DE69839163T2 - Methode zur Feststellung der therapeutischen Aktivität eines MBP-Fragments - Google Patents

Methode zur Feststellung der therapeutischen Aktivität eines MBP-Fragments Download PDF

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Description

  • FACHGEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung befasst sich allgemein mit ausgewählten Polypeptiden und ihrer Verwendung bei der Immunregulation von Antikörpern gegen das menschliche basische Myelinprotein. Diese Erfindung betrifft auch allgemein ein Verfahren der Verwendung dieser Peptide für die Behandlung von Multipler Sklerose.
  • HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
  • Die Multiple Sklerose (MS) ist eine mit Entzündung assoziierte multifokale demyelinisierende Erkrankung des menschlichen zentralen Nervensystems (ZNS). Die erhöhte IgG-Synthese innerhalb der Blut-Hirn-Schranke (intra-BBB) ist ein Kennzeichen der MS (Tourtelotte, W. W., J Neurol Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. und Tibbling, G., Scand J Clin Lab. Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte, W. W. und Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J. M. und Tourtelotte, W. W., In: Hrsg. Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. und Tourtelotte, W. W., Multiple sclerosis, Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 275-358; und Warren, K. G., und Catz, I. Ann Neurol 17: 475-480, 1985).
  • Die IgG-Synthese innerhalb der BBB ist bei klinisch eindeutigen MS-Patienten (Schumacher, G. A., Beebe, G., Kibler R. E., et al., Ann NY Acad Sci 15: 266-272, 1965) mit aktiver oder ruhender Erkrankung allgemein erhöht. Die Spezifität der Mehrheit des ZNS-IgG ist unbekannt. Während ein kleiner Anteil antivirale Aktivität hat oder gegen Antigene des Gehirns, Nucleinsäuren, Erythrocyten oder Antigene des glatten Muskels reagiert, kann der nicht-spezifische Anteil die polyclonale Aktivierung von B-Zellen repräsentieren (Tourtelotte, W. W., und Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978). Während des letzten Jahrzehnts gab es deutliches Interesse an der Untersuchung von Antikörpern gegen spezifische Myelinproteine.
  • Nach dem Nachweis von zirkulierenden Immunkomplexen, welche das basische Myelinprotein (MBP) als ihre antigene Komponente enthalten (Dasgupta, M. K., Catz, I, Warren, K. G. et al., Can J Neurol Sci 10: 239-243, 1983), wurden erhöhte Titer von Antikörpern gegen MBP (anti-MBP) in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) von Patienten mit aktiven Formen der MS beobachtet (Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986). Klinisch wird die MS durch Phasen der Krankheitsaktivität wie akute Rückfälle oder chronische Progression und durch Phasen von klinischer Remission charakterisiert. Die aktive MS ist mit erhöhten Niveaus von intrathekal hergestellten anti-MBP assoziiert (Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; und Catz, I. und Warren, K. G., Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986). Diese Antikörper werden vorwiegend in freier (F) Form während der akuten Rückfälle und vorwiegend in gebundener (B) Form, wenn die Erkrankung schleichend progressiv ist, gefunden (Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986). Während der akuten Rückfälle korrelierten die anti-MBP-Titer der CSF mit der Krankheitsaktivität (Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Die anti-MBP-Niveaus waren auch bei Patienten mit ersten Anfällen der Optikusneuritis und in den meisten Patienten, welche die ersten Anfälle der MS erfuhren, erhöht (Warren, K. G., Catz, I. und Bauer, C., Ann Neurol 23: 297-299, 1988; Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989).
  • Longitudinale Kinetik-Untersuchungen von anti-MBP-Niveaus der CSF bei Patienten, welche im Anschluss an einen akuten Rückfall in die Erholungsphase eintreten, zeigten eine allmähliche Abnahme an F anti-MBP-Titern, entsprechend mit einem progressiven Anstieg an B-Fraktionen (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989; Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988). In der Remissionsphase kann der anti-MBP der CSF nicht nachweisbar werden, was eine anti-MBP-Neutralisation, assoziiert mit ruhenden Phasen der MS, nahelegt (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988). Dagegen ist die chronisch progressive MS, welche durch die Ausdauer des erhöhten anti-MBP über lange Zeiträume charakterisiert ist, mit einer Hemmung der anti-MBP-Neutralisation assoziiert (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988). Neulich enthielt eine Kaskade des basischen Myelinprotein-Antikörpers, welche in der IgG- Fraktion, die von der CSF der MS-Patienten aufgereinigt wurde, identifiziert wurde, anti-MBP, Antikörper, welche anti-MBP neutralisieren, und Antikörper, welche die anti-MBP-Neutralisation hemmen (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990).
  • Unsere frühere Forschung von der autoimmunen B-Zell-Perspektive zeigte, dass es mindestens zwei eindeutige Formen der MS mit der Mehrheit von Patienten, welche Autoantikörper gegen das basische Myelinprotein (anti-MBP) haben, und einer geringeren Anzahl, welche Antikörper gegen das Proteolipid-Protein (anti-PLP) haben, gibt (Warren, K. G. et al., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994). Bei anti-MBP-assoziierter MS sind die akuten Rückfälle mit erhöhten (größer als 1) Quotienten von freiem (F)/gebundenen (B) anti-MBP assoziiert, während die chronisch progressive Phase durch F/B-anti-MBP-Quotienten von gleich oder kleiner als 1 charakterisiert ist und Patienten in Remission manchmal ein bisschen erhöhte B anti-MBP-Titer haben (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci. 88, 185-194, 1989).
  • Es wurde bewiesen, dass einige der proliferierenden T-Zellen bei MS-Patienten gegen MBP gerichtet sind (Allegretta et al., Science, 247, 718-721, 1990) und dass menschliche T-Zellen mehrere Epitope auf dem Molekül erkennen können (Richert et al., J Neuroimmun 23, 55-66, 1989). MBP scheint auch in der Lage zu sein, einige T-Zellen ohne Beteiligung der Antigen-präsentierenden Zellen zu aktivieren (Altman et al., Eur. J. Immun. 17, 1635-1640, 1987). Es ist wahrscheinlich, dass kleine Peptide des MBP von T-Zellen ohne die Bedingung für die intrazelluläre Bearbeitung, einfach durch ihre Fähigkeit, Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse II auf der Oberfläche von präsentierenden Zellen zu binden, erkannt werden können.
  • Da die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE), ein anerkanntes Tiermodell der MS, durch Impfung von empfindlichen Nagetieren mit entweder MBP oder PLP in Verbindung mit komplettem Freundschem Adjuvans erzeugt werden kann, kann der Prozess der MS-Demyelinisierung einen autoimmunen Mechanismus haben (Fritz, R. B. et al., J Immunol. 130, 1024-1026, 1983; Trotter, J. L. et al., J Neurol. Sci. 79, 173-188, 1987). Aus der Perspektive des B-Zell-Antikörpers wurde das MBP-Epitop, das durch den Erkrankungsprozess betroffen ist, proximal zu der tri-Prolil-Sequenz (Reste-99-100-101-) auf einen Bereich zwischen den Resten 80 und 100 lokalisiert (Warren, K. G. et al., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994). Dieses B-Zell-Epitop überlappt das immundominante Epitop für zu MBP reaktive T-Zellen, welche bei MS-Hirnläsionen gefunden werden (Oksenberg, J. R. et al., Nature, 362, 68-70, 1983).
  • Frühere Untersuchungen zeigten, dass anti-MBP von MBP neutralisiert wird. Jedoch waren frühere Bestrebungen, die MS durch intramuskuläre oder subkutane Verabreichung von heterologen MBP zu behandeln, nicht erfolgreich (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. und Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. und Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; und Romine, J. S. und Salk, J., In: Hrsg. Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. und Tourtelotte, W. W., Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Das Problem der Verwendung des natürlichen MBP ist zweifach. Erstens wird das Protein aus menschlichen Hirnproben präpariert und demgemäß gibt es eine mögliche Gefahr, dass latente Neuroviren in der Probe vorhanden sein können. Zweitens ist es möglich, obwohl lösliches MBP normalerweise kein Immunogen ist, dass lösliches MBP als Antigen wirken und die Produktion von Antikörpern gegen MBP verursachen könnte, wenn es an Einzelpersonen mit geändertem Immunsystem verabreicht wird.
  • Demgemäß bestimmt die vorliegende Erfindung, ob der aus der CSF von MS-Patienten gereinigte anti-MBP durch ausgewählte lösliche Peptide des menschlichen MBP (h-MBP) neutralisiert werden kann. Zu diesem Zweck wurden lösliche synthetische Peptide, welche die gesamte Länge von h-MBP abdecken, verwendet, um den möglichen Epitopbereich auf h-MBP, welches den von diesen Patienten erhaltenen anti-MBP neutralisiert, zu bestimmen. Daher können ausgewählte lösliche Peptide, welche die Neutralisation von anti-MBP zeigen, verwendet werden, um die MS wirksamer zu behandeln als das gesamte Molekül. Diese löslichen Peptide werden synthetisch hergestellt, und als solches würde keine mögliche Gefahr der Neuroviren existieren. Zusätzlich könnten diese Peptide wegen ihrer kleinen Größe nicht als Immunogen wirken. Daher würde die Verwendung von ausgewählten Peptiden als Behandlung für MS die Probleme bewältigen, welche mit der Verwendung des natürlichen Proteins identifiziert werden.
  • Weiter wurde das in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendete Protein erforscht, um seine Wirksamkeit bei der Bindung oder Anpassung der Produktion von anti-MBP der MS in vivo zu bestimmen.
  • WO 96/12737 offenbart isolierte Peptide und Kombinationen von Peptiden, welche von Myelin-Autoantigenen einschließlich MBP abgeleitet sind, welche für die Behandlung von multipler Sklerose geeignet sind.
  • WO 93/21222 offenbart Peptide des menschlichen basischen Myelinproteins und insbesondere Aminosäuresequenzen, welche das immundominante Epitop des menschlichen basischen Myelinproteins enthalten. Verfahren zur Unterdrückung von Autoimmunreaktionen durch Verabreichung der Peptide des menschlichen basischen Myelinproteins werden auch offenbart.
  • WO 93/08212 offenbart synthetische Peptide, welche in Sequenz wesentlich homolog zu einem Teil der Aminosäuresequenz des menschlichen Myelinproteins sind. Diese Peptide reichen an Länge von etwa 8 Aminosäureresten bis etwa 25 Aminosäureresten und entsprechen der Aminosäuresequenz des menschlichen basischen Myelinproteins (h-MBP) von etwa dem Aminosäurerest 61 bis etwa dem Aminosäurerest 106.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Das in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendete Peptid ist in Sequenz wesentlich homolog zu einem Teil der Aminosäuresequenz eines menschlichen basischen Myelinproteins. Dieses Peptid ist in der Lage, die Produktion von anti-MBP zu neutralisieren oder modulieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit der Behandlung eines multiple Sklerose-Patienten mit einem Peptid der Formel:
    Figure 00060001
    umfassend das in vitro-Durchmustern des multiple Sklerose-Patienten auf die Anwesenheit von menschlichem Leukocytenantigen des (HLA)-DR2-Haplotyps, wobei die Anwesenheit des HLA-DR2-Haplotyps prädiktiv für die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung mit dem Peptid ist.
  • Beispiele von Peptiden, welche nicht in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden, werden ausgewählt von:
    Figure 00060002
  • Zu Identifizierungszwecken werden MBP82-98 und MBP(82-98) hierin verwendet, um das Peptid (welches in Verbindung mit der Erfindung verwendet wird) anzuzeigen:
    Figure 00070001
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 zeigt die Lokalisierung von 18 synthetischen Peptiden (kleine Zahlen) in Bezug auf das intakte menschliche MBP-Molekül. Die Peptide werden durch vertikale Balken dargestellt, welche neben ihrer entsprechenden Region auf dem MBP-Molekül angeordnet sind. Große Zahlen stellen Aminosäurereste des menschlichen MBP dar.
  • 2 zeigt die Inhibitionskurven von anti-MBP, das von 10 unterschiedlichen multiple Sklerose-Patienten aufgereinigt und zusammengefasst wurde, durch das menschliche MBP und MBP-Peptide.
