CZ299535B6 - Peptidový fragment myelinového bazického proteinua jeho použití v lécbe sklerózy multiplex - Google Patents

Abstract

Lidský myelinový bazický protein (h-MBP) má molekulární váhu 18,5 KD a obsahuje 170 aminokyselinových zbytku. Byly vyrobeny syntetické peptidy o délce v rozmezí asi od 8 do 25 zbytku a pokrývající celou délku proteinu. Ukázalo se, že protilátky h-MBP (anti-MBP) mohou být neutralizovány syntetickýmipeptidy, in vitro, které se shodují s h-MBP asi od aminokyselinového zbytku 61 do aminokyselinovéhozbytku 106. Peptidy, které se shodují s aminovým koncem (asi zbytky 1 až 63) a karboxylovým koncem (asi zbytky 117 až 162) h-MBP neumožnují neutralizaci precištené anti-MBP. Intratekální podávání peptidu MBP(82-98) zpusobuje úplnou vazebnou neutralizaci volných (F) anti-MBP, pricemž nemení hladiny vázaných (B). Kontrolní peptid nemel žádný úcinek na hladiny (F) nebo (B) anti-MBP. Intravenózní podávání MBP(82-98) zpusobuje podstatný pokles úrovní(F) a (B) anti-MBP v mozkomíšním moku. Podávání syntetických peptidu MBP pacientum se sklerózou multiplex bud intratekálne, nebo intravenózne nemelo žádné nepríznivé neurologické úcinky a nebyly pozorovány systémové komplikace. Jako epitop (vazebné místo) MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex byla urcena oblast mezi Pro86 a Pro95.

Description

Peptidový fragment myelinového bazického proteinu a jeho použití v léčbě sklerózy multiplex

Oblast techniky

Vynález se týká vybraného polypeptidů a jeho použití v regulaci imunitní reakce protilátek lidského myelinového bazického proteinu. Vynález se také týká způsobu použití tohoto peptidu v léčbě sklerózy multiplex.

Dosavadní stav techniky

Skleróza multiplex je onemocnění, které se projevuje roztroušenou demyelinizací lidské centrální nervové soustavy (CNS) související se zánětem. Charakteristickým znakem sklerózy multiplex je zvýšení syntézy IgG ve vnitřní hematoencefalické bariéře (intra-blood-brain barrier (intra BBB)). (Tortelotte, W. W., J. Neurol. Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. a Tibbing, G., Scand J Clin Lab Invest 37: 397^101, 1977; Tourtelotte, W. W. a Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J. M. Tourtelotte, W. W., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. a Tourtellote, W. W., eds.

Multiple sclerosis. Baltimore. Wiliams & Wilkins, 1982: 275-358; a Warren, K. G., a Catz, I. Ann Neurol 17: 475-480, 1985).

Syntéza IgG ve vnitřní hematoencefalické bariéře (BBB) je u klinicky pozorovaných pacientů (Schumecher, G. A., Beebe, G., Kibler R. E. a kol., Ann NY Acad Sci 15 : 266- 272, 1965) s aktivní nebo neaktivní sklerózou multiplex většinou zvýšená. Určení množství IgG CNS je neznámé. Zatímco malá část má protivirový účinek nebo působí proti mozkovým antigenům, antigenům nukleových kyselin, erytrocytů nebo antigenům hladkého svalstva, neurčitá část může způsobovat polyklonální aktivaci B-buněk (Tourtelotte, W. W., a Ma, B., Neurology 28 : 76 83, 1978). Během posledních deseti let se soustřeďoval značný zájem na výzkum protilátek k určitým myelinovým proteinům.

Poté, co byly v oběhu detekovány imunitní komplexy obsahující myelinový bazický protein (MBP) jako svou antigenní složku (Dasgupta, Μ. K., Catz, I, Warren, K. G. a kol., Can J Neurol Sci 10 : 239 - 243, 1983), byly pozorovány zvýšené titry protilátek kmyelinovému bazickému proteinu (anti-MBP) v mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid (CSF)) u pacientů s aktivní formou sklerózy multiplex (Waren, K. G. a Catz, I., Ann Neurol 209 : 20 - 25, 1986). Klinicky je skleróza multiplex charakterizována ve dvou fázích. Fáze aktivního onemocnění, například akutní recidivy nebo chronický vývoj a fáze klinické remise. Aktivní skleróza multiplex souvisí se zvýšenými hodnotami intratekálně tvořených protilátek myelinového bazického proteinu (anti-MBP) (Waren, K. G., a Catz, I., Ann Neurol 209: 20 - 25, 1986; a Catz, I. a Warren, K. G., Can J Neurol Sci 13 : 21 - 24, 1986). Tyto protilátky se nacházejí převážně ve volné formě (free form (F)) v průběhu akutní recidivy a převážně ve vázané formě (bound form (B)), když se nemoc vyvíjí skrytě. (Warren, K. G., a Catz, I., ann Neurol 209: 20 - 25, 1986). V průběhu akutní recidivy odpovídají titry protilátek myelinového bazického proteinu (anti-MBP) v mozkomíšním moku aktivitě onemocnění (Warren, K. G., a Catz, I., Ann Neurol 21: 183 - 187, 1987). Hodnoty protilátek myelinového bazického proteinu (anti-MBP) byly také zvýšené u pacientů s prvním projevem zánětu očního nervu a u většiny pacientů trpících prvními projevy sklerózy multiplex. (Waren, K. G., a Catz, I., a Bauer, C., Ann Neurol 23 : 297 - 299, 1988; Warren, K. G., a Catz, 1., J Neurol Sci 91 : 143- 151, 1989).

Průběžné kinetické studie hodnot anti-MBP v mozkomíšním moku pacientů, u kterých nastala fáze uzdravování po akutní recidivě, ukázaly postupný pokles titrů F anti-MBP v mozkomíšním moku úměrně k nárůstu v B frakcích (Warren, K. G., a Catz, I., J Neurol Sci 91 : 143-151, 1989; Warren, K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 88 : 185 - 194, 1988). Ve fázi remise mohou hod55 noty anti-MBP v mozkomíšním moku klesnout pod měřitelnou mez, díky neutralizaci související

-1 CZ 299535 B6 s neaktivní fází sklerózy multiplex (Warren, K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 88 : 185 - 194, 1988). Naproti tomu, chronický vývoj sklerózy multiplex charakterizovaný trváním zvýšené hladiny anti-MBP po dlouhou dobu, souvisel s inhibici neutralizace anti-MBP (Warren, K. G., a Catz, I.,

J. Neurol Sci 88 : 185- 194, 1988). Novým poznatkem je, že kaskáda protilátky myelinového bazického proteinu, určená ve frakci IgG získané přečištěním mozkomíšního moku pacientů se sklerózou multiplex, obsahuje anti-MBP, protilátky, které neutralizují anti-MBP a protilátky, které inhibují neutralizaci anti-MBP (Warren, K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 96 :19 - 27, 1990).

Předchozí výzkum ukázal, že s pohledu autoimunity B-buněk existují nejméně dvě různé formy sklerózy multiplex, přičemž většina pacientů má vlastní protilátky myelinového bazického proteinu (anti-MBP) a menší skupina má protilátky proteolipidového proteinu (anti-PLP) (Warren,

K. G., a kol., Ann Neurol 35, 280 - 289, 1994). U sklerózy multiplex související s anti-MBP jsou akutní recidivy spojeny se zvýšením (více než 1) poměru volné/vázané anti-MBP, zatímco vývoj chronické fáze je charakterizován poměrem volné/vázané anti-MBP stejným nebo menším než 1 a pacienti ve fázi remise mají mírně zvýšené titry B anti-MBP (Warren, K. G., a Catz, L, J. Neurol Sci 8 : 185- 194, 1989).

Ukázalo se, že množení T-buněk u pacientů se sklerózou multiplex je namířeno proti MBP (Allegretta a kol., Science, 247, 718-721, 1990) a lidské T-buňky mohou tedy rozpoznat četné epitopy na molekule. (Richert a kol., J. Neuroimmun 23, 55 - 66, 1989). Ukazuje se také, že MBP je schopen aktivovat některé T-buňky bez účasti antigenů přítomných buněk. (Altman a kol., Eur. J. Immun. 17, 1635 - 1640, 1987). Je tomu tak pravděpodobně proto, že malé peptidy MBP mohou být rozpoznány T-buňkami bez požadavku vnitrobuněčného zpracování, jednoduše díky jejich schopnosti vázat třídu II hlavních histokompatibilních činidel na povrch přítomných buněk.

Vzhledem k tomu, že experimentální alergická encefalomyelitida (EAE), přijatelný zvířecí model sklerózy multiplex, může být vyvolána naočkováním vnímavých hlodavců buď MBP, nebo PLP spolu s Freundovým kompletním přídavkem, může mít proces demyelinizace při skleróze multi30 plex autoimunitní mechanismus (Fritz, R. B. a kol., J. Immunol. 130, 1024 - 1026, 1983; Trotter, J. L. a kol., J. Neurol. Sci. 79, 173 - 188, 1987). Z hlediska vlastních protilátek B-buněk byl epitop MBP, který byl cílem vývoje nemoci, lokalizován přibližně v tri-Prolil sekvenci (zbytky 99-100-101-) oblasti mezi zbytky 80 a 100 (Warren, K. G. a kol., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994). Tyto epitopy B buněk překrývají imunodominantní epitopy T buněk reagující s MBP, které se nalézají v lézích mozku postiženém sklerózou multiplex (Oksenberg, J. R. a kol., Nátuře, 362, 68-70, 1993).

Předcházející studie ukázaly, že anti-MBP je neutralizována pomocí MBP. Avšak předchozí pokusy léčit sklerózu multiplex intramuskulámím nebo subkutaneálním podáváním heterologní40 ho MBP nebyly úspěšné (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. a Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. a Demonty, L., J. Neurol. 216: 27-31, 1977; a Romine, J. S. a Salk, J., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. a Tourtelotte, W. W.,1 ads. Multiple sclerosis, Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Při použití přírodního MBP nastávají dva problémy. Za prvé, protein je připraven ze vzorků lidského mozku a je zde tedy možné nebezpečí, že ve vzorku mohou být přítomny latentní neuroviry. Za druhé, ačkoli rozpustný MBP není obvykle imunogenem, je možné, že při podávání jednotlivcům s rozdílným imunitním systémem, může rozpustný MBP reagovat jako antigen a způsobit tvorbu protilátek proti MBP.

Podstata vynálezu

Vynález stanovuje, zda přečištěná anti-MBP z mozkomíšního moku pacientů se sklerózou multiplex může být neutralizována určitými rozpustnými peptidy lidského MBP (h-MBP). Za tímto účelem byly použity rozpustné syntetické peptidy pokrývající celou délku h-MBP, aby bylo určeno možné rozmezí epitopů na h-MBP, který neutralizuje anti-MBP získané z těchto pacien-2CZ 299535 B6 tů. To je důvod, proč mohou být určité rozpustné peptidy, které jsou schopny neutralizovat antiMBP, použity k léčbě sklerózy multiplex s větší účinností, než celá molekula. Tyto rozpustné peptidy jsou synteticky vyráběny, a proto zde není žádné nebezpečí ohrožení neuroviry. Navíc, díky jejich malým rozměrům, nemohou tyto peptidy reagovat jako imunogen. Použití určitých peptidů v léčbě sklerózy multiplex může předejít problémům, které souvisí s použitím přírodního proteinu. Dále byly peptidy podle vynálezu zkoumány pro určení jejich účinnosti ve vazbě nebo modulaci protilátek sklerózy multiplex in vivo.

Vynález se týká peptidů ajejích solí, jejichž sekvence aminokyselin je významně homologní se sekvencí aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu. Tyto peptidy jsou schopny neutralizovat nebo zmírnit tvorbu anti-MBP a mohou být popsány obecným vzorcem:

Ri-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂ kde Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, hydroxy skupiny, zbytku aminokyseliny a zbytku polypeptidu; za předpokladu, že R) a R₂ nejsou oba zároveň vodík nebo hydroxyl skupina. V peptidu mohou být provedeny substituce, delece nebo adice, za předpokladu, že peptid si zachová svoji funkci neutralizace nebo zmírnění tvorby anti-MBP.

