DE3781078T2 - Verwendunng eines peptids zur herstellung von zusammensetzungen fuer die linderung, behandlung und diagnose von autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritis, zu diesem peptid analoge verbindungen, mikro-organismen, die dieses peptid oder eine zu diesem peptid analoge verbindung produzieren, als auch pharmazeutische und diagnostische zusammensetzungen und test kits. - Google Patents

Verwendunng eines peptids zur herstellung von zusammensetzungen fuer die linderung, behandlung und diagnose von autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritis, zu diesem peptid analoge verbindungen, mikro-organismen, die dieses peptid oder eine zu diesem peptid analoge verbindung produzieren, als auch pharmazeutische und diagnostische zusammensetzungen und test kits.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines bestimmten Peptids zur Herstellung von Zusammensetzungen für die Linderung, Behandlung und Diagnose von Autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritischen Zuständen. Die Erfindung betrifft weiterhin zu diesem Peptid analoge Verbindungen, Mikroorganismen, welche diese analogen Verbindung exprimieren, sowie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, umfassend eine zu diesem Peptid analoge Verbindung, als auch Test-Kits zur Durchführung immunologischer Tests.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Millionen Menschen leiden an chronischen Formen der Arthritis, von welchen man annimmt, daß sie Autoimmunität gegenüber Bestandteilen der Gelenke oder Bindegewebe des Körpers beinhalten. Diese Zustände umfassen rheumatische Arthritis, ankylosiernede Spondylitis, Reiter'sches Syndrom und andere Formen der reaktiven Arthritis. Die Ätiologie dieser Krankheiten ist nicht bekannt. jedoch scheint eine frühere Infektion mit verschiedenen Mikroben als ein anreizender Umstand in genetisch empfindlichen Individuen zu wirken. Beispielsweise können Patienten mit rheumatischer Arthritis eine ungewöhnliche Reaktivität gegenüber mycobakteriellen Antigenen zeigen, und es hat sich gezeigt, daß eine Immunisierung mit dem BCG-Stamm von Mycobakterien bei 15 bis 150 Individuen zu Arthritis führt. Die ankylosierende Spondylitis wurde in Verbindung gebracht mit der Infektion durch Klebsiella- oder Yersinia-Bakterienspecies und andere Arten derArthritis durch Salmonella, Shigella etc. Es gibt keine Anzeichen einer aktiven Infektion von Gelenken durch diese Mikroben in den allermeisten Fällen, und es wurde postuliert, daß eine mikrobielle Infektion eine abartige autoimmune Reaktion des Individuums gegenüber seinen eigenen, in den Gelenken vorhandenen Antigenen auslösen kann. Die Adjuvans-Arthritis (AA) ist ein experimentelles Modell der Arthritis, welche durch Immunisieren empfindlicher Rattenstämme gegen Mycobakterien induzierbar ist. Die Krankheit, welche sich etwa 12 Tage nach der Immunisierung entwickelt, weist viele der Merkmale der rheumatischen Arthritis (primär chronische Polyarthritis) auf, so daß AA als ein Modell der rheumatischen Arthritis betrachtet worden ist.
    • Stand der Technik
  • Die EP-A-0 181 364 beschreibt in wäßrigem Aceton lösliche und unlösliche Fraktionen bestimmter Mycobakterien, wie etwa Mycobacterium H-37, M. kansasii und M. vaccae. Es wurde gefunden. daß die lösliche Fraktion von Myc. H-37 eine Immunreaktion provoziert, welche zu einer Resistenz gegenüber Adjuvans-Arthritis führt. Die unlösliche Fraktion war anscheinend für die Induktion der Adjuvans-Arthritis verantwortlich. Es wurde gezeigt, daß das Mycobacterium vaccae im wesentlichen frei an Adjuvans- Arthritis hervorrufenden Komponenten ist. Weiterhin beschreibt die EP- A-0 181 364 bestimmte Linien und Klone von T-Lymphozyten, die wegen ihrer Reaktivität gegenüber Mycrobakterien ausgewählt wurden. Diese können zur Hervorrufung von Arthritis durch Inokulation in bestrahlte Ratten verwendet werden. Es wurde gefunden, daß eine Linie, als A2 bezeichnet, nach intravenöser Injektion in bestrahlte Ratten Arthritis induziert. Die gleiche A2-Linie ist wirksam bei der Impfung unbestrahlter Ratten gegenüber nachfolgender autoimmuner Arthritis, die durch aktive Immunisierung gegen Mycobakterien induziert wird. Die Zellinie A2 ist kloniert worden. Hierbei wurden zwei verschiedene Klone, die als A2b undA2c bezeichnet wurden, erhalten. A2b verursacht Arthritis, impft jedoch nicht gegen sie; Klon A2c verursacht keine Arthritis, impft jedoch gegen sie. Weiterhin kann zur Verhinderung von Arthritis der Klon A2c zur Behandlung von AA verwendet werden. Schließlich können die Klone A2b und A2c zur Identifizierung von Antigenen, welche mit Arthritogenizität oder mit der Unterdrückung von Arthritogenizität in Verbindung stehen, verwendet werden. Beide Klone reagieren gegenüber sämtlichen Mycobakterien sowie gegenüber Knorpel-Proteoglycan.
