NO325018B1 - Anvendelse av et peptid for fremstilling av et farmasoytisk preparat for behandling av multippel sklerose. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRADE

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et

peptid, som er i stand til å nøytralisere eller modulere produksjon av anti-myelin basisk protein, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for anvendelse i behandling av multippel sklerose.

BAKGRUNN 06 TEKNIKKENS STAND

Multippel sklerose (MS) er en multifokal demyelineringssykdom

i det humane sentralnervesystem (CNS) forbundet med inflammasjon. Økt intra-blod-hjerne-barriere (intra-BBB) IgG syntese er et kjennetegn på MS (Tourtelotte, W.W., J Neurol Sei 10: 279-304, 1970, Link, H. og Tibbling, G. Scand J Clin

Lab Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte, W.W. og Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J.M. og Tourtelotte, W.W.,

In: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. og Tourtelotte, W.W., forfattere, Multiple sclerosis, Baltimore, Williams &

Wilkins, 1982. 275-358; og Warren, K.G., og Catz, I, Ann

Neurol 17: 475-480, 1985).

IgG syntese innen BBB forhøyes generelt i klinisk bestemte MS pasienter (Schumacher, G.A. Beebe, G., Kibler R.E., et al.,

Ann NY Acad Sei 15: 266-272, 1965) med aktiv eller inaktiv sykdom. Spesifisiteten til hoveddelen av CNS IgG er ukjent. Mens en mindre andel har antiviral aktivitet eller reagerer

mot hjerne-antigener, nukleinsyrer, erytrocytter eller glatt muskel-antigener, kan den ikke-spesifikke del representere polyklonal aktivering av B-celler (Tourtelotte, W.W., og Ma,

B., Neurology 28: 76-83, 1978). I løpet av det siste tiår

har det vært en betydelig interesse vedrørende undersøkelse av antistoffer til spesifikke myelinproteiner.

Etter detekteringen av sirkulerende immunkomplekser inneholdende myelin basisk protein (MBP) som deres antigeniske komponent (Dasgupta, M.K., Catz, I, Warren, K.G. et al., Can J Neurol Sei 10: 239-243, 1983), ble det iakttatt økte titere av antistoffer til MBP (anti-MBP) i cerebrospinalvæsken (CSF) til pasienter med aktive former av MS (Warren, K.G. og Catz, I., Ann neurol 209: 20-25, 1986). Klinisk er MS karakterisert ved faser av sykdomsaktivitet slik som akutte relapser eller, kronisk progresjon, og ved faser av klinisk remisjon. Aktiv MS er forbundet med økte nivåer av intrakalt produsert anti-MBP (Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; og Catz, I. og Warren-, K.G., Can J Neurol Sei 13: 21-24, 1986). Disse antistoffene finnes hovedsakelig i fri (F) form under akutte relapser og hovedsakelig i bundet (B) form når sykdommen er snikende progressiv (Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986). Under akutte relapser korrelerte CSF anti-MBP titere med sykdomsaktivitet (Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Anti-MBP nivåer ble også økt i pasienter med første angrep av optikusnevritt og i de fleste pasienter som opplever første angrep av MS (Warren, K.G., Catz. I., og Bauer, C, Ann Neurol 23: 297-299, 1988; Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 91: 143-151, 1989) .

Longitudinelle kinetikkundersøkelser av CSF anti-MBP nivåer i pasienter som går inn i restitusjonsfasen etter en akutt relaps viste en gradvis nedsettelse i F anti-MBP titere som svarer til en progressiv stigning i B fraksjoner (Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 91: 143-151> 1989; Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol. Sei 88: 185-194, 1988). I remisjonsfasen kan CSF anti-MBP bli udetekterbar og dette antyder en anti-MBP nøytralisering forbundet med inaktive faser av MS (Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 88: 185-194, 1988). I motsetning var kronisk progressiv MS karakterisert ved persistens av økt anti-MBP over lange" tidsperioder forbundet med inhibering av anti-MBP nøytralisering (Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 88: 185-194, 1988). Nylig inneholdt en myelin basisk protein antistoff-kaskade, identifisert i IgG fraksjonen renset fra CSF til MS pasienter, anti-MBP, antistoffer som nøytraliserer anti-MBP og antistoffer som inhiberer anti-MBP nøytralisering (Warren, K.G. og Catz, I., \J Neurol Sei 96: 19-27, 1990). Vår tidligere forskning har vist fra det B-celle autoimmune synspunkt at det er minst to distinkte former av MS idet hoveddelen av pasientene har autoantistoffer til myelin basisk protein (anti-MBP) og et mindre antall har antistoffer til proteolipid protein (ahti-PLP) (Warren, K.G. et al., Ann Neurol 35, 280-289, 1994). I anti-MBP forbundet MS er akutte relapsér forbundet med forhøyede (høyere enn 1) fri

(F)/bundet (B). anti-MBP forhold mens den kroniske progressive fase er karakterisert ved F/B anti-MBP forhold lik eller

mindre enn 1, og pasienter i remisjon har enkelte ganger svakt forhøyede B anti-MBP titere (Warren, K.G. og Catz, I.., J Neurol Sei 88, 185-194, 1989).

Det er blitt vist at noen av de proliferende T-celler i MS pasienter er rettet mot MBP (Allegretta et al., Science, 247, 718-721, 1990) og at humane T-celler kan gjenkjenne multiple epitoper på molekylet (Richert et al., J. Neuroimmun 23, 55-66, 198 9). MBP viser seg også å være i stand til å aktivere noen T-celler uten at antigen-presenterende celler er engasjert (Altman et al., Eur. J. Immun. 17, 1635-1640, 1987). Det er sannsynlig at små peptider av MBP kan gjen-kjennes av T-celler uten behovet for intracellulær behandling, ganske enkelt ved deres evne til å binde klasse II større histokompatibilitets-antigener på overflaten av presenterende celler.

Siden eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en akseptert dyremodell for MS, kan induseres ved inokulering av mottagelige gnagere med enten MBP eller PLP i forbindelse med Freund's adjuvans, kan prosessen med MS demyelinering ha en autoimmun mekanisme (Fritz, R.B. et al., J. Immunol. 130, 1024-1026, 1983, Trotter, J.L. et al., J Neurol Sei 79, 173-188, 1987). Fra et B-celle autoantistoff synspunkt har MBP epitopen targetrettet ved sykdomsprosessen blitt lokalisert proksimalt til tri-Prolil sekvensen (rester -99-100-101-) til et område mellom rester 80 og 100 (Warren, K.G. ét al., Ann Neurol 35, 280-289, 1994). Denne B-celle epitop overlapper den immundominante epitop for T-celler som er reaktive

overfor MBP, som finnes i MS hjernelesjoner (Oksenberg, J.R.

et al., Nature, 362, 68-70, 1993).

Tidligere undersøkelser har vist at anti-MBP nøytraliseres

ved hjelp av MBP. Tidligere forsøk på å behandle MS ved intramuskulær eller subkutan administrering av heterologt MBP har imidlertid ikke vært vellykket (Campbell, B., Vogel,

R.J., Fischer, E. og Lorenz, R., Arch Neurol 29:10-15, 1973; Gonsette, R.E., Delmotte, P. og Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977, og Romine, J.S. og Salk, J., In.- Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. og Tourtelotte, W.W., forfattere Multiple sclerosis, Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Problemet med bruk av nativt MBP er dobbelt. For det første

er proteinet fremstilt fra prøver av human hjerne og det er følgelig en potensiell fare for at latente nevroviruser kan være tilstede i prøven.. For det andre, selv om oppløselig MBP ikke vanligvis er et immunogen, er det mulig at opp-

løselig MBP ved administrering til individer med et endret immunsystem kan virke som et antigen og forårsake produksjon av antistoffer mot MBP.

Følgelig bestemmer den foreliggende oppfinnelse hvorvidt anti-MBP renset fra CSF til MS pasienter kan nøytraliseres ved hjelp av valgte oppløselige peptider av humant MBP (h-

MBP). For dette formål ble oppløselige syntetiske peptider

som dekker hele lengden av h-MBP anvendt til å bestemme det mulige opitopområdet på h-MBP som nøytraliserer anti-MBP oppnådd fra disse pasientene. Valgte oppløselige peptider,

som viser nøytralisering av anti-MBP, kan derfor anvendes til å behandle MS mer effektivt enn hele molekylet. Disse opp-løselige peptider er syntetisk fremstilt og det vil som sådan ikke foreligge noen potensiell risiko for nevroviruser. På grunn av deres lille størrelse kan disse peptidene i tillegg ikke virke som et immunogen. Anvendelsen av valgte peptider som en behandling for MS vil derfor overvinne problemene som er identifisert med bruk av det native protein.

Peptidet anvendt i den foreliggende oppfinnelse ble videre undersøkt for å bestemme dets effektivitet med hensyn til binding eller modulering av produksjonen av MS anti-MBP in vivo.

WO 96/12737 omhandler isolerte peptider og kombinasjoner av peptider avledet fra myelin auto-antigener inkluderende MBP som er egnet for behandling av multippel sklerose.

WO 93/21222 omhandler peptider av humant myelin basisk protein og særlig aminosyresekvenser inneholdende den immunodominerende epitop av humant myelin basisk protein. Metoder for undertrykkelse av autoimmune responser ved administrering av de humane myelin basiske proteinpeptider er også omhandlet.

WO 93/08212 omhandler syntetiske peptider, som er hovedsakelig homologe i sekvens til en del aminosyresekvensen av et humant myelin protein. Disse peptider varierer i lengde fra omtrent 8 aminosyrerester til omtrent 25 aminosyrerester og svarer til aminosyresekvensen av det humane myelin basisk protein (h-MBP) fra omtrent aminosyrerest 61 til omtrent aminosyrerest 106.

WO 96/12731 omhandler peptid-spesifisitet til anti-myelin basisk protein og administrering av myelin basiske proteinpeptider til pasienter med multippel sklerose.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse anvender et peptid som er hovedsakelig homologt i sekvens til en del av aminosyresekvensen av et humant myelin basisk protein. Dette peptidet er i stand til å nøytralisere eller modulere produksjonen av anti-MBP .

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således anvendelse av et peptid med formelen: Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, som er i stand til å nøytralisere eller modulere produksjon av anti-myelin basisk protein, til fremstilling av et farma-søytisk preparat for anvendelse i behandling av multippel sklerose i en pasient som har kronisk progressiv multippel sklerose.

Andre utførelsesformer av anvendelsen i henhold til oppfinnelsen fremgår av de uselvstendige patentkrav.