Vynález se dále týká použití peptidu pro léčby sklerózy multiplex, který zahrnuje podávání účinného množství peptidu jako aktivní složky, jak bylo uvedeno výše, buď samotného, nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem pro účinnou neutralizaci nebo zmírnění tvorby protilátek lidského myelinového bazického proteinu.

Vynález se týká peptidu, jehož sekvence aminokyselin je významně homologní se sekvencí aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu. Termínem „významně homologní“ je míněno, že rozdíl mezi sekvencí aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu a peptidů může existovat za předpokladu, že peptidy, s rozdílnou sekvencí aminokyselin, stále plní svoji funkci, tj. snižují tvorbu protilátek lidského myelinového bazického proteinu (anti-MBP).

Odborníkům v dané oblasti je z vynálezu zřejmé, jak empiricky určit, jaké změny mohou být provedeny v sekvenci vybraných peptidů bez účinku na jejich funkci.

Na základě další práce vztahující se k vynálezu, pomocí srovnávacích testů inhibice s využitím série 41 dekapeptidů, byl epitop MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex upřesněn a lokalizován do oblasti mezi aminokyselinu 86 a aminokyselinu 95. Na základě nejvyšší hladiny inhibice, (95% a více) B-anti MBP, je epitop MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex mezi aminokyselinou 86 a aminokyselinou 95. Nejkratší společná oblast účinných dekapeptidů je od aminokyseliny 87 do aminokyseliny 95.

Usek 7 aminokyselin ležících na pozicích 87 až 93 nebude pravděpodobně dost velký pro účinné navázán anti-MBP. Proto nemohou být Rj a R₂ oba zároveň vodík nebo hydroxy skupina.

Když Ri nebo R₂ je aminokyselina, může být aminokyselina vybrána z přírodních aminokyselin. Ri nebo R₂ nejsou omezeny na aminokyseliny vyskytující se před nebo za Val87 a Ue93 v lidském myelinovém bazickém proteinu, což je znázorněno v SEQ ID NO: 1. Mohou být použity různé změny zahrnující substituce, adice nebo delece v sekvencích před a za R, a R₂. Dále mohou být změny zahrnující substituce, adice nebo delece provedeny na sekvenci -Val-HisPhe-Phe-Lys-Asn-Ile za předpokladu, že peptidy mají stále svoji zamýšlenou funkci; tj. neutralizovat nebo zmírnit tvorbu protilátek myelinového bazického proteinu.

Pojem „zbytek polypeptidu“ znamená různě velké polypeptidy zahrnující proteiny nebo jejich části. Jak bylo uvedeno výše, když R, nebo R₂ je zbytek polypeptidu, nejsou Ri nebo R₂ omezeny na peptidy vyskytující se před nebo za Val87 a Ile93 v lidském myelinovém bazickém proteinu. Může být použit jakýkoli zbytek polypeptidu.

-3CZ 299535 B6

V jednom provedení vynálezu může být R] peptid vybraný ze skupiny peptidů v rozmezí od aminokyselinového zbytku 61 do aminokyselinového zbytku 86 SEQ IN NO:1. Délka uvedeného peptidu se může pohybovat v rozmezí od 1 do 26 aminokyselin.

V dalším provedení vynálezu může být R₂ peptid vybraný ze skupiny peptidů v rozmezí od aminokyselinového zbytku 94 do aminokyselinového zbytku 106 SEQ IN NO:1. Délka uvedeného peptidu se může pohybovat v rozmezí od 1 do 13 aminokyselin.

Ri a/nebo R₂ může být opakováním sekvence -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile, nebo jejich ío změněná podoba zahrnující substituce, adice nebo delece. Tak může peptid obsahovat množství kopií vazebných míst (epitopů) anti-MBP.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny podle běžně používaných metod syntézy polypeptidů. Pojmem „peptid“ se rozumí i peptidy vyráběné technologií rekombinace DNA. Jestliže známe sekvence vybraných peptidů podle vynálezu, zahrnuje vynález určení vhodných sekvencí DNA, které kódují určité sekvence aminokyselin. Vhodné sekvence DNA mohou být vyrobeny běžnými známými metodami syntézy sekvencí DNA. Tak vyrobené sekvence DNA mohou být klonovány do vhodných nosičů klonů a použity k transformaci vhodné hostitelské buňky tak aby vyráběla rekombinantní peptid. Všechny metodiky výše popsané jsou velmi dobře známé odbor20 níkům v dané oblasti.

Peptidy podle vynálezu jsou významně homologní s částí sekvence aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu. Pojmem „část sekvence aminokyselin“ je míněno, že sekvence může být jakékoliv délky za předpokladu, že sekvence aminokyselin je dost dlouhá, aby plnila funkci snižování tvorby protilátek lidského myelinového bazického proteinu, ale ne tak dlouhá, aby způsobila problémy již dříve známé v dané oblasti, kdy byly MBP peptidy používány pro léčbu sklerózy multiplex in vivo. Podle vynálezu mohou být peptidy alespoň 10 aminokyselin dlouhé.

V jednom příkladu vynálezu mohou být peptidy od asi 10 aminokyselin do asi 25 aminokyselin. Jestliže jsou peptidy vynálezu používány jako část fúzního proteinu, celková velikost peptidů může být mnohem větší.

Podle jednoho provedení vynálezu bylo určeno, že vybrané peptidy významně odpovídající sekvenci aminokyselin h-MBP jsou účinné ve snižování tvorby anti-MBP. Tyto peptidy odpovídají sekvenci aminokyselin h-MBP od zbytku asi 61 do zbytku asi 106. V jednom příkladu odpoví35 dají tyto peptidy sekvenci aminokyselin h-MBP od zbytku 75 do zbytku asi 106, kde jsou peptidy použity pro neutralizaci volných anti-MBP. V dalším příkladu odpovídají tyto peptidy sekvenci aminokyselin h-MBP od zbytku asi 82 do zbytku asi 92, kde jsou peptidy použity pro neutralizaci F anti-MBP nebo snižují syntézu F a B anti-MBP. Proto jsou peptidy vybrány ze zbytků s 10 aminokyselinami až 25 aminokyselinami, které jsou vzaty ze spojité sekvence aminokyselin ukázané dále (SEQ ID NO:1), za předpokladu, že zmíněná posloupnost může neutralizovat nebo zmírnit tvorbu antimyelinového bazického proteinu.

SEQINNO:1

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly

106

Příklady uvedených peptidů jsou vybrány z:

-4CZ 299535 B6

MBP75-95

Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr MBP64-78

Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly

MBP61-75

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys

MBP69-83

Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu

MBP80-97

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg MBP91-106

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly MBP84-93

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile

MBP85-94

Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val

MBP86-95

Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr

MBP87-96

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

MBP82-98

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

Peptid MBP82-98 má větší rozpustnost, než ostatní peptidy podle vynálezu díky pěti přidaným hydrofilním zbytkům. Použití tohoto peptidu je tedy výhodnější než použití ostatních peptidů podle vynálezu.

Potenciální úloha anti-MBP v patogenezi sklerózy multiplex bude dále zkoumána. Zvýšení titru anti-MBP u pacientů s rozvinutou sklerózou multiplex bylo nejdříve popsáno v Panitch a kol. (Panitc, H. S., Hooper, C. D., a Johnson, Κ. P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980), kde bylo použito radioimunitního testu na pevné fázi u MBP morčete. Pacienti s rozvinutou recidivou sklerózy multiplex mají většinou zvýšené anti-MBP hlavně ve volné formě, zatímco někteří pacienti v klinické remisi nemají určitelné hladiny anti-MBP. Během přechodné fáze od akutní recidivy k remisi titry volné anti-MBP silně poklesnou během týdnů nebo měsíců, zatímco vázané části protilátky rostou ve srovnání s jejich počátečními hodnotami. U jiných pacientů v remisi je možné pozorovat nízké titry volných a vázaných anti-MBP obvykle s poměrem F/B menším než jedna, anti-MBP neutralizující protilátka(y) jsou pravděpodobně vázány na anti-MBP. Příležitostně pacienti, kteří splňují kritéria klinické sklerózy multiplex, nebo pacienti, kteří mají neuro-5CZ 299535 B6 patologicky potvrzenou sklerózu multiplex, mají neurčitelné anti-MBP během aktivní fáze jejich nemoci. Je možné, že takoví pacienti mají protilátky proti jinými myelinovým proteinům. Nepřítomnost specifických protilátek nebrání předpokládané důležitosti anti-MBP v mechanismu demyenilizace u většiny pacientů se sklerózou multiplex.

V poslední době byla pozorována sekvence protilátek MBP v části IgG přečištěné z mozkomíšního moku pacientů se sklerózou multiplex (Warren, K. G. a Catz, I. J. Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Primární protilátky MBP ve volné i vázané formě vyskytující se v souvislosti s aktivní nemocí: F/B poměry jsou větší než jedna u pacientů s akutní recidivou a pod jedna u pacientů ío s chronickou progresivní nemocí (Warren, K. G. a Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz,

I. a Warren, K. G., Can J. Neurol Sci 13: 21-24, 1986; a Warren, K. G. a Catz, I. Ann Neurol 21:

183-187, 1987). Sekundární protilátky, které neutralizují anti-MBP se objevují, když se nemoc dostává do aktivní fáze. Terciální protilátky, které inhibují neutralizaci anti-MBP, jsou přítomny, když je nemoc chronicky progresivní a začíná být neaktivní. Skutečnost, že sekvence protilátek

MBP souvisí s různými fázemi sklerózy multiplex naznačuje její pravděpodobnou důležitost v přirozeném vývoji této nemoci.

Ačkoli mohou být anti-MBP detekovány v mozkomíšním moku pacientů s aktivní sklerózou multiplex, jejich přímou úlohu v patogenezi demyenilizace je stále třeba potvrdit. Účast anti20 MBP v mechanismu sklerózy multiplex může být nejlépe určena jejich snižováním in vivo pravděpodobně podáváním vybraných peptidů a sledováním klinického vývoje nemoci. Jestliže je (jsou) anti-MBP jedinou primární protilátkou (protilátkami) související s demyenilizací při skleróze multiplex, je možné zamezit tomuto procesu intratekálním nebo intravenózním podáním vybraných MBP peptidů, které by měly snížit anti-MBP a měly by podporovat toleranci k MBP in šitu. Jiné lidské myelinové proteiny se mohou také účastnit demyenilizace při skleróze multiplex, a proto je ve vynálezu zahrnuto použití peptidů významně homologních s částí sekvence aminokyselin těchto dalších myelinových proteinů, aby byly sníženy odpovídající protilátky. Ačkoli předchozí snaha léčit sklerózu multiplex intramuskulámím nebo subkutaneálním podáváním heterologních MBP nebyl příliš úspěšná (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. a Lorenz, R.,

Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. a Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; a Romine, J. S. a Salk, J. In“ Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. a Tourtelotte, W. W., eds Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 621-630), intratekální nebo intravenózní podávání MBP peptidů, které neutralizují, nebo snižují tvorbu anti-MBP podle vynálezu je ukázáno na řadě úspěšných výsledků.

Zvířecí model sklerózy multiplex, experimentální alergická encefalomyelitida (EAE), je nemoc projevující se demyelinizací, kterou způsobují T buňky. EAE může být zlepšena intraperitoneálním injikováním MBP syntetických peptidů postiženým myším (Critchfield, J. M. a kol. Science 263, 1139-1143, 1994). Dokonce orální podání MBP ovlivnilo EAE cestou navození periferní tolerance (Chen, W. a kol., Science 265, 1237—1240, 1194). Kombinace myelinových antigenů nebo syntetických peptidů těchto antigenů podávaná intravenózně a/nebo intratekálně může být potřebná k ovlivnění T buněk, B buněk a makrofágů, které způsobují poškozování myelinu pacientů postižených sklerózou multiplex.