    • Beschreibung der Erfindung.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß ein Polypeptid mit einer Molekularmasse von etwa 64 kD dessen Herstellung in Infection and Immunitiy 1985, Seiten 800-806, beschrieben ist, als Immunogen, welches Resistenz gegenüber autoimmuner Arthritis und ähnlichen Autoimmunkrankheiten induziert, geeignet ist.
  • In dem oben erwähnten Artikel wird das fragliche Peptid als Antigen A bezeichnet, diese Bezeichnung wird hierin ebenfalls verwendet. Antigen A wurde erhalten durch Aufbauen einer Genbank aus Mycobakterium bovis BCG DNA in Escherichia coli durch Klonieren Sau3A-gespaltener Mycobakterium DNA-Fragmente in den Lambda-Vektor EMBL3. Die Expression mycobakterieller Antigene wurde durch Western-Blotting mit hyperimmunen Kaninchen-Seren analysiert. Der Artikel führt aus, daß unter 770 getesteten Klonen einige gefunden wurden, welche verschiedene mycobakterielle Antigene in geringen Mengen produzierten, in Konzentrationen, die im allgemeinen nahe der Nachweisgrenze liegen. Ein besonderer Klon wurde für die weitere Erforschung ausgewählt. Dieser Klon produzierte ein 64kD Antigen. Durch Plazieren des Lambda-Promoters P&sub1; vor das Strukturgen dieses Antigens wurde ein überproduzierender E. coli-Stamm erhalten. Der Artikel zeigt, daß mit dem 64kD Protein kreuzreagierende Antigene in einer breiten Varietät von Mycobakterien und ebenso in sogennannten gereinigten Proteinderivaten, die routinemäßig für Hautprüfungen verwendet werden, vorliegen. Schließlich wird in dem Artikel ausgeführt, daß Vorversuche auf das Vorhandensein von Antikörpern gegenüber dem 64kD Antigen in Seren von Tuberkulose Patienten hinweisen.
  • Es hat sich gezeigt, daß Antigen A die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Wie oben erwähnt, können die in EP-A-0 181 364 beschriebenen Klone A2b und A2c zur Identifizierung von Antigenen verwendet werden, die mit Arthritogenizität oder mit der Unterdrückung von Arthritogenizität in Verbindung stehen. Beide Klone reagieren gegenüber sämtlichen Mycobakterien und beide, A2b und A2c, reagieren gegenüber Antigen A.
  • Die T-Zellenklone A2b, A2c und die Kontroll-Zellinie Cla (Antieieralbumin) wurden hinsichtlich ihrer in vitro Proliferativen Reaktionen gegenüber Mycobacterium tuberculosis, Antigen A, E. coli-Kontrollysat, Eieralbumin (OVA) und Mytogen ConA in einem Standarttest (20 x 10³ Klon-/Linie-Zellen, 2 x 10&sup6; bestrahlte zusätzliche Zellen und Antigene in optimalen Konzentrationen pro Behältnis, ³H-Tymidin-Einbringung über 18 Stunden nach 48-stündiger Inkubation) geprüft. Die nachfolgende Tabelle A zeigt die Prüfergebnisse die als Stimulationsindices angegeben sind. Tabelle A Coli-Kontr.
  • Die in vivo-Potenz von Antigen A wurde durch Immunisieren von Ratten mit Antigen A vor und nach Induktion von Arthritis mit M. tuberculosis überprüft. Die Expositionsprüfung nach der Immunisierung wurde wie folgt durchgeführt:
  • Gruppen mit 4 Lewis-Ratten wurden durch intraperitoneale Inokulation von Wasser, Antigen A (50ug) und E. coli-Kontroll Lysat (zu einem coli- Gehalt von 50ug Antigen A äquivalente Menge) in Öl behandelt. 35 Tage später wurde die Empfindlichkeit gegenüber der Induktion von Adjuvans- Arthritis geprüft durch intrakutane Inokulation der Ratten mit M. tuberculosis (1 mg) in Öl.
