RO119303B1 - Proteină de bază a mielinei, compoziţie farmaceutică şi utilizarea acestora pentru tratarea sclerozei multiple - Google Patents
Proteină de bază a mielinei, compoziţie farmaceutică şi utilizarea acestora pentru tratarea sclerozei multiple Download PDFInfo
- Publication number
- RO119303B1 RO119303B1 RO99-01064A RO9901064A RO119303B1 RO 119303 B1 RO119303 B1 RO 119303B1 RO 9901064 A RO9901064 A RO 9901064A RO 119303 B1 RO119303 B1 RO 119303B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- mbp
- patients
- peptide
- patient
- free
- Prior art date
Links
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 110
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 claims abstract description 106
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 102
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108700028031 Myelin Basic Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 200
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 12
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- -1 substitutions Chemical compound 0.000 claims description 6
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 claims description 3
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 2
- 208000007118 chronic progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 abstract description 7
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 97
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 89
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 77
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 77
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 55
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 44
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 32
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 25
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 25
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 24
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 23
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 21
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 101001018318 Homo sapiens Myelin basic protein Proteins 0.000 description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 102000054064 human MBP Human genes 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 8
- SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N His-Phe-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 8
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 8
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 8
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 206010033885 Paraparesis Diseases 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 6
- LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)N LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 6
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 6
- JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N Ala-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N 0.000 description 5
- LBFXVAXPDOBRKU-LKTVYLICSA-N Ala-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LBFXVAXPDOBRKU-LKTVYLICSA-N 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 5
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 5
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N Gly-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N Val-His-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000003016 quadriplegic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N Arg-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- JBSLJUPMTYLLFH-MELADBBJSA-N His-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N)C(=O)O JBSLJUPMTYLLFH-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- 206010033892 Paraplegia Diseases 0.000 description 3
- RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- SSKKGOWRPNIVDW-AVGNSLFASA-N Val-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N SSKKGOWRPNIVDW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N (2s)-2-[2-[[(1s)-1,2-dicarboxyethyl]amino]ethylamino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NCCN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- VHQSGALUSWIYOD-QXEWZRGKSA-N Asn-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VHQSGALUSWIYOD-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 101710110798 Mannose-binding protein C Proteins 0.000 description 2
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 2
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 208000002548 Spastic Paraparesis Diseases 0.000 description 2
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N Asn-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 206010005186 Blindness unilateral Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010064885 HLA-DR3 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010046732 HLA-DR4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010001041 HLA-DR7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N Ile-Val-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000055324 Myelin Proteolipid Human genes 0.000 description 1
- 108700021862 Myelin Proteolipid Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 206010067063 Progressive relapsing multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100332235 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DRN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001077 Spastic ataxia Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gly-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 208000029444 double vision Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000012073 inactive phase Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000037456 inflammatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229940124625 intravenous corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007694 polyacrylamide gel isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la o proteină de bază a mielinei, care este capabilă să neutralizeze sau să moduleze producţia de antiproteină de bază a mielinei, la o compoziţie farmaceutică care conţine proteina de bază a mielinei împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic şi la utilizarea proteinei de bază a mielinei într-o metodă de tratare, identificare şi selectare a pacienţilor cu scleroză multiplă sau de predeterminare a eficienţei tratamentului la un pacient cu scleroză multiplă. ŕ
Description
Invenția se referă la o proteină umană de bază a mielinei, la o compoziție farmaceutică care conține această proteină și la utilizarea acesteia într-o metodă pentru tratarea, identificarea și selectarea paciențilorcu scleroză multiplă sau de predeterminare a eficienței tratamentului la un pacient cu scleroză multiplă.
Se cunoaște că scleroza multiplă (SM) este o boală demielinizantă multifocală a sistemului nervos central (CNS), asociată cu inflamarea. Sinteza crescută a IgG în bariera hemato-encefalică (intra-BBB) este semnul distinctiv al SM (Tourtelotte W. W. J.Nbeurol.Sci. 10:279-304, 1970; Link K. și Tibbling G. Scand. J.CIin. Lab. Invest. 37:397-401, 1977; Tourtelotte W. W. și MaB. Neurology 28:76-83,1978; Walsh J. M. și Tourtelotte W. W. în: editori Hallpike. J.F. Adams C. W. M. și Tourtelotte W. W., Scleroza Multiplă, Baltimore. Williams & Wilkins. 1982: 275 - 358: și Warren K. G. și Catz I. Ann. Neurol. 17:475 - 480, 1985).
Sinteza IgG în BBB este, în general, ridicată la pacienții cu SM definită clinic (Schumacher G. A., Beebe G., Kibler R.E. și colab., Ann. NYAcad.Sci.15:266-272,1965) cu boală activă sau inactivă. Specificitatea majorității IgG CNS este necunoscută. în timp ce o mică proporție are activitate antivirală sau reacționează împotriva antigenilor din creier, a acizilor nucleici, a eritrocitelor sau a antigenilor din mușchiul neted, porțiunea nespecifică poate reprezenta activarea policlonală a celulelor-B (Tourtelotte W. V. și Ma B., Neurology 28:76-83,1978). în timpul ultimei decade a existat un interes considerabil pentru studierea anticorpilor specifici proteinelor mielinice.
După detectarea complecșilor imuni care conțin proteina de bază a mielinei (MBP) drept componenta antigenică (Dasgrupta Μ. K., Catz. I., Warren K. G. și colab., Can. J. Neurol. Sci. 10:239-243,1983), în fluidul cerebrospinal (CSF) al paciențilorcu forme active de SM a fost observat un titru mărit al anticorpilor la MBP (anti-MBP) (Warren K. G. și Catz
I. , Ann. Neurol. 209:20-25,1986). Din punct de vedere clinic, SM este caracterizată prin faze de activitate a bolii cum ar fi recidivă acută sau progresie cronică și prin faze de revenire clinică. SM activă este asociată cu niveluri crescute de anti-MBP produs intratecal (Warren
K. G. și Catz I. Ann. Neurol., 209:20-25,1986; și Catz I. și Warren K. G., Can. J. Neurol. Sci. 13:21 -24,1986). Acești anticorpi se găsesc predominant în formă liberă (F) în timpul recidivei acute și predominant în formă legată (B) atunci când boala progresează în mod insidios (Warren K. G. și Catz I. Ann. Neurol., 209:20-25,1986). în timpul recidivei acute, titrul antiMBP din CSF s-a corelat cu activitatea bolii (Warren K. G. și Catz I. Ann. Neurol., 21:183187, 1987). Nivelurile de anti-MBP au fost, de asemenea, crescute la pacienții cu prime atacuri ale neuriților optici și la cei mai mulți pacienți care se aflau la prima criză de SM (Warren K. G. și Catz I. și Bauer C. Ann. Neurol. 23:297-299,1988; Warren K.G. și Catz I.
J. Neurol. Sci., 91:143-151,1989).
Studiile cinetice longitudinale ale nivelurilor de anti-MBP din CSF la pacienții care au intrat în faza de revenire după o cădere acută, au demonstrat o scădere gradată a titrului de anti-MBP liber coroborat cu o ridicare progresivă în fracția legată (Warren K. G. și Catz I. J. Neurol. Sci., 91:143-151,1989; Warren K. G. și Catz I. J. Neurol. Sci., 88:185-194,1988). în faza de revenire, anti-MBP din CSF poate deveni nedetectabil, ceea ce sugerează o neutralizare a anti-MBP asociată cu faza inactivă a SM (Warren K.G. și Catz I. J. Neurol. Sci., 88.Ί85-194, 1988). Prin contrast, scleroza cronică progresivă, caracterizată prin persistența anti-MBP crescuți pe perioade lungi de timp, a fost asociată cu inhibarea neutralizării anti-MBP (Warren K. G. și Catz /. J. Neurol. Sci., 88:185-194, 1988). Recent, o cascadă a anticorpului proteinei de bază a mielinei, identificată în fracțiunea IgG purificată din CSF de la pacienții cu SM, conținea-antLMBP, anticorpii care neutralizează anti-MBP și · anticorpii care inhibă neutralizarea anti-MBP (Warren K. G. și Catz I. J. Neurol. Sci., 96:1927, 1990).
RO 119303 Β1
Cercetările precedente au demonstrat că din punctul de vedere autoimun al celulelor- 50
B, există cel puțin două forme distincte de SM, majoritatea pacienților având autoanticorpi la proteina de bază a mielinei (anti-MBP) și un număr mai mic având anticorpi pentru proteina proteolipidică (anti-PLP) (Warren K. G. și colab., Ann. Neurol. 35:280-289,1994). La SM asociată cu anti-MBP, recidivele acute sunt asociate cu rapoarte ridicate (mai mari de I) anti-MBP liber (F)/legat (B), pe când faza cronică progresivă este caracterizată prin 55 rapoarte anti-MBP F/B egale sau mai mici de 1, și pacienții cu remisie au uneori un titru de anti-MBP B de mărime medie (Warren K. G. și Catz I. J. Neurol. Sci., 88:185-194,1988).
S-a demonstrat că unele dintre celulele-T proliferante la pacienții cu SM sunt direcționate către MBP (Allegretta și colab. Science, 247:718-721,1990) și că celulele-T umane pot recunoaște epitopi multipli la moleculă (Richert și colab., J. Neuroimmun, 23:55-66, 60
1989). MBP apare de asemenea ca fiind capabilă de a activa unele dintre celulele-T fără implicarea celulelor care prezintă antigen (Altman și colab., Eur. J. Immun. 17:1635-1640, 1987). Se pare că peptidele mici ale MBP pot recunoaște celulele-T fără a fi necesară procesarea intracelulară, pur și simplu prin capacitatea lor de a lega antigenii cu biocompatibilitate majoră de clasa II pe suprafața celulelor prezentate. 65
Deoarece encefalomielita alergică experimentală (EAE), un model animal acceptat de SM, poate fi introdusă prin inocularea rozătoarelor susceptibile fie cu MBP, fie cu PLP, împreună cu adjuvantul complet al lui Freund, procesul de demielinizare din SM poate avea un mecanism autoimun (Fritz și colab., J. Immunol. 130:1024-1026,1983; Trotter și colab., J. Neurol. Sci. 79:173-188, 1987). Din punctul de vedere al autoanticorpilor la celule-B, 70 epitopul MBP țintit de procesul bolii a fost localizat în apropierea secvenței tri-Prolil (reziduuri-99-100-101-) într-o zonă între reziduurile 80 și 100 (Warren K. G. și colab. Ann. Neurol. 35:280-289, 1994). Acest epitop al celulei-B se suprapune peste epitopul imunodominant pentru celulele T reactive la MBP, care sunt găsite în leziunile de SM din creier (Oksenberg J. R. și colab. Nature, 362:68-70,1993). 75
Studiile precedente au arătat că anti-MBP este neutralizat de MBP. Totuși, încercările precedente de a trata SM prin administrare intramusculară sau subcutanată a MBP heterologă nu au fost încununate de succes (Campbell B., Vogel R.J., Fisher E. și Lorenz R., Arch. Neurol. 29:10-15, 1973; Gonsette R. E., Delmonte P. și Delmote L. J. Neurol, 216:27-31, 1977; și Romine J. S. și Salk J., editori Hallpike J. F., Adams C. W. M. și 80 Tourtelotte W. W., Scleroza Multiplă, Baltimore, Williams & Wilkins, 1982:621-630). Problema utilizării MBP nativă are două aspecte. Mai întâi, proteina este preparată din probe de creier uman și, în consecință, există un pericol potențial ca în probă să fie prezente neurovirusuri latente. în al doilea rând, deși MBP solubil nu este în mod uzual un imunogen, este posibil ca atunci când este administrat la indivizi cu un sistem imun alterat, MBP solubilă 85 să poată acționa ca un antigen și să provoace producția de anticorpi contra MBP.
în consecință, prezenta invenție determină dacă anti-MBP purificat din CSF-ul pacienților cu SM poate fi neutralizat de către peptide solubile selectate ale MBP uman (hMBP). în acest scop, peptide sintetice solubile acoperind întreaga lungime a h-MBP au fost utilizate pentru a determina intervalul posibil de epitop asupra căruia h-MBP poate neutraliza 90 anti-MBP obținut de la acești pacienți. Prin urmare, peptide solubile selectate, care demonstrează neutralizarea anti-MBP pot fi utilizate pentru a trata SM mai eficient decât molecula întreagă. Aceste peptide solubil^ sunt produse pe cale sintetică și ca atare nu există amenințarea potențială a unor neurovirusuri. în plus, din cauza dimensiunii lor mici, aceste peptide nu pot acționa ca un imunogen. Prin urmare, utilizarea peptidelor selectate 95 ca tratament pentru SM ar înlătura problemele identificate la utilizarea proteinelor nativa. .........
în plus, peptidele din prezenta invenție au fost investigate pentru a determina eficacitatea lor de a lega sau modula producerea de anti-MBP în SM in vivo.
RO 119303 Β1
Problema pe care o rezolvă invenția este o proteină umană de bază a mielinei, o
100 compoziție farmaceutică care conține această proteină umană și utilizarea proteinei umane de bază a mielinei într-o metodă de tratare, de identificare și de selectare a pacienților cu scleroză multiplă sau de predeterminare a eficienței tratamentului la un pacient.
Proteina umană de bază a mielinei conform invenției, are următoarea formulă: R,Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr-Pro-R2,
105 în care R, este Asp-Glu, R2 este Arg-Thr, incluzând substituții, adiții sau deleții, cu condiția ca acestea să dea o peptidă care să fie capabilă să neutralizeze sau să moduleze producția de anti-proteină de bază a mielinei.