Vynález se také týká farmaceutických kompozic obsahujících, jako aktivní složku, výše uvedený peptid buď samotný, nebo v kombinaci ve směsi s farmaceuticky přijatelnými nosiči. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti a zahrnují například obyčejný solný roztok.

Peptidy podle vynálezu mohou být podávány lidem pro léčbu nebo zmírněné sklerózy multiplex. Terapeutická dávka pro intravenózní podávání při léčbě sklerózy multiplex může být asi od 1,0 mg na kilogram tělesné hmotnosti do 10,0mg na kilogram tělesné hmotnosti; pro intratekální podávání může být celková dávka asi od 1 do 100 mg. V jednom příkladu vynálezu je peptid podáván buď intravenózně, nebo intratekálně nebo v kombinaci. Peptidy mohou být podávány buď jako jednotlivá dávka, nebo posloupnost dávek, podle potřeby.

-6CZ 299535 B6

Podle vynálezu bylo zjištěno, že intravenózní podávání snižuje volné i vázané anti-MBP; zatímco intratekální podávání má účinek pouze na neutralizaci nebo zmírnění volných anti-MBP.

Jedno použití vynálezu ukázalo, že postupné intratekální podávání MBP peptidů může snižovat F anti-MBP a udržovat jejich nízkou úroveň po měsíce po aplikaci peptidů u pacientů trpící monosymptomatickými recidivami. V jednom příkladu tohoto provedení bylo pacientovi podáváno 50 mg peptidu MBP denně po dobu 4 až 5 dnů. V dalším příkladu mohla být další dávka podána týden až dva po první injekci.

Ačkoli je vynález podrobně popsán s odkazy na výhodná provedení, následující příklady jsou ilustrativní a vynález neomezují.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje umístění osmnácti syntetických peptidů (malá čísla) ve vztahu k celé molekule lidského MBP. Peptidy jsou představovány vertikálními sloupci umístěnými vedle jejich odpovídající oblasti na molekule MBP. Velká čísla představují aminokyselinové zbytky na lidském

MBP.

Obr. 2 ukazuje inhibiční křivky anti-MBP, které byly získány přečištěním a smíšením z 10 různých pacientů se sklerózou multiplex, pro lidské MBP a MBP-peptidy.

Obr. 3 ukazuje neutralizaci anti-MBP, které byly izolovány zjednotlivých pacientů se sklerózou multiplex, pro lidské MBP a peptidy MBP80-97; MBP91-106 a MBP75-95.

Obr. 4 - Průběžné sledování titrů protilátek mozkomíšního moku pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex:

F (volné) a B (vázané) - hladiny volných a vázaných protilátek byly trvale zvýšené při odebrání 26 vzorků za dobu 11 let od 1983 do 1993. cpm: impulzy za minutu jednotky radioaktivity = (cpm vzorek - cpm blank) / (cpm celkem - cpm blank) nevyplněné kroužky: Vázané (B) anti-MBP zjištěné po kyselé hydrolýze imunitních komplexů mozkomíšního moku.

vyplněné kroužky: Volné (F) anti-MBP Římská čísla značí měsíce v roce.

Obr. 5 - Kontrolní pacienti: Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku ve 2 „kontrolách v časo40 vých intervalech“ (1F56, Obr. 5A a 3M66, Obr. 5B) a 2 „kontrolách se solným roztokem“ (4M45, Obr. 5C a 5M59, Obr. 5D). Když byl odebrán vzorek mozkomíšního moku každých 30 minut v průběhu prvních dvou hodin, stejně jako o 24 hodin později, zůstaly u všech čtyř pacientů protilátky anti-MBP F a B konstantně zvýšené oproti základní úrovni. Symboly jsou stejné jako na obrázku 4.

Obr. 6 - Studie peptidů více pacientů: Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku ve skupině 4 pacientů (10F38, Obr. 6A; 13F43, Obr. 6C; 5M59, Obr. 6D; a 3M66, Obr. 6G), kterým byla podána tato množství (1; 2,5; 5 a 10 mg po řadě) nevazebného kontrolního syntetického peptidu MBP35-58 a ve druhé skupině čtyř jiných pacientů se sklerózou multiplex (6F53, Obr. 6B;

8M41, Obr. 6D; 4M45, Obr. 6F a 1F56, Obr. 6H), kterým byla podána tato množství (1; 2,5; 5 a mg po řadě) anti-MBP vazebného syntetického peptidu MBP75-95. Anti-MBP F v mozkomíšním moku byla vázána peptidem MBP75-95 v závislosti na dávce a nereagovala s peptidem MBP35-58. Hranice anti-MBP zůstala prakticky nezměněná.

-7CZ 299535 B6

Obr. 7 - Studie peptidů více pacientů: Když pacienti se sklerózou multiplex byli buď „kontrola v časovém intervalu“ (1F56, Obr. 7C a 3M66, Obr. 7D) nebo „kontrola v časovém intervalu se solným roztokem“ (5M59, Obr. 7A a 4M45, Obr. 7B), nebo když jim byl podán nevazebný kont5 rolní peptid MBP35-38 (5M59 a 3M66), zůstaly jejich hladiny anti-MBP F a B v mozkomíšním moku stejné. Naproti tomu, když bylo týmž pacientům 4M45, 1F56 a 3M66 později podáno 5 až 10 mg pro anti-MBP vazebného peptidu MBP75-95, jejich anti-MBP F klesla na nezjistitelnou úroveň do 7 dnů a vrátila se na základní úroveň mezi 10 až 21 dnem.

ío Obr. 8 - Opakované intratekální injekce syntetického peptidu: pacientovi s chronickou progresivní sklerózou multiplex byla desetkrát podána vždy po týdnu injekce 10 mg MBP75-95 injikovaná přímo do mozkomíšního moku; titry anti-MBP F a B byly měřeny před (kroužky) a po 30 minutách (čtverečky) po každé aplikaci. Anti-MBP F (vyplněné kroužky a čtverečky) byly neurčitelné po dobu 10 týdnů, zatímco protilátky B zůstaly v podstatě nezměněné (nevyplněné kroužky a čtverečky).

Obr. 9 - Intravenózní podávání syntetického peptidu: Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku po jedné intravenózní injekci 500 mg MBP75-95; obě hladiny anti-MBP F a B významně klesaly při testování 10, 16 a 30 dní po aplikaci. Symboly jsou stejné jako na obrázku 4.

Obr. 10 - K dalšímu upřesnění epitopu MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex byla použita sada 41 dekapeptidů, které pokryly oblast mezi zbytky 61 a 10.

Legenda:

- sloupce představují procenta inhibice =100- radioaktivní jednotky

- MBP a peptid MBP75-95 byly použity jako pozitivní kontroly a způsobily úplnou (100%) inhibici protilátek F a B.

- peptidy MBP51-60 a MBP111-120 byl použity jako negativní kontroly a způsobily nevýznamnou inhibici (0 až 10%) anti-MBP F i B.

- dekapeptidy MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 a MBP87-96, které způsobily maximální inhibici (90 až 100%) protilátek F i B jsou silně spojeny s MBP epitopem.

- tečkovaná čára: 95% konfidenční limity inhibičního testu.

Obr. 11 a - ukazuje anti-MBP mozkomíšního moku volné (F)-· a vázané (B)-° u pacienta s jednostrannou optickou neuritidou, kterému byly podány intratekálně dvě injekce (it# 1 a it#2) 50 mg pMBP86-95, v odstupu 4 týdnů; w = počet týdnů.

Obr. 11b- ukazuje hladiny anti-MBP volných (F)-· a vázaných (B)-° v mozkomíšním moku u pacientů s celkovou jednostrannou optickou neuritidou, kterým byly několikrát podány intratekální injekce (it#l it#2 it#3 it#4 a it#5) 50 mg pMBP82-98 během prvního týdne recidivy.

Obr. 11c-ukazuje hladiny anti-MBP volných (F)-· a vázaných (B)-° v mozkomíšním moku pacientů s pseudoaterózou, kterým byla pětkrát denně podána intratekální injekce (it# 1 it#2 it#3 it#4 a it#5) 50 mg pMBP82-98.

Obr. lid-ukazuje hladiny anti-MBP volných (F)-· a vázaných (B)-° v mozkomíšním moku pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány čtyři intratekální injekce (it# 1 it#2 it#3 it#4) 50 mg pMBP86-95 každé 2 až 3 dny v průběhu prvního týdne recidivy a jedna intravenózní injekce (IV) 400 mg pMBP86-95, když znovu nastala progresivní fáze nemoci.

Obr. 12 ukazuje anti-MBP mozkomíšního moku volné a vázané u pacienta s polysymptomatickou recidivou, kterému bylo podáno celkem sedm intratekálních injekcí 50 mg pMBP86-95.

-8CZ 299535 B6

Nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku 30 minut po it#2; vzorek mozkomíšního moku byl získán o 24 hodin později. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.

Obr. 13 ukazuje hladiny anti-MBP volných a vázaných v mozkomíšním moku u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány jak intratekální (it#l, it#2 a it#3) tak intravenózní (IV#1 a IV#2) injekce pMBP86-95. Nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku před nebo po it#2. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.

Obr. 14 ukazuje hladiny anti-MBP volných a vázaných v mozkomíšním moku u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány intravenózně (IV#1, IV#2 a IV#3) a intratekálně (it#l až it#9) injekce pMBP86-95 a pMBP82-98. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.

Obr. 15 ukazuje pokus zabránit budoucí recidivě u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány dvě intravenózní injekce (IV#1 a IV#2) 400 mg pMBP86-95 a pMPB82-98. Nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku v průběhu první recidivy, tři měsíce po IV#1. Přirozená frekvence recidiv je znázorněna v horní části šipkami, které odpovídají měsíci ataku. Orámovaná oblast představuje období pokusu. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.

Obr. 16 ukazuje pokus zabránit budoucí recidivě u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány dvě intratekální injekce (it#l a it#2) a jedna intravenózní injekce (IV) pMBP86-95. Vyplněné čtverečky - vysoká intravenózní dávka methylprednisolonu. Přirozená frekvence recidiv je znázorněna v horní části šipkami, které odpovídají měsíci ataku. Orámovací oblast představuje období pokusu. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.

Obr. 17 ukazuje účinek intratekálního a intravenózní podání peptidu na protilátky specifické pro MBP v mozkomíšním moku pacientů trpících chronickou progresivní sklerózou multiplex; na obrázku 17a byl injikován pMBP75-95 přímo do mozkomíšního moku (2,5 mg v 5 ml solného roztoku) a protilátky specifické pro MBP byly měřeny radioimunitním testem na pevné fázi v různých časových okamžicích (0,5 hodiny až 7 dní po aplikaci). Injekce peptidu způsobila přechodnou neutralizaci volné anti-MBP (vyplněné kroužky) ale neměla účinek na vázanou antiMBP (nevyplněné kroužky). Vlastní protilátky byly neurčítelné jednu až dvě hodiny a začaly se vracet k základním hodnotám mezi 12 a 24 hodinou po aplikaci. Podobná pozorování byla provedena u sedmi jiných pacientů s chronickou progresivní sklerózu multiplex. Na obrázku 17b, třináct měsíců po intratekální injekci peptidu, což ukazuje Obr. 17a, bylo intravenózně injikováno 500 mg pMBP75-95 v 50 ml solného roztoku a protilátky specifické pro MBP v mozkomíšním moku byly měřeny každé tři měsíce (střední hodnota ± standardní odchylka).

Obr. 18 ukazuje složené hodnoty anti-MBP v mozkomíšním moku třinácti pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kterým byla podána intravenózní injekce (IV#1) 5 až 6 mg/kg tělesné hmotnosti (256 až 500 mg v klasickém solném roztoku) pMBP 75-95 (dva pacienti) nebo pMBP86-95 (11 pacientů); byly sledovány jak volné tak vázané anti-MBP (vyplněné a nevyplněné kroužky - v tomto pořadí). Hladiny vlastních protilátek bylý nižší nebo neurčitelné v období mezi prvním a čtvrtým měsícem po IV# 1, kdy se začaly vracet na základní hladiny. Mezi 6 a 10 měsícem po IV#1 byla podána všem pacientům druhá intravenózní injekce pMBP82-98 ve stejné dávce (IV#2).

