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Die Erfindung
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AGLYCO-PRODUKTE
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Diese
Erfindung betrifft die Entdeckung von Produkten und Verfahren zur
Unterstützung
in der Diagnose und Behandlung von Störungen von konjugierten Kohlenhydratbestandteilen
von lebenden Organismen, welche zu Zellfehlfunktion und Zelltod
beitragen.
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Die
vorliegende Erfindung lehrt, dass, wo normale Kohlenhydratbestandteile
kovalent gebunden oder anderweitig in der Form von Glycokonjugaten
eng mit anderen Zellstrukturen assoziiert sind, diese Kohlenhydratbestandteile
zu der Zellstabilität,
zu Rezeptor- und Erkennungsfunktionen der Zelle und zu dem Schutz
von Zellbestandteilen vor einem Schaden durch sowohl native als
auch fremde Substanzen beitragen können. Wenn diese normalen Kohlenhydratbestandteile
in ihrer Konzentration vermindert oder anderweitig strukturell verändert werden,
was hierin gemeinsam als Aglyco-Zustände definiert wird, werden
die Stabilitäts-,
Rezeptor-, Erkennungs- und Schutzfunktionen dieser Kohlenhydrate
vermindert oder verloren, und es resultieren Zellfehlfunktion und
Zelltod mit daraus folgenden Krankheitszuständen, die von dem Ort der Zellfehlfunktion oder
des Zelltodes abhängen.
Hierin präsentiertes
Hinweismaterial zeigt, daß diese
Krankheitszustände
in dem Nervensystem, z. B. als eine Folge von Zellfehlfunktion oder
Zelltod (d.h. Zellverlust), Gehirntumore umfassen, aber nicht darauf
beschränkt
sind.
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Diese
Erfindung lehrt, daß diese
Störungen
durch die Produkte von Aglyco-Pathologie wir folgt diagnostiziert
werden können:
1) durch direkte Bestimmung von strukturellen Veränderungen
in den Nervensystem-Glycokonjugaten, wobei diese Veränderungen
neue Aglyco-Produkte
erzeugen, oder 2) weil diese neuen Aglyco-Produkte als Antigene
wirken können,
durch Bestimmung der neuen Antikörperprodukte,
die von dem Körper
gegen die neuen antigenen Aglyco-Produkte produziert werden. Somit
können
diese Aglyco-Zellantigenprodukte ausreichend verschieden von den
normalen Bestandteilen sein, daß der
Körper
die neuen Aglyco-Produkte
als fremd erkennt und Antikörper
gegen sie herstellt, wobei diese Antikörper einen nachteiligen oder
erwünschten
Effekt auf die Zelle haben und Zelltod verursachen können (z.
B. in sich normal entwickelndem Gehirn nicht erwünscht; in Gehirntumoren erwünscht).
Die Identifizierung dieser Aglyco-Produkte durch direkte Bestimmung
oder durch Bestimmung der Antikörper,
die gegen diese gerichtet sind, kann eine Hilfe oder die Grundlage
für eine
Diagnose der Störung
sowie die Grundlage für
Ihre Behandlung sein.
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Viele
scheinbar nicht in Zusammenhang stehende Beobachtungen in der Vergangenheit,
welche nicht verstanden wurden und hinsichtlich Zellfehlfunktion,
Zelltod und speziellen Krankheitszuständen nicht verstanden werden
konnten, können
nun im Lichte der vorliegenden Erfindung verstanden werden, welche
erstmals den Zustand und die Konsequenzen von Aglyco-Pathologie,
deren Produkte sowie Produkte und Verfahren für Ihre Feststellung und Behandlung
definiert.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt,
bei dem die Sequenz der Aminosäuren Tyrosin-Lysin-Alanin-Glycin-Valin-Alanin-Phenylalanin-Leucin-Histidin-Lysin-Lysin-Asparagin-Asparaginsäure-Isoleucin-Asparagin-Glutaminsäure oder
eine Derivat davon ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt
bei dem die Sequenz der Aminosäuren
Glycin-Leucin-Serin-Asparaginsäure-Glycin-Serin-Asparagin-Theronin-Glutaminsäure-Serin-Asparginsäure-Isoleucin
oder ein Derivat davon ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines
Peptids der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments
für die
Behandlung von Krebs bereitgestellt.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Ex vivo-Verfahren zum Diagnostizieren
von Krebs oder von Empfänglichkeit
für Krebs
in einem Subjekt, welches mit Expression oder Aktivität eines
Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einem Subjekt in Zusammenhang
steht, bereitgestellt, welches umfasst, daß man eine Analyse hinsichtlich
des Vorhandenseins oder der Menge des Polypeptids oder eines Antikörpers gegen
das Polypeptid in einer Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde,
durchführt.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt,
die ein Polypeptid, wie es in der vorliegenden Erfindung definiert
ist, und einen pharmazeutisch wirksamen Träger umfasst.