Compoziția farmaceutică, conform invenției, conține proteina definită în revendicarea 1, împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic.
o Utilizarea proteinei umane de bază a mielinei într-o metodă de tratare, de identificare și de selectare a pacienților cu scleroză multiplă sau de predeterminare a eficienței tratamentului la un pacient cu scleroză multiplă când produce, în reacția de răspuns la tratamentul cu o proteină așa cum este definită în revendicarea 1, o cantitate scăzută sau nedetectabilă de anti-MBP, atunci când este asociată cu prezența haplotipului HLA-DR2.
115 Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:
- moderează producția de anticorpi pentru proteina de bază a mielinei umane (antiMBP);
- ușurința determinării empirice a variațiilor ce se pot face în secvența peptidelor selectate fără a afecta funcționarea peptidelor.
120 Conform prezentei invenții sunt obținute peptide care sunt substanțial omoloage secvenței sau unei părți a secvenței de amino acizi din proteina de bază a mielinei umane. Aceste peptide sunt capabile să neutralizeze sau să moduleze producția de anti-MBP. în conformitate cu prezenta invenție, peptidele sunt cele cu formula:
R, -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-I le-R2
125 și săruri ale acestora, în care R1 și R2 sunt selectați în mod independent din grupul constând din hidrogen, hidroxi, resturi de aminoacizi și resturi de polipeptide: cu condiția ca Rt și R2 să nu fie în același timp hidrogen sau hidroxi. Peptidă poate conține substituții, deleții și adiții, cu condiția ca peptidă să-și mențină funcția sa de neutralizare sau să moduleze producerea de anti-MBP.
130 Exemple ale peptidelor respective sunt selectate dintre:
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly
135 MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Glnb Asp Glu
MBP80-97
140 Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro Arg
MBP91-106
Lys Asn lle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle
445----MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val
RO 119303 Β1
ΜΒΡββ-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro 150
MBP82-98
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Thr
Suplimentar, conform prezentei invenții se asigură compoziții farmaceutice care cuprind ca ingredient activ o peptidă așa cum a fost descrisă mai sus, fie singură, fie în combinație, în amestec cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. 155 în plus, conform prezentei invenții, se prezintă o metodă de tratare a sclerozei multiple, cuprinzând administrarea unei cantități eficiente dintr-o peptidă așa cum a fost descrisă mai sus, fie singură, fie în combinație, pentru a neutraliza sau modula efectiv producția proteinei de bază anti-umane a mielinei.
Prezenta invenție se referă la polipeptide selectate, care au secvența substanțial 160 omologă unei părți de secvență de aminoacizi a proteinei de bază a mielinei umane. Prin “substanțial omoloagă” se înțelege că pot exista unele variații între secvența de aminoacid a proteinei de bază a mielinei umane și polipeptide, cu variația în secvența de aminoacid, încă funcționând în scopul intenționat pentru ele, adică pentru a modera producția de anticorpi pentru proteina de bază a mielinei umane (anti-MBP). Date fiind cele arătate în pre- 165 zenta invenție, unei persoane specialiste în domeniu îi va fi ușor să înțeleagă determinarea, empirică, a variațiilor care se pot produce în secvența peptidelor selectate, fără a afecta funcționarea peptidelor.
Pe baza lucrărilor suplimentare legate de prezenta invenție și luând în considerare testele de inhibare competitivă utilizând o serie de 41 decapeptide, epitopul MBP pentru anti- 170
MBP de SM a fost rafinat și localizat într-o zonă între aminoacidul 86 și aminoacidul 95. Bazat pe nivelul cel mai ridicat de inhibare, (egal sau mai mare de 9%) a anti-MBP legat, epitopul MBP pentru anti-MBP de SM este între aminoacidul 85 și aminoacidul 95. Cea mai mică regiune comună a decapeptidelor efective este de la aminoacidul 87 la aminoacidul 93.
Astfel, conform prezentei invenții, peptidele pot fi ilustrate prin următoarea formulă: 175
R^Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Rg și săruri ale acestora, în care Rî și R2 sunt selectați în mod independent din grupa constând din hidrogen, hidroxi, un rest de aminoacid și un rest de polipeptidă: cu condiția ca R, și R2 să nu fie în același timp hidrogen sau hidroxi.
Cei 7 aminoacizi cuprinși între pozițiile 87 până la 93 nu vor fi destul de mari pentru 180 a lega în mod efectiv anti-MBP. Astfel, R, și R2 nu pot fi în același timp hidrogen sau hidroxil.
Atunci când R, sau R2 este un aminoacid, acesta poate fi selectat dintre aminoacizii de origine naturală. R^au R2 nu sunt restricționați la aminoacizii care apar mai sus sau mai jos de Val87 și Ile93 în proteina de bază a mielinei umane, așa cum este arătat în SECV. ID nr.1, se pot utiliza diverse modificări, incluzând substituții, adiții sau deleții în secvențele 185 în amonte sau în aval față de R, și R2. în plus, se pot face modificări, incluzând substituții, adiții sau deleții în secvența -Vai-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle, cu condiția ca peptidele astfel produse să funcționeze în scopul lor intenționat, adică să neutralizeze sau moduleze producția de anticorpi pentru proteina de bază a mielinei.
Prin termenul “rest de polipeptidă” sau “rest polipeptidic” se înțelege că include poli- 190 peptidele de diverse dimensiuni incluzând proteine sau fragmente ale acestora. Așa cum s-a arătat mai sus, atunci când Rf sau R2 este un rest de polipeptidă, R, sau R2 nu se limitează la peptidele care apar mai oua oau mai jos de Val87 și Ile93, în proteina de bază a mielinei umane, se poate utiliza orice rest de polipeptidă.
RO 119303 Β1 într-o variantă a invenției R, poate fi o peptidă selectată din grupul de peptide care se situează în intervalul cuprins de la restul de aminoacid 61 la restul de aminoacid 86 a
SECV.ID nr.1. Lungimea respectivei peptide se poate situa în intervalul cuprins de la un singur rest de aminoacid la un rest din 24 aminoacizi.
într-o altă variantă a prezentei invenții, R2 poate fi o peptidă selectată din grupul de peptide care se situează în intervalul de la restul de aminoacid 94 la restul de aminoacid 106 a SECV.ID nr.1. Lungimea respectivei peptide se poate situa în intervalul cuprins de la un singur rest de aminoacid la un rest din 13 aminoacizi.
R, și/sau R2 pot fi o repetare a secvenței -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle, sau modificări ale acesteia, incluzând substituții, adiții sau deleții. Astfel peptidă poate conține copii multiple ale situsului de legare anti-MBP (epitop).
Compușii din prezenta invenție pot fi preparați conform metodelor larg acceptate pentru sintetizarea polipeptidelor. De asemenea, în domeniul termenului “peptidă” sunt incluse peptidele produse prin tehnici de ADN recombinant. Cunoscând secvența peptidelor selectate, așa cum este dezvăluită în prezenta invenție, determinarea unei secvențe ADN adecvate, care va codifica secvențe selectate de aminoacizi face parte din domeniul prezentei invenții. Secvența ADN adecvată poate fi produsă prin metode convenționale cunoscute, de sintetizare a secvențelor ADN. Secvențele ADN astfel produse pot fi apoi donate în vehicule adecvate de donare și se pot utiliza pentru a transforma o celulă gazdă adecvată pentru a produce peptidă recombinantă. Toată metodologia la care se face referire mai sus este convențională și binecunoscută persoanelor specialiste în domeniu.
Peptidele din prezenta invenție sunt substanțial omoloage ca secvență cu o parte a secvenței de aminoacid a proteinei de bază a mielinei umane. Prin “o parte a secvenței de aminoacid” se înțelege că secvența poate fi de orice lungime cu condiția ca secvența de aminoacid să fie suficient de lungă pentru a funcționa, pentru a modera producția de proteină de bază a mielinei anti-umane, dar nu de o lungime care ar conduce la problemele din stadiul tehnicii atunci când au fost utilizate proteine MBP pentru tratarea in vivo a Sclerozei Multiple. Conform prezentei invenții, peptidele pot fi în lungime de cel puțin 10 aminoacizi. într-un exemplu din prezenta invenție peptidele pot fi de la circa 10 resturi de aminoacizi la circa 25 resturi de aminoacizi. Dacă peptidele din prezenta invenție sunt utilizate ca parte a unei proteine de fuziune, dimensiunea globală a peptidei poate fi mult mai mare.
Conform unei variante a prezentei invenții s-a determinat că peptidele selectate corespunzând substanțial secvenței de aminoacizi a h-MBP sunt eficiente pentru a modera producerea de anti MBP. Aceste peptide corespund secvenței de aminoacizi a h-MBP de circa 61 până la 106 reziduuri. într-un exemplu, aceste peptide corespund secvenței de aminoacizi a h-MBP de la restl 75 la circa restul 106, atunci când peptidele sunt utilizate pentru neutralizarea anti-MBP liber. într-un alt exemplu, aceste peptide corespund secvenței de aminoacizi a h-MBP circa de la reziduul 82 la reziduul 99, atunci când peptidele sunt utilizate pentru neutralizarea anti-MBP liber sau pentru a modera sinteza anti-MBP liber și legat. Prin urmare, peptidele sunt selectate de la reziduuri de 10 aminoacizi la reziduuri de 25 aminoacizi luate dintr-o secvență continuă de aminoacizi din secvența arătată mai jos (SECV. ID nr.1), cu condiția ca respectiva secvență să poată neutraliza sau modula producția de proteină de bază a anti-mielinei.
SECV.ID nr.1
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp ____________
Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly
Ser Gly
RO 119303 Β1
Exemple de peptide sunt selectate din grupa constând din:
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys 245
MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle MBP80-97 250
Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro Arg
MBP91-106
Lys Asn lle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly.
într-o variantă a prezentei invenții peptidele sunt reprezentate prin formula:
R^Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Rg 255 sau săruri ale lor, în care R, și R2 sunt selectați în mod independent din grupa constând din hidrogen, hidroxi, resturi ale unui aminoacid și resturi ale unei polipeptide, cu condiția ca R1 și R2 să nu fie în același timp hidrogen sau hidroxi. Peptidă poate conține substituții, adiții sau deleții ale ei cu condiția de a-și menține funcția de neutralizare sau de modulare a producției de anti-MBP. 260
Exemple de peptide sunt selectate dintre.
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val 265
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro MBP82-98 270
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro Thr
Peptidă MBP82-98 are o solubilitate îmbunătățită față de celelalte peptide utilizate în invenție, din cauza celor cinci resturi hidrofile suplimentare, din peptidă. Astfel, utilizarea acestei peptide este preferată față de celelalte peptide descrise în această invenție.
Rolul potențial al anti-MBP în patogeneza SM continuă să fie explorat. Mărirea titrului 275 de anti-MBP la pacienții cu SM activ a fost raportat inițial de Panitich și colab. (Panitch H.S., Hooper C.S. și Johnson K.P., Arch. Neurol. 37:206-209,1980) care au utilizat o radioimunodeterminare în fază solidă la MBP de la cobai. Pacienții cu căderi acute ale SM au în mod uzual anti-MBP crescut predominant în formă liberă, pe când unii pacienți care sunt în revenire clinică pot avea niveluri nedetectabile de anti-MBP; în timpul fazei de tranziție de la o 280 cădere acută la revenire, titrul de anti-MBP descrește progresiv în săptămâni și luni de zile, în timp ce fracțiunile de anticorp legat cresc comparativ cu valoarea lor inițială. La alți pacienți în revenire este posibil să se observe un titru scăzut de anti-MBP liber și legat, în mod uzual cu un raport de F/B subunitar, sugerând că anticorpii care neutralizează anti-MBP sunt legați la anti-MBP. în mod ocazional, pacienții care se potrivesc criteriilor de SM definită sau 285 pacienții care au SM confirmată din punct de vedere neuropatologic au anti-MBP nedetectabil în timpul fazei active a bolii lor. Este posibil ca astfel de pacienți să aibă anticorpi pentru alte proteine mielinice. Absența unui scenariu specific pentru anticorp nu neagă importanța ► potențială a anti-MBP în mecanismul de demielinizare a majorității pacienților cu SM.
RO 119303 Β1
Recent, a fost observată o cascadă de anticorp anti-MBP în fracțiunea IgG purificată din CSF de SM (Warren K.G. și Catz-, J.Neurol. Sci. 96:19-27, 1990). Anticorpii primari la MBP atât în formă liberă, cât și legată, apar în asociere cu boala activă: rapoartele F/B sunt peste unitate la pacienții cu recădere acută și sub unitate, la pacienții cu boală cronică progresivă (Warren K.G. și Catz I. Ann, Neurol. 209:20-25,1986; Catz.l. și Warren K. G., Can. J. Neurol. Sci., 13:21-24,1986; și Warren K.G. și Catz.l., Ann. Neurol. 21:183-187,1987). Anticorpii secundari care neutralizează anti-MBP apar atunci când boala devine inactivă. Anticorpii terțiari care inhibă neutralizarea anti-MBP sunt prezenți atunci când boala progresează cronic și nu devine inactivă. Faptul că o cascadă de anticorp MBP este asociată cu faze distincte ale SM sugerează posibila sa importanță vis-a-vis de istoria naturală a acestei boli.
