CZ9903464A3 - Peptidické fragmenty myelinového bazického proteinu, jejich farmaceutické kompozice a jejich použití při léčbě sklerózy multiplex - Google Patents
Peptidické fragmenty myelinového bazického proteinu, jejich farmaceutické kompozice a jejich použití při léčbě sklerózy multiplex Download PDFInfo
- Publication number
- CZ9903464A3 CZ9903464A3 CZ19993464A CZ346499A CZ9903464A3 CZ 9903464 A3 CZ9903464 A3 CZ 9903464A3 CZ 19993464 A CZ19993464 A CZ 19993464A CZ 346499 A CZ346499 A CZ 346499A CZ 9903464 A3 CZ9903464 A3 CZ 9903464A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mbp
- peptide
- val
- patients
- peptides
- Prior art date
Links
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 122
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 title claims description 109
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 title claims description 109
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 6
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 title description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 215
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 124
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims abstract description 23
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 89
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 71
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 71
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 claims description 6
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- -1 hydroxy, amino Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 4
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 claims description 4
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 claims description 3
- SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N His-Phe-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 claims 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 101001018318 Homo sapiens Myelin basic protein Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000054064 human MBP Human genes 0.000 abstract description 24
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 89
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 61
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 25
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 25
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 15
- 208000007118 chronic progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 10
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 206010033885 Paraparesis Diseases 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 7
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 6
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 6
- RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 6
- SSKKGOWRPNIVDW-AVGNSLFASA-N Val-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N SSKKGOWRPNIVDW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 6
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 5
- LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)N LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N Asn-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 4
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 4
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 3
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N Gly-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 3
- JBSLJUPMTYLLFH-MELADBBJSA-N His-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N)C(=O)O JBSLJUPMTYLLFH-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N Ile-Val-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 3
- 206010033892 Paraplegia Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- 206010053395 Progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 208000002548 Spastic Paraparesis Diseases 0.000 description 3
- AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gly-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N Asn-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 2
- WQAOZCVOOYUWKG-LSJOCFKGSA-N Asn-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WQAOZCVOOYUWKG-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- ZFDKSLBEWYCOCS-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C1=CC=CC=C1 ZFDKSLBEWYCOCS-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 2
- ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N Val-His-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N (2s)-2-[2-[[(1s)-1,2-dicarboxyethyl]amino]ethylamino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NCCN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 208000012639 Balance disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108010046732 HLA-DR4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010001041 HLA-DR7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010016230 MBP-8298 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000055324 Myelin Proteolipid Human genes 0.000 description 1
- 108700021862 Myelin Proteolipid Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000001077 Spastic ataxia Diseases 0.000 description 1
- 101001018322 Sus scrofa Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- STGXWWBXWXZOER-MBLNEYKQSA-N Thr-Ala-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 STGXWWBXWXZOER-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002502 anti-myelin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- RCTCWZRPYFBGLQ-WMCRPSJMSA-N dirucotide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 RCTCWZRPYFBGLQ-WMCRPSJMSA-N 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 208000029444 double vision Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000012073 inactive phase Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007694 polyacrylamide gel isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008664 renal activity Effects 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Peptidické fragmenty myelinového bazického proteinu, jejich farmaceutické kompozice a jejich ^27~ ffi použití v léčbě sklerózy multiplex.
Oblast techniky
Vynález se týká vybraných polypeptidů a jejich použití v regulaci imunitní reakce protilátek lidského myelinového bazického proteinu. Vynález se také týká nových farmaceutických kompozicí, které obsahují tyto vybrané polypeptidy a způsobu použití těchto peptidů v léčbě sklerózy multiplex.
Dosavadní stav techniky
Skleróza multiplex je onemocnění, které se projevuje roztroušenou demyelinizací lidské centrální nervové soustavy (CNS) související se zánětem. Charakteristickým znakem sklerózy multiplex je zvýšení syntézy IgG ve vnitřní hematoencefalické bariéře (intra-blood-brain barrier (intra BBB)). (Tortelootte, W.W., J Neurol Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. a Tibbling, G„
Scand J Clin Lab Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte, W. W. a Ma, B., Neurology 28: 76-83,
1978; Walsh, J.M. Tourtelotte, W.W., In: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. a Tourtelotte, W.W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore. Wiliams & Wilkins, 1982: 275-358; a Warren, K. G., a Catz,
I. Ann Neurol 17: 475-480, 1985).
Syntéza IgG ve vnitřní hematoencefalické bariéře (BBB) je u klinicky pozorovaných pacientů (Schumecher, G. A., Beebe, G., Kibler R. E. a kol., Ann NY Acad Sci 15 : 266 - 272,
1965) s aktivní nebo neaktivní sklerózou multiplex většinou zvýšená. Určení množství IgG CNS je neznámé. Zatímco malá část má protivirový účinek nebo působí proti mozkovým antigenům, antigenům nukleových kyselin, erytrocytů nebo antigenům hladkého svalstva, neurčitá část může způsobovat polyklonální aktivaci B-buněk (Tourtelotte, W. W. , a Ma, B., Neurology 28 : 76 83, 1978). Během posledních deseti let se soustřeďoval značný zájem na výzkum protilátek k > určitým myelinovým proteinům.
Poté, co byly v oběhu detekovány imunitní komplexy obsahující myelinový bazický protein (MBP) jako svou antigenní složku (Dasgupta, Μ. K., Catz, I, Warren, K. G. a kol., Can J Neurol Sci 10 : 239 - 243, 1983), byly pozorovány zvýšené titry protilátek k myelinovému bazickému proteinu (anti-MBP) v mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid (CSF)) u pacientů s aktivní formou sklerózy multiplex (Waren, K. G. a Catz, I., Ann Neurol 209 : 20 - 25, 1986).
Klinicky je skleróza multiplex charakterizována ve dvou fázích. Fáze aktivního onemocnění, například akutní recidivy nebo chronický vývoj a fáze klinické remise. Aktivní skleróza multiplex souvisí se zvýšenými hodnotami intratekálně tvořených protilátek myelinového • · bazického proteinu (anti-MBP) (Waren, K. G., a Catz, I., Ann Neurol 209: 20 - 25,1986; a Catz, I. a Warren, K. G., Can J Neurol Sci 13 : 21 - 24,1986). Tyto protilátky se nacházejí převážně ve volné formě (free form (F)) v průběhu akutní recidivy a převážně ve vázané formě (bound form (B)), když se nemoc vyvíjí skrytě. (Warren, K. G., a Catz, I., Ann Neurol 209: 20 - 25, 1986). V průběhu akutní recidivy odpovídají titry protilátek myelinového bazického proteinu (antiMBP) v mozkomíšním moku aktivitě onemocnění (Warren, K. G., a Catz, I., Ann Neurol 21 : 183 - 187, 1987). Hodnoty protilátek myelinového bazického proteinu (anti-MBP) byly také zvýšené u pacientů s prvním projevem zánětu očního nervu a u většiny pacientů trpících prvnímy projevy sklerózy multiplex. (Waren, K. G., a Catz, I., a Bauer, C., Ann Neurol 23 : 297 - 299, 1988; Warren, K. G., a Catz, I., J Neurol Sci 91 : 143 - 151,1989).
Průběžné kinetické studie hodnot anti-MBP v mozkomíšním moku pacientů, u kterých nastala fáze uzdravování po akutní recidivě, ukázaly postupný pokles titrů F anti-MBP v mozkomíšním moku úměrně k nárůstu v B frakcích (Warren, K. G., a Catz, I., J Neurol Sci 91 : 143 - 151, 1989; Warren, K. G., a Catz, L, J. Neurol Sci 88 : 185 - 194, 1988). Ve fázi remise mohou hodnoty anti-MBP v mozkomíšním moku klesnout pod měřitelnou mez, díky neutralizaci související s neaktivní fází sklerózy multiplex (Warren, K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 88 : 185 194, 1988). Naproti tomu, chronický vývoj sklerózy multiplex charakterizovaný trváním zvýšené hladiny anti-MBP po dlouhou dobu, souvisel s inhibici neutralizace anti-MBP (Warren,
K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 88 : 185 - 194, 1988). Novým poznatkem je, že kaskáda protilátky mielinového bazického proteinu, určená ve frakci IgG získané přečištěním mozkomíšního moku pacientů se sklerózou multiplex, obsahuje anti-MBP, protilátky, které neutralizují anti-MBP a protilátky, které inhibují neutralizaci anti-MBP (Warren, K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 96 : 19 27,1990).
Předchozí výzkum ukázal, že s pohledu autoimunity B-buněk existují nejméně dvě různé formy sklerózy multiplex, přičemž většina pacientů má vlastní protilátky myelinového bazického proteinu (anti-MBP) a menší skupina má protilátky proteolipidového proteinu (anti-PLP) (Warren, K. G., a kol., Ann Neurol 35, 280 - 289,1994). U sklerózy multiplex související s antiMBP jsou akutní recidivy spojeny se zvýšením (více než 1) poměru volné/vázané anti-MBP, zatímco vývoj chronické fáze je charakterizován poměrem volné/vázané anti-MBP stejným nebo menším než 1 a pacienti ve fázi remise mají mírně zvýšené titry B anti-MBP (Warren, K. G., a Catz, I., J. Neurol Sci 88 : 185 - 194,1989).
Ukázalo se, že množení T-buněk u pacientů se sklerózou multiplex je namířeno proti S4J3P (Allegretta a kol., Science, 247, 718 - 721, 1990) a lidské T-buňky mohou tedy rozpoznat Četné epitopy na molekule. (Richert a kol., J. Neuroimmun 23, 55 - 66, 1989). Ukazuje se také, že MBP je schopen aktivovat některé T-buňky bez účasti antigenů přítomných buněk. (Altman a kol., Eur. J. Immun. 17, 1635 - 1640, 1987). Je tomu tak pravděpodobně proto, že malé peptidy MBP mohou být rozpoznány T-buňkami bez požadavku vnitrobuněčného zpracování, jednoduše díky jejich schopnosti vázat třídu II hlavních histokompatibilních činidel na povrch přítomných buněk.
Vzhledem ktomu, že experimentální alergická encefalomyelitida (EAE), přijatelný zvířecí model sklerózy multiplex, může být vyvolána naočkováním vnímavých hlodavců buď MBP, nebo PLP spolu s Freundovým kompletním přídavkem, může mít proces demyelinizace při skleróze multiplex autoimunitní mechanismus (Fritz, R. B. a kol., J. Immunol. 130, 1024 1026, 1983; Trotter, J. L. a kol., J. Neurol. Sci. 79, 173 - 188,1987). Z hlediska vlastních protilátek B-buněk byl epitop MBP, který byl cílem vývoje nemoci, lokalizován přibližně v triProlil sekvenci (zbytky -99-100-101-) oblasti mezi zbytky 80 a 100 (Warren, K. G. a kol., Ann. Neurob 35, 280-289, 1994). Tyto epitopy B buněk překrývají imunodominantm epitopy T buněk reagující s MBP, které se nalézají v lezích mozku postiženém sklerózou multiplex (Oksenberg, J.R. a kol., Nátuře, 362,68-70,1993).
Předcházející studie ukázaly, že anti-MBP je neutralizována pomocí MBP. Avšak předchozí pokusy léčit sklerózu multiplex intramuskulárním nebo subkutaneálním podáváním heterologního MBP nebyly úspěšné (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. a Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15,1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. a Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; a Romine, J.S. a Salk, J., In: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. a Tourtelotte, W.W.,1 ads. Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Při použití přírodního MBP nastávají dva problémy. Za prvé, protein je připraven ze vzorků lidského mozku a je zde tedy možné nebezpečí, že ve vzorku mohou být přítomny latentní neuroviry. Za druhé, ačkoli rozpustný MBP není obvykle imunogenem, je možné, že při podávání jednotlivcům s rozdílným imunitním systémem, může rozpustný MBP reagovat jako antigen a způsobit tvorbu protilátek proti MBP.
Popis vynálezu
Vynález tedy určuje, zda přečištěná anti-MBP z mozkomíšního moku pacientů se sklerózou multiplex může být neutralizována určitými rozpustnými peptidy lidského MBP (hMBP). Za tímto účelem byly použity rozpustné syntetické peptidy pokrývající celou délku hMBP, aby bylo určeno možné rozmezí epitopu na h-MBP, který neutralizuje anti-MBP získané z těchto pacientů. To je důvod, proč mohou být určité rozpustné peptidy, které jsou schopny neutralizovat anti-MBP, použity k léčbě sklerózy multiplex s větší účinností, než celá molekula.
• · ·
Tyto rozpustné peptidy jsou synteticky vyráběny, a proto zde není žádné nebezpečí ohrožení neuroviry. Navíc, díky jejich malým rozměrům, nemohou tyto peptidy reagovat jako imunogen. Použití určitých peptidů v léčbě sklerózy multiplex může předejít problémům, které souvisí s použitím přírodního proteinu. Dále byly peptidy podle vynálezu zkoumány pro určení jejich účinnosti ve vazbě nebo modulaci protilátek sklerózy multiplex in vivo.
Vynález se týká peptidů, jejichž sekvence aminokyselin je významně homologní se sekvencí aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu. Tyto peptidy jsou schopny neutralizovat nebo zmírnit tvorbu anti-MBP.