  • Das Auftreten von Arthritis wurde durch tägliche Inspektion der Rattengelenke überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle B gezeigt. Tabelle B Primäre Immunisierung Sekundäre Exposition (35 Tage später) mit M. tuberculosis in Öl Inokulum in Öl Auftreten von Arthritis Auftreten von Arthritis klinischer Grad Wasser Antigen A E. coli-Kontr. schwer sehr schwach
  • Die Prüfungen unter Einbeziehung einer Inokulation nach Induktion autoimmuner Arthritis wurden wie folgt durchgeführt:
  • Arthritis wurde durch intrakutane Inokulation von Gruppen mit drei Lewis-Ratten mit M. tuberculosis (1 mg) in Öl induziert. Drei Tage später wurden die Ratten durch intraperitoneale Inokulation von Wasser, Antigen A (200ug) und E. coli-Kontroll-Lysat (zu einem coli-Gehalt von 200ug Antigen A äquivalente Menge) in Öl behandelt. Das Auftreten von Arthritis wurde durch tägliche Inspektion der Rattengelenke überprüft.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle C gezeigt. Tabelle C Am Tag 3 nach Krankheitsinduktion verabreichtes Inokulum Arthritis Auftreten klinischer Grad Wasser Antigen E. coli-Kontr. schwer sehr schwach
  • Es ist zu sehen, daß Antigen A selbst nicht arthritogen ist, jedoch das Auftreten von Arthritis nach aktiver Induktion der Krankheit um 50% reduziert und ebenso die Schwere der verbleibenden Krankheit beträchtlich verringert. Eine ähnliche Reduktion des Auftretens der Krankheit und der Schwere ist zu sehen, wenn Antigen A3 Tage nachdem die Krankheit induziert wurde, verabreicht wird. E. coli selbst zeigt keine Wirkung. Somit unterdrückt Antigen A Arthritis, während es nicht arthritogen ist.
  • Weiterhin hat sich gezeigt, daß Antigen A mit ähnlichen Proteinen in verschiedenen anderen Mycobakterien und E. coli sowie mit Treponema und gram-negativen Enterobakterien kreuzreagiert. Diese Kreuzreaktivität ist in der folgenden Tabelle D gezeigt. Tabelle D Kreuzreaktivität zwischen Antigen A und in anderen Bakterien vorhandenen Antigenen. Antig.A 64kD aus Mycobact. E.coli 60kD Trep-poli Shig. Salmon. Klebsiella Polycl. anti gemeins. Ag. Legion/Pseudom.
  • Seriologische Kreuzreaktivität, wie durch Western-Blot-Analyse gezeigt.
  • HATR 1-24 und F47- 10 sind monoklonale Antikörper, die gegen Treponema und Mycobacerium tuberculosis gesetzt wurden. Das polyklonale Serum wurde gegenüber dem gemeinsamen Antigen von Legionella und Pseudomonas gesetzt.
  • Dies deutet darauf hin, daß auf Antigen A vorhandene Epitope in ähnlicher Weise auf vermutlich äquivalenten Proteinen verschiedener Bakteriumspecies vorhanden sind, wie etwa von Mycobacterium, Escherichia, Treponema, Shigella, Salmonella, Yersinia, Nocardia, Campylobacter oder Klebsiella Species. Insbesondere ist die Antigen A-Aminosäuresequenz 190-213 ebenso in einem korrespondierenden 65 kD Protein aus Mycobacterium leprae vorhanden, mit der Ausnahme, daß in dem M. leprae-Protein die Aminosäure 206 nicht Prolin, sondern Alanin ist.
  • Weiterhin wurde gefunden, daß nur ein Teil der Antigen A-Sequenz für die stimulierende Aktivität auf die T-Zellenklone A2b und A2c verantwortlich ist. Dies wurde festgestellt durch Testen von Antigen A- Fragmenten, nämlich von verkürzten Derivaten, die durch Deletionsmutanten des Gens produziert wurden, von Fusionsproteinen mit β-Galactosidase und Proteolyse Produkten von Antigen A, hinsichtlich deren Fähigkeit, diese T-Zellenklone zu stimulieren. Diese Fragmente wurden mittels Rekombinant-DNA-Techniken durch Einbringung von Teilen des Antigen A-Gens, in manchen Fällen vereinigt mit dem β-Galactosidase-Gen, in ein Plasmid und Expression in E.coli K12 M1070, erhalten.
