DE69327239T2

DE69327239T2 - Methoden and reagentien zur diagnose von autoantikörpern

Info

Publication number: DE69327239T2
Application number: DE69327239T
Authority: DE
Inventors: John Harley
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1992-04-13
Filing date: 1993-04-13
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2013-04-14
Also published as: DK0640101T3; EP0640101A4; ES2142867T3; JP2004002441A; EP0640101B1; AU679443B2; EP0640101A1; WO1993021223A1; ATE187459T1; DE69327239D1; CA2117904C; CA2117904A1; AU4102893A; JPH07509221A

Description

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Prävention, Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen, insbesondere systemischem Lupus erythematode.
Die Regierung der Vereinigten Staaten besitzt aufgrund von Zuweisungen der National Institutes of Health AR39577, AI24717, AI21568, AI31584 und AR01844 und der Veterans Administration Rechte an dieser Erfindung.
Systemischer Lupus erythematode (SLE) ist ähnlich vielen sonstigen Störungen, bei denen sich Autoantikörper finden und als bei der Ätiologie und Pathogenese von Bedeutung angesehen werden. SLE kann unter die Erkrankungen eingeordnet werden, bei denen üblicherweise Autoantikörper vorliegen, bei denen jedoch eine zentrale Rolle des Autoantikörpers bei der Pathogenese, die zu einer klinischen Expression führt, noch nicht vollständig festgestellt oder akzeptiert wurde. Sonstige derartige Erkrankungen umfassen das Sjogren- Syndrom, rheumatoide Arthritis, Jugenddiabetes mellitus, primär-biliäre Zirrhose, Wegener-Granulomatose, entzündliche Darmerkrankung und viele andere.
Typischerweise treten Autoimmunerkrankungen mit einer großen Reihe von Symptomen und klinischen Zeichen auf. Die Erzeugung zirkulierender Autoantikörper gegenüber Ribonucleoproteinkomplexen (RNPs) ist eine einigende Eigenschaft von einigen der rheumatischen Autoimmunerkrankungen. Die häufigsten Antigene bei SLE und eng verwandten Störungen umfassen: Ro/SSA, La/SSB, nRNP und Sm. Anfänglich wurden diese Antikörper unter Verwendung von doppelter Immundiffusion gefunden, doch wurden in jüngerer Zeit empfindliche Festphasen tests zur quantitativen Bestimmung der Autoantikörper entwickelt.
Das Ro/SSA-RNA-Proteinpartikel erwies sich als Bestandteil aller bisher evaluierten humanen Zellen. Nahezu die Hälfte der Patienten mit Sjogren-Syndrom (SS) und systemischem Lupus erythematode (SLE) besitzen anti-Ro/SSA-Präzipitine. Etwa 75% der Patienten mit subakutem kutanem Lupus erythematode oder Komplementkomponente-C2-Mangel mit SLE besitzen anti-Ro/SSA-Präzipitine. Über 80% der Mütter von Neugeborenen mit Neugeborenen-Lupus dermatitis oder angeborenem vollständigem Herzblock besitzen diesen Autoantikörper. 5% der Patienten mit rheumatoider Arthritis, Polymyositis und fortschreitender systemischer Sklerose besitzen anti-Ro/SSA nach dem Bericht von R. M. Bernstein et al., Mol. Biol. Med. 2: 105-120 (1984); und J. B. Harley und K. K. Gaither, "Autoantibodies. In Rheumatic Disease Clinics of North American: Systemic Lupus Erythematosus" 14: 1, 43-56 (1988)
Antikörper gegenüber dem La/SSB-Ribonucleoproteinantigen finden sich ebenfalls in Patienten mit SS und SLE nach dem Bericht von Alspaugh et al., Arthritis Rheum. 19: 216 (1976) und Mattioli et al., Arthritis Rheum. 17: 421 (1974). Außerdem werden diese Antikörper nach dem Bericht von Horsfall et al., J. Autoimmunity 4: 165 (1991) als pathogen für den Fötus während der Schwangerschaft bei einigen Müttern, die anti- La/SSB-Autoantikörper besitzen, gehalten, wo sie zusammen mit anti-Ro/SSA in Verbindung mit angeborenem vollständigem Herzblock (CCHB) stehen.
Es war Gegenstand einer intensiven Debatte, ob die vielen bei systemischem Lupus erythematode und verwandten Erkrankungen gefundenen Autoantikörper eine antigenspezifische oder eine polyklonale, nicht für ein Antigen spezifische Antwort darstellen. Es ist ganz offensichtlich, daß Autoantikörper bei der Expression von SLE und verwandten Syndro men wichtig ist. Eine spezifische Verarmung bei einem Neugeborenem mit Herzblock (J. B. Harley et al., Arthritis Rheum. 28 : 1321-1325 (1985)) und die spezifische Ablagerung von anti-Ro/SSA-Immunglobin in menschlicher Haut (L. A. Lee et al., J. Clin. Invest. 83 : 1556-1562 (1989)) wurden aufgezeigt. Eine spezifische Konzentration von anti-Ro/SSA wurde im Immunglobulin von Niereneluaten von mit Lupus nephritis befallenen Nieren gezeigt (P. J. Maddison und M. Reichlin, Arthritis Rheum. 22: 858-863 (1979)). Anti-Ro/SSA wurde spezifisch konzentriert in einer Ohrspeicheldrüse eines Patienten mit Sjogren-Syndrom und primär-biliärer Zirrhose gefunden (E. Penner und M. Reichlin, Arthritis Rheum., 25 : 1250- 1253 (1982)). Beobachtungen, daß Kinder mit über die Placenta erworbenem mütterlichem IgG Neugeborenen-Lupus dermatitis und/oder angeborenen vollständigen Herzblock entwickeln (J. B. Harley und K. K. Gaither: "Autoantibodies, In Rheumatic Disease Clinics of North America: Systemic Lupus Erythematosus" 14: 1, 43-56 (1988)) legen stark nahe, daß über die Placenta transportierter mütterlicher Autoantikörper (anti-Ro/SSA oder anti-La/SSB) eine kritische Komponente ist, die für diese klinischen Probleme erforderlich, jedoch nicht ausreichend ist.
Für die Ro/SSA-Familie von Proteinen wurden nun mehrere Molekülformen aufgezeigt, die als Arbeitsgrundlage durch das Molekulargewicht des identifizierten Antigens definiert werden. Eine Hauptform besitzt ein offensichtliches Molekulargewicht von 60 kiloDalton (kD). Dieses Protein ist mit einem von vier hY-RNAs assoziiert. Vor kurzem wurden zwei weitere, durch anti-Ro/SSA-Seren gebundene Proteine durch M. D. Rader et al., J. Clin. Invest. 83: 1556-1562 (1989) mit Molekulargewichten von 52 kD und 54 kD identifiziert. Ein 48-kD-Protein, Calmodulin, wurde als durch anti-Ro/SSA-Seren gebunden identifiziert (McCauliffe et al., J. Clin. Invest. 85: 1379- 1391 (1990)). Das La/SSB-Protein, ein 48-kD-Peptid, beschrieben von J. C. Chambers und J. D. Keene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2115-2119 (1985), ist ebenfalls ein Glied dieser Gruppe von Autoantikörpern und es bindet kleine RNAs mit einem Polyuridinterminus nach dem Bericht von J. E. Stephano, Cell 36: 145-154 (1984). La/SSB wird durch ein drittes der anti-Ro/SSA-Präzipitin-positiven Seren gebunden. Das La/SSB-Protein wurde aus einer Reihe von Gewebequellen gereinigt und erwies sich als monomeres Phosphoprotein von 46-50 kD nach dem Bericht von Habets et al., EMBO J. 2: 1625 (1983) und Venables et al., Clin. Exp. Immunol. 54: 731 (1983). Es assoziiert mit RNA-Polymerase-III-Transkripten nach dem Bericht von Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5495 (1979) und Steitz et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 47: 893 (1983) und kann nach dem Bericht von Gottlieb et al., EMBO J. 8: 841 (1989) als Terminationsfaktor für dieses Enzym fungieren. Eine nucleinsäureabhängige ATPase/dATPase-Enzymaktivität wurde von Bachmann et al., Cell 60: 85 (1990) ebenfalls La/SSB zugeordnet.
Anti-Sm-Antikörper sind häufig mit SLE assoziiert. Diese Autoantikörper fällen snRNP, das die U1-, U2-, U4/U6- und US-RNA enthält. Diese Komplexe bilden das Spleißosom und spleißen heterogene nucleäre RNA nach dem Bericht von Sharp, Science 235: 766 (1987) und Maniatis und Reed, Nature 325: 673 (1987). Anti-Sm-Antikörper sind gegen eines oder eine Kombination von sechs Polypeptiden: B (26 kDa), B' (27 kDa), D (13 kDa), E/F (11-kDa-Dublett) und G (weniger als 10 kDa) gerichtet.
Nahezu alle Patienten mit einer rheumatischen Erkrankung, die bei der Ouchterlony-Immundiffusion ein anti-Sm-Präzipitin bilden, besitzen nach dem Bericht von Fisher et al., Arthritis Rheum. 28: 1348 (1985) ein anti-nRNP-Präzipitin oder entwickeln dieses. Anti-Sm- und anti-nRNP-Präzipitine bilden bei der Ouchterlony-Immundiffusion nach der Diskussion von Mattioli und Reichlin, J. Immunol. 110: 1318 (1973) eine partiell identische Linie. Die Grundlage für diese par tiell geteilte Antigenität läßt sich durch die Zusammensetzung der U-snRNP-Partikel erklären. Das Antigen für das anti-nRNP-Präzipitin sind die bei U1-snRNP singulären Peptide A und C von 70 kD. Die Peptide B/B' und D finden sich ebenfalls auf dem U1-snRNP. Das B/B'- und D-Ag, jedoch nicht das A oder C von 70 kDa finden sich in dem U2-, U4/6- und US-snRNP. Daher binden sowohl anti-Sm als auch anti-nRNP anti-U1-snRNP-Aktivität, jedoch bindet nur anti-Sm U2-, U4/U6- und US-snRNP.
Die am 31. Januar 1991 von John B. Harley eingereichte US- Anmeldung mit dem Aktenzeichen 07/648 205 zu "Assays and Treatments for Autoimmune Diseases" und die am 31. Januar 1990 eingereichte US-Anmeldung mit dem Aktenzeichnen 07/472 947 mit dem Titel "Assays and Treatments for Autoimmune Diseases", entsprechen der WO-91/11718 und beschreiben ein spezielles Verfahren zur Identifizierung der für die Erzeugung von für eine spezielle Störung charakteristischen Autoantikörpern verantwortlichen ätiologischen oder antigenen Substanz. Das Antigen wird zunächst unter Verwendung von beispielsweise aus einem oder mehr Patienten isolierten Autoantikörpern isoliert. Das Antigen wird dann in überlappende kurze Aminosäuresequenzen, zweckmäßigerweise 20 Aminosäuren oder weniger, vorzugsweise Octapeptide, zerlegt. Die Sequenzen mit der größten Reaktivität mit den Autoantikörpern werden identifiziert und dann mit allen bekannten Aminosäuresequenzen unter Verwendung der verfügbaren Computerdatenbanken verglichen. Das Protein mit der größten Zahl oder dem größten Anteil von zu den Sequenzen mit der größten Reaktivität mit den Autoantikörpern homologen Sequenzen ist unter den wahrscheinlichsten Kandidaten der bekannten sequenzierten Proteine für die ätiologische Substanz oder das Immunogen. Sobald die ätiologische Substanz und die antigenen Sequenzen bekannt sind, können Tests und Reagenzien zur Diagnose und Behandlung von Patienten mit entweder der ätiologischen Substanz und/oder Autoantikörpern entworfen werden.
Barakt et al., Clin. Exp. Immunol. (1996) 86, 71-78 betrifft eine Epitopkartierungsuntersuchung, in der 13 Peptide, die den Resten 1-11, 7-37, 35-38, 56-77, 74-96, 103-135, 131- 153, 149-166, 163-184, 180-205, 203-225, 224-251 und 257-282 in der Sequenz von snRNP UlA entsprechen, synthetisiert wurden.
Die Beispiele in den früheren Anmeldungen verwendeten von der Sequenz für das Ro/SSA-Protein von 60 kDa und La/SSB abgeleitete Peptide, die mit Antiseren von SLE- und SS-Patienten reaktiv waren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung zusätzlicher Diagnosereagenzien zur Identifizierung und Klassifizierung von Individuen, die bereits einem speziellen Immunogen ausgesetzt waren oder mit Ro/SSA, La/SSB, nRNP oder Sm-B/B'-Polyeptiden reaktive Autoantikörper oder die Produktion der Autoantikörper anregende Epitope (oder ihr Immunäquivalent) exprimieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur Identifizierung und Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie systemischer Lupus erythematode und Sjogren-Syndrom. Die Erfindung liefert ein ein lineares Epitop für einen humanen Antikörper bildendes Peptid nach der Definition in den beigefügten Ansprüchen.
Es wurde eine Anzahl von Octapeptiden aus den Sequenzen mit Codierung für das 60-kDa-RoiSSA-Peptid, das La/SSB-Autoantigen, das nucleäre Ribonucleoprotein mit 70 kD (nRNP) und das Sm-B/B'-Polypeptid hergestellt, die lineare Epitope für in den Seren von SLE- und SS-Patienten vorhandene Autoantikörper darstellen.
Beispielsweise sind die aus Sm-B/B' abgeleiteten wichtigsten antigenen Peptide (29) GTFKAFDK, (45) CDEFRKIKPKNAKQP, (94) RVPLAGAA, (101) AGGPGVGRAAGRGVPAG, (125) AGLAGPVRGVGGPSQ, (140) QVMTPOGRGTVA, (165) PTQYPPGRGTPPPPV, (174) TPPPPVGRATPPPGI, (184) PPPGIMAP, (189) MAPPPGMRPPM, (202) PIGLPPARGTPIGMPP, (212) PIGMPPPG, (221) RPPPPGIRGPP und (228) RGPPPPGMRFFR. Weitere reaktive Peptide können von (30) TFKAFDKHM, (83) EGPPPKDT, (88) KDTGIARV und (120) IPOAPAGLAG abgeleitet werden. Diese wurden durch Bindungsuntersuchungen bestimmt. PPPGMRPP ist besonders antigen und wird in der Sequenz von B/B' dreimal wiederholt. Die Antigenität anderer Peptide wurde bestimmt und umfaßt die kürzeren Peptide PPPGMRP und PPPGMR. Substitutionsuntersuchungen wurden ebenfalls durchgeführt. Alle 19 der sonstigen üblichen natürlich vorkommenden Aminosäuren werden anstelle einer Aminosäure in einer speziellen Position substituiert. Beispielsweise kann das Arginin an Position 6 von PPPGMRPP durch: F, G, H, I, K, S, T, V, W und Y substituiert werden.
Diese Peptide eignen sich für Festphasentests für durch das Vorhandensein dieser Autoantikörper gekennzeichnete Patienten und können verwendet werden, um Patienten bezüglich der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung bestimmter mit SLE verbundener Störungen zu kategorisieren. Die Peptide eignen sich möglicherweise auch bei der Behandlung dieser Patienten, wobei immobilisiertes Peptid zur Entfernung von Autoantikörper, zur Blockierung der Bindung der Antikörper mit mit den Autoantikörpern reaktiven Patientenmolekülen oder als Komponente eines Impfstoffs verwendet wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm der antigenen Regiohen von Sm B/B' mit den mit einer Extinktion von über 0,50 bindenden Octapeptiden und den sie umgebenden Octapeptiden.
Fig. 2 ist ein Diagramm der Ergebnisse von Deletionsuntersuchungen an dem Sm-B/B'-Epitop PPPGMRPP: Fig. 2a zeigt die Abnahme der Bindung bei einer Entfernung von Aminosäuren aus dem Epitop; Fig. 2b zeigt die Wirkung der Substitution des Arginins an der sechsten Position.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Eine Anzahl von vorzugsweise aus 8 Aminosäuren bestehenden Peptiden, die durch für SLE und sonstige Autoimmunerkrankungen charakteristische humane Autoantikörper gebunden werden, werden offenbart. Die Peptide werden auf der Grundlage der veröffentlichten Aminosäuresequenzen für bekannten Autoantigene, Ro/SSA, La/SSB, nRNP und Sm-B/B' synthetisch hergestellt. Sie besitzen eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten, beispielsweise als Komponenten bei diagnostischen Tests, möglicherweise als Therapeutika und bei der Forschung bezüglich der möglichen Ursachen dieser Autoimmunerkrankungen.