Podle vynálezu jsou peptidy vzorce:
Ri -V al-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2 a jejich soli, kde Ri a R2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, hydroxy skupiny, zbytku aminokyseliny a zbytku polypeptidu; za předpokladu, že Ri a R2 nejsou oba zároveň vodík nebo hydroxyl skupina. V peptidu mohou být provedeny substituce, delece nebo adice, za předpokladu, že peptid si zachová svoji funkci neutralizace nebo zmírnění tvorby antiMBP.
Příklady uvedených peptidů jsou vybrány z:
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu
MBP80-97
Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
MBP91-106
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
MBP82-98
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
Vynález se dále týká farmaceutických kompozic, které obsahují jako aktivní složku peptid, jak bylo uvedeno výše, buď samotný nebo v kombinaci, v příměsi s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Vynález se dále týká způsobu léčby sklerózy multiplex, který zahrnuje podávání účinného množství peptidu, jak bylo uvedeno výše, buď samotného nebo v kombinaci, pro účinnou neutralizaci nebo zmírnění tvorby protilátek lidského myelinového bazického proteinu.
Vynález se týká peptidů, jejichž sekvence aminokyselin je významně homologní se sekvencí aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu. Termínem významně homologní je míněno, že rozdíl mezi sekvencí aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu a peptidů může existovat za předpokladu, že peptidy, s rozdílnou sekvencí aminokyselin, stále plní svoji funkci, tj. snižují tvorbu protilátek lidského myelinového bazického proteinu (anti-MBP). Odborníkům v dané oblasti je z vynálezu zřejmé, jak empiricky určit, jaké změny mohou být provedeny v sekvenci vybraných peptidů bez účinku na jejich funkci.
Na základě další práce vztahující se k vynálezu, pomocí srovnávacích testů inhibice s využitím série 41 dekapeptidů, byl epitop MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex upřesněn a lokalizován do oblasti mezi aminokyselinu 86 a aminokyselinu 95. Na základě nej vyšší hladiny inhibice, (95% a více) B-anti MBP, je epitop MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex mezi aminokyselinou 86 a aminokyselinou 95. Nejmenší společná oblasti účinných dekapeptidů je od aminokyseliny 87 do aminokyseliny 95. Podle vynálezu mohou být tedy peptidy popsány následujícím vzorcem:
Ri - V al-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2 • »
a jejich soli, kde Ri a R2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, hydroxy supiny, zbytku aminokyseliny a zbytek polypeptidu; za předpokladu, že Ri a R2 nejsou oba zároveň vodík nebo hydroxyl skupina.
Úsek 7 aminokyselin ležících na pozicích 87 až 93 nebude pravděpodobně dost velký pro účinné navázání anti-MBP. Proto nemohou být Ri a R2 oba zároveň vodík nebo hydroxy skupina.
Když Ri nebo R2 je aminokyselina, může být aminokyselina vybrána z přírodních aminokyselin. Rj nebo R2 nejsou omezeny na aminokyseliny vyskytující se před nebo za Val87 a Ile93 v lidském myelinovém bazickém proteinu, což je znázorněno v SEQIN NO: 1. Mohou být použity různé změny zahrnující substituce, adice nebo delece v sekvencích před a za Ri a R2. Dále mohou být změny zahrnující substituce, adice nebo delece provedeny na sekvenci -Val-HisPhe-Phe-Lys-Asn-Ile za předpokladu, že peptidy mají stále svoji zamýšlenou funkci; tj. neutralizovat nebo zmírnit tvorbu protilátek myelinového bazického proteinu.
Pojem zbytek polypeptidu znamená různě velké polypeptidy zahrnující proteiny nebo jejich části. Jak bylo uvedeno výše, když Ri nebo R2 je zbytek polypeptidu, nejsou R) nebo R2 omezeny na peptidy vyskytující se před nebo za Val87 a Ile93 v lidském myelinovém bazickém proteinu. Může být použit jakýkoli zbytek polypeptidu.
V jednom provedení vynálezu může být Ri peptid vybraný ze skupiny peptidu v rozmezí od aminokyselinového zbytku 61 do aminokyselinového zbytku 86 SEQ IN NO:1. Délka uvedeného peptidu se může pohybovat v rozmezí od 1 do 26 aminokyselin.
V dalším provedení vynálezu může být R2 peptid vybraný ze skupiny peptidu v rozmezí od aminokyselinového zbytku 94 do aminokyselinového zbytku 106 SEQ IN NO:1. Délka uvedeného peptidu se může pohybovat v rozmezí od 1 do 13 aminokyselin.
Ri a/nebo R2 může být opakováním sekvence -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile, nebo jejich změněná podoba zahrnující substituce, adice nebo delece. Tak může peptid obsahovat množství kopií vazebných míst (epitopů) anti-MBP.
Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny podle běžně používaných metod syntézy polypeptidů. Pojmem peptid se rozumí i peptidy vyráběné technologií rekombinace DNA. Jestliže známe sekvence vybraných peptidů podle vynálezu, zahrnuje vynález určení vhodných sekvencí DNA, které kódují určité sekvence aminokyselin. Vhodné sekvence DNA mohou být vyrobeny běžnými známými metodami syntézy sekvencí DNA. Tak vyrobené sekvence DNA mohou být klonovány do vhodných nosičů klonů a použity k transformaci vhodné hostitelské buňky tak aby vyráběla rekombinantní peptid. Všechny metodiky výše popsané jsou velmi dobře známé odborníkům v dané oblasti.
Peptidy podle vynálezu jsou významně homologní s částí sekvence aminokyselin lidského myelinového bazického proteinu. Pojmem část sekvence aminokyselin je míněno, že sekvence může být jakékoliv délky za předpokladu, že sekvence aminokyselin je dost dlouhá, aby plnila funkci snižování tvorby protilátek lidského myelinového bazického proteinu, ale ne tak dlouhá, aby způsobila problémy již dříve známé v dané oblasti, kdy byly MBP peptidy používány pro léčbu sklerózy multiplex in vivo. Podle vynálezu mohou být peptidy alespoň 10 aminokyselin dlouhé. V jednom příkladu vynálezu mohou být peptidy od asi 10 aminokyselin do asi 25 aminokyselin. Jestliže jsou peptidy vynálezu používány jako část fuzního proteinu, celková velikost peptidů může být mnohem větší.
Podle jednoho provedení vynálezu bylo určeno, že vybrané peptidy významně odpovídající sekvenci aminokyselin h-MBP jsou účinné ve snižování tvorby anti-MBP. Tyto peptidy odpovídají sekvenci aminokyselin h-MBP od zbytku asi 61 do zbytku asi 106. V jednom příkladu odpovídají tyto peptidy sekvenci aminokyselin h-MBP od zbytku 75 do zbytku asi 106, kde jsou peptidy použity pro neutralizaci volných anti-MBP. V dalším příkladu odpovídají tyto peptidy sekvenci aminokyselin h-MBP od zbytku asi 82 do zbytku asi 92, kde jsou peptidy použity pro neutralizaci F anti-MBP nebo snižují syntézu F a B anti-MBP. Proto jsou peptidy vybrány ze zbytků s 10 aminokyselinami až 25 aminokyselinami, které jsou vzaty ze spojité sekvence aminokyselin ukázané dále (SEQ IN NO:1), za předpokladu, že zmíněná posloupnost může neutralizovat nebo zmírnit tvorbu antimyelinového bazického proteinu.
SEQINNO:1
His His Přo Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg
Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly 106
Příklady peptidů jsou vybrány se skupiny sestávající z;
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys
MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Valů Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr MBP80-97
Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
MBP91-106
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly
V jednom provedení vynálezu jsou peptidy popsány následujícím vzorcem:
Ri-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2 a jejich soli, kde Ri a R2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, hydroxy skupiny, aminokyselinový zbytek a zbytek polypeptidu; za předpokladu, že Ri a R2 nejsou oba zároveň vodík nebo hydroxyl. V peptidech mohou být provedeny substituce, delece nebo adice za předpokladu, že peptidy si udrží svoji funkci neutralizace nebo zmírnění tvorby anti-MBP.
Příklady peptidů jsou vybrány z:
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
MBP82-98
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
Peptid MBP82-98 má větší rozpustnost, než ostatní peptidy podle vynálezu díky pěti přidaným hydrofilním zbytkům. Použití tohoto peptidu je tedy s výhodou před ostatními peptidy podle vynálezu.
Potenciální úloha anti-MBP vpatogenezi sklerózy multiplex bude dále zkoumána. Zvýšení titru anti-MBP u pacientů s rozvinutou sklerózou multiplex bylo nejdříve popsáno vPanitch a kol. (Panitc, H.S., Hooper, C.D., a Johnson, K.P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980),
kde bylo použito rádio imunitního testu na pevné fázi u MBP morčete. Pacienti s rozvinutou recidivou sklerózy multiplex mají většinou zvýšené anti-MBP hlavně ve volné formě, zatímco někteří pacienti v klinické remisi nemají určitelné hladiny anti-MBP.Během přechodné fáze od akutní recidivy k remisi titry volné anti-MBP silně poklesnou během týdnů nebo měsíců, zatímco vázané části protilátky rostou ve srovnání s jejich počátečními hodnotami. U jiných pacientů v remisi je možné pozorovat nízké titry volných a vázaných anti-MBP obvykle s poměrem F/B menším než jedna, anti-MBP neutralizující protilátka(y) jsou pravděpodobně vázány na anti-MBP. Příležitostně pacienti, kteří splňují kritéria klinické sklerózy multiplex, nebo pacienti, kteří mají neuropatologicky potvrzenou sklerózu multiplex, mají neurčitelné antiMBP během aktivní fáze jejich nemoci. Je možné, že takoví pacienti mají protilátky proti jiným myelinovým proteinům. Nepřítomnost specifických protilátek nebrání předpokládané důležitosti anti-MBP v mechanismu demyenilizace u většiny pacientů se sklerózou multiplex.
V poslední době byla pozorována sekvence protilátek MBP v části IgG přečištěné z mozkomíšního moku pacientů se sklerózou multiplex (Warren, K.G. a Catz, I. J. Neurol Sci 96; 19-27, 1990). Primární protilátky MBP ve volné i vázané formě vyskytující se v souvislosti s aktivní nemocí: F/B poměry jsou větší než jedna u pacientů s akutní recidivou a pod jedna u pacientů s chronickou progresivní nemocí (Warren, K.G. a Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I. a Warren, K.G., Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986; a Warren, K.G. a Catz, I. Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Sekundární protilátky, které neutralizují anti-MBP se objevují, když se nemoc dostává do aktivní fáze. Terciální protilátky, které inhibují neutralizaci anti-MBP, jsou přítomny, když je nemoc chronicky progresivní a začíná být neaktivní. Skutečnost, že sekvence protilátek MBP souvisí s různými fázemi sklerózy multiplex naznačuje její pravěpodobnou důležitost v přirozeném vývoji této nemoci.
Ačkoli mohou být anti-MBP detekovány vmozkomíšním moku pacientů s aktivní sklerózou multiplex, jejich přímou úlohu vpatogenezi demyenilizace je stále třeba potvrdit. Účast anti-MBP v mechanismu sklerózy multiplex může být nejlépe určena jejich snižováním in vivo pravděpodobně podáváním vybraných peptidů a sledováním klinického vývoje nemoci. Jestliže je Osou) anti-MBP jedinou primární protilátkou (protilátkami) související s demyenilizací při skleróze multiplex, je možné zamezit tomuto procesu intratekálním nebo intravenózním podáním vybraných MBP peptidů, které by měly snížit anti-MBP a měly by podporovat toleranci kMBP in šitu. Jiné lidské myelinové proteiny se mohou také účastnit demyenilizace při skleróze multiplex, a proto je ve vynálezu zahrnuto použití peptidů významně homologních s částí sekvence aminokyselin těchto dalších myelinových proteinů, aby byly sníženy odpovídající protilátky. Ačkoli předchozí snaha léčit sklerózu multiplex intramuskulárním nebo subkutaneálním podáváním heterologních MBP nebyla příliš úspěšná (Campbell, B., Vogel, R.J., Fisher, E. a Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15,1973; Gonsette, R.E., Delmotte, P. a Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; a Romine, J.S. a Salk, J. In Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. a Tourtelotte, W.W., eds Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 621-630), intratekální nebo intravenózní podávání MBP peptidů, které neutralizují, nebo snižují tvorbu anti-MBP podle vynálezu je ukázáno na řadě úspěšných výsledků.
Zvířecí model sklerózy multiplex, experimentální alergická encefalomyelitida (EAE), je nemoc projevující se demyelinizací, kterou způsobují T buňky. EAE může být zlepšena intraperitoneálním injikováním MBP syntetických peptidů postiženým myším (Critchfield, J.M. a kol. Science 263, 1139-1143, 1994). Dokonce orální podání MBP ovlivnilo EAE cestou navození periferní tolerance (Chen, W. a kol., Science 265, 1237-1240, 1194). Kombinace myelinových antigenů nebo syntetických peptidů těchto antigenů podávaná intravenózně a/nebo intratekálně může být potřebná k ovlivnění T buněk, B buněk a makrofágů, které způsobují poškozování myelinu pacientů postižených sklerózou multiplex.
Vynález se také týká farmaceutických kompozic obsahujících, jako aktivní složku, výše uvedený peptid buď samotný, nebo v kombinaci ve směsi s farmaceuticky přijatelnými nosiči. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti a zahrnují například obyčejný solný roztok.