Eksempler på peptider som ikke anvendes i oppfinnelsen er valgt fra: MBP75-95 MBP64-78 MBP61-75 MBP69-83 MBP80-97 i MBP91-106 MBP84-93 MBP85-94 MBP86-9S MBP87-96

For identifikasjonsformål anvendes MBP82-98 og MBP(82-98) heri til å indikere peptidet:

MBP82-98

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. l viser lokaliseringen av atten syntetiske peptider (små tall) i forhold til det intakte human-MBP molekyl. Peptider representeres ved vertikale staver anbragt ved siden av deres tilsvarende region på MBP molekylet. Store tall representerer aminosyrerester på humant MBP. Fig. 2 viser inhiberingskurver for anti-MBP, renset og samlet fra ti forskjellige pasienter med multippel sklerose, ved humane MBP og MBP-peptider. Fig. 3 viser nøytralisering av anti-MBP isolert fra en enkelt pasient med multippel sklerose ved humant MBP og peptider MBP80-97; MBP91-106 og MBP75-95. Fig. 4 -longitudinell overvåkning av CSF anti-MBP titere i en pasient med kronisk progressiv MS: F(frie) og B(bundede) nivåer av anti-MBP ble vedvarende forhøyet ved prøvetagning 26 ganger over en periode på 11 år fra 1983 til 1993.

cpm: tellinger pr. minutt

åpne sirkler: Bundet (B) anti-MBP bestemt etter syrehydrolyse

av CSF immunkomplekser.

fylte sirkler: Fri (F) anti-MBP

Fig. 5 - kontrollpasienter: CSF anti-MBP nivåer i 2 "tids-kontroller" (1F56, Fig. 5A og 3M66, fig. 5B) og 2 "tid-saltoppløsning kontroller" (4M45, fig. 5C og 5M59, fig. 5D). I alle fire pasienter forble F og B anti-MBP konstant forhøyet ved basislinjenivå når

prøver ble tatt av CSF hvert 30. minutt i de første 2 timer såvel som 24 timer senere. Symboler er som i fig. 4.

Fig. 6 - peptidundersøkelser mellom pasienter: CSF anti-MBP

nivåer i en gruppe på fire pasienter (10F38, fig. 6A;

13F43, fig. 6C; 5M59, fig. 6D; og 3M66, fig. 6G) som mottok økende mengder (henholdsvis 1, 2,5, 5 og 10

mg) av et ikke-bindende syntetisk kontrollpeptid MBP35-58 og en paret gruppe av fire andre MS pasienter (6F53, fig. 6B; 8M41, fig. SD; 4M45, fig. 6F; og 1F56, fig. 6H) som mottok økende mengder (henholdsvis 1, 2,5, 5 og 10 mg) av det anti-MBP bindende syntetiske peptid MBP75-95. CSF F anti-MBP ble bundet på en doseavhengig måte av peptid MBP75-95 og det reagerte ikke med peptid MBP35-58. Bundet anti-MBP forble praktisk talt upåvirket.

Fig. 7 - peptidundersøkelser mellom pasienter: når MS

pasienter var enten "tidskontroller" (1F56, fig. 7C og 3M66, fig. 7D) eller "tid-saltoppløsning kontroller" (5M59, fig. 7A og 4M45, fig. 7B), eller når de mottok det ikke-bindende kontrollpeptid MBP35-58 (5M59 og 3M66) forble deres F og B CSF anti-MBP

nivåer upåvirket. Når de samme pasienter 4M45, 1F56 og 3M66 senere mottok 5-10 mg av det anti-MBP bindende peptid MBP75-95, ble deres F anti-MBP i motsetning udetekterbart i perioder på opptil 7 døgn og returnerte til basislinjenivå mellom 10 og 21 døgn.

Fig. 8 r gjentatte intratekale injeksjoner av syntetisk peptid: en pasient med kronisk progressiv MS mottok 10 ukentlige injeksjoner av 10 mg MBP75-95 inokulert

direkte i CSF. F og B titere av anti-MBP ble målt før (sirkler) og 3 0 minutter etter (firkanter) hver inokulering. F anti-MBP (fylte sirkler og firkanter) ble gjort udetekterbare i den 10 ukers perioden mens B antistoff forble hovedsakelig uendret (åpne sirkler og firkanter).

Fig. 9 - intravenøs administrasjon av syntetisk peptid: CSF

anti-MBP nivåer etter en enkelt intravenøs injeksjon av 500 mg MBP75-95: både F og B anti-MBP nivåer avtok signifikant ved testing 10, 16 og 30 døgn etter injeksjon. Symboler er som i fig. 4.

Fig. 10 - ytterligere rensing av MBP epitopen for MS anti-MBP

under anvendelse av et sett av 41 dekapeptider som dekket området mellom rester 61 og 110.

Forklaring:

staver representerer prosent inhibering = 100 - radio aktivitet senhet er MBP og peptid MBP75-95 ble anvendt som positive kontroller og ga fullstendig (100 %) inhibering av både F og B antistoff peptider MBP51-60 og MBP111-120 ble anvendt som negative kontroller og ga usignifikant inhibering (0-10 %) av F og B anti-MBP dekapeptider MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 og MBP87-96 som ga maksimum inhibering (90-100 %) av både F og B antistoff er i høy grad forbundet med den MBP epitop stiplede linje: 95 % konfidensgrenser for inhiberings- analysen Fig. Ila viser fri (F)-• og bundet (B)-0 CSF anti-MBP i en pasient med unilateral optikusnevritt som intfatekalt mottok to injeksjoner (it#l og it#2) av 50 mg pMPB86-95, med 4 uker i mellom, w = antall uker.. Fig. 11b viser fri (F)-• og bundet (B)-0 CSF anti-MBP nivåer i en pasient med fullstendig unilateral optikusnevritt som mottok flere.intratekale injeksjoner (it#l, it#2, it#3, it#4 og it#5) av 50 mg pMBP82-98 under den første uken med relaps. Fig. lic viser fritt (F)-• og bundet (B)-0 CSF anti-MBP

nivåer i en pasient med pseudoaterose som fem ganger daglig mottok intratekale injeksjoner (it#l, it#2, it#3, it#4 og it#5) av 50. mg pMBP82-98.

Fig. Ild viser fritt (F)-• og bundet (B)-0 CSF anti-MBP

nivåer i en pasient med relapserende-progressiv MS som mottok fire intratekale injeksjoner (it#l, it#2,

it#3 og it#4) av 50 mg pMBP86-95 hver andre til tredje dag under den første uken av en relaps og en intravenøs injeksjon (IV) av 4 00 mg pMPB86-95 når sykdommen på ny gikk inn i den progressive fasen.

Fig. 12 viser fritt og bundet CSF anti-MBP nivåer i en pasient med en polysymptornatisk relaps som totalt, mottok sju intratekale injeksjoner av 50 mg pMPB86-95. Ingen CSF prøve ble ervervet 3 0 minutter etter

it#2. En CSF prøve ble ervervet 24 timer senere. Symboler er som i fig. 11.

Fig. 13 viser fritt og bundet CSF anti-MBP nivåer i en pasient med relapserende-progressiv MS som mottok både intratekale (it#l, it#2 og it#3) og intravenøse (IV#1 og IV#2) injeksjoner av pMPB86-95. Ingen CSF prøve ble ervervet før eller etter it#2. Symboler er som i fig. 11. Fig. 14 viser fritt og bundet CSF anti-MBP nivåer i en pasient med relapserende-progressiv MS som mottok intravenøs (IV#1, IV#2 og IV#3) og intratekal (it#l til it#9) injeksjon av pMPB86-95 og pMPB82-98. Symboler er som i fig. 11. Fig. 15 viser forsøket på å hindre fremtidige relapser i en pasient med relapserende-progressiv MS som mottok to intravenøse injeksjoner (IV#1 og IV#2) av 400 mg pMPB86-95 og pMPB82-98. Ingen CSF prøve ble ervervet under den første relapsen, 3 måneder etter IV#1. En naturlig grad av relapser er representert øverst ved hjelp av piler som svarer til måneden for angrepet. Innrammet område representerer tidspunktet for

forsøket. Symboler er som i fig. 11.

Fig. 16 viser forsøket på å hindre fremtidige relapser i en pasient med relapserende-progressiv MS som mottok to intratekale (it#l og it#2) og en. intravenøs injeksjon (IV) av pMPB86-95. I, høy dose av intravenøst metyl-prednisolon. En naturlig grad av relapser er

representert øverst ved hjelp av piler som svarer til måneden for angrepet. Innrammet areal representerer tidspunktet for forsøket. Symboler er som i fig. 11.

Fig. 17 viser effekten av intratekal og intravenøs peptid administrering åv MBP spesifikke autoantistoffer i CSF hos en kronisk progressiv MS pasient, hvor pMBP75-95 i fig. 17a ble injisert direkte i CSF (2,5 mg saltoppløsning) og MBP spesifikke auto-antistof f er ble målt ved hjelp av en fastfase-radioimmunoassay ved forskjellige tidspunkter (0,5 time til 7 døgn etter injeksjon). Peptidinjeksjon

resulterte i forbigående nøytralisering av fritt anti-MBP (fylte sirkler), men påvirket ikke bundet anti-MBP (åpne sirkler). Autoantistoffer var udetekterbare ved 1 og 2 timer og begynte å returnere til basislinjeverdier mellom 12 og 24 timer etter injeksjon. Lignende iakttagelser ble gjort hos sju andre pasienter med kronisk progressiv MS. I fig. 17b tretten måneder etter intratekal peptidinjeksjon vist i fig. 17a, ble 500 mg pMBP75-95 injisert intravenøst i 50 ml saltoppløsning og MBP spesifikke antistoffer i CSF ble målt over en 3 måneders periode (gjennomsnitt + standardavvik).

Fig. 18 viser en sammensetning av CSF anti-MBP nivåer i tretten pasienter med kronisk progressiv MS som ble gitt en intravenøs injeksjon (IV#1) av 5 til 6 mg/kg kroppsvekt (256-500 mg i normal saltoppløsning) av pMBP75-95 (2 pasienter) eller pMBP86-95 (11 pasienter) . Både fritt og bundet anti-MBP (henholdsvis fylte og åpne sirkler) ble bestemt. Nivåer av autoantistoff var lave eller udetekterbare mellom en og fire måneder etter IV#1, når de begynte å returnere til basislinjenivåer. Mellom 6 og 10 måneder etter IV#1 mottok alle pasienter en andre intravenøs

injeksjon av pMBP82-98 ved den samme dose (IV#2).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse anvender et peptid, som er hovedsakelig homologt i sekvens til en del av aminosyresekvensen av et humant myelin basisk protein. Med "hovedsakelig homologt" menes at noe variasjon mellom aminosyresekvensen til humant myelin basisk protein og peptidet kan foreligge forutsatt at peptidet, med én variasjon i aminosyresekvens, likevel fungerer i sin til-tenkte anvendelse, dvs. til å nedregulere produksjonen av antistoffer til humant myelin basisk protein (anti-MBP). Gitt det som læres i den foreliggende oppfinnelse vil det på en enkel måte være åpenbart for fagkyndige på området å bestemme, empirisk, hvilken variasjon som'kan gjøres i sekvensen av de valgte peptider uten å innvirke på funksjonen til peptidene.