Definition linearer Enitope und Syntheseverfahren

Der hier verwendete Ausdruck "Peptid"' ist so definiert, daß es aus weniger als 100 Aminosäuren besteht und im allgemeinen ein Octapeptid ist. Peptide aus bis zu 40 Aminosäuren, vorzugsweise aus zwischen 4 und 25 Aminosäuren, können unter Verwendung eines der Fachleuten bekannten Verfahren synthetisiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren wird detailliert in den Beispielen beschrieben. Die in den hier gegebenen Beispielen beschriebenen Octapeptide werden aus veröffent lichten Sequenzen, die die Autoantigene codieren, abgeleitet. Die Zahl in Klammern ist die Sequenzposition für den ersten Aminosäurerest des ersten bindenden Octapeptids. Der unterstrichene Teil der Sequenzen sind die Octapeptide mit der größten Bindung.
Trotz der Beschreibung unter Bezug auf spezielle Sequenzen kann in den Peptiden eine Anzahl von Substitutionen unter Verwendung natürlicher oder synthetischer Aminosäuren durchgeführt werden, wobei ein Peptid, das als zur offenbarten Sequenz funktionell äquivalentes lineares Epitop wirkt, wie in den Beispielen 3 und 4 gezeigt, erhalten wird. Daher wird der Ausdruck eines durch eine spezielle Sequenz definierten linearen Epitops hier so verwendet, daß er Peptide mit Substitutionen, die ein in einer äquivalenten Weise oder einem äquivalenten Ausmaß durch einen Antikörper gebundenes Peptid ergeben, umfaßt.
Beispielsweise zeigten Substitutionsuntersuchungen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Peptiddeterminanten von Sm-B/B', daß R in PPPGMRPP durch A, G und S bei der Bindung eines Antikörpers, KSm3, substituiert werden kann. Analog kann I in PPPGIRGP durch F, H, T, V und Y bei der Bindung von KSm3 substituiert werden.
Während die monoklonalen Antikörper sehr instruktiv sein können, ist es von Bedeutung, zu erkennen, daß die von Patienten erhaltenen polyklonalen Autoimmunseren zu viel komplizierteren Bindungsphänomenen führen können.

Durchmustern von Peptiden durch Binden an Autoantikörper

Die Festphasenbindung von Autoantikörpern an Peptide erwies sich als günstig, um sequentielle lineare Epitope zu untersuchen und wichtige Reste in einer Epitopstruktur zu definieren, ist jedoch vermutlich weniger günstig bei der Defi nition von Konformationsepitopen oder -regionen, bei denen zwei oder mehr lineare, jedoch nicht sequentielle Epitope durch die Tertiärstruktur zusammengebracht werden. Außerdem können - obwohl viele Peptide dazu neigen, in Lösung Konformationen anzunehmen, die sich in der nativen Proteinstruktur nicht finden - wirkliche Epitope dennoch durch dieses Verfahren skizziert werden. Die Peptide, die eher eine der in dem nativen Molekül gefundenen ähnliche Struktur besitzen, werden durch einen größeren Teil der Autoantikörper, die die analoge Sequenz auf dem nativen Protein binden, gebunden und können auch mit einer größeren Affinität gebunden sein.
Die im folgenden gegebenen Beispiele beschreiben detailliert, wie die Peptide synthetisiert und bezüglich Bindung durchmustert werden können.