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Die
Signifikanz des Zellschadens oder Zelltodes, was eine Folge einer
Influenazvirus-Infektion
in dem sich entwickelnden Gehirn sein kann, sieht man in diesem
Beispiel, welches eine Influenzavirusinfektion mit neuronaler Zellbeschädigung,
Zelltod und somit Verlust und mit Schizophrenie in Verbindung stellt
und direkt und quantitativ die Art der beteiligten Aglyco-Produkte demonstriert.
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Frühere quantitative
neurochemische Studien legten nahe, daß Neuraminsäure und Hexosaminsäure Teil
eines Glycokonjugat-„Wegweiser"-Systems für interzelluläre Erkennung
sind, welches das Nervennetzwerk bildet, das normaler Gehirnentwicklung
und normalem Hirnverhalten unterliegt. Jüngere histologische Studien
von schizophrenem Gehirn zeigen eine neuronale Desorganisation,
welche von einigen Entwicklungsstörungen herrühren könnten. Epidemiologische Studien
legen nun nahe, daß eine
pränatale
Infektion mit Influenzavirus, welches Neuramidase enthält, für Schizophrenie
prädisponiert.
Daß konjugierte
Neuraminsäure und
Hexosamin in cerebrospinaler Flüssigkeit
bei Schizophrenie quantitativ vermindert sind, wird hier in einer Doppelblindstudie
gezeigt.
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Die
Häufigkeit
von Schizophrenie scheint anhand von jüngeren epidemiologischen Beobachtungen
in Individuen, deren Mütter
während
des zweiten Trimesters der Gestation des Individuums eine Influenzavirusinfektion
hatten (1–9)
und in Populationen mit einer hohen Häufigkeit von Gangliosid- und
anderen Glycolipidstörungen
(10) erhöht
zu sein. Histologische Studien zeigen Nervenzellverlust und neuronale
Desorganisation in schizophrenem Gehirn (11–15). Das Entfernen von Neuraminsäure von
deren Konjugaten durch das Influenzavirusenzym Neuraminidase (Sialidase)
könnte
verantwortlich sein für
eine Schädigung
von Nervenzellerkennungsmolekülen
in dem unreifen Gehirn. Die oben genannten jüngeren Entdeckungen in der
Epidemiologie und der Histologie sind relevant für quantitative neurochemische
Daten, die eine Abnahme in der tatsächlichen Konzentration von
Neuraminsäure-
und Hexosaminkonjugaten in cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) von schizophrenen
Patienten zeigen (16–23,
36, 37, 39), was hierin bestätigt
wird, und die im Zusammenhang stehende Arbeit an Glycokonjugat (Glycolipid,
Glycoprotein)-Erkennungssubstanzen im Gehirn (24–33), welche zu der „Wegweiser"-Hypothese von neuronaler Konnektivität und Nervensystemreifung
führte
(34–35).
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Arbeit
in diesem Labor führte
zu der Schlussfolgerung, daß Glycokonjugate
im Nervensystem Erkennungssubstanzen sind (24–35). Nachdem die Struktur
der Gehirngangliosiden erstmals ausreichend bestimmt wurde, wurde
von Gangliosiden in vitro gezeigt, daß sie sowohl als Rezeptoren
für Influenzavirus
als auch als Effektoren bei der Stimulierung von gehemmtem Herz-
und glattem Muskel wirken. In vivo wirkte intracerebral zusätzlich verabreichtes
Gangliosid als ein „Köder" und hemmte eine
Infektion von Gehirnneuronen durch Influenzavirus. Menschliche Gehirnglycoproteine
wurden in der Masse isoliert, getrennt und teilweise hinsichtlich ihrer
Kohlenhydratbestandteile charakterisiert. Von Glycokonjugaten wurde
dann gezeigt, daß sie
in synaptischen Membranen vorhanden sind, daß sie an der Säugernervenentwicklung
und bei Trainings- und Lernprozessen in Tauben beteiligt sind. Die „Wegweiser"-Funktion von Glycokonjugaten
im Nervensystem wurde unter Bezugnahme auf die Etablierung von neuralen
Netzwerken sowohl während
der Entwicklungsreifung als auch mit Erfahrung postuliert. Von Schizophreniepatienten
wurde gezeigt, daß sie
eine signifikante Abnahme an konjugierter Neuraminsäure und
Hexosamin in CSF im Vergleich zu anderen psychotischen Störungen zu
Normalen aufweisen (16–23).
Diese Abnahme war quantitativ proportional zu der Schwere der Krankheit
und nahm in Richtung des Normalen mit einer Verbesserung des klinischen
Status zu (36, 37, 39).