Deși anti-MBP se pot detecta în CSF la pacienții cu SM activ, rolul lor direct în patogeneza demielinizării rămâne de confirmat. Implicarea anti-MBP în mecanismul SM poate fi determinată cel mai bine prin moderarea lor, in vivo, prin administrarea unor peptide selectate și monitorizarea cursului clinic al bolii. Dacă anti-MBP este singurul anticorp asociat demielinizării în SM, poate fi posibil să fie blocat acest proces prin administrarea intratecală și/sau intravenoasă a peptidelor MBP selectate care ar scădea reglarea anti-MBP și ar promova toleranța la MBP in situ. Alte proteine umane mielinice pot fi, de asemenea, implicate în demielinizarea SM și, în consecință, utilizarea peptidelor substanțial omoloage ca secvență cu o parte a secvenței de aminoacid a acestor proteine mielinice, pentru a modula anticorpii corespunzători face parte din domeniul prezentei invenții. Deși încercările precedente de a trata SM prin administrare intramusculară sau subcutanată a altor MBP heterologe nu a fost pe deplin încununată de succes (Campbell B., Vogel R.J., Fischer E. și Lorenz R., Arch. Neurol. 29:10-15, 1973; Gonsette R.E., Delmotte P. și Demonty L. J. Neurol. 216:27-31, 1977; și Romine J.S. și Salk J., în: editori Hallpike, J.F. Adams C. W. M. și Tourtelotte W. W., Scleroza Multiplă, Baltimore, Williams & Wilkins, 1982:621-630), administrarea intratecală și/sau intravenoasă a peptidelor MBP care neutralizează sau moderează producția de anti-MBP, conform prezentei invenții, a demonstrat rezultate mai benefice.
Modelul animal de SM, encefalomielită alergică (E.A.E), este o boală de demielinizare mediată de celula T. EAE poate fi ameliorată prin inocularea intraperitoneală a șoarecelui afectat cu peptide MBP sintetice (Gaur A. și colab. Science, 258:1491 -1494,1992). Mai mult, administrarea unor doze mari de peptide MBP a suprimat celulele T și a abrogat semnele clinice și patologice ale EAE la șoareci (Critchfield J. M. și colab., Science 263:11391143,1994) chiar și administrare orală a MBP a modulat EAE prin introducerea toleranței periferice (Chen W. și colab., Science, 265:1237-1240, 1994). O combinație de antigeni mielinici sau peptide sintetice ale acestor antigeni, administrată pe cale intravenoasă și/sau intratecală poate fi cerută pentru a modula celulele T, celulele B și macrofagele implicate în distrugerea mielinei la pacienții cu MS.
în consecință, această invenție se referă, de asemenea, la compoziții farmaceutice care conțin ca ingredient activ o peptidă așa cum a fost descrisă mai înainte, fie singură, fie în combinație, cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Exemple de purtători acceptabili din punct de vedere farmaceutic sunt binecunoscuți în domeniu și includ, de exemplu, serul normal.
Peptidele din prezenta invenție pot fi administrate la oameni pentru tratarea sau modularea Sclerozei Multiple. Doza terapeutică, pentru administrare intravenoasă, pentru tratarea SM poate fi de la circa 1,0 mg pe kilogram corp la circa 10,0 mg pe kilogram corp; pentru administrare intratecală, doza totală poate fi de la circa 1 la circa 100 mg. într-un exemplu din prezenta invenție, peptidă este administrată fie intravenos, fie intratecal, sau în combinație. Peptidele pot fi administrate ca doză unică sau secvențiată, așa după cum poate fi necesar.
RO 119303 Β1
Conform prezentei invenții administrarea intravenoasă s-a găsit că moderează atât anti-MBP liber, cât și legat; pe când, administrarea intratecală a fost eficientă numai pentru neutralizarea sau modularea anti-MBP liber.
într-o variantă a prezentei invenții s-a găsit că administrarea intratecală secvențială a peptidelor MBP poate reduce anti-MBP liber și menține nivelurile sale scăzute timp de 345 câteva luni după ce peptidele au fost injectate la pacienții care suferă de recăderi monosimptomatice. într-un exemplu al acestei variante, 50 mg de peptidă MBP au fost administrate la un pacient zilnic timp de 4 până la 5 zile. în încă un alt exemplu o doză suplimentară poate fi administrată la două - trei săptămâni după injectările inițiale.
Se dau în continuare 18 exemple de realizare în legătură cu fig. 1 ...18, care repre- 350 zintă:
- fig.1, localizarea a optsprezece peptide sintetice (numere mici) în legătură cu mole- cula intactă de MBP uman. Peptidele sunt reprezentate prin bare verticale plasate alăturat regiunii lor corespunzătoare regiunii de pe molecula de MBP. Numerele mari reprezintă resturi de aminoacizi din MBP uman; 355
- fig.2, curbele de inhibare ale anti-MBP, purificat și reunit de la 10 pacienți diferiți cu scleroză multiplă, cu MBP uman și peptide MBP;
- fig.3, neutralizarea unui anti-MBP izolat de la un pacient cu scleroză multiplă cu anti-MBP și peptidele MBP 80-97, MBP 91-106 și MBP 75-95;
- fig.4, monitorizarea longitudinală a titrului anti-MBP din CSF la un pacient cu SM 360 cronică progresivă;
Nivelurile de anti-MBP liberă (F) și legată (B) au fost persistent ridicate atunci când s-au luat probe de 26 ori pe o perioadă de 11 ani din 1983 în 1993;
cpm numărători pe minut:
365
-A-..· j j- . cpm probă - cpm oarbă unități de radioactivitate = ——-----------------cpm total - cpm oarbă cercuri deschise: anti-MBP legat, determinat după hidroliza acidă a complecșilor imuni CSF;
cercuri închise: anti-MBP liberă; 370
- fig.5, pacienți pentru control: niveluri de anti-MBP din CSF la 2 “control în timp” (1F56, Fig.5A și 3M66, Fig.5B) și 2 “control timp - ser” (4M45, Fig.5C și 5M59, Fig.5D). La toți cei patru pacienți anti-MBP F și B a rămas ridicat la nivel linear atunci când CSF a fost înregistrat la fiecare 30 min, în primele două ore ca și 24 h mai târziu. Simbolurile ca în fig.4;
- fig.6, studii cu peptidă între pacienți: niveluri de anti-MBP din CSF la patru pacienți 375 (10F30, fig.6A; 13F43, fig.6C, 5M59, fig.6D și 3M66, fig.6D) care au primit cantități crescătoare (1, 2,5, 5 și respectiv 10 mg) dintr-o peptidă sintetică de control MBP35-58, care nu se leagă și o grupă pereche de alți 4 pacienți cu SM (6F53, fig.6B; 8M(41, fig.6E; 4M45, fig.6E și 1F56, fig.6H), care au primit cantități crescătoare (1,2,5,5 și respectiv 10 mg) ale peptidei sintetice MBP75-95. Anti-MBP F din CSF a fost legat depinzând de doza de peptidă 380 MBP75-95 și nu a reacționat cu peptidă MBP35-58. Anti-MBP legat a rămas practic nelegat;
- fig.7, studii cu peptidă între pacienți: atunci când pacienții au fost fie “control în timp” (1F56, fig.7C și 3M66, fig.7D), fie “control timp-ser” (5M59, fig.7A și 4M45, fig.7B) sau atunci când au primit peptidă de control MBP35-58 care nu se leagă (5M59 și 3M66) nivelurile lor de anti-MBP F și B din CSF au rămas neafectate. Prin contrast, când aceiași pacienți 4M45, 385
1F56 și 3M66 au primit mai târziu 5-10 mg de peptidă de legare a anti-MBP. MBP 75-95, anti-MBP liber al lor a devenit nedetectabil pe o perioadă de 7 zile și a revenit la nivelul liniei de bază între 10 și 21 de zile;
RO 119303 Β1
- fig. 8, injectări intratecale repetate cu peptidă sintetică: un pacient cu SM progresivă cronică a primit 10 injectări săptămânale cu 10 mg de MBP75-95 inoculate direct în CSF: titrul de anti-MBP F și B a fost măsurat înainte (cercuri) și la 30 de minute (pătrate) de la inoculare. Anti-MBP liber (cercuri și pătrate închise) au devenit nedetectabile pe o perioadă de 10 săptămâni pe când anticorpul legat a rămas practic neschimbat (cercuri și pătrate deschise);
- fig.9, administrarea intravenoasă a peptidei sintetice: nivelurile de anti-MBP din CSF după o unică injectare intravenoasă cu 500 mg de MBP75-95; atât nivelul de anti-MBP liber, cât și legat, a descrescut semnificativ la 10,16 și 30 de zile de la injectare. Simbolurile sunt ca în fig. 4;
- fig.10, prezentarea suplimentară mai amănunțită a epitopului MBP pentru anti-MBP la SM utilizând un set de 41 decapeptide care acoperă zona dintre resturile 61 și 110.
Legendă:
• barele reprezintă procente de inhibare = 100 - unități de radioactivitate • MBP și peptidă MBP75-95 au fost utilizate drept controale pozitive și au produs inhibarea completă (100%) a ambilor anticorpi liber și legat • peptidele MBP51-60 și MBP111-120 au fost utilizate drept control negativ și au produs o inhibare nesemnificativă (0-10%) a anti-MBP liber și legat • decapeptidele MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 și MBP87-96 care au produs inhibare maximă (90-100%) a ambilor anticorpi liber și legat sunt puternic asociate cu epitopul MBP • linie punctată: limite de 95% credibilitate ale țestului de inhibare;
- fig. 11a, anti-MBP din CSF liber (F)-· și legat (B)-0 la un pacient cu neurită optică unilaterală care a primit două injectări intratecale (it#1 și it#2) cu 50 mg de pMBP86-95, la diferență de 4 săptămâni; w = număr de săptămâni;
- fig. 11b, nivelurile de anti-MBP din CSF liber (F)-· și legat (B)-0 la un pacient cu neurită optică unilaterală completă, care a primit multiple injectări intratecale (it#1, it#2, it#3, it#4 și it#5)cu 50 mg pMBP82-98 în timpul primei săptămâni de recădere.
- fig 11c, nivelurile de anti-MBP din CSF liber (F)-· și legat (B)-0 la un pacient cu pseudoteroză care a primit cinci injectări zilnice intratecale (it#1, it#2, it#3, it#4 și it#5)cu 50 mg pMBP82-98;
- fig. 11 d, nivelurile de anti-MBP din CSF liber (F)-· și legat (B)-0 la un pacient cu SM cu recădere progresivă care a primit patru injectări intratecale (it#1, it#2, it#3 și it#4)cu 50 mg pMBP86-95 la fiecare două la trei zile în timpul primei săptămâni a unei reveniri și o injectare intravenoasă (IV) cu 400 mg pMBP86-95 atunci când boala a reintrat în fază progresivă;
- fig 12, nivelurile de anti-MBP din CSF liber și legat la un pacient cu recădere polisimptomatică care a primit un total de șapte injecții intratecale (it#1, it#2, it#3, it#4 și it#5)cu 50 mg pMBP82-98. Cu 50 mg de pMBP86-95. Nu s-a obținut nici o probă de CSF la 30 de minute după it#2; o probă de CSF a fost obținută 24 h mai târziu. Simbolurile sunt ca în fig. 11;
- fig. 13, nivelurile de anti-MBP din CSF liber și legat la un pacient SM cu recădere progresivă care a primit injecții atât intratecale (it#1, it#2 și it#3) cât și intravenoase IV#1 și I V#2 pMBP82-98. Nu s-a obținut nici o probă de CSF înainte sau după it#2. Simbolurile sunt ca în fig. 11;
- fig. 14, nivelurile de anti-MBP din CSF liber și legat la un pacient SM cu recădere progresivă care a primit injectări intravenoase (I V#1, IV#2 și IV#3 și intratecale (it#1 la it#9) cu 400 mg de pMBP86-95 și pMBP82-98. Simbolurile sunt ca în fig. 11;
RO 119303 Β1
- fig. 15, o încercare de a preveni căderi viitoare la un pacient cu SM cu recădere progresivă care a primit două injectări intravenoase (IV#1 și I V#2) cu 400 mg de pMBP86-95 și pMBP82-98. Nu s-a obținut nici o probă de CSF în timpul primei recăderi, 3 luni după IV#1. Rata naturală a recăderii este reprezentată în vârf prin săgeți corespunzând lunii atacului. Zonele îngrădite reprezintă timpul experimentului. Simbolurile sunt ca în fig. 11.
- fig. 16, încercarea de a preveni recăderi viitoare la un pacient SM cu recădere progresivă care a primit două injecții intratecale (it#1 și it#9) și o injecție intravenoasă (IV) cu pMBP86-95. , doză mare de metilprednisolon intravenos. Rata naturală a recăderilor este reprezentată la vârf prin săgeți care corespund lunii atacului. Zona împrejmuită reprezintă timpul experimentului. Simbolurile sunt ca în fig. 11.