Basert på ytterligere arbeid relatert til den foreliggende oppfinnelse på basis av de konkurrerende inhiberingsanalyser ved anvendelse av en serie av 41 dekapeptider, har MBP epitopen for MS anti-MBP blitt renset og lokalisert til et område mellom aminosyre 86 og aminosyre 95. Basert på det høyeste inhiberingsnivå (lik eller høyere enn 95 %) av B-anti MBP, er MBP epitopen for MS anti-MBP mellom aminosyre 86 og aminosyre 95. Den minste felles region av de effektive dekapeptider er fra aminosyre 87 til aminosyre 93. I samsvar med den foreliggende oppfinnelse illustreres peptidet således ved den følgende formel:

De 7 aminosyrer som spenner over aminosyre-posisjon 87 til 93 ville trolig ikke være stort nok til effektivt å binde anti-MBP.

Peptidet anvendt i den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles i samsvar med alminnelig akseptable metoder for syntetisering av polypeptider. Peptider produsert ved hjelp av. rekombinant DNA teknologi er også inkludert innenfor rammen av betegnelsen "peptid". Med kjennskap til sekvensen av det valgte peptid, som omhandlet i den foreliggende oppfinnelse, er det innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelsen å bestemme en passende DNA sekvens, som vil kode for den valgte aminosyre-sekvens. Den passende DNA sekvens kan pro-duseres ved hjelp av vanlige kjente metoder for syntetisering av DNA sekvenser. De således produserte DNA sekvenser kan deretter klones inn i passende kloningsvehikler og anvendes til å transformere en passende vertscelle til å produsere det rekombinante peptid. All den metodikk som det refereres til ovenfor er vanlig og velkjent for fagkyndige på området.

Peptidet anvendt i den foreliggende oppfinnelse er hovedsakelig homologt i sekvens til en del av aminosyre-sekvensen av humant myelin basisk protein. Med "en del av aminosyre-sekvensen" menes det at sekvensen kan ha en hvilken som helst lengde forutsatt at aminosyre-sekvensen er lang nok til å fungere til å nedregulere produksjon av anti-humant myelin basisk protein, men ikke med en lengde som ville resultere i problemer i henhold til teknikkens stilling hvor MBP peptider ble anvendt for in vivo behandling, av multippel sklerose.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse er det blitt bestemt at valgte peptider som hovedsakelig svarer til aminosyre-sekvensen av h-MBP er effektive ved nedregulering av produksjon av anti-MBP. Disse peptidene svarer til aminosyre-sekvensen av h-MBP fra omtrent rest 61 til omtrent 106. I et eksempel svarer disse peptidene til aminosyre-sekvensen av h-MBP fra rest 75 til omtrent rest 106, når peptidene anvendes for nøytralisering av fritt anti-MBP. I et ytterligere eksempel svarer disse peptidene til aminosyre-sekvensen av h-MBP fra omtrent rest 82 til omtrent rest 99, når peptidene anvendes for nøytralisering av F anti-MBP eller nedregulering av syntese av F og B anti-MBP. Derfor er peptidene valgt fra 10 aminosyre-rester til 25 aminosyre-rester tatt fra en kontinuerlig aminosyre-sekvens innen sekvensen vist nedenfor (SEQ ID N0:1), forutsatt at denne sekvensen kan nøytralisere eller modulere produksjonen av anti-myelin basisproteinet.

SEQ ID NO: 1

Eksempler på peptider som ikke anvendes i oppfinnelsen er valgt fra gruppen bestående av: MBP61-75 MBP64-78 MBP69-83 , MBP75-95 MBP80-9? MBP91-106

Eksempler på peptider som ikke anvendes i oppfinnelsen er valgt fra: MBP84-93 MBP85-94 MBP86-95 MBP87-96

Peptidet som anvendes i oppfinnelsen:

MBP82-98

Peptidet MBP82-98 anvendt i oppfinnelsen har en forbedret oppløselighet i forhold til de andre angitte peptider som ikke anvendes i den foreliggende oppfinnelse, på grunn av de fem ytterligere hydrofile rester i dette peptidet.

Den potensielle rollen til anti-MBP i patogenesen av MS utforskes fremdeles. Økte anti-MBP titere i pasienter med aktiv MS ble initialt rapportert av Panitch et al (Panitch, H.S., Hooper, C.S., og Johnson, K.P., Arch Neurol 37:206-209, 1980) som benyttet en fastfase-radioimmunoassay med marsvin MBP. Pasienter med akutte MS relapser har vanligvis økt anti-MBP hovedsakelig i fri form, mens noen pasienter i klinisk remisjon kan ha udetekterbare anti-MBP nivåer. Under overgangsfasen fra en akutt relaps til remisjon avtar titere av fritt anti-MBP progressivt i løpet av uker eller måneder, mens bundede fraksjoner av antistoffet øker sammenlignet med deres initiale verdi. I andre pasienter i remisjon er det mulig å iaktta lave titere av fritt og bundet anti-MBP, vanligvis med et F/B forhold under enhet, hvilket antyder at ett eller flere anti-MBP nøytraliserende antistoffer er bundet til anti-MBP. Pasienter som passer til kriteriene for klinisk bestemt MS eller pasienter som fikk nevropatologisk bekreftet MS hadde leilighetsvis udetekterbart anti-MBP under aktive faser av sin sykdom. Det er mulig at slike pasienter har antistoffer til andre myelinproteiner. Fraværet av et spesifikt antistoff-scenario opphever ikke den potensielle viktigheten av anti-MBP i demyeliniseringsmekanismen i hoveddelen av MS pasienter.

I den senere tid ble en MBP antistoff-kaskade iakttatt i IgG fraksjonen renset fra MS CSF (Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 96:19-27, 1990). Primære antistoffer til MBP i både frie og bundede former forekommer i forbindelse med aktiv sykdom: F/B forhold er over enhet i pasienter med akutte relapser, og under enhet i pasienter med kronisk progressiv sykdom (Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 209:20-25, 1986; Catz, I og Warren, K.G., Can J Neurol Sei 13:21-24, 1986; og Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 21:183-187, 1987). Sekundære antistoffer som nøytraliserer anti-MBP fremtrer når sykdommen blir inaktiv. Tertiære antistoffer som inhiberer anti-MBP nøytralisering er tilstede når sykdommen er kronisk progressiv og svikter med hensyn til å bli inaktiv. Det forhold at en MBP antistoff-kaskade er forbundet med særskilte faser av MS antyder dens mulige viktig-het vis-a-vis den naturlige historien til denne sykdommen.

Selv om anti-MBP kan detekteres i CSF til pasienter med aktiv MS, gjenstår deres direkte rolle i demyeliniserings-patogenesen å bli bekreftet. Engasjementet av anti-MBP i mekanismen ved MS kan best bestemmes ved deres nedregulering, in vivo, muligens ved administrering av valgte peptider og overvåking av det kliniske forløp ay sykdommen. Hvis anti-MBP er det eller de eneste primære antistoffer forbundet med demyelinisering i MS kan det være mulig å blokkere denne prosessen ved intratekal og/eller intravenøs administrering av det valgte MBP peptid som vil nedregulere anti-MBP og vil fremme toleranse overfor MBP in situ. Andre humane myelinproteiner kan også være involvert i demyeliniseringen i MS,

og det kan anvendes peptider som er hovedsakelig homologe i sekvens til en del av aminosyre-sekvensen av disse andre, myelinproteiner til å nedregulere de tilsvarende antistoffer. Selv om tidligere forsøk på å behandle MS ved intramuskulær eller subkutan administrering av heterologt MBP ikke i sin helhet har vært vellykket (Campbell, B., Vogel, R.J., Fisher, E. og Lorenz, R., Arch Neurol 29:10-15, 1973; Gonsette, R.E., Delmotte, P. og Demonty, L. J Neurol 216:27-31, 1977.; og Romine, J.S. og Salk, J., In: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M.

og Tourtelotte, W/.W., forfattere, Multiple sclerosis, Baltimore,.Williams & Wilkins, 1982:621-630) har intratekal og/eller intravenøs administrering av MBP peptidet som nøytraliserer eller nedregulerer produksjonen av anti-MBP, i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, vist mer for-delaktige, resultater.

Dyremodellen for MS, eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), er en T-celle mediert demyeliniseringssykdom. EAE kan bedres ved intraperitoneal inokulering av rammede mus med MBP syntetiske peptider (Gaur, A. et al., Science 258, 1491-1494, 1992). Administrering av høye doser av MBP peptider deleterte videre autoreaktive T-celler og motvirket kliniske og patologiske tegn på EAE i mus (Critchfield, J.M. et al., Science 263, 1139-1143, 1994). Selv oral administrering av MBP modulerte EAE ved indusering av perifer toleranse (Chen, W. et al., Science 265, 1237-1240, 1194). En kombinasjon av myelinantigener eller syntetiske peptider av disse antigener administrert ved intravenøse og/eller intratekale ruter kan være nødvendig for å modulere T-cellene, B-cellene og makro-fagene som er involvert i ødeleggelsen av myelin i MS pasienter.

I forbindelse med oppfinnelsen kan det fremstilles farmasøy-tiske preparater som inneholder som en aktiv bestanddel et peptid som beskrevet ovenfor, enten alene eller i kombinasjon, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på farmasøytisk akseptable bærere er velkjent på området og inkluderer f.eks. vanlig saltoppløsning.

Peptidet anvendt i den foreliggende oppfinnelse kan administreres i mennesker for behandling eller modulering av multippel sklerose. Den terapeutiske dose, for intravenøs administrering, for behandling av MS kan være fra omtrent 1,0 mg pr. kg kroppsvekt til omtrent 10,0 mg pr. kg kroppsvekt. For intratekal administrering kan den totale dose være fra omtrent 1 til omtrent 100 mg. I ett eksempel i henhold til den foreliggende oppfinnelse administreres peptidet enten intravenøst eller intratekalt, eller i kombinasjon. Peptidet kan administreres som en enkelt eller sekvensiell dose, noe som kan.være nødvendig.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse ble intravenøs administrering funnet å nedregulere både fritt og bundet anti-MBP, mens intratekal administrering kun var effektiv ved nøytralisering eller modulering av fritt anti-MBP.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse ble det funnet at fortløpende intratekal administrering av MBP peptidet kunne redusere F anti-MBP, og opprettholde dets lave nivåer i måneder etter at peptidet var injisert i pasienter som lider av monosymptomatiske relapser. I ett eksempel ble 50 mg av et peptid av MBP administrert til en pasient daglig i 4 til 5 døgn. I enda et ytterligere eksempel kan en ytterligere dose administreres en til to uker etter de initiale injeksjoner.