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Wir
erläutern
hierin eine Doppelblindstudie, welche die Abnahme von konjugierter
Neuraminsäure
und Hexosamin in CSF von schizophrenen im Vergleich zu nicht schizophrenen
psychotischen Patienten zeigt. Von 19 Patienten wurden 2 Patienten
ausgeschlossen, weil die klinischen Diagnosen nicht bekannt waren.
Die Verbleibenden 17 wurden als „schizophren" bezeichnet (N =
11), wenn dieser diagnostische Begriff verwendet wurde, und als „nicht
schizophrene" andere
Psychosen (N = 6), wenn die Diagnose nicht Schizophrenie war. Diese
Diagno sen wurden durch sorgfältige
klinische Aufarbeitung, einschließlich der vollen Historie und
einer Einordnung des mentalen Status anhand der Skala für psychotische
Eigenschaften (39), von Forschungspsychiatern erstellt, welche ein
Minimum von drei Jahren psychiatrischen Facharzttrainings abgeschlossen
hatten, und die Diagnosen wurden von hochrangigen Psychiatern bestätigt.
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Lumbale
CSF-Proben, 5 bis 18 ml, welche kodiert und ohne klinische Information
waren, wurden in Trockeneis zu dem Labor verfrachtet. Jede der Proben
wurde lyophilisiert, gegen destilliertes Wasser ausgiebig (Cellophanporengröße für ein Molekulargewicht
von etwa 12.000 Dalton) bei 0 bis 5°C dialysiert, um freie Neuraminsäure und
freie Hexose zu entfernen, und die nicht dialysierbare Fraktion
wurde in doppelter Untersuchung hinsichtlich konjugierter Neuraminsäure nach
der Bial'schen Orzinprobe
und nach dem Thiobarbitursäure
(TBA)-Verfahren hinsichtlich konjugiertem Hexosamin und konjugierter
Hexose, wie sie alle zuvor beschrieben wurden (19), quantitativ
analysiert. Nachdem die neurochemischen Test für alle Proben abgeschlossen
waren, wurde der Code eröffnet.
Trotz der geringen Probengröße waren
konjugierte Neuraminsäure
(p < 0,025) und
konjugiertes Hexosamin (p < 0,006),
aber nicht konjugierte Hexose hinsichtlich der Konzentration statistisch
signifikant geringer in der schizophrenen Gruppe in dem zweiseitigen
T-Test. Werte von konjugierter Neuraminsäure in 81,8% der Schizophrenen
waren geringer als 7,5 μg/ml
CSF und waren in 83,3% der nicht Schizophrenen größer als
7,5 μg/ml
CSF (siehe 1). Darüber hinaus wurde in drei Patienten,
einem nicht schizophrenen und zwei schizophrenen Patienten, denen
im Abstand von Wochen wiederholt CSF abgenommen wurde, eine Reproduzierbarkeit
in der neurochemischen Analyse der randomisierten Blindproben erhalten.
Die Bestimmung von konjugierter Neuraminsäure nach dem TBA-Verfahren erwies
sich als nicht zuverlässig
(38, 39). Es sollte betont werden, daß in der vorliegenden und allen
früheren
Studien sowohl in vitro als auch in vivio es nur die konjugierte
und nie die freie Neuraminsäure
ist, von der gefunden wird, daß sie
biologisch aktiv oder bei Schizophrenie vermindert ist.
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Somit
führten
frühere
neurochemische Daten zu der normalen „Wegweiser"-Hypothese, aber die Art der Pathologie
von Glycokonjugaten wurde nicht verstanden. D.h., daß die Bedeutung
einer Abnahme in der Konzentration an Neuraminsäure und Hexosamin als Glycokonjugate
nicht verstanden wurde. Daß eine
Abnahme in diesen Glycokonjugaten prä- oder postnatal aufgrund von
Virus oder einer anderen akuten oder chronischen Ursache in der
Pathogenese von Schizophrenie kritisch ist, wurde nicht realisiert.
Die Erwägung
der epidemiologischen Bedeutung des Verhältnisses von Influenzavirusinfektion
in dem zweiten Trimester der Schwangerschaft zu der Häufigkeit
von daraus resultierender Schizophrenie und die histologische Bedeutung von
Gehirnzellverlust und -desorganisation, zusammengenommen mit dem
direkten Beweis der quantitativen Abnahme der Neuraminsäure- und
Hexosaminkonzentration in Glycokonjugaten, führte zu der vorliegenden Entdeckung
von Aglyco-Pathologie.
