen stammenden Sequenzen identische Sequenzen aufweisen. Sie betrifft gleichfalls die Peptide (längere oder kürzere), deren Sequenzen in jenen der längeren Sequenzen der obengenannten Peptide enthalten sind, sobald sie den obengenannten mycoplasmischen Sequenzen, insbesondere jenen von M. genitalium stammenden, entsprechen.
Gleichfalls umfaßt die Erfindung ferner Peptide, die selbst noch viel kürzer sind, beispielsweise SKSSVTGWP, von da ab, wo sie selbst in der Lage sind,
- entweder (gegebenenfalls nach ihrer Kopplung an ein Trägermolekül) die in vivo-Produktion von Antikörpern zu induzieren, die die Vervielfältigung eines Retrovirus in Kulturen neutralisieren können,
- oder selbst mit dieser Vervielfältigung zu interferieren.
Die Erfindung betrifft ferner die Peptide, die sich von den Vorhergehenden durch Anwendung der Isologie-Regeln, von denen weiter oben die Rede war, unterscheiden, beispielsweise Peptide, in denen diejenigen der vorliegenden Aminosäuren, die zu isobgen Familien gehören, wie sie weiter oben definiert wurden, durch andere Aminosäuren, die jeweils zu denselben isologen Familien gehören, ausgetauscht sein können.
Aus dem Vorhergehenden ergibt sich, - innerhalb der Grenzen der Untersuchungen, die bis zu diesem Tage durchgeführt wurden - daß M. genitalium oder M. pirum oder verwandte Mycoplasmen eine bevorzugte Quelle für Peptidsequenzen sind, die für die bevorzugten Anwendungen der Erfindung verwendet werden können, insbesondere die Inhibition der Vermehrung von HIV in biologischen Medien, die infiziert werden könnten.
Die von Proteinen von Mycoplasmen oder aus einer anderen Quelle stammenden Peptide, sobald sie identische oder ähnliche Sequenzen enthalten, sind diejenigen, die die Synthese von in vitro die Infektion durch HIV hemmenden Antikörpern induzieren, wie groß auch immer das Ausmaß an Homologie oder Isologie in Bezug auf HIV sei.
Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die spezifisch gegen die obengenannten Peptide gerichtet sind. Bevorzugte Antikörper sind diejenigen, die spezifisch die Sequenzen der Anheftungsbereiche der Adhäsin- Proteine von Mycoplasma, und insbesondere p1 von M. pneumoniae, M. genitalium oder M. pirum, erkennen.
Gegen solche Peptide, insbesondere gegen das Peptid A, gebildete Antikörper haben zu 90% die Infektion einer Kultur einkerniger peripherer Blutzellen aus hauptsächlich durch Phytohaemagglutinin (PHA) aktivierten T-Lymphozyten durch den Prototypstamm HIV-1 (BRU) inhibiert. In Anwesenheit dieser Antikörper wird keinerlei Bildung von Synzytien beobachtet. Identische Ergebnisse wurden mit HIV-2 (ROD) erhalten. Dies ist ein interessantes Ergebnis für das Verständnis der Pathogenese der Infektion durch HIV insoweit, als die Prävention dieser Infektion nicht nur HIV-1 und HIV-2 einschließt, sondern gleichfalls einen etwaigen Cofaktor oder ein opportunistisch wirksames Mittel, wie ein spezifisches Mycoplasma, das gegebenenfalls die Infektion durch die HIV "erleichtern" könnte.
Solche Zubereitungen von Antikörpern, die gegen eine Peptidsequenz gerichtet sind, die wahrscheinlich der Wechselwirkungsstelle von Mycoplasma genitalium oder eines anderen Mycoplasma, beispielsweise M. pirum, mit den Eukaryotenzellen entspricht, inhibieren die Infektion von aktivierten T-Lymphozyten oder Zellen der Linie CEM durch den Prototypstamm von HIV-1, BRU (11).
Die vollständige Sequenz des Adhäsins Mg Pa von M. genitalium ist in der in den Figuren 2 bis 9 abgebildeten, oberen Zeile aufgeführt.
Diese Ergebnisse werden am besten durch die neutralisierende Wirkung des so erhaltenen Antikörpers auf die zelluläre Anheftung eines Mycoplasma, das diesen Virusstamm begleitet, erklärt. Dies könnte bedeuten, daß dieses Mycoplasma eine Schlüsselrolle bei der Auslösung der Replikation des Virus spielt.