Verwendung von Peptiden bei der Behandlung und Klassifikation von Patienten

Unterklassen antigener Peptide bieten die Möglichkeit, Risikopatienten bezüglich spezieller klinischer Manifestationen oder Patienten in Gruppen mit spezieller Prognose zu identifizieren. Die hier offenbarten Peptide können in Kombination in Tests, beispielsweise dem Festphasentest, zur Klassifikation von Patienten verwendet werden.
Insbesondere werden die Peptide, die durch Autoantikörper in durch spezielle Erkrankungen, wie eine Nierenerkrankung oder eine Zentralnervensystemstärung, gekennzeichneten Patienten gebunden werden, in einem Test, beispielsweise einem ELISA, für einen Test zum Nachweis der diese spezielle Peptidsammlung bindenden Sammlungsautoantikörper ausgewählt und kombiniert. Durch die Verwendung eines Peptidgemischs kann die Effizienz und Verläßlichkeit solcher Tests im Vergleich zur Verwendung eines einzigen Autoantigens oder eines einzigen Peptids erhöht werden.
Die Peptide können in Lösung oder an einem festen Substrat immobilisiert, beispielsweise einem für Affinitätschromatographie geeigneten Gel, oder einer Platte mit Mehrfachvertiefungen unter Verwendung von Standardverfahren, wie dem im Handel erhältlichen Cyanbromid, verwendet werden.
Die Peptide können therapeutisch in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwendet werden. Die Peptide können in einer zur Blockierung von Autoantikörpern wirksamen Dosierungsmenge oder als Impfstoff zur Blockade der Autoantikörper durch Hervorrufen einer Immunantwort verabreicht werden. Das Peptid wirkt als funktioneller Antagonist durch ein die Immunzellen nicht stimulierendes oder aktivierendes Binden an den Antikörper und blockiert dadurch die Immunantwort auf die Autoantigene.
Pharmazeutische Träger sind Fachleuten bekannt und umfassen die Einkapselung von Verbindungen zur oralen Verabreichung, beispielsweise in einen enterischen Überzug oder in Kombination mit einem Bindemittel, wie Stearat oder Lactose, oder in Lösung. Akzeptable Lösungen umfassen steriles Wasser, Kochsalzlösung und gepufferte Lösungen bei physiologischem pH-Wert. Als Impfstoffe verwendete Peptide können oral, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Andere Verbindungen werden gemäß von Fachleuten verwendeten Standardverfahren verabreicht. In der hier gegebenen Definition ist ein pharmazeutischer Träger üblicherweise inert als solcher, er kann jedoch biologische Aktivität aufweisen. Beispielsweise kann ein Impfstoff aus immunogenen Peptiden oder Proteinen in. Kombination mit einem Hilfsstoff bestehen.
Alternativ können die zur Behandlung verwendeten Peptide zu einer identifizierten antigenen Sequenz homologe Peptide umfassen. Diese Peptide können entweder frei oder an einen Träger gebunden an einen Patienten zur Verringerung der Menge an zirkulierendem Antikörper mit einer speziellen Spezi fität verabreicht werden. Zusätzlich kann die Kenntnis von Epitopen mit einer Kreuzreaktion zwischen einem Fremdantigen und einem Autoantigen eine Reinduktion der Toleranz ermöglichen. In experimentellen Modellen der Immunantwort ist bekannt, daß durch Behandlung mit dem Antigen die Reaktion unterdrückt und Toleranz induziert werden kann. Eine Peptidtherapie mit den Sequenzen mit Kreuzreaktion kann eine mögliche Therapie bei Autoimmunerkrankungen sein.
Die Aminosäuresequenzen können auch verwendet werden, um Substanzen zur Neutralisierung von zirkulierenden oder auf Substraten in extrakorporalen Vorrichtungen zur spezifischen Entfernung von Autoantikörpern immobilisierten Antikörpern unter Verwendung von Fachleuten bekannten Techniken herzustellen.
Die vorliegende Erfindung läßt sich unter Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele genauer verstehen:

Beispiel 1: Identifizierung linearer Epitope des La/SSB- Autoantigens

Patienten und Verfahren

Peptidsynthese: Bei der aus der Nucleotidsequenz von cDNA- Klonen vorhergesagten La/SSB-Aminosäuresequenz handelte es sich um die Sequenz nach dem Bericht von Chambers et al., J. Biol. Chem. 263: 18043 (1988) und Sturgess et al., J. Immunol. 140: 3212 (1988), deren Lehren hier eingearbeitet sind. Die vermutlich vollständige La/SSB-Peptidsequenz mit 408 Aminosäuren wurde verwendet, um simultan aufeinanderfolgende Octapeptide, die jeweils 7 Aminosäuren mit ihrem Nachbar überlappen, auf Polystyrolpins zu konstruieren. Die gesamte Aminosäuresequenz des La/SSB-Proteins wurde auf 5 Blocks mit 96 Pins in einem Format 8 · 12 synthetisiert. Auf jedem Pinblock wurden drei identische Octapeptide zur posi tiven Kontrolle mit der Sequenz EYRKKMDI, die ein Hauptepitop aus der carboxylterminalen Sequenz des humanen 60-kD- Ro/SSA-Proteins darstellt, synthetisiert. Die Inkubation von Verdünnungen von anti-Ro/SSA-Referenzserum auf diesen Kontrollpins während jedes Tests machte Vergleiche zwischen Platten und Tests möglich.
Festhasen-anti-Peptidtest: Alle Stufen wurden durch Eintauchen der Pinblocks in Mikrotiterplattenvertiefungen durchgeführt. Die Pins wurden in Blockierungspuffer (1% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,2) 1 h lang bei Raumtemperatur und anschließend in 1 : 100-Verdünnungen von Seren in Verdünnungsmittel (1% BSA und 0,05% Tween in PBS) über Nacht bei 40ºC in befeuchteten Containern inkubiert. Die Pinblocks wurden 10 min lang unter Rühren viermal mit Waschpuffer (0,05% Tween in PBS) gewaschen und anschließend 1 h lang bei Raumtemperatur in affinitätsgereinigtem, mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-anti-human-kettenspezifischem Antikörper (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), der mit 1 : 1000 in einem Verdünnungsmittel verdünnt war, eingetaucht. Nach dem Waschen in der geschilderten Weise wurden die Pins in p-Nitrophenylphosphatlösung 2 h bei 37ºC inkubiert. Die Farbentwicklung wurde bei 410 nm auf einem Dynatech MR5000 ELISA-Plattenlesegerät abgelesen.
Regeneration der Pins: Nach der Substratentwicklung wurden Pinblocks in einem frisch zubereitetes 1% Natriumdodecylsulfat und 0,1% 2-Mercaptoethanol enthaltenden Ultraschallwasserbad von 50-60ºC 1 h lang inkubiert. Sie wurden anschließend zweimal in destilliertem Wasser gespült, auf 50-60ºC vorgeheizt und schließlich 2 min lang in siedendes Methanol getaucht, bevor sie an Luft getrocknet wurden.
Darstellung der Ergebnisse: Die Variation innerhalb und zwischen den Tests wurde standardisiert, indem die auf jedem Block vorhandenen Ro/SSA-Peptidpins zur positiven Kontrolle, die mit anti-Ro/SSA-Refererizserum bei einer Verdünnung von 3 : 1000 inkubiert worden waren, auf einen konstanten Wert von 0,175 bei A&sub4;&sub1;&sub0; genormt wurden. Alle Extinktionsdaten wurden auf diese Weise durch Multiplizieren mit dem Umwandlungsfaktor Aobs/0,175, wobei Aobs der beobachtete A&sub4;&sub1;&sub0;-Wert für das mit 3 : 1000 anti-Ro/SSA-Referenzserum inkubierte Ro/SSA-Kontrollpin für jeden gegebenen Test ist, genormt. Die Extinktion für jedes Octapeptid wurde unter Verwendung eines Kalkulationstabellenprogramms (AOK.abc Version 2.4) auf einem VAX-8250/VMS-Computer aufgetragen.
Proben: Seren von fünf normalen gesunden Spendern und zehn Patienten mit primärem SS und/oder SLE wurden durch Pin- ELISA bezüglicban die La/SSB-Octapeptide bindenden Antikörpern durchmustert. Acht dieser zehn Patienten wiesen Autoantikörper auf, die sowohl anti-Ro/SSA als auch anti-La/SSB- Präzipitin bildeten, und sieben dieser acht hatten ausgetragene Kinder mit angeborenem Herzblock (CCHB). Zwei Patienten besaßen Antikörper gegen lediglich Ro/SSA. Anti-La/SSB-Antikörper wurden aus den Seren von zwei Patienten auf La/SSBquervernetzten Immunsorbenzien nach der Beschreibung von Horsfall et al., J. Immunol. Meth. 104: 43 (1987) affinitätsgereinigt.
Feststellung von Enitopen mit linearer Sequenz: Die Hintergrundbindung wurde durch die gesamte mittlere Reaktivität (A&sub4;&sub1;&sub0;) von fünf normalen Seren gegenüber der Gesamt-La/SSB- Sequenz definiert (O. D. = 0,333 ± 0,128 Standardabweichung) Reaktivitätsregionen, die mehr als 3,5 Standardabweichungen oder 3,5 Standardabweichungen über der Hintergrundbindung lagen (äquivalent zu 0,9998 der Normalverteilung) und von mindestens drei Patientenseren gebunden wurden, wurden als mögliche La/SSB-Epitope darstellend angesehen. Die Epitope wurden in der Reihenfolge von der größten bis zur geringsten Reaktivität numeriert. Bei der Durchführung wurde diese zu nächst durch die Anzahl der Patienten, die stärker als oder gleich 3,5 Standardabweichungen über dem normalen Mittelwert als Maß des Konservierungsgrads zwischen den Seren banden, definiert. Als zweites Kriterium wurde der Mittelwert der Größe der Spitzenreaktivität der Patienten in der Region des vermutlichen Epitops verwendet, um Epitope, die mit der gleichen Anzahl von Patientenseren eine Bindung eingehen, einzustufen. In einigen Fällen konnte ein Epitop aus einem einzigen Octapeptid bestehen und in anderen wurde ein breiter Reaktivätsbereich über mehrere Octapeptide beobachtet. In einigen dieser letzteren Fälle wurde mehr als ein vermutliches Epitop identifiziert.

Ergebnisse

Bindung von anti-La/SSB-Antikörpern an La/SSB-Octapeptide:

Alle acht anti-La/SSB-positiven Patientenseren wiesen stark gebundene ausgewählte La/SSB-Octapeptide auf, die die gesamte Sequenz von den aminoterminalen bis zu den carboxylterminalen Regionen umfassen. Normale Seren binden ebenfalls, jedoch mit einem viel geringeren Grad. Seren, denen anti- La/SSB-Antikörper fehlen, die jedoch hohe Titer an sonstigen Autoantikörpern besitzen, zeigten ebenfalls eine geringe Reaktivität gegenüber der La/SSB-Sequenz, die mit einem Hintergrundansprechen konsistent ist. Das in diesen Untersuchungen verwendete, gamma-kettenspezifische Ziege-antihuman-Antikörperkonjugat bindet in Abwesenheit von Humanserum nicht signifikant an die Octapeptide.