- fig. 17, efectul administrării intratecale și intravenoase a peptidei asupra autoanticorpilor specifici pentru MBP din CSF la un pacient cu SM cronică progresivă: în care în fig. 17a pMBP75-95 a fost injectat direct în CSF (2,5 mg în 5 ml de ser) și anticorpii specifici la MBP au fost măsurați prin radioimunodeterminare în fază solidă la diferite puncte temporale (0,5 ore la 7 zile după injectare). Injecția cu peptidă a condus la neutralizarea tranzitivă a anti-MBP liber (cercuri închise) dar nu a afectat anti-MBP legat (cercuri deschise). Autoanticorpii au fost nedetectabili la 1 și 2 h și au început să revină la valorile liniei de bază între 12 și 24 h după injectare. Observații similare au fost făcute de alți șapte pacienți cu SM cronică progresivă. în fig. 17b, la treisprezece luni după injectarea intratecală a peptidei arătată în fig. 17a, au fost injectate intravenos 500 mg de pMBP75-92 în 50 ml de saramaură și s-au măsurat autoanticorpii specifici MBP în CSF pe o perioadă de 3 luni (media ± deviația standard);
- fig. 18, un compozit al nivelurilor de anti-MBP din CSF la treisprezece pacienți cu SM cronică progresivă cărora li s-a făcut o injectare intravenoasă (IV#1 cu 5 la 6 mg/kg corp (256-500 mg în saramură normală) cu PMBP75-95 (2 pacienți) sau pMBP86-95 (11 pacienți); s-a determinat atât anti-MBP liber, cât și legat (cercuri închise și respective deschise). Nivelurile de autoanticorpi au fost joase sau nedetectabile între una și două luni după IV”1, când au început să revină la nivelurile liniei de bază. între 6 și 10 luni după IV#1, toți pacienții au primit o a doua injecție intravenoasă cu pMBP82-98în aceeași doză (IV#2).
în timp ce această invenție este descrisă în detaliu cu referire particulară la variantele preferate ale acesteia, următoarele exemple sunt oferite pentru a ilustra dar a nu limita invenția.
Exemplul 1. Neutralizare in vitro a proteinei de bază a mielinei anti-umane
Fig. 1 arată localizarea a 18 peptide ale h-MBP utilizate în acest studiu în legătură cu molecula intactă de MBP. MBP nativă a fost izolată din țesut de creier fără SM (Diebler G. E., Martenson R. E., Kies M. W., Prep. Biochem. 2:139-165, 1972) și a fost purificată suplimentar prin filtrare pe gel și cromatografie lichidă de înaltă presiune în fază inversă (HPLC). Preparatele finale de antigen au fost verificate pentru puritate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă-SDS. Numai preparatele care au migrat la greutate moleculară de 18,5 KD au fost utilizate pentru studii ulterioare. MBP purificată a fost utilizată în cromatografia de afinitate specifică antigenului, pentru studii de neutralizare și în radioimuno determinări anti-MBP în fază solidă.
Optsprezece peptide acoperind lungimea h-MBP și conținând între 8 și 25 reziduuri de aminoacizi au fost sintetizate prin metoda Fmoc, așa cum a fost descris precedent (Groome N.P. Dawkes A., Barry R. și colab., J. Neuroimmun. 19:305-315,1988). Puritatea peptidei a fost verificată prin HPLC cu fază reversată cu o coloană C18 și gradient de apă/acetonitril (0,1 % ATF). Analiza de aminoacid a peptidelor a fost, de asemenea, realizată utilizând analize standard. Multe dintre peptidele utilizate în acest studiu conțineau reziduuri nenaturale de cisteină atunci când au fost făcute să funcționeze ca imunogen împreună cu adjuvantul lui Freund. Acest lucru este improbabil să afecteze prezentele descoperiri.
440
445
450
455
460
465
470
475
480
485
RO 119303 Β1
Fluidul cerebrospinal (CSF) a fost obținut într-o săptămână de la instalarea simptomelor la 35 de pacienți cu SM cu recădere acută și prin nefelometrie au fost determinate nivelurile de IgG. Probe de CSF utilizate în acest studiu au fost selectate pentru a avea inițial niveluri absolute mari de lgG(^0,080 g/l) și titru crescut de anti-MBP (raport F/B > 1,0). Toți pacienții cu SM au boală definită din punct de vedere clinic.
IgG a fost purificată din CSF concentrat al pacienților cu SM acută prin cromatografie de afinitate pe proteină A-Sepharose (Pharmacia™) așa cum a fost descris precedent (Warren K. G. șl Catz I., J. Neurol. Sci. 96:19-27,1990). Puritatea fiecărui preparat IgG a fost verificat prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă și focalizare izoelectrică. Atunci când nivelurile ridicate de anti-MBP din IgG purificată au fost absorbite la zero cu MBP, post absorbția supernatanților conținea IgG rezidual indicând că anti-MBP reprezintă numai o fracțiune a IgG mărit.
MBP purificată a fost cuplată la Sepharose 4B activată cu CNBr (Pharmacia™) conform indicațiilor fabricantului IgG din CSF purificată conținând niveluri crescute de anti-MBP de la 35 de pacienți cu recădere acută de SM a fost utilizată pentru a izola anti-MBP prin cromatografie de afinitate Sepharose-MBP (Warren K. G. și Catz I. J. Neurol. Sci. 103:9096.1991). Probele purificate de anti-MBP au fost comparate cu sursa inițială de IgG prin electroforeză de gel de poliacrilamidă. Atunci când au fost purificate probele de anti-MBP au fost absorbite la zero cu MBP, supernatanții postabsorbție nu conțineau InG rezidual, ceea ce indică puritatea anti-MBP.
Cantități constante de anti-MBP (15 unități radioactive de legare corespunzând la 100 pentru scopuri de expansiune scalară = 0%) au fost incubate cu cantități crescătoare de hMBP (0-100 ng) sau peptide individuale ale MBP (0-10.000 ng) într-un test în fază lichidă și după 1,5 h de incubare s-au determinat nivelurile de anti-MBP liber în toate amestecurile. Anti-MBP izolat de la 7 indivizi cu SM sau anti-MBP adunat de la 10 pacienți diferiți s-a utilizat în experimente de neutralizare. Histonă din timus de vițel și albumină serică umană s-au utilizat drept controale negative de antigen (interval: 10-1000 ng). Drept controale pozitive de anticorp s-au utilizat un anticorp monoclonal (Mab) la peptidă MBP64-78 și un ser policlonal de iepure la peptidă MBP1-8 (GroomeN., Harland J. șl Dawkes A., Neurochem. Int. 7:309-317,1985; Barry R., Payton M. și Groome N., Neurochem. Int. 2:291 300, 1991). Drept control anticorp negativ a fost utilizat un alt anticorp monoclonal de șoarece la epitopul 45-50.
Nivelurile de anti-MBP au fost determinate prin radioimuno determinare în fază solidă cu MBP uman (Warren K. G. și Catz I. Ann. Neurol. 209:20-25,1986; Warren K. G. șl Catz
I., Ann. Neurol. 21:183-187, 1987; și Warren K. G. și Catz i., J. Neurol. Sci. 91:143-151, 1989). Nivelurile de anti-MBP liber au fost măsurate pentru toate fracțiunile prin cromatografie de afinitate și în toate amestecurile de neutralizare. Toate probele individuale au fost experimentate în patru exemplare, utilizând același material iodurat pentru a micșora variabilitatea dintre teste.
Anti-MBP purificat a fost complet neutralizat prin MBP și prin peptidele MBP80-97, MBP91-106 și MBP75-95 și a fost parțial neutralizat cu peptidele MBP64-78, MBP69-83 și MBP61-75 (tabelul 1 și fig. 2). Restul de douăsprezece peptide nu au neutralizat anti-MBP purificat și curbele lor cinetice au scăzut în zona hașurată așa cum se arată în fig. 2. Histona din timus de vițel și albumina serică umană nu reacționează cu anti-MBP purificat chiar și la concentrații mari de până la 1000 ng. Mab la peptidă MBP64-78 a fost inhibată numai de peptidă MBP64-78 și Mab la peptidă MBP1 -8 a fost inhibată numai de către peptidă MBP1 -8. Peptidă MBP45-50 nu a reacționat cu MBP sau oricare dintre peptide (pentru claritatea figurii nu sunt ilustrate datele de control). Probele de control demonstrează valabilitatea abordării neutralizării, întrucât fiecare anticorp de control a fost complet neutra Ii7at de către peptidă așteptată și de către nici o altă peptidă. Aceasta arată că, chiar la concentrația mare de peptidă (10.000 ng) a fost observată specificitatea recunoașterii.
RO 119303 Β1
540
Tabelul 1
| SECVENȚĂ DE MBP UMAN | REACTIVITATE CU ANTI-MBP |
| 1-70 | ++ |
| 1-8Cy | |
| Cy4.18 | |
| C11-24 | |
| 18-32 | |
| 26-40 | |
| Cy35-58 | |
| Cy51-64Gly | + |
| Cy64-78 | + |
| Cy61-75 | + |
| Cy69-83 | ++ |
| Cy75-95 | ++ |
| Cy80-97Gly | ++ |
| Cy91-106 | |
| 117-129 | |
| Cy127-140 | |
| Cy136-149 | |
| 141-155 | |
| Cy149-162 |
++ neutralizare completă + neutralizare parțială
- reactivitate nesemnificativă
545
550
555
560
Anti-MBP purificat de la 7 pacienți individuali cu SM a fost complet neutralizat cu hMBP și peptidele MBP80-97, MBP91 -106 și MBP75-95 (vezi fig. 3 cu un exemplu ilustrativ). 565 Din cauza cantităților limitate de anticorpi obținuți de la pacienții individuali cu SM, anti-MBP nu a fost reacționat cu restul de 15 peptide.
Așa cum s-a notat mai înainte, anti-MBP a fost neutralizat cu peptidele care se întind de la circa reziduul de aminoacid 61 la circa reziduul de aminoacid 106. Peptidele care nu au neutralizat anti-MBP acoperă ambele terminații, atât amino (circa reziduurile 1 la 63) cât 570 și carboxil (circa reziduurile 117-162) ale h-MBP. Apare că peptidele de la diferite regiuni nesuprapuse ale MBP neutralizează aceiași anticorpi. Acest lucru ar putea fi explicat dacă anticorpii recunosc un epitop discontinuu (asamblat) conținând aminoacizii din diferite regiuni. Un fenomen similar a fost observat mai înainte de Hruby și colab. (Hruby S., Alvord E. C., Groome N. P. șl colab., Molec. Immun. 24:1359-1364,1987) care au arătat că un anti- 575 corp monoclonal de șobolan are un epitop major în secvența MBP 112-121, dar_aputemică— reacție încrucișată cu un alt epitop din peptidă 39-91. Acest lucru este mai plauzibil decât posibilitatea ca anticorpul să fie reticulat cu două secvențe complet diferite care nu formează
RO 119303 Β1 un epitop discontinuu (Hruby S., Alvord E. C., Martenson R. E. și colab., J. Neurochem. 44:637-650,1985). Datele de neutralizare ar putea fi explicate prin capacitatea peptidelor din diferite secțiuni ale MBP de a ocupa fiecare parțial porțiunea de legare a anticorpului prin interacțiune cu diferite catene laterale de aminoacid ale anticorpului. Această explicație se potrivește cu observațiile că peptidele care dau inhibare completă (MNPA60-97, MBP91 -106 și MBP75-95) sunt aproximativ de 100 ori mai puțin eficiente pe o bază moleculară decât MBP intact pentru cauzarea inhibării. Prin ipoteza avansată mai sus, aceasta s-ar putea datora fiecărui clon de peptidă care este capabil să realizeze energia de legare a epitopului original MBP.
Exemplul 2. Neutralizarea sau modularea in vivo a procedurii de proteină mielinică de bază anti-umană
Selectare pacienți și studii de control
Pacienții care au participat la acest proiect de cercetare au fost văzuți la Clinica de îngrijire și Cercetare a Pacienților cu Scleroză Multiplă a Universității din Alberta. Edmonton. Canada. Pacienții au fost diagnosticați ca având scleroză multiplă definită din punct de vedere clinic conform criteriului lui Schumacher (1965) confirmat prin imagistică de rezonanță magnetică a creierului și profiluri imunochimice ale CSF. Pentru a ilustra că în SM cronică progresivă anti-MBP au fost ridicate în mod constant pe perioade lungi de timp, pacienților li s-au făcut puncții lombare repetate cu monitorizarea anti-MBP liber și legat. La un pacient cu SM cronică progresivă s-a observat că autoanticorpul a rămas persistent ridicat pe perioade lungi de până la 11 ani și că descreșterea spontană a nivelurilor de anti-MBP nu a apărut (fig.4 este un exemplu ilustrativ).
Pentru a determina că nivelurile ridicate inițial de anti-MBP din CSF au rămas relativ constante pe timp de 24 h, la 2 pacienți (1 F56 și 3M66) li s-au luat repetat probe de CSF la fiecare 30 min timp de 2 h ca și la 24 h mai târziu, cu monitorizarea anti-MBP liber și legat (fig.5A și respectiv 5B). Pacienții 1F56 și 3M66 au servit drept “control timp”. Nivelurile de anti-MBP liber și legat au rămas ridicate constant atunci când s-au luat probe de CSF la fiecare 30 min timp de 2 h ca și 24 h mai târziu.
în plus în mod similar s-a determinat efectul inoculării a 5 cm3 de ser normal în CSF; fig.5C și respectiv 5D). Acești pacienți au servit drept “controale timp-ser”. Atunci când s-au injectat 5 cm3 de ser normal intratecal, nivelurile de anti-MBP liber și legat au rămas ridicate la niveluri lineare, atunci când s-au luat probe de CSF ca mai sus, astfel demonstrând că “efectul diluării” asupra titrului de anti-MBP a fost neglijabil.