-9CZ 299535 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Neutralizace protilátek lidského myelinového proteinu in vitro

Obr. 1 ukazuje umístění osmnácti peptidů h-MBP užívaných v této studii ve vztahu k celé molekule MBP. Přirozený MBP byl izolován z mozkové tkáně nezasažené sklerózou multiplex (Diebler, G. E., Martenson, R. E. Kies, M. W., Prep Biochem 2: 139-165, 1972) a dále přečištěn gelovou filtrací a vysokotlakou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (HPLC). Výsledná příprava antigenů byla kontrolována na čistotu elektroforézou v SDS-polyakiylamidovém gelu. K dalším studiím byly použity pouze preparáty, kterým odpovídala molekulární hmotnost

18,5 KD. Ve studii neutralizace byl použit přečištěný MBP ve specifické afinitní chromatografii a v radioimunitním testu na pevné fázi.

Osmnáct peptidů pokrývajících délku h-MBP a obsahujících zbytky mezi 8 a 25 aminokyselinami byly syntetizovány metodou Fmoc, jak bylo dříve popsáno (Groome, N. P., Dawkes, A., Barry, R. a kol, J. Neuroimmun 19: 305-315, 1988). Čistota peptidu byla kontrolována HPLC na reverzní fázi s kolonou Cl8 a gradientem vody/acetonitrilu (0,1 % TFA). Analýza aminokyselin peptidů byla také provedena standardním způsobem. Mnoho peptidů použitých v této studii obsahovalo nepřirozené cysteinové zbytky, protože byly připraveny pro funkci imunogenů ve spojení s Freundovým adjuvants. Je nepravděpodobné, že to ovlivnilo zde popisované výsledky.

Během prvního týdne prudkého nástupu symptomů akutní recidivy sklerózy multiplex byl získán mozkomíšní mok od 36 pacientů a hladiny IgG byly určeny nefelometricky. Vzorky mozkomíšního moku užité při této studii byly vybrány tak, aby měly vysokou počáteční absolutní IgG úroveň (> 0,80 g/1) a zvýšené titry anti-MBP (F/B poměr blížící se 1,0). Všichni pacienti se sklerózou multiplex měli klinicky definované onemocnění.

IgG bylo přečištěno z koncentrovaného mozkomíšního moku pacientů s akutní sklerózou multiplex afinitní chromatografií na A-Sepharose (Pharmacia™), jak bylo již popsáno (Warren, K. G. a Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Čistota každého vzorku IgG byla kontrolována elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a izoelektrickou fokusací. Během přípravy se hladiny zvýšeného anti-MBP z přečištěného IgG snížily vlivem absorpce MBP k nule, supematanty po absorpci obsahovaly zbytkové IgG indikující, že anti-MBP představuje pouze frakci zvýšeného IgG.

Přečištěný MBP se navázal na CNBr-aktivovanou Sepharosu 4B (Pharmacia™) podle instrukcí výrobce. Přečištěné IgG mozkomíšního moku obsahující zvýšené hladiny anti-MBP od 35 acientů s akutní recidivou sklerózy multiplex bylo použito k izolaci anti-MBP afinitní chromatografií na MBP-Sepharose (Warren, K. G. a Catz, I., J Neurol Sci 103: 90-96, 1991). Přečištěné anti-MBP vzorky byly porovnány s původním zdrojem IgG elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Během přečištění byly vzorky anti-MBP sníženy na nulovou úroveň vlivem MBP, supematanty po absorpci neobsahovaly žádné zbytkové IgG indikující čistotu anti-MBP.

Konstantní množství anti-MBP (15 radioaktivních vázaných jednotek odpovídajících hodnotě 15 pro účely rozšiřování stupnice = 0%) bylo inkubováno se zvyšujícími se množstvími h-MBP (0 až 1000 ng) nebo jednotlivými peptidy MBP (0 až 10 000 ng) v tekuté fázi a po 1,5 hodinové inkubaci byly určeny hladiny volného anti-MBP ve všech směsích. Anti-MBP izolované ze 7 jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex nebo směs anti-MBP z 10 různých pacientů se sklerózou multiplex bylo použito k neutralizačním pokusům. Histon telecího brzlíku a albumin lidského séra byly použity jako kontrolní antigen (10 až 1000 ng). Jedna monoklonální protilátka (MAb) peptidu MBP64-78 a polyklonální králičí antisérum peptidu MBP1-8 byly použity jako pozitivní protilátkové kontroly (Groome, N., Harland, J. a Dawkes, A., Neurochem Int 7: 309-10CZ 299535 B6

317, 1985; Barry, R.,Payton, M., a Groome, N., Neurochem Int 2: 291-300, 1991). Další myší monoklonální protilátka epitopu 45-50 byla použita jako negativní protilátková kontrola.

Hladiny anti-MBP byly určeny radioimunitním testem na pevné fázi s lidským MBP (Warren,

K. G., a Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Warren, K. G., a Catz, I., Ann Neurol 21: 183— 187, 1987; Warren, K. G., a Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989). Hladiny volných antiMBP byly měřeny ve všech frakcích získaných po afmitní chromatografii a ve všech neutralizačních směsích. Běhy, pro všechny jednotlivé vzorky, byly provedeny čtvermo s použitím téhož jodizovaného materiálu, aby byla co nejvíce snížena variabilita zkoušek.

Přečištěná anti-MBP byla zcela neutralizována pomocí MBP a peptidů MBP80-97, MBP91-106 a MBP75-95 a byla částečně neutralizována peptidy MBP64-78, MBP69-83 a MBP61-75 (Tabulka 1 a Obr. 2). Zbývajících 12 peptidů neumožnilo neutralizaci přečištěné anti-MBP a jejich kinetické křivky klesaly v oblasti označené šrafováním na obrázku 2. Histon telecího brzlí15 ku a lidský sérový albumin nereagovaly s přečištěnou anti-MBP dokonce ani v tak vysoké koncentraci jako je 1000 ng. MAb peptidu MBP64-78 bylo inhibováno pouze peptidem MBP64-78 a MAb peptidu MBP1-8 bylo inhibováno pouze peptidem MBP1-8. MAb peptidu MBP45-50 nereagovalo s MBP ani s jinými peptidy (pro přehlednost obrázku kontrolní data nejsou zobrazena). Kontrolní vzorky ukazují platnost neutralizačního postupu, protože každá kontrolní proti20 látka byla zcela neutralizována očekávaným peptidem a nebyla neutralizována žádným jiným peptidem. To ukazuje, že dokonce při vysokých koncentracích peptidu (10 000 ng) lze pozorovat specifické rozpoznávání.

TABULKA 1
SEKVENCE LIDSKÉHO MBP	SCHOPNOST REAGOVAT S ANTI-MBP
1-170	4-f-
l-8Cy	-
Cy4-18	-
Cyll-24	-
18-32	-
26-40	•
Cy35-58	-
Cy 51 - 64 Gly	+
Cy 64-78	+
Cy 61 - 75	+
Cy61-83	++
Cy75-95	++
Cy 80 - 97 Gly	++
Cy 91 -106	-
117-129
Cy 127-140	-
Cy 136-149	-
141-155 Cy 149-162	-

++ úplná neutralizace + částečná neutralizace - nevýznamná schopnost reagovat

Anti-MBP přečištěná ze 7 jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex, byla zcela neutralizová30 na h-MBP a peptidy MBP80-97, MBP91-106 a MB75-95 (viz Obr. 3 jako příklad). Díky omezenému množství protilátky získaného od jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex nereagovala anti-MBP se zbývajícími 15 peptidy.

-11 CZ 299535 B6

Jak bylo uvedeno výše, anti-MBP byla neutralizována peptidy, které leží mezi aminokyselinovým zbytkem 61 a aminokyselinovým zbytkem 106. Peptidy, které neumožňují neutralizaci antiMBP pokrývají jak aminové (od zbytku 1 do 63), tak karboxylové (od zbytku 117 do 162) konce h-MBP. Ukazuje se, že peptidy z různých nepřekrývajících se oblastí MBP neutralizují stejnou/né protilátku/ky. Toto může být vysvětleno, jestliže protilátky rozpoznávají nespojité (skládané) epitopy obsahující aminokyseliny z různých oblastí. Podobný jev dříve pozoroval Hrubý a kol. (Hrubý, S., Alvord, E. C., Groome, N. P. a kol, Molec Immun 24: 1359-1364, 1987), který ukázal, že krysí monoklonální protilátka má hlavní epitop v sekvenci MBP112-121, ale silnou křížovou reakci s jiným epitopem v peptidu 39-91. To je pravděpodobnější, než možnost, že protilátka je křížově reaktivní se dvěma zcela odlišnými sekvencemi, které nejsou z nespojitého epitopu Hrubý, S., Alvord, E. C„ Martenson, R. E. a kol. J Neurochem 44: 637-650, 1985). Neutralizační údaje mohou být vysvětleny schopností peptidů z rozdílných úseků MBP, z nichž každý je schopen obsadit vazebné místo protilátky tím, že reaguje s odlišným postranním řetězcem aminokyseliny protilátky. Toto vysvětlení souhlasí s pozorováním, že peptidy způsobující úplnou inhibici (MBP80-97, MBP91-106 a MBP75-95) jsou při inhibici přibližně stokrát méně účinné na molekulární úrovni než celý MBP. Podle uvedené hypotézy to může být způsobené tím, že klon peptidu není schopen dosáhnout vazebné energie původního epitopu MBP.

Příklad 2

Neutralizace nebo zmírnění tvorby protilátek lidského myelinového bazického proteinu in vivo Výběr pacientů a kontrolní studie

Pacienti, kteří se účastnili tohoto výzkumného projektu byli sledování na klinice péče a výzkumu sklerózy multiplex Univerzity v Albertě v Edmontnu v Kanadě. Pacienti byli diagnostikováno na klinickou sklerózu multiplex podle Schumacherova kritéria (1965), což bylo potvrzeno magnetickou rezonancí zobrazující mozek a imunochemickými profily mozkomíšního moku. Aby bylo dokázáno, že při chronické progresivní skleróze multiplex anti-MBP stále vzrůstala během dlouhých časových období měsíců až let, pacienti byli podrobeni opakovaným lumbálním punkcím se sledováním F a B anti-MBP. U pacienta s chronickou progresivní sklerózou multiplex bylo pozorováno, že vlastní protilátky zůstávaly stále zvýšené po dobu 11 let a tedy nenastal spontánní pokles úrovní anti-MBP (Obr. 4 je ilustrativní příklad).

Aby bylo určeno, že počáteční zvýšení úrovní anti-MBP v mozkomíšním moku zůstávalo relativně konstantní déle než 24 hodin, byli 2 pacienti (1F56 a 3M66) podrobeni opakovanému testování mozkomíšního moku každých 30 minut po dobu 2 hodin a o 24 hodin později bylo sledováno F a B anti-MBP (Obr. 5A a 5B v tomto pořadí). Pacienti 1F56 a 3M66 sloužili jako „kontrola“. Hladiny F a B anti-MBP zůstávaly stále zvýšené během testování mozkomíšního moku po dobu 2 hodin stejně jako o 24 hodin později.

Navíc účinek injikovaných 5 ml normálního solného roztoku do mozkomíšního moku byl podobně stanoven u dvou jiných pacientů (4M45 a 5M59; Obr. 5C a 5D, v tomto pořadí). Tito pacienti sloužili jako „kontrola v časovém intervalu“ při použití solného roztoku. Po intratekálním injikování 5 ml normálního solného roztoku zůstaly hladiny F a B anti-MBP na základní úrovni a mozkomíšní mok byl testován tak, jak bylo uvedeno výše, čímž bylo ukázáno, že „zeslabující účinek“ na anti-MBP titry byl zanedbatelný.