Durch anti-La/SSB-Seren von Patienten definierte Epitope:

Als positive Reaktivität wurde eine Reaktivität definiert, die größer als oder gleich 3,5 Standardabweichungen über der mittleren Reaktivität von fünf normalen Seren gegenüber überlappenden Octapeptiden aus der gesamten La/SSB-Sequenz liegt. Regionen, die durch drei oder mehr anti-La/SSB-Seren erkannt wurden, wurden in dieser Untersuchung als mögliche Epitope definiert, obwohl mit einem oder zwei Autoimmunseren reaktive Regionen ebenfalls Epitope darstellen können.
Kein Epitop wurde von allen acht getesteten Seren gebunden; jedoch wurden 13 der auf diese Weise definierten 18 Epitope durch mindestens vier Seren gebunden. Außerdem tendiert die Spitzenreaktivität innerhalb jedes Epitops zu einer Variation zwischen den Patientenseren, was ein individuelles Ansprechen spiegelt. Obwohl daher drei Patienten an Octapeptide von Epitop 18 banden, trat die stärkste Bindung nicht mit dem gleichen Octapeptid auf. Kontrollseren weisen nach diesem Kriterium ebenfalls eine minimale, wenn auch positive Bindung an die La/SSB-Sequenz auf. Wichtiger ist jedoch, daß zwei weitere Autoimmunseren ohne nachweisbare anti-La/SSB-Antikörper kein Octapeptid aus der La/SSB- Sequenz in einer Stärke von 3,5 Standardabweichungen über dem Mittelwert der normalen Seren binden.
Die Epitope wurden gemäß Tabelle I aufeinanderfolgend vom größtem zum kleinsten numeriert, wobei zunächst die Anzahl der reagierenden Seren und anschließend die relative Stärke des Ansprechens berücksichtigt wurden. Einige dieser Epitope entsprechen Bereichen mit hohem antigenem Index oder Hydrophilie nach der Voraussage der Plots von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105 (1982). Tabelle 1. La/SSB-Autoepitope
Die Position bezieht sich auf die vom N-Terminus aus numerierten Aminosäuren in der La/SSB-Sequenz. Die Epitope sind als eine Reaktivität von mindestens 3,5 Standardabweichungen über dem Hintergrund in mindestens drei anti-La/SSB-Patientenseren aufweisend definiert. Die Epitope sind vom größten zum geringsten in der Reihenfolge des Bindungsgrades numeriert. Die Octapeptide jedes vermutlichen Epitops mit der größten Bindung sind unterstrichen. In Fällen, in denen zwei Octapeptide innerhalb eines speziellen Epitops eine sehr ähnliche Bindung besitzen, sind beide unterstrichen.

Bindung von affinitätsgereinigten anti-La/SSB-Antikörpern

Anti-La/SSB-Antikörper von zwei Patienten wurden auf La/SSBquervernetzten-Immunsorbenzien affinitätsgereinigt. Die affinitätsangereicherte anti-La/SSB-Präparation von Patient E11 ist relativ zu dem Serum, aus dem es hergestellt wurde, spezifisch bezüglich anti-La/SSB-Bindungsaktivität erhöht. Die affinitätsangereicherte Präparation bindet 17 der 18 zuvor identifizierten Epitope mit Ausnahme des Epitops 17 (Octapeptid 379); diese Präparation bindet jedoch zu Epitop 17 benachbarte Octapeptide, insbesondere die Octapeptide 380 und 382. Die vermutlichen Epitope, in denen eine Bindung am stärksten angereichert ist, umfassen die Epitope, 2, 3, 6, 9, 10, 12, 13 und 15. Diese gleichen Epitope scheinen angereichert zu sein, unabhängig davon, ob Spitzenreaktivitäten oder mittlere Reaktivitäten für jedes vermutliche Epitop verglichen werden. Im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wurden aus einer affinitätsangereicherten Präparation des anti-La/SSB von einem zweiten Patienten erhalten. Dieses Aufzeigen einer verstärkten Bindung mit einer erhöhten anti- La/SSB-spezifischen Aktivität ist ein starker Beweis dafür, daß zumindest diese Peptidsequenzen lineare Epitope der anti-La/SSB-Autoimmunantwort darstellen.

Reproduzierbarkeit des La/SSB-Pin-ELISA

Die Reproduzierbarkeit der anti-Ro/SSA-Referenzserumbindung an die Ro/SSA-Octapeptid (EYRKKMDI)-Pins zur positiven Kontrolle wurde durchgehend während der Untersuchung verfolgt, wobei eine mittlere Standardabweichung zwischen Tests von 14,0% und 16,3% für in 1 : 100- bzw. 3 : 100-anti-Ro/SSA-Referenzserum inkubierten Pins erhalten wurde. Seren mit und ohne anti-La/SSB-Antikörpern lieferten in gleicher Weise konsistente Ergebnisse, wenn sie im Pin-ELISA wiederholt wurden.
Gemeinsame Sequenzen mit herzbezogenen Proteinen: Eine aufeinanderfolgende Aminosäuresequenz tritt zwischen der schweren Kette von humanem Herz-β-Myosin und drei linearen Regionen in der La/SSB-Sequenz, von denen zwei mit La/SSB- Epitopen zusammenfallen, auf. Innerhalb der Epitope 13 (La/SSB-Aminosäuren 277 bis 280) ist eine Sequenz aus vier Aminosäuren zu Herz-β-Myosin gleich (Sequenzreste 453 bis 456), während ein Pentapeptid innerhalb des Epitops 18 (204 bis 208) und von Herz-β-Myosin (619 bis 623) gleich sind. Drei der fünf zu dem M6-Protein von Streptoccocus pyogenes, dem mit rheumatischer Herzerkrankung assoziierten Bakterium, gleichen homologen Sequenzen fallen in die La/SSB-Epitope. Speziell treten zwei Pentapeptid-Übereinstimmungen in den La/SSB-Epitopen 5 (59 bis 63) und 18 (203 bis 207) auf, während eine Tetrapeptid-Übereinstimmung im Epitop 13 (276 bis 279) liegt. Überraschenderweise teilen die Epitope 13 und 18 auch eine Aminosäuresequenz mit der B1-Kette von Laminin, einem in allen Grundmembranen einschließlich der Sarcolemmalmembran des Herzens auftretenden Haftglykoprotein. Die Region innerhalb des Epitops 13 enthält zwei überlappende Tetrapeptid-Übereinstimmungen mit Laminin B1 (1202 bis 1205 und 1376 bis 1370), die mit den La/SSB-Aminosäureresten 277 bis 280 bzw. 275 bis 278 zusammenfallen; Während das La/SSB-Epitop 18 (202 bis 207) sechs aufeinanderfolgende Aminosäuren mit Laminin B1 teilt (1467 bis 1472). An diese Epitope bindende Antikörper fanden sich in jedem der sieben Seren von Patienten, die ein Kind mit CCHB hatten.

Beispiel 2: Identifizierung linearer Epitope des 60-kD- Ro/SSA-Proteins

Peptide, die lineare Epitope für das 60-kD-Protein darstellen, einschließlich vieler ursprünglich in der früheren Anmeldung dargestellter, sind in Tabelle 2 angegeben. Diese Daten geben das Durchschnittsergebnis von sieben normalen Seren, vier anti-Ro/SSA-Präzipitin-positiven Seren und dem affinitätsgereinigten anti-Ro/SSA-Autoantikörper aus den gleichen vier anti-Ro/SSA-Präzipitin-positiven Patientenseren an. Die Daten wurden in jedem Fall mit einer Konstante multipliziert, so daß die Größe der Bindung bei einer kon stanten IgG-Konzentration, 100 ug IgG pro ml bei diesen Ergebnissen, verglichen werden konnte.
Diese Untersuchung zeigt, daß die anti-Ro/SSA-Peptid-Bindungsaktivität parallel zur gegen das native Molekül gerichteten anti-Ro/SSA-Aktivität angereichert ist. Die spezifische Bindungsaktivität gegen sowohl die antigenen Peptide als auch das Ro/SSA-Antigen nahm durch das Affinitätsanreicherungsverfahren um das etwa Dreifache zu, was belegt, daß die Peptidbindung ein Teil des gesamten anti-Ro/SSA-Ansprechens ist.
Die ersten und zweiten Spalten von Tabelle 2 geben die mit mehr als einem Schwellenwert von A&sub4;&sub1;&sub0; von 0,3 gebundenen Sequenzen an. Dieser Schwellenwert wurde gewählt, da keines der Peptide durch die normalen Seren mit einem Mittelwert von über A&sub4;&sub1;&sub0; = 0,3 gebunden wurde. Die erste Spalte in Tabelle 2 stammt aus dem Mittelwert der vier anti-Ro/SSA- Präzipitin-Seren und die zweite aus dem affinitätsangereicherten anti-Ro/SSA. In der dritten Spalte befinden sich die antigenen Sequenzen, aus denen die antigenen Octapeptide zusammengesetzt sind. Der hochgestellte Stern "*" gibt die Octapeptidnummer des Octapeptids mit der größten Bindung aus einer beliebigen fortlaufenden Sammlung mit jeweils A&sub4;&sub1;&sub0; von mindestens 0,3 an. Dieser Teil der Sequenz ist ebenfalls unterstrichen. Falls zwei Octapeptide einen A&sub4;&sub1;&sub0;-Wert innerhalb von 1% voneinander aufweisen, sind die beiden Octapeptide durch ein Sternchen identifiziert und die zu beiden Octapeptiden beitragenden Aminosäuren unterstrichen. Tabelle 2. Mittlere Bindung von vier anti-Ro/SSA-Seren und affinitätsangereicherten anti-Ro/SSA-Präparationen an aus der Sequenz des 60-kD-Ro/SSA-Peptids konstruierte Octapeptide eines größeren Grades als ein A&sub4;&sub1;&sub0;-Wert von 0,3.

Beispiel 3: Identifizierung linearer Epitope des nucleären Ribonucleoproteins mit 70 kD

Die Sequenz des nucleären Ribonucleoproteins von 70 kD (nRNP) wird von R. A. Spritz e al. in Nucleic Acids Research 24 : 10373-10391 (1987) angegeben, dessen Lehren hier aufgenommen werden. Die Datenanalyse erfolgte wie für die Ro/SSA- und La/SSB-Antigene. Jede identifizierte Sequenz gibt die willkürliche Kriterien im Festphasentest übersteigende Bindung von Antikörper an Octapeptide an. Die identifizierten antigenen Regionen liegen mehr als zwei Standardabweichungen oberhalb des Mittelwerts normaler Seren und werden von mehr als der Hälfte der Patienten gebunden.
Für die Bindung des 70-kD-Peptids liegt der Schwellenwert im Test bei einem A&sub4;&sub1;&sub0;-Wert von 0,380. Die Nummern in Klammern geben die Sequenzpositionen der ersten Aminosäure in dem ersten Octapeptid, das den Schwellenwert überschreitet, an. Jede identifizierte Sequenz besteht aus einem oder mehr Octapeptiden. Die Zahl der Octapeptide in jeder Sequenz ist die Sequenzlänge minus acht. Der unterstrichene Teil der Sequenz ist das durch das Patientenserum am stärksten gebundene Octapeptid. In einigen Fällen ist ein anderes Octapeptid im wesentlichen äquivalent, jedoch nicht unterstrichen.
Die antigenen Sequenzen des 70-kD-nRNP sind: (11) ALFAPRDP; (65) ERMERKRREK; (133) HMVYSKRSGPRGY, (161) YVKHADGKKIDGRRVL; (178) VERGRTVK, (186) VKGWRPRR, (264) RRSRSRDK, (274) RRRSRERS, (277) SRERSKDK, (282) KDKDRDRKRRSSRSR und (355) RRSHRSER.
Das A-Peptid von nRNP besitzt die folgenden antigenen Octapeptide: (16) NLNEKIKKD, (21) IKKDELKKSL, (44*) LVSRSLKMRGOAF, (73) QGFPFYDKPMRI, (93) ILAKMKGTF, (103*) ERDRKREKRKPKS, (116) OETPATKKA, (263) ALOGFKIT und (274) AMKISFAKK. Der als zwei Standardabweichungen über dem Mittelwert definierte Schwellenwert ist ein genormter A&sub4;&sub1;&sub0;-Wert von 0,400. Die durch ein (*) bezeichneten Octapeptidsequenzen werden von einer Unterklasse der getesteten Seren gebunden. Die Sequenzen, auf denen dieses Ergebnis beruht, finden sich in Sillekens et al., EMBO J. 6: 3841-3848 (1987), deren Lehren hier aufgenommen sind.
Das C-Peptid von nRNP besitzt die folgenden antigenen Octapeptide: (19) SVRKTHCSGRKHKENVKD, (35) KDYYQKWM, (56) AFOOGKIPP, (61) KIPPTPFS, (78) PPPPSLPG, (82) SLPGPPRP, (85) GPPRPGMMPA, (108) PPPPGMMP, (117) GPAPGMRPP, (136) PPMMRPPA und (152) PGMTRPDR. Der Schwellenwert für die Bindung dieser Octapeptide war ein A&sub4;&sub1;&sub0;-Wert von 0,440. Die Sequenz, auf der dieses Ergebnis beruht, findet sich in Sillekens et al., Nucleic Acids Res. 25: 8307-8321 (1988), deren Lehren hier aufgenommen sind.