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BEISPIEL
4 Behandlungen von Schizophrenie, welche vorteilhaft sind, erhöhen die
Konzentration von Glycokonjugaten in dem Nervensystem bei gleichzeitiger
Verbesserung des Patienten. Literaturstelle 39 beschreibt die Zunahme
(+) oder Abnahme (–)
der absoluten Mengen an Glycoproteinkohlenhydratbestandteilen in
der cerebrospinalen Flüssigkeit
in 65 Fällen
einer Verbesserung, „keine
Veränderung" oder einer Verschlechterung
des klinischen Status von 47 schizophrenen Patienten während des
Eintritts in und die Erholung von einem psychotischen Zustand, der
mit Elektroschock oder Arzneimitteln behandelt wurde.
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BEISPIEL
5 Verabreichung eines Neuraminsäure-
und Hexosaminvorläufers
an schizophrene Patienten führt
zu einer Verbesserung. D-Glucosamin HCl, 200 mg pro Tag, wurde chronischen
hospitalisierten schizophrenen Patienten für 30 Tage über den Mund verabreicht. Es
wurde die Beurteilungsskala für
psychotische Eigenschaften zusammen mit dem gesamten klinischen
Zustand verwendet.
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PREPARATIVES BEISPIEL
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Erhöhung der
Gehirnglycokonjugathexose und der Aufnahme von 14C-Glucose in Tauben
während des
Trainings.
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Die
Gehirne von Tauben in Ruhe im Vergleich zum Training in einer Skinner-Box
wurden verglichen hinsichtlich a) der absoluten Menge an Glycokonjugathexose
und b) der Aufnahme von 14C-Glucose in Gehirnglycokonjugate.
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Die
Ergebnisse sind die folgenden:
- a) ABSOLUTE
KONZENTRATION VON GLYCOKONJUGATHEXOSE
- b) 14C-GLUCOSE-AUFNAHME IN TAUBENGEHIRNGLYCOKONJUGATE
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Neunzig
Mikrocurie 1-14C-Glucose wurden intravenös in Tauben
vor einer Ruhe- oder Trainingsperiode injiziert, und die Tauben
wurden danach in Abständen
getötet.
Die Proteine des Gehirns von jedem Taubengehirn wurden dann extrahiert
und Chromatographie unterzogen und die Radioaktivität auf einem
Szintillationszähler
bestimmt. Nach ausgiebiger Dialyse der isolierten Gehirnproteingruppen
wurde die Gesamtradioaktivität
der Fraktion bestimmt, dann wurde die Fraktion stufenweise saurer
Hydrolyse unterzogen mit einer Dialyse gegen freie Zucker, welche
quantitativ bestimmt wurden. Diese Zuckerbestandteile wurden dann
durch Dünnschichtchromatographie
getrennt, gefärbte
Punkte wurden durch Vakuumabsaugung entfernt und zusammen mit Blindproben
ausgezählt.
Die Ergebnisse waren die folgenden:
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Der
zeitliche Verlauf der Aufnahme ist deutlich anders in dem Trainingszustand
im Vergleich zu dem Ruhezustand. In dem Trainingszustand tritt eine
maximale Aufnahme innerhalb von 30 Minuten auf, einer Zeit, bei
der in dem Ruhezustand nur ein Zwanzigstel soviel aufgenommen wird.
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Literaturstellen:
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BEISPIEL
1 Aglyco-Gehirnglycoprotein 10B und dessen spezifischer Antikörper sind
zwei Aglyco-Produkte im Gehirn und in anderen Malignitäten. Der
Antikörper
gegen Aglyco 10B, der in dem Körper
produziert wird, verursacht Zelltod.
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Der
in diesem Beispiel angegebene Beweis, der sowohl in dem Gehirnglycokonjugat
10B bestimmbar ist als auch durch Quantifizierung des zytotoxischen
Antikörpers,
der von dem Körper
gegen das resultierende Aglyco-Produkt von 10B („Aglyco 10B") hergestellt wird,
be stimmbar ist, erläutert
die vorliegende Erfindung. Daß die
Erhöhung
in der absoluten Konzentration dieses Antikörpers (Anti-Aglyco 10B oder
Antimalignin) in anderen üblichen
Malignitäten
von verschiedenen Zelltypen, d.h. Krebs der Lunge, der Brust, des
Darms etc., beobachtet wird, zeigt, daß Aglyco-Pathologie ein allgemeines
pathologisches Phänomen
ist, das nicht nur auf das Gehirn beschränkt ist.
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Wenn
Glycoprotein 10B als ein normaler 250 kD großer Membranbestandteil im menschlichen
Gehirn identifiziert wurde und gezeigt wurde, daß es im Training in Taubengehirnen2,5-10 eine Rolle spielt, war eine der untersuchten
Kontrollen, um hinsichtlich des Verhältnisses von normaler 10B zu
Zell-Zell-Wechselwirkung zu testen, Gehirnmagnilität. Es wurde
die Hypothese aufgestellt, daß in
Gehirnglioblastom, wo ein deutlicher Verlust von Kontaktinhibition
der Zellteilung mit unbeschränkter
Proliferation einherging, man erwarten könnte, daß die Struktur von 10B verändert wäre. Tatsächlich wurde
gefunden, daß die
Struktur von 10B in Gehirnglioblastom deutlich verändert war:
Die Kohlenhydratgruppen waren in einer Menge von etwa 50% reduziert
und es gab einen Verlust an Heterogenität. Wo es in dem normalen 10B
9 verschiedene Kohlenhydratbestandteile gab, waren diese in Tumor
10B auf 5 oder 6 reduziert. Darüber
hinaus wurde der Proteinanteil von 10B 7–10fach überproduziert oder überexprimiert.