Hladiny anti-MBP byly určeny metodou radioimunitního testu na pevné fázi s lidskou MBP vlmmulon mikrotitračních jamkách. Immulon mikrotitrační jamky byly pokiyty 100 pl MBP v koncentraci 10 pg/ml (1 pg/jamku) a inkubovány do druhého dne při teplotě 37 °C. Po přidání hovězího sérového albuminu ( BSA) a trojím promytí vodou byly jamky ponechány při pokojové teplotě. Vzorky 100 pl mozkomíšního moku nebo tkáňové extrakty zředěné na 0,010 gm IgG/1 (s 0,01 M solný roztok pufrovaný Barbitolem (BBS) pH 6,9 až 7,1, 0,5% BSA a 0,05% Tween 20)

-12CZ 299535 B6 byly inkubovány v jamkách pokrytých MBP po dobu 1 až 2 hodin při pokojové teplotě. Po 5 promytích pufrem (s 0,01 M BBS, 0,5 BSA a 0,05% Tween 20) byly jamky inkubovány s kozím antikráličím specifickým IgG-Fc (v 0,01 M BBS, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté promyty jak bylo uvedeno výše. Nakonec byl přidán ¹²⁵Iprotein A (nebo ¹²⁵I-protein G) a byl inkubován po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Když byl použit ¹²⁵I-protein G jako značkovač, ovalbumin nahradil BSA v testovacím pufru a při ukončení. Po třech závěrečných promytích vodou byly jamky jednotlivě odečteny. Výsledky jsou vyjádřeny v radioaktivitě definované jako: (impulzy vzorku - impulzy blanku) / (impulzy celkové radioaktivity - impulzy blanku). Všechny vzorky jsou odečítány v 10 kopiích a doba měření je 10 minut aby bylo získáno více než 10 000 impulzů pro každý pozitivní vzorek.

Před testováním byly všechny vzorky mozkomíšního moku a/nebo tkáně zředěny na konečnou IgG koncentraci 0,010 g/1. F anti-MBP byla určena přímo v mozkomíšním moku nebo tkáňovém extraktu, zatímco hladiny protilátek B byly určeny následnou kyselou hydrolýzou imunitních komplexů s glycinovým HCI pufrem pH 2,2. Nespecifická vazba nastala pro každý vzorek v nepokrytých jamkách. Pro lokalizaci epitopů nejdříve reagovaly syntetické peptidy s přečištěnou protilátkou v srovnávacím testu tekuté fáze a pak byla anti-MBP určena radioimunitním testem ve všech výsledných supematantech. Výsledky kombinovaného srovnávacího vazebného testu a radioimunitního testu byly vyjádřeny jako procento inhibice syntetického peptidu a definovány jako 100 - radioaktivní jednotky. Vzorky byly připraveny v 10 kopiích a odečítány po 10 minutách, každý v FKB1275 Minigamma čítači. Přečištěná anti-MBP tkáně byla použita v pěti předem určených ředěních jako pozitivní kontrola. Shromážděný mozkomíšní mok od pacientů bez neurologického onemocnění byl použit jako negativní kontrola. V testu byla opakovatelnost mezi 3 a 5 % a mezi jednotlivými testy byla proměnlivost menší než 7 %.

Přetrvávání anti-MBP mozkomíšního moku na zvýšené a konstantní úrovni u pacientů, kteří sloužili jako kontrola, (kontrola v časovém intervalu a kontrola ředění) umožnilo další krok tohoto výzkumu.

Výzkumná studie Fáze 1 jedné intratekální injekce MBP syntetických peptidů

Aby se stanovil účinek syntetického peptidu MBP75-95 na F a B titry anti-MBP mozkomíšního moku byl proveden pokus Fáze 1. Po odsouhlasení Výborem pro etiku výzkumu Univerzity v Albertě byl tento projekt prováděn na pacientech s klinicky definovanou sklerózou multiplex (Schumacher a kol., Ann NY Acad Sci., 122: 552-568, 1965), těžce postižených a s postupující progresivní nemocí. Byl získán souhlas 14, dobrovolníků pro tuto studii; 8 pacientů bylo vybráno na základě jejich počátečního titru F anti-MBP mozkomíšního moku (nad 8 radioaktivních jednotek) (tabulka 2) a byla jim aplikována jedna intratekální injekce buď peptidu MBP75-95, který váže anti-MBP in vitro, nebo kontrolního peptidu MBP35-58 (Warren a Catz 1993 b). Pokus byl veden tak, že žádný z výzkumníků ani z pacientů nevěděl jaká látka pacientu byla injikována. Všechny peptidy byly kódované označeny sedmi počítačem náhodně generovanými čísly bez možnosti ovlivnění lékařem. Párované peptidy rozpuštěné v 5 ml normálního solného roztoku a injikované do mozkomíšního moku cestou lumbální punkce byly podávány v rostoucích dávkách 1; 2,5; 5 a 10 mg. Mozkomíšní mok byl odebírán před injekcí (základní úroveň), v třicetiminutových intervalech po dobu 2 hodin po injekci, 24 hodin později a pak v týdenních intervalech po dobu 3 až 4 týdnů dokud se hladiny nevrátily na základní úroveň. Počty buněk, celková úroveň proteinu, úroveň glukóza, úroveň IgG a úroveň albuminu byly určeny ve všech získaných vzorcích mozkomíšního moku. Hladiny anti-MBP F a B byly určeny pomocí radioimunitního testu jak bylo popsáno výše.

-13CZ 299535 B6

Identifikace pacienta č,, pohlaví, věk	Doba trvání nemoci (roky)	Kurtzke EDSS	Anti-MBP mozkomíšního moku (radioaktivní jednotky) volné (F) vázané (B)	Vybráno pro výzkum
1	žena	56	10	8,5 - Triplegie	9	10	Ano
2	muž	50	18	6 - Paraparéza	2	10	Ne
3	muž	66	20	9 - Kvadruplegie	11	12	Ano
4	muž	45	21	9 - Kvadruplegie	10	11	Ano
5	muž	59	28	9 - Kvadruplegie	8	10	Ano
6	žena	53	19	9 - Kvadruplegie	10	9	Ano
7	žena	33	11	6 -Paraparéza,ataxie	5	13	Ne
8	muž	41	8	8 - Triplegie	9	12	Ano
9	muž	49	7	7 - Paraparéza	5	10	Ne
10	žena	38	7	8,5 - Paraplegie	11	10	Ano
11	muž	49	20	8 - Triplegie	6	13	Ne
12	muž	35	12	6,5-Paraparéza, ataxie	7	12	Ne
13	žena	43	15	8 - Paraplegie	9	10	Ano
14	žena	32	4	6- Paraparéza, ataxie	8	7	Ne

Tabulka 2: Klinická data a hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku 14 pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří se dobrovolně účastnili výzkumné studie Fáze 1 jedné intratekální injekce MBP syntetických peptidů. Protože byla nutná vysoká výchozí hodnota F anti-MBP (> 8 radioaktivních jednotek) pro dosažení zřetelné změny po injekci, bylo pro studii vybráno pouze 8 ze 14 pacientů.

Všechny peptidy užívané v této studii byly syntetizovány pod kódem „dobrý produkt“ (Good ío Manufacturing Product - GMP) používající Fmoc (9-fluorenylmetoxykarbonyl) metodu podle

Procyon lne. (London, Ontario, Kanada). Čistota peptidu byla kontrolována vysokotlakou kapalinovou chromatografií s reverzní fází sC18 kolonou a gradientem voda-acetonitril obsahující 0,1% TFA. Hmotnostní spektroskopie a aminokyselinová analýza byla provedeny standardními postupy. Před inokulací byly všechny peptidy zkoušeny na pyrogenicitu (Vancouver General

Hospital, Vancouver, Kanada), sterilitu (Provincial Laboratory for Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Kanada) a akutní toxicitu (Health Sciences Laboratory Animal Services, University of Alberta, Edmonton, Kanada) a byly klasifikovány jako „vhodné pro podávání člověku“. Vhodná množství kódovaných syntetických peptidů byla rozpuštěna v 5 ml sterilního normálního solného roztoku (0,9% injekce chloridu sodného USP, nepyrogenický, Baxter Corp,

Toronto, Kanada), dvakrát filtrována přes 0,22 pm jednotkový sterilizační filtr (Millex-GX, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) a podávána do mozkomíšního moku cestou lumbální punkce.

Peptidové studie u pacientů

Pacientům 6F53, 8M41, 4M45 a 1F56 byl podán syntetický peptid MBP75-95 schopný vázat anti-MBP in vitro a pacientům 10F36, 13F43, 5M59 a 3M66 byl podán „kontrolní“ nevazebný syntetický peptid MBP35-58 ve vzrůstajících množstvích 1; 2,5; 5 a 10 mg v tomto pořadí (Obr. 6). U pacienta 6F53 (Obr. 6B), kterému byl podán 1 mg MBP75-95, bylo pozorováno 75% snížení F anti-MBP následované bezprostředním návratem hodnot na základní úroveň; pacientovi 8M41 (Obr. 6D) bylo podáno 2,5 mg MBP75-95 a byla zjištěna úplná neutralizace F antiMBP vazbou následovaná návratem hodnot na základní úroveň během 24 hodin; u pacienta 4M45 (Obr. 6F), kterému bylo podáno 5 mg MBP75-95, došlo k náhlé a úplné neutralizaci vazbou, která vydržela 7 dní a vrátila se na základní úroveň, když byla testována o 21 dnů později;

pacientovi 1F56 (Obr. 6H) bylo podáno 10 mg MBP75-95 a byla pozorována celková neutralizace F anti-MBP vazbou, která vydržela 7 dní a vrátila se na základní hodnoty, když byla testována o 14 a 28 dní později. Vazebné hladiny anti-MBP se významně neměnily při intratekální ínoku- 14CZ 299535 B6 láci MBP75-95. Pacientům 10F38, 13F43, 5M59 a 3M66 bylo podáno po řadě 1; 2,5; 5 a 10 mg kontrolního peptidu MBP35-58, hladiny F a B anti-MBP v mozkomíšním moku zůstávaly nezměněné vzhledem k původním hodnotám v průběhu 24 hodinového pokusu (Obr. 6A, 6C, 6E a 6G, v tomto pořadí). Běžné parametry při zánětu mozkomíšního moku při skleróze multiplex, jako například počty buněk, absolutní hladiny celkových proteinů, IgG a albumin, oligoklonální pásy, IgG index a syntéza IgG CNS zůstávaly nezměněné před a po podání peptidu.

Peptidové studie u pacientů ío Experimenty s více pacienty byly prováděny za účelem minimalizace vlivu rozdílnosti jednotlivých pacientů na průběh pokusů. U pacienta, který sloužil jako nebo mu bylo podáno 5 mg neúčinného peptidu MBP35-58, hladiny F anti-MBP zůstaly na základní úrovni v průběhu dvou pokusů (Obr. 7A). Pacient 4M45 sloužil nejdříve jako „kontrola rozpustnosti“ a o dva měsíce později mu bylo podáno 5 mg MBP75-95. Jeho úroveň F anti-MBP zůstala konstantně zvýšená ve všech vzorcích získaných v průběhu pokusu „na rozpustnost“ a stala se nestanovitelnou po podání MBP75-95 (Obr. 7B). Podobné výsledky byly získány u pacienta 1F56, který měl neustále zvýšené hladiny protilátek F v průběhu pokusu „kontrola v časovém intervalu“ a po podání 10 mg MBP75-95 byla hladina F anti-MBP pod mezí stanovitelnosti (Obr. 7C). Celková studie byla provedena u pacienta 3M66. Jeho F anti-MBP hladiny byly neustále zvýšené v průběhu pokusu „kontrola v časovém intervalu“, nebo po podání 10 mg MBP35-58; avšak po injekci 10 mg MBP75-95 F anti-MBP byly zcela neutralizovány a zůstaly pod hranicí stanovitelnosti po dobu 7 dnů (Obr. 7B).