Beispiel 3(i): Kartierung des linearen Epitops eines Sm- B/B' -Polypeptids

Die Sm-B/B'-Peptide bindende Autoantikörper, die üblicherweise mit überlappende Octapeptide von Sm-B/B' bindenden SLE-IgG-Antikörpern in Zusammenhang stehen, wurden bei 10 Patienten mit anti-Sm- und anti-nRNP-Präzipitinen, 5 Patienten mit anderen Autoimmunseren und 4 normalen humanen Seren evaluiert. Weder normale Kontrollen noch Patienten ohne ein anti-Sm-Präzipitin binden signifikant eines der Sm-B/B'- Octapeptide. Alle ein anti-Sm-Präzipitin enthaltenden getesteten Seren binden stark an Octapeptide aus acht Regionen der Sm-B/B'-Sequenz. Drei dieser acht Regionen teilen die gleichen Octapeptidsequenzen (PPPGMRPP), die durchgängig die am stärksten immunreaktiven Octapeptide von Sm-B/B' sind. Die Bindung des ähnlichen PPPGIRGP sowie die Bindung an Deletions- und Substitutionspeptide legen nahe, daß das Motiv PPPG(I,M)(R,K) diese Bindung am besten zu definieren scheint. PAPGMRPP im nRNP-C-Peptid zeigt die gleiche Antigenität wie PPPGMRPP und kann eine teilweise Erklärung für die zwischen Sm- und nRNP-Autoantikörpern gezeigte Kreuzreaktivität liefern. Die Sequenz PPPGMIPP von nRNP-A ist jedoch nicht antigen. Diese Daten definieren die Autoantigenität der linearen Sequenz des Sm-B/B'-Proteins. Sie belegen auch, daß das vorherrschende Autoimmunepitop eine prolinreiche Sequenz ist, für die eine begrenzte Varianz erlaubt ist, bevor die Antigenität zerstört wird.
Zwei Sequenzen von Sm-B/B' wurden berichtet. Rokeach et al., J. Biol. Chem. 264: 5024 (1989), erhielten eine Sequenz aus einer Lymphoblastoidzellen (Raji)-Bibliothek, die zu einem partiellen Klon von HeLa-Zellen (Sharpe et al., FEB Lett. 250: 585 (1989)) und zu Sm N aus einer humanen Zerebellarbibliothek (Schmauss et al., Nucleic Acids Res. 17: 1733 (1989)) identisch ist. Sm B und Sm B' besitzen sehr ähnliche Aminosäuresequenzen, von Dam et al., EMBO J. 8: 3853 (1989). Tatsächlich scheinen Sm B und Sm B' abwechselnde Spleißprodukte einer gleichen prä-mRNA zu sein.
In dieser Untersuchung wurden überlappende Octapeptide der codierenden Regionen beider Sm-B/B'-Sequenzen durch Festphasenpeptidsynthese synthetisiert. Die Antigenität des einzelnen Octapeptids wurde mit einer Vielzahl von Seren von Patienten mit SLE und normalen Kontrollpersonen bestimmt.