Mens denne oppfinnelsen er beskrevet detaljert med spesiell referanse til foretrukne utførelsesformer av denne, frembys de etterfølgende eksempler for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1 (Referanseeksempel)

ln vitro nøytralisering av anti-humant myelin basisk protein Fig. l viser lokaliseringen av 18 peptider av h-MBP anvendt i denne undersøkelsen i forhold til det intakte MBP molekyl. Nativt MBP ble isolert fra ikke-MS hjernevev (Diebler, G.E., Martenson, R.E., Kies, M.W., Prep Biochem 2:139-165, 1972) og ytterligere renset ved gelfiltrering og revers fase høy-trykks -væskekromatograf i (HPLC). De endelige antigenprepa-rater ble kontrollert med hensyn på renhet ved hjelp av SDS-polyakrylamid gel elektroforese. Kun preparater som migrerte ved en molekylvekt på 18,5 KD ble anvendt i videre under-søkelser. Renset MBP ble anvendt i antigen-spesifikk affinitetskromatografi, i nøytraliseringsundersøkelser og i fastfase anti-MBP radioimmunoassay.

Atten peptider som dekker lengden av h-MBP og som inneholder mellom 8 og 25 aminosyre-rester ble syntetisert ved hjelp av Fmoc-metoden som tidligere beskrevet (Groome, N.P., Dawkes, A., Barry, R. et al. J Neuroimmun 19:305-315, 1988). Peptid-renhet ble kontrollert ved hjelp av revers-fase HPLC med en C18 kolonne og vann/acetonitril gradient (0,1 % TFA). Aminosyreanalyse av peptider ble også utført ved anvendelse av standard analyse. Mange av peptidene anvendt i denne under-søkelsen inneholdt en unaturlig cystein-rest etter som de var fremstilt til å funksjonere som immunogener i forbindelse med Freund's adjuvans. Det er lite trolig at dette virker inn på de foreliggende funn.

Cerebrospinalvæske (CSF) ble ervervet i løpet av en uke fra begynnende symptomer fra 3 5 pasienter med akutte MS relapser og IgG nivåer ble bestemt ved hjelp av nefelometri. CSF prøver benyttet i denne undersøkelsen ble valgt til å ha initialt høye absolutte IgG nivåer 0,080 g/l) og økte titere av anti-MBP (F/B forhold >> 1,0). Alle MS pasienter hadde klinisk bestemt sykdom.

IgG ble renset fra konsentrert CSF til pasienter med akutt MS ved hjelp av protein A-Sepharose (Pharmacia) affinitetskromatografi som tidligere beskrevet (Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 96:19-27, 1990). Renheten av hvert IgG preparat ble kontrollert ved hjelp av polyakrylamid gel elektroforese og isoelektrisk fokusering. Når forhøyede anti-MBP nivåer fra renset IgG ble absorbert til null med MBP, inneholdt supernatantene etter absorpsjon resterende IgG hvilket indikerer at anti-MBP representerer kun en fraksjon av det forhøyede IgG.

Renset(MBP ble koblet tii CNBr-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia) i samsvar med produsentens instruksjoner. Renset CSF IgG inneholdende økte anti-MBP nivåer fra 3 5 pasienter med akutte MS relapser ble anvendt til å isolere anti-MBP ved hjelp av MBP-Sepharose affinitetskromatografi (Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 103:90-96, 1991). Rensede anti-MBP prøver ble sammenlignet med den initiale IgG kilde ved hjelp av polyakrylamid gel elektroforese. Når rensede anti-MBP prøver var absorbert til null med MBP, inneholdt supernatantene etter absorpsjon intet resterende. IgG hvilket indikerer renheten til anti-MBP.

Konstante mengder av anti-MBP (15 radioaktivitet-bindings-enheter svarende til 100 for målestokk-utvidelsesformål =

0 %) ble inkubert med økende mengder av h-MBP (0-1000 ng) eller individuelle peptider av MBP (0-10.000 ng) i en væske-faseanalyse og etter inkubering i 1,5 timer ble nivåer av fritt anti-MBP bestemt i alle blandinger.. Anti-MBP isolert fra 7 individuelle MS pasienter eller samlet anti-MBP fra 10 forskjellige MS pasienter ble anvendt i nøytraliserings-

forsøk. Kalvebrissel-histon og humant serumalbumin ble anvendt som negative antigen-kontroller (område: 10-1000 ng) . Et monoklonalt antistoff (MAb) til peptid MBP64-78 og et polyklonalt kanin-antiserum til peptid MBP1-8 ble anvendt som positive antistoff-kontroller (Groome, N., Harland, J., og Dawkes, A., Neurochem Int 7:309-317, 1985; Barry, R., Payton, M., og Groome, N., N Neurochem Int 2:291-300, 1991). Et annet mus-monoklonalt antistoff til epitop 45-50 ble anvendt som negativ antistoff-kontroll.

Anti-MBP nivåer ble bestemt ved hjelp av fastfase-radioimmunoassay med humant MBP (Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 209:20-25, 1986; Warren, K.G. og Catz, I., Ann Neurol 21:183-187, 1987; og Warren, K.G. og Catz, I., J Neurol Sei 91:143-151, 1989). Nivåer av fritt anti-MBP ble målt i alle fraksjoner fra affinitetskromatografi og i alle nøytrali-seringsblandinger. Alle individuelle prøver ble kjørt fire-dobbelt ved anvendelse av det samme joderte material for å minimalisere variabilitet mellom analyser.

Renset anti-MBP ble fullstendig nøytralisert av MBP og av peptider MBP80-97, MBP91-106 og MBP75-95, og ble delvis nøytralisert av peptider MBP64-78, MBP69-83 og MBP61-75 (tabell 1 og fig. 2). De gjenværende tolv peptider nøytrali-serte ikke renset anti-MBP og deres kinetikk-kurver faller innenfor det stripede området vist i fig. 2. Kalvebrissel-histon og humant serumalbumin reagerte ikke med renset anti-MBP selv ved konsentrasjoner så høye som 1000 ng. MAb til peptid MBP64-78 ble kun inhibert av peptid MBP64-78, og MAb til peptid MBP1-8 ble kun inhibert av peptid MBP1-8. MAb peptidet MBP45-50 reagerte ikke med MBP eller noen av peptidene (for klargjørende hensyn for figuren, er ikke kontrolldata vist). Kontrollprøvene viste gyldigheten til nøytraliseringsmetoden ettersom hvert kontroll-antistoff ble nøytralisert fullstendig av det forventede peptid og av ingen av de andre peptidene. Dette viser at selv ved høye peptid-konsentrasjoner (10.000 ng) ble det iakttatt spesifisitet med hensyn til gjenkjennelse.

Anti-MBP renset fra 7 individuelle MS pasienter ble fullstendig nøytralisert av h-MBP og peptider MBP80-97, MBP91-106 og MBP75-95 (se fig. 3 som et illustrerende eksempel).. På grunn av den begrensede mengden antistoff som er ervervet fra individuelle MS pasienter, ble ikke anti-MBP reagert med de gjenværende 15 peptider.

Som tidligere angitt ble anti-MBP nøytralisert med peptider som spenner fra omtrent aminosyre-rest 61 til omtrent aminosyre-rest 106. Peptidene som ikke nøytraliserte anti-MBP dekker både amino- (omtrent rester 1 til 63) og karboksyl- (rester 117 til 162) terminalene av h-MBP. Det viser seg at peptider fra forskjellige ikke-overlappende regioner av MBP nøytraliserer det eller de samme antistoffer. Dette kan forklares hvis antistoffene gjenkjenner et diskontinuerlig (sammenstilt) epitop inneholdende aminosyrer fra forskjellige regioner. Et lignende fenomen er tidligere blitt observert av Hruby et al (Hruby, S., Alvord, E.C., Groome, N.P. et al., Molec Immun 24:1359-1364, 1987) som viste at et rotte-monoklonalt antistoff hadde et hoved-epitop i MBP sekvens 112-121, men en sterk kryssreaksjon med et annet epitop i peptid 39-91. Dette er mer sannsynlig enn den mulighet at antistoffet er kryssreaktivt med to fullstendig forskjellige sekvenser som ikke dannet et diskontinuerlig epitop (Hruby, S., Alvord, E.C., Martenson, R.E., et al., J Neurochem 44:637-650, 1985). Nøytraliseringsdataene kan forklares ved evnen til peptider fra forskjellige seksjoner av MBP til hver å delvis okkupere antistoff-bindingslommen ved interagering med forskjellige antistoff aminosyre-side-kjeder. Denne forklaringen passer iakttagelsen at peptidene som gir fullstendig inhibering (MBP80-97, MBP91-106 og MBP75-95) er omtrent 100 ganger mindre effektive på en molar basis enn intakt MBP med hensyn til å bevirke inhibering. Ved hypotesen som er fremsatt ovenfor kan dette skyldes at hver peptid-klon ikke er i stand til å oppnå bindingsenergien til det opprinnelige MBP epitop.

EKSEMPEL 2 (Referanseeksempel)

In vivo nøytralisering eller modulering av produksjon av anti-humant myelin basisk protein

Pasientutvelgelse og kontrollundersøkelser

Pasienter som deltok i dette forsøksprosjektet ble sett i Multiple Sclerosis Patient Care and Research Clinic på University of Alberta, Edmonton, Canada. Pasientene hadde blitt diagnostisert til å ha klinisk bestemt multippel sklerose ved hjelp av Schumacher kriterier (1965) bekreftet ved hjelp av magnetisk resonans-avbilding av hjernen og CSF immunkjemiprofiler. For å illustrere at anti-MBP i kronisk progressiv MS var vedvarende forhøyet over lange tidsperioder, måneder til år, hadde pasienter gjentatte lumbal-punkturer med overvåking av F og B anti-MBP. I en pasient med kronisk progressiv MS ble det iakttatt at autoantistoffet forble vedvarende forhøyet i perioder så lange som 11 år og at spontan nedsettelse av anti-MBP nivåer ikke forekom (fig.

4 er et illustrerende eksempel).

For å bestemme at initialt forhøyede CSF anti-MBP nivåer forble relativt konstante over 24 timer, hadde 2 pasienter (1F56 og 3M66) gjentatt tagning av prøver av CSF hvert 30. minutt i 2 timer såvel som 24 timer senere med overvåking av F og B anti-MBP (henholdsvis fig. 5A og 5B). Pasienter 1F56 og 3M66 tjente som "tids-kontroller". F og B anti-MBP nivåer forble konstant forhøyede ved tagning av prøver av CSF hvert 30. minutt i 2 timer såvel som 24 timer senere.