Peptidy podle vynálezu mohou být podávány lidem pro léčbu nebo zmírnění sklerózy multiplex. Terapeutická dávka pro intravenózní podávání při léčbě sklerózy multiplex může být asi od 1,0 mg na kilogram tělesné hmotnosti do 10,0 mg na kilogram tělesné hmotnosti; pro intratekální podávání může být celková dávka asi od 1 do 100 mg. V jednom příkladu vynálezu je peptid podáván buď intravenózně, nebo intratekálně nebo v kombinaci. Peptidy mohou být podávány buď jako jednotlivá dávka, nebo posloupnost dávek, podle potřeby.
Podle vynálezu bylo zjištěno, že intravenózní podávání snižuje volné i vázané anti-MBP; zatímco intratekální podávání má účinek pouze na neutralizaci nebo zmírnění volných anti-MBP.
Jedno použití vynálezu ukázalo, že postupné intratekální podávání MBP peptidů může snižovat F anti-MBP a udržovat jejich nízkou úroveň po měsíce po aplikaci peptidů u pacientů trpící monosymptomatickými recidivami. V jednom příkladu tohoto provedení bylo pacientovi podáváno 50 mg peptidů MBP denně po dobu 4 až 5 dnů. V dalším příkladu mohla být další dávka podána týden až dva po první injekci.
Ačkoli je vynález podrobně popsán s odkazy na výhodná provedení, následující příklady jsou ilustrativní a vynález neomezují.
» ·
Přehled obrázků na výkrese
Obr. 1 ukazuje umístění osmnácti syntetických peptidů (malá čísla) ve vztahu kcelé molekule lidského MBP. Peptidy jsou představovány vertikálními sloupci umístěnými vedle jejich odpovídající oblasti na molekule MBP. Velká čísla představují aminokyselinové zbytky na lidském MBP.
Obr. 2 ukazuje inhibiční křivky anti-MBP, které byly získány přečištěním a smíšením z 10 různých pacientů se sklerózou multiplex, pro lidské MBP a MBP-peptidy.
Obr. 3 ukazuje neutralizaci anti-MBP, které byly izolovány z jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex, pro lidské MBP a peptidy MBP80-97; MBP91-106 a MBP75-95.
Obr. 4 - Průběžné sledování titrů protilátek mozkomíšního moku pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex:
F (volné) a B (vázané) - hladiny volných a vázaných protilátek byly trvale zvýšené při odebrání 26 vzorků za dobu 11 let od 1983 do 1993.
cpm: impulsy za minutu jednotky radioaktivity = (cpm vzorek - cpm blank) / (cpm celkem - cpm blank) nevyplněné kroužky: Vázané (B) anti-MBP zjištěné po kyselé hydrolýze imunitních komplexů mozkomíšního moku.
vyplněné kroužky: Volné (F) anti-MBP
Římská čísla značí měsíce v roce.
Obr. 5 - Kontrolní pacienti: Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku ve 2 kontrolách v časových intervalech (1F56, Obr. 5A a 3M66, Obr. 5B) a 2 kontrolách se solným roztokem (4M45, Obr. 5C a 5M59, Obr. 5D). Když byl odebrán vzorek mozkomíšního moku každých 30 minut v průběhu prvních dvou hodin, stejně jako o 24 hodin později, zůstaly u všech čtyř pacientů protilátky anti-MBP F a B konstantně zvýšené oproti základní úrovni. Symboly jsou stejné jako na obrázku 4.
Obr. 6 - Studie peptidů více pacientů: Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku ve skupině 4 pacientů (10F38, Obr. 6A; 13F43, Obr. 6C; 5M59, Obr. 6D; a 3M66, Obr. 6G) kterým byla podána tato množství (1; 2,5; 5 a 10 mg po řadě) nevazebného kontrolního syntetického • · • · · · ···«· • · · · · · · ······ peptidů MBP35-58 a ve druhé skupina čtyř jiných pacientů se sklerózou multiplex (6F53, Obr. 6B; 8M41, Obr. 6D; 4M45, Obr. 6F a 1F56, Obr. 6H), kterým byla podána tato množství (1; 2,5; 5 a 10 mg po řadě) anti-MBP vazebného syntetického peptidů MBP75-95. Anti-MBP F vmozkomíšním moku byla vázána peptidem MBP75-95 v závislosti na dávce a nereagovala s peptidem MBP35-58. Hranice anti-MBP zůstala prakticky nezměněná.
Obr. 7 - Studie peptidů více pacientů: Když pacienti se sklerózou multiplex byli buď kontrola v časovém intervalu (1F56, Obr. 7C a 3M66, Obr. 7D) nebo kontrola v časovém intervalu se solným roztokem (5M59, Obr. 7A a 4M45, Obr. 7B), nebo když jim byl podán nevazebný kontrolní peptid MBP35-58 (5M59 a 3M66), zůstaly jejich hladiny anti-MBP F a B v mozkomíšním moku stejné. Naproti tomu, když bylo týmž pacientům 4M45, 1F56 a 3M66 později podáno 5 - 10 mg pro anti-MBP vazebného peptidů MBP75-95, jejich anti-MBP F klesla na nezjistitelnou úroveň do 7 dnů a vrátila se na základní úroveň mezi 10 až 21 dnem.
Obr. 8 - Opakované intratekální injekce syntetického peptidů: pacientovi s chronickou progresivní sklerózou multiplex byla desetkrát podána vždy po týdnu injekce 10 mg MBP75-95 injikovaná přímo do mozkomíšního moku; titry anti-MBP F a B byly měřeny před (kroužky) a po 30 minutách (čtverečky) po každé aplikaci. Anti-MBP F (vyplněné kroužky a čtverečky) byly neurčítelné po dobu 10 týdnů, zatímco protilátky B zůstaly vpodstatě nezměněné ( nevyplněné kroužky a čtverečky).
Obr. 9 - Intravenózní podávání syntetického peptidů: Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku po jedné intravenózní injekci 500 mg MBP75-95; obě hladiny anti-MBP F a B významně klesaly při testování 10, 16 a 30 dní po aplikaci. Symboly jsou stejné jako na obrázku 4.
Obr. 10 - K dalšímu upřesnění epitopu MBP pro anti-MBP sklerózy multiplex byla použita sada 41 dekapeptidů, které pokryly oblast mezi zbytky 61 a 110.
Legenda:
- sloupce představují procenta inhibice = 100 - radioaktivní jednotky
MBP a peptid MBP75-95 byly použity jako pozitivní kontroly a způsobily úplnou (100%) inhibici protilátek F a B.
peptidy MBP51-60 a MBP111-120 byly použity jako negativní kontroly a způsobily nevýznamnou inhibici (0 až 10%) anti-MBP F i B.
- dekapeptidy MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 a MBP87-96, které způsobily maximální inhibici (90-100%) protilátek F i B jsou silně spojeny s MBP epitopem.
- tečkovaná čára: 95% konfidenční limity inhibičního testu.
Obr. 11a - ukazuje anti-MBP mozkomíšního moku volné (F)-· a vázané (B)-° u pacienta s jednostrannou optickou neuritidou, kterému byly podány intratekálně dvě injekce (it#l a it#2) 50 mg pMBP86-95, v odstupu 4 týdnů; w = počet týdnů.
Obr. 11b- ukazuje hladiny anti-MBP volných (F)-· a vázaných (B)-° v mozkomíšním moku u pacientů s celkovou jednostrannou optickou neuritidou, kterým byly několikrát podány intratekální injekce (it#l it#2 it#3 it#4 a it#5) 50 mg pMBP82-98 během prvního týdne recidivy.
Obr. 11c - ukazuje hladiny anti-MBP volných (F)-· a vázaných (B)-° v mozkomíšním moku pacientů s pseudoaterózou, kterým byla pětkrát denně podána intratekální injekce (it#l it#2 it#3 it#4 a it#5) 50 mg pMBP82-98.
Obr. lid - ukazuje hladiny anti-MBP volných (F)-· a vázaných (B)-° v mozkomíšním moku pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány čtyři intratekální injekce (it# 1 it#2 it#3 it#4) 50 mg pMBP86-95 každé 2-3 dny v průběhu prvního týdne recidivy a jedna intravenózní injekce (IV) 400 mg pMBP86-95, když znovu nastala progresivní fáze nemoci.
Obr. 12 ukazuje anti-MBP mozkomíšního moku volné a vázané u pacienta s polysymptomatickou recidivou, kterému bylo podáno celkem sedm intratekálních injekcí 50 mg pMBP86-95. Nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku 30 minut po it#2; vzorek mozkomíšního moku byl získán o 24 hodin později. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.
Obr. 13 ukazuje hladiny anti-MBP volných a vázaných v mozkomíšním moku u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány jak intratekální (it#l, it#2 a it#3) tak intravenózní (IV#1 a IV#2) injekce pMBP86-95. Nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku před nebo po it#2. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.
Obr. 14 ukazuje hladiny anti-MBP volných a vázaných v mozkomíšním moku u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány intravenózně (IV# 1, IV#2 a IV#3) a intratekálně (it#l až it#9) injekce pMBP86-95 a pMBP82-98. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.
Obr. 15 ukazuje pokus zabránit budoucí recidivě μ pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány dvě intravenózní injekce (IV# 1 μ IV#2) 400 mg pMBP86-95 a pMBP82-98. Nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku v průběhu první recidivy, tři měsíce po IV# 1. Přirozená frekvence recidiv je znázorněna v horní části šipkami, které odpovídají měsíci ataku. Orámovaná oblast představuje období pokusu. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.
Obr. 16 ukazuje pokus zabránit budoucí recidivě u pacienta s progresivní recidivou sklerózy multiplex, kterému byly podány dvě intratekální injekce (it# 1 a it#2) a jedna intravenózní injekce
• · (IV) pMBP86-95. Vyplněné čtverečky - vysoká intravenózní dávka metylprednisolonu. Přirozená frekvence recidiv je znázorněna v horní části šipkami, které odpovídají měsíci ataku. Orámovaná oblast představuje období pokusu. Symboly jsou stejné jako na obrázku 11.
Obr. 17 ukazuje účinek intratekálního a intravenózního podání peptidu na protilátky specifické pro MBP v mozkomíšním moku pacientů trpících chronickou progresivní sklerózou multiplex; na obrázku 17a byl injikován pMBP75-95 přímo do mozkomíšního moku (2,5 mg v 5 ml solného roztoku) a protilátky specifické pro MBP byly měřeny radioimunitním testem na pevné fázi v různých časových okamžicích (0,5 hodiny až 7 dní po aplikaci). Injekce peptidu způsobila přechodnou neutralizaci volné anti-MBP (vyplněné kroužky) ale neměla účinek na vázanou anti-MBP (nevyplněné kroužky). Vlastní protilátky byly neurčitelné jednu až dvě hodiny a začaly se vracet k základním hodnotám mezi 12 a 24 hodinou po aplikaci. Podobná pozorování byla provedena u sedmi jiných pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex. Na obrázku 17b, třináct měsíců po intratekální injekci peptidu, což ukazuje Obr. 17a, bylo intravenózně injikováno 500 mg pMBP75-95 v 50 ml solného roztoku a protilátky specifické pro MBP v mozkomíšním moku byly měřeny každé tři měsíce (střední hodnota + standardní odchylka).
Obr. 18 ukazuje složené hodnoty anti-MBP v mozkomíšním moku třinácti pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kterým byla podána intravenózní injekce (IV# 1) 5- 6 mg/kg tělesné hmotnosti (256 - 500 mg v klasickém solném roztoku) pMBP 75-95 (dva pacienti) nebo pMBP86-95 (11 pacientů); byly sledovány jak volné tak vázané anti-MBP (vyplněné a nevyplněné kroužky - v tomto pořadí). Hladiny vlastních protilátek byly nižší nebo neurčitelné v období mezi prvním a čtvrtým měsícem po IV#1, kdy se začaly vracet na základní hladiny. Mezi 6 a 10 měsícem po IV# 1 byla podána všem pacientům druhá intravenózní injekce pMBP82-98 ve stejné dávce (IV#2).
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Neutralizace protilátek lidského myelinového proteinu in vitro
Obr. 1 ukazuje umístění osmnácti peptidů h-MBP užívaných v této studii ve vztahu k celé molekule MBP. Přirozený MBP byl izolován z mozkové tkáně nezasažené sklerózou multiplex (Diebler. G.E., Martenson, R.E. Kies, M.W., Prep Biochem 2: 139-165, 1972) a dále přečištěn gelovou filtrací a vysokotlakou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi (HPLC). Výsledná příprava antigenu byla kontrolována na čistotu elektroforézou v SDS-polyakrylamidovém gelu.
K dalším studiím byly použity pouze preparáty, kterým odpovídala molekulární hmotnost 18,5 KD. Ve studii neutralizace byl použit přečištěný MBP ve specifické afinitní chromatografii a v rádio imunitním testu na pevné fázi.
Osmnáct peptidů pokrývajících délku h-MBP a obsahujících zbytky mezi 8 a 25 aminokyselinami byly syntetizovány metodou Fmoc, jak bylo dříve popsáno (Groome, N.P., Dawkes, A., Barry, R. a kol. J Neuroimmun 19: 305-315, 1988). Čistota peptidu byla kontrolována HPLC na reverzní fázi s kolonou Cl8 a gradientem vody/acetonitrilu (0,1 % TFA). Analýza aminokyselin peptidů byla také provedena standardním způsobem. Mnoho peptidů použitých v této studii obsahovalo nepřirozené cysteinové zbytky, protože byly připraveny pro funkci imunogenů ve spojení s Freundovým adjuvants. Je nepravděpodobné, že to ovlivnilo zde popisované výsledky.