  • 3 zeigt die Neutralisation von anti-MBP, das von einem einzelnen multiple Sklerose-Patienten isoliert wurde, durch das menschliche MBP und durch die Peptide MBP80-97; MBP91-106 und MBP75-95.
  • 4 – Longitudinales Überwachen von anti-MBP-Titern der CSF bei einem Patienten mit chronisch progressiver MS: Die F (freien) und B (gebundenen) Niveaus von anti-MBP waren ständig erhöht, als Proben 26-mal über einen Zeitraum von 11 Jahren von 1983 bis 1993 genommen wurden.
    • ZpM:
    Zählimpulse pro Minute
    Figure 00070002
    offene Kreise: Gebundener (B) anti-MBP, bestimmt nach saurer Hydrolyse von Immunkomplexen der CSF
    Geschlossene Kreise: Freier (F) anti-MBP
  • 5 – Kontrollpatienten: Anti-MBP-Niveaus der CSF in 2 „Zeitkontrollen" (1F56, 5A und 3M66, 5B) und 2 „Zeitkontrollen mit Salzlösung" (4M45, 5C und 5M59, 5D). Bei allen vier Patienten blieben die F und B anti-MBP konstant auf Basislinien-Niveau erhöht, wenn von der CSF die ersten zwei Stunden alle 30 Minuten sowie 24 Stunden später eine Probe genommen wurde. Symbole wie in 4.
  • 6 – Peptiduntersuchungen zwischen den Patienten: Anti-MBP-Niveaus der CSF in einer Gruppe von vier Patienten (10F38, 6A; 13F43, 6C; 5M59, 6D und 3M66, 6G), die steigende Mengen (jeweils 1, 2.5, 5 und 10 mg) eines nicht bindenden synthetischen Kontrollpeptids MBP35-58 erhielten, und eine gepaarte Gruppe von vier anderen MS-Patienten (6F53, 6B; 8M41, 6D; 4M45, 6F und 1F56, 6H), die steigende Mengen (jeweils 1, 2.5, 5 und 10 mg) des anti-MBP-bindenden synthetischen Peptids MBP75-95 erhielten. Der F anti-MBP der CSF wurde in einer dosisabhängigen Weise von dem Peptid MBP75-95 gebunden und er reagierte nicht mit dem Peptid MBP35-58. Der gebundene anti-MBP blieb nahezu unbeeinflusst.
  • 7 – Peptiduntersuchungen innerhalb des Patienten: Wenn MS-Patienten entweder „Zeitkontrollen" (1F56, 7C und 3M66, Fig. D) oder „Zeitkontrollen mit Salzlösung" (5M59, 7A und 4M45, 7B) waren oder wenn sie das nicht bindende Kontrollpeptid MBP35-58 (5M59 und 3M66) erhielten, blieben ihre F und B anti-MBP-Niveaus der CSF unbeeinflusst. Wenn dagegen dieselben Patienten 4M45, 1F56 und 3M66 später 5–10 mg des anti-MBP bindenden Peptids MBP75-95 erhielten, wurde ihr F anti-MBP für Zeiträume bis zu 7 Tagen nicht nachweisbar und kehrte zwischen 10 und 21 Tagen zum Basislinien-Niveau zurück.
  • 8 – Wiederholte intrathekale Injektionen des synthetischen Peptids: Ein Patient mit chronisch progressiver MS erhielt 10 wöchentliche Injektionen von 10 mg MBP75-95, welches direkt in die CSF geimpft wurde; die F und B-Titer von anti-MBP wurden vor (Kreise) und 30 Minuten nach (Quadrate) jeder Impfung gemessen. Der F anti-MBP (geschlossene Kreise und Quadrate) wurde für einen Zeitraum von 10 Wochen nicht nachweisbar gemacht, während der B-Antikörper im Wesentlichen unverändert blieb (offene Kreise und Quadrate).
  • 9 – Intravenöse Verabreichung des synthetischen Peptids: Die anti-MBP-Niveaus der CSF nach einer einzelnen intravenösen Injektion von 500 mg MBP75-95; sowohl die F als auch die B anti-MBP-Niveaus nahmen signifikant ab, wenn 10, 16 und 30 Tage nach der Injektion getestet wurde. Symbole wie in 4.
  • 10 – Weitere Verfeinerung des MBP-Epitops für anti-MPB der MS unter Verwendung eines Satzes von 41 Decapeptiden, welcher den Bereich zwischen den Resten 61 und 110 abdeckt. Legende:
    • • Die Balken stellen die prozentuale Hemmung dar = 100 – Radioaktivitätseinheiten
    • • Das MBP und das Peptid MBP75-95 wurden als Positivkontrollen verwendet und bewirkten vollständige (100%) Hemmung sowohl des F- als auch des B-Antikörpers
    • • Die Peptide MBP51-60 und MBP111-120 wurden als Negativkontrollen verwendet und bewirkten eine vernachlässigbare Hemmung (0–10%) des F und B anti-MBP
    • • Die Decapeptide MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 und MBP87-96, welche die maximale Hemmung (90–100%) sowohl des F- als auch des B-Antikörpers bewirkten, sind stark mit dem MBP-Epitop assoziiert
    • • Gepunktete Linie: 95% Konfidenzgrenzen des Hemmtests
  • 11a zeigt den freien
    Figure 00090001
    und gebundenen (B)-o anti-MBP der CSF in einem Patienten mit einseitiger Optikusneuritis, der in vierwöchigem Abstand intrathekal zwei Injektionen (it#1 und it#2) von 50 mg pMPB86-95, erhielt; w = Anzahl der Wochen.
  • 11b zeigt die Niveaus des freien
    Figure 00100001
    und des gebundenen (B)-o anti-MBP der CSF bei einem Patienten mit vollständiger einseitiger Optikusneuritis, der mehrere intrathekale Injektionen (it#1, it#2, it#3, it#4 und i5#5) von 50 mg pMBP82-98 während der ersten Woche des Rückfalls erhielt.
  • 11c zeigt die Niveaus des freien
    Figure 00100002
    und des gebundenen (B)-o anti-MBP der CSF bei einem Patienten mit Pseudoathetose, der täglich fünf intrathekale Injektionen (it#1, it#2, it#3, it#4 und it#5) von 50 mg pMBP82-98 erhielt.
  • 11d zeigt die Niveaus des freien
    Figure 00100003
    und des gebundenen (B)-o anti-MBP der CSF bei einem Patient mit rezidivierend-progressiver MS, der alle 2 bis 3 Tage während der ersten Woche des Rückfalls vier intrathekale Injektionen (it#1, it#2, it#3 und it#4) von 50 mg pMPB86-95 und eine intravenöse Injektion (IV) von 400 mg pMPB86-95 erhielt, als die Erkrankung wieder in die progressive Phase eintrat.
  • 12 zeigt die Niveaus des freien und des gebundenen anti-MBP der CSF bei einem Patienten mit einem poylsymptomatischen Rückfall, der insgesamt sieben intrathekale Injektionen von 50 mg pMPB86-95 erhielt. Keine CSF-Probe wurde 30 Minuten nach it#2 erhalten; eine CSF-Probe wurde 24 Stunden später erhalten. Symbole wie in 11.
  • 13 zeigt die Niveaus des freien und des gebundenen anti-MBP der CSF bei einem Patienten mit rezidivierend-progressiver MS, der sowohl intrathekale (it#1, it#2 und it#3) als auch intravenöse (IV#1 und IV#2) Injektionen von pMBP86-95 erhielt. Keine CSF-Probe wurde vor oder nach it#2 erhalten. Symbole wie in 11.
  • 14 zeigt die Niveaus des freien und des gebundenen anti-MBP der CSF bei einem Patienten mit rezidivierend-progressiver MS, der intravenöse (IV#1, IV#2 und IV#3) und intrathekale (it#1 bis it#9) Injektionen von pMPB86-95 und pMPB82-98 erhielt. Symbole wie in 11.
  • 15 zeigt das Bestreben, künftige Rückfälle bei einem Patienten mit rezidivierend-progressiver MS zu vermeiden, der zwei intravenöse Injektionen (IV#1 und IV#2) von 400 mg pMPB86-95 und pMPB82-98 erhielt. Keine CSF-Probe wurde während des ersten Rückfalls 3 Monate nach IV#1 erhalten. Die natürliche Häufigkeit der Rückfälle wird oben durch Pfeile dargestellt, welche dem Monat des Anfalls entsprechen. Der eingerahmte Bereich stellt die Zeit des Experiments dar. Symbole wie in 11.
  • 16 zeigt das Bestreben, künftige Rückfälle bei einem Patienten mit rezidivierend-progressiver MS zu vermeiden, der zwei intrathekale (it#1 und it#2) und eine intravenöse Injektion (IV) von pMPB86-95 erhielt.
    Figure 00110001
    hohe Dosis von intravenösen Methylprednisolon. Die natürliche Häufigkeit von Rückfällen wird oben durch Pfeile dargestellt, welche dem Monat des Anfalls entsprechen. Der eingerahmte Bereich stellt die Zeit des Experiments dar. Symbole wie in 11.
  • 17 zeigt die Wirkung der intrathekalen und intravenösen Peptidverabreichung von MBP spezifischen Autoantikörpern in der CSF eines Patienten mit chronisch progressiver MS; wobei in 17a pMBP75-95 direkt in die CSF injiziert wurde (2.5 mg in 5 ml Salzlösung) und die MBP spezifischen Autoantikörper durch einen Festphasen-Radioimmunassay bei unterschiedlichen Zeitpunkten (0.5 Stunden bis 7 Tage nach der Injektion) gemessen wurden. Die Peptidinjektion führte zu einer vorübergehenden Neutralisation des freien anti-MBP (geschlossene Kreise), aber beeinflusste nicht den gebundenen anti-MBP (offene Kreise). Die Autoantikörper waren zu 1 und 2 Stunden nicht nachweisbar und begannen, zwischen 12 und 24 Stunden nach Injektion zu Basislinien-Werten zurückzukehren. Ähnliche Beobachtungen wurden in sieben anderen Patienten mit chronisch progressiver MS gemacht. In 17b wurden 13 Monate nach der in 17a gezeigten intrathekalen Peptidinjektion 500 mg pMBP75-95 intravenös in 50 ml Salzlösung injiziert und die MBP spezifischen Autoantikörper in der CSF wurden über einen Zeitraum von 3 Monaten gemessen (Mittelwert ± Standardabweichung).
  • 18 zeigt eine Zusammenstellung der anti-MBP-Niveaus der CSF bei 13 Patienten mit chronisch progressiver MS, denen eine intravenöse Injektion (IV#1) von 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht (256–500 mg in normaler Salzlösung) von pMBP75-95 (2 Patienten) oder pMBP86-95 (11 Patienten) gegeben wurde; sowohl der freie als auch der gebundene anti-MBP (geschlossene bzw. offene Kreise) wurden bestimmt. Die Autoantikörper-Niveaus waren zwischen einem und vier Monaten nach IV#1 niedrig oder nicht nachweisbar, als sie begannen, zu Basislinien-Niveaus zurückzukehren. Zwischen 6 und 10 Monaten nach IV#1 erhielten alle Patienten eine zweite intravenöse Injektion von pMBP82-98 in der gleichen Dosierung (IV#2).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist auf ein ausgewähltes, in Verbindung mit dem Verfahren der Erfindung verwendetes Peptid gerichtet, welches in der Sequenz zu einem Teil der Aminosäuresequenz eines menschlichen basischen Myelinproteins homolog ist.
  • Auf Grundlage weiterer Arbeit in Bezug auf die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage der kompetitiven Hemmtests unter Verwendung einer Reihe von 41 Decapeptiden das MBP-Epitop für anti-MBP der MS verfeinert und zu einem Bereich zwischen Aminosäure 86 und Aminosäure 95 lokalisiert. Auf Grundlage des Höchststands der Hemmung (gleich oder größer als 95%) von B anti-MBP ist das MBP-Epitop für anti-MPB der MS zwischen der Aminosäure 86 und der Aminosäure 95. Die kleinste gemeinsame Region der wirksamen Decapeptide ist von Aminosäure 87 bis Aminosäure 93.
  • Die 7 Aminosäuren, welche die Aminosäurepositionen 87 bis 93 umfassen, würden wahrscheinlich nicht groß genug sein, um effektiv anti-MBP zu binden.