I tillegg ble virkningen av inokulering av 5 cm3 normal salt-oppløsning i CSF tilsvarende bestemt i to andre pasienter (4M45 og 5M5 9, henholdsvis fig. 5C og 5D). Disse pasientene tjente som "tid-saltoppløsning kontroller". Når 5 cm<3> normal saltoppløsning ble injisert intratekalt forble F og B anti-MBP nivåer forhøyede ved basislinjenivå ved tagning av prøver av CSF som ovenfor, hvilket således viser at "fortynnings-virkningen" på anti-MBP titere var neglisjerbar.

Anti-MBP nivåer ble bestemt ved hjelp av en fastfase-radioimmunoassay med humant MBP belagt på Immulon mikrotiter-brønner. Immulon mikrotiterbrønner ble belagt med 100 /xl av 10 /xg/ml MBP (1 ^g/brønn) og inkubert over natten ved 3 7°C. Etter quenching med bovint serumalbumin (BSA) og tre vaskinger med vann ble brønnene lagret ved romtemperatur. Prøver av 10 0 /il CSF eller vevsekstrakter fortynnet til

0,010 g IgG/1 (med 0,01 M Barbitol-bufret saltoppløsning (BBS) pH 6,9-7,1, 0,5 % BSA og 0,05 % Tween 20) bleinkubert i MBP-belagte brønner i 1-2 timer ved romtemperatur. Etter 5 vaskinger med buffer (med 0,01 M BBS, 0,5 BSA og 0,05 % Tween 20) ble brønnene inkubert med geit anti-kanin IgG-Fc spesifikk (i 0,01 M BBS, 0,05 % Tween 20, 0,5 % BSA) i 1 time ved romtemperatur og deretter renset som ovenfor. Til sist ble <125>I-protein A (eller 125I-protein G) tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Når <125>1-protein G ble anvendt som en tracer, erstattet ovalbumin BSA i analysebuffer og for quenching. Etter tre siste vaskinger med vann ble brønnene telt individuelt. Resultatene uttrykkes i radioaktivitet definert som: (tellinger av prøver - tellinger av blank) -s-(tellinger av total radioaktivitet - tellinger av blank).

Alle prøver kjøres i 10 repetisjoner og tellingstid er 10 minutter for å samle > TO.000 tellinger.for enhver positiv prøve.

Før analyseringen ble alle CSF prøver og/eller vevsprøver fortynnet til en endelig IgG konsentrasjon på 0,010 g/l. F anti-MBP ble detektert direkte i CSF ekstrakt eller vevs-ekstrakt mens B nivåer i antistoff ble bestemt etter syrehydrolyse av immunkomplekser med glysih-HCl buffer pH 2,2. Ikke-spesifikk binding ble utført for hver prøve i ubelagte brønner. For epitop-lokalisering ble syntetiske peptider først reagert med renset antistoff i en væskefase kompetitiv analyse og deretter ble anti-MBP bestemt ved hjelp av radioimmunoassay i alle resulterende supernatanter. Resultatene av den kombinerte kompetitive bindingsanalyse og radioimmunoassay ble uttrykt som prosent inhibering av syntetisk peptid definert som 100 - radioaktivitetsenheter. Prøver ble utført i 10 repetisjoner og telt i 10 minutter hver i en LKB1275 Minigamma teller. En samlet mengde vevsrenset anti-MBP ble anvendt ved 5 på forhånd etablerte fortynninger som positive kontroller. Samlet CSF fra pasienter med ikke-nevrologiske sykdommer ble anvendt som negative kontroller. Reproduserbarhet innenfor analyser var mellom 3 og 5 % og variasjon mellom analyser var mindre enn 7 %.

Vedvaring av CSF anti-MBP ved et forhøyet og konstant nivå i pasienter som deltar som kontroller (tidskontroll og fortynn-.ingskontroll) tillot det neste trinn i denne undersøkelsen.

Dobbeltblind peptid kontrollert fase 1 forsøk - intratekal injeksjon

Et fase 1 forsøk for å bestemme virkningen av syntetisk peptid MBP75-95 på F og B titere av CSF anti-MBP ble utført. Etter å ha mottatt godkjenning fra Research Ethics Board ved University of Alberta, ble dette prosjektet utført i pasienter med klinisk bestemt MS (Schumacher et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 122, 552-568, 1965), sterkt invalide og med fremskreden progressiv sykdom. Etter underrettelse om samtykke meldte 14 pasienter seg frivillig for denne undersøkelsen. 8 pasienter ble valgt på grunnlag av sin initiale titer av F CSF anti-MBP (over 8 radioaktivitetsenheter) (tabell 2) til å motta en intratekal injeksjon av enten peptid MBP75-95 som bandt anti-MBP in vitro eller et ikke-bindende kontroll-peptid MBP35-58 (Warren og Catz, 1993b). Forsøket ble utført på dobbeltblind måte slik at hverken forskerne eller pasientene hadde kjennskap til naturen av inokulatet. Alle peptider ble kodet med 7-sifrede vilkårlig frembragte tall av en uavhengig lege. Parede peptider oppløst i 5 cm<3> normal saltoppløsning og injisert i CSF ved hjelp av en lumbal punktur ble administrert i økende doseringer på 1, 2,5, 5 og 10 mg. Prøver av CSF ble tatt før injeksjon (basislinje), ved 30 minutters intervaller i 2 timer etter injeksjon, 24 timer senere og deretter ved ukentlige intervaller i 3-4 uker inntil anti-MBP nivåer returnerte til basislinjen. Celle-tellinger, totalt protein-, glukose-, IgG- og albuminnivåer ble bestemt i alle oppnådde CSF prøver. F og B anti-MBP nivåer ble bestemt ved hjelp av radioimmunoassay, som beskrevet i det foregående.

Tabell 2: Kliniske data og CSF anti-MBP nivåer for 14 pasienter med kronisk progressiv MS som meldte seg frivillig til å delta i en fase 1 forskningsundersøkelse av en intratekal injeksjon av MBP syntetiske peptider. Siden et initialt høyt F anti-MBP (> 8 radioaktivitetsenheter) var nødvendig for å oppnå en signifikant endring etter injeksjon, ble kun 8 av 14 pasienter valgt for undersøkelsen.

Alle peptidene benyttet i disse undersøkelsene ble syntetisert under "good manufacturing product" (GMP) koden under anvendelse av Fmoc (9 fluorenylmetoksykarbonyl) metoden av Procyon Inc. (London, Ontario, Canada). Peptid-renhet ble kontrollert ved hjelp av revers fase høytrykks-væskekromato-grafi med en C18 kolonne og vann-acetonitril gradient inneholdende 0,1 % TFA. Massespektroskopi og aminosyreanalyse ble utført ved hjelp av standard metoder. Før inokulering ble alle peptidene kontrollert med hensyn på pyrogenisitet (Vancouver General Hospital, Vancouver, Canada), sterilitet (Provincial Laboratory for Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Canada) og akutt toksisitet (Health Sciences Laboratory Animal Services, University of Alberta, Edmonton, Canada) og de ble erklært "egnet for administrering til mennesker". Passende mengder av kodede syntetiske peptider ble oppløst i 5 cm<3> steril vanlig saltoppløsning (0,9 % natriumklorid-injeksjon USP, ikke-pyrogen, Baxter Corp, Toronto, Canada), filtrert to ganger gjennom 0,22 /im steriliserende filterenheter (Millex-GX, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) og administrert i CSF ved hjelp av en lumbal punktur.

Peptidundersøkelser mellom pasienter

Pasienter 6F53, 8M41, 4M45 og 1F56 mottok syntetisk peptid MBP75-95 som er i stand til å binde anti-MBP in vitro og pasienter 10F3 6, 13F43, 5M59 og 3M66 mottok en "kontroll", ikke-bindende syntetisk peptid MBP35-58 i økende mengder på henholdsvis 1, 2,5, 5 og 10 mg (fig. 6). I pasient 6F53 (fig. 6B) som mottok 1 mg MBP75-95 ble det iakttatt en 75 % reduksjon av F anti-MBP etterfulgt av dets umiddelbare returnering til basislinjenivå. Pasient 8M41 (fig. 6D) som mottok 2,5 mg MBP75-95 viste fullstendig binding-nøytrali-sering av F anti-MBP etterfulgt av dets returnering til basislinjenivå i løpet av 24 timer. I pasient 4M45 (fig. 6F) som mottok 5 mg MBP75-95 inntraff en bratt og fullstendig F anti-MBP binding-nøytralisering som vedvarte i 7 døgn, og som har returnert til sin initiale verdi ved prøvetagning 21 døgn senere. Pasient lF56(fig. 6H) mottok 10 mg MBP75-95 som også frembragte fullstendig binding-nøytralisering av F anti-MBP

som vedvarte i 7 døgn og som hadde returnert til basislinje-verdi ved prøvetagning 14 og 28 døgn senere. Bundede nivåer av anti-MBP ble ikke signifikant endret av en intratekal inokulering av MBP75-95. I pasienter 10F38, 13F43, 5M59 og 3M66 som mottok henholdsvis 1, 2,5, 5 og 10 mg av det "kontroll" ikke-bindende peptid MBP35-58, forble F og B nivåer av CSF anti-MBP uendret fra initialt høye basislinjenivåer under det 24. timers forsøket (henholdsvis fig. 6A, 6C, 6E og 6G). Tradisjonelle CSF parametre for inflammasjon i MS slik som celletellinger, absolutte nivåer for totalt protein, IgG og albumin, oligoklonal binding, IgG indeks og CNS IgG

syntese forble uendret forut for og etter administrering av peptid.

Peptidundersøkelse i pasient

Forsøk i pasient ble utført for å minimalisere variabilitet mellom pasienter. I pasient 5M59 som hverken var en "tidskontroll" eller mottok 5 mg av det ikke-bindende peptid MBP35-58, forble F anti-MBP nivåer forhøyet ved basislinjenivå under begge forsøkene (fig. 7A). Pasient 4M45 var initialt en "fortynningsmiddelkontroll'<1> og '2 måneder senere mottok han 5 mg MBP75-95. Hans F anti-MBP forble konstant forhøyet i alle prøver samlet under "fortynningsmiddel" forsøket, og det ble udetekterbart etter administrering av MBP75-95 (fig. 7B). Lignende resultater ble oppnådd i pasient 1F56 som hadde vedvarende forhøyede nivåer av F antistoff under et "tidskontroll" forsøk og etter administrering av 10 mg MBP75-95 ble hennes F anti-MBP udetekterbart (fig. 7C). En fullstendig undersøkelse ble utført i pasient 3M66. Hans F anti-MBP nivåer var vedvarende forhøyet under et

. "tidskontroll" forsøk eller når 10 mg MBP35-38 ble admini-

strert. Når imidlertid 10 mg MBP 75-95 ble injisert, ble F anti-MBP fullstendig nøytralisert og forble udetekterbart i 7 døgn (fig. 7D).