Nivelurile de anti-MBP au fost determinate prin radioimuno determinate în fază solidă cu MBP uman acoperit pe eprubete de microtitrare Immulon. Eprubetele de microtitrare Immulon au fost acoperite cu 100 μΙ de MBP 10 μΙ/ml (1 μg/eprubetă) și au fost incubate peste noapte la 370C. După stingere cu albumină serică bovină (BSA) și trei spălări cu apă, eprubetele au fost depozitate la temperatura camerei. Probe de 100 μΙ de CSF sau extract tisular diluate la 0,010 g de IgG/l (cu 0,01 M ser tamponat cu barbitol (BBS) pH 6,9 - 7,1, 0,5% BSA și 0,05% Tween 20) au fost incubate în eprubetele acoperite cu MBP timp de 1 2 h la temperatura camerei. După 5 spălări cu tampon (cu 0,01 M BBS, 0,5 BSA și 0,05% Tween 20), eprubetele au fost incubate cu IgG-Fc specific, de capră anti-iepure (în 0,01 M BBS, 0,05% Tween 20,0,5% BSA) timp de 1 h la temperatura camerei și apoi au fost spălate ca mai sus) în final, s-a adăugat 125l)-proteină A (sau 125l-proteină G) și s-a incubat 1 h la temperatura camerei. Atunci când s-a utilizat 125l-proteină G ca marker. BSA a fost înlocuită cu o albumină în tamponul de testare și pentru stingere. După trei spălări finale cu apă, eprubetele au fost contorizate individual. Rezultatele sunt exprimate în radioactivitate definită ca: (contorizări ale probei - contorizări ale probei oarbe) + (contorizări ale radioactivității totale - contorizările probei oarbe). Toate probele sunt efectuate în 10 exemplare și timpul de contorizare este de 10 min pentru a colecta >10.000 numărători pentru orice probă pozitivă.
RO 119303 Β1 înainte de a fi testate toate probele de CSF sau de țesut au fost diluate la o con- 630 centrație finală de IgG de 0,010 g/l. Anti-MBP liber a fost detectat direct în CSF sau extractul de țesut în timp ce nivelurile de anticorp legat au fost determinate după hidroliză acidă a complecșilor imuni cu soluție de glicină tamponată cu HCI pH 2,2. Legarea nespecifică a fost realizată pentru fiecare probă în eprubete nepelicularizate. Pentru localizarea epitopului, peptidele sintetice au fost mai întâi reacționate cu anticorp purificat într-un test competitiv 635 în fază lichidă și apoi anti-MBP a fost determinat prin radioimuno determinare în toți supernatanții rezultați. Rezultatele testului combinat de legare competitivă și ale radioimuno determinării au fost exprimate ca procente de inhibare ale peptidei sintetice ca 10O-unități de radioactivitate. Probele au fost făcute în 10 exemplare și au fost contorizate timp de 10 min fiecare în contor LKB1275 Minigama. O rezervă de anti-MBP purificat din țesut a fost utilizată 640 la 5 diluții prestabilite drept controale pozitive. CSF adunat de la pacienți cu boli neneurologice a fost utilizat drept controale negative. Reproductibilitatea între teste a fost între 3 și 5% și variația între teste a fost mai mică de 7%.
Persistența anti-MBP din CSF la nivel ridicat și constant la pacienții care au participat drept control (control timp și control diluant) au permis etapa următoare a acestei cercetări. 645 Experiment dublu orb Faza 1 controlat cu peptidă - injecție intratecală
A fost condus un experiment Faza 1 pentru a determina efectul peptidei sintetice MBP75-95 asupra titrului de anti-MBP liber și legat din CSF. Ulterior primirii aprobării de la Comisia Etică de Cercetare de la Universitatea din Alberta, acest proiect a fost condus pe pacienți cu SM definită din punct de vedere clinic (Schumacher și colab. Ann. N. Y. Acad. Sci. 650
122.552-568, 1965), puternic afectați și cu boală avansată progresivă. După obținerea consimțământului informat, 14 pacienți s-au oferit voluntari pentru acest studiu; opt pacienți au fost selectați pe baza titrului lor inițial de anti-MBO liber din CSF (peste 8 unități de radioactivitate) (Tabelul 2) pentru a primi o injecție intratecală fie cu peptidă MBP75-85 care leagă anti-MBP in vitro, fie o peptidă de control care nu leagă MBP35-58 (Warren și Catz, 655 1993b). Experimentul a fost condus în manieră dublu oarbă astfel încât nici cercetătorii, nici pacienții nu au cunoscut natura inoculului. Toate peptidele au fost codificate cu numere de 7 cifre generate la întâmplare de către un medic independent. Peptidele pereche au fost dizolvate în 5 cm3 ser normal și injectate în CSF prin intermediul unei puncții lombare, au fost administrate în doze crescătoare de 1, 2,5, 5 și 10 mg. S-au luat probe de CSF înainte de 660 injectare (linia de bază), la intervale de 30 min timp de 2 h după injecție, 24 h mai târziu și apoi la intervale săptămânale timp de 3-4 săptămâni până când nivelurile de anti-MBP a revenit la linia de bază. Numărătoarea celulelor, totalul de proteină, nivelurile de glucoză, IgG și albumină au fost determinate prin radioimuno determinare, așa cum a fost descris mai înainte. 665
Tabelul 2
| ID Pacient #, sex, vârstă | Durată boală (ani) | EDSS Kurtzke | anti-MBP CSF (unități radioact.) | Selectat pentru cercetare | |
| liber | legat | ||||
| 1F56 | 10 | 8,5-triplegie | 9 | 10 | Da |
| 1M50 | 18 | 6-parapareză | 2 | 10 | Nu |
| 3M66 | 20 | 9-cvadriplegie | 11 | 12 | Da |
| 4M45 | 21 | 9-cvadriplegie | 10 | 11 | Da |
| 5M59 | 28 | 9-cvadriplegie | 8 | 10 | Da |
RO 119303 Β1
Tabelul 2 (continuare)
| ID Pacient #, sex, vârstă | Durată boală (ani) | EDSS Kurtzke | anti-MBP CSF (unități radioact.) | Selectat pentru cercetare | |
| liber | legat | ||||
| 6F53 | 19 | 9-cvadriplegie | 10 | 9 | Da |
| 7F33 | 11 | 6-parapareză, ataxie | 5 | 13 | Nu |
| 8M41 | 8 | 8-triplegie | 9 | 12 | Da |
| 9M49 | 7 | 7-parapareză | 5 | 10 | Da |
| 10F38 | 7 | 8,5-paraplegie | 11 | 10 | Nu |
| 11M49 | 20 | 8-triplegie | 6 | 13 | Nu |
| 12M35 | 12 | 6,5-parapareză, ataxie | 7 | 12 | Nu |
| 13F43 | 15 | 8-paraplegie | 9 | 10 | Da |
| 14F32 | 4 | 6-parapareză, ataxie | 8 | 7 | Nu |
Tabelul 2: date clinice și niveluri anti-MBP din CSF la 14 pacienți cu SM cronică progresivă care s-au oferit voluntari pentru a participa la studiul de cercetare Faza 1 a unei injectări intratecale cu peptidă sintetică MBP. Deoarece a fost necesar un nivel inițial mare de anti-MBP (>8 unități de radioactivitate) pentru a atinge o schimbare semnificativă după injectare, numai 8 din 14 pacienți au fost selectați pentru studiu.
Toate peptidele utilizate în aceste studii au fost sintetizate sub codul “produs bine fabricat” (GMP) utilizând metoda Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil) de către Procyon Inc. (London, Ontario, Canada). Puritatea peptidei a fost verificată prin cromatografie lichidă de înaltă presiune în fază inversă pe o coloană C18 și gradient de apă-acetonitril conținând 0,1% ATF. Spectrometria de masă și analiza de aminoacid au fost realizate prin metode standard. înainte de inoculare toate peptidele au fost verificate pentru pirogenicitate (Spitalul General din Vancouver, Vancouver, Canada), sterilitate (Laboratorul Provincial pentru Sănătate Publică pentru Northern Alberta, Edmonton, Canada) și toxicitate acută (Health Sciences Laboratory Animal Services, Universitate Alberta, Edmonton, Canada) și au fost declarate “adecvate pentru administrarea la oameni”. Cantități adecvate de peptide sintetice codificate au fost dizolvate în 5 cc de ser normal steril (0,9% injecție cu clorură de sodiu USP, nepirogenică, Baxter Corp., Rtoronto, Canada), s-au filtrat prin unități sterile de filtrare de 0,22 pm (MiIlex-GX, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) și s-au administrat în CSF prin intermediul unei puncții lombare.
Studii cu peptidă între pacienți
Pacienții 6F53, 8M41,4M45 și 1F56 au primit peptida sintetică MBP75-95 capabilă să lege anti-MBP in vitro și pacienții 10F36, 13F43, 5M59 și 3M66 au primit un “control”, peptidă sintetică MBP35-58 care nu leagă în cantități crescătoare de 1, 2,3, 5 și respectiv 10 mg (fig. 6). La pacientul 6F53 (fig. 6B) care a primit 1 mg de MBP 75-95 a fost observată o descreștere de 75% a anti-MBP liber urmată de o revenire imediată la nivelul de bază; pacientul 8M41 (fig. 6D) care a primit 2,5 mg de MBP75-95 a arătat o neutralizare prin legare, completă a anti-MBP liber urmat de revenire la nivelul e bază în 24 h; la pacientul 4M45 (fig. 6F) care a primit 5 mg de MBP75-95 a apărut o neutralizare prin legare a antiMBP liber prin precipitare și complet și a persistat timp de 7 zile, revenind la valoarea sa inițială atunci când s-au luat probe 21 de zile mai târziu: pacientul 1F56 (fig. 6H) a primit 10 mg
RO 119303 Β1 de MBP75.95 care, de asemenea, a produs neutralizarea completă prin legare a anti-MBP liber care a persistat 7 zile și a revenit la valoarea de bază atunci când s-au luat probe 14 725 zile și 28 de zile mai târziu. Nivelurile legate de anti-MBP nu au fost semnificativ modificate printr-o inoculare intratecală cu MBP75-95. La pacienții 10F38,13F43,5M59 și 3M66 care au primit respectiv 1,2,5,5 și 10 mg de “control” peptidă MBP35-58 care nu leagă, nivelurile de anti-MBP liber și legat au rămas neschimbate de la nivelurile de bază inițiale ridicate în timpul experimentului de 24 h (fig. 6A, 6C, 6F și respectiv 6G). Parametrii CSF tradiționali 730 de inflamare în SM, cum ar fi numărarea celulelor, nivelurile absolute de proteină totală, IgG și albumină, legarea oligoclonală, indexul IgO și sinteza IgG din CNS au rămas neschimbate înainte și după administrarea peptidei.
Studii cu peptidă intrapacient
Experimentele intrapacient au fost conduse pentru a micșora variabilitatea interpa- 735 cient. La pacientul 5M59 care fie a fost “control timp fie a primit 5 mg de peptidă MBP35-58 care nu leagă, nivelurile de anti-MBP liber au rămas ridicate la nivelul de bază în timpul ambelor experimente (fig.7A). Pacientul 4M45 a fost inițial un “control cu diluant” și două luni mai târziu acesta a primit 5 mg de MBP75-95. Anti-MBP-ul său liber a rămas constant ridicat în toate probele colectate în timpul experimentului cu “diluant” și a devenit nedetectabil după 740 amdinistrarea MBP75-95 (fig.7B). Rezultate similare au fost obținute la pacientul 1F56 care a avut niveluri persistent ridicate de anticorp liber în timpul experimentului “control în timp” și după administrarea a 10 mg de MBP75-95 anti-MBP liber al său a devenit nedetectabil (fig.7C). Un studiu complet a fost realizat pe pacientul 3M66. Nivelul său de anti-MBP liber a fost persistent ridicat în timpul experimentului “control în timp” sau atunci când i s-au admi- 745 nistrat 10 mg de MBP35-58; totuși, atunci când s-au injectat 10 mg de MBP75.95, anti-MBP liber a fost complet neutralizat și a rămas nedetectabil timp de 7 zile (fig.7D).
Administrarea repetată a peptidei sintetice MBP75-95
După determinarea că peptidă MBP75-95 a neutralizat anti-MBP liber in vivo pe perioade mai mari de 7 zile, aceasta a fost aleasă pentru a inocula repetat 10 mg de MBP75- 750 95 în fluidul spinal la intervale săptămânale timp de 10 săptămâni. Acest experiment a fost condus pe 3 pacienți diferiți cu SM cronică progresivă care nu au participat la proiectul de unică injecție cu peptidă și care s-au oferit voluntari pentru acest studiu. Anti-MBP liber și legat s-au determinat cu 1-2 săptămâni înainte de prima inoculare, înainte de și la 30 min după fiecare dintre cele 10 injectări și din nou după o lună de la ultima injectare. Numărarea 755 celulelor, nivelurile de proteină totală, glucoză, IgG și albumină au fost determinate la toate CSF-urile obținute înainte de fiecare dintre cele 10 injectări. înainte de prima și după ultima !
injectare s-a obținut sânge și a fost analizat pentru electroliți, creatină, enzime cardiace și i din ficat și tabloul hematologic.
Atunci când pacienții cu SM cu boală cronică progresivă au primit injecții intratecale 760 repetate cu 10 mg de MBP75-95 la intervale săptămânale, pe perioade de până la 10 săptămâni, anti-MBP-ul lor liber și legat inițial a fost nedetectabil atât timp cât peptidă a fost admi- !
nistrată; atunci când peptidă nu a mai fost administrată, anti-MBP liber și legat au revenit lai nivelul inițial într-o lună (fig.8). Titrul de anticorp legat a rămas constant ridicat de-a lungul’ întregului experiment, sugerând că la acești pacienți sinteza anti-MBP a continuat, și admi- 765!
nistrarea intratecală a peptidei produce numai un “efect de măturare” a anti-MBP liber.