  • Es wurde gezeigt, daß das Peptid mit der Antigen A-Aminosäuresequenz 234-540 die Klone A2p und A2c nicht stimuliert. Das Fragment, welches die Aminosäurefrequenz 481-540 nicht enthielt, tat es jedoch. Die Peptide aus β-Galactosidase vereinigt mit Antigen A-Aminosäurefrequenzen 61-540,109-540 und 171-54O waren reaktiv, diejenigen mit Aminosäuresequenzen 272-540 und 280-540 waren nicht reaktiv. β-Galactosidase alleine war nicht reaktiv.
  • Das für die Stimulation der T-Zellenklone A2b und A2c verantwortliche Epitop befindet sich daher in der Aminosäuresequenz 171-234.
  • Weiterhin wurde gefunden, daß ein synthetisches Peptid mit der Antigen A-Aminosäuresequenz 180-196 ebenso durch die T-Zellenklone A2b und A2c erkannt wird. Somit enthält jedes Polypeptid, das aus mindestens 17 Aminosäureresten aufgebaut ist und in seinem Molekül die Antigen A- Aminosäuresequenz 180-196 beinhaltet, das zur Stimulation der T-Zellenklone A2b und A2c verantwortliche Epitop. Ein Beispiel eines solchen Polypeptids ist das Polypeptid mit der Antigen A-Aminosäuresequenz 171 - 240.
  • Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von Antigen A, das heißt dem Peptid mit der Sequenz von 540 Aminosäuren, wie vorangehend erwähnt, zur Herstellung von Zusammensetzungen für die Linderung, Behandlung und Diagnose von Autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritischen Zuständen.
  • Die Erfindung betrifft ebenso Polypeptide, die aus 17-70 Aminosäureresten aufgebaut sind und in deren Molekül die Antigen A-Aminosäuresequenz 180-196 umfassen.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung das Polypeptid mit der Antigen A- Aminosäuresequenz 171-240, wie folgt.
  • Obwohl die T-Zellenklone A2b und A2c gegenüber sämtlichen der oben definierten Polypeptide reagieren, kann die Antigenizität und Immunogenizität der Polypeptide verstärkt werden durch Ankupplung wenigstens eines Radikals bzw. Restes das bzw. der in der Lage ist, die Präsentation der antigenen Determinanten der Polypeptide zu verbessern. Solche Radikale sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise Radikale von Peptiden, des Tetanustoxoids, Diphterietoxoids, der β-Galactosidase sowie der mikrobiellen äußeren Membranproteine. Multimere der in Rede stehenden Polypeptide sind ebenso in Betracht zu ziehen. Die modifizierten Polypeptide gehören ebenso zum Gegenstand der Erfindung. Sämtliche erfindungsgemäßen Polypeptide, das heißt die Polypeptide die aus 17-70 Aminosäureresten aufgebaut sind und in deren Molekül die Antigen A-Aminosäuresequenz 180-196 einschließen, die oben definierten Peptide einschließlich den Multimeren, können als Immunogene in pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffen für die Linderung und Behandlung vonAutoimmunkrankheiten, insbesondere arthritischen Zuständen, sowie als Antigene in diagnostischen Zusammensetzungen für die Diagnose dieser Krankheiten verwendet werden. Diese pharmazeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen, die in bekannter Weise hergestellt werden können, gehören ebenso zum Gegenstand der Erfindung.
  • Ein weiterer Weg zur Verbesserung der Immunogenizität der erfindungsgemäßen Polypeptide besteht darin, mittels bekannter Gentechnologie-Verfahren Mikroorganismen zu konstruieren, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid entweder als solches oder als Teil eines Fusionsproteins oder als ein Multimer hiervon, exprimieren. Diese Mikroorganismen können zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes verwendet werden, der nicht nur die Produktion von Antikörpern gegen die in Rede stehenden Mikroorganismen provoziert, sondern ebenso für die Linderung und Behandlung von Autoimmunkrankheiten nützlich ist. Diese gentechnologisch veränderten Mikroorganismen und diese enthaltende pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören ebenso zum Gegenstand der Erfindung. Beispiele geeigneter gentechnologisch modifizierter Mikroorganismen sind Vaccinia- und Salmonella-Stämme.