Gjentatt administrering av syntetisk peptid MBP75- 95

Etter bestemmelse av at peptid MBP75-95 nøytraliserte F anti-MBP in vivo i perioder, på over 7 døgn, ble det valgt gjentagende ganger å inokulere 10 mg MBP75-95 i spinalvæsken ved ukentlige intervaller i 10 uker. Dette forsøket ble utført i 3 forskjellige pasienter med kronisk progressiv MS som ikke hadde deltatt i prosjektet med den ene peptid-injeksjonen og som meldte seg frivillig for denne under-søkelsen. F og B anti-MBP ble bestemt 1-2 uker før den første inokuleringen, forut for og 30 minutter etter hver av de 10 injeksjonene og igjen 1 måned etter den siste injeksjonen. Celletellinger, totalt protein, glukose, IgG og albuminnivåer ble bestemt i alle CSF'er ervervet før hver av de 10 injeksjonene. Forut for den første og etter den siste injeksjonen ble blod ervervet og analysert med hensyn på elektrolytter, kreatinin, hjerte- og leverenzymer og blod-plater (hematology panel).

Når MS pasienter med kronisk progressiv sykdom mottok gjentatte intratekale injeksjoner av 10 mg MBP75-95 ved ukentlige intervaller, i perioder på opp til 10 uker, ble deres initialt høye F anti-MBP udetekterbart så lenge som peptidet ble administrert. Når peptidet ikke lenger ble administrert returnerte F anti-MBP til basislinjenivå i løpet av 1 måned (fig. 8). Titere av B antistoff forble konstant forhøyet gjennom hele forsøket og dette antyder at i disse pasientene fortsatte syntese av anti-MBP og intratekal peptid-administrering produserte kun en "rensingseffekt" av F anti-MBP.

Pasienter som mottok enten en enkelt injeksjon av syntetisk peptid eller gjentatte ukentlige injeksjoner hadde kronisk progressiv multippel sklerose med en fremskreden grad av nevrologisk invaliditet. Ingen av disse pasientene rapporterte forverring av deres nevrologiske symptomer eller forverringer av MS etter intratekal peptid-administrering og en cellulær respons ble ikke utviklet i CSF. MS pasienter som mottar gjentatte inokuleringer av MBP75-95 har blitt overvåket med hensyn på systemiske komplikasjoner inkluderende endringer i elektrolytt såvel som hjerte-lever-nyre-dysfunksjon og endringer i hematologi, og ingen skadelige komplikasjoner har forekommet. Ingen skadelige virkninger ble iakttatt.

Intravenøs administrering av MBP75- 95

Etter bestemmelse av at intratekal administrering av peptid MBP75-95 frembragte fullstendig binding-nøytralisering av F anti-MBP uten noen endring i nivåer av B antistoff, ble det avgjort å bestemme virkningen av intravenøs administrering av det samme peptidet på CSF titere av F og B anti-MBP. 500 mg MBP75-95 ble oppløst i 100 cm3 vanlig saltoppløsning og injisert intravenøst i løpet av 30 minutter i pasient 8M41 med overvåking av CSF anti-MBP hvert 30. minutt i de to første timer, 18 timer senere såvel som 10, 16 og 3 0 døgn senere. Blod ble ervervet før injeksjon såvel som 16 og 3 0 døgn senere og ble analysert med hensyn på elektrolytter, kreatinin, hjerte- og leverenzymer og blodplate. Spinalvæske ble overvåket med hensyn på celletellinger, totalt protein, glukose, IgG og albuminnivåer. Ingen skadelige virkninger ble iakttatt.

Som vist i fig. 8, frembragte ikke intravenøs administrering av 500 mg MBP75-95 noen endring i titere av F og B nivåer av CSF anti-MBP i løpet av de første to timene. En 30 % reduksjon av CSF F anti-MBP ble iakttatt 18 timer senere. Når prøver påny ble tatt av CSF lo, 16 og 3 0 døgn senere hadde både F og B anti-MBP avtatt fra sitt initiale nivå på 11 radioaktivitetsenheter til henholdsvis 4, 2 og 1 radioaktivitetsenheter.

En gjentatt iakttagelse i alle pasienter som er behandlet intratekalt med MBP75-95 var vedvaringen av forhøyede nivåer av bundet antistoff, mens F anti-MBP ble udetekterbart på en dose-respons måte. Dette antydet at syntese av autoantistoffer til MBP forble aktiv under og etter intratekal administrering av MBP75-95. Som en følge av denne iakttagelsen ble MBP75-95 administrert intravenøst til en pasient som tidligere hadde mottatt en enkelt intratekal injeksjon av peptidet. Etter intravenøs administrering viste både F og B nivåer av CSF anti-MBP en signifikant reduksjon ved overvåking i perioder på opp til en måned. Reduksjonen av F såvel som B nivåer av CSF anti-MBP etter intravenøs administrering av MBP75-95 antyder at denne administreringsruten frembragte nedregulering av den autoimmune inflammatoriske prosess som er ansvarlig for syntesen av anti-MBP. I en oppfølgings-undersøkelse til dags dato begynte anti-MBP nivåer å øke 4-6 måneder etter en første intravenøs injeksjon, en andre intravenøs injeksjon av det samme peptid (booster) frembragte nedregulering av anti-MBP syntese i opp til 2 år i omtrent 70 forskjellige pasienter med kronisk progressiv MS.

MBP epitop for MS anti- MBP'

For videre å lokalisere MBP epitopen for MS anti-MBP, ble F og B anti-MBP renset ved hjelp av affinitetskromatografi fra CSF og MS hjernevev (Warren, K.G. et al., Ann Neurol 35, 280-289, 1994) reagert i kompetitive inhiberingsanalyser med 41 konsekutive MBP syntetiske peptider med lik lengde (hver av 10 rester og som overlapper de tilgrensende med 9) som dekker området mellom rester 61 og 110 av humant MBP. Peptidet eller peptidene som frembringer maksimal inhibering ble betraktet å være særdeles forbundet med antistoff-bindings-sete.

Maksimal inhibering (^ 80 %) av både renset F og B anti-MBP fra MS hjernevev (fig.,10) ble frembragt av fire dekapeptider, dvs. MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 og MBP87-96, hvilket antyder at MBP epitopen for MS anti-MBP er. lokalisert mellom rester 84 og 96. Minimumsområdet for felles aminosyrerester er fra rest 87 til rest 93. B anti-MBP hadde et mer begrenset område enn f antistoff.

Rollen til anti-MBP antistoffer i patogenesen av MS demyelinisering har ikke blitt belyst og kan kun bestemmes ved modulering av anti-MBP in vivo og etterfølgende iakttagelse av de kliniske og patologiske utfall, f.eks. under en akutt relaps av MS, når P/B antistoff-forhold er over enhet, kan et peptid som er kjent å binde F anti-MBP inokuleres intratekalt for å binde fritt sirkulerende antistoff og terminere de kliniske virkninger av den akutte relaps. Ukentlig administrering kan være nødvendig inntil remisjon inntreffer. I MS pasienter med kronisk progressiv sykdom og tilliggende akutte relapser, kan intratekal såvel som intravenøs peptid-administrering være nødvendig for å nedregulere inflammatoriske mekanismer som produserer anti-MBP.

EKSEMPEL 3

Passende dosering av intratekalt administrert pMBP86-95 eller pMBP82-98 i pasienter med akutt relaps

MS relapser er forbundet med F/B anti-MBP forhold over en 1,0 på grunn av høyere nivåer av fritt enn bundet antistoff i CSF. Generelt over en periode på 3 måneder, når en relaps går inn i den etterfølgende resitusjons/remisjonsfase, avtar F anti-MBP nivåer gradvis og når biologisk remisjon er fullstendig blir CSF, F og B anti-MBP generelt udetekterbart i CSF.

Pasienter som deltok i de følgende Eksempler hadde enten relapserende-remitterende eller relapserende-progressiv MS.

I dette og de etterfølgende Eksempler ble enten pMBP8G-95 eller pMBP82-98 anvendt. pMBP86-95 hadde svært lav oppløselighet i vanlig saltoppløsning siden det inneholdt fire hydrofile og seks hydrofobe rester. På den annen side har pMBP82-98 økt oppløselighet i vanlig saltoppløsning, som et resultat av de fem ytterligere hydrofile rester.

To pasienter ble undersøkt for å bestemme den passende dosering av intratekalt administrert pMBP86-95 eller pMBP82-98, som vil umiddelbart redusere F anti-MBP til udetekterbare nivåer. En pasient hadde en akutt relaps av ataktisk gange og trunkal dysekvilibrium. Ved begynnelsen av angrepet mottok denne pasienten en enkelt intratekal injeksjon av 10 mg pMBP86-95. F og B anti-MBP nivåer ble målt før og 1 time etter injeksjon og fem ganger til i løpet av de neste 3 måneder. Denne doseringen undertrykket F anti-MBP kun delvis og gjehopprettelseskurven for antistoff fulgte nær det naturlige forløp. Denne pasienten fortsatte å ha progressiv spastisk paraparese og ataksi. Det ble konkludert at en enkelt intratekal injeksjon av 10 mg pMBP86-95 var utilstrek-kelig til fullt ut å undertrykke F anti-MBP og endre dets naturlige gjenopprettelseshastighet.

Den andre pasienten, en 18 år gammel kvinne, med akutt optikusnevritt som mottok en enkelt intratekal injeksjon av 50 mg pMBP86-95, hadde F og B antistoff-nivåer målt før og 30 minutter etter injeksjon. 30 minutter etter injeksjon var F antistoff udetekterbart. Pasienten gikk ikke med på etter-følgende lumbal punkturer. Det ble således konkludert med at doseringer av minst 50 mg er nødvendig for å binde og nøytralisere F anti-MBP i CSF i minst 3 0 minutter.

EKSEMPEL 4

Hyppighet og varighet av administrering i pasienter med monosymptomatiske relapser

I dette eksempelet ble hyppigheten og varigheten av administrering av pMBP som ville opprettholde lave eller udetekterbare nivåer av F antistoff i en lengre tidsperiode bestemt. De fire pasientene som ble undersøkt i denne gruppen mottok syntetiske peptider i løpet av en uke fra begynnelsen av et angrep.