Během prvního týdne prudkého nástupu symptomů akutní recidivy sklerózy multiplex byl získán mozkomíšní mok od 36 pacientů a hladiny IgG byly určeny nefelometricky. Vzorky mozkomíšního moku užité při této studii byly vybrány tak, aby měly vysokou počáteční absolutní IgG úroveň (> 0,80 g/1) a zvýšené titry anti-MBP ( F/B poměr blížící se 1,0). Všichni pacienti se sklerózou multiplex měli klinicky definované onemocnění.
IgG bylo přečištěno z koncentrovaného mozkomíšního moku pacientů s akutní sklerózou multiplex afinitní chromatografii na A-Sepharose (Pharmacia™), jak bylo již popsáno (Warren,
K.G. a Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Čistota každého vzorku IgG byla kontrolována elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a izoelektrickou fokusací. Během přípravy se hladiny zvýšeného anti-MBP z přečištěného IgG snížily vlivem absorbce MBP k nule, supematanty po absorbci obsahovaly zbytkové IgG indikující, že anti-MBP představuje pouze frakci zvýšeného IgG.
Přečištěný MBP se navázal na CNBr-aktivovanou Sepharosu 4B (Pharmacia™) podle instrukcí výrobce. Přečištěné IgG mozkomíšního moku obsahující zvýšené hladiny anti-MBP od 35 pacientů s akutní recidivou sklerózy multiplex bylo použito k izolaci anti-MBP afinitní chromatografii na MBP-Sepharose (Warren, K. G. a Catz, I., J Neurol Sci 103: 90-96, 1991). Přečištěné anti-MBP vzorky byly porovnány s původním zdrojem IgG elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Během přečištění byly vzorky anti-MBP sníženy na nulovou úroveň vlivem MBP, supematanty po absorbci neobsahovaly žádné zbytkové IgG indikující čistotu antiMBP.
Konstantní množství anti-MBP ( 15 radioaktivních vázaných jednotek odpovídajících hodnotě 100 pro účely rozšiřování stupnice = 0% ) bylo inkubováno se zvyšujícími se množstvími h-MBP ( 0 - 1000 ng ) nebo jednotlivými peptidy MBP ( 0- 10 000 ng ) v tekuté
fázi a po 1,5 hodinové inkubaci byly určeny hladiny volného anti-MBP ve všech směsích. AntiMBP izolované ze 7 jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex nebo směs anti-MBP z 10 různých pacientů se sklerózou multiplex bylo použito k neutralizačním pokusům. Histon telecího brzlíku a albumin lidského séra byly použity jako kontrolní antigen ( 10 - 1000 ng ). Jedna monoklonální protilátka (MAb) peptidu MBP64-78 a polyklonální králičí antisérum peptidu MBP1-8 byly použity jako pozitivní protilátkové kontroly (Groome, N., Harland, J. a Dawkes, A., Neurochem Int 7: 309-317, 1985; Barry, R., Payton, M., a Groome, N., Neurochem Int 2: 291-300, 1991). Další myší monoklonální protilátka epitopu 45-50 byla použita jako negativní protilátková kontrola.
Hladiny anti-MBP byly určeny radioimunitním testem na pevné fázi s lidským MBP (Warren, K. G, a Catz, I, AnnNeurol 209: 20-25, 1986; Warren, K. G, a Catz, I, Ann Neurol 21: 183-187, 1987; Warren, K. G, a Catz, I, J Neurol Sci 91: 143-151, 1989). Hladiny volných anti-MBP byly měřeny ve všech frakcích získaných po afínitní chromatografii a ve všech neutralizačních směsích. Běhy, pro všechny jednotlivé vzorky, byly provedeny čtvermo s použitím téhož jodizovaného materiálu, aby byla co nejvíce snížena variabilita zkoušek.
Přešištěná anti-MBP byla zcela neutralizována pomocí MBP a peptidů MBP80-97, MBP91-106 a MBP75-95 a byla částečně neutralizována peptidy MBP64-78, MBP69-83 a MBP61-75 (Tabulka 1 a Obr. 2). Zbývajících 12 peptidů neumožnilo neutralizaci přečištěné antiMBP a jejich kinetické křivky klesaly v oblasti označené šrafováním na obrázku 2. Histon telecího brzlíku a lidský sérový albumin nereagovaly s přečištěnou anti-MBP dokonce ani v tak vysoké koncentraci jako je 1000 ng. MAb peptidu MBP64-78 bylo inhibováno pouze peptidem MBP64-78 a MAb peptidu MBP1-8 bylo inhibováno pouze peptidem MBP1-8. MAb peptidu MBP45-50 nereagovalo sMBP ani s jinými peptidy (pro přehlednost obrázku kontrolní data nejsou zobrazena). Kontrolní vzorky ukazují platnost neutralizačního postupu, protože každá kontrolní protilátka byla zcela neutralizována očekávaným peptidem a nebyla neutralizována žádným jiným peptidem. To ukazuje, že dokonce při vysokých koncentracích peptidu ( 10 000 ng) lze pozorovat specifické rozpoznávání.
| TABULKA 1 | |
| SEKVENCE LIDSKÉHO MBP | SCHOPNOST REAGOVAT S ANTI-MBP |
| 1-170 | ++ |
| 1 - 8 Cy | - |
| Cy4-18 | - |
| Cy 11 -24 | - |
| 18-32 | - |
| 26-40 | - |
| Cy35-58 | - |
a «
| Cy51 -64 Gly | + |
| Cy 64 - 78 | + |
| Cy61 -75 | + |
| Cy 61 - 83 | ++ |
| Cy 75 - 95 | ++ |
| Cy 80 - 97 Gly | ++ |
| Cy91-106 | - |
| 117-129 | - |
| Cy 127-140 | - |
| Cy 136-149 | - |
| 141-155 Cy 149-162 | - |
++ úplná neutrallizace + částečná neutralizace
- nevýznamná schopnost reagovat
Anti-MBP přečištěná ze 7 jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex byla zcela neutralizována h-MBP a peptidy MBP80-97, MBP91-106 a MB75-95 (viz Obr. 3 jako příklad). Díky omezenému množství protilátky získaného od jednotlivých pacientů se sklerózou multiplex nereagovala anti-MBP se zbývajícími 15 peptidy.
Jak bylo uvedeno výše, anti-MBP byla neutralizována peptidy, které leží mezi aminokyselinovým zbytkem 61 a aminokyselinovým zbytkem 106. Peptidy, které neumožňují neutralizaci anti-MBP pokrývají jak aminové (od zbytku 1 do 63) tak karboxylové (od zbytku 117 do 162) konce h-MBP. Ukazuje se, že peptidy z různých nepřekrývajících se oblastí MBP neutralizují stejnou/né protilátku/ky. Toto může být vysvětleno, jestliže protilátky rozpoznávají nespojité (skládané) epitopy obsahující aminokyseliny z různých oblastí. Podobný jev dříve pozoroval Hrubý a kol. (Hrubý, S., Alvord, E.C., Groome, N.P. a kol, Molec Immun 24: 13591364, 1987), který ukázal, že krysí monoklonální protilátka má hlavní epitop v sekvenci MBP112-121, ale silnou křížovou reakci s jiným epitopem v peptidu 39-91. To je pravděpodobnější, než možnost, že protilátka je křížově reaktivní se dvěma zcela odlišnými sekvencemi, které nejsou z nespojitého epitopu (Hrubý, S., Alvord, E.C., Martenson, R.E., a kol. J Neurochem 44: 637-650, 1985). Neutralizační údaje mohou být vysvětleny schopností peptidů z rozdílných úseků MBP, z nichž každý je schopen obsadit vazebné místo protilátky tím, že reaguje s odlišným postranním řetězcem aminokyseliny protilátky. Toto vysvětlení souhlasí s pozorováním, že peptidy způsobující úplnou inhibici (MBP80-97, MBP91-106 a MBP75-95) jsou při inhibici přibližně stokrát méně účinné na molekulární úrovni, než celý MBP. Podle • · ··· · ♦ • · Φ · φφφφ φ · • Φ Φ Φ ΦΦΦ • * ΦΦ Φ ΦΦΦ·· • · · · Φ Φ V ·· ΦΦΦ «ΦΦ «ΦΦΦ φφ «φ uvedené hypotézy to může být způsobené tím, že klon peptidu není schopen dosáhnout vazebné energie původního epitopu MBP.
Příklad 2
Neutralizace nebo zmírnění tvorby protilátek lidského myelinového bazického proteinu in vivo Výběr pacientů a kontrolní studie
Pacienti, kteří se účastnili tohoto výzkumného projektu byli sledování na klinice péče a výzkumu sklerózy multiplex Univerzity v Albertě v Edmontnu v Kanadě. Pacienti byli diagnostikováni na klinickou sklerózu multiplex podle Schumacherova kritéra (1965), což bylo potvrzeno magnetickou rezonancí zobrazující mozek a imunochemickými profily mozkomíšního moku. Aby bylo dokázáno, že při chronické progresivní skleróze multiplex anti-MBP stále vzrůstala během dlouhých časových období měsíců až let, pacienti byli podrobeni opakovaným lumbárním punkcím se sledováním F a B anti-MBP. U pacienta s chronickou progresivní sklerózou multiplex bylo pozorováno, že vlastní protilátky zůstávaly stále zvýšené po dobu 11 let a tedy nenastal spontánní pokles úrovní anti-MBP (Obr. 4 je ilustrativní příklad).
Aby bylo určeno, že počáteční zvýšení úrovní anti-MBP v mozkomíšním moku zůstávalo relativně konstantní déle než 24 hodin, byli 2 pacienti (1F56 a 3M66 ) podrobeni opakovanému testování mozkomíšního moku každých 30 minut po dobu 2 hodin a o 24 hodin později bylo sledováno F a B anti-MBP (Obr. 5A a 5B v tomto pořadí). Pacienti 1F56 a 3M66 sloužili jako kontrola . Hladiny F a B anti-MBP zůstávaly stále zvýšené během testování mozkomíšního moku po dobu 2 hodin stejně jako o 24 hodin později.
Navíc účinek injikováných 5 ml normálního solného roztoku do mozkomíšního moku byl podobně stanoven u dvou jiných pacientů (4M45 a 5M59; Obr. 5C a 5D, v tomto pořadí). Tito pacienti sloužili jako kontrola v časovém intervalu při použití solného roztoku. Po intratekálním injiko vání 5 ml normálního solného roztoku zůstaly hladiny F a B anti-MBP na základní úrovni a mozkomíšní mok byl testován tak jak bylo uvedeno výše, čímž bylo ukázáno, že zeslabující účinek na anti-MBP titry byl zanedbatelný.
Hladiny anti-MBP byly určeny metodou radioimunitního testu na pevné fázi s lidskou MBP vlmmulon mikrotitračních jamkách-Immulon mikrotitrační jamky byly pokryty 100 μΐ MBP v koncentraci 10 pg/ml (1 pg/jamku) a inkubovány do druhého dne při teplotě 37 °C. Po přidání hovězího sérového albuminu (BSA) a trojím promytí vodou byly jamky ponechány při pokojové teplotě. Vzorky 100 μΐ mozkomíšního moku nebo tkáňové extrakty zředěné na 0,010 gm IgG/1 (s 0,01 M solný roztok pufrovaný Barbitolem (BBS) pH 6,9 - 7,1 , 0,5% BSA a 0,05% Tween 20) byly inkubovány v jamkách pokrytých MBP po dobu 1 - 2 hodin při pokojové • « ·· »e teplotě. Po 5 promytích pufrem (s 0,01 M BBS, 0,5 BSA a 0,05% Tween 20) byly jamky inkubovány s kozím antikráličím specifickým IgG-Fc (v 0,01 M BBS, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté promyty jak bylo uvedeno výše. Nakonec byl přidán 125I-protein A ( nebo 125I-protein G) a byl inkubován po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Když byl použit 125I-protein G jako značkovač, ovalbumin nahradil BSA v testovacím pufru a při ukončení. Po třech závěrečných promytích vodou byly jamky jednotlivě odečteny. Výsledky jsou vyjádřeny v radioaktivitě definované jako: (impulzy vzorku -impulzy blanku) ί (impulzy celkové radioaktivity - impulzy blanku). Všechny vzorky jsou odečítány v 10 kopiích a doba měření je 10 minut aby bylo získáno více než 10 000 impulzů pro každý pozitivní vzorek.
Před testováním byly všechny vzorky mozkomíšního moku a/nebo tkáně zředěny na konečnou IgG koncentraci 0,010 g/1. F anti-MBP byla určena přímo v mozkomíšním moku nebo tkáňovém extraktu, zatímco hladiny protilátek B byly určeny následnou kyselou hydrolýzou imunitních komplexů s glycinovým HC1 pufrem pH 2,2. Nespecifická vazba nastala pro každý vzorek v nepokrytých jamkách. Pro lokalizaci epitopu nejdříve reagovaly syntetické peptidy s přečištěnou protilátkou v srovnávacím testu tekuté fáze a pak byla anti-MBP určena rádio imunitním testem ve všech výsledných supematantech. Výsledky kombinovaného srovnávacího vazebného testu a radioimunitního testu byly vyjádřeny jako procento inhibice syntetického peptidu a definovány jako 100 - radioaktivní jednotky. Vzorky byly připraveny v 10 kopiích a odečítány po 10 minutách, každý vLKB1275 Minigamma čítači. Přečištěná antiMBP tkáně byla použita v pěti předem určených ředěních jako pozitivní kontrola. Shrpmážděný mozkomíšní mok od pacientů bez neurologického onemocnění byl použit jako negativní kontrola. V testu byla opakovatelnost mezi 3 a 5% a mezi jednotlivými testy byla proměnlivost menší než 7%.