Pacienții care au primit fie o singură injecție cu peptidă sintetică, fie injecții săptămânale repetate au scleroză multiplă cronică progresivă cu un grad avansat de inaptitudine neurologică. Nici unul dintre acești pacienți nu a raportat înrăutățirea simptomelor neurologice sau exacerbarea SM după administrarea intratecală a peptidei și în CSF nu a apărut 770 un răspuns celular. Pacienții cu SM care au primit inoculări repetate cu MBP75-95 au fost monitorizați pentru complicații sistemice incluzând schimbări electrolitice ca și disfuncții _______i cardiace-ficat-rinichi și schimbări hematologice, și nu au apărut complicații adverse. Nu au Γ fost observate efecte adverse. i κυ îiyaua di
Administrarea intravenoasă a MBP75-95
După determinarea că administrarea intratecală a peptidei MBP75-95 produce completa neutralizare a anti-MBP liber fără schimbarea nivelului de anticorp legat, s-a decis să se determine efectul administrării intravenoase a aceleiași peptide asupra titrului CSF de anti-MBP liber și legat: 500 mg de MBP75-95 s-au dizolvat în 100cm3 de ser normal și s-au injectat intravenos pe timp de 30 min la pacientul 8M41 cu monitorizarea anti-MBP din CSF la fiecare 30 min pe perioada primelor două ore, după 18 h ca și la 10,16 și 30 de zile mai târziu. S-a obținut sânge înainte de injectare ca și 16 și 30 de zile mai târziu și a fost analizat, pentru electroliți, creatină, enzime cardiace și din ficat, și tabloul hematologic. Fluidul spinal a fost monitorizat pentru numărarea celulelor, nivelurile de proteină totală, glucoză, IgG și albumină. Nu au fost observate efecte adverse.
Așa cum este arătat în fig.8, administrarea intravenoasă a 500 mg de MBP75-95 nu a produs nici o schimbare a titrului de anti-MBP liber și legat din CSF în primele două ore. O scădere de 30% a anti-MBP liber din CSF a fost observată 18 h mai târziu. Atunci când s-au luat din nou probe de CSF cu 10,16 și 30 de zile mai târziu ambii anti-MBP liber și legat au scăzut de la nivelul lor inițial de 11 unități de radioactivitate la 4,2 și respectiv 1 unitate de radioactivitate.
O observare reperată la toți pacienții tratați intratecal cu MBP75-95 a fost persistența nivelurilor ridicate de anticorp legat, pe când anti-MBP liber devine nedetectabil în funcție de răspuns-doză. Aceasta sugerează că sinteza autoanticorpilor la MBP a rămas activă în timpul și după administrarea intratecală a MBP75-95. Ca o consecință a acestei observații, MBP75-95 a fost administrată intravenos la un pacient care a primit mai înainte o singură injecție intratecală cu peptidă. După administrarea intravenoasă, ambele niveluri de antiMBP liber și legat au arătat o scădere semnificativă atunci când au fost monitorizate pe perioade de până la o lună. Scăderea nivelurilor de anti-MBP atât liber, cât și legat din CSF după administrarea intravenoasă a MBP75-95, sugerează că această cale de administrare produce moderarea procesului inflamator autoimun responsabil pentru sinteza anti-MBP. într-un stadiu ulterior, nivelurile de anti-MBP au început să crească la 4-6 luni de la prima injecție intravenoasă: o a doua injecție intravenoasă cu aceeași peptidă (auxiliar) produce scăderea reglării sintezei anti-MBP pe o perioadă de până la 2 ani la aproximativ 70 de pacienți diferiți cu SM cronică progresivă.
Epitop MBP pentru anti-MBP SM
Pentru a localiza suplimentar epitopul MBP pentru anti-MBP la SM, anti-MBP liber și legat, purificat prin cromatografie de afinitate din CSF și țesut de creier cu SM (Warren
K. G. și colab. Ann. Neurol. 35:280-289,1994) au fost reacționați în teste de inhibare competitivă cu 42 peptide MBP consecutive de lungime egală (fiecare de 10 reziduuri și suprapunându-se celor adiacente cu 9) acoperind zona dintre reziduurile 61 și 110 a MBP uman. Peptidele care produc maximum de inhibare au fost considerate a fi cele mai puternic asociate cu situsul de legare a anticorpului.
Maximum de inhibare (>80%) a ambilor anti-MBP, liber și legat, purificați din țesut de creier cu SM (fig. 10) a fost produs de patru decapeptide și anume MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 și MBP87-96 ceea ce sugerează că epitopul MBP pentru anti-MBP SM este localizat între reziduurile 84 și 96. Zona minimă de reziduuri comune de aminoacid este de la reziduul 87 la rereziduul 93. Anti-MBP legat are o zonă mai restrânsă decât anticorpul liber.
Rolul anticorpilor anti-MBP în patogeneza demielinizării SM nu a fost elucidat și poate fi determinat numai prin modularea anti-MBP in vivo și ulterior, observând rezultatele clinice și patologice. De exemplu, în timpul recăderii acute a SM, atunci când rapoartele F/B de anticorp sunt peste unitate, o peptidă cunoscută că leagă anti-MBP liber (F) poate fi inoculată intratecal, pentru a lega anticorpul care circulă liber, și poate termina efectele clinice ale
RO 119303 Β1 recăderii acute; administrarea săptămânală poate fi necesară până la apariția revenirii. La pacienții cu SM cu boală cronică progresivă și recăderi acute suprapuse, poate fi necesară 825 atât administrarea intratecală, cât și intravenoasă, pentru a modula mecanismele inflamatorii care produc anti-MBP.
Exemplul 3. Dozarea adecvată a pMBP86-95saupMBP82-98administrată intratecal la pacienții cu recădere acută
Recăderile SM sunt asociate cu rapoarte F/B de anti-MBP mai mari de 1,0 din cauza 830 nivelurilor mai mari de anticorp liber decât legat în CSF. în general, pe o perioadă de 3 luni, în timp ce o recădere intră în faza următoare de recădere/revenire, nivelurile de anti-MBP liber descresc gradat și atunci când revenirea biologică este completă, anti-MBP liber și legat din CSF devin în general nedetectabile în CSF.
Pacienții care au participat în următoarele exemple au avut SM fie cu recădere- 835 revenire, fie cu recădere progresivă.
în acesta și în exemplele următoare au fost utilizate fie pMBP86-95, fie pMBP82-98. PMBP86-95 are o solubilitate foarte scăzută în ser normal deoarece conține patru reziduuri hidrofile și șase reziduuri hidrofobe. Pe de altă parte, pMBP82-98 are solubilitate crescută în ser normal, ca un rezultat al celor cinci resturi hidrofile. 840
Doi pacienți au fost studiați pentru a se determina doza adecvată de pMBP86-95 sau pMBP82-98 administrată intratecal, care ar reduce imediat anti-MBP liber la niveluri nedetectabile. Un pacient avea o recădere acută cu ataxie la mers și dezechilibru al trunchiului. La inițierea atacului, acest pacient a primit o singură injecție intratecală cu 10 mg de pMBP8695; au fost măsurate nivelurile de anti-MBP liber și legat înainte și la 1 h după injecție și de 845 încă cinci ori în timpul următoarelor 3 luni. Această doză a suprimat anti-MBP liber numai parțial și curba de revenire a anticorpului a urmat îndeaproape cursul natural; acest pacient a continuat să aibă parapareză spastică și ataxie. S-a tras concluzia că o singură injecție intratecală cu 10 mg de pMBP86-95 a fost inadecvată pentru a suprima total anti-MBP liber și a modifica rata naturală de revenire. 850
Celălalt pacient, de sex feminin, în vârstă de 18 ani, cu neurită optică acută care a primit o singură injecție intratecală cu 50 mg de pMBP86-95, avea nivelurile de anti-MBP liber și legat măsurate înainte și la 30 min de la injectare. La treizeci de minute după injectare, anticorpul liber a devenit nedetectabil. Pacientul nu a acceptat puncții lombare ulterioare. Astfel, s-a conchis că sunt necesare doze de cel puțin 50 mg pentru a lega și 855 neutraliza anti-MBP liber din CSF pe o perioadă de cel puțin 30 min.
Exemplul 4. Frecvența și durata administrării la pacienții cu recăderi monostimptomatice în acest exemplu au fost determinate frecvența și durata administrării pMBP care ar menține nivelurile de anticorp liber scăzute sau nedetectabile. Cei patru pacienți studiați în 860 acest grup au primit peptide sintetice în timp de o săptămână de la inițierea atacului.
Primii doi pacienți aveau neurită optică unilaterală acută. Unul dintre acești pacienți (fig. 11a) a primit două injecții intratecale cu 50 mg de pMBP86-95 (it#1, it#2) la diferență de patru săptămâni. După fiecare injecție anti-MBP liber a devenit nedetectabil într-o oră. Atunci când a fost măsurat după o săptămână de la prima injecție,anti-MBP era ridicat, și 4 săptă- 865 mâni anticorpul liber era semnificativ ridicat. La acel moment pacientul a primit a doua injecție intratecală (it#2) și anti-MBP liber a devenit nedetectabil după 30 min, dar ulterior nu a fost monitorizat până în 24 h. S-a conchis că această frecvență era neadecvată și ar putea fi necesare injecții multiple în timpul primei săptămâni a unui atac, pentru a se menține niveluri neglijabile de anticorp.
870
RO 119303 Β1
Cel de-al doilea pacient cu neurită optică unilaterală completă a primit injecții intratecale multiple cu 50 mg de pMBP82-98 în timpul primei săptămâni a atacului său: patru injecții zilnice (Figura 11 b; it# 1, it#2, it#3 și it#4)și o a cincea injecție (it#5) după o săptămână. Profilul anti-MBP al acestui pacient a arătat o scădere rapidă constantă pe perioada de 7 zile. Mai important, la 7 săptămâni și 6 luni după it#5, nivelurile de anti-MBP din CSF au rămas nedetectabile și pacientul nu a suferit nici o recădere a neuritei optice nici un alt tip de recădere SM. în plus, orbirea unilaterală secundară neuritei optice a fost recuperată total.
Aceeași schemă cu injecții intratecale zilnice cu 50 mg de pMBP82-98 a fost apoi administrată la pacienți cu diferite tipuri de recăderi mono-simptomatice. Fig. 11c ilustrează profilul anti-MBP al unui pacient cu pseudoatetoză acută a mâinii stângi, care a primit intratecal, cinci injecții zilnice cu 50 mg de pMBP82-98 (it# 1, it#2, it#3, it#4, it#5) în a doua săptămână a atacului său. Nivelurile de anti-MBP liber au scăzut la valori nedetectabile în interval de 4 zile și au rămas nedetectabile atunci când au fost determinate la 11 zile și după o lună. Pacientul a recăpătat constant funcțiunea mâinii sale stângi, astfel încât a putut din nou să conducă motocicleta și să cânte la chitară.
Ultimul pacient avusese un atac acut de hemiplegie stângă suprapusă pe SM progresivă cronică. A fost măsurat anti-MBP înainte și după 30 min de la prima injecție (fig. 11 d: it#1, it#2, it#3, it#4) și după 10 zile de la prima injecție. Anti-MBP liber ridicat inițial a devenit nedetectabil în următoarele 7 zile de la prima injecție, când pacientul a revenit din punct de vedere clinic și biochimic la starea sa cronică progresivă, și curând după aceasta a primit intravenos 400 mg de pMBP86-95. Aceasta a suprimat nivelul său de anti-MBP legat timp de 4 luni după injecția i.v. Totuși, după ultima sa puncție lombară la 8,5 luni de la injecția intravenoasă, boala revenise la modelul cronic progresiv atât din punct de vedere clinic, cât și biochimic.
Exemplul 5. Frecvența și durata administrării la pacienții cu recăderi polisimptomatice
Aceleași peptide MBP au fost apoi administrate la pacienți cu atacuri polisimptomatice, care afectează zone multiple ale CSF. Acest grup a constat din trei pacienți: unul cu recădere-revenire și doi cu boală cu recădere progresivă.
Primul pacient avea o exacerbare polisimptomatică gravă. în timpul primei săptămâni de recădere aceasta a primit trei injecții cu 50 mg de pMBP86-95 în zilele 1, 3 și 7) fig 12: it#1, it#2 și it#3). Anti-MBP s-a măsurat înainte de fiecare injecție și 30 min mai târziu. După ce a primit aceste trei injecții, anti-MBP liber a fost suprimat la niveluri aproape nedetectabile. Atunci când s-a măsurat după o lună, anti-MBP liber era în creștere și la 1,5 luni recăderea era din nou activă din punct de vedere clinic și confirmată biochimic. La acel moment pacientul a primit o a doua repriză de patru injecții intratecale cu 50 mg de pMBP86-95 în zilele 45, 48, 49 și 50 ale recăderii (it#4, it#5, it#6 și it#7). Anti-MBP a fost măsurat înainte și la treizeci de minute după fiecare injecție și de încă trei ori în următoarele două luni. Din nou anti-MBP liber a fost suprimat pe timp de cel puțin două săptămâni, dar pacientul a revenit din nou și la acel moment nivelul ei de anticorp liber a revenit la nivelul inițial de înainte de pre-cădere în mod clar este necesară o administrare intratecală mai susținută a peptidei sintetice pentru a menține niveluri scăzute/nedetectabile de anti-MBP liber pe perioade mai lungi de timp.