De to første pasientene hadde angrep av akutt unilateral optikusnevritt. En av disse pasientene (fig. Ila) mottok intratekalt to injeksjoner av 50 mg pMBP86-95 (it#l, it#2) med fire ukers mellomrom. Etter hver injeksjon ble F anti-MBP udetekterbart i løpet av 1 time. Når målt 1 uke etter den første injeksjonen var F anti-MBP forhøyet, og 4 uker senere var F antistoffet signifikant høyt. På den tid får pasienten en andre intratekal injeksjon (it#2) og F anti-MBP ble udetekterbart etter 30 minutter, men det ble ikke overvåket etter dette utover 24 timer. Det ble konkludert med at denne hyppigheten var.utilstrekkelig og at flere injeksjoner i løpet av den første uken av et angrep kan være påkrevd for å opprettholde neglisjerbare nivåer av antistoffer.

Den andre pasienten med fullstendig unilateral optikusnevritt mottok flere intratekale peptidinjeksjoner av 50 mg pMBP82-98 i løpet av den første uken av sitt angrep: fire

daglige injeksjoner (fig. 11b: it#l, it#2, it#3, it#4) og en femte injeksjon (it#5) en uke senere. Anti-MBP profilen til denne pasienten viste en stabil hurtig nedgang i løpet av den 7 døgns perioden. Mer viktig, forble hans CSF anti-MBP nivåer, 7 uker og 6 måneder etter it#5, udetekterbare og pasienten opplevde ikke en rekurrens av optikusnevritt og heller ingen annen type av MS relaps. I tillegg ble den unilaterale blindhet sekundært til optikusnevritt fullstendig restituert.

Den samme planen méd daglige intratekale injeksjoner av 50 mg pMBP82-98 ble deretter administrert til MS pasienter med forskjellige typer mono-symptomatiske relapser. Fig. lic illustrerer anti-MBP profilen til en pasient med akutt pseudoatetose i sin venstre hånd, som intratekalt mottok fem daglige injeksjoner av 50 mg.pMBP82-98 (it#l, it#2, it#3, it#4, it#5) i den andre uken i sitt angrep. Nivåer av F antistoff avtok til udetekterbare nivåer i løpet av 4 døgn og forble udetekterbare ved vurdering 11 døgn og 1 måned senere. Denne pasienten fikk stabilt igjen funksjonen i sin venstre hånd slik at han igjen kunne kjøre motorsykkelen sin og spille gitar.

Den siste pasienten hadde et angrep av akutt venstre hemiplegi som ligger oppå kronisk progressiv MS. Han fikk fire intratekale injeksjoner av 50 mg. pMBP86-95 hvert 2. til 3. døgn. Anti-MBP ble målt før og 30 minutter etter hver injeksjon (fig. Ild: it#l, it#2, it#3, it#4) og 10 døgn etter den første injeksjonen. Det initialt forhøyede F anti-MBP

ble udetekterbart i løpet av 7 døgn når pasienten returnerte klinisk og biokjemisk til sin initiale kroniske progressive tilstand, og snart etter dette mottok han intravenøst 4 00 mg pMBP86-95. Dette undertrykte hans nivå av bundet antistoff i 4 måneder etter i.v. injeksjonen. Etter hans siste lumbal punktur 8,5 måneder etter intravenøs injeksjon, hadde imidlertid sykdommen returnert til et kronisk progressivt mønster både klinisk og biokjemisk.

EKSEMPEL 5

Hyppighet og varighet av administrering i pasienter med polysymptomatiske relapser

De samme MBP peptider ble deretter injisert i pasienter med polysymptomatiske angrep, som påvirker flere områder av CNS. Denne gruppen besto av tre pasienter: en med relapserende-remitterende og to med relapserende-progressiv sykdom.

Den første pasienten hadde en alvorlig polysymptomatisk forverring. I løpet av den første uken av relapsen mottok hun tre injeksjoner av 50 mg pMBP86-95 på dager 1, 3 og 7

(fig. 12: it#l, it#2 og it#3). Anti-MBP ble målt før hver injeksjon og 3 0 minutter senere. Etter mottagelse av disse tre injeksjonene var F anti-MBP undertrykket til nesten udetekterbare nivåer. Ved måling 1 måned senere var F anti-MBP stigende og ved 1,5 måneder var relapsen enda en gang klinisk aktiv og biokjemisk bekreftet. På denne tid mottok pasienten et andre forløp av fire intratekale injeksjoner av 50 mg pMBP86-95 på dager 45, 48, 49 og 50 av relapsen (it#4, it#5, it#6 og it#7). Anti-MBP ble målt før og 30 minutter etter hver injeksjon og tre ganger til i de etterfølgende 2 måneder. Enda en gang ble F anti-MBP undertrykket i minst 2 uker, men pasienten relapserte igjen og på det tidspunktet hadde hennes nivå av F antistoff returnert til det initiale nivå før relaps. "Det er klart at det er påkrevet med en mer langvarig intratekal administrering av det syntetiske peptid,

for å opprettholde lave/udetekterbare nivåer av F anti-MBP i lengre tidsperioder.

Den andre pasienten hadde relapserende-progressiv MS (fig.

13). Initialt i den progressive form (F=B) mottok han

intravenøst 500 mg pMBP86-95 (IV#1). Selv om både nivåer av F og B antistoff var noe nedsatt etter 1 måned,, opplevde pasienten 9 uker etter I.V. injeksjonen en polysymptomatisk klinisk relaps forbundet med et svært økt F anti-MBP nivå. På dette tidspunkt mottok han tre intratekale injeksjoner av 50 mg pMBP86-95 (it#l, it#2 og it#3) på dager 1, 3 og 12 av

relapsen, og anti-MBP ble målt før, 30 minutter og 24 timer etter den første og tredje injeksjonen. Ved undersøkelse en måned senere hadde pasienten returnert til sin initiale kliniske og biokjemiske status av progressiv spastisk paraparese når han i løpet av 2 uker mottok en andre intravenøs injeksjon av 500 mg pMBP86-95 (IV#2). Til dags dato forble F og B CSF anti-MBP nivåer overvåket fortløpende i de neste 26 måneder undertrykket ved sammenligning med basislinjenivåer. Hans evne til å stå oppreist og gå forbedret seg betydelig.

Den siste pasienten i denne gruppen med MS, initialt i den progressive fase (F=B), (fig. 14), mottok intravenøst 500 mg pMBP86-95 (IV#1). CSF anti-MBP ble målt etter 9 døgn, og deretter månedlig i 2 måneder og 4,5 måneder etter IV#1. Etter denne injeksjonen ble F og B anti-MBP nivåer undertrykket i 2 måneder. 4,5 måneder etter IV#1 klaget pasienten over økende svakhet, som ble bekreftet klinisk såvel som biokjemisk ved økte nivåer av antistoff som er i overensstemmelse med kronisk progressiv sykdom. I løpet av den neste måneden mottok han en andre intravenøs injeksjon av 500 mg pMBP82-98 (IV#2). CSF analyse av prøven tatt rett før den andre injeksjonen antydet et mønster med akutt relaps (F>B), og neste dag utviklet pasienten akutt diplopi på grunn av en venstre lateral rektus paresus. På dette tidspunkt opplevde han klart en klinisk og biokjemisk akutt relaps, som vedvarte over de neste 4,5 måneder og var karakterisert ved alvorlig dysekvilibrium ved stilleståing og gange, svakhet i bena og dobbeltsyn. I et forsøk på å senke hans forhøyede F anti-MBP mottok denne pasienten intratekalt to forløp av pMBP82-98. Under det første forløpet initiert 4,5 måneder fra begynnelsen av relapsen mottok han 50 mg pMBP82-98, daglig i 5 døgn (it#l, it#2, it#3, it#4 og it#5), og anti-MBP nivåer målt før og 3 0 minutter etter hver injeksjon forble rimelig forhøyet. Siden relapsen vedvarte og i alvorlig grad var invalidiser-ende, ble det besluttet å ytterligere administrere et andre forløp av en høyere dosering av peptid og med en høyere hyppighet, og pasienten mottok 10 0 mg pMBP82-98 to ganger daglig i to døgn (dag 19 og 20: it#6, it#7, it#8 og it#9). Anti-MBP ble målt før og 3 0 minutter etter hver injeksjon. Etter denne økte dosering og hyppighet ble F anti-MBP undertrykket til neglisjerbare nivåer, og ved testing en uke senere (dag 28) var hans CSF profil i overensstemmelse med sakte fremskridende sykdom (F/B anti-MBP=l,0). På dette tidspunkt mottok pasienten en tredje intravenøs injeksjon av 500 mg pMBP82-98 (IV#3) som ikke nedregulerte noe mer anti-MBP produksjon.

EKSEMPEL 6

Intravenøs administrering av MBP peptider i et forsøk på å hindre fremtidige relapser

To pasienter med relapserende-progressiv MS, som hadde hyppige relapser, ble injisert intravenøst med enten pMBP86-95 eller pMBP82-98 for å bestemme om denne administreringsruten vil hindre ytterligere angrep.

Den første pasienten opplevde 2 til. 3 relapser pr. år i 4 år, med resulterende trinnvis progresjon av spastisk paraparese (fig. 15). Hun mottok to intravenøse injeksjoner med 6 måneder imellom, en av 400 mg pMBP86-95 (IV#1) og den andre av 400 mg pMBP82-98 (IV#2). Klinisk overvåkning og CSF analyse ble utført månedlig. Fig. 15 viser anti-MBP nivåer over en periode på 9 måneder (øvre innrammede område). Den første intravenøse injeksjon nedregulerte anti-MBP syntese i omtrent 2 måneder. I løpet av den tredje måneden etter injeksjon opplevde denne pasienten en klinisk relaps. Beklageligvis ble ikke CSF ervervet på det tidspunkt. I løpet av de etterfølgende 2 til 3 måneder, etter at relapsen svant hen og at sykdommen på ny gikk inn i den kroniske progressive fase, mottok denne pasienten den andre intrave-nøse injeksjon (IV#2). CSF anti-MBP nivåer ble igjen undertrykket i 2 måneder, men tre måneder etter den andre injeksjonen hadde pasienten et nytt relaps forbundet med markert forhøyet F anti-MBP. På lignende måte som den grad av relaps som hun hadde i de tidligere 4 år, fortsatte denne pasienten å oppleve 2 til 3 relapser pr. år til tross for at hun mottok to intravenøse injeksjoner av pMBP86-95 og pMBP82-98.