Materialien und Verfahren

Seren: Humanseren von Patienten, die die Klassifikationskriterien der American Rheumatism Association für SLE oder normale altersmäßig passende, geschlechtsmäßig passende Kontrollen erfüllten, wurden in dieser Untersuchung eingesetzt. Es wurden 15 Seren von Lupus-Patienten getestet. Zehn dieser getesteten Seren enthielten Antikörper, die mit sowohl Sm als auch nRNP starke Präzipitinlinien bildeten, drei bildeten Präzipitinlinien nur mit nRNP, eines bildete eine Präzipitinlinie mit Ro/SSA und La/SSB und eines bildete eine Präzipitinlinie mit lediglich Ro/SSA. Alle dieser serologischen Ergebnisse wurden durch entsprechende Molekulargewichtsbanden für das berichtete Antigen, das in einem Immunoblot durch die jeweiligen Seren gebunden ist, bestätigt.
Festphasensynthese nicht abspaltbarer Peptide: Die veröffentlichte Sequenz von Sm-B/B' wurde zur Konstruktion aller möglichen überlappenden Octapeptide verwendet. Die zur Peptidsynthese verwendeten Aminosäuren besaßen mit Fmoc geschützte primäre Amingruppen und mit tert.-Butyl (oder sonstigen geeigneten Gruppen) geschützte Seitenketten. Überlappende Octapeptide wurden gleichzeitig an den abgerundeten Enden strahlungsderivatisierter Polyethylenpins, die im Format einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen angeordnet waren (Cambridge Research Biochemicals. Cambridge, UK und Coselco Mimitopes Pty Ltd., Victoria, Australien), synthetisiert. Die aktiven Ester von Fmoc-, tert.-Butylaminosäurelösungen (30 mM) wurden in mit 10 Hydroxybenzotriazol zu einer Endkonzentration von 30 mM versetztem DMF solubilisiert und in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte verteilt. Jede Aminosäure wurde entsprechend der Bestimmung der 240 Aminosäuren der Raji-Sm-B/B'-Sequenz zugegeben. Nach 18- stündiger Inkubation wurden die Pins 5 min lang in DMF, viermal 2 min lang jeweils in Methanol und erneut 5 min lang einmal in DMF gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppen wurden dann von der neu zugegebenen Aminosäure durch ein 20% -Piperidin/DMF-Bad während 30 min entfernt. Diese Stufen wurden wiederholt, bis alle acht Aminosäuren zugesetzt waren. Nach der letzten Aminosäure wurden die aminoterminalen Gruppen jedes Peptids durch Inkubation der Pins in ein 5 : 2 : 1 (v/v/v)-Gemisch von DMF : Essigsäureanhydrid : Triethylamin während 90 min bei Raumtemperatur acetyliert. Nach dieser Stufe wurden die Pins erneut 2 min lang in DMF, viermal 2 min lang jeweils in Methanol gewaschen und anschließend 10 min lang an Luft getrocknet. Schließlich wurden die Seitenkettenaminoschutzgruppen durch 95 : 2, 5 : 2,5 (v/w/v) Trifluoressigsäure : Phenol : Ethandithiol entfernt. Die Waschstufen umfaßten 2 min in Methylenchlorid, zweimal 5 min jeweils in 5% Diisopropylethylen/Methylenchlorid und schließlich 5 min in Methylenchlorid. Nach zehnminütigem Trocknen wurden die Pins 2 min lang in destilliertes Wasser gegeben, 18 h lang in ein Methanolbad gebracht und 18 h lang unter Vakuum getrocknet. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um einen weiteren Satz der 36 carboxylterminalen Octapeptide zur Bestätigung der früheren Daten zu ermöglichen. Außerdem wurden auch andere Octapeptide, einschließlich der in den Sequenzen von von Dam/Ohosone Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4249 (1989) beobachteten Aminosäureveränderungen synthetisiert.
Ausgewählte Substitutions- und Deletionssequenzen wurden zusammen mit ähnlichen Sequenzen von anderen Proteinen ebenfalls konstruiert. Aus Aminosäuren in einer willkürlichen Sequenz bestehende Kontrollpins wurden hergestellt, die in keiner der Sm- oder nRNP-Antigensequenzen vorlagen. Außerdem wurden Pins zur positiven Kontrolle aus einer bekannten reaktiven Sequenz des La/SSB-Peptids synthetisiert.
Festphasensynthese abspaltbarer Peptide: Coselco Mimotopes Pty Ltd. entwickelten ein Verfahren zur Herstellung abspaltbarer Peptide. Diese Peptide werden auf Polyethylenpins, die eine eine weitere Prolin-Lysin-Alanin-Sequenz enthaltende abspaltbare Linkeranordnung enthalten, synthetisiert. Nach der Synthese des Peptids in der geschilderten Weise wird eine 15-minütige Schlußultraschallbehandlung in 0,1% HCl (in 1 : 1 Methanol/ddH&sub2;O) angefügt. Die Pins werden in einer Lösung aus gleichen Teilen von 0,1 M Citrat und 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 3,0 während 3 h unter leichtem Rühren inkubiert. Dadurch werden alle übrigen Verunreinigungen entfernt. Die Peptide werden dann von den Pins durch Inkubation in einer 0,1-M-Phosphatlösung bei einem pH- Wert von 7,0, die eine Cyclisierung und Bildung eines Diketopiperazols bewirkt, abgespalten. Diese Peptide werden dann bezüglich des Aminosäuregehalts analysiert. Vier Octapeptide wurden in der geschilderten Weise konstruiert und es waren in allen getesteten Peptiden die richtigen Aminosäuren in den richtigen Anteilen vorhanden.
Festphasenantipeptidtest: Die Waschstufen und Inkubationen wurden in verschlossenen Kunststoffbehältern durchgeführt. Die sonstigen Teststufen wurden durch Absenken der Pins in Mikrotiterplattenvertiefungen durchgeführt. Zunächst wurden die Pins mit 3%iger fettarmer Milch in PBS während 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Dann wurden die Pins in 1/100 Verdünnungen der Seren in 3% Milch/PBS mit 0,5% Tween über Nacht bei 4ºC in befeuchteten verschlossenen Behältern inkubiert. Die Pinblocks wurden dann viermal mit PBS mit 0,05% Tween jeweils 10 min unter heftigem Rühren gewaschen. Danach wurde jedes Pin mit in einer Ziege gebildetem, anti-humanegamma-Kette-spezifischem IgG inkubiert, affinitätsgereinigt und mit alkalischer Phosphatase (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) bei einer Verdünnung 1/10.000 konjugiert. p-Nitrophenylphosphatdinatrium wurde als Substrat für alkalische Phosphatase verwendet und die Platten wurden bei 405 nm mit einem Mikroelisa-Lesegerät (Dynatech, Alexandria, VA) abgelesen. Die Ergebnisse für jede Platte wurden dann durch Vergleich mit Pins zur positiven Kontrolle standardisiert. Es wurden die gleichen Kontrollpins für alle Platten verwendet und sie wurden bis zu einem speziellen OD mit einer bekannten Konzentration eines Standardkontrollserums entwickeln gelassen.
Nach der Beendigung eines Tests wurden die Pins 2 h lang in Ultraschallbehandlungspuffer (40 g SDS, 4 ml β-Mercaptoethanol und 62,4 g Natriumphosphat auf 4 l) zur Entfernung von Antikörpern, Konjugat und Substrat beschallt. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Pins zweimal in heißem Wasser gewaschen und 2 min lang in Methanol gekocht. Die Pins wurden dann mindestens 10 min lang an Luft trocknen gelassen und mit einem Trockenmittel gelagert oder für einen weiteren Test verwendet.
Epitopmarkierung von Sm-B/B': Die Peptide wurden zunächst bezüglich Reaktivität mit anti-Human-IgG-Konjugat allein durchmustert. Mit anti-Human-IgG-Konjugat wurde kein Hintergrund aufgezeigt. Vier normale Humanseren zeigten ebenfalls eine minimale Hintergrundreaktivität ohne den Nachweis spezifischer antigener Regionen. SLE-Patienten mit anderen Autoimmunseren als anti-Sm, anti-nRNP zeigten ebenfalls keine überzeugende spezifische Reaktivität mit einem der Octapeptide. Andere getestete Rheumaseren umfaßten Seren, die mit Ro/SSA und auch mit sowohl Ro/SSA- als auch La/SSB-Ag Präzipitine bildeten. Jeder Patient, bei dem Sm und nRNP ausgefällt wurde, zeigte jedoch eine beträchtliche Reaktivität mit verschiedenen Regionen des Sm-B/B'-Proteins. Zehn Sm, nRNP-Seren wurden getestet und alle wiesen ein ähnliches Bindungsmuster auf. Eine beträchtliche Reaktivität zeigte sich in der prolinreichen carboxylterminalen Region des Proteins. Ein wiederholtes Motiv, PPPGMRPP, findet sich in drei Regionen des Sm-B/B'-Polypeptids und ist in jeder Region ähnlich antigen. Außerdem wird eine nahe verwandte vierte Region, PPPGIRGP, durch alle getesteten Sm, nRNP-Seren gebunden.
Mehrere andere antigene Regionen wurden ebenfalls in den ersten und mittleren Bereichen des Polypeptids nachgewiesen. Diese Regionen waren in allen getesteten Seren nicht stark reaktiv, sie können jedoch durch Definieren der Unterschiede in der sehr feinen Spezifität zwischen Individuen mit einem Autoimmunansprechen auf das B/B'-Ag wichtig sein.
Zur Erläuterung, welche Aminosäuren zur Reaktivität wesentlich sind, ist die durchschnittliche Bindung um das einzelne vermutliche Epitop herum zusammen mit der Sequenz des jeweiligen relevanten Octapeptids in Fig. 1 dargestellt. Das mit der Aminosäure 29 beginnende Octapeptid, GTFKAFDK, erfordert alle acht Reste für eine Reaktivität. Die Antigenität des reaktiven Bereichs in der Region von Octapeptid 45 scheint jedoch auf der Notwendigkeit von zwei Lysinen mit einem dazwischenliegenden Aminosäure-Spacer zu beruhen. Die Bindung in den Octapeptiden 44 und 53 geht verloren, wenn die zwei Lysine mit dem dazwischenliegenden Spacer entfernt werden.
Die Sequenzen von den Octapeptiden 140 bis 145 weisen alle eine mäßig erhöhte durchschnittliche Bindung auf. Jede besitzt eine PQGR-Sequenz, die für eine Bindung kritisch zu sein scheint. Der das Octapeptid 169 umgebende reaktive Bereich läßt sich andererseits nicht ohne weiteres durch eine spezielle Sequenz erklären. Das PPGMRPP mit Wiederholung und das ähnliche PPPGIRGP, die bei den Octapeptiden 191, 216, 223 und 231 gefunden werden, teilen das Hexamer PPPGXR, wobei X eine unbestimmte Aminosäure bezeichnet, mit der stärksten Bindung in allen Octapeptiden. Dieses wiederholte Motiv scheint bei der Bindung von anti-Sm an lineare Epitope von Sm-B/B' wichtig zu sein.
Deletionsexperimente mit PPPGMRPP: Deletionsexperimente der PPPGMRP-Sequenz zeigten, daß nicht alle acht Aminosäuren für eine Antigenität gegenüber den sechs getesteten Patientenseren, wie in Fig. 2a gezeigt, erforderlich sind. Es wurden Peptide synthetisiert, bei denen die carboxylterminale Aminosäure deletiert war, wobei ein Heptamer PPPGMRP, ein Hexamer PPPGMR, ein Pentamer PPPGM und verschiedene Tetramere einschließlich PPPG, PPGM, PGMR, GMRP und PPPP zurückblieben. Eine Bindung scheint zumindest das Hexamer PPPGMR zu erfordern, bevor die signifikante Reaktivität verloren geht. Mehr als 60% der Reaktivität des PPPGMRPP-Motivs wird zerstört, wenn das Arginin der sechsten Position entfernt wird. Eine Entfernung der carboxylterminalen Proline scheint die Bindung bei den sechs getesteten Patienten nicht signifikant zu ändern. Außerdem zeigte keine getestete, ledigliche Poly- Prolin-Sequenz (PPPPP, PPPP, PPP, PP) Reaktivität mit diesen Seren. Sechs der zehn anti-Sm und anti-nRNP enthaltenden Seren wurden mit diesen deletierten Peptiden getestet und ergaben ähnliche Ergebnisse. Ein normales Serum band keines dieser Peptide.
Substitutionsexperimente der antigenen Sequenz PPPGMRPP: Die Substitution des Arginins (R) durch die anderen 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren zeigte verschiedene Grade an Reaktivität mit den sechs getesteten Seren, wie in Fig. 2b gezeigt. Eine Substitution des Arginins durch eine andere positiv geladene Aminosäure, Lysin (K), konserviert mehr als 75% der ursprünglichen Reaktivität. Eine andere Unterklasse der neun Aminosäuren (umfassend F, G, H, I, S. T, V, W und Y) hält etwa 50-65% der ursprünglichen Bindung zurück, während die anderen neun Aminosäuren die Bindung auf weniger als 25% verringern.
Synthese verschiedener ähnlicher Epitope: Kurze Sequenzen verschiedener Proteine, die eine beträchtliche Homologie mit dem PPPGMRPP-Motiv aufwiesen, wurden ebenfalls auf Polyethylenpins synthetisiert. Diese Sequenzen und ihre Reaktivität wurde durch sechs unterschiedliche Patientenseren mit anti- Sm- und anti-nRNP-Präzipitinen aus den ersten Versuchen gemessen. Octapeptide aus nRNP-A (23), rmP-C (24) und dem EBV-nucleären Ag-1 (25) wurden hergestellt. Die nRNP-A- und eine nRNP-C-Sequenz zeigten relativ keine Reaktivität; die zweite nRNP-C-Sequenz (PAPGMRPP) zeigte jedoch über 90% der ursprünglichen Bindung. Außerdem wird die EBV-Sequenz (die eine Homologie von fünf von sechs Aminosäuren mit dem erforderlichen antigenen Bereich von PPPGMRPP besitzt) ebenfalls signifikant durch Sm, nRNP-Präzipitin-positive Patienten gebunden.
Alle in dieser Untersuchung bestimmten antigenen Bereiche erfordern eine positiv geladene Aminosäure. Die Größe dieser Bereiche variiert von zwei nicht aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren bis zu einem ganzen Octapeptid. Das PPPGMRPP-Motiv scheint in allen getesteten Sm, nRNP-Seren das lineare antigene Hauptepitop zu sein; diese Sequenz scheint jedoch nicht durch Seren gebunden zu werden, die ein anti-Sm-Präzipitin in Abwesenheit eines anti-nRNP- Präzipitins enthalten. Patienten mit Sm-Präzipitin allein binden zwei Regionen von Sm-B/B'.
Das carboxylterminale Di-Prolin des PPPGMRPP-Motivs ist für Antigenität nicht erforderlich. Andere Deletionsstudien zeigten ebenfalls, daß die Antigenität dieser Autoantikörper nicht spezifisch gegen die Poly-Prolinregionen gerichtet ist. Zwischen zwei und sechs Polyproline enthaltende Peptide zeigten keine Reaktivität mit den in dieser Untersuchung verwendeten Seren. Außerdem enthalten natürlich vorkommende Octapeptide der Aminosäuresequenzen 175-186 und 85-92 drei oder vier aufeinanderfolgende Proline: keine dieser Regionen ist antigen. Auch binden die sehr ähnlichen PPPGMIPP-Octapeptide nicht an die Sm und nRNP ausfällenden Seren.
Substitutionsexperimente zeigten, daß die Veränderung einer Aminosäure die Reaktivität einer Sequenz um mehr als 90% verringern kann. Die Substitution der sechsten Aminosäure, Arginin (R), der PPPGMRPP-Sequenz durch die anderen 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren teilte diese Aminosäuren in drei getrennte Gruppen. Lysin (K), eine weitere basische Aminosäure, stellt die einzige Substitution dar, bei der im Mittel mehr als 75% der Bindung konserviert werden. Mit jedem getesteten Serum ist diese Aminosäuresubstitution durchgängig am reaktivsten. Die Reaktivität ist jedoch mit neun Aminosäuren auf weniger als 25% verringert. Dieser Satz umfaßt die sauren Aminosäuren und ihre Amine, die schwefelhaltigen Aminosäuren und das hydrophobe Leucin, Prolin und Alanin. Die anderen neun Aminosäuren behalten einen Teil, 42- 65%, der ursprünglichen Bindung. Phenylalanin war durchgängig das reaktivste dieser Gruppe. Dennoch führt die Fähigkeit von Lysin zur Substitution von Arginin zu der Hypothese, daß eine positiv geladene Aminosäure an dieser Position für die Antigenität dieser Sequenz bevorzugt ist.