1) Wahl einer bevorzugten immunisierenden Sequenz

Wenige Proteinsequenzen von Mycoplasmen wurden ausgehend von klonierten Genen bestimmt und diejenigen, die bekannt sind, zeigen eine große Variabilität von einer Art zur anderen.
Dennoch wurden bei mindestens zwei für den Menschen parasitären Arten, M. pneumoniae und M. genitalium, Adhäsionsproteine (Adhäsine) höherer Molekulargewichte charakterisiert (12) und deren Sequenzen veröffentlicht (6;15).
Der Vergleich dieser Aminosäuresequenzen ergibt eine gewisse Homologie (50%), insbesondere im Bereich der Sequenz, von der angenommen wird, daß sie direkt mit der Anheftung von M. pneumoniae an Eukaryoten in Zusammenhang steht (12).
Diese Sequenz ist für M. pneumoniae die folgende (Peptid B):
GIVRTPLAELLDGE
Wir haben nach gezielter gegenseitiger Ausrichtung (alignment) eine homologe Sequenz (50%) zu der für M. genitalium veröffentlichten Sequenz (Peptid A) gefunden: (Peptid A)
Zwei Varianten des Peptids A bestehen darin, daß sie die folgenden Sequenzen tragen:
Ein spezielles Epitop besteht aus der Sequenz:
TPL
Dieses Peptid selbst ist Teil der Erfindung.
Die obengenannte relative Konservierung legt nahe, daß die zwei Mycoplasmen, und möglicherweise andere Arten, diese Sequenz verwenden, um eine gemeinsame Struktur an der Oberfläche eukaryotischer Zellen, für die sie parasitär sind, zu erkennen.
Wir haben vorzugsweise die Sequenz aus M. genitalium zur Induktion für diese Sequenz spezifischer Antikörper aufgrund der Tatsache ausgewählt, daß dieses Mycoplasma auf den Atemwegs-, Rektum- und Genitalschleimhäuten vorliegt (16) und wir es auf den roten Blutkörperchen und den Lymphozyten einer an AIDS erkrankten Person nachgewiesen haben. Andere Mycoplasmen wurden aus dem Intestinaltrakt des Menschen isoliert.
Es ist gleichfalls bei immundepressiven Patienten gezeigt worden, daß ein Mycoplasma, M. hominis, aus verschiedenen Organen, Geweben und Flüssigkeiten isoliert werden konnte. Siehe beispielsweise die Veröffentlichung von D. Macmahon et al. "Extragenital M. hominis infections in adults", veröffentlicht in 1990, Band 89, S. 275-281 in Am. Journal of Medicine.
Die von diesen verschiedenen Stämmen stammenden Proteine und Peptide, die den weiter oben definierten Bedingungen entsprechen, sind in der Definition der Peptide gemäß der Erfindung umfaßt. Insbesondere kann Bezug genommen werden auf die Veröffentlichung von GIEBEL, J., BINDER A. et al., "Isolation of Mycoplasmas from the intestine or rat, swine and man" (Zentralblatte für Bacteriologie, 1990, Supplement Nr. 20, S.).
Zu Kontrollzwecken wurde die den 25 Aminosäuren am C-terminalen Ende desselben Proteins entsprechende Sequenz synthetisiert (Peptid C):
APKKLKQATPTKPTPKTPPKPPVKQ

2) Synthese des Peptids

Das von Merrifield entwickelte Verfahren (17) einer Festphasensynthese wurde eingesetzt. Das Zusammenfügen der Peptide wurde automatisch mit einem APPLIED BIOSYSTEMS Modell 430A- Synthesizer bewerkstelligt.
Ein Teil (10 mg) wurde an ein Trägerprotein, das "Keyhole limpet hemocyanin" (KLH, 10 mg), durch das Glutaraldehydverfahren gekoppelt (18). Die Ausbeute der Kopplung betrug 50 bis 75% gemäß der Bestimmung des nicht gekoppelten Anteils des Peptids, der nach einer Passage durch eine Sephadex G 25-Säule noch vorlag.
Man kann (für die Herstellung der Peptide) gleichfalls auf Verfahren genetischer Rekombination zurückgreifen, indem man beispielsweise geeignete Plasmide einsetzt, die zelluläre Wirte, wie Bakterien, Hefen, Eukaryotenzellen, u.s.w. transfizieren und die Nukleotidsequenzen enthalten, die für die Peptide nach der Erfindung, einschließlich Gesamt- oder Teilsequenzen von Proteinen aus Mycoplasma, welches diese enthält, oder von anderen Proteinsequenzen kodieren, insoweit als die entsprechenden Expressionsprodukte die Produktion von Antikörpern induzieren, die deren Eigenschaften einer Hemmung hinsichtlich einer Infektion durch HIV bewahren.
Wie man im weiteren sehen wird, betrifft die Erfindung gleichfalls Zusammenstellungen oder Kombinationen der Peptide der Erfindung oder anderer Peptide, insbesondere der Peptide, die eine immunogene Aktivität dahingehend aufweisen, daß sie in vivo die Produktion von Antikörpern induzieren, die Infektionen durch HIV, insbesondere durch HIV-1 und HIV-2, neutralisieren können.
Die Erfindung betrifft genauer rekombinante oder hybride Peptide, die Sequenzen enthalten, die einem oder einem anderen der obengenannten Peptide entsprechen&sub1; Diese rekombinanten oder hybriden Peptide sind insbesondere durch die Technik der genetischen Rekombination zugänglich, deren Prinzip weiter oben in Erinnerung gebracht wurde, indem die geeigneten viralen Plasmide oder Vektoren, beispielsweise das Virus des Impfstoffs, das Baculovirus, u.s.w. eingesetzt werden, die in diesem Falle die Nukleotidsequenzen enthalten, die für diese rekombinanten oder hybriden Peptide kodieren und deren Expression in zellulären eukaryotischen Wirten, einschließlich der Hefe (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris u.s.w.) oder in Bakterien bewirkt werden kann.
Beispielsweise besteht eine bevorzugte Rekombinante aus einer Nukleotidsequenz, die für den Bereich V&sub3; des gp 120 aus HIV, insbesondere das Peptid, dessen Aminosäuren die Nummern 307 bis 321 tragen, kodiert (Rusche J. et al., PNAS, 1988, 85, S. 3198-3202), in Verbindung mit der Sequenz des Adhäsinproteins aus M. genitalium, dessen Gensequenz in Gene, 1989, 82, 5. 259- 267 (Inamine et al.) beschrieben wurde, oder der Sequenz des Adhäsins aus M. pirum oder aus verwandten Mycoplasmen und vorzugsweise der Nukleotidsequenz, die der Sequenz des Peptids A entspricht. Ein solches Hybrid, das in einem eukaroytischen zellulären Wirt, der auch die Hefen, beispielsweise Pichia und Kluyveromyces umfaßt, oder in einem prokaryotischen Wirt exprimiert wird, erlaubt es, ein hybrides Protein oder Peptid zu erhalten, das einen der Bestandteile einer immunogenen Zusammensetzung, die Antikörper induziert, die in vitro eine Infektion durch HIV inhibieren, darstellen kann. Hinsichtlich der Wahl der HIV-1- oder HIV-2-Sequenzen, die ein Protein exprimieren, kann auf die Veröffentlichung von GUYADER et al., Nature, 1987, 326, S. 662-669, Bezug genommen werden.
Dieselben hybriden Peptide können zu Zwecken einer in vitro-Diagnose verwendet werden. Die verwendete Methodik ist diejenige, die in der US-Patentschrift Nr. 4,839,288 beschrieben ist.