Opakované podávání syntetického peptidu MBP75-95

Po zjištění, že peptid MBP75-95 neutralizuje F-anti MBP in vivo po dobu 7 dnů, bylo rozhodnuto opakovaně injikovat 10 mg MBP75-95 do míšního moku v týdenních intervalech po dobu 10 týdnů. Tyto pokusy byly vedeny u tří různých pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří se neúčastnili projektu jedné injekce peptidu a dali souhlas k účasti na této studii.

F a B anti-MBP byly zjišťovány 1 až 2 týdny před prvním injikováním, před a 30 minut po každé z 10 injekcí a opět měsíc po poslední injekci. Množství buněk, hladiny celkového proteinu, glukózy, IgG a albuminu byly určeny ve všech vzorcích mozkomíšního moku získaných před každou z 10 injekcí. Před první a po poslední injekcí byl odebrán vzorek krve a analyzován na elektrolyty, kreatin, srdeční a jatemí enzymy a hematologický panel.

Byla-li pacientům s chronickou progresivní sklerózou multiplex opakovaně podávána intratekální injekce 10 mg MBP75-95 v týdenních intervalech po dobu 10 týdnů, jejich počáteční vysoké hodnoty F anti-MBP byly pod hranicí stanovitelnosti tak dlouho, dokud byl peptid podáván. Když byl peptid podáván déle, F anti-MBP se vrátily na základní úroveň v průběhu jednoho měsíce (Obr. 8). Titry protilátek B zůstávaly konstantně zvýšené, což naznačuje, že u těchto pacientů pokračovala syntéza anti-MBP a intratekální podávání peptidů způsobilo pouze „stírací účinek“ F anti-MBP.

Pacienti, kterým byla podána buď jedna injekce syntetického peptidu, nebo týdně opakované injekce měli chronickou progresivní sklerózu multiplex s vysokým stupněm neurologického postižení. Žádný z těchto pacientů neudával zhoršení svých neurologických symptomů, nebo zhoršení sklerózy multiplex následně po intratekální podání peptidu a nebyla pozorována buněčná reakce v mozkomíšním moku. Pacienti se sklerózou multiplex, kterým byl opakovaně injikován MBP75-95 byli sledováno z hlediska systémových komplikací včetně elektrolytických změn, stejně jako srdečních, jatemích a ledvinových dysfunkcí a hematologických změn a neobjevily se žádné nepříznivé komplikace. Nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky.

- 15CZ 299535 B6

Intravenózní podávání MBP75-95

Po zjištění, že intratekální podávání peptidu MBP75-95 způsobuje celkovou neutralizaci F antiMBP vazbou, přičemž nedochází k žádné změně úrovní protilátek B, bylo rozhodnuto zjistit úči5 nek intravenózního podávání stejného peptidu na titry F a B anti-MBP mozkomíšního moku; 500 mg MBP75-95 bylo rozpuštěno ve 100 ml normálního solného roztoku a intravenózně injikováno v průběhu 30 minut pacientovi 8M41, anti-MBP byly sledovány každých 30 minut v průběhu prvních dvou hodin, o 18 hodin později, stejně jako o 10, 16 a 30 dní později. Krev byla odebrána před injekcí, stejně jako 16 a 30 dní později a analyzována na elektrolyty, kreatin, srdeční a jatemí enzymy a hematologický panel. Míšní mok byl sledován na množství buněk, hladiny celkového proteinu, glukózy, IgG a albuminu. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky.

Jak je vidět z obr. 8, intravenózní podání 500 mg MBP75-95 nezpůsobilo žádnou změnu v úrov15 nich titrů F a B anti-MBP mozkomíšního moku v průběhu prvních dvou hodin. 30% Pokles F anti-MBP v mozkomíšním moku byl pozorován o 18 hodin později. Když byl mozkomíšní mok odebrán o 10, 16 a 30 dní později, F i B anti-MBP byly sníženy zjejich počáteční hladiny o 11 radioaktivních jednotek na 4, 2 a 1 radioaktivních jednotek v daném pořadí. U všech pacientů léčených intratekálně MBP75-95 bylo opakovaně pozorováno přetrvávání zvýšených úrovní vázaných protilátek, zatímco F anti-MBP zůstávaly pod hranící stanovitelností v závislosti na dávce. To ukazuje, že syntéza vlastních protilátek MBP zůstala aktivní v průběhu a následně po intratekálním podání MBP75-95. Jako důsledek tohoto pozorování bylo MBP75-95 podáváno intravenózně pacientům, kterým byla dříve podána jedna intratekální injekce peptidu. Po intravenózním podání hladiny F a B anti-MBP v mozkomíšním moku významně poklesly, když byly sledovány v průběhu jednoho měsíce. Pokles F stejně jako B anti-MBP v mozkomíšním moku následně po intravenózním podání MBP75-95 naznačuje, že tato cesta podávání způsobuje zeslabení autoimunitního zánětlivého procesu odpovědného za syntézu anti-MBP. V následující studii se začaly hladiny anti-MBP zvyšovat 4 až 6 měsíců po první intravenózní injekci, druhá intravenózní injekce téhož peptidu (posilující injekce) způsobila snížení syntézy anti-MBP až na dva roky zhruba u 70 různých pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex.

MBP epitop pro anti-MBP sklerózy multiplex

Aby bylo blíže určeno umístění MBP epitopu pro anti-MBP sklerózy multiplex, byly přečištěné

F a B anti-MBP z mozkomíšního moku a z mozkové tkáně pacientů se sklerózou multiplex pomocí afinitní chromatografie (Warren, K. G. a kol., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994) podrobeny ve srovnávacím inhibičním testu reakci se 41 po sobě následujícími MBP syntetickými peptidy totožné délky (každý z nich se skládal z 10 zbytků a překrýval přiléhající zbytky o 9) z oblasti mezi zbytky 61 a 110 lidské MBP. Peptid(y) způsobující maximální inhibicí pravděpodobně nej40 více souvisí s místy, která vážou protilátky.

Maximální inhibice (>80%) bylo dosaženo pro přečištěné F i B anti-MBP z mozkové tkáně pacientů se sklerózou multiplex (Obr. 10) čtyřmi dekapeptidy, jmenovitě MBP84-93, MBP8594, MBP86-95 a MBP87-96 za předpokladu, že MBP epitop pro anti-MBP pacientů se skleró45 zou multiplex byl umístěn mezi zbytky 84 a 96. Minimální oblast obecných aminokyselinových zbytků je od zbytku 87 do zbytku 93. B anti-MBP měl více omezený rozsah, než protilátka F.

Úloha protilátek anti-MBP v patogenezi demyenilizace při skleróze multiplex nebyla objasněna a může být určena pouze stanovením zmírnění anti-MBP in vivo a následným pozorováním klinic50 kých a patologických závěrů. Například během akutní recidivy sklerózy multiplex, kdy jsou poměry F/B protilátek větší než jedna, mohou být očkovány intratekálně peptidy, o nichž je známo, že vážou F anti-MBP, aby vázaly volnou obíhající protilátku a ukončily klinické projevy akutní recidivy; může být potřebné týdenní podávání dokud nedojde k remisi. Ό pacientů se sklerózou multiplex s chronickou progresivní nemocí a s vícenásobnými akutními recidivami, může

-16CZ 299535 B6 být potřebné intratekální stejně jako intravenózní podávání peptidů, aby bylo dosaženo snížení zánětlivého procesu, který způsobuje vytváření anti-MBP.

Příklad 3

Vhodné dávkování intratekálního podávání pMBP86-95 nebo pMBP82-98 u pacientů s akutními recidivami ío Recidivy sklerózy multiplex jsou spojeny s poměry F/B anti-MBP většími než jedna díky vyšším úrovním volných než vázaných protilátek v mozkomíšním moku. Většinou, během období 3 měsíců, když recidiva přejde v následné zlepšení/remisi, hladiny anti-MBP postupně klesají a když je biologická remise kompletní, hladiny F a B anti-MBP v mozkomíšním moku se většinou dostanou pod hranici stanovitelnosti. Pacienti, kteří se podíleli na následujících příkladech, měli buď odeznívající, nebo progresivní recidivu sklerózy multiplex.

V tomto a následujících příkladech byl použit buď pMBP86-95, nebo pMBP82-98. pMBP86-95 měl velmi nízkou rozpustnost v normálním solném roztoku, protože obsahuje čtyři hydrofilní a šest hydrofobních zbytků. Naopak, pMBP82-98 měl zvýšenou rozpustnost v normálním solném roztoku důsledkem pěti dodatečných hydrofilních zbytků.

Dva pacienti byli sledování pro stanovení vhodného dávkování intratekálně podávaného pMBP86-95 nebo pMBP82-98, které okamžitě snižují F anti-MBP pod hranici stanovitelnosti. Jeden pacient měl akutní recidivu ataxie a poruchy rovnováhy. Na začátku ataku byla tomuto pacientovi podána jedna intratekální injekce 10 mg pMBP86-95; hladiny F a B anti-MBP byly měřeny před a jednu hodinu po injekci a pětkrát v průběhu dalších tří měsíců. Tato dávka potlačila F anti-MBP pouze částečně a průběh obnovování protilátky byl podobný přirozenému průběhu; tento pacient trpěl dále progresivní spastickou paraparézou a ataxií. To ukazuje, že jedna intratekální injekce 10 mg pMBP86-95 nepostačuje k plnému potlačení F anti-MBP a změně přirozeného tempa jejího obnovování.

Jinému pacientovi, osmnáctileté ženě s akutní optickou neuritidou, byla podána jedna intratekální injekce 50 mg pMBP86-95, byly měřeny hladiny F a B protilátek před a 30 minut po injekci. 30 minut po injekci se staly F protilátky neurčitelné. Pacientka nesouhlasila s následnou lumbální punkcí. Byl tedy učiněn závěr, že dávky alespoň 50 mg jsou nutné k tomu, aby došlo k vazbě a neutralizaci F anti-MBP v mozkomíšním moku po dobu alespoň 30 minut.

Příklad 4

Frekvence a doba podávání pacientům s monosymptomatickou recidivou

V tomto příkladu byly určovány frekvence a doba podávání pMBP, které by udrželo nízké nebo neurčitelné hladiny protilátek F po delší časové období. Čtyřem pacientům sledovaným v této skupině byly podány syntetické peptidy během týdne následujícího po nástupu ataku.

První dva pacienti byli postiženi akutní jednostrannou optickou neuritidou. Jednomu z těchto pacientů (Obr. 11a) byly podány intratekálně dvě injekce 50 mg pMBP 86-95 (it#l, it#2) v odstupu čtyř týdnů. Po každé s injekcí byly F anti-MBP pod hranicí stanovitelnosti během jedné hodiny. Při měření týden po první injekci byly F anti-MBP zvýšené a o čtyři týdny později byly F protilátky významně zvýšené. V tomto období byla pacientovi podána druhá intratekální injekce (it#2) a F anti-MBP byly pod hranicí stanovitelnosti v průběhu 30 minut, ale nebyly následně sledovány 24 hodin. Byl učiněn závěr, že tato frekvence byla nepostačující a že opakované injekce v průběhu prvního týdne ataku mohou být nezbytné k udržení zanedbatelných hladin protilátek.

- 17CZ 299535 B6

Druhému pacientovi s celkovou jednostrannou optickou neuritidou byly podány opakované intratekální injekce peptidu 50 mg pMBP82-98 v průběhu prvního týdne ataku: 4 injekce denně (Obr. 11B: it#l, it#2, it#3, it#4) a pátá injekce (it#5) o týden později. Profil ani-MBP tohoto pacienta ukázal stejnoměrný rychlý pokles v průběhu sedmidenního období. Důležitější bylo, že po 7 týdnech a po 6 měsících od podání it#5 byly hladiny jeho anti-MBP v mozkomíšním moku stále pod hladinou stanovitelnosti a pacient neměl žádné projevy ani optické neuritidy ani jiného typu recidivy sklerózy multiplex. Navíc jednostranná slepota způsobená optickou neuritidou plně odezněla.