  • Das in Verbindung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Peptid kann gemäß weitgehend annehmbaren Verfahren der Synthese von Polypeptiden hergestellt werden. Innerhalb des Umfangs des Begriffs ,Peptid' sind auch Peptide einbezogen, die durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden. Durch das Wissen der Sequenz des ausgewählten Peptids, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, ist es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, eine geeignete DNA-Sequenz zu bestimmen, welche die ausgewählte Aminosäuresequenz codieren wird. Die geeignete DNA-Sequenz kann durch konventionelle, bekannte Verfahren der Synthese von DNA-Sequenzen hergestellt werden. Die so hergestellten DNA-Sequenzen können dann in geeignete Clonierungsvehikel cloniert und verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, um das rekombinante Peptid herzustellen. Jede dieser Methodik, auf die vorstehend verwiesen wird, ist konventionell und den Fachleuten gut bekannt.
  • Beispiele von Peptiden, welche nicht in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden, werden aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:
    Figure 00130001
  • Beispiele von Peptiden, welche nicht in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden, werden ausgewählt aus:
    Figure 00140001
  • Das Peptid MBP82-98, das in Verbindung mit dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, hat wegen der fünf zusätzlichen hydrophilen Reste in diesem Peptid eine verbesserte Löslichkeit über die anderen offenbarten Peptide, die nicht in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die mögliche Funktion von anti-MBP bei der Pathogenese der MS bleibt zu erforschen. Über erhöhte anti-MBP-Titer bei Patienten mit aktiver MS wurde zuerst von Panitch et al berichtet (Panitch, H. S., Hooper, C. S., und Johnson, K. P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980), die einen Festphasen-Radioimmunassay mit MBP des Meerschweinchens verwendeten. Patienten mit akuten MS-Rückfällen haben normalerweise erhöhte anti-MBP vorwiegend in freier Form, während einige Patienten in klinischer Remission nicht nachweisbare anti-MBP-Niveaus haben können. Während der Übergangsphase von einem akuten Rückfall zur Remission nehmen die Titer des freien anti-MBP fortschreitend über Wochen oder Monate ab, während die gebundenen Fraktionen des Antikörpers zunehmen, verglichen mit ihrem Anfangswert. Bei anderen Patienten in Remission ist es möglich, geringe Titer des freien und gebundenen Anti-MBP normalerweise mit einem F/B-Quotienten unter Eins zu beobachten, was nahelegt, dass (ein) anti-MBP neutralisierende(r) Antikörper an anti-MBP gebunden wird (werden). Gelegentlich hatten Patienten, bei denen die Kriterien von klinisch eindeutiger MS passen, oder Patienten, die neuropathologisch bestätigte MS hatten, nicht nachweisbare anti-MBP während der aktiven Phasen ihrer Erkrankung. Es ist möglich, dass solche Patienten Antikörper gegen andere Myelinproteine haben. Die Abwesenheit des Szenariums eines spezifischen Antikörpers verneint nicht die mögliche Bedeutung des anti-MBP in dem Demyelinisierungsmechanismus bei der Mehrheit der MS-Patienten.
  • Vor kurzem wurde eine MBP-Antikörper-Kaskade in der aus der MS-CSF gereinigten IgG-Fraktion beobachtet (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Primäre Antikörper gegen MBP in sowohl freien als auch gebundenen Formen treten in Verbindung mit der aktiven Erkrankung auf: F/B-Quotienten sind über Eins bei Patienten mit akuten Rückfällen und unter Eins bei Patienten mit chronisch progressiver Erkrankung (Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I. und Warren, K. G., Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986; und Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Sekundäre Antikörper, welche anti-MBP neutralisieren, erscheinen, wenn die Erkrankung inaktiv wird. Tertiäre Antikörper, welche die anti-MBP-Neutralisation hemmen, sind vorhanden, wenn die Erkrankung chronisch progressiv ist und nicht inaktiv wird. Die Tatsache, dass eine MBP-Antikörper-Kaskade mit eindeutigen Phasen der MS assoziiert ist, schlägt ihre mögliche Bedeutung hinsichtlich der natürlichen Entwicklung dieser Erkrankung vor.
  • Obwohl anti-MBP in der CSF von Patienten mit aktiver MS nachgewiesen werden können, bleibt ihre direkte Funktion bei der Pathogenese der Demyelinisierung zu bestätigen. Die Beteiligung von anti-MBP bei dem Mechanismus der MS könnte am besten durch ihre Herunterregulierung in vivo, vielleicht durch Verabreichung von ausgewählten Peptiden und Überwachung des klinischen Verlaufs der Erkrankung bestimmt werden. Wenn der/die anti-MBP der/die einzige(n) primäre(n) Antikörper, assoziiert mit der Demyelinisierung bei der MS, ist/sind, kann es möglich sein, diesen Prozess durch intrathekale und/oder intravenöse Verabreichung des ausgewählten MBP-Peptids zu blockieren, welches anti-MBP herunterregulieren würde und die Verträglichkeit zu MBP in situ fördern würde. Andere menschliche Myelinproteine können auch bei der Demyelinisierung bei der MS beteiligt sein und demgemäß ist es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Peptide zu verwenden, die in der Sequenz zu einem Teil der Aminosäuresequenz dieser anderen Myelinproteine wesentlich homolog sind, um die entsprechenden Antikörper herunterzuregulieren. Obwohl frühere Bestrebungen, die MS durch intramuskuläre oder subkutane Verabreichung von heterologen MBP zu behandeln, nicht ganz erfolgreich waren (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. und Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. und Demonty, L. J Neurol 216: 27-31, 1977; und Romine, J. S. und Salk, J., In: Hrsg. Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. und Tourtelotte, W. W., Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 621-630), zeigte die intrathekale und/oder intravenöse Verabreichung des MBP-Peptids, welches die Produktion von anti-MBP neutralisiert oder herunterreguliert, gemäß der vorliegenden Erfindung günstigere Ergebnisse.
  • Das Tiermodell der MS, experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), ist eine T-Zell-vermittelte demyelinisierende Erkrankung. Die EAE kann durch intraperitoneale Impfung der betroffenen Mäuse mit synthetischen MBP-Peptiden verbessert werden (Gaur, A. et al., Science 258, 1491-1494, 1992). Darüber hinaus zerstörte die Verabreichung von MBP-Peptiden in hohen Dosierungen die autoreaktiven T-Zellen und hob die klinischen und pathologischen Anzeichen der EAE bei den Mäusen auf (Critchfield, J. M. et al., Science 263, 1139-1143, 1994). Sogar die orale Verabreichung von MBP modulierte die EAE durch Erzeugung peripherer Toleranz (Chen, W. et al., Science. 265, 1237-1240, 1194). Eine Kombination von Myelin-Antigenen oder synthetischen Peptiden dieser Antigene, verabreicht durch intravenöse und/oder intrathekale Wege, kann benötigt werden, um T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen zu modulieren, welche bei dem Myelin-Abbau bei MS-Patienten beteiligt sind.
  • Während diese Erfindung ausführlich mit spezieller Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben wird, werden die folgenden Beispiele geboten, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht zu begrenzen.
  • BEISPIEL 1 (Referenzbeispiel)
  • In vitro-Neutralisation des anti-menschliches basisches Myelinprotein-Antikörpers
  • 1 zeigt die Lokalisierung von 18 Peptides des in dieser Untersuchung verwendeten h-MBP in Bezug auf das intakte MBP-Molekül. Natürliches MBP wurde aus MS-freien Hirngewebe isoliert (Diebler, G. E., Martenson, R. E., Kies, M. W., Prep Biochem 2: 139-165, 1972) und durch Gelfiltration und Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Die letzten Antigenpräparate wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf Reinheit geprüft. Nur Präparate, die bei dem Molekulargewicht von 18.5 KD wanderten, wurden in weiteren Untersuchungen verwendet. Das gereinigte MBP wurde in Antigen-spezifischer Affinitätschromatographie, bei Neutralisierungsuntersuchungen und bei dem Festphasen-Radioimmunassay des anti-MBP verwendet.
  • 18 Peptide, welche die Länge des h-MBP abdecken und zwischen 8 und 25 Aminosäurereste enthalten, wurden durch das Fmoc-Verfahren synthetisiert, wie früher beschrieben (Groome, N. P., Dawkes, A., Barry, R. et al. J Neuroimmun 19: 305-315, 1988). Die Reinheit des Peptids wurde durch Umkehrphasen-HPLC mit einer C18-Säule und einem Wasser/Acetonitril-Gradienten (0.1% TFA) überprüft. Die Aminosäureanalyse der Peptide wurde auch unter Verwendung der Standardanalyse durchgeführt. Viele der in dieser Untersuchung verwendeten Peptide enthielten einen unnatürlichen Cysteinrest, weil sie gemacht wurden, um als Immunogene in Verbindung mit dem Freundschen Adjuvans zu fungieren. Dies beeinflusst die vorliegenden Befunde wahrscheinlich nicht.
  • Die Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) wurde innerhalb einer Woche vom Ausbruch der Symptome von 35 Patienten mit akuten MS-Rückfällen erhalten und die IgG-Niveaus wurden durch Nephelometrie bestimmt. Die in dieser Untersuchung verwendeten CSF-Proben wurden ausgewählt, um zunächst hohe absolute IgG-Niveaus (≥ 0.080 g/l) und erhöhte anti-MBP-Titer (F/B-Quotient » 1.0) zu haben. Alle MS-Patienten hatten eine klinisch eindeutige Erkrankung.
  • IgG wurde aus der konzentrierten CSF der Patienten mit akuter MS durch Affinitätschromatographie mit Protein A-Sepharose (PharmaciaTM) aufgereinigt, wie früher beschrieben (Warren, K. G. und Catz, I. J Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Die Reinheit jedes IgG-Präparats wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese und isoelektrischer Fokussierung überprüft. Wenn erhöhte anti-MBP-Niveaus aus gereinigtem IgG mit MBP auf Null absorbiert wurden, enthielten die Überstände nach Absorption restliches IgG, was anzeigt, dass anti-MBP nur einen Bruchteil des erhöhten IgG repräsentiert.
  • Das gereinigte MBP wurde an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (PharmaciaTM) nach den Anleitungen des Herstellers gekoppelt. Das gereinigte IgG der CSF, das erhöhte anti-MBP-Niveaus enthielt, von 35 Patienten mit akuten MS-Rückfällen, wurde verwendet, um anti-MBP durch MBP-Sepharose-Affinitätschromatographie zu isolieren (Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 103: 90-96, 1991). Die gereinigten anti-MBP-Proben wurden mit der anfänglichen IgG-Quelle durch Polyacrylamidgelelektrophorese verglichen. Wenn die gereinigten anti-MBP-Proben mit MBP auf Null absorbiert wurden, enthielten die Überstände nach der Absorption kein restliches IgG, was die Reinheit von anti-MBP anzeigt.
  • Konstante Mengen von anti-MBP (15 Radioaktivitäts-Bindungseinheiten entsprechen 100 zu Zwecken der Maßstaberweiterung = %0) wurden mit steigenden Mengen von h-MBP (0–1000 ng) oder einzelnen Peptiden von MBP (0–10,000 ng) in einem Flüssigphasen-Assay inkubiert und nach 1.5 Stunden Inkubation wurden die Niveaus des freien anti-MBP in allen Mischungen bestimmt. Die aus 7 einzelnen MS-Patienten isolierten anti-MBP oder die aus 10 unterschiedlichen MS-Patienten zusammengefassten anti-MBP wurden in Neutralisationsexperimenten verwendet. Kalbsthymushiston und menschliches Serumalbumin wurden als Antigen-Negativkontrollen verwendet (Bereich: 10–1000 ng). Ein monoclonaler Antikörper (mAk) gegen das Peptid MBP64-78 und ein polyclonales Kaninchen-Antiserum gegen das Peptid MBP1-8 wurden als Antikörper-Positivkontrollen verwendet (Groome, N., Harland, J., und Dawkes, A., Neurochem Int 7: 309-317, 1985; Barry, R., Payton, M. und Groome, N. Neurochem Int 2: 291-300, 1991). Ein anderer monoclonaler Mausantikörper gegen das Epitop 45–50 wurde als Antikörper-Negativkontrolle verwendet.