3) Herstellung und Charakterisierung der Antikörper

Neuseeland-Kaninchen wurde wie folgt immunisiert: 200 µg des an die KLH-Mischung gekoppelten Peptids wurde mit einem gleichen Volumen komplettes Freund-Adjuvans auf intradermalem Wege am Tag 0 injiziert. Diese Vorgehensweise wurde dann auf subkutanem Wege in Anwesenheit von unkomplettem Freund-Adjuvans an den Tagen 30, 60 und 90 wiederholt.
Den Tieren wurde eine Woche nach jeder Injektion Blut abgenommen, um das Serum zu erhalten. Serum dieser Tiere vor Beginn der Immunisierung wurde zum Nachweis der biologischen Wirkungen der Seren aufbewahrt.
In dem Falle, wo das Peptid A als an KLH gekoppeltes, immunogenes Mittel verwendet wurde, erkennen die so erhaltenen Antikörper spezifisch das immunisierende Peptid und auch unter Verwendung des Western-Blot-Verfahrens ein Protein von 140 kDa in einem durch eine wäßrige Lösung von 1% (Gew.-/Vol.) Natriumdodecylsulfat solubilisierten Extrakt von M. genitalium (G37). Die verwendete Lösung ist M. genitalium G37 (ATCC Nr. 33530).
Das Protein von 140 kDa entspricht dem Adhäsin, wie es in der Literatur beschrieben worden ist, und wird durch das Antiserum bis zu einer Verdünnung von mindestens 1/100000 dieses letzteren erkannt (Figur 10).
Bei einer geringeren Verdünnung (1/2000) erkennt der anti- Peptid A-Antikörper gleichfalls ein Protein von 130 kDa, das in einem lysierten Extrakt von Mycoplasma pirum (Stamm Ber) (hinterlegt bei der C.N.C.M. am 03. Mai 1990 unter der Nummer 1-950 und bei der N.C.I.N.B. unter der Nr. 40283 am 17. Mai 1990) enthalten ist, einem Mycoplasma, das man gleichfalls häufig bei an AIDS erkrankten Personen findet und das demnach gleichfalls die HIV-Stämme kontaminieren könnte.
Die Molekulargewichtsmessungen der obengenannten Proteine (erhalten aus mit 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) behandelten Lysaten von Mycoplasmen) wurden durch Vergleich von deren jeweiligen Wanderungsstrecken in einem Elektrophoresegel mit denjenigen von sechs Referenzproteinen vorgenommen, die die nachstehend angegebenen Molekulargewichte aufweisen (Analysezusammenstellung oder "Kit" hergestellt von Bio-Rad):
Lysozym 14400
Sojabohnen-Trypsininhibitor 21500
Carboanhydrase 31000
Ovalbumin 45000
Rinderserumalbumin 66200
Phosphorylase B 92500
Diese Messungen wurden mit einer Genauigkeit von ± 10% vorgenommen. Das Protein von 130 kDa kann als Reagens, das einen Bestandteil einer Zusammenstellung für einen ELISA-Test oder einen RIA-Test ausmacht, oder ferner als Reagens nach einer Markierung durch beispielsweise einen Fluoreszenzmarker verwendet werden. Das Protein P130 kDa von M. pirum kann gleichfalls als immunogenes Mittel zur Induktion der Synthese von gegen eine Infektion durch Mycoplasma wirksamen Antikörpern verwendet werden.
Geringere antigene Reaktionen werden unter denselben Bedingungen mit demselben anti-Peptid A-Antikörper mit Proteinen mit Molekulargewichten unter 65 kda, insbesondere mit drei Proteinen eines Molekulargewichts von 64 kDa, 45 und 42 kDa von M. pirum beobachtet.
Man findet gleichfalls häufig bei an AIDS erkrankten Personen gegen das obengenannte 130 kDa-Protein aus M. pirum gerichtete Antikörper oder solche, die Proteine mit ähnlichen antigenen Eigenschaften erkennen und die demnach gleichfalls die aus erkrankten Personen isolierten HIV-Stämme kontaminieren können.
Die für die Herstellung der ausgewählten Peptide oder der entsprechenden Antikörper eingesetzten Verfahren können natürlich auf die Herstellung anderer Peptide oder Antikörper, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen, übertragen werden. Hinsichtlich monoklonaler Antikörper kann das von Köhler und Milstein (Nature, 1975, 256, 5. 495-497) beschriebene Verfahren eingesetzt werden.
4. Wirkung der Antikörper auf die Infektion durch HIV HIV-negative Spender-Lymphozyten wurden durch Phytohaemagglutinin 3 Tage aktiviert und in Gegenwart von Interleukin 2- Protein in RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 50 U/ml Streptomycin gezüchtet. Sie wurden durch den Prototyp-Stamm HIV-1 LAVBRU entsprechend einer Reverse Transkriptase-Aktivität von 10&sup4; cpm auf 10&sup6; Zellen infiziert. Der Stamm HIV-1 BRU ist eine Probe des Stamms CNCM I-232.