Přetrvávání anti-MBP mozkomíšního moku na zvýšené a konstantní úrovni u pacientů, kteří sloužili jako kontrola, (kontrola v časovém intervalu a kontrola ředění) umožnilo další krok tohoto výzkumu.
Výzkumná studie Fáze 1 jedné intratekální injekce MBP syntetických peptidů
Aby se stanovil účinek syntetického peptidu MBP75-95 na F a B titry anti-MBP mozkomíšního moku byl proveden poku Fáze 1. Po odsouhlasení Výborem pro etiku výzkumu Univerzity v Albertě byl tento projekt prováděn na pacientech s klinicky definovanou sklerózou multiplex (Schumacher a kol., Ann NY Acad Sci., 122: 552-568, 1965), těžce postižených a s postupující progresivní nemocí. Byl získán souhlas 14. dobrovolníků pro tuto studii; 8 pacientů
bylo vybráno na základě jejich počátečního titru F anti-MBP mozkomíšního moku (nad 8 radioaktivních jednotek) (tabulka 2) a byla jim aplikována jedna intratekální injekce buď peptidů MBP75-95, který váže anti-MBP in vitro, nebo kontrolního peptidů MBP35-58 (Warren a Catz 1993 b). Pokus byl veden tak, že žádný z výzkumníků ani z pacientů nevěděl jaká látka pacientu byla injikována. Všechny peptidy byly kódované označeny sedmi počítačem náhodně generovanými čísly bez možnosti ovlivnění lékařem. Párované peptidy rozpuštěné v 5 ml normálního solného roztoku a injikované do mozkomíšního moku cestou lumbální punkce byly podávány v rostoucích dávkách 1; 2,5; 5 a 10 mg. Mozkomíšní mok byl odebírán před injekcí (základní úroveň), v třicetiminutových intervalech po dobu 2 hodin po injekci, 24 hodin později a pak v týdenních intervalech po dobu 3-4 týdnů dokud se hladiny nevrátily na základní úroveň. Počty buněk, celková úroveň proteinu, úroveň glukóza, úroveň IgG a úroveň albuminu byly určeny ve všech získaných vzorcích mozkomíšního moku. Hladiny anti-MBP F a B byly určeny pomocí rádio imunitního testu jak bylo popsáno výše.
| Identifikace pacienta č., pohlaví, věk | Doba trvání nemoci (roky) | Kurtzke EDSS | Anti-MBP mozkomíšního moku (radioaktivní jednotky) volné (F) vázané (B) | Vybráno pro výzkum | |||
| 1 | žena | 56 | 10 | 8,5 - Triplegie | 9 | 10 | Ano |
| 2 | muž | 50 | 18 | 6 - Paraparéza | 2 | 10 | Ne |
| 3 | muž | 66 | 20 | 9 - Kvadruplegie | 11 | 12 | Ano |
| 4 | muž | 45 | 21 | 9 - Kvadruplegie | 10 | 11 | Ano |
| 5 | muž | 59 | 28 | 9 - Kvadruplegie | 8 | 10 | Ano |
| 6 | žena | 53 | 19 | 9 - Kvadruplegie | 10 | 9 | Ano |
| 7 | žena | 33 | 11 | 6 -Paraparéza,ataxie | 5 | 13 | Ne |
| 8 | muž | 41 | 8 | 8 - Triplegie | 9 | 12 | Ano |
| 9 | muž | 49 | 7 | 7 - Paraparéza | 5 | 10 | Ne |
| 10 | žena | 38 | 7 | 8,5 - Paraplegie | 11 | 10 | Ano |
| 11 | muž | 49 | 20 | 8 - Triplegie | 6 | 13 | Ne |
| 12 | muž | 35 | 12 | 6,5-Paraparéza, ataxie | 7 | 12 | Ne |
| 13 | žena | 43 | 15 | 8 - Paraplegie | 9 | 10 | Ano |
| 14 | žena | 32 | 4 | 6- Paraparéza, ataxie | 8 | 7 | Ne |
Tabulka 2; Klinická data a hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku 14 pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří se dobrovolně účastnili výzkumné studie Fáze 1 jedné intratekální injekce MBP syntetických peptidů. Protože byla nutná vysoká výchozí hodnota F anti-MBP ( > 8 radioaktivních jednotek ) pro dosažení zřetelné změny po injekci, bylo pro studii vybráno pouze 8 ze 14 pacientů.
Všechny peptidy užívané v této studii byly syntetizovány pod kódem dobrý produkt (Good Manufacturing Product - GMP) používající Fmoc (9-fluorenylmetoxykarbonyl) metodu podle Procyon lne. (London, Ontario, Kanada). Čistota peptidu byla kontrolována vysokotlakou kapalinovou chromatografií rverzní fáze s Cl8 kolonou a gradientem voda-acetinitril obsahující 0,1% TFA. Hmotnostní spektroskopie a aminokyselinová analýza byly provedeny standardními postupy. Před inokulací byly všechny peptidy zkoušeny na pyrogenicitu (Vancouver General Hospital, Vancouver, Kanada), sterilitu (Provincial Laboratory for Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Kanada) a akutní toxicitu (Health Sciences Laboratory Animal Services, University of Alberta, Edmonton, Kanada) a byly klasifikovány jako vhodné pro podávání člověku. Vhodná množství kódovaných syntetických peptidů byla rozpuštěna v 5 ml sterilního normálního solného roztoku (0,9% injekce chloridu sodného USP, nepyrogenický, Baxter Corp, Toronto, Kanada), dvakrát filtrována přes 0,22 pm jednotkový sterilizační filtr (Millex-GX, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) a podávána do mozkomíšního moku cestou lumbální punkce.
Peptidové studie u pacientů
Pacientům 6F53, 8M41, 4M45 a 1F56 byl podán syntetický peptid MBP75-95 schopný vázat anti-MBP in vitro a pacientům 10F36, 13F43, 5M59 a 3M66 byl podán „kontrolní“ nevazebný syntetický peptid MBP35-58 ve vzrůstajících množstvích 1; 2,5; 5 a 10 mg v tomto pořadí (Obr. 6). U pacienta 6F53 (Obr. 6B), kterému byl podán 1 mg MBP75-95, bylo pozorováno 75% snížení F anti-MPB následované bezprostředním návratem hodnot na základní úroveň; pacientovi 8M41 (Obr. 6D) bylo podáno 2,5 mg MBP75-95 a byla zjištěna úplná neutralizace F anti-MBP vazbou následovaná návratem hodnot na základní úroveň během 24 hodin; u pacienta 4M45 (Obr. 6F), kterému byla podáno 5 mg MBP75-95, došlo k náhlé a úplné neutralizaci vazbou, která vydržela 7 dní a vrátila se na základní úroveň, když byla testována o 21 dnů později; pacientovi 1F56 (Obr. 6H) bylo podáno 10 mg MBP75-95 a byla pozorována celková neutralizace F anti-MBP vazbou, která vydržela 7 dní a vrátila se na základní hodnoty, když byla testována o 14 a 28 dní později. Vazebné hladiny anti-MBP se významně neměnily při intratekální inokulaci MBP75-95. Pacientům 10F38, 13F43, 5M59 a 3M66 bylo podáno po řadě 1; 2,5; 5 a 10 mg kontrolního peptidu MBP35-58, hladiny F a B anti-MBP vmozkomíšním moku zůstávaly nezměněné vzhledem k původním hodnotám v průběhu 24 hodinového pokusu (Obr. 6A, 6C, 6E a 6G, v tomto pořadí). Běžné parametry při zánětu mozkomíšního moku při skleróze multiplex, jako například počty buněk, absolutní hladiny celkových proteinů, IgG a albumin, oligoklonální pásy, IgG index a syntéza IgG CNS zůstávaly nezměněné před a po podání peptidu.
Peptidové studie u pacientů
Experimenty svíce pacienty byly prováděny za účelem minimalizace vlivu rozdílností jednotlivých pacientů na průběh pokusů. U pacienta, který sloužil jako nebo mu bylo podáno 5 mg neúčinného peptidu MBP35-58, hladiny F anti-MBP zůstaly na základní úrovni v průběhu dvou pokusů (Obr. 7A). Pacient 4M45 sloužil nejdříve jako kontrola rozpustnosti a o dva měsíce později mu bylo podáno 5 mg MBP75-95. Jeho úroveň F anti-MBP zůstala konstantně zvýšená ve všech vzorcích získaných v průběhu pokusu na rozpustnost a stala se nestanovitelnou po podání MBP75-95 (Obr. 7B). Podobné výsledky byly získány u pacienta 1F56, který měl neustále zvýšené hladiny protilátek F v průběhu pokusu „kontrola v časovém intervalu a po podání 10 mg MBP75-95 byla hladina F anti-MBP pod mezí stánovitelnosti (Obr. 7C). Celková studie byla provedena u pacienta 3M66. Jeho F anti-MBP hladiny byly neustále zvýšené v průběhu pokusu kontrola v časovém intervalu , nebo po podání 10 mg MBP35-58; avšak po injekci 10 mg MBP75-95 F anti-MBP byly zcela neutralizovány a zůstaly pod hranicí stáno vitelnosti po dobu 7 dnů (Obr. 7B).
Opakované podávám syntetického peptidu MBP75-95
Po zjištění, že peptid MBP75-95 neutralizuje F-anti MBP in vivo po dobu 7 dnů, bylo rozhodnuto opakovaně injikovat 10 mg MBP75-95 do míšního moku v týdenních intervalech po dobu 10 týdnů. Tyto pokusy byly vedeny u tří různých pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří se neúčastnili projektu jedné injekce peptidu a dali souhlas k účasti na této studii. F a B anti-MBP byly zjišťovány 1 až 2 týdny před prvním injikováním, před a 30 minut po každé z 10 injekcí a opět měsíc po poslední injekci. Množství buněk, hladiny celkového proteinu, glukózy, IgG a albuminu byly určeny ve všech vzorcích mozkomíšního moku získaných před každou z 10 injekcí. Před první a po poslední injekcí byl odebrán vzorek krve a analyzován na elektrolyty, kreatin, srdeční a jatemí enzymy a hematologický panel.
Byla-li pacientům s chronickou progresivní sklerózou multiplex opakovaně podávána intratekální injekce 10 mg MBP75-95 v týdenních intervalech po dobu 10 týdnů, jejich počáteční vysoké hodnoty F anti-MBP byly pod hranicí stanovitelnosti tak dlouho, dokud byl peptid podáván. Když byl pepid podáván déle, F anti-MBP se vrátily na základní úroveň v průběhu jednoho měsíce (Obr. 8). Titry protilátek B zůstávaly konstantně zvýšené, což naznačuje, že u těchto pacientů pokračovala syntéza anti-MBP a intratekální podávání peptidů způsobilo pouze „stírací účinek“ F anti-MBP.
Pacienti, kterým byla podána buď jedna injekce syntetického peptidů, nebo týdně opakované injekce měli chronickou progresivní sklerózu multiplex s vysokým stupněm neurologického postižení. Žádný z těchto pacientů neudával zhoršení svých neurologických symptomů, nebo zhoršení sklerózy multiplex následně po intratekální podání peptidů a nebyla pozorována buněčná reakce v mozkomíšním moku. Pacienti se sklerózou multiplex, kterým byl opakovaně injikován MBP75-95 byli sledováni z hlediska systémových komplikací včetně elektrolytických změn, stejně jako srdečních, jatemích a ledvinových dysfunkcí a hematologických změn a neobjevily se žádné nepříznivé komplikace. Nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky.
Intravenózní podávání MBP75-95
Po zjištění, že intratekální podávání peptidů MBP75-95 způsobuje celkovou neutralizaci F anti-MBP vazbou, přičemž nedochází k žádné změně úrovní protilátek B, bylo rozhodnuto zjistit účinek intravenózního podávání stejného peptidů na titry F a B anti-MBP mozkomíšního moku; 500 mg MBP75-95 bylo rozpuštěno ve 100 ml normálního solného roztoku a intravenózně injikováno v průběhu 30 minut pacientovi 8M41, anti-MBP byly sledovány každých 30 minut v průběhu prvních dvou hodin, o 18 hodin později, stejně jako o 10, 16 a 30 dní později. Krev byla odebrána před injekcí, stejně jako 16 a 30 dní později a analyzována na elektrolyty, kreatin, srdeční a jatemí enzymy a hematologický panel. Míšní mok byl sledován na množství buněk, hladiny celkového proteinu, glukózy, IgG a albuminu. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky.