Beispiel 4: Bindung von monoklonalen Antikörpern gegenüber Peptiddeterminanten von Sm-B/B'

Autoantikörper, die an die Sm-B- und -B'-Peptide (B/B') binden, sind üblicherweise mit systemischem Lupus erythematode beim Menschen und MRL-lpr/lpr-Mäusen verbunden. KSm 3 und KSm 5 wurden aus einer unmanipulierten MRL-lpr/lpr-Maus unter Verwendung von Hybridom-monoklonaler Antikörper- Techniken abgeleitet. Überstände, die monoklonale KSm-3- und KSm-5-Antikörper enthielten wurden aus klonierten Maus- Hybridomzellinien in RPMI 1640 mit 10% Rinderfötusserum, Glutamin, Penicillin und Streptomycin gesammelt. Diese monoklonalen Autoantikörper gehören beide zur IgG2a- Subklasse. Die linearen antigenen Regionen dieser beiden monoklonalen anti-Sm-B/B'-Mausantikörper wurden unter Verwendung überlappender Octapeptide kartiert. Singuläre Epitope wurden für jeden monoklonalen Antikörper identifiziert. Der monoklonale Antikörper KSm 5 erkennt das Peptid PPPGMRPP, das in dem Sm-B-Polypeptid dreimal wiederholt ist. KSm 3 bindet am besten an zwei sehr ähnliche, nahezu benachbarte Octapeptide, PPPGIRGP und PGIRGPPP. Die zwei monoklonalen Körper gehen keine Kreuzreaktion ein. Diese beiden Regionen Sm-B/B' sind Hauptbereiche der Antigenität für humane anti-Sm-Autoantikörper. Eine Aminosäuredeletion und -substitution in antigenen Octapeptiden zeigt, daß die Bindung an das KSm-5-Epitop bei nur leichter Modifikation verloren geht. Wenn das Arginin in der sechsten Position von PPPGMRPP substituiert wird, findet sich eine KSm-5-Bindung in einer unerwarteten Subklasse von Octapeptiden. Ein Moleküldynamikmodell legt nahe, daß die Bindung eher mit einer gemeinsamen Peptidrückgratstruktur als mit der Ladung oder Hydrophobie der substituierten Aminosäure zusammenhängt. Im Gegensatz dazu geht die Bindung von KSm 3 an PPPGIRPP verloren, wenn das Arginin der sechsten Position durch eine andere Aminosäure substituiert wird. Diese beiden Maus-Autoantikörper binden bestimmte lineare Epitope von Sm-B/B', die auch durch humane anti-Sm- B/B'-Autoantikörper gebunden werden. Die gebundenen Epitope sind prolinreich und enthalten in der vierten oder sechsten Position ein Arginin. Die Substitution bei Arginin und Modellexperimente legen daher sehr unterschiedliche Bindungsmechanismen für KSm 3 und KSm 5 nahe. Eine spezielle Peptidrückgratkonformation, die durch einige Aminosäureseitenket ten an Position 6 des Octapeptids PPPGMRPP verliehen wird, kann an der Bindung von KSm 5 beteiligt sein, während die Bindung von KSm 3 die Spezifität der Argininseitenkette erfordert. Natürlich auftretende Autoantikörper können ganz unterschiedliche Merkmale ähnlicher Peptidstrukturen binden. Eine Substitution der Aminosäuren an entweder der fünften oder sechsten Position von PPPGIRGP durch all die anderen 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren zeigt singuläre Reaktivitätsmuster. Die Substitution des Arginins (R) der sechsten Aminosäure zeigt, daß keine andere Aminosäure einen Bindungsgrad ermöglicht. Wenn das Isoleucin (I) der fünften Position substituiert wird, ermöglichen sechs der 20 Aminosäuren, Phenylalanin (F), Histidin (E), Threonin (T), Valin (V) und Tyrosin (Y) über 50% der mit dem ursprünglichen Octapeptid gezeigten Bindung. Von diesen besitzt Threonin mehr Reaktivität als das ursprüngliche Octapeptid.
Zur Bestimmung des Peptiden jeder antigenen Gruppe gemeinsamen Strukturmotivs wurden Moleküldynamiksimulationen für ausgewählte Peptide, die gegenüber KSm 5 oder KSm 3 antigen sind, durchgeführt. Insgesamt 2500, eine Nanosekundentrajektorie bezüglich der Zeit darstellende Strukturen wurden für jedes Peptid gesammelt und durch Registrieren der dihedralen Winkel des Rückgrats analysiert. Mindestens ein vorherrschendes Konformer konnte für alle Peptide gewählt werden, das durch einen stabilen Satz dihedraler Winkel des Rückgrats beobachtet wurde. Die Wurzel aus dem mittleren Quadrat der Differenz zwischen den KSm-3-positiven Peptiden PPPGIRGP und PGIRGPPP von 4,87 A für die Rückgratatome von acht Resten belegt, daß zwischen diesen beiden Peptiden kein gemeinsames Rückgrat existiert.
Im Gegensatz hierzu legt die Bindung von KSm 5 an bezüglich Arginin (R) an der sechsten Position in PPPGMRPP substituierten Peptiden ganz unterschiedliche Bindungserforder nisse nahe. Aminosäuren mit Seitenketten, -(CH&sub3;)&sub3;-NH-C- NHNH&sub2;, -CH&sub3;, -OH und -H waren in ihrer Fähigkeit zur Bindung durch KSm 5 alle im Groben gesehen äquivalent. Diese Aminosäuren zeigen kein gemeinsames Merkmal bezüglich Ladung oder Hydrophobie. Auch konnten Lysin und Histidin, die üblicherweise als Arginin am ähnlichsten betrachteten Aminosäuren, nicht substituieren und die Bindung konservieren. Die Möglichkeit einer signifikanten Rückgratkonformation, die dem nativen Peptid, PPPGMRPP, bei Abgrenzung durch eine oder mehr Aminosäuren in irgendeiner Richtung, gemeinsam ist, wurde unter Verwendung von OVRLAP18 ausgegrenzt. Die beste Übereinstimmung fand sich für die ersten paar Reste des Rückgrats ohne Abgrenzung. Die Konformation kann daher bei der Bindung eine Rolle spielen.

Claims

1. Peptid, das ein lineares Epitop für einen humanen Autoantikörper bildet und das entweder (i) aus der Gruppe der Peptide mit weniger als 40 Aminosäuren, wobei die Sequenz des Epitops mit der vom Aminoterminus her numerierten Aminosäure beginnt, gefolgt von der angegebenen Aminosäuresequenz, bestehend aus den folgenden La/SSB-Epitopen:

ICHQIEYYFGDFNLPRDKFLK (Sequenzprotokoll ID No: 20),

YFGDFNLP (Aminosäuren 8-15 des Sequenzprotokolls ID No. 20),

WVPLEIMIKFNR (Sequenzprotokoll ID No. 21),

VPLEIMIK (Aminosäuren 2-9 des Sequenzprotokolls ID No. 21),

NRLNRLTTDFNVIVE (Sequenzprotokoll ID No. 23),

NRLNRLTT (Aminosäuren 1-8 des Sequenzprotokolls ID No. 23),

TDFNVIVE (Sequenzprotokoll ID No. 30),

DFNVIVEA (Aminosäuren 2-9 des Sequenzprotokolls ID No. 30),

KTKIRRSPSKPL (Sequenzprotokoll ID No. 22),

KIRRSPSK (Aminosäuren 4-11 des Sequenzprotokolls ID No. 22),

YKNDVKNRSWIKGFPT (Sequenzprotokoll ID No. 29),

SVYIKGFP (Aminosäuren 9-16 des Sequenzprotokolls ID No. 29),

QVLNIQMRRTLHKAFKGS (Sequenzprotokoll ID No. 19),

NIQMRRTLHKAFK (Aminosäuren 4-16 des Sequenzprotokolls ID No. 19) ,

RTLHKAFK (Aminosäuren 9-16 des Sequenzprotokolls ID No. 19),

IFWFDSIE (Sequenzprotokoll ID No. 27),

FWFDSIE (Aminosäuren 2-9 des Sequenzprotokolls ID No. 27),

KETDLLILFKDDYFA (Sequenzprotokoll ID No. 28),

ILFKDDYF (Aminosäuren 7-14 des Sequenzprotokolls ID No. 28),

KVEAKLRAKQ (Sequenzprotokoll ID No. 36),

EAKLRAKQ (Aminosäuren 3-ZO des Sequenzprotokolls ID No. 36),

CHLKFSGD (Sequenzprotokoll ID No. 34),

REDLHILF (Sequenzprotokoll ID No. 33),

GEIKWIDFVRGAK (Sequenzprotokoll ID No. 24),

KWIDFVRGAK (Aminosäuren 4-13 des Sequenzprotokolls ID No. 24) ,

IDFVRGAK (Aminosäuren 6-13 des Sequenzprotokolls ID No. 24),

EGIILFKEKAK (Sequenzprotokoll ID No. 31),

EGIILFKE (Aminosäuren 1-8 des Sequenzprotokolls ID No. 31),

GNLQLRNKEVTW (Sequenzprotokoll ID No. 26),

LRNKEVTW (Aminosäuren 5-12 des Sequenzprotokolls ID No. 26),

SLNKWKSKGRRFKGKGKGNK (Sequenzprotokoll ID No. 25),

KSKGRRFK (Aminosäuren 6-13 des Sequenzprotokolls ID No. 25),

KVQFQGKKTKFASD (Sequenzprotokoll ID No. 32),

KKTKFASD (Aminosäuren 7-14 des Sequenzprotokolls ID No. 32),

TGPVKRAR (Sequenzprotokoll ID No. 35),

den folgenden Ro/SSA-Epitopen:

MNRLHRFL (Sequenzprotokoll ID No. 37),

LCFGSEGGT (Sequenzprotokoll ID No. 38),

CFGSEGGT (Aminosäuren 2-9 des Sequenzprotokolls ID No. 38),

SEGGTYYIKEQ (Sequenzprotokoll ID No. 39),

EGGTYYIKEQ (Aminosäuren 2-11 des Sequenzprotokolls ID No.