  • Die anti-MBP-Niveaus wurden durch einen Festphasen-Radioimmunassay mit menschlichem MBP bestimmt (Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Warren, K. G. und Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987; und Warren, K. G. und Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989). Die Niveaus von freiem Anti-MBP wurden in allen Fraktionen aus der Affinitätschromatographie und in allen Neutralisationsmischungen gemessen. Alle Einzelproben wurden unter Verwendung des gleichen iodierten Materials in vierfacher Ausfertigung ausgeführt, um die Schwankungen zwischen den Assays zu minimieren.
  • Der gereinigte anti-MBP wurde vollständig durch MBP und durch die Peptide MBP80-97, MBP91-106 und MBP75-95 neutralisiert und wurde teilweise durch die Peptide MBP64-78, MBP69-83 und MBP61-75 neutralisiert (Tabelle 1 und 2). Die restlichen zwölf Peptide neutralisierten nicht den gereinigten anti-MBP und ihre Kinetikkurven nahmen innerhalb des in 2 gezeigten, gestreiften Bereichs ab. Das Kalbsthymushiston und das menschliche Serumalbumin reagierten nicht mit dem gereinigten anti-MBP, sogar bei Konzentrationen so hoch wie 1000 ng. Der mAk gegen das Peptid MBP64-78 wurde nur durch das Peptid MBP64-78 gehemmt und der mAk gegen das Peptid MBP 18 wurde nur durch das Peptid MBP1-8 gehemmt. Das mAk-Peptid MBP45-50 reagierte nicht mit dem MBP oder einem der Peptide (zur Übersichtlichkeit der Figur sind die Kontrolldaten nicht dargestellt). Die Kontrollproben zeigen die Gültigkeit der Neutralisationsmethode, da jeder Kontrollantikörper vollständig von dem erwarteten Peptid und von keinem der anderen Peptide neutralisiert wurde. Dies zeigt, dass sogar bei hohen Peptidkonzentrationen (10,000 ng) die Spezifität der Erkennung beobachtet wurde.
    TABELLE 1
    MENSCHLICHE MBP-SEQUENZ REAKTIVITÄT MIT ANTI-MBP
    1–170 ++
    1–8 Cy -
    Cy 4–18
    Cy 11–24 -
    18–32 -
    26–40 -
    Cy 35–58 -
    Cy 51–64 Gly +
    Cy 64–78 +
    Cy 61–75 +
    Cy 69–83 ++
    Cy 75–95 ++
    Cy 80–97 Gly ++
    Cy 91–106 -
    117–129 -
    Cy 127–140 -
    Cy 136–149 -
    141–155 -
    Cy 149–162
    • ++ vollständige Neutralisation
    • + Teilneutralisation
    • – unbedeutende Reaktivität
  • Der von 7 einzelnen MS-Patienten aufgereinigte anti-MBP wurde vollständig durch h-MBP und die Peptide MBP80-97, MBP91-106 und MBP75-95 neutralisiert (s. 3 als erklärendes Beispiel). Wegen der begrenzten Menge des Antikörpers, der von den einzelnen MS-Patienten erhalten wurde, ließ man den anti-MBP nicht mit den restlichen 15 Peptiden reagieren.
  • Wie früher erwähnt, wurde der anti-MBP mit Peptiden neutralisiert, welche sich etwa von dem Aminosäurerest 61 bis etwa den Aminosäurerest 106 erstrecken. Die Peptide, welche den anti-MBP nicht neutralisierten, decken sowohl den Amino- (etwa die Reste 1 bis 63) als auch den Carboxy- (etwa die Reste 117 bis 162) Terminus von h-MBP ab. Es erscheint, dass Peptide von unterschiedlichen nicht überlappenden MBP-Regionen den/die gleichen Antikörper neutralisieren. Dies könnte dadurch erklärt werden, dass die Antikörper ein unterbrochenes (zusammengefügtes) Epitop erkennen, welches Aminosäuren aus unterschiedlichen Regionen enthält. Ein ähnliches Phänomen wurde früher von Hruby et al beobachtet (Hruby, S., Alvord, E. C., Groome, N. P. et al, Molec Immun 24: 1359-1364, 1987), die zeigten, dass ein monoclonaler Antikörper der Ratte ein Hauptepitop in der MBP-Sequenz 112–121, aber eine starke Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop im Peptid 39–91 hatte. Dies ist wahrscheinlicher als die Möglichkeit, dass der Antikörper mit zwei vollständig unterschiedlichen Sequenzen kreuzreaktiv ist, welche kein unterbrochenes Epitop bilden (Hruby, S., Alvord, E. C., Martenson, R. E., et al. J Neurochem 44: 637-650, 1985). Die Neutralisationsdaten könnten durch die Fähigkeit der Peptide von unterschiedlichen Abschnitten des MBP erklärt werden, je teilweise die Antikörper-Bindungstasche durch Wechselwirkung mit unterschiedlichen Aminosäureseitenketten des Antikörpers zu besetzen. Diese Erklärung passt zu der Beobachtung, dass die Peptide, welche zu vollständiger Hemmung führen (MBP80-97, MBP91-106 und MBP75-95), auf einer molaren Basis bei der Verursachung der Hemmung 100-mal weniger wirksam als das intakte MBP sind. Aufgrund der vorstehend aufgestellten Hypothese könnte dies an jedem Peptidclon liegen, der nicht die Bindungsenergie des ursprünglichen MBP-Epitops erreichen kann.
  • BEISPIEL 2 (Referenzbeispiel)
  • In vivo-Neutralisation oder Modulation der Produktion des anti-menschlichen basischen Myelinprotein-Antikörpers
  • Patientenauswahl und Kontrolluntersuchungen
  • Patienten, die an diesem Forschungsprojekt teilnahmen, wurden in der Multiple Sclerosis Patient Care und Research Clinic der University of Alberts, Edmonton, Kanada gesehen. Die Patienten wurden durch die Schumacher-Kriterien (1965) diagnostiziert, klinisch eindeutige Multiple Sklerose zu haben, die durch Kernspinresonanztomographie des Gehirns und durch die Immunochemie-Profile der CSF bestätigt wurde. Um zu veranschaulichen, dass bei chronischer progressiver MS der anti-MBP über lange Zeiträume, Monate bis Jahre, ständig erhöht war, hatten die Patienten wiederholte Lumbalpunktionen mit Überwachung des F und B anti-MBP. Bei einem Patienten mit chronischer progressiver MS wurde beobachtet, dass der Autoantikörper für Zeiträume so lange wie 11 Jahre ständig erhöht blieb und dass eine spontane Abnahme der anti-MBP-Niveaus nicht stattfand (4 ist ein veranschaulichendes Beispiel).
  • Um zu bestimmen, dass die anfangs erhöhten anti-MBP-Niveaus der CSF über 24 Stunden relativ konstant blieben, hatten 2 Patienten (1 F56 und 3M66) 2 Stunden alle 30 Minuten sowie 24 Stunden später wiederholte CSF-Probenahme, wobei eine F und B anti-MBP-Überwachung stattfand (5A bzw. 5B). Die Patienten 1F56 und 3M66 dienten als „Zeitkontrollen". Die Niveaus des F und B anti-MBP blieben konstant erhöht, als von der CSF 2 Stunden alle 30 Minuten sowie 24 Stunden später eine Probe genommen wurde.
  • Zusätzlich wurde die Wirkung der Impfung von 5 cm3 normaler Salzlösung in die CSF bei zwei anderen Patienten (4M45 und 5M59; 5C bzw. 5D) gleichermaßen bestimmt. Diese Patienten dienten als „Zeitkontrollen mit Salzlösung". Als 5 cm3 normale Salzlösung intrathekal injiziert wurde, blieben die Niveaus der F und B anti-MBP bei einem Basislinien-Niveau erhöht, wenn von der CSF eine Probe genommen wurde, wie vorstehend, was somit zeigt, dass der „Verdünnungseffekt" auf die anti-MBP-Titer vernachlässigbar war.
  • Die anti-MBP-Niveaus wurden durch einen Festphasen-Radioimmunsassay mit menschlichem MBP, beschichtet auf Immulon-Mikrotitervertiefungen, bestimmt. Die Immulon-Mikrotitervertiefungen wurden mit 100 μl 10 μg/ml MBP (1 μg/Vertiefung) beschichtet und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Quenchen mit Rinderserumalbumin (BSA) und drei Wasserwaschungen wurden die Vertiefungen bei Raumtemperatur gelagert. Die Proben von 100 μl CSF oder die auf 0.010 g IgG/l verdünnten Gewebeextrakte (mit 0.01 M Barbitol gepufferter Salzlösung (BBS) pH 6.9–7.1, 0.5% BSA und 0.05% Tween 20) wurden 1–2 Stunden bei Raumtemperatur in MBP-beschichteten Vertiefungen inkubiert. Nach 5 Pufferwaschungen (mit 0.01 M BBS, 0.5 BSA und 0.05% Tween 20) wurden die Vertiefungen 1 Stunde bei Raumtemperatur mit spezifischen Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Fc (in 0.01 M BBS, 0.05% Tween 20, 0.5% BSA) inkubiert und dann wie vorstehend abgespült. Schließlich wurde 125I-Protein A (oder 125I-Protein G) hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Wenn 125I-Protein G als Tracer verwendet wurde, ersetzte Ovalbumin BSA im Probenpuffer und zum Quenchen. Nach drei letzten Wasserwaschungen wurden die Vertiefungen einzeln gezählt. Die Ergebnisse werden in Radioaktivität dargestellt, definiert als: (Zählimpulse der Probe – Zählimpulse der Leerprobe) ÷ (Zählimpulse der gesamten Radioaktivität – Zählimpulse der Leerprobe). Alle Proben werden in 10 Replikaansätzen ausgeführt und die Zählzeit ist 10 Minuten, um > 10,000 Zählimpulse für eine positive Probe zu sammeln.
  • Bevor sie getestet wurden, wurden alle CSF- und/oder Gewebeproben auf eine IgG-Endkonzentration von 0.010 g/l verdünnt. Der F anti-MBP wurde direkt in der CSF oder im Gewebeextrakt nachgewiesen, während die B-Niveaus des Antikörpers nach saurer Hydrolyse der Immunkomplexe mit Glycin-HCl-Puffer pH 2.2 bestimmt wurden. Unspezifische Bindung wurde für jede Probe in unbeschichteten Vertiefungen durchgeführt. Für die Lokalisiserung des Epitops ließ man synthetische Peptide zuerst mit dem gereinigten Antikörper in einem kompetitiven Test in flüssiger Phase reagieren, und dann wurde der anti-MBP durch Radioimmunassay in allen resultierenden Überständen bestimmt. Die Ergebnisse des kombinierten kompetitiven Bindungstests und des Radioimmunassays wurden als prozentuale Hemmung des synthetischen Peptids dargestellt, definiert als 100 – Radioaktivitätseinheiten. Die Proben wurden in 10 Replikaansätzen ausgeführt und jede 10 Minuten in einem LKB1275-Minigamma-Zähler gezählt. Ein Zusammenschluss von aus Gewebe aufgereinigtem anti-MBP wurde bei 5 voretablierten Verdünnungen als Positivkontrollen verwendet. Die zusammengefasste CSF von Patienten mit nicht neurologischen Erkrankungen wurde als Negativkontrollen verwendet. Innerhalb des Tests war die Reproduzierbarkeit zwischen 3 und 5% und zwischen des Tests war die Schwankung kleiner als 7%.
  • Die Persistenz des anti-MBP der CSF bei einem erhöhten und konstanten Niveau bei Patienten, die als Kontrollen teilnehmen (Zeitkontrolle und Verdünnungskontrolle), ermöglichte den nächsten Schritt dieser Forschung.