Andere Gefäße derselben Kultur wurden mit derselben Virussuspension infiziert, die vorher 1 h bei 37ºC mit verschiedenen Konzentrationen der 1/50- oder 1/200-verdünnten Antiseren von gegen die Peptide des Adhäsins gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren immunisierten Kaninchen inkubiert worden waren.
Sie wurden nach Kopplung mit KLH und in Verbindung mit komplettem Freund-Adjuvans Kaninchen injiziert. Die erhaltenen Antikörper wurden nach dem von Szmelcman et al. (8) beschriebenen Verfahren untersucht, um deren Wirkungen nach In-Kontakt-Bringen mit T-Lymphozyten in Kultur, die dann durch den Prototyp-Stamm HIV-1 (BRU) infiziert wurden, auszuwerten. Die Konzentration an Reverser Transkriptase und die Rate der Produktion an p25 wurden gemessen, um die Virusproduktion nachzuweisen.
Die HIV-Produktion durch die Kulturen wurde anhand der Reverse Transkriptase-Aktivität verfolgt und die Produktion von Antigen p25 wurde durch ELISA gemessen (Diagnostic Pasteur) in Kulturüberständen. Diese Produktion wird auch anhand der cytopathogenen Wirkung (Bildung von Synzytien und Lyse isolierter Zellen), die durch das Virus induziert wird, beurteilt. Man stellt fest, daß die Produktion von p25 und folglich von Virus zu mehr als 90% durch eine 1/50-Verdünnung des gegen das Peptid A gerichteten Antiserums inhibiert wird. Eine geringere, aber noch bemerkenswerte Inhibition wird bei 1/200-Verdünnung erhalten. Die Veränderungen der Inhibitionsraten der produzierten Menge an p25 (p25) in ng auf der Ordinatenachse in Abhängigkeit von der Zeit (in Tagen (d) auf der Abszissenachse) sind durch die Kurven der Figur 1 verdeutlicht. Die Messungen wurden in Gegenwart von gegen das Peptid A gerichteten Antikörpern (in 1/50- und 1/200-Verdünnung) vorgenommen.
Die vor der Immunisierung abgenommenen Kaninchenseren zeigen keine Wirkung, keine größere als die gegen das Peptid C des C-terminalen Abschnitts des Adhäsins immunisierten Kaninchenseren.
Die Spezifität der Inhibition wird durch die Tatsache gezeigt, daß sie durch Vorinkubation des anti-Peptid A-Serums mit Peptid A im Überschuß verringert wird, wobei die verbleibende Inhibition mit dem Peptid selbst in Verbindung steht (siehe weiter unten).
Die Inhibition durch das anti-Peptid A-Antiserum wird beobachtet, wenn es im Augenblick der Infektion der normalen T- Lymphozyten durch die Viruszubereitung zugesetzt wird. Unter "Viruszubereitung" versteht man einen rohen Überstand einer Kultur durch das Virus HIV infizierter lymphozytärer Zellen, wobei dieser Überstand Mycoplasmen enthalten kann. Aber die Inhibition kann auch beobachtet werden, wenn die Viruszubereitung 1 h bei 37ºC mit dem anti-Peptid A-Antiserum vorinkubiert und dann den Zellen für die Infektion zugesetzt wird. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, während der Dauer des Experiments in der Folge Antiserum dem Kulturmedium aufs neue hinzuzufügen, um die maximale Inhibitionswirkung zu erhalten.
Ähnliche Ergebnisse werden mit der Zellinie CEM Klon 13, die für den Stamm HIV-1 BRU permissiv ist, erhalten. Diese Zellen werden vorab 3 Wochen in Anwesenheit von Antibiotika mit Breitspektrumwirkung gegen Mycoplasmen (MRA) vermehrt, bevor sie durch das Virus infiziert werden, auf eine Weise, daß die endogene Kontaminierung dieser Linie durch Mycoplasmen verringert wird.
Man beobachtet bei der Zellinie CEM, die durch eine mit dem anti-Peptid A-Antiserum behandelte Viruszubereitung von HIV-1 (BRU) oder HIV-2 (ROD) infiziert wurde, eine Verzögerung der Kurve der Virusproduktion, aber keine vollständige Suppression dieser Produktion, sowie eine Verzögerung der cytopathogenen Wirkung des Virus. Diese cytopathogene Wirkung ist gekennzeichnet, durch die Bildung von Zellansammlungen, dann von Synzytien; man könnte annehmen, daß sekundär eine Erhöhung der Infektion durch interzelluläre Kontakte hervorgerufen wird, wobei diese Infektionsweise nicht mehr gegenüber dem anti-Peptid A-Antiserum empfindlich ist.
Eine ähnliche Inhibition durch das Antiserum wurde bei dem Stamm HIV-2 ROD, vermehrt in CEM-Zellen, beobachtet (Figur 1 bis).