Jak je vidět z obr. 8, intravenózní podání 500 mg MBP75-95 nezpůsobilo žádnou změnu v úrovních titrů F a B anti-MBP mozkomíšního moku v průběhu prvních dvou hodin. 30% Pokles F anti-MBP v mozkomíšním moku byl pozorován o 18 hodin později. Když byl mozkomíšní mok odebrán o 10, 16 a 30 dní později, F i B anti-MBP byly sníženy z jejich počáteční hladiny o 11 radioaktivních jednotek na 4, 2 a 1 radioaktivních jednotek v daném pořadí. U všech pacientů léčených intratekálně MBP75-95 bylo opakovaně pozorováno přetrvávání zvýšených úrovní vázaných protilátek, zatímco F anti-MBP zůstávaly pod hranicí stánovitelností v závislosti na dávce. To ukazuje, že syntéza vlastních protilátek MBP zůstala aktivní v průběhu a následně po intratekálním podání MBP75-95. Jako důsledek tohoto pozorování bylo MBP75-95 podáváno intravenózně pacientům, kterým byla dříve podána jedna itratekální injekce peptidů. Po intravenózním podání hladiny F a B anti-MBP v mozkomíšním moku významně poklesly, když byly sledovány v průběhu jednoho měsíce. Pokles F stejně jako B anti-MBP v mozkomíšním moku následně po intravenózním podání MBP75-95 naznačuje, že « · • · · ····· • · · · · · ······ tato cesta podávání způsobuje zeslabení autoimunitního zánětlivého procesu odpovědného za syntézu anti-MBP.V následující studii se začaly hladiny anti-MBP zvyšovat 4-6 měsíců po první intravenózní injekci, druhá intravenózní injekce téhož peptidu (posilující injekce) způsobila snížení syntézy anti-MBP až na dva roky zhruba u 70 různých pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex.
MBP epitop pro anti-MBP sklerózy multiplex
Aby bylo blíže určeno umístění MBP epitopu pro anti-MBP sklerózy multiplex, byly přečištěné F a B anti-MBP z mozkomíšního moku a z mozkové tkáně pacientů se sklerózou multiplex pomocí afmitní chromatografíe (Warren, K.G. a kol., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994) podrobeny ve srovnávacím inhibičním testu reakci se 41 po sobě následujícími MBP syntetickými peptidy totožné délky (každý z nich se skládal z 10 zbytků a překrýval přiléhající zbytky o 9) z oblasti mezi zbytky 61 a 110 lidské MBP. Peptid(y) způsobující maximální inhibici pravděpodobně nejvíce souvisí s místy, která vážou protilátky.
Maximální inhibice ( >80% ) bylo dosaženo pro přečištěné F i B anti-MBP z mozkové tkáně pacientů se sklerózou multiplex (Obr. 10) čtyřmi dekapeptidy, jmenovitě MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 a MBP87-96 za předpokladu, že MBP epitop pro anti-MBP pacientů se sklerózou multiplex byl umístěn mezi zbytky 84 a 96. Minimální oblast obecných aminokyselinových zbytků je od zbytku 87 do zbytku 93. B anti-MBP měl více omezený rozsah, než protilátka F.
Úloha protilátek anti-MBP vpatogenezi demyenilizace při skleróze multiplex nebyla objasněna a může být určena pouze stanovením zmírnění anti-MBP in vivo a následným pozorováním klinických a patologických závěrů. Například během akutní recidivy sklerózy multiplex, kdy jsou poměry F/B protilátek větší než jedna, mohou být očkovány intratekálně peptidy, o nichž je známo, že vážou F anti-MBP, aby vázaly volnou obíhající protilátku a ukončily klinické projevy akutní recidivy; může být potřebné týdenní podávání dokud nedojde k remisi. U pacientů se sklerózou multiplex s chronickou progresivní nemocí a s vícenásobnými akutními recidivami, může být potřebné intratekální stejně jako intravenózní podávání peptidů, aby bylo dosaženo snížení zánětlivého procesu, který způsobuje vytváření anti-MBP.
Příklad 3
Vhodné dávkování intratekálního podávání pMBP86-95 nebo pMBP82-98 u pacientů s akutními recidivami • · ·
Recidivy sklerózy multiplex jsou spojeny s poměry F/B anti-MBP většími než jedna díky vyšším úrovním volných než vázaných protilátek v mozkomíšním moku. Většinou, během období 3 měsíců, když recidiva přejde v následné zlepšení/remisi, hladiny anti-MBP postupně klesají a když je biologická remise kompletní, hladiny F a B anti-MBP v mozkomíšním moku se většinou dostanou pod hranici stanovitelnosti. Pacienti, kteří se podíleli na následujících příkladech, měli buď odeznívající, nebo progresivní recidivu sklerózy multiplex.
V tomto a následujících příkladech byl použit buď pMBP86-95, nebo pMBP82-98. pMBP86-95 měl velmi nízkou rozpustnost v normálním solném roztoku, protože obsahuje čtyři hydrofilní a šest hydrofobních zbytků. Naopak, pMBP82-98 měl zvýšenou rozpustnost v normálním solném roztoku důsledkem pěti dodatečných hydrofilních zbytků.
Dva pacienti byli sledování pro stanovení vhodného dávkování intratekálně podávaného pMBP86-95 nebo pMBP82-98, které okamžitě snižují F anti-MBP pod hranici stanovitelnosti. Jeden pacient měl akutní recidivu ataxie a poruchy rovnováhy. Na začátku ataku byla tomuto pacientovi podána jedna intratekální injekce 10 mg pMBP86-95; hladiny F a B anti-MBP byly měřeny před a jednu hodinu po injekci a pětkrát v průběhu dalších tří měsíců. Tato dávka potlačila F anti-MBP pouze částečně a průběh obnovování protilátky byl podobný přirozenému průběhu; tento pacient trpěl dále progresivní spastickou paraparézou a ataxií. To ukazuje, že jedna intratekální injekce 10 mg pMBP86-95 nepostačuje k plnému potlačení F anti-MBP a změně přirozeného tempa jejího obnovování.
Jinému pacientovi, osmnáctileté ženě s akutní optickou neuritidou, byla podána jedna intratekální injekce 50 mg pMBP86-95, byly měřeny hladiny F a B protilátek před a 30 minut po injekci. 30 minut po injekci se staly F protilátky neurčitelné. Pacientka nesouhlasila s následnou lumbální punkcí. Byl tedy učiněn závěr, že dávky alespoň 50 mg jsou nutné k tomu, aby došlo k vazbě a neutralizaci F anti-MBP v mozkomíšním moku po dobu alespoň 30 minut.
Příklad 4
Frekvence a doba podávání pacientům s monosymptomatickou recidivou
V tomto příkladu byly určovány frekvence a doba podávání pMBP, které by udrželo nízké nebo neurčitelné hladiny protilátek F po delší časové období. Čtyřem pacientům sledovaným v této skupině byly podány syntetické peptidy během týdne následujícího po nástupu ataku.
První dva pacienti byli postižení akutní jednostrannou optickou neuritidou. Jednomu z těchto pacientů (Obr. 1 la) byly podány intratekálně dvě injekce 50 mg pMBP 86-95 (it#l, it#2) v odstupu čtyř týdnů. Po každé s injekcí byly F anti-MBP pod hranicí stanovitelnosti během
• · · jedné hodiny. Při měření týden po první injekci byly F anti-MBP zvýšené a o čtyři týdny později byly F protilátky významně zvýšené. V tomto období byla pacientovi podána druhá intratekální injekce (it#2) a F anti-MBP byly pod hranicí stánovitelnosti v průběhu 30 minut, ale nebyly následně sledovány 24 hodin. Byl učiněn závěr, že tato frekvence byla nepostačující a že opakované injekce v průběhu prvního týdne ataku mohou být nezbytné k udržení zanedbatelných hladin protilátek.
Druhému pacientovi s celkovou jednostrannou optickou neuritidou byly podány opakované intratekální injekce peptidu 50 mg pMBP82-98 v průběhu prvního týdne ataku: 4 injekce denně (Obr. 11B: it#l, it#2, it#3, it#4) a pátá injekce (it#5) o týden později. Profil aniMBP tohoto pacienta ukázal stejnoměrný rychlý pokles v průběhu sedmidenního období. Důležitější bylo, že po 7 týdnech a po 6 měsících od podání it#5 byly hladiny jeho anti-MBP v mozko míšním moku stále pod hladinou stáno vitelnosti a pacient neměl žádné projevy ani optické neuritidy ani jiného typu recidivy sklerózy multiplex. Navíc jednostranná slepota způsobená optickou neuritidou plně odezněla.
Stejným postupem byly podávány denně intratekálně injekce 50 mg pMBP82-98 pacientům se sklerózou multiplex, kteří trpěli různými typy monosymptomatické recidivy. Obr. 11c ukazuje profil anti-MBP pacienta s akutní pseudoatherózou levé ruky, kterému bylo v druhém týdnu ataku intratekálně podáno 5 injekcí denně 50 mg pMBP82-98 (it#l, it#2, it#3, it#4, it#5). Hladiny F protilátek klesly na neurčitelné hodnoty v průběh 4 dní a zůstaly neurčitélné, když byly hodnoceny o 11 dní a o jeden měsíc později. Tomuto pacientovi se neustále zlepšovala funkce levé ruky a to dokonce tak, že mohl znovu řídit motocykl a hrát na kytaru.
Poslední pacient měl atak akutní levostranné hemiplegie při chronické progresivní skleróze multiplex. Byly mu podáván 4 intratekální injekce 50 mg pMBP86-95 každé 2 až 3 dny. Anti-MBP byla měřena před a 30 minut po každé injekci (Obr. 1 ld: it#l, it#2, it#3, it#4) a 10 dní po první injekci. Z počátku zvýšené F anti-MBP se staly nedetekovatelnými během 7 dní, kdy se pacient vrátil klinicky a biochemicky do svého chronického progresivního stavu a brzy poté mu bylo podáno intravenózně 400 mg pMBP86-95. To snížilo úroveň jeho vázaných protilátek na 4 měsíce po intravenózní injekci. Nicméně po poslední lumbální punkci 8,5 měsíců po intravenózní injekci se nemoc vrátila do chronického progresivního stadia klinicky a biochemicky.
Příklad 5
Frekvence a doba podávání pacientům s polysymptomatickými recidivami
Poté byly tytéž MBP peptidy injikovány pacientům s polysymptomatickými ataky, které postihovaly různé oblasti CNS. Tato skupina sestávala ze tří pacientů: jeden s recidivujícíodeznívající a dva s recidivující-progresivní nemocí.
První pacientka měla těžké polysymptomatické podráždění. V průběhu prvního týdne recidivy jí byly podány tři injekce 50 mg pMBP86-95 ve dnech 1, 3 a 7 (Obr. 12: it#l, it#2 a it#3). Anti-MBP byla měřena před každou injekcí a o 30 minut později. Po aplikaci těchto tří injekcí byla F anti-MBP snížena na téměř nedetekovatelnou úroveň. Zatímco měření o měsíc později ukázalo, že F anti-MBP vzrostla a v průběhu 1,5 měsíce byla recidiva opět klinicky aktivní a biochemicky potvrzena. V tomto období byla pacientce podána druhá sada 4 intratekálních injekcí 50 mg pMBP86-95 ve dnech 45, 48, 49 a 50 recidivy (it#4, it#5, it#6 a it#7). Anti-MBP byla měřena před a 30 minut po každé injekci a dále třikrát v následujících dvou měsících. F anti-MBP byly opět snížené alespoň po dobu dvou týdnů, ale recidiva se u pacientky znovu projevila a tehdy se vrátila úroveň jejích F protilátek na počáteční úroveň před recidivou. Je jasné, že je nutné delší podávání syntetického peptidu, aby bylo dosaženo nízkých/nedetekovatelných úrovní F anti-MBP po delší časová období.
Druhý pacient trpěl recidivující-progresivní sklerózou multiplex (Obr. 13). Zpočátku, v období progresivní formy nemoci (F=B) mu bylo podáno intravenózně 500 mg pMBP86-95 (IV# 1). Ačkoli hladiny protilátek F i B byly po jednom měsíci poněkud snížené, 9 týdnů po intravenózní injekci byla u pacienta pozorována polysymptomatická klinická recidiva související s velmi zvýšenou úrovní F anti-MBP. V tomto období byly pacientovi podány 3 intratekální injekce 50 mg pMBP86-95 (it#l, it#2 a it#3) ve dnech 1, 3 a 12 recidivy a anti-MBP byly měřeny před, 30 minut po a 24 hodin po první a třetí injekci. Při sledování o měsíc později se pacient vrátil opět do počátečního klinického a biochemického stavu progresivní spastické paraparézy, a tehdy mu byla během 2 týdnů podána druhá intravenózní injekce 500 mg pMBP86-95 (IV#2). K získání úrovní F a B anti-MBP v mozkomíšním moku bylo prováděno pravidelné sledování následujících 26 měsíců a bylo zjištěno, že hladiny zůstaly snížené v porovnání se základními hladinymi. Jeho schopnost stát a chodit se podstatně zlepšila.