  • Peptid-kontrolliertes Phase 1-Doppelblindexperiment – Intrathekale Injektion
  • Ein Phase 1-Experiment zur Bestimmung der Wirkung des synthetischen Peptids MBP75-95 auf die F- und B-Titer des anti-MBP der CSF wurde ausgeführt. Im Anschluss an den Erhalt der Genehmigung von dem Research Ethics Board der University of Alberts wurde dieses Projekt bei Patienten mit klinisch eindeutiger MS (Schumacher et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 122, 552-568, 1965), die schwer behindert waren, und mit fortgeschrittener progressiver Erkrankung ausgeführt. Nach Erhalt der Einverständniserklärung boten sich 14 Patienten für diese Studie an; acht Patienten wurden auf Grundlage ihres Anfangstiters von F anti-MBP der CSF (über 8 Radioaktivitätseinheiten) (Tabelle 2) ausgewählt, um eine intrathekale Injektion von entweder dem Peptid MBP75-95, welches anti-MBP in vitro bindet, oder einen nicht bindenden Kontrollpeptid MBP35-58 zu erhalten (Warren und Catz, 1993b). Das Experiment wurde in einer doppelblinden Weise ausgeführt, so dass weder die Forscher noch die Patienten Kenntnis der Art des Inokulums hatten. Alle Peptide wurden mit 7-stelligen zufällig erzeugten Zahlen von einem unabhängigen Arzt codiert. Peptide, die paarweise in 5 cm3 normaler Salzlösung gelöst und in die CSF mit Hilfe von einer Lumbalpunktion injiziert wurden, wurden in steigenden Dosierungen von 1, 2.5, 5 und 10 mg verabreicht. Von der CSF wurde eine Probe vor der Injektion (Basislinie), 2 Stunden in 30 Minuten-Zeitabständen nach der Injektion, 24 Stunden später und dann zu wöchentlichen Zeitabständen für 3–4 Wochen, bis die anti-MBP-Niveaus zur Basislinie zurückkehrten, genommen. Die Zellzahlen, das Gesamtprotein, Glucose, IgG- und Albumin-Niveaus wurden in allen erhaltenen CSF-Proben bestimmt. Die Niveaus der F und B anti-MBP wurden durch Radioimmunassay bestimmt, wie vorstehend beschrieben. TABELLE 2
    Patient ID #, Geschlecht, Alter Krankheitsdauer (Jahre) Kurtzke EDSS Anti-MBP der CSF (Radioaktivitätseinheiten) Freier (F) Gebundener (B) Für die Forschung ausgewählt
    1F56 10 8.5 – Triplegie 9 10 Ja
    2M50 18 6 – Paraparese 2 10 Nein
    3M66 20 9 – Quadriplegie 11 12 Ja
    4M45 21 9 – Quadriplegie 10 11 Ja
    5M59 28 9 – Quadriplegie 8 10 Ja
    6F53 19 9 – Quadriplegie 10 9 Ja
    7F33 11 6 – Paraparese, Ataxie 5 13 Nein
    8M41 8 8 – Triplegie 9 12 Ja
    9M49 7 7 – Paraparese 5 10 Nein
    10F38 7 8.5 – Paraplegie 11 10 Ja
    11M49 20 8 – Triplegie 6 13 Nein
    12M35 12 6.5 – Paraparese, Ataxie 7 12 Nein
    13F43 15 8 – Paraplegie 9 10 Ja
    14F32 4 6 – Paraparese, Ataxie 8 7 Nein
  • Tabelle 2: Klinische Daten und anti-MBP-Niveaus der CSF von 14 Patienten mit chronisch progressiver MS, die sich anboten, an einer Phase 1-Forschungsstudie einer intrathekalen Injektion von synthetischen MBP-Peptiden teilzunehmen. Da ein anfänglich hoher F anti-MBP (> 8 Radioaktivitätseinheiten) notwendig war, um eine signifikante Änderung nach der Injektion zu erreichen, wurden nur 8 von 14 Patienten für die Studie ausgewählt.
  • Alle in diesen Studien verwendete Peptide wurden unter dem „guten Herstellungsprodukt" (GMP)-Code unter Verwendung des Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Verfahrens von Procyon Inc. (London, Ontario, Kanada) synthetisiert. Die Reinheit des Peptids wurde durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie mit einer C18-Säule und einem Wasser-Acetonitril-Gradienten, der 0.1% TFA enthielt, überprüft. Die Massenspektroskopie und die Aminosäure-Analyse wurden durch Standardverfahren durchgeführt. Vor der Impfung wurden alle Peptide auf Pyrogenität (Vancouver General Hospital, Vancouver, Kanada), Sterilität (Provincial Laboratory for Public Health for Northern Alberts, Edmonton, Kanada) und akute Toxizität (Health Sciences Laboratory Animal Services, University of Alberts, Edmonton, Kanada) überprüft, und sie wurden als „geeignet für die Verabreichung an Menschen" deklariert. Geeignete Mengen der codierten synthetischen Peptide wurden in 5 cm3 steriler normaler Salzlösung (0.9%ige Natriumchlorid-Injektion USP, nicht pyrogen, Baxter Corp, Toronto, Kanada) gelöst, zweimal durch 0.22 μm-Sterilisationsfiltereinheiten (Millex-GX, Millipore Corp., Redford, MA, USA) filtriert und in die CSF mit Hilfe einer Lumbalpunktion verabreicht.
  • Peptidstudien zwischen Patienten
  • Die Patienten 6F53, 8M41, 4M45 und 1F56 erhielten das synthetische Peptid MBP75-95, das in der Lage ist, Anti-MBP in vitro zu binden, und die Patienten 10F36, 13F43, 5M59 und 3M66 erhielten ein nicht bindendes synthetisches „Kontroll"-Peptid MBP35-58 in steigenden Mengen von jeweils 1, 2.5, 5 bzw. 10 mg (6). Bei dem Patient 6F53 (6B), der 1 mg MBP75-95 erhielt, wurde eine 75%ige Abnahme des F anti-MBP, gefolgt durch seine unmittelbare Rückkehr zum Basislinien-Niveau, beobachtet; der Patient 8M41 (6D), der 2.5 mg MBP75-95 erhielt, zeigte eine vollständige Bindungsneutralisation von F anti-MBP, gefolgt durch seine Rückkehr zum Basislinien-Niveau innerhalb von 24 Stunden; beim Patienten 4M45 (6F), der 5 mg MBP75-95 erhielt, trat eine überstürzte und vollständige Bindungsneutralisation von F anti-MBP auf und dauerte 7 Tage an, welche zu ihrem Anfangswert zurückkehrte, als 21 Tage später eine Probe genommen wurde; der Patient 1F56 (6H) erhielt 10 mg MBP75-95, welches auch eine vollständige Bindungsneutralisation von F anti-MBP erzeugte, welche 7 Tage andauerte und zur Basislinie zurückgekehrt war, als eine Probe 14 und 28 Tage später genommen wurde. Die Niveaus des gebundenen anti-MBP wurden durch eine intrathekale Impfung von MBP75-95 nicht signifikant verändert. Bei den Patienten 10F38, 13F43, 5M59 und 3M66, die jeweils 1, 2.5, 5 und 10 mg des nicht bindenden „Kontroll"-Peptids MBP35-58 erhielten, blieben die F- und B-Niveaus des anti-MBP der CSF von der anfangs hohen Basislinie während des 24-Stunden Experiments unverändert (6A, 6C, 6E bzw. 6G). Die üblichen CSF-Entzündungsparameter bei der MS wie Zellzahlen, absolute Niveaus von Gesamtprotein, IgG und Albumin, oligoclonales Banding, IgG-Kennzahl und IgG-Synthese des ZNS blieben vor und nach der Peptidverabreichung unverändert.
  • Peptidstudien innerhalb des Patienten
  • Die Experimente innerhalb des Patienten wurden durchgeführt, um die Schwankungen zwischen den Patienten zu minimieren. Beim Patienten 5M59, der entweder eine „Zeitkontrolle" war oder 5 mg nicht-bindendes Peptid MBP35-58 erhielt, blieben die F anti-MBP-Niveaus auf Basislinien-Niveau während der beiden Experimente erhöht (7A). Der Patient 4M45 war zunächst eine „Verdünnungsmittel-Kontrolle" und zwei Monate später erhielt er 5 mg MBP75-95. Sein F anti-MBP blieb in allen Proben, die während des „Verdünnungsmittel"-Experiments gesammelt wurden, konstant erhöht, und er wurde nach Verabreichung von MBP75-95 nicht nachweisbar (7B). Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem Patient 1F56 erhalten, die ständig erhöhte Niveaus des F-Antikörpers während eines „Zeitkontroll"-Experiments hatte, und nach Verabreichung von 10 mg MBP75-95 wurde sein F anti-MBP nicht nachweisbar (7C). Eine vollständige Untersuchung wurde beim Patienten 3M66 durchgeführt. Seine F anti-MBP-Niveaus waren während eines „Zeitkontroll"-Experiments oder als 10 mg MBP35-58 verabreicht wurden ständig erhöht; jedoch als 10 mg MBP75-95 injiziert wurden, wurde der F anti-MBP vollständig neutralisiert und blieb für 7 Tage nicht nachweisbar (7D).
  • Wiederholte Verabreichung des synthetischen Peptids MBP75-95
  • Nach der Bestimmung, dass das Peptid MBP75-95 für Zeiträume von mehr als 7 Tagen den F anti-MBP in vivo neutralisiert, wurde bestimmt, wiederholt 10 mg MBP75-95 in die Rückenmarksflüssigkeit 10 Wochen zu wöchentlichen Zeitabständen zu impfen. Dieses Experiment wurde bei 3 unterschiedlichen Patienten mit chronischer progressiver MS durchgeführt, die nicht an dem Projekt der einzelnen Peptidinjektion teilnahmen und sich für diese Studie anboten. Die F und B anti-MBP wurden 1–2 Wochen vor der ersten Impfung, vor und 30 Minuten nach jeder der 10 Injektionen und wieder 1 Monat nach der letzten Injektion bestimmt. Zellzahlen, Gesamtprotein, Glucose, IgG- und Albumin-Niveaus wurden in allen CSFs bestimmt, die vor jeder der 10 Injektionen erhalten wurde. Vor der ersten und nach der letzten Injektion wurde Blut erhalten und auf Elektrolyte, Creatinin, Herz- und Leberenzyme und hämatologisch analysiert.
  • Wenn die MS-Patienten mit chronischer progressiver Erkrankung wiederholte intrathekale Injektionen von 10 mg MBP75-95 zu wöchentlichen Zeitabständen für Zeiträume bis zu 10 Wochen erhielten, war ihr anfangs hoher F anti-MBP nicht nachweisbar, so lange wie das Peptid verabreicht wurde; wenn das Peptid nicht länger verabreicht wurde, kehrte F anti-MBP innerhalb von 1 Monat zum Basislinien-Niveau zurück (8). Die B-Antikörper-Titer blieben während des ganzen Experiments konstant erhöht, was nahelegte, dass bei diesen Patienten die Synthese des anti-MBP fortdauerte und die intrathekale Peptidverabreichung nur einen „Wischeffekt" des F anti-MBP bewirkte.
  • Die Patienten, die entweder eine einzelne Injektion des synthetischen Peptids oder wiederholte wöchentliche Injektionen erhielten, hatten chronische progressive Multiple Sklerose mit einem fortgeschrittenen Ausmaß an neurologischer Behinderung. Keiner dieser Patienten berichtete über eine Verschlechterung seiner neurologischen Symptome oder eine Verschlimmerung der MS im Anschluss an die intrathekale Peptidverabreichung, und in der CSF entwickelte sich keine Zellreaktion. Die MS-Patienten, welche die wiederholten Impfungen von MBP75-95 erhielten, wurden auf systemische Komplikationen, welche Elektrolytänderungen sowie Herzleber-Niere-Funktionsstörung und Hämatologie-Änderungen beinhalten, überwacht und keine nachteiligen Komplikationen traten auf. Keine negativen Auswirkungen wurden beobachtet.
  • Intravenöse Verabreichung von MBP75-95
  • Im Anschluss an die Bestimmung, dass die intrathekale Verabreichung des Peptids MBP75-93 die vollständige Bindungsneutralisation des F anti-MBP ohne Änderung in den Niveaus des B-Antikörpers bewirkte, wurde entschieden, die Wirkung der intravenösen Verabreichung des gleichen Peptids auf die CSF-Titer des F und B anti-MBP zu bestimmen; 500 mg MBP75-95 wurden in 100 cm3 normale Salzlösung gelöst und intravenös über 30 Minuten in den Patienten 8M41 mit Überwachung des anti-MBP der CSF alle 30 Minuten für die ersten 2 Stunden, 18 Stunden später sowie 10, 16 und 30 Tage später injiziert. Blut wurde vor der Injektion sowie 16 und 30 Tage später erhalten und auf Elektrolyte, Creatinin, Herz- und Leberenzyme und hämatologisch analysiert. Die Rückenmarksflüssigkeit wurde auf Zellzahlen, Gesamtprotein, Glucose, IgG- und Albumin-Niveaus überwacht. Keine negativen Auswirkungen wurden beobachtet.