  • Schließlich sieht die Erfindung Kits zur Durchführung Immmunologischer Tests vor, welche ein Behältnis mit mindestens einer der vorgenannten antigenen Verbindungen oder ein Behältnis mit der vorgenannten diagnostischen Zusammensetzung umfassen.
  • Die antigenen Verbindungen und diagnostischen Zusammensetzungen sowie die diagnostischen Kits gemäß der Erfindung können für verschiedene Arten von Untersuchungen verwendet werden, wie
  • a.1. Lymphozyten-Proliferationstest oder Bestimmung irgendeiner Entität, die für eine solche Proliferation indikativ ist;
  • a.2. Indikativ für die Messung der Lymphozyten-Aktivierung sind ebenso Änderungen, die durch Standardmittel geprüft werden können, um so das Vorhandensein und das Ausmaß der Lymphozyten-Aktivierung festzustellen: unter diesen können erwähnt werden:
  • a. Produktion von Lymphokinen (wie etwa Interleukin-2 (IL-2));
  • b. Gamma-Interferon;
  • c. Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF)
  • d. Expression von Membranmarkern, wie etwa IL-2-Rezeptor; Erdnuss-Agglutinations-Rezeptor;
  • e. Expression von Enzymen, wie etwa Heparanase.
  • b. Bestimmung von Antikörper-Titer in absoluten Werten oder als Verhältnis der durch verschiedene Zusammensetzungen erhaltene Werte, wobei diese Werte oder Verhältnisse für das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Krankheit indikativ sind. Erhaltene quantitative Werte sind zur Feststellung der Schwere der Krankheit nützlich.
  • Die diagnostischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können hergestellt werden durch Kombinieren einer oder mehrerer erfindungsgemäßer antigener Verbindungen, wie oben definiert, mit geeigneten Adjuvantien und Hilfskomponenten. Standarisierte Kits mit Referenz-und Eichmitteln sind wertvoll bei der raschen und bequemen Bestimmung einer arthritischen Krankheit und deren Stufe und/oder Schwere.

Claims (11)

1. Verwendung eines Peptids der Formel
zur Herstellung von Zusammensetzungen zur Linderung, Behandlung und Diagnose von Autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritischen Zuständen.
2. Polypeptid, das für die Diagnose von oder als Immunogen gegenüber Autoimmunkrankheiten geeignet ist, wobei das Polypeptid aus 17 bis 70 Aminosäureresten zusammengesetzt ist und in seinem Mokekül die Aminosäuresequenz 180-196 des in Anspruch 1 genannten Polypeptids enthält.
3. Polypeptid nach Anspruch 2 mit der folgenden Aminosäuresequenz:
4. Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, welche an mindestens ein Radikal gekuppelt ist, welches ihre Antigenizität und Immunogenizität verstärkt.
5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei das die Immunogenizität verstärkende Radikal ein Radikal eines Peptids, des Tetanustoxoids, Diphterietoxoids, der β-Galactosidase oder eines mikrobiellen äußeren Membranproteins ist.
6. Multimere der Verbindungen nach Anspruch 2 oder 3.
7. Mikroorganismen, welche eine Verbindung nach Anspruch 2 oder 3 als solche oder als Teil eines Fusionsproteins oder als Multimer exprimieren.
8. Mikroorganismen nach Anspruch 7, welche gentechnologisch veränderte Vaccinia- oder Salmonella-Stämme sind.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere Impfstoff gegen Autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritische Zustände, umfassend eine Verbindung nach einem der Anspüche 2 bis 6 oder einen Mlkroorganismus nach Anspruch 7 oder 8.
10.Diagnostische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 6.
11. Kit zur Durchführung immunologischer Tests, umfassend ein Behältnis mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 6 oder mit der diagnostischen Zusammensetzung nach Anspruch 10.
DE8787201691T 1986-09-09 1987-09-07 Verwendunng eines peptids zur herstellung von zusammensetzungen fuer die linderung, behandlung und diagnose von autoimmunkrankheiten, insbesondere arthritis, zu diesem peptid analoge verbindungen, mikro-organismen, die dieses peptid oder eine zu diesem peptid analoge verbindung produzieren, als auch pharmazeutische und diagnostische zusammensetzungen und test kits. Expired - Lifetime DE3781078T2 (de)

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