Poslednímu pacientovi této skupiny se sklerózou multiplex v progresivní fázi (F=B), (Obr. 14) byl intravenózně podáno 500 mg pMBP86-95 (IV#1). Úroveň anti-MBP v mozkomíšním moku byla měřena po 9 dnech a dále 2 a 4,5 měsíci po IV#1. Po podání této injekce byly hladiny F a B sníženy po dobu 2 měsíců; 4,5 měsíce po IV# 1 si pacient stěžoval na vzrůstající slabost, což bylo potvrzeno klinicky, stejně jako biochemicky zvýšením hladin protilátky související s chronickou progresivní nemocí. Během dalšího měsíce mu byla podána druhá intravenózní injekce 500 mg pMBP82-98 (IV#2). Analýza mozkomíšního moku
získaného těsně před druhou inkjekcí naznačovala na akutní recidivu (F>B) a následující den se u pacienta objevila akutní diplopie způsobená levou laterální rektální parézou. V této době jasně prodělával klinickou a biochemickou akutní recidivu, která trvala další 4,5 měsíce a byla charakterizována těžkou poruchou rovnováhy při stání a chůzi, slabostí nohou a dvojím viděním. Ve snaze snížit jeho zvýšené F anti-MBP byla tomuto pacientovi podána intratekálně ve dvou kůrách pMBP82-98. Během první kůry započaté 4,5 měsíce od začátku recidivy mu bylo podáno 50 mg pMBP82-98 denně po období 5 dní (it#l, it#2, it#3, it#4 a it#5) a hladiny anti-MBP měřené před a 30 minut po každé injekci zůstaly mírně zvýšené. Protože recidiva přetrvávala a těžce postihovala pacienta, bylo rozhodnuto o podání druhé kůry vyšší dávky peptidů s vyšší frekvencí a pacientovi bylo podáno 100 mg pMBP82-98 dvakrát denně po dobu dvou dnů (den 19 a 20: it#6, it#7, it#8 a it#9). Anti-MBP bylo měřeno před a 30 minut po každé injekci. Následně, díky zvýšenému dávkování a frekvenci, F anti-MBP bylo potlačeno na zanedbatelné hladiny a při testování o týden později (den 28) byl profil jeho mozkomíšního moku srovnatelný s profilem při pomalu progresivní nemoci (F/B anti-MBP=l,0). V této době byla pacientovi podána třetí intravenózní injekce 500 mg pMBP82-98 (IV#3), která již dále nesnížila tvorbu anti-MBP.
Příklad 6
Intravenózní podávání MBP peptidů s cílem předejít budoucím recidivám
Dvěma pacientům s recidivující-progresivní sklerózou multiplex, kteří měli časté recidivy, byl intravenózně injikován buď pMBP86-95, nebo pMBP82-98, aby bylo zjištěno, zda tento způsob podávání bude působit jako prevence následujících ataků.
U první pacientky probíhaly 2 až 3 recidivy za rok po dobu 4 let s následnou postupnou progresí spastické paraparézy (Obr. 15). Byly jí podány dvě intravenózní injekce v odstupu 6 měsíců, první 400 mg pMBP86-95 (IV#4) a druhá 400 mg pMBP82-98 (IV#2); klinické sledování a analýzy mozkomíšního moku byly prováděny měsíčně. Obr. 15 ukazuje hladiny anti-MBP během období 9 měsíců (horní orámovaná oblast). První intravenózní injekce snížila tvorbu anti-MBP na dobu dvou měsíců. Během třetího měsíce po injekci byla tato pacientka postižena klinickou recidivou; bohužel v této době nebyl získán žádný vzorek mozkomíšního moku. Během následujících 2-3 měsíců po recidivě, kdy se ukázalo, že nemoc znovu vstoupila do chronické progresivní fáze, byla této pacience podána druhá intravenózní injekce (IV#2). Hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku se opět snížily na dobu 2 měsíců, ale tři měsíce po druhé injekci měl pacient recidivu související se zjevně zvýšenou F anti-MBP. I přes podání • · dvou intravenózních injekcí pMBP86-95 a pMBP82-98 měla pacientka 2-3 recidivy za rok stejně jako v předchozích 4 letech.
Druhá pacientka (Obr. 16), která mívala 1 až 4 akutní recidivy za rok v průběhu uplynulých 10 let (horní stupnice) byla vážně postižená, paraplegická a upoutána na pojízdné křeslo. V průběhu 11 roku měla pacientka opět 4 recidivy (horní ohraničená oblast) ačkoli jí byly podávány MBP syntetické peptidy intratekálně a intravenózně. V průběhu první recidivy se po intratekálním podání dvou injekcí 50 mg pMBP86-95 dne 1 a dne 6 (it#l, it#2) úroveň její F anti-MBP značně snížila; 6. den jí bylo také podáno intravenózně 300 mg pMBP86-95 (IV), který následně snížil F i B protilátky na dobu následujících 3 měsíců. Čtyři měsíce po intravenózní injekci měla tato pacientka opět klinickou recidivu, která se časem zhoršovala: hladiny protilátek v mozkomíšním moku byly velmi zvýšené a 6,5 měsíce po IV injekcích byla pacientka podrobena kůře 4 injekcí 50 mg pMBP82-98 (it#3, it#4, it#5 a it#6) denně, které však nesnížily hladiny F protilátek a nezabránily klinické recidivě.
Příklad 7
Porovnání různých způsobů podávání peptidu
Ve výchozích studiích byly podávány syntetické MBP peptidy 8 pacientům s chronickou progresivní sklerózou multiplex. Pacientům byl intratekálně podán každému vazebný peptid MBP75-95 nebo nevazebný peptid MBP35-58 jako kontrola v rostoucích dávkách od 1 do 10 mg v 5 ml solného roztoku; čtyřem pacientům, kterým byl zpočátku podán nevazebný peptid (MBP35-58) jako kontrola, byl později podán vazebný peptid MBP(75-95).
Injekce MBP(75-95) do mozkomíšního moku způsobila přechodnou neutralizaci F MBP specifických protilátek; vázané vlastní protilátky MBP nebyly účinné. Účinek přetrvával 1 hodinu (1 mg peptidu), 24 (2,5 mg peptidu) nebo 7 dní (5 - 10 mg peptidu). Protože účinek intratekálního podávání peptidu nebyl úplný (B anti-MBP zůstávaly zvýšené) a byl relativně krátkodobý, byl tento způsob podávání srovnáván s intravenózní injekcí. Oproti intratekálnímu podávání byly jak volné tak vázané vlastní protilátky MBP pod hranicí stánovitelnosti jeden měsíc po jedné intravenózní injekci 500 mg MBP(75-95) a zůstávaly na nízké úrovni po dobu 3 měsíců a po posilující injekci dalších 26 měsíců (Obr. 17). Podobná pozorování bylo učiněna při sledování přibližně 70 pacientů s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří byli intravenózně injikováni MBP vazebným peptidem například MBP75-95, MBP86-95, MBP8298. Dávka 500 mg (mg/kg tělesné váhy) v 10 - 50 ml normálního solného roztoku byla vybrána kvůli většímu množství krve ve srovnání s mozkomíšním mokem (faktor 15) a rychlému vymizení peptidu z krevního řečiště činností ledvin; dávky peptidu odpovídající dávkám podaným intravenózně nebyly podány intratekálně, protože takové množství nemůže být injikováno do mozkomíšního moku. Závěrem lze říci, že intratekální podávání v rozsahu testovaného dávkování u těchto pacientů má za následek přechodné odstranění pouze F antiMBP, zatímco intravenózní injekce snižují syntézu anti-MBP, jedna intravenózní injekce způsobí dlouho trvající toleranci.
Příklad 8
Doba tolerance po intravenózním podání MBP peptidů
Na základě těchto výsledků byla testována kinetika tolerance kMBP na přibližně 70 pacientech s chronickou progresivní sklerózou multiplex, kteří byli sledováni po dobu dvou let a následně jim bylo podáno více intravenózních injekcí MBP(75-95), MBP(86-95) nebo MBP(8298). Peptidy byly dávkovány 5 - 6 mg na kg tělesné váhy (256 - 500 mg) a intravenózně injikovány v 10 až 50 ml solného roztoku. Před intravenózním podáním peptidů mělo všech 13 pacientů vysoké hladiny volných a vázaných protilátek MBP vmozkomíšním moku (Obr. 18, tabulka 3). Jeden měsíc po podání peptidů byly specifické protilátky MBP v podstatě pod hranicí stánovitelnosti a zůstaly na nízkých úrovních většinou 3-4 měsíce, poté začaly hladiny protilátek opět růst a vrátily se na svou původní úroveň v průběhu 8 měsíců. 6-10 Měsíců po (IV#1), byla všem pacientům podána posilující injekce (IV#2) 275 - 500 mg (5 - 6 mg na kg tělesné váhy) MBP(82-98) v 10 ml solného roztoku (IV#2). Delší peptid vybraný pro druhou injekci byl více rozpustný a mohl být rozpuštěn a podáván v menším množství. V této skupině, jako celku, klesaly hladiny anti-MBP vmozkomíšním moku dramaticky v 6 týdnech až 2 měsících od injekce a zůstávaly pod hranicí stáno vitelnosti po delší dobu (déle než 26 měsíců). V celé skupině přibližně 70 pacientů nebyl jeden schopen dokončit studii kvůli plicní embólii následované protikoagulantní terapií, která zabránila dalším lumbálním punkcím a další pacient byl vyloučen z následujících pokusů, protože dostal vysokou intravenózní dávku kortikosteroidů. Z celkem asi 70 pacientů mělo asi 63 hladiny anti-MBP pod hranicí stáno vitelnosti 18-26 měsíců po posilující injekci.
Příklad 9
Dlouhotrvající tolerance u pacientů s HLA-DR2 haplotypem
Haplotypy HLA-DR pacientů se sklerózou multiplex byly určeny molekulární analýzou genomové DNA (tabulka 3). Čtyři z jedenácti pacientů, kteří dokončili studii nesli nemoc
související s haplotypem DR2 (DRB1*15O1 nebo DRBl *15021); všichni tito pacienti měli nízké nebo neurčitelné hladiny vlastních protilátek rok po druhé intravenózní injekci MBP peptidu. MBP peptid se váže s vysokou afinitou k HLA-DR2 a je imunodominantní pro T buňky, které jsou specifické kMBP a omezené na HLA-DR2. HLA-DR4 (DRB 1*0401) a HLA-DR7 (DRB 1*0701) vážou MBP peptid, který byl podán; studie vazby nebyly provedeny pro molekuly DR nesené pacienty k(M) (DRB 1*0407, DRB 1*0801). MBP peptid není vázán HLADR3 (DRBl*03011); dva pacienti, kteří měli zvýšené anti-MBP na konci studie nesli DRB1 *03011 haplotyp (tabulka 3). Tyto údaje ukazují, že trvání tolerance MBP závisí na haplotypu HLA-DR pacienta. Tolerance může být dlouhodobější, jestliže jak T buňky specifické k MBP, tak B buňky jsou tolerovány.
Tabulka 3
Haplotypy HLA-DR pacientů se sklerózou multiplex A. Nízké hladiny celkového anti-MBP v jednom roce po IV#2
| Pacient | haplotypy HLA-DR | Celkové anti-MBP (Ru) |
| b(F) | DRBl*1501 | 4,1 |
| e(F) | DRB1*15O1 DRBl*1303 | 2,5 |
| m(M) | DRBl*1501 DRBl*0101 | 3,9 |
| 1(F) | DRBl* 15021 DRB 1*0403 | 3,9 |
| a(M) | DRB1*14O1 DRBl*0701 | 4,1 |
| f(F) | DRBl *0701 | 2,4 |
| k(M) | DRBl*0407 DRBl*0801 | 4,5 |
| b. : | Zvýšené hladiny celkového anti-*MBP v jednom roce po IV#2 | |
| Pacient | haplotypy HLA-DR | Celkové anti-MBP (Ru) |
| j(M) | DRBl*03011 | 7,3 |
| h(F) | DRBl*0101 DRBl*0701 | 9,7 |
| g(F) | DRBl*0101 DRBl*1101 | 19,1 |
| I(M) | DRBl*0403 DRB 1*03011 | 19,0 |
Haplotypy HLA-DR 11 pacientů trpících sklerózou multiplex, kteří dokončili studii rok po druhé intravenózní injekci peptidu (IV#2). Všichni 4 pacienti s haplotypem HLA-DR2 (DRBl*1501 nebo DRB1*15O21) měli nízké hladiny vlastní protilátky rok po IV#2.
Příklad 10
Subkutaneální podávání peptidů nezpůsobuje toleranci
Nejvhodnější způsob podávání peptidů byl dále zkoumán pomocí subkutaneální(ch) injekce(í) MBP(82-98) v solném roztoku ve skupině 33 pacientů se sklerózou multiplex. U 26 pacientů se sklerózou multiplex neměla vzrůstající množství (1 - 100 mg) jedné subkutaneální injekce MBP(82-98) účinek na hladiny vlastních protilátek MBP v mozkomíšním moku (údaje nejsou prezentovány); Osmi z těchto pacientů byla následně podána intravenózní injekce peptidu a v průběhu dvou měsíců se staly hladiny protilátek v mozkomíšním moku neurčitelné (tabulka 4A). U pěti dalších pacientů, měla celková dávka 900 - 1000 mg (5 x 100 mg, denně 5 po sobě následujících dní s následnou další subkutaneální injekcí 400 nebo 500 mg) za následek pouze mírné snížení úrovní protilátek MBP v mozkomíšním moku (tabulka 4B). Aby bylo zjištěno, zda jsou různé způsoby podávání více účinné, byly dvěma pacientům podány dvě subkutaneální injekce 250 mg MBP(82-98) v odstupu jednoho měsíce (tabulka 4C). Hladiny vlastních protilátek opět nebyly ovlivněny. Celkově vzato, tyto údaje ukazují, že pouze intravenózní podávání MBP peptidu způsobuje dlouhotrvající toleranci kMBP při dávkách peptidu testovaných v této studii.