  • Wie in 8 gezeigt, bewirkte die intravenöse Verabreichung von 500 mg MBP75-95 innerhalb der ersten zwei Stunden keine Änderung in den Titern der Fund B-Niveaus des anti-MBP der CSF. Eine 30%ige Abnahme im anti-MBP der CSF wurde 18 Stunden später beobachtet. Wenn von der CSF 10, 16 und 30 Tage später wieder eine Probe genommen wurde, hatten sowohl der F als auch der B anti-MBP von ihrem Anfangsniveau von 11 Radioaktivitätseinheiten auf 4, 2 bzw. 1 Radioaktivitätseinheit abgenommen.
  • Eine wiederholte Beobachtung bei allen Patienten, die intrathekal mit MBP75-95 behandelt wurden, war die Persistenz von erhöhten Niveaus des gebundenen Antikörpers, während der F anti-MBP in einer Dosis-Wirkungs-Weise nicht nachweisbar wurde. Dies legte nahe, dass die Synthese von Autoantikörpern gegen MBP während und im Anschluss an die intrathekale Verabreichung von MBP75-95 aktiv blieb. Als eine Konsequenz dieser Beobachtung wurde MBP75-95 einem Patienten, der vorher eine einzelne intrathekale Injektion des Peptids erhalten hatte, intravenös verabreicht. Nach der intravenösen Verabreichung zeigten sowohl die F- als auch die B-Niveaus des anti-MBP der CSF eine signifikante Abnahme, wenn sie für Zeiträume bis zu einem Monat überwacht wurden. Die Abnahme der F- sowie der B-Niveaus des anti-MBP der CSF im Anschluss an die intravenöse Verabreichung von MBP75-95 legt nahe, dass dieser Verabreichungsweg eine Herunterregulierung des autoimmunen Entzündungsprozesses, der für die anti-MBP-Synthese verantwortlich ist, bewirkt. In einer Anschlussstudie bis dato begannen die anti-MBP-Niveaus 4–6 Monate nach einer ersten intravenösen Injektion anzusteigen; eine zweite intravenöse Injektion des gleichen Peptids (Booster) bewirkte eine Herunterregulierung der anti-MBP-Synthese für bis zu 2 Jahren bei ungefähr 70 unterschiedlichen Patienten mit chronischer progressiver MS.
  • Das MBP-Epitop für den anti-MBP bei MS
  • Um weiter das MBP-Epitop für den anti-MBP bei MS zu lokalisieren, ließ man den F und den B anti-MBP, welcher durch Affinitätschromatographie aus der CSF und dem MS-Hirngewebe aufgereinigt wurde (Warren, K. G. et al., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994) in kompetitiven Hemmtests mit 41 aufeinanderfolgenden synthetischen MBP-Peptiden von gleicher Länge (jedes mit 10 Resten, wobei die benachbarten Reste um 9 überlappt wurden), welche den Bereich zwischen den Resten 61 und 110 des menschlichen MBP abdecken, reagieren. Das/die Peptid(e), welches/welche die maximale Hemmung bewirkte(n), wurde(n) als das/die am meisten mit der Antikörper-Bindungsstelle assoziierte(n) angesehen.
  • Die maximale Hemmung (≥ 80%) von sowohl dem gereinigten F als auch dem gereinigten B anti-MBP aus dem MS-Hirngewebe (10) wurde durch vier Decapeptide und zwar durch MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 und MBP87-96 bewirkt, was nahelegt, dass das MBP-Epitop für den anti-MBP bei MS zwischen den Resten 84 und 96 liegt. Der minimale Bereich der gemeinsamen Aminosäurereste ist von Rest 87 bis Rest 93. Der B anti-MBP hatte einen eingeschränkteren Bereich als der F-Antikörper.
  • Die Funktion der anti-MBP-Antikörper bei der Pathogenese der MS-Demyelinisierung wurde nicht aufgeklärt und kann nur durch Modulierung des anti-MBP in vivo und anschließender Beobachtung der klinischen und pathologischen Folgen bestimmt werden. Zum Beispiel könnte während eines akuten Rückfalls der MS, wenn die F/B-Antikörper-Quotienten über Eins sind, ein Peptid, das bekannt ist, an F anti-MBP zu binden, intrathekal geimpft werden, um den freien zirkulierenden Antikörper zu binden und um die klinischen Wirkungen des akuten Rückfalls zu begrenzen; die wöchentliche Verabreichung kann erforderlich sein, bis die Remission stattfindet. Bei MS-Patienten mit chronischer progressiver Erkrankung und überlagerten akuten Rückfällen kann die intrathekale sowie die intravenöse Peptidverabreichung erforderlich sein, um die Entzündungsmechanismen, welche anti-MBP erzeugen, herunterzuregulieren.
  • BEISPIEL 3 (Referenzbeispiel)
  • Geeignete Dosierung von intrathekal verabreichten pMBP86-95 oder pMBP82-98 bei akut rezidivierenden Patienten
  • Die MS-Rückfälle sind mit F/B anti-MBP-Quotienten größer als 1.0 auf Grund höherer Niveaus des freien als des gebundenen Antikörpers in der CSF assoziiert. Allgemein nehmen die F anti-MBP-Niveaus über einen Zeitraum von 3 Monaten allmählich ab, da ein Rückfall in die nachfolgende Erholungs-/Remissionsphase eintritt, und wenn die biologische Remission vollständig ist, werden die F und B anti-MBP der CSF allgemein nicht nachweisbar in der CSF.
  • Patienten, die an den folgenden Beispielen teilnahmen, hatten entweder rezidivierend-nachlassende oder rezidivierend-progressive MS.
  • In diesem und den folgenden Beispielen wurden entweder pMBP86-95 oder pMBP82-98 verwendet. pMBP86-95 hatte eine sehr geringe Löslichkeit in normaler Salzlösung, da es vier hydrophile und sechs hydrophobe Reste enthält. Andererseits hat pMBP82-98 als Folge der fünf zusätzlichen hydrophilen Reste eine erhöhte Löslichkeit in normaler Salzlösung.
  • Zwei Patienten wurden untersucht, um die geeignete Dosierung des intrathekal verabreichten pMBP86-95 oder pMBP82-98 zu bestimmen, welche sofort den F anti-MBP zu nicht nachweisbaren Niveaus verringern werden. Ein Patient hatte einen akuten Rückfall der Ataxie des Gangs und der Gleichgewichtsstörung des Rumpfs. Beim Ausbruch des Anfalls erhielt dieser Patient eine einzelne intrathekale Injektion von 10 mg pMBP86-95; die F und B anti-MBP-Niveaus wurden vor und 1 Stunde nach Injektion und noch fünfmal während der nächsten 3 Monate gemessen. Diese Dosierung unterdrückte den F anti-MBP nur teilweise und die Antikörper-Erholungskurve folgte genau dem natürlichen Verlauf; dieser Patient fuhr fort, progressive spastische Paraparese und Ataxie zu haben. Es wurde gefolgert, dass eine einzelne intrathekale Injektion von 10 mg pMBP86-95 unzureichend war, um vollständig den F anti-MBP zu unterdrücken und seine natürliche Erholungsrate zu verändern.
  • Der andere Patient, eine 18-jährige Frau mit akuter Opitkusneuritis, die eine einzelne intrathekale Injektion von 50 mg pMBP86-95 erhielt, hatte F- und B-Antikörper-Niveaus, die vor und 30 Minuten nach der Injektion gemessen wurden. 30 Minuten nach der Injektion wurde der F-Antikörper nicht nachweisbar. Der Patient möchte nicht den anschließenden Lumbalpunktionen zustimmen. Es wurde so gefolgert, dass Dosierungen von mindestens 50 mg benötigt werden, um den F anti-MBP in der CSF für mindestens 30 Minuten zu binden und zu neutralisieren.
  • BEISPIEL 4 (Referenzbeispiel)
  • Die Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung bei Patienten mit monosymptomatischen Rückfällen
  • In diesem Beispiel wurden die Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung von pMBP, das geringe oder nicht nachweisbare F-Antikörper-Niveaus für einen längeren Zeitraum beibehalten würde, bestimmt. Die vier in dieser Gruppe untersuchten Patienten erhielten synthetische Peptide innerhalb einer Woche vom Ausbruch eines Anfalls.
  • Die ersten zwei Patienten hatten Anfälle von akuter einseitiger Optikusneuritis. Einer dieser Patienten (11a) erhielt im Abstand von vier Wochen intrathekal zwei Injektionen von 50 mg pMBP86-95 (it#1, it#2). Nach jeder Injektion wurde der F anti-MBP innerhalb 1 h nicht nachweisbar. Wenn 1 Woche nach der ersten Injektion gemessen wurde, war der F anti-MBP erhöht, und 4 Wochen später war der F-Antikörper signifikant hoch. Zu dieser Zeit hat der Patient eine zweite intrathekale Injektion (it#2) und der F anti-MBP wurde nach 30 Minuten nicht nachweisbar, aber er wurde anschließend nicht über 24 Stunden hinaus überwacht. Es wurde gefolgert, dass diese Häufigkeit unzureichend war und dass mehrere Injektionen während der ersten Woche eines Anfalls benötigt werden könnten, um geringfügige Antikörper-Niveaus aufrechtzuerhalten.
  • Der zweite Patient mit ganzer einseitiger Optikusneuritis erhielt mehrere intrathekale Peptidinjektionen von 50 mg pMBP82-98 während der ersten Woche seines Anfalls: vier tägliche Injektionen (11b: it#1, it#2, it#3, it#4) und eine fünfte Injektion (it#5) eine Woche später. Das anti-MBP-Profil dieses Patienten zeigte eine stetige, schnelle Abnahme über einen Zeitraum von 7 Tagen. Was entscheidender ist, seine anti-MBP-Niveaus der CSF blieben 7 Wochen und 6 Monate nach it#5 nicht nachweisbar, und der Patient erfuhr kein Wiederauftreten der Optikusneuritis oder einer anderen Art eines MS-Rückfalls. Zusätzlich genas er von der zur Optikusneuritis zusätzlichen einseitigen Blindheit vollständig.
  • Das gleiche Schema von täglichen intrathekalen Injektionen von 50 mg pMBP82-98 wurde dann MS-Patienten mit unterschiedlichen Arten von monosymptomatischen Rückfällen verabreicht. 11c veranschaulicht das anti-MBP-Profil eines Patienten mit akuter Pseudoathetose seiner linken Hand, der intrathekal fünf tägliche Injektionen von 50 mg pMBP82-98 (it#1, it#2, it#3, it#4, it#5) in der zweiten Woche seines Anfalls erhielt. Die F-Antikörper-Niveaus nahmen innerhalb von 4 Tagen auf nicht nachweisbare Werte ab und blieben nicht nachweisbar, wenn sie 11 Tage und einen Monat später beurteilt wurden. Dieser Patient gewann stetig die Funktion seiner linken Hand zurück, so konnte er wieder Motorrad fahren und Gitarre spielen.
  • Der letzte Patient hatte einen Anfall von akuter linker Hemiplegie, die der chronischen progressiven MS überlagert war. Er hatte alle 2 bis 3 Tage vier intrathekale Injektionen von 50 mg pMBP86-95. Der anti-MBP wurde vor und 30 Minuten nach jeder Injektion (11d: it#1, it#2, it#3, it#4) und 10 Tage nach der ersten Injektion gemessen. Der anfangs erhöhte F anti-MBP wurde innerhalb von 7 Tagen nicht nachweisbar, wenn der Patient klinisch und biochemisch zu seinem anfänglichen chronischen progressiven Zustand zurückkehrte, und bald danach erhielt er intravenös 400 mg pMBP86-95. Dieses unterdrückte das Niveau seines gebundenen Antikörpers für 4 Monate nach der i. v.-Injektion. Jedoch war nach seiner letzten Lumbalpunktion bei 8.5 Monaten nach der intravenösen Injektion die Erkrankung sowohl klinisch als auch biochemisch zum chronischen progressiven Schema zurückgekehrt.