Astrocytin war der Name, dem man dem 10 kD Peptid gegeben hat, welches
von Gehirntumor 10B abgespalten wurde. Von Glioblastomzellen, die
in Gewebekultur gezüchtet wurden,
wurde das Äquivalent
zu Astrocytin, Malignin, isoliert und es erwies sich als ein sehr
naher struktureller Verwandter von Astrocytin16.
Malignin wurde so bezeichnet, weil in Gewebekultur die Expression
dieses Peptides und somit dessen Konzentration pro mg extrahierbarem
Membranprotein mit einer erhöhten
Geschwindigkeit der Zellteilung pro Zeiteinheit zunahm.
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Recognin
M wurde von malignen Säugerzellen
MCF7 isoliert. Es ist ein 10 kD Krebspolypeptidantigen, das reich
an Glutamin- und Asparaginsäuren
ist und welches mit Malignin verwandt ist, das auch aus Gliagehirntumoren
isoliert wurde (Glu13, Asp9, His2)21. Ein
IgM37-Autoantikörper gegen
Recognin M, Antimalignin, wurde aus menschlichem Serum20 isoliert,
als monoklonaler Maus-Antikörper
hergestellt31,33, in menschlicher Form durch
Reizsetzung an menschliche Lymphozyten mit dem Antigen in vitro
hergestellt35,37 und von malignen Zellen,
die bei Chirurgie und Autopsie24 erhalten
wurden, durch Elution und Immunabsorption an ihr immobilisiertes
gereinigtes Antigen isoliert.
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KLINISCHE DATEN
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In
einer zwanzigjährigen,
randomisierten, meistenteils blinden Studie, welche mehrere hundert Ärzte und
drei unabhängige
Laboratorien in den USA und drei Krankenhäuser und ein Laboratorium in
Großbritannien
einbezog, haben wir nun herausgefunden, daß die Konzentration von Antimalignin
in Serum in μg/ml
1) von normalen, gesunden, keinen Tumor tragenden Menschen jedes
Jahrzehnt zwischen dem dritten und dem siebten mäßig zunimmt, während das
Risiko von Krebs zunimmt (p < 0,001;
N = 1,972) (1), 2) früher und deutlicher zunimmt
in bislang offensichtlich nicht betroffenen Mitgliedern von Hochrisiko-Krebsfamilien
(p < 0,001; N =
1,106) (1 und 3) und 3)
hinsichtlich der Konzentration in menschlichem Serum innerhalb von
Wochen seit dem Auftreten von maligner Transformation zu klinischem
Brustkrebs deutlich zunimmt, aber nicht stigmatisch ist (im Sinne
von invariant), da sie innerhalb von drei Monaten einer erfolgreichen
Behandlung auf ein normales Maß zurückkehrt39,41,44,45 und in dem normalen Bereich bis
zu 27 Jahre nach erfolgreicher Behandlung bleibt (2 und 3)
(p < 0,001; falsche
positive und falsche negative < 5%
bei der ersten Bestimmung, < 1%
bei wiederholter Bestimmung; N = 600).
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Ein
Beispiel dafür,
wie Antimalignin nicht fixiert, sondern moduliert wird, ist in Tabelle
II gezeigt. Vollständig
entnommene Zervix lieferte ein pathologisches Anzeichen für eine Transformation
von Dysplasie bis zu dem Stadium von klinisch-manifestiertem invasivem
Karzinom; dies ging einher mit einer deutlichen Erhöhung der
Konzentration von Antimalignin. Nach chirurgischer Entfernung ging
Antimalignin innerhalb von drei Monaten wieder auf das normale Maß zurück. 2 und 3 zeigen,
daß dies
statistisch signifikante Veränderungen
in beiden Richtungen sind (p < 0,001).
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Eine
quantitative Bestimmung von Serum-Antimalignin-Antikörpern ist
daher von Interesse für
eine Verwendung als ein nicht invasiver Biomarker zur Anzeige erfolgreicher
Ergebnisse von Chemoprophylaxeversuchen bei Brustkrebs.