Tabulka 4
A
| ID. pacienta, pohlaví | MBP (82-98) SC mg | Základní úroveň | 6-7 týdnů | Čas (měsí- ce) | Základní úroveň | MBP (82-98) IV# 1 mg | 2 měsíce | 4 měsíce | |||||
| f | b | f | b | f | b | f | b | f | b | ||||
| E (žena) | 5 | 9,1 | 11,2 | 10,2 | 10,4 | 6 | 9,3 | 9,8 | 400 | 1,0 | 1,1 | 1,4 | 1,0 |
| K(žena) | 7 | 2,1 | 3,4 | 3,1 | 5,9 | 6,5 | 6,3 | 6,7 | 500 | 1,5 | 0,8 | ||
| N(žena) | 10 | 8,1 | 8,0 | 7,1 | 8,1 | 8 | 6,6 | 5,6 | 500 | 3,0 | 3,0* | ||
| Q (žena) | 40 | 9,1 | 10,1 | 10,9 | 8,3 | 6 | 10,0 | 9,3 | 400 | 1,5 | 1,6 | 2,1 | 2,1 |
| R (muž) | 50 | 10,2 | 10,3 | 11,1 | 7,4 | 6 | 7,5 | 9,9 | 500 | 1,5 | 1,6 | 1,5 | 1,7 |
| S (žena) | 60 | 4,1 | 4,3 | 6,1 | 5,4 | 6,5 | 7,4 | 7,4 | 500 | 1,8 | 0,9 | ||
| X (muž) | 100 | 9,9 | 7,3 | 9,5 | 8,2 | 4,5 | 9,7 | 9,0 | 500 | 1,4 | 1,0 | 1,5 | 1,1 |
| Z (muž) | 100 | 9,9 | 8,4 | 10,9 | 10,1 | 4,5 | 10,5 | 9,7 | 500 | 2,0 | 1,9 | 1,5 | 1,6 |
| střední hodnota | 7,9 | 7,9 | 8,6 | 8,0 | 8,4 | 8,4 | 1,7 | 1,5 | 1,6 | 1,5 | |||
| stan- dardní odchylka | 2,9 | 2,6 | 2,7 | 1,7 | 1,5 | 1,5 | 0,6 | 0,7 | 0,3 | 0,4 |
B
| ID. pacienta, pohlaví | MBP (82-98) SC mg | Základní úroveň | 6-7 týdnů | Čas (měsíce) | MBP (82-98) SC mg | 7 týdnů | |||
| f | b | f | b | f | b | ||||
| AA (žena) | 100/d x 5 | 7,7 | 8,1 | 4,4 | 4,9 | 0,5 | 400 | 4,3 | 3,4 |
| BB (žena) | 100/dx5 | 5,4 | 5,4 | 3,5 | 3,7 | 0,5 | 500 | 2,0 | 2,5 |
| CC (muž) | 100/d x 5 | 5,9 | 5,4 | 6,9 | 8,8 | - | - | ||
| DD (žena) | 100/d x 5 | 4,6 | 4,8 | 2,7 | 1,9 | 0,5 | 500 | 3,0 | 2,8 |
| EE (žena) | 100/d x 5 | 7,4 | 8,9 | 3,7 | 3,9 | 0,5 | 500 | 2,6 | 2,4 |
| střední | 6,2 | 6,5 | 4,2 | 4,6 | 3,0 | 2,9 | |||
| hodnota standardní odchylka | 1,2 | 1,7 | 1,4 | 2,3 | 0,8 | 0,7 |
C
| Id. | MBP | Základní | 15 týdnů | ||
| pacienta, | (82-98) | úroveň | |||
| pohlaví | SC mg | f | b | f | b |
| GG (muž) | 250 / mx 2 | 8,4 | 8,7 | 7,1 | 8,3 |
| FF (žena) | 250 / mx 2 | 4,8 | 5,3 | 5,4 | 4,2 |
A. Osmi pacientům byla podána jedna subkutaneální injekce MBP(82-98) (5 - 100 mg v 1 - 5 ml solného roztoku), která neměla žádný vliv na hladiny vlastních protilátek MBP. Naopak jedna intravenózní injekce (400 - 500 mg) stejného peptidu podávaného 4,5 až 8 měsíců později měla za následek snížení hladiny protilátek v mozkomíšním moku pod hranici stánovitelnosti.
B. Opakované subkutaneální injekce vysokých dávek MBP(82-98) (100 mg na den 5 po sobě následujících dnů) mělo malý účinek na hladiny anti-MBP v mozkomíšním moku. Dodatečná vysoká dávka (400 nebo 500 mg) MBP(82-98) podaná subkutaneálně dva týdny po první sadě injekcí nesnižovala dále hladiny vlastních protilátek.
C. Dvě subkutaneální injekce vysokých dávek MBP(82-98) (2 x 250 mg, po měsíci) neměla žádný vliv na vlastní protilátky MBP v mozkomíšním moku. Celkově vzato ukazují tyto údaje, že pouze intravenózní způsob podávání je účinný ve vytváření tolerance k MBP.
Mohou být vytvořeny různé modifikace pro použití s výhodou aniž by se opustil rozsah a meze vynálezu tak jak je uvedeno v připojených nárocích.
Claims (15)
1. Peptid vzorce Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr; včetně substitucí, adicí nebo jeho delecí, za předpokladu, že uvedené substituce, adice nebo delece dají vzniku peptidu, který je schopen neutralizovat nebo zmírnit tvorbu protilátek myelinového bazického proteinu.
2. Farmaceutické kompozice obsahující jako účinnou složku peptid podle nároku 1 v příměsi s farmaceuticky přijatelným nosičem.
3. Použití peptidu vzorce Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr; včetně substitucí, adicí nebo jeho delecí, za předpokladu, že uvedené substituce, adice nebo delece dají vzniku peptidu, který je schopen neutralizovat nebo zmírnit tvorbu protilátek myelinového bazického proteinu v příměsi s farmaceuticky přijatelným nosičem pro výrobu léčiva pro léčení sklerózy multiplex.
4. Použití peptidu obecného vzorce:
Ri - V al-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2 a jeho sob, kde Ri a R2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, hydroxy skupiny, zbytku aminokyseliny a zbytku polypeptidu; za předpokladu, že Ri a R2 nejsou oba zároveň vodík nebo hydroxylová skupina; včetně jeho substitucí, adicí nebo delecí, za předpokladu, že peptid je schopen neutralizovat nebo zmírnit tvorbu protilátek myelinového bazického proteinu, sám nebo v kombinaci, v příměsi s farmaceuticky přijatelným nosičem; pro výrobu léčiva pro léčení sklerózy multiplex.
5. Použití podle nároku 3, kde Rt je Asn-Pro-Val- a R2je vodík nebo hydroxy skupina.
6. Použití podle nároku 3, kde Ri je Pro-Val- a R2 je -Val.
7. Použití podle nároku 3, kde Ri je Val-a R2 je-Val-Thr.
• · • · · · · ·· · · ··
8. Použití podle nároku 3, kde Ri je vodík nebo hydroxy a R2je -Val-Thr-Pro.
9. Použití podle nároku 3, kde Ri je Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-ProVal- a R2 je-Val-Thr.
10. Použití podle nároku 3, kde Ri je Asp-Glu-Asn-Pro-Val-a R2 je Val-Thr-Pro-ArgThr.
11. Použití podle nároku 3, kde dávka peptidu je intravenózní, intratekální nebo v kombinaci obou.
12. Použití podle nároku 10, kde dávka peptidu je intravenózní v rozmezí od 1 mg/kg tělesné váhy do 10 mg/kg tělesné váhy.
13. Použití podle nároku 10, kde dávka peptidu je intratekální v rozmezí od 1 mg do 100 mg.
14. Použití podle nároku 10, kde dávka peptidu se opakuje alespoň denně po čtyři až pět dní.
15. Použití podle nároku 13, kde peptid, pokud je dále podáván v přídavné dávce asi jeden týden po prvních injekcích.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA2201841A CA2201841C (en) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ9903464A3 true CZ9903464A3 (cs) | 2000-11-15 |
| CZ299535B6 CZ299535B6 (cs) | 2008-08-27 |
Family
ID=4160340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0346499A CZ299535B6 (cs) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | Peptidový fragment myelinového bazického proteinua jeho použití v lécbe sklerózy multiplex |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0970121B1 (cs) |
| JP (1) | JP4173557B2 (cs) |
| AT (2) | ATE386941T1 (cs) |
| AU (1) | AU751303B2 (cs) |
| CA (2) | CA2494338C (cs) |
| CY (2) | CY1107445T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ299535B6 (cs) |
| DE (2) | DE69839163T2 (cs) |
| DK (2) | DK1394178T3 (cs) |
| ES (2) | ES2299657T3 (cs) |
| HU (1) | HU226768B1 (cs) |
| NO (1) | NO325018B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ338091A (cs) |
| PL (1) | PL191965B1 (cs) |
| PT (2) | PT1394178E (cs) |
| RO (1) | RO119303B1 (cs) |
| RU (1) | RU2198893C2 (cs) |
| SK (1) | SK285815B6 (cs) |
| UA (1) | UA60331C2 (cs) |
| WO (1) | WO1998045327A1 (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1401484A1 (en) | 2001-06-11 | 2004-03-31 | Transition Therapeutics Inc. | Combination therapies using vitamin b12 and interferon for treatment of viral, proliferative and inflammatory diseases |
| RU2261713C1 (ru) * | 2004-04-27 | 2005-10-10 | Государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова Министерства здравоохранения Российской Федерации" | Способ лечения тяжелой формы острого оптического неврита у пациентов с рассеянным склерозом |
| EP2488196B1 (en) | 2009-10-12 | 2015-12-16 | LIFEBio Laboratories LLC | Composition for treatment of multiple sclerosis |
| RU2646817C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2018-03-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Пептид из состава тяжелой цепи иммуноглобулина человека, пригодный для лечения рассеянного склероза |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2021611C1 (ru) * | 1991-04-19 | 1994-10-15 | Михайленко Анатолий Андреевич | Способ диагностики рассеянного склероза |
| CA2053799C (en) * | 1991-10-22 | 2002-03-12 | Kenneth G. Warren | Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid |
| US5817629A (en) * | 1991-10-22 | 1998-10-06 | The Governors Of The University Of Alberta | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
| WO1993021222A1 (en) * | 1992-04-09 | 1993-10-28 | Autoimmune, Inc. | Suppression of t-cell proliferation using peptide fragments of myelin basic protein |
| US5824315A (en) * | 1993-10-25 | 1998-10-20 | Anergen, Inc. | Binding affinity of antigenic peptides for MHC molecules |
| WO1996012737A2 (en) * | 1994-10-25 | 1996-05-02 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | Compositions and treatment for multiple sclerosis |
| US6329499B1 (en) * | 1994-11-18 | 2001-12-11 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogues of human myelin basic protein |
-
1997
- 1997-04-04 CA CA002494338A patent/CA2494338C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-04 CA CA2201841A patent/CA2201841C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-03-04 UA UA99116049A patent/UA60331C2/uk unknown
- 1998-04-03 AT AT03022727T patent/ATE386941T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 ES ES03022727T patent/ES2299657T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PT PT03022727T patent/PT1394178E/pt unknown
- 1998-04-03 AU AU69130/98A patent/AU751303B2/en not_active Ceased
- 1998-04-03 DK DK03022727T patent/DK1394178T3/da active
- 1998-04-03 DE DE69839163T patent/DE69839163T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 NZ NZ338091A patent/NZ338091A/en unknown
- 1998-04-03 JP JP54217098A patent/JP4173557B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-03 EP EP98914725A patent/EP0970121B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 AT AT98914725T patent/ATE400582T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 DK DK98914725T patent/DK0970121T3/da active
- 1998-04-03 PT PT98914725T patent/PT970121E/pt unknown
- 1998-04-03 ES ES98914725T patent/ES2307317T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PL PL336085A patent/PL191965B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 RO RO99-01064A patent/RO119303B1/ro unknown
- 1998-04-03 DE DE69839694T patent/DE69839694D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 RU RU99122954/04A patent/RU2198893C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 SK SK1329-99A patent/SK285815B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 CZ CZ0346499A patent/CZ299535B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 EP EP03022727A patent/EP1394178B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 WO PCT/CA1998/000290 patent/WO1998045327A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-03 HU HU0000812A patent/HU226768B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-01 NO NO19994806A patent/NO325018B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-04-24 CY CY20081100462T patent/CY1107445T1/el unknown
- 2008-08-05 CY CY20081100818T patent/CY1108239T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6258781B1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| US20080242616A1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basis protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| EP0610446B1 (en) | Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid | |
| CZ9903464A3 (cs) | Peptidické fragmenty myelinového bazického proteinu, jejich farmaceutické kompozice a jejich použití při léčbě sklerózy multiplex | |
| US7090982B2 (en) | Methods of predicting therapeutic efficacy of treatment of a multiple sclerosis patient | |
| US20020111312A1 (en) | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients | |
| HK1063805B (en) | Method for the determination of the therapeutic activity of a mbp fragment | |
| NZ513065A (en) | Peptide fragments of MBP, their pharmaceutical compositions and their use in treating multiple sclerosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110403 |