  • BEISPIEL 5 (Referenzbeispiel)
  • Häufigkeit und Dauer der Verabreichung bei Patienten mit polysymptomatischen Rückfällen
  • Die gleichen MBP-Peptide wurden dann in Patienten mit poylsymptomatischen Anfällen, welche mehrere Bereiche des ZNS betreffen, injiziert. Diese Gruppe bestand aus drei Patienten: eine mit rezidivierend-nachlassender und zwei mit rezidivierend-progressiver Erkrankung.
  • Der erste Patient hatte eine schwere poysymptomatische Verschlimmerung. Während der ersten Woche des Rückfalls erhielt er drei Injektionen von 50 mg pMBP86-95 an den Tagen 1, 3 und 7 (12: it#1, it#2 und it#3). Der anti-MBP wurde vor jeder Injektion und 30 Minuten später gemessen. Nach dem Erhalten dieser drei Injektionen wurde der F anti-MBP auf fast nicht nachweisbare Niveaus gedrückt. Wenn ein Monat später gemessen wurde, stieg der F anti-MBP an und bei 1.5 Monaten war der Rückfall wieder einmal klinisch aktiv und wurde biochemisch bestätigt. Zu dieser Zeit erhielt der Patient einen zweiten Durchlauf mit den vier intrathekalen Injektionen von 50 mg pMBP86-95 an den Tagen 45, 48, 49 und 50 des Rückfalls (it#4, it#5, it#6 und it#7). Der anti-MBP wurde vor und 30 Minuten nach jeder Injektion und noch dreimal in den nachfolgenden zwei Monaten gemessen. Wieder einmal wurde der F anti-MBP für mindestens zwei Wochen gedrückt, aber der Patient hatte wieder einen Rückfall, und zu dieser Zeit war sein F-Antikörper-Niveau zu dem Anfangsniveau vor dem Rückfall zurückgekehrt. Eindeutig wird eine länger andauernde intrathekale Verabreichung des synthetischen Peptids benötigt, um die geringen/nicht nachweisbaren Niveaus des F anti-MBP für längere Zeiträume aufrechtzuerhalten.
  • Der zweite Patient hatte eine rezidivierend-progressive MS (13). Zunächst erhielt er in der progressiven Form (F = B) intravenös 500 mg pMBP86-95 (IV#1). Obwohl sowohl die F- als auch die B-Antikörper-Niveaus nach einem Monat etwas verringert waren, erfuhr der Patient 9 Wochen nach der I. V.-Injektion einen polysymptomatischen klinischen Rückfall, der mit einem stark erhöhten F anti-MBP- Niveau assoziiert war. Zu dieser Zeit erhielt er drei intrathekale Injektionen von 50 mg pMBP86-95 (it#1, it#2 und it#3) an den Tagen 1, 3 und 12 des Rückfalls, und der anti-MBP wurde vor, 30 Minuten und 24 Stunden nach der ersten und dritten Injektion gemessen. Wenn einen Monat später untersucht wurde, war der Patient zu seinem anfänglichen klinischen und biochemischen Zustand der progressiven spastischen Paraparese zurückgekehrt, wenn er innerhalb von 2 Wochen eine zweite intravenöse Injektion von 500 mg pMBP86-95 (IV#2) erhielt. Bis heute blieben die Niveaus des F und B anti-MBP der CSF, welche reihenweise die nächsten 26 Monate überwacht werden, unterdrückt, wenn sie mit den Basislinien-Niveaus verglichen wurden. Seine Fähigkeit, zu stehen und zu gehen, verbesserte sich wesentlich.
  • Der letzte Patient in dieser Gruppe mit MS erhielt zunächst in der progressiven Phase (F = B) (14) intravenös 500 mg pMBP86-95 (IV#1). Der anti-MBP der CSF wurde nach 9 Tagen, dann 2 Monate monatlich und 4.5 Monate nach IV#1 gemessen. Nach dieser Injektion wurden die F und B anti-MBP-Niveaus für 2 Monate unterdrückt; 4.5 Monate nach IV#1 beklagte sich der Patient über ansteigende Schwäche, welche klinisch sowie biochemisch durch erhöhte Antikörperniveaus, die mit chronischer progressiver Erkrankung vereinbar sind, bestätigt wurde. Innerhalb des nächsten Monats erhielt er eine zweite intravenöse Injektion von 500 mg pMBP82-98 (IV#2). Die CSF-Analyse der Probe, die unmittelbar vor der zweiten Injektion genommen wurde, deutete ein akutes Rückfallschema (F > B) an, und am nächsten Tag entwickelte der Patient wegen einer linksseitigen lateralen Rektusparese eine akute Diplopie. Zu dieser Zeit erfuhr er eindeutig einen klinischen und biochemischen akuten Rückfall, welcher über die nächsten 4.5 Monate andauerte und durch schwere Gleichgewichtsstörung der Haltung und der Gangart, Schwäche seiner Beine und Doppelsicht charakterisiert war. In einem Bestreben, seinen erhöhten F anti-MBP zu verringern, erhielt dieser Patient intrathekal zwei Durchläufe von pMBP82-98. Während des ersten Durchlaufs, der 4.5 Monate von dem Beginn des Rückfalls eingeleitet wurde, erhielt er 5 Tage täglich 50 mg pMBP82-98 (it#1, it#2, it#3, it#4 und it#5), und die anti-MBP-Niveaus, die vor und 30 Minuten nach jeder Injektion gemessen wurden, blieben in vernünftigem Ausmaß erhöht. Da der Rückfall andauerte und körperlich schwer behinderte, wurde entschieden, einen zweiten Durchlauf einer höheren Dosierung des Peptids und mit einer höheren Häufigkeit weiter zu verabreichen, und der Patient erhielt zwei Tage (Tag 19 und 20: it#6, it#7, it#8 und it#9) zweimal täglich 100 mg pMBP82-98. Der anti-MBP wurde vor und 30 Minuten nach jeder Injektion gemessen. Im Anschluss an diese erhöhte Dosierung und Häufigkeit wurde der F anti-MBP auf vernachlässigbare Niveaus unterdrückt, und als eine Woche später (Tag 28) getestet wurde, war sein CSF-Profil mit langsam fortschreitender Erkrankung (F/B anti-MBP = 1.0) vereinbar. Zu dieser Zeit erhielt der Patient eine dritte intravenöse Injektion von 500 mg pMBP 82-98 (IV#3), welche nicht weiter die anti-MBP-Produktion herunterregulierte.
  • BEISPIEL 6 (Referenzbeispiel)
  • Intravenöse Verabreichung der MBP-Peptide in einem Bestreben, künftige Rückfälle zu vermeiden
  • In zwei Patienten mit rezidivierend-progressiver MS, die häufige Rückfälle hatten, wurden entweder pMBP86-95 oder pMBP82-98 intravenös injiziert, um zu bestimmen, ob dieser Verabreichungsweg weitere Anfälle vermeiden wird.
  • Der erste Patient erfuhr 4 Jahre 2 bis 3 Rückfälle pro Jahr mit resultierendem stufenweisem Fortschreiten der spastischen Paraparese (15). Sie erhielt im Abstand von 6 Monaten zwei intravenöse Injektionen, eine von 400 mg pMBP86-95 (IV#1) und die zweite von 400 mg pMBP82-98 (IV#2); die klinische Überwachung und die CSF-Analyse wurden monatlich durchgeführt. 15 zeigt die anti-MBP-Niveaus über einen Zeitraum von 9 Monaten (oberer eingerahmter Bereich). Die erste intravenöse Injektion regulierte etwa 2 Monate die anti-MBP-Synthese herunter. Während des dritten Monats nach der Injektion erfuhr diese Patientin einen klinischen Rückfall; leider wurde die CSF zu dieser Zeit nicht erhalten. Während der nachfolgenden 2 bis 3 Monate, nachdem der Rückfall ergab, dass die Krankheit wieder in die chronische progressive Phase eintrat, erhielt dieser Patient die zweite intravenöse Injektion (IV#2). Die anti-MBP-Niveaus der CSF wurden wieder 2 Monate unterdrückt, aber drei Monate nach der zweiten Injektion hatte der Patient noch einen Rückfall, der mit merklich erhöhtem F anti-MBP assoziiert war. Ähnlich zu der Rückfallhäufigkeit, die sie in den vorherigen 4 Jahren hatte, erlitt diese Patientin trotz des Erhalts von zwei intravenösen Injektionen von pMBP86-95 und pMBP82-98 weiterhin 2 bis 3 Rückfälle pro Jahr.
  • Ein zweiter Patient (16), der in den vorherigen 10 Jahren 1 bis 4 akute Rückfälle pro Jahr erfahren hatte (obere Skala), wurde ernsthaft behindert, paraplegisch und auf einen Rollstuhl eingeschränkt. Während des 11. Jahrs erfuhr der Patient wieder vier Rückfälle (oberer gerahmter Bereich), obwohl der intrathekal und intravenös die synthetischen MBP-Peptide erhielt. Während des ersten Rückfalls nach zwei intrathekalen Injektionen von 50 mg pMBP86-95 an Tag 1 und Tag 6 (it#1, it#2) wurde ihr F anti-MBP-Niveau wesentlich verringert; an Tag 6 erhielt sie auch intravenös 300 mg pMBP86-95 (IV), welches nachfolgend die nächsten 3 Monate sowohl den F- als auch den B-Antikörper unterdrückte. Vier Monate nach der intravenösen Injektion erfuhr dieser Patient noch einen klinischen Rückfall, welcher fortfuhr, sich mit der Zeit zu verschlimmern: Die Antikörperniveaus der CSF waren stark erhöht, und 6.5 Monate nach den IV-Injektionen erhielt der Patient einen Durchlauf von vier täglichen Injektionen von 50 mg pMBP82-98 (it#3, it#3, it#5 und it#6), welche die F-Antikörper-Niveaus nicht unterdrücken und den klinischen Rückfall nicht beheben konnten.
  • BEISPIEL 7 (Referenzbeispiel)
  • Vergleich von unterschiedlichen Verabreichungswegen des Peptids
  • Bei Anfangsstudien wurden synthetische MBP-Peptide an acht chronische progressive MS-Patienten verabreicht. Die Patienten erhielten intrathekal entweder ein MBP-bindendes Peptid MBP(75-95) oder ein nicht-bindendes Kontrollpeptid MBP(35-58) in steigenden Dosierungen von 1 bis 10 mg in 5 ml Salzlösung; die vier Patienten, die zunächst das nicht-bindende Kontrollpeptid (MBP35-58) erhielten, erhielten später das bindende MBP(75-95)-Peptid.
  • Die Injektion von MBP(75-95) in die CSF führte zu vorübergehender Neutralisation der F MBP spezifischen Antikörper; die gebundenen MBP-Autoantikörper wurden nicht beeinflusst. Die Wirkungsdauer dauerte 1 Stunde (1 mg Peptid), 24 Stunden (2.5 mg Peptid) oder 7 Tage (5–10 mg Peptid). Da die Wirkung der intrathekalen Peptidverabreichung unvollständig (der B anti-MBP blieb erhöht) und relativ kurzlebig war, wurde dieser Verabreichungsweg mit der intravenösen Injektion verglichen. Im Gegensatz zur intrathekalen Verabreichung wurden sowohl die freien als auch die gebundenen MBP-Autoantikörper einen Monat nach einer einzelnen intravenösen Injektion von 500 mg MBP(75-95) nicht nachweisbar und blieben drei Monate und nach einer Booster-Injektion bis zu 26 Monate bei niedrigen Niveaus (17). Ähnliche Beobachtungen wurden bis dato bei ungefähr 70 Patienten mit chronischer progressiver MS gemacht, denen intravenös ein MBP-bindendes Peptid wie MBP75-95, MBP86-95, MBP82-98 injiziert wurde. Eine Dosis von 500 mg (5 mg/kg Körpergewicht) in 10–50 ml normaler Salzlösung wurde wegen des größeren Blutvolumens versus CSF (Faktor 15) und der schnellen Clearance der Peptide aus dem Blutstrom durch die Niere gewählt; die Peptiddosierungen, welche jenen entsprechen, die intravenös gegeben wurden, wurden nicht intrathekal verabreicht, weil solche Volumina nicht in die CSF injiziert werden konnten. Zusammenfassend gesagt führte die intrathekale Verabreichung in dem in diesen Patienten getesteten Dosierungsbereich zu einem vorübergehenden „Wegwischen" nur des F anti-MBP, im Gegensatz zu(r) intravenösen Injektion(en), welche die anti-MBP-Synthese herunterregulierte(n), bedingte eine einzelne intravenöse Injektion eine langanhaltende Toleranz.