Cel de-al doilea pacient avea SM cu recădere progresivă (fig. 13). Inițial în forma progresivă (F=B), el a primit intravenos 500 mg de pMBP86-95 (IV#1). Deși ambele niveluri de anticorp liber (F) și legat (B) erau întrucâtva scăzute după o lună, la 9 săptămâni după injecția i.v., pacientul a suferit o recădere clinică polisimptomatică asociată cu nivel crescut de anti-MBP liber. La acest moment, el a primit trei injecții intratecale cu 50 mg de pMBP-8695 (it#1, it#2 și it#3) în zilele 1, 3 și 12 ale recăderii și anti-MBP a fost măsurat înainte, la 30 min și la 24 h după prima și a doua injecție. Atunci când a fost examinat după o lună,
RO 119303 Β1 pacientul revenise la starea sa clinică și biochimică inițială de parapareză spastică progresivă atunci când, în interval de 2 săptămâni, el primise o a doua injecție intravenoasă cu 500 mg de pMBP86-95 (I V#2). Nivelurile de anti-MBP liber și legat din CSF care au fost monitorizate la zi în serie în următoarele 26 de luni au rămas suprimate comparativ cu nivelurile de bază. Capacitatea sa de a sta în picioare și a merge a fost substanțial îmbunătățită. 925
Ultimul pacient din acest grup cu SM, inițial în faza progresivă (F=B), a primit intravenos 500 mg pMBP86-95 (IV#1). A fost măsurat anti-MBP din CFS la 9 zile după, apoi lunar în de timp 2 luni și 4,5 luni după IV#1. După această injecție, nivelurile de anti-MBP liber și legat au fost suprimate timp de 2 luni; la 4,5 după IV#1, pacientul s-a plâns de creșterea slăbiciunii, confirmat clinic ca și din punct de vedere biochimic prin niveluri crescute de 930 anticorp compatibile cu boala cronică progresivă. în luna următoare el a primit o a doua injecție intravenoasă cu 500 mg de pMBP82-98 (IV#2). Analiza CSF a probei luate chiar înainte de a doua injecție, a fost sugestivă pentru un model de recădere acută (F>B), și în ziua următoare, pacientul a dezvoltat diplopie acută din cauza unei pareze a părții laterale drepte. La acest moment a devenit clar că trecea printr-o recădere acută, clinică și biochi- 935 mică, care a persistat pe perioada următoarelor 4,5 luni și a fost caracterizată prin dezechilibrul grav al poziției și mersului, slăbiciunea picioarelor și vedere dublă. într-un efort de a-i scădea anti-MBP liber crescut, acest pacient a primit în două reprize intratecal pMBP82-98. în timpul primei reprize inițiată la 4,5 luni de la începerea recăderii, el a primit 50 mg de pMBP82-98, zilnic (it#1, it#2, it#3, it#4 și it#5) și nivelurile de anti-MBP au fost măsurate 940 înainte și, la 30 min după fiecare injecție, au rămas rezonabil de ridicate. Deoarece recăderea a persistat, și a fost grav afectantă, s-a decis să se mai administreze o a doua repriză de doză mai mare de peptidă și cu frecvență mai mare, și pacientul a primit 100 mg de pMBP82-98 de două ori pe zi timp de două zile (zilele 19 și 20, it#6, it#7, it#8 și it#9). AntiMBP a fost măsurat înainte și după 30 min de la fieccare injecție. Ulterior acestei doze și 945 frecvențe crescute, anti-MBP liber a fost adus la niveluri neglijabile și atunci când a fost testat după o săptămână (ziua 28), profilul său CSF a fost compatibil cu boala, progresând încet (anti-MBP F/B=1,0). La acest moment pacientul a primit o a treia injecție intravenoasă cu 500 mg de pMBP82-98 (IV#3) care nu a mai moderat producția de anti-MBP.
Exemplul 6. Administrarea intravenoasă a peptidelor MBP într-o încercare de a 950 preveni recăderi viitoare
Doi pacienți cu SM cu recădere progresivă care au căderi frecvente au fost injectați intravenos, fie cu pMBP86-95, fie cu pMBP82-98, pentru a determina dacă această cale de administrare va preveni atacuri ulterioare.
Primul pacient a suferit 2 la 3 recăderi pe an timp de 4 ani, cu progresare rezultantă 955 în trepte a paraparezei spastice (fig. 15). Acesta a primit două injecții intravenoase la interval de 6 luni, una cu 400 mg de pMBP86.95 (IV#1) și a doua cu 400 mg de pMBP82-98 (IV#2); monitorizarea clinică și analiza CSF au fost făcute lunar. Fig. 15 arată nivelurile de antiMBP pe o perioadă de 9 luni (zona superioară îngrădită). Prima injecție intravenoasă a moderat sinteza anti-MBP timp de circa 2 luni. în timpul celei de-a treia luni de la injectare, acest 960 pacient a suferit o recădere clinică; din nefericire nu s-a obținut CSF la acel moment. în timpul lunii a 2-a și a 3-a, după rezolvarea recăderii boala a reintrat în faza clinică progresivă, acest pacient a primit cea de-a doua injecție intravenoasă (IV#2). Anti-MBP din CSF a fost din nou suprimat timp de 2 luni dar, după trei luni de la cea de-a doua injecție, pacientul a avut o altă recădere asociată cu anti-MBP liber marcat ridicat. Similar ratei de 965 recădere pe care le-a avut în cei 4 ani precedenți, acest pacient a continuat să aibă 2 la 3 recăderi pe an, în ciuda faptului că a primit două injecții intravenoase cu pMBP86-95 și pMBP82-98.
RO 119303 Β1
Un al doilea pacient (fig. 16) care a suferit de la 1 la 4 recăderi acute pe an în 10 ani precedenți (scala superioară) a devenit grav indisponibilizat, paraplegic și dependent de cărucior. în timpul celui de-al 11-lea an, pacientul a suferit din nou patru recăderi (zona superioară îngrădită), deși a primit intratecal și intravenos peptide MBP sintetice. în timpul primei recăderi, după ce a primit intratecal două injecții cu 50 mg de pMBP86-95 în ziua 1 și ziua 6 (it#1, it#2) nivelul său de anti-MBP liber a fost substațial redus; în ziua 6 ea a primit de asemenea intravenos 300 mg de pMBP86-95 (IV) care a suprimat ulterior ambii anticorpi liber și legat pe perioada următoarelor 3 luni. La patru luni de la injecția intravenoasă, acest pacient a suferit o altă recădere clinică care a continuat să se înrăutățească în timp: nivelurile de anticorp din CSF au fost foarte ridicate și la 6,5 luni de la injecția IV pacientul a primit o repriză de patru injecții zilnice cu 50 mg de pMBP82-98 (it#3, it#4, it#4, it#5 și it#6), care nu au reușit să suprime nivelurile de anticorp liber și să rezolve recăderea clinică.
Exemplul 7. Compararea diferitelor căi de administrare a peptidelor în studii inițiale, peptidele MBP au fost administrate la opt pacienți cu SM cronică progresivă. Pacienții au primit intratecal fie o peptidă MBP de legare MBP75-95 sau o peptidă control care nu leagă MBP35-58 în doze crescătoare de la 1 la 10 mg în 5 ml de soluție fiziologică; cei patru pacienți care au primit inițial peptidă de control care nu leagă MBP35-58 mai târziu au primit peptidă de legare MBP75-95.
Injectarea MBP75-95 în CSF a condus la neutralizarea trecătoare a anticorpilor liberi specifici MBP; autoanticorpii MBP legați nu au fost afectați. Durata efectului a durat 1 oră (1mg de peptidă), 24 ore (2,5 mg de peptidă) sau 7 zile (5-10 mg de peptidă). Deoarece efectul administrării intratecale a peptidei a fost incomplet (anti-MBP legat a rămas ridicat) și relativ de scurtă durată, această cale de administrare a fost comparată cu injectarea intravenoasă. Spre deosebire de administrarea intratecală, autoanticorpii MBP atât liberi, cât și legați, au devenit nedetectabili la o lună după o singură injecție intravenoasă cu 500 mg de MBP95-95 și au rămas la niveluri mici timp de trei luni și, după o injecție auxiliară de susținere, timp de până la 26 de luni (fig. 17). Observații similare au fost puse la punct pentru aproximativ 70 de pacienți cu SM cronică progresivă, la care s-a injectat intravenos o peptidă de legare MBP cum ar fi MBP75-95, MBP86-95, MBP82-98. O doză de 500 mg (5mg/kg greutate corporală) în 10-50 ml de soluție fiziologică normală a fost aleasă din cauza unui volum mai mare de sânge față de CSF (factor 15) și a eliminării rapide a peptidelor din sânge prin rinichi: dozele de peptidă corespunzând celor date intravenos nu au fost administrate intratecal din cauză că astfel de volume nu pot fi injectate în CSF. Rezumând, admininstrarea intratecală, în intervalul de doze testat pe acești pacienți, a condus la o îndepărtare tranzitorie numai a anti-MBP liber, spre deosebire de injecțiile intravenoase care au moderat sinteza anti-MBP, o singură injecție intravenoasă a indus toleranță de lungă durată.
Exemplul 8. Durata toleranței după administrarea intravenoasă a peptidei MBP
Pe baza acestor rezultate a fost examinată dinamica toleranței la MBP a fi pusă la punct pe 70 de pacienți cu SM cronică progresivă care au fost urmăriți timp de peste doi ani, după injecții intravenoase multiple cu MBP75-95, MBP86-95 sau MBP82-98. Peptidele au fost dozate în 5-6 mg/kg corp (256-500 mg) și au fost injectate intravenos în 10-50 ml de soluție fiziologică. înainte de administrarea intravenoasă a peptidei, toți cei 13 pacienți aveau niveluri mari de anticorpi liber și legat în CSF (fig. 18, tabelul 3). La o lună după administrarea peptidei, anticorpii specifici MBP au devenit practic nedetectabili și au rămas la niveluri scăzute în general timp de 3-4 luni, moment la care nivelurile de anticorp au început să crească; linii au revenit la nivelul lor inițial după 8 luni. La șase până la zece luni după IV#1), toți pacienții au primit o injecție auxiliară (IV#2) cu 275-500 mg (5-6 mg/kg greutate corporală) cu MBP82-98 în 10 ml de soluție fiziologică (IV#2). Peptidă mai lungă aleasă
RO 119303 Β1
1020 pentru cea de-a doua injecție a fost mai solubilă și poate fi dizolvată și administrată într-un volum mai mic. în acest grup ca un întreg, nivelurile de anti-MBP din CSF au scăzut dramatic în 6 săptămâni la 2 luni de la injectare și au rămas nedetectabile pe o perioadă mai lungă de timp (până la 26 de luni). Din întregul grup de aproximativ 70 de pacienți, unul a fost incapabil să termine studiul din cauza unei embolii pulmonare și terapie anticoagulantă ulterioară, care a împiedicat alte puncții lombare, și un altul a fost exclus din urmărire, deoarece a primit doză mare de corticosteroizi intravenos. Individual, din cei aproximativ 70 de pacienți, circa 63 aveau niveluri nedetectabile de anti-MBP, la 18-26 luni de la injecția auxiliară.
Exemplul 9. Toleranță de durată la pacienții cu haplotip HLA-DR2
Haplotipurile HLA-DR ale pacienților cu SM au fost determinate prin determinarea moleculară a ADN genomic (tabelul 3). Patru dintre unsprezece pacienți care au mers până la capătul studiului purtau boala asociată cu haplotipul DR2 (DRB1 *1501 sau DRB1 *15021); toți acești pacienți aveau niveluri scăzute sau nedetectabile de autoanticorpi la un an după cea de-a doua injecție intravenoasă cu peptidă MBP. Peptidă MBP se leagă cu mare afinitate la HLA-DR2 și este imunodominantă pentru celulele T specifice MBP, reziduuri acționate cu HLA-DR2, HLA-DR4 (DRN1*0401) și, HLA-DR7 (DRB1*0701) leagă peptidă MBP care a fost administrată; studii de legare nu au fost făcute pentru moleculele DR purtate de pacientul k(M) (DRB1 *0407, DRB1 *0801). Peptidă MBP nu este legată de haplotipul HLA-DR3 (DRB1 *03011) (tabelul 3). Aceste date indică că durata toleranței la MBP depinde de haplotipul HLA-DR a pacientului. Toleranța poate fi de mai lungă durată atunci când ambele celule T și celule B specifice MBP sunt tolerate.
Tabelul 3
1025
1030
1035
1040
Haplotipurile HLA-DR ale pacienților cu SM A. Niveluri scăzute de anti-MBP total la 1 an după IV#2
| Pacient | Haplotipuri HLA-DR | Total anti-MBP(Ru) |
| b(GF) | DRB1*1501 | 4,1 |
| e(F) | DRB1*1501 DRB1*1303 | 2,5 |
| m(M) | DRB1*1501 DRB1*0101 | 3,9 |
| KF) | DRB1 *15021 DRB1*0403 | 3,9 |
| a(M) | DRB1*1401 DRB1*0701 | 4.1 |
| f(M) | DRB1*1701 | 2,4 |
| k(M) | DRBV0407 DRB1*1801 | 4,5 |
1045
1050
B. Niveluri ridicate de anti-MBP total la un an după IV#2
| Pacient | Haplotipuri HLA-DR | Total anti-MBP(Ru) |
| j(M) | DRBV13011 | 7,3 |
| h(F) | DRB1*1101 DRB1*1701 | 9,7 |
| g(F) | DRB1*0101 DRB1*1101 | 19,1 |
| l(M) | DRB1*0403 DRB1 *03011 | 19,0 |
| total anti-MBP: anti-MBP liber + anti-MBP legat |
1055
RO 119303 Β1
Haplotipurile HLA-DR a 11 pacienți cu SM care au completat formularul de urmărire timp de 1 după cea de-a doua injecție intravenoasă cu peptidă (IV#2). Toți cei patru pacienți cu haplotip HLA-DR2 (DRB1*1501 sau DRB1 *15021) au avut niveluri scăzute de autoanticorp timp de 1 an după IV#2.