39) ,

GTYYIKEQ (Aminosäuren 4-11 des Sequenzprotokolls ID No. 39),

GTYYI (Aminosäuren 4-8 des Sequenzprotokolls ID No. 39),

EIKSFSQEGRT (Sequenzprotokoll ID No. 40),

KSFSQEGR (Aminosäuren 3-10 des Sequenzprotokolls ID No. 40),

SQEGRTTKQ (Sequenzprotokoll ID No. 41),

GRTTKQEPM (Sequenzprotokoll ID No. 42),

STKQAAFKAV (Aminosäuren 2-11 des Sequenzprotokolls ID No. 43) ,

ISTKQAAFKAVS (Sequenzprotokoll ID No. 43),

KQAAFKAV (Aminosäuren 4-11 des Sequenzprotokolls ID No. 43),

AFKAVSEVC (Sequenzprotokoll ID No. 44),

FTFIQFKKDLKESMK (Sequenzprotokoll ID No. 45),

QFKKDLKE (Aminosäuren 5-12 des Sequenzprotokolls ID No. 45),

SMKCGMWGRA (Sequenzprotokoll ID No. 46),

MKCGMWGRA (Aminosäuren 2-10 des Sequenzprotokolls ID No. 46),

GMWGRALRKAIA (Sequenzprotokoll ID No. 47),

GRALRKAI (Aminosäuren 4-11 des Sequenzprotokolls ID No. 47),

ALAVTKYKQRNGWSHKDLLRLSH (Sequenzprotokoll ID No. 48),

TKYKQRNG (Aminosäuren 5-12 des Sequenzprotokolls ID No. 48),

QRNGWSHK (Aminosäuren 9-16 des Sequenzprotokolls ID No. 48),

LLRLSHLKPSS (Sequenzprotokoll ID No. 49),

RLSHLKPS (Aminosäuren 3-10 des Sequenzprotokolls ID No. 49),

TKYITKGW (Aminosäuren 2-9 des Sequenzprotokolls ID No. 71),

ITKGWKEV (Aminosäuren 5-12 des Sequenzprotokolls ID No. 71),

HELYKEKA (Sequenzprotokoll ID No. 50),

LYKEKALSV (Sequenzprotokoll ID No. 51),

KALSVETEKLLKYL (Sequenzprotokoll ID No. 52),

TEKLLKYL (Aminosäuren 7-14 des Sequenzprotokolls ID No. 52),

KLLKYLEA (Sequenzprotokoll ID No. 53),

LEAVEKVKRTKDE (Sequenzprotokoll ID No. 54),

KVKRTKDE (Aminosäuren 6-13 des Sequenzprotokolls ID No. 54),

HLLTNHLKSKEVWKALLQEMPL (Sequenzprotokoll ID No. 55),

LKSKEVWK (Aminosäuren 7-14 des Sequenzprotokolls ID No. 55),

KSKEVWKA (Aminosäuren 8-15 des Sequenzprotokolls ID No. 55),

SKEVWK (Aminosäuren 9-14 des Sequenzprotokolls ID No. 55),

ALLRNLGKMTA (Sequenzprotokoll ID No. 56),

RNLGKMT (Aminosäuren 4-10 des Sequenzprotokolls ID No. 56),

LGKMTANS (Sequenzprotokoll ID No. 57),

LCNEKLLKKARIHPFHI (Sequenzprotokoll ID No. 58),

LLKKARI (Aminosäuren 6-12 des Sequenzprotokolls ID No. 58),

KKARIHPF (Aminosäuren 8-15 des Sequenzprotokolls ID No. 58),

TYKTGHGLRGKLKWRPDE (Sequenzprotokoll ID No. 59),

YKTGHGL (Aminosäuren 2-8 des Sequenzprotokolls ID No. 59),

ALDAAFYK (Sequenzprotokoll ID No. 60),

AAFYKTFKTVEPTGKRFLLA (Sequenzprotokoll ID No. 61),

ASMNQRVLGS, (Sequenzprotokoll ID No. 62),

EPTGKRFL (Aminosäuren 11-18 des Sequenzprotokolls ID No. 61),

AMCMWTR (Sequenzprotokoll ID No. 63),

AFSDEMVP (Sequenzprotokoll ID No. 64),

VPCPVTTD (Sequenzprotokoll ID No. 65),

VLMAMSQI (Sequenzprotokoll ID No. 66),

TDCSLPMI (Sequenzprotokoll ID No. 67),

LPMIWAQKTNTPA (Aminosäuren 3-15 des Sequenzprotokolls ID No. 68) ,

TFAGGVHPAI (Sequenzprotokoll ID No. 69),

TFAGGVHP (Aminosäuren 1-8 des Sequenzprotokolls ID No. 69),

IALREYRKKMDIPAKL (Sequenzprotokoll ID No. 70),

REYRKKMD (Aminosäuren 4-11 des Sequenzprotokolls ID No. 70),

die folgenden 70 kD-nRNP-Epitopen:

ALFAPRDP (Sequenzprotokoll ID No. 72),

ERMERKRR (Sequenzprotokoll ID No. 73),

MVYSKRSG (Sequenzprotokoll ID No. 74),

GKKIDGRR (Sequenzprotokoll ID No. 75),

VERGRTVK (Sequenzprotokoll ID No. 76),

VKGWRPRR (Sequenzprotokoll ID No. 77),

RRSRSRDK (Sequenzprotokoll ID No. 78),

RRRSRERS (Sequenzprotokoll ID No. 79),

SRERSKDK (Sequenzprotokoll ID No. 80),

KRRSSRSR (Sequenzprotokoll ID No. 81) und

RRSHRSER (Sequenzprotokoll ID No. 82),

den folgenden nRNP-A-Peptid-Epitopen:

LNEKIKKD (Sequenzprotokoll ID No. 83),

KKDELKKS (Sequenzprotokoll ID No. 84),

SRSLKMRG (Sequenzprotokoll ID No. 85),

PFYDKPMR (Sequenzprotokoll ID No. 86),

IIAKMKGTF (Sequenzprotokoll ID No. 87),

DRKREKRK (Sequenzprotokoll ID No. 88),

QETPATKK (Sequenzprotokoll ID No. 89),

ALQGFKIT (Sequenzprotokoll ID No. 90) und

MKISFAKK (Sequenzprotokoll ID No. 91), und

den folgenden nRNP-C-Peptid-Epitopen:

RKHKENVK (Sequenzprotokoll ID No. 92),

KDYYQKWN (Sequenzprotokoll ID No. 93),

AFQQGKIP (Sequenzprotokoll ID No. 94),

KIPPTPFS (Sequenzprotokoll ID No. 95),

PPPPSLPG (Sequenzprotokoll ID No. 96),

SLPGPPRP (Sequenzprotokoll ID No. 97),

PPRPGMMP (Sequenzprotokoll ID No. 98),

PPPPGMMP (Sequenzprotokoil ID No. 99),

GPAPGMRP (Sequenzprotokoll ID No. 100),

PPMMRPPA (Sequenzprotokoil ID No. 101) und

PGMTRPDR (Sequenzprotokoll ID No. 102);

oder (ii) aus der Gruppe von Peptiden gemäß Definition bei (i) , die aus 4 bis 25 Aminosäuren bestehen, jedoch nicht Peptide mit einer aus A I A L R E Y R K K M D I P A, V H P A I A L R, K L G L E N, K D L K, K S K E, L T A L L R, R G K L K W, L K A L D, T R T E K D S. D E M V, E Y R K K M D, A A A M, D P D D, L S H L K, R T K D E, E K D S oder E V C R bestehenden Aminosäuresequenz noch Peptide, die den Resten 1-111 35-58, 56-77, 74, 96, 131-153, 149-166, 163-184, 180-205, 203-225 oder 257-282 in der Sequenz von sn-RNP-UIA entsprechen, umfassen, wobei die Peptide aus 4-7 Aminosäuren in den bei (i) definierten Aminosäuresequenzen als Beginn des Epitops enthalten sind, ausgewählt ist.

2. Peptid aus der Gruppe (i) gemäß Anspruch 1.

3. Peptid aus der Gruppe (ii) gemäß Anspruch 1, das aus 6-25 Aminosäuren besteht.

4. Peptide nach Anspruch 1, die gegenüber polyklonalen anti- Ro/SSA-Antikörpern oder polyklonalen anti-La/SSB-Antikörpern reaktiv sind.

5. Peptide nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und in einer wirksamen Menge, um einen immunogenen Effekt bei einem Menschen hervorzurufen oder um Autoantikörper zu blockieren, wobei das Peptid aus

GTFKAFDK (Sequenzprotokoll ID No. 1),

TFKAFDKHM (Sequenzprotokoll ID No. 15),

CDEFRKIKPKNAKQP (Sequenzprotokoll ID No. 2),

EGPPPKDT (Sequenzprotokoll ID No. 16),

KDTGIARV (Sequenzprotokoll ID No. 17) und

RVPLAGAA (Sequenzprotokoll ID No. 3),

AGGPGVGRAAGRGVPAG (Sequenzprotokoll ID No. 4),

IPQAPAGLAG (Sequenzprotokoll ID No. 18),

AGLAGPVRGVGGPSQ (Sequenzprotokoll ID No. 5),

QVMTPQGRGTVA (Sequenzprotokoll ID No. 6),

PTQYPPGRGTPPPPV (Sequenzprotokoll ID No, 7),

TPPPPVGRATPPPGI (Sequenzprotokoll ID No. 8),

PPPGIMAP (Sequenzprotokoll ID No. 9),

MAPPPGMRPPM (Sequenzprotokoll ID No. 10),

PIGLPPARGTPIGMPP (Sequenzprotokoll ID No. 11),

PIGMPPPG (Sequenzprotokoll ID No. 12),

RPPPPGIRGPP (Sequenzprotokoll ID No. 13),

RGPPPPGMRPPR (Sequenzprotokoll ID No. 14)

oder Gemischen hiervon ausgewählt ist.

6. Peptide nach einem der Ansprüche 1-4 in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger zur Verabreichung an einen Patienten.

7. Peptide nach Anspruch 6 in einer wirksamen Konzentration zur Verabreichung an einen Patienten zur Neutralisation zirkulierender Autoantikörper.

8. Peptide nach Anspruch 6 oder 7, die ferner einen pharmazeutischen Träger zur Verabreichung an einen Patienten umfassen, wobei der Träger und die Konzentration der Sequenzen bei Verabreichung an einen Wirt eine Immunantwort hervorrufen.

9. Peptide nach einem der Ansprüche 1-5, die mit einer Verbindung markiert sind, die aus Farbstoffen, fluoreszierenden Markierungen, chemilumineszierenden Markierungen, Enzymen und radioaktiven Markierungen ausgewählt ist.

10. Peptide nach einem der Ansprüche 1-5, die an ein Substrat immobilisiert sind.

11. Ex-vivo-Verfahren zum Screenen von Patienten auf Autoimmunstörungen durch Umsetzen einer aus einem Patienten entnommenen biologischen Probe mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1-5.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das des weiteren ein Nachweisen von Autoantikörpern in der Probe des Patienten umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das des weiteren eine Krankheitsvorhersage des Patienten auf der Basis der Reaktivität der Probe des Patienten mit den Peptiden umfaßt.

14. Peptide nach einem der Ansprüche 1-10 zur Verwendung in der Medizin.

15. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1-10 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Patienten bezüglich Autoimmunstörungen durch Verabreichen des Medikaments an den Patienten.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Peptid als Vaccine gegen eine Autoimmunstörung wirkt.

17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Peptid an die Autoantikörper bindet, um die Autoimmunantwort zu blockieren.

18. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Peptide in Kombination verabreicht werden, um eine mehr als einen Autoantikörper umfassende Autoimmunantwort zu blockieren.