  • BEISPIEL 8 (Referenzbeispiel)
  • Dauer der Toleranz nach intravenöser Verabreichung des MBP-Peptids
  • Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde die Kinetik der Verträglichkeit zu MBP bis dato bei ungefähr 70 Patienten mit chronisch-progressiver MS untersucht, die über zwei Jahre nach mehreren intravenösen Injektionen von MBP(75-95), MBP(86-95) oder MBP(82-98) beobachtet wurden. Die Peptide wurden auf 5–6 mg/kg Körpergewicht dosiert (256–500 mg) und intravenös in 10–50 ml Salzlösung injiziert. Vor der intravenösen Peptidverabreichung hatten alle 13 Patienten hohe Niveaus von freien und gebundenen MBP-Antikörpern in der CSF (18, Tabelle 3). Ein Monat nach der Peptidverabreichung wurden die MBP spezifischen Antikörper im Wesentlichen nicht nachweisbar und blieben im Allgemeinen 3–4 Monate auf niedrigen Niveaus; zu dieser Zeit begannen die Antikörper-Niveaus wieder anzusteigen; einige kehrten über 8 Monate zu ihren Anfangsniveaus zurück. Sechs bis zehn Monate nach IV#1 erhielten alle Patienten eine Booster-Injektion (IV#2) von 275–500 mg (5–6 mg/kg Körpergewicht) von MBP(82-98) in 10 ml Salzlösung (IV#2). Das für die zweite Injektion gewählte längere Peptid war löslicher und konnte in einem kleineren Volumen gelöst und verabreicht werden. In dieser Gruppe als Ganzes nahmen die anti-MBP-Niveaus der CSF innerhalb 6 Wochen bis 2 Monate von der Injektion drastisch ab und blieben längere Zeit (bis zu 26 Monaten) nicht nachweisbar. Von der gesamten Gruppe von ungefähr 70 Patienten konnte einer die Studie wegen eines Lungenembolus und anschließender gerinnungshemmender Therapie, die weitere Lumbalpunktionen verhinderte, nicht abschließen, und ein anderer wurde von der Nachfolge ausgeschlossen, weil er intravenöse Kortikosteroide von hoher Dosis erhielt. Einzeln betrachtet hatten von den ungefähr 70 Patienten etwa 63 18–26 Monate nach der Booster-Injektion nicht nachweisbare Anti-MBP-Niveaus.
  • BEISPIEL 9
  • Langanhaltende Toleranz bei Patienten mit dem HLA-DR2-Haplotyp
  • Die HLA-DR-Haplotypen der MS-Patienten wurden durch molekulare Typisierung der genomischen DNA bestimmt (Tabelle 3). Vier von elf Patienten, welche die Studie abschlossen, trugen diese Krankheit, die mit dem DR2-Haplotyp (DRB1*1501 oder DRB1*15021) assoziiert ist; alle diese Patienten hatten ein Jahr nach der zweiten intravenösen MBP-Peptid-Injektion niedrige oder nicht nachweisbare Autoantikörper-Niveaus. Das MBP-Peptid bindet mit hoher Affinität an HLA-DR2 und ist immundominant für HLA-DR2 begrenzte, MBP spezifische T-Zellen. HLA-DR4 (DRB*0401) und HLA-DR7 (DRB1*0701) binden das MBP-Peptid, das verabreicht wurde; Bindungsstudien wurden für die DR-Moleküle, die von dem Patienten k(M) getragen werden (DRB1*0407, DRB1*0801) nicht ausgeführt. Das MBP-Peptid wird nicht von HLA-DR3 (DRB1*03011) gebunden; zwei Patienten, die am Ende der Studie erhöhten anti-MBP hatten, trugen den DRB1*03011-Haplotyp (Tabelle 3). Diese Daten zeigen, dass die Toleranzdauer gegenüber MBP von dem HLA-DR-Haplotyp eines Patienten abhängt. Die Toleranz kann langlebiger sein, wenn sowohl MBP spezifische T-Zellen als auch B-Zellen toleriert werden. TABELLE 3 HLA-DR-Haplotypen der MS-Patienten A. Niedrige Niveaus des gesamten anti-MBP 1 Jahr nach IV#2
    Patient HLA-DR-Haplotypen Gesamter anti-MBP (Ru)
    b(F) DRB1*1501 4.1
    e(F) DRB1*1501 DRB1*1303 2.5
    m(M) DRB1*1501 DRB1*0101 3.9
    l(F) DRB1*15021 DRB1*0403 3.9
    a(M) DRB1*1401 DRB1*0701 4.1
    f(F) DRB1*0701 2.4
    k(M) DRB1*0407 DRB1*0801 4.5
    B. Erhöhte Niveaus des gesamten anti-MBP 1 Jahr nach IV#2
    Patient HLA-DR-Haplotypen Gesamter anti-MBP (Ru)
    j(M) DRB1*03011 7.3
    h(F) DRB1*0101 DRB1*0701 9.7
    g(F) DRB1*0101 DRB1*1101 19.1
    l(M) DRB1*0403 DRB1*03011 19.0
    • Gesamter anti-MBP: freier anti-MBP + gebundener anti-MBP
  • Die HLA-DR-Haplotypen von 11 Patienten, die 1 Jahr Nachfolge von der zweiten intravenösen Peptidinjektion (IV#2) abschlossen. Alle vier Patienten mit dem HLA-DR2-Haplotyp (DRB1*1501 oder DRB1*15021) hatten ein Jahr nach IV#2 niedrige Autoantikörper-Niveaus.
  • BEISPIEL 10 (Referenzbeispiel)
  • Subkutane Peptidverabreichung bedingt nicht die Toleranz
  • Der optimale Weg der Peptidverabreichung wurde weiter durch (eine) subkutane Injektion(en) von MBP(82-98) in Salzlösung in einer Gruppe von 33 MS-Patienten erforscht. Bei 26 MS-Patienten beeinflussten steigende Mengen (1 bis 100 mg) einer einzelnen subkutanen Injektion von MBP(82-98) nicht die Niveaus der CSF-Autoantikörper gegen MBP (Daten nicht gezeigt); acht dieser Patienten erhielten anschließend eine intravenöse Peptidinjektion und innerhalb von zwei Monaten wurden die Antikörper-Niveaus der CSF nicht nachweisbar (Tabelle 4A). Bei fünf anderen Patienten führte eine Gesamtdosis von 900–1000 mg (5 × 100 mg, täglich für fünf aufeinanderfolgende Tage, gefolgt durch noch eine subkutane Injektion von 400 oder 500 mg) nur zu einer zurückhaltenden Abnahme der MBP-Antikörper-Niveaus in der CSF (Tabelle 4B). Um zu untersuchen, ob ein unterschiedliches Verabreichungsschema effektiver sein würde, erhielten zwei Patienten im Abstand von einem Monat zwei subkutane Injektionen von 250 mg von MBP(82-98) (Tabelle 4C). Wieder wurden die Autoantikörper-Niveaus nicht beeinflusst. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass nur die intravenöse Verabreichung des MBP-Peptids eine langandauernde Toleranz gegenüber MBP bei den in dieser Studie getesteten Peptiddosierungen bedingt. TABELLE 4 A
    Patient ID (Geschlecht) MBP(82-98) SC mg Basislinie 6–7 Wochen Verstrichene Zeit (Monate) Basislinie MBP(82-98) IV#1 mg 2 Monate 4 Monate
    f b f b f b f b f b
    E(W) 5 9.1 11.2 10.2 10.4 6 9.3 9.8 400 1.0 1.1 1.4 1.0
    K(W) 7 2.1 3.4 3.1 5.9 6.5 6.3 6.7 500 1.5 0.8
    N(W) 10 8.1 8.0 7.1 8.1 8 6.6 5.6 500 3.0 3.0°
    Q(W) 40 9.9 10.1 10.9 8.3 6 10.0 9.3 400 1.5 1.6 2.1 2.1
    R(M) 50 10.2 10.3 11.1 7.4 6 7.5 9.9 500 1.5 1.6 1.5 1.7
    S(W) 60 4.1 4.3 6.1 5.4 6.5 7.4 7.4 500 1.8 0.9
    X(M) 100 9.9 7.3 9.5 8.2 4.5 9.7 9.0 500 14 1.0 1.5 1.1
    Z(M) 100 9.9 8.4 10.9 10.1 4.5 10.5 9.7 500 2.0 1.9 1.5 1.6
    MITTELWERT 7.9 7.9 8.6 8.0 8.4 8.4 1.7 1.5 1.6 1.5
    SA 2.9 2.6 2.7 1.7 1.5 1.5 0.6 0.7 0.3 0.4
    B
    Patient ID (Geschlecht) MBP(82-98) SC mg Basislinie 6–7 Wochen Verstrichene Zeit (Monate) MBP(82- 98) SC mg 7 Wochen
    f b f b f b
    AA(W) 100/d × 5 7.7 8.1 4.4 4.9 0.5 400 4.3 3.4
    BB(W) 100/d × 5 5.4 5.4 3.5 3.7 0.5 500 2.0 2.5
    CC(M) 100/d × 5 5.9 5.4 5.9 8.8 - -
    DD(W) 100/d × 5 4.6 4.8 2.7 1.9 0.5 500 3.0 2.8
    EE(W) 100/d × 5 7.4 8.9 3.7 3.9 0.5 400 2.6 2.4
    MITTELWERT 6.2 6.5 4.2 4.6 3.0 2.9
    SA 1.2 1.7 1.4 2.3 0.8 0.7
    C
    Patient ID (Geschlecht) MBP (2298) SC mg Basislinie 15 Wochen
    f b f b
    GG(M) 250/m × 2 8.4 8.7 7.1 8.3
    FF(W) 250/m × 2 4.8 5.3 5.4 4.2
    • A. Acht Patienten erhielten eine einzelne subkutane Injektion von MBP(82-98) (5–100 mg in 1–5 ml Salzlösung), welche keine Wirkung auf die MBP-Autoantikörper-Niveaus hatte. Dagegen führte eine einzelne intravenöse Injektion (400–500 mg) des gleichen Peptids, das 4.5 bis 8 Monate später verabreicht wurde, zu nicht nachweisbaren Autoantikörper-Niveaus der CSF.
    • B. Wiederholte subkutane Injektionen von MBP(82-98) von hoher Dosis (100 mg/Tag für fünf aufeinander folgende Tage) hatten eine zurückhaltende Wirkung auf die anti-MBP-Niveaus der CSF; eine zusätzliche hohe Dosis (400 bis 500 mg) von MBP(82-98), die subkutan zwei Wochen nach der ersten Reihe von Injektionen verabreicht wurde, verringerte die Autoantikörper-Niveaus nicht weiter.
    • C. Zwei subkutane Injektionen von MBP(82-98) hoher Dosis (2 × 250 mg, ein Monatsabstand) hatte keine Wirkung auf die MBP-Autoantikörper in der CSF. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass nur der intravenöse Verabreichungsweg zur Erzeugung der Toleranz gegenüber MBP wirksam ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00440001

Claims (3)

  1. Verfahren zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit der Behandlung eines multiple Sklerose-Patienten mit einem Peptid der Formel:
    Figure 00450001
    umfassend das in vitro-Durchmustern des multiple Sklerose-Patienten auf die Anwesenheit von menschlichem Leukocytenantigen des (HLA)-DR2-Haplotyps, wobei die Anwesenheit des HLA-DR2-Haplotyps prädiktiv für die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung mit dem Peptid ist.
  2. Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei der HLA-DR2-Haplotyp DRB1*1501 oder DRB1*15021 umfasst.
  3. Verfahren wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert, wobei der Patient chronisch progressive multiple Sklerose hat.
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