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Darüber hinaus
ist gereinigter Antimalignin-Antikörper (MTAG) aufgrund seiner
gezeigten Spezifizität bei
Fluroeszenz- und anderer Chromogenfärbung von Zellmembranen, in
welchen die Epitope von Malignin exponiert wurden16,27,28,30 für eine Verwendung
allein oder als Teil einer Batterie von auf Prädysplasie oder Dysplasie basierenden
Surrogatendpunktbiomarkern sowohl in der individuellen als auch
der computergestützten Zytometrie
anwendbar.
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VERHÄLTNIS ZUM PATHOLOGISCHEN PROZESS:
ANTIMALIGNIN IST EIN HEMMENDER TRANSFORMATIONSANTIKÖRPER
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Zellen,
die maligne Transformation im Menschen durchlaufen haben, können Jahre
brauchen, um zu proliferieren und zu klinischem Krebs zu werden,
oder können
niemals proliferieren. Wenn eine Hemmung von Proliferation in einem
Immunprozess, wie es theoretisch dargestellt1,3 und
aufgrund des erhöhten
Auftretens von Krebs bei Immunschwächestörungen, wie AIDS nahegelegt
wurde, gibt es keinen direkten Beweis in menschlichem Krebs für solch
einen Immunprozess, und die verantwortlichen Mechanismen sind unbekannt. Antimalignin
steht zusätzlich
zu den oben aufgezählten
Eigenschaften in einem quantitativen Verhältnis zum Überleben in Patienten32,34. In vitro bindet über Antigen gereinigtes menschliches
Antimalignin an Krebszellen unabhängig vom Zelltyp, ist in nicht
sättigenden
Mengen auf Krebszellen, die bei Chirurgie oder Autopsie entnommen
wurden, vorhanden, wirkt hemmend auf das Wachstum von Kleinzelllungenkarzinomzellen
in Picogrammmengen (Femtomol, da dies ein IgM ist) Antikörper pro
Zelle (4) und ist zytotoxisch für maligne Gliazellen (5j,
k und l).
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Antimaligninantikörper oder
Derivate davon in menschlicher Form, die ihre immunologische Spezifität aufweisen,
werden Tieren oder Menschen subkutan oder intravenös in Mengen
von einem bis zehn Gramm pro Tag gegeben und liefen eine Zerstörung von
Krebszellen.
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Quantitative
Bestimmung von Antimalignin-Antikörper: Bestimmt mit immobilisiertem
Malignin-Antigen (TARGET-Reagenz, Brain Research, Inc., Boston).
Bei der Herstellung von TARGET-Reagenz, wie es zuvor beschrieben
wurde, wurden menschliche Glioblastomzellen in sterilen Gewebekulturflaschen
von 250 ml, die in der horizontalen Position in einem Inkubator
bei 37°C
gestapelt waren, gezüchtet,
bis eine Einzelschicht von Zellen die Wand der Flasche bedeckt hatte,
mit Trypsin von der Wand befreit, mit einem Spatel in einen Glasbecher
gescharbt, mit einem Branson-Sonikator homogenisiert, dialysiert,
durch Vorverdampfung konzentriert, zentrifugiert, auf einer Cellex
D-Säule
unter stufenweiser Elution mit gepufferten Lösungen mit abnehmendem pH-Wert
Chromatographie unterzogen, wobei das Protein in jedem Eluat durch
Absorption bei 280 nm quantifiziert wurde. Das letzte Eluat, welches
Malignin enthält,
das bei dessen pK-Wert von etwa 2,7 eluierte, wurde erneut Chromatographie
unterzogen. Die Endpräparation
enthielt das Malignin mit der folgenden Zusammensetzung: Glu13,
Asp9, Thr5, Ser5, Pro4, Gly6, Ala7, Val6, Met2, Ileu4, Leu8, Tyr3,
Phe3, His2, Lys6, Arg5½, Cys1,
und zeigt ein Molekulargewicht von etwa 10 kD und Dimere und Trimere
davon auf dem SDS-Gel
und in Dünnschichtgelchromatographie.
Malignin wurde mit Bromacetylcellolase unter Herstellung von immobilisiertem
TARGET-Reagenz kovalent vereinigt. Zur Quantifizierung des Antimalignin-Antikörpers in
Krebs- und normalen Seren wurden 0,2 ml-Proben von jeder Serenprobe
in Doppelbestimmung an TARGET-Reagenz unter Schütteln für entweder 2 Stunden oder 10
Minuten ausgesetzt, der gebundene Antikörper wurde dreimal mit kaltem
NaCl gewaschen, dann durch Inkubation unter Schütteln mit 0,25 molarer Essigsäure von
dem Antigen befreit, bei 3.000 U.p.M. zentrifugiert, der klare Essigsäureüberstand
spektrophotometrisch bei O.D. 280 ausgelesen und die Ergebnisse
in Mikrogramm Protein umgerechnet. Die Ergebnisse sind als Mittelwert
+/– SD
für jedes
Serum für
NET TAG (= langsam bindender Antikörper) (2 Stunden Kontakt von
Eluat mit immoblisiertem Malignin) minus schnell bindendem Antikörper (10
Minuten Kontakt von Eluat mit immobilisiertem Malignin) in Mikrogramm/ml
Serum angegeben44.