Stejným postupem byly podávány denně intratekálně injekce 50 mg pMBP82-98 pacientům se sklerózou multiplex, kteří trpěli různými typy monosymptomatické recidivy. Obr. 11c ukazuje profil anti-MBP pacienta s akutní pseudoatherózou levé ruky, kterému bylo v druhém týdnu ataku intratekálně podáno 5 injekcí denně 50 mg pMBP82-98 (it#l, it#2, it#3, it#4, it#5). Hladi15 ny F protilátek klesly na neurčitelné hodnoty v průběhu 4 dní a zůstaly neurčitelné, když byly hodnoceny o 11 dní a o jeden měsíc později. Tomuto pacientovi se neustále zlepšovala funkce levé ruky, a to dokonce tak, že mohl znovu řídit motocykl a hrát na kytaru.

Poslední pacient měl atak akutní levostranné hemiplegie při chronické progresivní skleróze mul20 tiplex. Byly mu podávány 4 intratekální injekce 50 mg pMBP86-95 každé 2 až 3 dny. Anti-MBP byla měřena před a 30 minut po každé injekci (Obr. 1 ld: it#l, it#2, it#3, it#4) a 10 dní po první injekci. Z počátku zvýšené F anti-MBP se staly nedetekovatelnými během 7 dní, kdy se pacient vrátil klinicky a biochemicky do svého chronického progresivního stavu a brzy poté mu bylo podáno intravenozně 400 mg pMBP86-95. To snížilo úroveň jeho vázaných protilátek na 4 měsí25 ce po intravenózní injekci. Nicméně po poslední lumbální punkci 8,5 měsíců po intravenózní injekci se nemoc vrátila do chronického progresivního stadia klinicky a biochemicky.

Příklad 5

Frekvence a doba podávání pacientům s polysymptomatickými recidivami

Poté byly tytéž MBP peptidy injikovány pacientům s polysymptomatickými ataky, které postihovaly různé oblasti CNS. Tato skupina sestávala ze tří pacientů: jeden s recidivující-odeznívající a dva s recidivující-progresivní nemocí.

První pacientka měla těžké polysympatomatické podráždění. V průběhu prvního týdne recidivy jí byly podány tři injekce 50 mg pMBP86-95 ve dnech 1, 3 a 7 (Obr. 12: it#l, it#2 a it#3). AntiMBP byla měřena před každou injekcí a o 30 minut později. Po aplikaci těchto tří injekcí byla F anti-MBP snížena na téměř nedetekovatelnou úroveň. Zatímco měření o měsíc později ukázalo, že F anti-MBP vzrostla a v průběhu 1,5 měsíce byla recidiva opět klinicky aktivní a biochemicky potvrzena. V tomto období byla pacientce podána druhá sada 4 intratekálních injekcí 50 mg pMBP86-95 ve dnech 45, 48, 49 a 50 recidivy (it#4, it#5, it#6 a it#7). Anti-MBP byla měřena před a 30 minut po každé injekci a dále třikrát v následujících dvou měsících. F anti-MBP byly opět snížené alespoň po dobu dvou týdnů, ale recidiva se u pacientky znovu projevila a tehdy se vrátila úroveň jejích F protilátek na počáteční úroveň před recidivou. Je jasné, že je nutné delší podávání syntetického peptidu, aby bylo dosaženo nízkých/nedetekovatelných úrovní F antiMBP po delší časová období.

Druhý pacient trpěl recidivující-progresivní sklerózou multiplex (Obr. 13). Zpočátku, v období progresivní formy nemoci (F=B) mu bylo podáno intravenozně 500 mg pMBP86-95 (IV#1). Ačkoli hladiny protilátek F i B byly po jednom měsíci poněkud snížené, 9 týdnů po intravenózní injekci byla u pacienta pozorována polysymptomatická klinická recidiva související s velmi zvýšenou úrovní F anti-MBP. V tomto období byly pacientovi podány 3 intratekální injekce 50 mg

-18CZ 299535 B6 pMBP86-95 (it#l, it#2 a it#3) ve dnech 1, 3 a 12 recidivy a anti-MBP byly měřeny před, 30 minut po a 24 hodin po první a třetí injekci. Při sledování o měsíc později se pacient vrátil opět do počátečního klinického a biochemického stavu progresivní spastické paraparézy, a tehdy mu byla během 2 týdnů podána druhá intravenózní injekce 500 mg pMBP86-95 (IV#2).

K získání úrovní F a B anti-MBP v mozkomíšním moku bylo prováděno pravidelné sledování následujících 26 měsíců a bylo zjištěno, že hladiny zůstaly snížené v porovnání se základními hladinami. Jeho schopnost stát a chodit se podstatně zlepšila.

Poslednímu pacientovi této skupiny se sklerózou multiplex v progresivní fázi (F=B), (Obr. 14) ío byl intravenózně podáno 500 mg pMBP86-95 (IV#1). Úroveň anti-MBP v mozkomíšním moku byla měřena po 9 dnech a dále 2 a 4,5 měsíci po IV# 1. Po podání této injekce byly hladiny F a B sníženy po dobu 2 měsíců; 4,5 měsíce po IV# 1 si pacient stěžoval na vzrůstající slabost, což bylo potvrzeno klinicky, stejně jako biochemicky zvýšením hladin protilátky související s chronickou progresivní nemocí. Během dalšího měsíce mu byla podána druhá intravenózní injekce 500 mg pMBP82-98 (IV#2). Analýza mozkomíšního moku získaného těsně před druhou injekcí naznačovala na akutní recidivu (F>B) a následující den se u pacienta objevila akutní diplopie způsobená levou laterální rektální parézou. V této době jasně prodělával klinickou a biochemickou akutní recidivu, která trvala další 4,5 měsíce a byla charakterizována těžkou poruchou rovnováhy při stání a chůzi, slabostí nohou a dvojím viděním. Ve snaze snížit jeho zvýšené F anti-MBP byla tomuto pacientovi podána intratekálně ve dvou kůrách pMBP82-98. Během první kůry započaté

4,5 měsíce od začátku recidivy mu bylo podáno 50 mg pMBP82-98 denně po období 5 dní (it#l, it#2, it#3, it#4 a it#5) a hladiny anti-MBP měřené před a 30 minut po každé injekci zůstaly mírně zvýšené. Protože recidiva přetrvávala a těžce postihovala pacienta, bylo rozhodnuto o podání druhé kůry vyšší dávky peptidu s vyšší frekvencí a pacientovi bylo podáno 100 mg pMBP82-98 dvakrát denně po dobu dvou dnů (den 19 a 20: it#6, it#7, it#8 a it#9). Anti-MBP bylo měřeno před a 30 minut po každé injekci. Následně, díky zvýšenému dávkování a frekvenci, F anti-MBP bylo potlačeno na zanedbatelné hladiny a při testování o týden později (den 28) byl profil jeho mozkomíšního moku srovnatelný s profilem při pomalu progresivní nemoci (F/B anti-MBP=l,0). V této době byla pacientovi podána třetí intravenózní injekce 500 mg pMBP82-98 (IV#3), která již dále nesnížila tvorbu anti-MBP.

Příklad 6

Intravenózní podávání MBP peptidů s cílem předejít budoucím recidivám

Dvěma pacientům s recidivující-progresivní sklerózou multiplex, kteří měli časté recidivy, byl intravenózně injikován buď pMBP86-95, nebo pMBP82-98, aby bylo zjištěno, zda tento způsob podávání bude působit jako prevence následujících ataků.

U první pacientky probíhaly 2 až 3 recidivy za rok po dobu 4 let s následným postupnou progresí spastické paraparézy (Obr. 15). Byly jí podány dvě intravenózní injekce v odstupu 6 měsíců, první 400 mg pMBP86-95 (IV#4) a druhá 400 mg pMBP82-98 (IV#2); klinické sledování a analýzy mozkomíšního moku byly prováděny měsíčně. Obr. 15 ukazuje hladiny anti-MBP během období 9 měsíců (horní orámovaná oblast). První intravenózní injekce snížila tvorbu antiMBP na dobu dvou měsíců. Během třetího měsíce po injekci byla tato pacientka postižena klinickou recidivou; bohužel v této době nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku. Během následujících 2 až 3 měsíců po recidivě, kdy se ukázalo, že nemoc znovu vstoupila do chronické progresivní fáze, byla této pacientce podána druhá intravenózní injekce (IV#2). Hladiny anti50 MBP v mozkomíšním moku se opět snížily na dobu 2 měsíců, ale tři měsíce po druhé injekci měl pacient recidivu související s zjevně zvýšenou F anti-MBP. I přes podání dvou intravenózních injekcí pMBP86-95 a pMBP82-98 měla pacientka 2 až 3 recidivy za rok stejně jako v předchozích 4 letech.

-19CZ 299535 B6

Druhá pacienta (Obr. 16), která mívala 1 až 4 akutní recidivy za rok v průběhu uplynulých 10 let (horní stupnice) byla vážně postižená, paraplegická a upoutána na pojízdné křeslo. V průběhu 11 roku měla pacientka opět 4 recidivy (horní ohraničená oblast) ačkoli jí byly podávány MBP syntetické peptidy intratekálně a intravenózně. V průběhu první recidivy se po intratekálním podání dvou injekcí 50 mg pMBP86-95 dne 1 a dne 6 (it#l, it#2) úroveň její F anti-MBP značně snížila; 6. den jí bylo také podáno intravenózně 300 mg pMBP86-95 (IV), který následně snížil F i B protilátky na dobu následujících 3 měsíců. Čtyři měsíce po intravenózní injekci měla tato pacientka opět klinickou recidivu, která se časem zhoršovala: hladiny protilátek v mozkomíšním moku byly velmi zvýšené a 6,5 měsíce po IV injekcích byla pacientka podrobena kůře 4 injekcí

50 mg pMBP82-98 (it#3, it#4, it#5 a it#6) denně, které však nesnížily hladiny F protilátek a nezabránily klinické recidivě.

Příklad 7

Porovnání různých způsobů podávání peptidu

Ve výchozích studiích byly podávány syntetické MBP peptidy 8 pacientům s chronickou progresivní sklerózou multiplex. Pacientům byl intratekálně podán každému vazebný peptid MBP75-95 nebo nevazebný peptid MBP35-58 jako kontrola v rostoucích dávkách od 1 do 10 mg v 5 ml solného roztoku; čtyřem pacientům, kterým byl zpočátku podán nevazebný peptid (MBP35-58) jako kontrola, byl později podán vazebný peptid MBP(75-95).

Injekce MBP(75-95) do mozkomíšního moku způsobila přechodnou neutralizaci F MBP speci25 fických protilátek; vázané vlastní protilátky MBP nebyly účinné. Účinek přetrvával 1 hodinu (1 mg peptidu), 24 (2,5 mg peptidu) nebo 7 dní (5 až 10 mg peptidu). Protože účinek intratekálního podávání peptidu nebyl úplný (B anti-MBP zůstávaly zvýšené) a byl relativně krátkodobý, byl tento způsob podávání srovnáván s intravenózní injekcí. Oproti intratekálnímu podávání byly jak volné tak vázané vlastní protilátky MBP pod hranicí stanovitelnosti jeden měsíc po jedné intravenózní injekci 500 mg MBP(75-95) a zůstávaly na nízké úrovni po dobu 3 měsíců a po posilující injekci dalších 26 měsíců (Obr. 17). Podobná pozorování bylo učiněna při sledování přibližně 70 pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří byli intravenózně injikováno MBP vazebným peptidem například MBP75-95, MBP86-95, MBP82-98. Dávka 500 mg (mg/kg tělesné váhy) v 10 až 50 ml normálního solného roztoku byla vybrána kvůli většímu množství krve ve srovnání s mozkomíšním mokem (faktor 15) a rychlému vymizení peptidu z krevního řečiště činností ledvin; dávky peptidu odpovídající dávkám podaným intravenózně nebyly podány intratekálně, protože takové množství nemůže být injikováno do mozkomíšního moku. Závěrem lze říci, že intratekální podávání v rozsahu testovaného dávkování u těchto pacientů má za následek přechodné odstranění pouze F anti-MBP, zatímco intravenózní injekce snižují syntézu anti-MBP, jedna intravenózní injekce způsobí dlouho trvající toleranci.