En andre pasient (fig. 16) som opplevde 1 til 4 akutte relapser pr. år i de forutgående 10 år (øvre skala) ble i alvorlig grad invalid, og fikk paraplegi og ble bundet til rullestol. I løpet av det 11. året opplevde pasienten nok en gang fire relapser (øvre innrammede område), selv om hun mottok MBP syntetiske peptider intratekalt og intravenøst. Under den første relapsen, etter intratekal mottagelse av to injeksjoner av 50 mg pMBP86-95 på dag 1 og 6 (it#l, it#2), ble hennes F anti-MBP nivå betydelig redusert. På dag 6 mottok hun også intravenøst 300 mg av pMBP86-95 (IV) som deretter undertrykte både F og B antistoff i de neste 3 måneder. Fire måneder etter den intravenøse injeksjonen opplevde denne pasienten en ny klinisk relaps som fortsatte å forverre seg over tid: nivåer av CSF antistoff ble svært for-høyet, og 6,5 måneder etter IV injeksjonene mottok pasienten et forløp av fire daglige injeksjoner av 50 mg pMBP82-98

(it#3, it#3, it#5 og it#6), som sviktet med hensyn til å undertrykke nivåer av F antistoff og å få den kliniske relaps til å svinne hen.

EKSEMPEL 7

Sammenligning av forskjellige administreringsruter for peptid

I initiale undersøkelser ble syntetiske MBP. peptider administrert til åtte pasienter med kronisk progressiv MS. Pasientene mottok intratekalt enten et MBP bindende peptid MBP(75-95) eller et ikke-bindende kontroll-peptid MBP(3 5-58) i

økende doser fra 1 til 10 mg i 5 ml saltoppløsning. De fire pasientene som initialt mottok det ikke-bindende kontroll-peptid (MBP35-58) mottok senere det bindende MBP(75-95) peptid.

Injeksjon av MBP (75-95) i CSF resulterte i forbigående nøytralisering av F MBP spesifikke antistoffer. Bundede MBP autoantistoffer ble ikke påvirket. Varigheten av virkningen varte i 1 time (1 mg peptid), 24 timer (2,5 mg peptid) eller 7 døgn (5-10 mg peptid). Siden virkningen av intratekal administrering av peptid var ufullstendig (B anti-MBP forble forhøyet) og relativt kortlivet, ble denne administreringsruten sammenlignet med intravenøs injeksjon. I motsetning til intratekal administrering, ble både fritt og bundet MBP autoantistoffer udetekterbare en måned etter en enkelt intravenøs injeksjon av 500 mg av MBP(75-95) og forble ved lave nivåer i 3 måneder og etter en booster-injeksjon i opp til 2 6 måneder (fig. 17). Lignende iakttagelser ble gjort til dags dato i omtrent 70 pasienter med kronisk progressiv MS som ble injisert intravenøst med et MBP bindende peptid slik som MBP75-95, MBP86-95 og MBP82-98. En dose på 500 mg (5 mg/kg kroppsvekt) i 10-50 ml normal saltoppløsning ble valgt på grunn av det større volum av blod sammenlignet med CSF (faktor 15) og den hurtige clearance av peptider fra blodstrømmen gjennom nyren. Peptiddoser som svarer til dem som gis intravenøst ble ikke administrert intratekalt fordi slike volumer ikke kunne injiseres i CSF. Sammenfattet resulterte intratekal administrering, i det doseområde som testes i disse pasientene, i en forbigående "rensing" av kun F anti-MBP, i motsetning til en eller flere intravenøse injeksjoner som nedregulerte anti-MBP syntese, induserte en enkelt intravenøs injeksjon langvarig toleranse.

EKSEMPEL 8

Varighet av toleranse etter intravenøs administrering av MBP peptidet

Basert på disse resultatene ble kinetikken ved toleranse overfor MBP undersøkt til dags dato i omtrent 70 pasienter med kronisk progressiv MS som ble fulgt i over to år etter flere intravenøse injeksjoner av MBP(75-95), MBP(86-95) eller MBP(82-98). Peptider ble dosert ved 5-6 mg/kg kroppsvekt (256-500 mg) og injisert intravenøst i 10-50 ml saltoppløs-ning. Før intravenøs administrering av peptid haddé alle 13 pasienter høye nivåer av fritt og bundet MBP antistoffer i CSF (fig. 18, tabell 3). En måned administrering av peptid ble MBP spesifikke antistoffer hovedsakelig udetekterbare og forble ved lave nivåer generelt i 3-4 måneder, og på dette tidspunktet begynte igjen nivåer av antistoff å stige. Noen returnerte til sine initiale nivåer etter 8 måneder. Seks til ti måneder etter IV#1 mottok alle pasienter en booster-injeksjon (IV#2) av 275-500 mg (5-6 mg/kg kroppsvekt) av MBP(82-98) i 10 ml saltoppløsning (IV#2). Det lengre peptid valgt for den andre injeksjonen var mere oppløselig og kunne oppløses og administreres i et mindre volum. I denne gruppen som et hele, avtok CSF anti-MBP nivåer dramatisk i løpet av 6 uker til 2 måneder fra injeksjonen og forble udetekterbare i lengre tid (opp til 26 måneder). Av hele gruppen på omtrent 70 pasienter var en ute av stand til å fullføre undersøkelsen på grunn av lungeemboli og etterfølgende terapi med anti-koagulant som hindret ytterligere lumbal punkturer, og en annen var utelukket fra oppfølging på grunn av intravenøs mottagelse av kortikosteroider i høye doser. Av de omtrent 70 pasienter hadde omtrent 63 individuelt udetekterbare anti-MBP nivåer, 18-26 måneder etter booster-injeksjonen.

EKSEMPEL 9

Langvarig toleranse i pasienter med HLA-DR2 haplotypen

HLA-DR haplotyper hos MS pasienter ble bestemt ved molekylær typebestemmelse av genomisk DNA (tabell 3). Fire av elleve pasienter som fullførte undersøkelsen bar den sykdomsforbund-ede DR2 haplotype (DRB1<*>1501 eller DRB1<*>15021). Alle disse pasientene hadde lave eller udetekterbare nivåer av autoanti-stof f er ett år etter den andre intravenøse injeksjonen av MBP peptid. MBP peptidet binder med høy affinitet til HLA-DR2 og er immunodominant for HLA.-DR2 begrensede MBP spesifikke T-celler. HLA-DR4 (DRB1<*>0401) og HLA-DR7 (DRB1<*>0701) binder MBP peptidet som ble administrert. Bindingsundersøkelser har ikke blitt utført for DR molekylene båret av pasient k(M)

(DRB1<*>0407, DRB1<*>0801). MBP peptidet er ikke bundet av HLA-DR3 (DRB1<*>03011). To pasienter som hadde forhøyet anti-MBP ved slutten av undersøkelsen bar DRB1<*>03011 haplotypen (tabell 3) . Disse data indikerer at varigheten av toleranse overfor MBP avhenger av HLA-DR haplotypen til en pasient. Toleranse kan være mer langvarig når både MBP spesifikke T-celler og B-celler er gjort tolerante.

HLA-DR haplotyper til 11 MS pasienter som fullførte den 1 års oppfølgingen fra den andre intravenøse injeksjon av peptid (IV#2). Alle fire pasienter med HLA-DR2 haplotype (DRB1<*>1501 eller DRB1<*>15021) hadde lave nivåer av autoantistoff ett år etter IV#2.

EKSEMPEL 10

Subkutan administrering av peptid induserer ikke toleranse

Den optimale rute for administrering av peptid ble ytterligere undersøkt ved en eller flere subkutane injeksjoner av MBP (82-98) i saltoppløsning i en gruppe på 33 MS pasienter .

I 26 MS pasienter påvirket ikke økende mengder (1 til 100 mg) av en enkelt subkutan injeksjon av MBP(82-98) nivåer av CSF autoantistoff til MBP (data ikke vist). Åtte av disse pasientene mottok deretter en intravenøs injeksjon av peptid og i løpet av 2 måneder ble nivåer av CSF antistoff udetekterbare (tabell 4A). I fem andre pasienter resulterte en total dose på 900-1000 mg (5x100 mg, daglig i fem etter-følgende døgn, etterfulgt av enda en subkutan injeksjon på 400 eller 500 mg) kun i en beskjeden reduksjon av nivåer av MBP antistoff i CSF (tabell 4B). For å undersøke hvorvidt en forskjellig administreringsplan vil være mer effektiv, mottok to pasienter to subkutane injeksjoner av 250 mg av MBP(82-98) med en måned imellom (tabell 4C). Igjen ble ikke nivåer av antistoff påvirket. Sammenfattet viser disse data at kun intravenøs administrering av MBP peptidet induserer langvarig toleranse overfor MBP ved de peptiddoser som er testet i denne undersøkelsen.

A. Åtte pasienter mottok en enkelt subkutan injeksjon av MBP(82-98) (5-100 mg i 1-5 ml saltoppløsning) som ikke hadde noen virkning på nivåer av MBP autoantistoff. I motsetning resulterte en enkelt intravenøs injeksjon (400-500 mg) av det samme peptid administrert 4,5 til 8 måneder senere i udetekterbare nivåer av CSF autoantistoff.

B. Gjentatte subkutane injeksjoner av høye doser av MBP (82-98) (10 0 mg/døgn i fem etterfølgende døgn) hadde en beskjeden virkning på nivåer av CSF anti-MBP. En ytterligere høy dose (4 00 eller 5 00 mg) av MBP(82-98) administrert subkutant to uker etter det første sett av injeksjoner reduserte ikke ytterligere nivåer av autoantistoff.

C. To subkutane injeksjoner av høye doser av MBP(82-98)

(2x250 mg, en måneds intervall) hadde ingen virkning på MBP autoantistoffer i CSF.

Sammenfattet viser disse data at kun den intravenøse administreringsruten er effektiv for å indusere toleranse overfor MBP.

Claims (6)

1. Anvendelse av et peptid med formelen: Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, som er i stand til å nøytralisere eller modulere produksjon av anti-myelin basisk protein, til fremstilling av et farma-søytisk preparat for anvendelse i behandling av multippel sklerose i en pasient som har kronisk progressiv multippel sklerose.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori det farmasøytiske preparat skal administreres intravenøst, intratekalt, eller en kombinasjon av begge.

3. Anvendelse som angitt i krav 2, hvori det farmasøytiske preparat inneholder tilstrekkelig peptid slik at det i enhetsdoseringsform kan administreres intravenøst i en dose av peptid som varierer fra 1 mg/kg kroppsvekt til 10 mg/kg kroppsvekt.

4. Anvendelse som angitt i krav 2, hvori det farmasøytiske preparat inneholder tilstrekkelig peptid slik at det i enhetsdoseringsform kan administreres intratekalt i en dose som varierer fra 1 mg til 100 mg.

5. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori pasienten har en HLA-DR2 haplotype.

6. Anvendelse som angitt i krav 5, hvori HLA-DR2 haplotypen omfatter DRB1<*>1501 eller DRB1<*>15021.