-
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Submitted for Publication 1993.
-
BEISPIEL 2 Die Kohlenhydratbestandteile
von Gehirnglycokoniugaten, die in der Gegenwart von Gehirntumoren
in ihrer Konzentration vermindert sind, können durch bestimmte Arzneimittel,
z. B. Diphenylhydantoin (DPH) in Richtung normaler Konzentration
erhöht
werden.
-
Mäuse wurde
in zwei Gruppen aufgeteilt, eine Hälfte, welche mit subkutanen
Gehirnependymomen angeimpft wurde, und eine Hälfte, welche nicht angeimpft
wurde. Jede dieser zwei Gruppen wurde in zwei Gruppen aufgeteilt:
Eine Hälfte
sollte täglich
subkutan DPH, 1 mg/kg Körpergewicht,
erhalten und eine Hälfte erhielt
kein DPH, sondern nur Injektionen von Kochsalzlösung. Die Tiere wurden getötet, wenn
das Ependymom ausreichend wuchs, daß es gerade die Hautoberfläche durchbrach.
Es gab eine signifikante Verminderung des Wachstums von Tumoren,
wenn DPH gegeben wurde. Die Gehirne wurden für jede Untergruppe vereinigt
und proteingebundene Hexose extrahiert, wie in dem präparativen
Beispiel, mit den folgenden
-
-
Es
sollte angemerkt werden, daß DPH
eine Erhöhung
der Konzentration an Gehirnprotein gebundener Hexose in der Abwesenheit
von Tumoren sowie in deren Gegenwart erzeugte.
-
BEISPIEL 3 Struktur von
Aglyco 10B
-
- A. Jodbenzoesäure-Hydrolyse von Aglyco 10B
gefolgt von Edman-Abbau lieferte das Peptid („Jodopeptid") mit der folgenden
Sequenz:
- B. Massensgektronomie gefolgt von Berechnungen unter Verwendung
von MacBioSpec-Software-Handbuch
013048-A, PESCIEX, Perkin Elmer Sciex Instruments, lieferte die
folgenden Eigenschaften des Peptides SEQ ID NO: 1:
N-terminale
Gruppe: Wasserstoff | C-terminale
Gruppe: freie Säure |
MH+
Monoisotopenmasse = 1.847,9656 amu | HPLC-Index
= 43,40 |
MH+
Durchschnittsmasse = 1.849,0998 amu | Bull & Breese-Wert = –80 |
Isoelektrischer
Punkt (pl) = 8,0 | Elementarzusammensetzung:
C84H131N22O25 |
- C. Massenspektrometrie: Die Sequenz von SEQ ID NO: 1 in 9A oben,
erhalten durch Jodbenzoesäure-Hydrolyse,
wurde unabhängig
durch Massenspektrometrie von Fragmenten von Aglyco 10B bestätigt, die durch
4 verschiedene Säurehydrolysen
von Aglyco 10B in Lösung
und von Aglyco 10B, das auf Bromacetylcellulose immobilisiert war
(Aglyco 10BC oder A10BC), erhalten wurden, wie es unten beschrieben
ist. Die Hydrolysen erzeugten 13 überlappende hydrolytische Fragmente
(von denen zwei, 6–10
und 6–12
unten, jeweils durch zwei verschiedene hydrolytische Verfahren erhalten
wurden). Zusammengefasst bestätigten
diese überlappenden
Fragmente unabhängig
voneinander die Peptidsequenz von SEQ ID NO: 1 wie folgt: * Inaktes
Aglyco 10B in Lösung
ist eine starke Säure
mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 2,7 und liefert Autohydrolyse,
wenn es für
Stunden bei Raumtemperatur oder sogar bei 0 bis 5°C für längere Zeiträume belassen
wird.