Příklad 8

Doba tolerance po intravenózním podání MBP peptidu

Na základě těchto výsledků byla testována kinetika tolerance k MBP na přibližně 70 pacientech s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří byli sledováni po dobu dvou let a následně jim bylo podáno více intravenózních injekcí MBP(75-95), MBP(86-95) nebo MBP(82-98).

Peptidy byly dávkovány 5 až 6 mg na kg tělesné váhy (256 až 500 mg) a intravenózně injikovány v 10 až 50 ml solného roztoku. Před intravenózním podáním peptidu mělo všech 13 pacientů vysoké hladiny volných a vázaných protilátek MBP v mozkomíšním moku (Obr. 18, tabulka 3). Jeden měsíc po podání peptidu byly specifické protilátky MBP v podstatě pod hranicí stanovitelnosti a zůstaly na nízkých úrovních většinou 3 až 4 měsíce, poté začaly hladiny protilátek opět růst a vrátily se na svou původní úroveň v průběhu 8 měsíců. 6 až 10 Měsíců po (IV#1), byla

-20CZ 299535 B6 všem pacientům podána posilující injekce (1V#2) 275 až 500 mg (5 až 6 mg na kg tělesné váhy) MBP(82-98) v 10 ml solného roztoku (IV#2). Delší peptid vybraný pro druhou injekci byl více rozpustný a mohl být rozpuštěn a podáván v menším množství. V této skupině, jako celku, klesaly hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku dramaticky v 6 týdnech až 2 měsících od injekce a zůstávaly pod hranicí stanovitelnosti po delší dobu (déle než 26 měsíců). V celé skupině přibližně 70 pacientů nebyl jeden schopen dokončit studii kvůli plicní embólii následované protikoagulantní terapií, která zabránila dalším lumbálním punkcím a další pacient byl vyloučen z následujících pokusů, protože dostal vysokou intravenózní dávku kortikosteroidů. Z celkem asi 70 pacientů mělo asi 63 hladiny anti-MBP pod hranicí stanovitelnosti 18 až 26 měsíců po posilující injekci.

Příklad 9

Dlouhotrvající tolerance u pacientů s HLA-DR2 haplotypem

Haplotypy HLA-DR pacientů se sklerózou multiplex byly určeny molekulární analýzou genomové DNA (tabulka 3). Čtyři z jedenácti pacientů, kteří dokončili studii nesli nemoc související s haplotypem DR2 (DRBl*1501 nebo DRB1* 15021); všichni tito pacienti měli nízké nebo neurčitelné hladiny vlastních protilátek rok po druhé intravenózní injekci MBP peptidů. MBP peptid se váže s vysokou afinitou k HLA-DR2 a je imunodominantní pro T buňky, které jsou specifické kMBP a omezené na HLA-DR2. HLA-DR4 (DRBl*0401) a HLA-DR7 (DRBl*0701) vážou MBP peptid, který byl podán; studie vazby nebyly provedeny pro molekuly DR nesené pacienty k(M) (DRB 1*0407, DRB 1*0801). MBP peptid není vázán HLA-DR3 (DRB 1*03011); dva pacienti, kteří měli zvýšené anti-MBP na konci studie nesli DRB 1*03011 haplotyp (tabulka 3). Tyto údaje ukazují, že trvání tolerance MBP závisí na haplotypu HLA-DR pacienta. Tolerance může být dlouhodobější, jestliže jak T buňky specifické k MBP, tak B buňky jsou tolerovány.

Tabulka 3

Haplotypy HLA-DR pacientů se sklerózou multiplex

A. Nízké hladiny celkového anti-MBP v jednom roce po IV#2

Pacient haplotypy HLA-DR Celkové anti-MBP (Ru)

b(F)	DRBl*1501	4,1
e(F)	DRBl*1501 DRB1*13O3	2,5
m(M)	DRB1*15O1 DRBl*010l	3,9
1(F)	DRB1* 15021 DRB 1*0403	3,9
a(M)	DRBl*1401 DRB 1*0701	4,1
f(F)	DRB 1*0701	2,4
k(M)	DRBl*0407 DRB 1*0801	4,5

-21 CZ 299535 B6

B. Zvýšené hladiny celkového anti-*MBP v jednom roce po IV#2

Pacient haplotypy HLA-DR Celkové anti-MBP (Ru) j(M) DRB1 *03011 7,3 h(F) DRBl*0101 DRBl*0701 9,7 g(F) DRBl*0101 DRBl*1101 19,1

I(M) DRB 1*0403 DRB1 *03011 19,0

Haplotypy HLA-DR 11 pacientů trpících sklerózou multiplex, kteří dokončili studii rok po druhé intravenózní injekci peptidu (IV#2). Všichni 4 pacienti s haplotypem HLA-DR2 (DRBl*1501 nebo DRB1* 15021) měli nízké hladiny vlastní protilátky rok po 1V#2.

Příklad 10

Subkutaneální podávání peptidů nezpůsobuje toleranci

Nejvhodnější způsob podávání peptidů byl dále zkoumán pomocí subkutaneální(ch) injekce(í) MBP(82-98) v solném roztoku ve skupině 33 pacientů se sklerózou multiplex. U 26 pacientů sklerózou multiplex neměla vzrůstající množství (1 až 100 mg) jedné subkutaneální injekce MBP(82-98) účinek na hladiny vlastních protilátek MBP v mozkomíšním moku (údaje nejsou prezentovány); Osmi z těchto pacientů byla následně podána intravenózní injekce peptidu a v průběhu dvou měsíců se staly hladiny protilátek v mozkomíšním moku neurčitelné (tabulka 4A). U pěti dalších pacientů, měla celková dávka 900 až 1000 mg (5 x 100 mg, denně 5 po sobě následujících dní s následnou další subkutaneální injekcí 400 nebo 500 mg) za následek pouze mírné snížení úrovní protilátek MBP v mozkomíšním moku (tabulka 4B). Aby bylo zjištěno, zda jsou různé způsoby podávání více účinné, byly dvěma pacientům podány dvě subkutaneální injekce 250 mg MBP(82-98) v odstupu jednoho měsíce (tabulka 4C). Hladiny vlastních protilátek opět nebyly ovlivněny. Celkově vzato, tyto údaje ukazují, že pouze intravenózní podávání MBP peptidu způsobuje dlouhotrvající toleranci k MBP při dávkách peptidu testovaných v této studii.

-22CZ 299535 B6

Tabulka 4

A

ID. pacienta, pohlaví	MBP (82-98) SC mg	Základní úroveň	6-7 týdnů	Čas (měsí- ce)	Základní úroveň	MBP (82-98) IV#1 mg	2 měsíce	4 měsíce
f	b	f	b	f	b	f	b	f	b
E(žena)	5	9,1	11,2	10,2	10,4	6	9,3	9,8	400	1,0	1,1	1,4	1,0
K(žena)	7	2,1	3,4	3,1	5,9	6,5	6,3	6,7	500	1,5	0,8
N(žena)	10	8,1	8,0	7,1	8,1	8	6,6	5,6	500	3,0	3,0*
Qížena)	40	9,1	10,1	10,9	8,3	6	10,0	9,3	400	1,5	1,6	2,1	2,1
R(muž)	50	10,2	10,3	11,1	7,4	6	7,5	9,9	500	1,5	1,6	1,5	1,7
S (žena)	60	4,1	4,3	6,1	5,4	6,5	7,4	7,4	500	1,8	0,9
X(muž)	100	9,9	7,3	9,5	8,2	4,5	9,7	9,0	500	1,4	1,0	1,5	M
Z (muž)	100	9,9	8,4	10,9	10,1	4,5	10,5	9,7	500	2,0	1,9	1,5	1,6
střední hodnota		7,9	7,9	8,6	8,0		8,4	8,4		1,7	1,5	1,6	1,5
stan- dardní odchylka		2,9	2,6	2,7	1,7		1,5	1,5		0,6	0,7	0,3	0,4

ID. pacienta, pohlaví	MBP (82-98) SC mg	Základní úroveň	6-7 týdnů	755 (měsíce)	MBP (82-98) SC mg	7 týdnů
f	b	f	b	f	b
AA(žerta)	100/d x 5	7,7	8,1	4,4	4,9	0,5	400	4,3	3,4
BB (žena)	100/dx5	5,4	5,4	3,5	3,7	0,5	500	2,0	2,5
CC (muž) DD(žena)	100/d x 5 100/dx5	5,9 4,6	5,4 4,8	6,9 2,7	8,8 1,9	0,5	500	3,0	2,8
EE (žena)	100/d x 5	7,4	8,9	3,7	3,9	0,5	500	2,6	2,4
střední hodnota standardní odchylka		6,2 1,2	6,5 1,7	4,2 1,4	4,6 2,3			3,0 0,8	2,9 0,7

Id. pacienta, pohlaví	MBP (82-98) SC mg	Základní úroveň	15 týdnů
f	b	f	b
GG(muž)	250 / m x 2	8,4	8,7	7,1	8,3
FF (žena)	250 / m x 2	4,8	5,3	5,4	4,2

A. Osmi pacientům byla podána jedna subkutaneální injekce MBP(82-98) (5 až 100 mg v 1 až 5 ml solného roztoku), která neměla žádný vliv na hladiny vlastních protilátek MBP. Naopak

-23CZ 299535 B6 jedna intravenózní injekce (400 až 500 mg) stejného peptidu podávaného 4,5 až 8 měsíců později měla za následek snížení hladiny protilátek v mozkomíšním moku pod hranici stanovitelnosti.

B. Opakované subkutaneální injekce vysokých dávek MBP(82-98) (100 mg na den 5 po sobě 5 následujících dnů) mělo malý účinek na hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku. Dodatečná vysoká dávka (400 nebo 500 mg) MBP(82-98) podaná subkutaneálně dva týdny po první sadě injekcí nesnižovala dále hladiny vlastních protilátek.

C. Dvě subkutaneální injekce vysokých dávek MBP(82-98) (2 x 250 mg, po měsíci) neměla ío žádný vliv na vlastní protilátka MBP v mozkomíšním moku. Celkově vzato ukazují tyto údaje, že pouze intravenózní způsob podávání je účinný ve vytváření tolerance k MBP.

Mohou být vytvořeny různé modifikace pro použití s výhodou aniž by se opustil rozsah a meze vynálezu tak, jak je uvedeno v připojených nárocích.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití peptidu vzorce Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, který je schopen u pacientů neutralizovat nebo zmírnit tvorbu protilátek myelinového bazického proteinu, v příměsi s farmaceuticky přijatelným nosičem pro výrobu léčiva pro léčení skle25 rózy multiplex u pacientů s haplotypem HLA-DR2.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde léčivo obsahující peptid je ve formě pro intravenózní, intratekální aplikaci nebo jejich kombinaci.

   30
3. 3. Použití podle nároku 2, kde léčivo obsahuje vhodný peptid, který je ve formě jednotkové dávky pro intravenózní aplikaci v rozmezí od 1 mg/kg tělesné hmotnosti do 10 mg/kg tělesné hmotnosti.
4. 4. Použití podle nároku 2, kde léčivo obsahujíce vhodný peptid, který je ve formě jednotkové

   35 dávky pro intravenózní aplikaci v rozmezí dávky od 1 mg do 100 mg.
5. 5. Použití podle nároku 1, kde haplotyp HLA-DR2 obsahuje alelu DRBl*1501 nebo alelu DRB1*15O21.

   40 6. Použití podle nároku 1 u pacientů trpících chronickou progresivní sklerózou multiplex.