Exemplul 10. Administrarea subcutanată a peptidei nu induce toleranță
Calea optimă de administrare a peptidei a fost investigată suplimentar prin injectare subcutanată a MBP82-98 în ser la un grup de 33 de pacienți cu S.M. La 26 de pacienți cu SM, cantități crescătoare (1 la 100 mg) dintr-o singură injecție subcutanată cu MBP82-98 nu au afectat nivelul de autoanticorp din CSF (date nearătate): opt dintre acești pacienți au primit ulterior o injecție intravenoasă cu peptidă și în două luni nivelurile de anticorp din CSF au devenit nedetectabile (tabelul 4A). La cinci alți pacienți, o doză totală de 900-1000 mg (5 x 100 mg, zilnic timp de cinci zile consecutive, urmat de o altă injecție subcutanată de 400 sau 500 mg), a condus numai la o descreștere modestă a nivelului de anticorp MBP în CSF (tabelul 4B). Pentru a examina dacă o schemă diferită de administrare ar fi mai eficientă, doi pacienți au primit două injecții subcutanate din 250 mg de MBP82-98, la diferență de o lună (tabelul 4C). Din nou, nivelurile de autoanticorp nu au fost afectate. Luate împreună, aceste date demonstrează că numai administrarea intravenoasă a peptidei MBP induce toleranță de lungă durată la MBP la dozele de peptidă testate în acest studiu.
o co o
RO 119303 Β1 io co o o σ> o io O) o
| 4 luni | XI | o | ci | h- y- | T- | CD v- | IO | sr o | |||
| M— | X. | ci | ID | CO | IO x— | co | 0,3 | ||||
| 2 luni i | xi | Y“ | 8*0 | 3,0* | CD | <o V | 0,9 | 1,0 | O) v— | IO | ro~ |
| M— | o | io | 3,0 | 1,5 | 1,5 | co T— | v— | 2,0 | r- | 9*0 | |
| MBP 8298IV#1, mg | 400 | o o IO | 500 | 400 | 500 | 500 | 500 | 500 | |||
| nivel bază | Xi | 8'6 | 6,7 | 5,6 | 9,3 | 8,9 | 7,4 | 9,0 | o> | 8,4 | IO |
| *♦— | 9,3 | 6,3 | 9*9 | o o | 7,5 | 9,7 | 10,5 | I 8,4 | y— | ||
| Timp scurs (luni) | co | 6,5 | co | co | co | S‘9 | 4,5 | ί 4,5 | |||
| 6-7 săpt. | XI | o | 5,9 | co' | 8,3 | 7,4 | 5,4 | 8,2 | o' | 8,0 | r- |
| M— | 10,2 | 00* | r< | 10,9 | V | <o | IO CD | 10,9 | co oo' | 2,7 | |
| nivel bază | x> | 11,2 | 3,4 | 0'8 | xo | 10,3 | 4,3 | 7,3 | 8,4 | CD l< | 2,6 |
| o | x— oi | co' | 6*6 | 10,2 | y— | 6*6 | 9,9 | 7,9 | 2,9 | ||
| MBP 82-98 SC.mg | IO | C- | o | 40 | 50 | 09 | 100 | 100 | |||
| Pacient ID(sex) | u? LU | K(F | u? z | u_ σ | R(M) | u? ω | X(M) | (IAI)Z | MEDIE SD |
RO 119303 Β1
Β
| Pacient ID(sex) | MBP 82-98 SC.mg | nivel bază | 6-7 săpt. | Timp scurs (Luni) | MBP 82-98 IV#1, mg | 7 săpt. | |||
| f | b | f | b | f | b | ||||
| AA(F) | 100/dx5 | 7,7 | 8,1 | 4,4 | 4,9 | 0,5 | 400 | 4,3 | 3,4 |
| BB(F) | 100/dx5 | 5,4 | 5,4 | 3,5 | 3,7 | 0,5 | 500 | 2,0 | 2,5 |
| CC(M) | 100/dx5 | 5,9 | 5,4 | 6,9 | 8,8 | - | - | ||
| DD(F) | 100/dx5 | 4,6 | 4,8 | 2,7 | 1,9 | 0,5 | 500 | 3,0 | 2,8 |
| EE(F) | 100/dx5 | 7,4 | 8,9 | 3,7 | 3,9 | 0,5 | 400 | 2.6 | 2,4 |
| MEDIE SD | 6,2 | 6,5 | 4,2 | 4,6 | 1.0 | 2,9 | |||
| 1,2 | 1,7 | 1,4 | 2,3 | 0,8 | 0,7 |
C
| Pacient ID(sex) | MBP 82-98 SC.mg | nivel bază | 6-7 săpt. | ||
| f | b | f | b | ||
| GG(M) | 250/mx2 | 8,4 | 8,7 | 7,1 | 8,3 |
| FF(F) | 250/mx2 | 4,8 | 5,3 | 5,4 | 4,2 |
A. Opt pacienți au primit o singură injecție subcutanată cu MBP82-98 (5-100 mg în 1-5 ml de soluție fiziologică) care nu a avut efect asupra nivelurilor de autoanticorpi MBP. Prin contrast, o singură injecție intravenoasă (400 - 500 mg) cu aceeași peptidă administrată la 4,5 până la 8 luni mai târziu a condus la niveluri nedetectabile de autoanticorpi în CSF.
B. Injecțiile subcutanate repetate cu doze mari de MBP82-98 (100 mg/zi, timp de cinci zile consecutiv) au avut un efect modest asupra nivelurilor de anti-MBP din CSF; o doză adițională mare (400 sau 500 mg) de MBP82-98 administrată subcutanat la două săptămâni după primul set de injecții nu a redus suplimentar nivelurile de autoanticorp.
C. Două injecții subcutanate cu doze mari de MBP82-98 (2 x 250 mgf, la interval de o lună) nu au avut efect asupra autoanticorpilor din CSF.
Luate împreună aceste date demonstrează că numai calea intravenoasă de administrare este eficientă pentru inducerea toleranței la MBP.
Variantelor preferate li se pot face diverse modificări fără îndepărtare de scopul și domeniul invenției, așa cum este el definit în revendicări.
Claims (6)
- Revendicări1. Proteină de bază a mielinei, care are următoarea formulă:R^Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr-Pro-Rj, caracterizată prin aceea că R, este Asp-Glu, R2 este Arg-Thr, incluzând substituții, adiții sau deleții, cu condiția ca acestea să dea o peptidă care să fie capabilă să neutralizeze sau să moduleze producția de anti-proteină de bază a mielinei.
- 2. Compoziție farmaceutică caracterizată prin aceea că aceasta conține proteina definită în revendicarea 1, împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic.RO 119303 Β1
- 3. Utilizare a proteinei de bază a mielinei într-o metodă de tratare, de identificare și de selectare a pacienților cu scleroză multiplă sau de predeterminare a eficienței tratamentului la un pacient cu scleroză multiplă când produce, în reacția de răspuns la tratamentul cu o proteină așa cum este definită în revendicarea 1, o cantitate scăzută sau nedetectabilă de anti-MBP, atunci când este asociată cu prezența haplotipului HLA-DR2.
- 4. Utilizare conform revendicării 3, în care haploidul HLA-DR2 cuprinde DRB*1501 sau DRB*15021.
- 5. Utilizare a proteinei de bază a mielinei, definită în revendicarea 1, în fabricarea unui medicament pentru tratarea, identificarea și selectarea pacienților cu scleroză multiplă sau pentru predeterminarea eficienței tratamentului la un pacient cu scleroză multiplă.
- 6. Utilizare conform revendicării 5, în care pacientul suferă de scleroză multiplă progresivă cronică.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA2201841A CA2201841C (en) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
| PCT/CA1998/000290 WO1998045327A1 (en) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | Peptide fragments of myelin basic protein, their pharmaceutical compositions and their use in treating multiple sclerosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO119303B1 true RO119303B1 (ro) | 2004-07-30 |
Family
ID=4160340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO99-01064A RO119303B1 (ro) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | Proteină de bază a mielinei, compoziţie farmaceutică şi utilizarea acestora pentru tratarea sclerozei multiple |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1394178B1 (ro) |
| JP (1) | JP4173557B2 (ro) |
| AT (2) | ATE400582T1 (ro) |
| AU (1) | AU751303B2 (ro) |
| CA (2) | CA2494338C (ro) |
| CY (2) | CY1107445T1 (ro) |
| CZ (1) | CZ299535B6 (ro) |
| DE (2) | DE69839694D1 (ro) |
| DK (2) | DK1394178T3 (ro) |
| ES (2) | ES2307317T3 (ro) |
| HK (1) | HK1063805A1 (ro) |
| HU (1) | HU226768B1 (ro) |
| NO (1) | NO325018B1 (ro) |
| NZ (1) | NZ338091A (ro) |
| PL (1) | PL191965B1 (ro) |
| PT (2) | PT970121E (ro) |
| RO (1) | RO119303B1 (ro) |
| RU (1) | RU2198893C2 (ro) |
| SK (1) | SK285815B6 (ro) |
| UA (1) | UA60331C2 (ro) |
| WO (1) | WO1998045327A1 (ro) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6894033B2 (en) | 2001-06-11 | 2005-05-17 | Transition Therapeutics Inc. | Combination therapies using vitamin B12 and therapeutic agents for treatment of viral, proliferative and inflammatory diseases |
| CN101353094B (zh) * | 2008-09-22 | 2011-04-13 | 刘年路 | 密闭瓶状软塑料袋及其应用 |
| CA2780961C (en) | 2009-10-12 | 2018-10-02 | Lifebio Laboratories Llc | Composition for treatment of multiple sclerosis |
| RU2646817C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2018-03-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Пептид из состава тяжелой цепи иммуноглобулина человека, пригодный для лечения рассеянного склероза |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2053799C (en) * | 1991-10-22 | 2002-03-12 | Kenneth G. Warren | Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid |
| US5817629A (en) * | 1991-10-22 | 1998-10-06 | The Governors Of The University Of Alberta | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
| BR9306272A (pt) * | 1992-04-09 | 1998-06-23 | Autoimmune Inc | Peptídeo e composiçao farmacêutica |
| US5824315A (en) * | 1993-10-25 | 1998-10-20 | Anergen, Inc. | Binding affinity of antigenic peptides for MHC molecules |
| CZ122697A3 (en) * | 1994-10-25 | 1997-09-17 | Immulogic Pharma Corp | Preparations and methods of treating disseminated sclerosis |
| US6329499B1 (en) * | 1994-11-18 | 2001-12-11 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogues of human myelin basic protein |
-
1997
- 1997-04-04 CA CA002494338A patent/CA2494338C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-04 CA CA2201841A patent/CA2201841C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-04 UA UA99116049A patent/UA60331C2/uk unknown
- 1998-04-03 CZ CZ0346499A patent/CZ299535B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 PT PT98914725T patent/PT970121E/pt unknown
- 1998-04-03 AT AT98914725T patent/ATE400582T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 ES ES98914725T patent/ES2307317T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 EP EP03022727A patent/EP1394178B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 ES ES03022727T patent/ES2299657T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DE DE69839694T patent/DE69839694D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DE DE69839163T patent/DE69839163T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 RO RO99-01064A patent/RO119303B1/ro unknown
- 1998-04-03 WO PCT/CA1998/000290 patent/WO1998045327A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-03 RU RU99122954/04A patent/RU2198893C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 AU AU69130/98A patent/AU751303B2/en not_active Ceased
- 1998-04-03 HU HU0000812A patent/HU226768B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 AT AT03022727T patent/ATE386941T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 PT PT03022727T patent/PT1394178E/pt unknown
- 1998-04-03 SK SK1329-99A patent/SK285815B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 JP JP54217098A patent/JP4173557B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-03 PL PL336085A patent/PL191965B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 EP EP98914725A patent/EP0970121B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DK DK03022727T patent/DK1394178T3/da active
- 1998-04-03 NZ NZ338091A patent/NZ338091A/en unknown
- 1998-04-03 DK DK98914725T patent/DK0970121T3/da active
-
1999
- 1999-10-01 NO NO19994806A patent/NO325018B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-09-01 HK HK04106565A patent/HK1063805A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-04-24 CY CY20081100462T patent/CY1107445T1/el unknown
- 2008-08-05 CY CY20081100818T patent/CY1108239T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2157815C2 (ru) | Пептидная специфичность антител к мвр (миелиновому основному белку), содержащая его фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза | |
| US20080242616A1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basis protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| WO1993008212A1 (en) | Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid | |
| RO119303B1 (ro) | Proteină de bază a mielinei, compoziţie farmaceutică şi utilizarea acestora pentru tratarea sclerozei multiple | |
| US7090982B2 (en) | Methods of predicting therapeutic efficacy of treatment of a multiple sclerosis patient | |
| US20020111312A1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| NZ513065A (en) | Peptide fragments of MBP, their pharmaceutical compositions and their use in treating multiple sclerosis |