5) Wirkung des Peptids A selbst

Wenn das gegen das Peptid A (oder gegen ein der Anheftungsstelle des Mycoplasma nachgebildetes Peptid (Mycoplasma Binding Site Peptide)) gerichtete Antiserum die Anheftung des Mycoplasma, das das Virus in der Viruszubereitung kontaminiert, an die Zellen inhibiert, folgt daraus, daß man gleichfalls diese Anheftung durch das Peptid selbst neutralisieren könnte, wenn es im Augenblick anwesend ist, wenn die Virus-Mycoplasmen-Zubereitung den Zellen zugegeben wird. Diese Hypothese wurde verifiziert und man beobachtet eine Inhibition der Infektiosität des Virus durch das Peptid in relativ hohen Konzentrationen (von einer Größenordnung von 500 µg/ml).
Zusammenfassend bestätigen unsere Ergebnisse, daß ein Mycoplasma des Typs M. genitalium oder M. pirum oder diesen letzteren relativ Verwandter an einer frühen Phase der Infektion durch HIV-1BRU (Anheftung, Penetration oder Beginn der Genexpression in den T-Zellen) beteiligt ist.
Man kann daher die Anwendung der vorliegenden Erfindung zur Herstellung immunogener Zusammensetzungen, von Impfstoffen oder von direkt wirksamen Arzneimitteln, für die Entwicklung neuer Therapien und für diagnostische Verfahren ins Auge fassen:
1. Impfung mit dem Peptid A oder mit anderen, wirksamen, der Erfindung entsprechenden Peptiden, von HIV-seronegativen oder HIV-seropositiven asymptomatischen Patienten mit dem Peptid A oder mit Peptiden, die dieselbe Sequenz enthalten oder Sequenzen enthalten, die die in vivo-Induktion spezifischer Antikörper mit identischen oder ähnlichen Eigenschaften gegen die Infektion durch HIV ermöglichen, gegebenenfalls in Gegenwart eines für den Menschen geeigneten Hilfsstoffs, wie Aluminiumhydroxid.
Diese Impfung dient dem Schutz gegen die Infektion durch HIV bei den HIV-seronegativen Patienten und dem Schutz gegen die Entwicklung zu AIDS bei den seropositiven asymptomatischen Patienten.
Gegebenenfalls sind die in diesen Impfzusammensetzungen enthaltenen Peptide diejenigen, die selbst an Trägerproteine oder -polypeptide gekoppelt sind, die die gewünschte Immunogenität der Peptide erhöhen können.
Die Erfindung umfaßt gleichfalls die Verwendung der Peptide nach der Erfindung für eine Impfung in Verbindung oder in Kombination mit einem unterschiedlichen HIV-Impfstoff, um das Schutzvermögen dieses letzteren zu verstärken.
Die Erfindung betrifft demnach gleichfalls immunogene Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffe, auf Basis mindestens eines der erfindungsgemäßen Peptide, entweder allein oder in Kombination mit immunogenen Peptiden, insbesondere Impfpeptiden, die von HIV stammen, oder mit Peptiden, die denen verwandt sind (siehe eingereichte Europäische Patentanmeldungen, die im Namen des Institut Pasteur, gegebenenfalls mit anderen Coanmeldern, veröffentlicht worden sind, beispielsweise die unter den Nummern EP 201540 (Anmeldenummer 85.905513.9) und EP 283327 (Anmeldenummer 88.400084.5 veröffentlichten Europäischen Patentanmeldungen). Ein von dem Glykoprotein der Hülle gp 120 stammendes Peptid, das von Rusche et al. (PNAS 1988, 85, 5. 3198) beschrieben worden ist, ist eines der von HIV stammenden bevorzugten Peptide.
Als HIV-Peptid nach der Erfindung können gleichfalls das Glykoprotein der Hülle gp 120 oder Fragmente davon, deren Aktivität von Berman et al. in NATURE, 1990, Band 345, Seiten
622-625 (Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp 120 but not gp 160) (Schutz von Schimpansen gegen eine Infektion durch HIV nach Impfung mit einem rekombinanten Glykoprotein gp 120, aber nicht gp 160), beschrieben worden ist, verwendet werden. Diese Zusammensetzungen enthalten gleichfalls gegebenenfalls für die gewählten Verabreichungsweisen, insbesondere auf parenteralem Wege, geeignete Träger. Man wird immunogene Dosen an Peptid zwischen 3 µg/kg und 10 µg/kg Wirt, der diese Dosen erhält, verwenden (Anderson, J. Inf. Dis., 1989, 160).
2. Therapie bei immundepressiven Patienten (im AIDS-Zustand) entweder durch intravenöse Injektion des Peptids selbst oder durch Verabreichung von vorab gegen erfindungsgemäße Peptide gebildete Antikörper, insbesondere anti-Peptid A-Antikörper, die in einem Tier hergestellt werden, (passive Immuntherapie) oder von monoklonalen Antikörpern. Die Verwendung von aktiven gereinigten Fragmenten, beispielsweise der FAB-Fragmente dieser Antikörper wird empfohlen, um Vorfälle von Hypersensibilisierung zu vermeiden.
3. Diagnose:
Messung der Konzentration von Antikörpern, die gegen das Peptid A oder andere erfindungsgemäße Peptide gerichtet sind, von Mycoplasmen stammen und in der Lage sind, Antikörper zu induzieren, die eine HIV-Infektion in vitro oder in vivo inhibieren oder verringern, bei Kranken und asymptomatischen Personen.
Anwendung für Diagnose und für die Überwachung der Wirkung von hinsichtlich Mycoplasmen und bei AIDS wirksamen Arzneimitteln.
Die folgenden Figuren 2 bis 9 liefern zugleich die Aminosäuresequenzen von von M. genitalium stammenden Proteinen und unterschiedlichen, entweder von HIV-1 oder von HIV-2 stammenden Proteinen.
Diese Figuren erlauben es, die Peptide der Erfindung zu identifizieren, die zu M. genitalium gehören und durch Anwendung der weiter oben definierten Isologie- und Homologieregeln Isologien, ja sogar Homologien, zu entsprechenden Bereichen der unterschiedlichen Proteine von HIV-1 und HIV-2 aufweisen. Genauer bemerkt man die Sequenzen der Aminosäuren des Proteins p1 von M. genitalium, die sich in gegenseitiger Ausrichtung (alignment) finden mit:
Fig. 2A bis 2J: der Aminosäuresequenz der Hülle (Gegenseitige Ausrichtung (alignment) hinsichtlich direkter Homologien) von HIV-2 ROD
Fig. 3A bis 3K: der Sequenz des Hüllproteins von HIV-2 ROD
Fig. 4A bis 4K: der Sequenz des Hüllproteins von HIV-1 BRU
Fig. 5A bis 5J: dem Hüllprotein von HIV-1 BRU
Fig. 6A bis 61: der Sequenz von p27 nef von HIV-1 BRU
Fig. 7A bis 71: dem Protein p27 nef von HIV-1 BRU
Fig. 8A bis 81: den Sequenzen von p31 nef von HIV-2 (ROD)
Fig. 9A bis 9I: den Sequenzen von p31 nef von HIV-2 ROD.
Die Aufmerksamkeit wird dann gelenkt
- auf die Figur 1bis, die die Inhibition der Produktion von viraler reverser Transkriptase (Aktivität auf der Ordinate) in T-Lymphozyten in Anwesenheit von HIV-2 und von anti-Peptid A- Antikörpern nach der Dauer (in Tagen auf der Abszissenachse) im Vergleich zu den Beobachtungen, die an einer "Kontroll"-Kultur in Anwesenheit von anti-Peptid A-Antikörpern gemacht wurden, verdeutlicht,
- auf die Figur 10, die die Elektrophoresebanden zeigt, die in den angegebenen Verdünnungen in den durch "Western Blot"- Analyse ausgeführten und an den Seren vorgenommenen Versuchen beobachtet wurden. Man erkennt das Vorliegen einer für die Anheftungsstelle des Peptids A charakteristischen Bande in den an M. genitalium ausgeführten Versuchen.
Um die mit den Antikörpern von mit dem Peptid A, gekoppelt an KLH, immunisierten Kaninchen erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurde dasselbe derart gekoppelte Peptid verwendet, um zwei Pferde nach dem folgenden Terminplan zu immunisieren: TERMINPLAN VON INJEKTIONEN UND BLUTABNAHMEN ZEITPUNKT INJEKTION BLUTABNAHME Tag Sterilblut * CFA = komplettes Freund-Adjuvans ** IFA= unkomplettes Freund-Adjuvans
Die bereits abgenommenen Seren zeigten eine starke Immunreaktivität gegen das Peptid in ELISA (Serumtiter der Größenordnung von 1/10&sup6;).
Immunglobuline werden zur Zeit hergestellt, um die entsprechenden Fab-Fragmente herzustellen. Das Gesamtserum, die so gereinigten Immunglobuline sowie die Fab-Fragmente werden auf ihre Fähigkeit untersucht werden, in vitro die Infektion der CD4&spplus;- Zellen durch das HIV-Virus zu inhibieren.

LITERATURVERZEICHNIS

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Claims

1. Verwendung eines Peptids oder einer Peptidsequenz, umfassend in Fragment eines Strukturproteins eines Mycoplasma, für die Herstellung einer Zusammensetzung, die geeignet ist, eine auf die Produktion von Antikörpern, die die Infektion durch ein HIV inhibieren können, gerichtete Immunantwort zu induzieren, wobei das Peptid einen Prozentsatz von mindestens 60 % Isologie oder, nach dem Umständen, 70 % Homologie zu einer aus HIV stammenden Peptid-, Protein- oder Glykoproteinsequenz aufweist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunreaktion eine in vivo-Produktion von zur Inhibierung der Infektion durch HIV geeigneten Antikörpern ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturprotein eines Mycoplasma ein Adhäsin eines Mycoplasma ist und daß das verwendete Fragment vorzugsweise eine aktive Stelle dieses Adhäsins enthält.

Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Peptid einen Prozentsatz von mindestens 60 % Isologie oder, nach den Umstanden, 70% Homologie zu einer Aminosäuresequenz eines gp 160 env. oder p 27 nef von HIV hat.

5. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es 5 bis 25 Aminosäuren, insbesondere 8 bis 15 Aminosäuren, umfaßt, wobei es eine der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist:

oder eine entweder langere oder kürzere Sequenz, die aber die Stelle umfaßt, die dem entsprechenden Peptid die Fähigkeit verleiht, in vivo die Produktion von Antikörpern zu Induzieren, die die Eigenschaft haben, eine Infektion von T-Lymphozyten durch HIV zu Inhibieren.

6. Peptid, gekennzeichnet dadurch, daß seine Sequenz von einem Adhäsin aus Mycoplasma abstammt und eine Stelle enthält, die die Fähigkeit hat, In vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die die Eigenschaft haben, eine Infektion von 7-Lymphozyten durch HIV zu inhibieren, wobei das Peptid einen Prozentsatz von mindestens 60 % Isologie oder, nach den Umständen, 70 % Homologie zu einer aus HIV stammenden Peptid-, Protein- oder Glykoproteinsequenz aufweist.

7. Peptid nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß es von einem Adhäsin eines Mycoplasma, ausgewählt insbesondere unter M. pneumoniae, M. genitalium oder M. pirum, abstammt.

Peptid nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Prozentsatz mindestens von 60 % Isologie oder, nach den Umständen, 70 % Homologle zu einer Aminosäuresequenz eines gp 160 env. oder p27 nef aus HIV, insbesondere HIV-1 oder HIV-2, aufweist.

9. Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet daß es den obengenannten Prozentsatz an Isologie oder, nach den Umständen, Homologle zu einer Aminosäuresequenz, die entweder aus einem Protein gag, einem Glykoprotein der Hülle oder weiters dem nef-Protein eines HIV stammt, aufweist.

10. Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es bis 25 Aminosäuren, insbesondere 3 bis 15 Aminosäuren, umfaßt, wobei es eine der rolgenden Aminosäureseouenzen aufweist:

oder eine entweder längere oder kürzere Sequenz, die aber die Stelle umfaßt, die dem entsprechenden Peptid die Fähigkeit verleiht, in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die die Eigenschaft haben, eine Infektion von T-Lymphozyten durch HIV zu nhibieren.

11. Peptid nach den Ansprüchen 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es ein besonderes Epitop, das die Sequenz TPL enthält, aufweist.

12. Peptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es von M. genitalium abgeleitet ist, die obengenannte Homologie oder Isologie zu dem gp 160 aus HIV-1 aufweist und entweder die folgende Aminosäuresequenz enthält:

L I V T V P I V

oder daß seine Aminosäuresequenz kürzer ist, in der vorstehend angegebenen Sequenz enthalten ist und die Stelle enthält, die dem entsprechenden Peptid die Fähigkeit verleiht, in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die die Eigenschaft haben eine Infektion von T-Lymphozyten durch HIV zu inhibieren.

13. Peptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es von M. genitalium abgeleitet ist, eine Sequenzhomologie zu dem nef-Protein aus HIV-1 aufweist und entweder die folgende Aminosäuresequenz enthält:

S K S S V T G W P

oder daß seine Aminosäuresequenz kürzer ist, in der vorstehend angegebenen Sequenz enthalten ist und die Stelle enthält, die dem entsprechenden Peptid die Fähigkeit verleiht, in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die die Eigenschaft haben, eine Infektion von T-Lymphozyten durch HIV zu inhibieren.

14. Peptid, das aus einem gp 160-Protein eines HIV stammt und mindestens 60 % Sequenzisologie zu einer Sequenz eines Peptids nach Anspruch 6 aufweist und dessen Aminosäuresequenz eine der folgenden ist:

15. Peptid, das aus einem nef-Protein eines HIV stammt und eine Isoloqie von mindestens 60 % oder eine Homologie von mindestens 70 % zu einem Peptid des Anspruchs 6 aufweist, wobei dessen Aminosäuresequenz die folgende ist:

S K S S V V G W P.

16. Peptid nach Anspruch 3 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es von M. pneumoniae abgeleitet ist, einen Prozentsatz von mindestens 60 % Isologie oder, nach den Umständen, 70 % Homologie zu dem gp 160 aus HIV-1 aufweist und eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält

17. Rekombinantes oder hybrides Peptid, das eine Peptidsequenz eines der Peptide nach einem der Ansprüche 6 bis 16 und eine immunogene Peptidsequenz, die in vivo die Produktion von zur Neutralisierung einer Infektion durch HIV, insbesondere durch HIV-1 und HIV-2, geeigneten Antikörpern induzieren kann, umfaßt.

3. Rekombinantes oder hybrides Peptid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die immunogene Peptidsequenz, die in vivo zur Neutralisierung einer Infektion durch HIV geeignete Antikörper induzieren kann, die für den Abschnitt V&sub3; des gp 120 aus HIV-1 kodierende Sequenz ist.

19. Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Trägerprotein oder Trägerpolypeptid, die geeignet sind, die Immunogenität des Peptids zu erhöhen, gekoppelt ist.

20. Gereinigtes Protein aus M. pirum mit einem Molekulargewicht von 130 kDa entsprechend dem Adhäsin, wobei dieses Protein durch Antikörper, die gegen das Peptid

G V V S T P L V N L I N G Q

des Anspruchs 10 gebildet werden, erkannt wird.

21. Gereinigtes Protein aus M. pirum mit einem Molekulargewicht unter 65 kDa, insbesondere von einer Größenordnung von 64 kDa, 45 oder 2 kDa, wobei dieses Protein durch Antikörper, die gegen das Peptid

G V V S T P L V N L I N G Q

des Anspruchs 10 gebildet werden, erkannt wird, wobei das Protein aus dem Stamm von M. pirum stammt, der am 03. Mai 1990 bei der C.N.C.M. unter der Nr. I-950 und am 17. Mai 1990 bei der N.C.I.M.B. unter der Nr. 40.233 hinterlegt worden ist.

22. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen eines der Peptide oder Proteine nach einem der Ansprüche 6 bis 21.

23. Antikörper nach Anspruch 22 gegen diejenigen der Peptide, die die aktive Anheftungsstelle des Adhäsins aus M. genitalium umfassen und die selbst die Infektion von T-Lymphozyten in Kultur durch HIV inhibieren.

24. Antikörper nach Anspruch 22 gegen diejenigen der Peptide, die die aktive Anheftungsstelle des Adhä sins aus M. pirum umfassen und die selbst die Infektion von T-Lymphozyten in Kultur durch HIV inhibieren.

Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels, das in vivo zur Inhibierung der Infektion für HIV, wie HIV-1 oder HIV-2, permissiver Zellen geeignete Antikörper induzieren kann,

- entweder einem Peptid, das aus einem Fragment eines Strukturproteins eines Mycoplasma besteht und einen Prozentsatz von nindestens 60 % Isologie oder, nach den Umständen, 70 % Homologie zu einer aus HIV stammenden Peptid-, Protein- oder Glykoproteinsequenz aufweist

- oder einem Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 17

- oder einem Peptid nach einem der Ansprüche 18 und 19 in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Peptid von einem Adhäsin eines Mycoplasma stammt.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid von einem Adhäsin aus M. pneumoniae, M. genitalium, M. pirum stammt.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß uas verwendete Peptid eines derjenigen ist, die in den Ansprüchen 6 bis 13 und in Anspruch 13 definiert wurden.

29. Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels, das in vivo zur Inhibierung der Infektion für HIV, wie HIV-1 oder HIV-2, permissiver Zellen geeignete Antikörper induzieren kann, von einem Protein nach Anspruch 20 oder Anspruch 21.

30. Immunogene Zusammensetzung gegen die Infektion durch HIV, das eines der Peptide nach einem der Ansprüche 6 bis 19 oder ein Protein nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 enthält.

31. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie darüberhinaus ein unterschiedliches Peptid für eine Impfung gegen HIV enthält.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das unterschiedliche Peptid, das in vivo die Produktion von Antikörpern, die eine Infektion durch HIV neutrausieren können, induzieren kann, ein Peptid ist, das in dem Abschnitt V&sub3; des gp 120 aus HIV-1 enthalten ist.

33. Impfstoff gegen eine Infektion mit HIV, der einerseits mindestens eines der Peptide nach den Ansprüchen 6 bis 20 oder ein Protein nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 und andererseits ein mindestens aus HIV-1 oder HIV-2 stammendes Peptid enthält.

34. Immunogene Zusammensetzung, die in vivo die Produktion von aktiven Antikörpern gegen Mycoplasmen induzieren kann, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 enthält.

35. Verfahren zum Nachweis in einer biologischen Probe, die von einer Person ohne Symptome oder einem Kranken stammt, von Antikörpern gegen Peptlde von Mycoplasmen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß diese biologische Probe mit einem Peptid in Kontakt gebracht wird, das in vivo die Produktion von Antikörpern, die die Infektion durch HIV in vitro inhibieren oder verringern können, induzieren kann, wobei das Peptid einen Prozentsatz von mindestens 60 % Isologie oder, nach den Umständen, 70 % Homologie zu einer aus HIV stammenden Peptid-, Protein- oder Glykoproteinsequenz aufweist.

36. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in einer biologischen Probe, die von einer Person stammt, die mit HIV, mit Mycoplasmen oder mit beiden zugleich infiziert sein könnte, gekennzeichnet dadurch, daß diese Probe mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 19 in Kontakt gebracht wird.

37. Verfahren zum Nachweis in einer biologischen Probe, die von einer Person ohne Symptome oder einem Kranken stammt, von Antikörpern gegen Peptide von Mycoplasmen, die Antikörper induzieren können, die eine Infektion durch HIV in vitro oder in vivo inhibieren oder verrinpern können, gekennzeichnet dadurch, daß diese biologische Probe nit einem Protein oder einem Proteinfragment nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 in Kontakt gebracht wird.

38. Verfahren zum Nachweis in einer biologischen Probe, die von einer Person ohne Symptome oder einem Kranken stammt, von für M. genitalium spezifischen Antikörpern, gekennzeichnet dadurch, daß diese biologische Probe mit einem Peptid, das den Abschnitt 7 des gp 120 enthält, Insbesondere dem Peptid, dessen Aminosäuren die Nummern 207 bis 321 aus HIV-1 tragen, oder dem Peptid des Anspruch 10, in Kontakt gebracht wird.

39. Verfahren zum Nachweis von für M. genitalium spezifischen Antikörpern in einer biologischen Probe, gekennzeichnet dadurch, daß diese Probe mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 9, das 5 bis 25 Aminosäuren, vorzugsweise 3 bis 15 Aminosäuren, umfaßt und eine der folgenden minosäuresequenzen aufweist:

oder eine entweder längere oder kürzere Sequenz aufweist, die aber die Stelle enthält, die dem entsprechenden Peptid die Fähigkeit verleiht, in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die die Eigenschaft haben, eine Infektion von T-Lymphozyten durch HIV zu inhibieren, in Kontakt gebracht wird.

40. Verfahren zur Herstellung von "hybriden Molekülen" oder "hybriden Peptiden", gekennzeichnet durch:

- die Transformation eines Organismus, der zur Exprimierung derselben fähig ist, mit einer rekombinanten Nukleinsäure, die zu einem Teil aus einer Nukleotidsequenz, die für mindestens ein zu HIV end rendes Peptid kodiert, und zu einem au aus einer Sequenz, die für mindestens ein Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 19 kodiert, besteht,

- die Kultur der so transformierten Organismen und

- die Gewinnung der "hybriden Moleküle" oder "hybriden Peptide" aus den exprimierten Produkten.

41. Zusammensetzung von hybriden Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu HIV gehörige Peptide und zu einem Teil ein Peptid eines Mycoplasma nach einem der Ansprüche 6 bis 19 enthält.

42. Zusammensetzung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß sie hybriden Peptide miteinander auf kovalente Weise verbunden sind.

Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung eines Peptids von HIV und eines Peptid eines Mycoplasma umfaßt, die miteinander nicht auf kovalente Weise verbunden sind, wobei die Peptide von Mycoplasmen einen Prozentsatz von mindestens 60 % Isologie oder, nach den Umständen, 70 % Homologie zu einer aus HIV stammenden Peptid-, Protein- oder Glykoproteinsequenz aufweisen.

44. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung eines Peptids von HIV und eines Proteins nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 umfaßt.

45. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 41 bis 44 zur Herstellung eines Impfstoffs gegen eine Infektion durch HIV.

46. Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend ein Peptid nach einem der Ansprüche 6 bis 19 oder eine Sequenz, umfassend ein Fragment eines Strukturproteins eines Mycoplasma nach Anspruch 20 oder 21, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die eine in vivo-Produktion von Antikörpern induzieren kann, die die Infektion durch ein HIV inhibieren können, und ein Peptid oder ein Polypeptid von HIV.