- C. Trypsinhydrolyse von Aglyco 10B, gefolgt von Edman-Abbau
lieferte das Peptid SEQ ID NO: 2 mit der folgenden Sequenz:
- D. Massenspektrometrie von hydrolytischen Fragmenten von Aglyco
10B, gefolgt von Berechnungen unter Verwendung des MacBioSpec-Softwarehandbuchs
013048-A, PESCIEX, Perkin Elmer Sciex Instruments, lieferte die
folgenden Eigenschaften des Peptides SEQ ID:2 Gly Leu Ser Asp Gly
Ser Asn Thr Glu Ser Arp Ile
N-terminale
Gruppe: Wasserstoff | C-terminale
Gruppe: freie Säure |
MH+
Monoisotopenmasse = 1.194,5126 amu | HPLC-Index
= 0,70 |
MH+
Durchschnittsmasse = 1.195,1817 amu | Bull & Brease-Wert =
2.690 |
Isoelektrischer
Punkt (pl) = 4,4 | Elementarzusammensetzung:
C46H76N13O24 |
- E. Massensgektrometrie: Die Sequenz der Aminosäuren 2–11 von
SEQ ID NO: 2 in 2C oben, erhalten durch Trypsinhydrolyse, wurde
unabhängig
bestätigt
durch Massenspektrometrie von Fragmenten von Aglyco 10B, die durch
vier verschiedene Säurehydrolysen
von Aglyco 10B in Lösung
und von Aglyco 10B, das an Bromacetylcellulose (Aglyco 10B-Cellulose
oder A10BC) immobilisiert war, erhalten, wie es nachfolgend angegeben
ist. Diese Hydrolysen erzeugten sieben überlappende hydrolytische Fragmente,
welche unabhängig
voneinander 2–11
der Peptidsequenz von SEQ ID NO: 2 Gly Leu Ser Asp Gly Ser Asn Thr
Glu Ser Asp Ile wie folgt bestätigten: * Inaktes
Aglyco 10B in Lösung
ist eine starke Säure
mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 2,7 und liefert Autohydrolyse,
wenn es für
Stunden bei Raumtemperatur oder sogar bei 0 bis 5°C für längere Zeiträume von
Wochen bis Monaten belassen wird.
- F. CNBr-Hydrolyse von Aglyco 10B, gefolgt von Edmann-Abbau lieferte
das Dipeptid SEQ ID NO: 3 mit der folgenden Sequenz: Met Asp
- G. VERWENDUNG VON AGLYCO 10B, A10BC, INTAKTEM 10B, SEQ ID NO:
1 ODER SEQ ID NO: 2, ALS EIN IMPFSTOFF. Etwa 1 mg jedes der oben
genannten Glycoprotein- oder Proteinfragmente, die zwei- oder dreimal
subkutan in Tiere, einschließllich
Menschen, injiziert wurden, erzeugen Antimalignin-Antikörper und
eine zelluläre
Antwort für
die Prävention
oder Behandlung von Krebs. SEQUENZPROTOKOLL:
- G. Eine Chromophorengruppe („Chromoghor") ist in Aglyco 10B
vorhanden, was dazu führt,
daß eine
konzentrierte Lösung
von Aglyco 10B (> 100 μg/ml) leicht
gelb ist. Das Chromophor bleibt bei Aglyco 10B während sämtlicher Phasen seiner Reinigung,
einschließlich
Hochdruckflüssigchromotographie.
-
Wenn
Sauerstoff durch Stickstoff ersetzt wird, indem man das Glasröhrchen,
welches die Aglyco 10B-Lösung
enthält,
evakuiert und mittels Hitze abdichtet, wird die Aglyco 10B-Lösung dunkelgrün. Wenn
das Glasröhrchen
an der Luft geöffnet
wird, kehrt die Lösung
sofort wieder zu der gelben Farbe zurück.
-
Da
dieser Übergang
von gelb in dem sauerstoffgesättigten
Zustand nach dunkelgrün
in dem sauerstofffreien Zustand und zurück zu gelb in dem sauerstoffgesättigten
Zustand ein reversibler Übergang
ist, den man nur in Bezug auf das Vorhandensein oder Fehlen von
Sauerstoff sieht, wird geschlussfolgert, daß die Farbveränderung
die Eigenschaft einer reversiblen Oxidation:Reduktion des Chromophors
ist.
- H. Klonierung des Gens für Aglyco
10B. Nach Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, wird das Gen
für Aglyco
10B und somit auch für
10B mit der vollständigen
Aminosäuresequenz
unter Verwendung entweder des Peptides SEQ ID NO: 1 aus Beispiel
9A oben oder des Peptides SEQ ID NO: 2 aus Beispiel 9C oben oder
beide zur Konstruktion von RNA und einer cDNA-Sonde von Bibliotheken
von normalen und transformierten Gliazellen erhalten. Das Gen für Aglyco
10B und von 10B erlaubt deren Verwendung in ihrer Gesamtheit oder
mit Fragmenten der Struktur als Impfstoffe. Darüber hinaus kann das gesamte
Gen oder können
Teile davon in verschiedene gut bekannte Expressionsysteme eingebracht
werden, um intaktes glycokonjugiertes 10B-Protein oder Aglyco 10B
herzustellen und diese Produkte als Impfstoffe in den Patienten
oder in Tieren zur Erzeugung der spezifischen Antikörper gegen
die intakten Moleküle
oder die Fragmente davon zu verwenden. Da 10B dafür bekannt
ist, daß es
an der Erkennung und an dem kognitiven Training in dem gesamten
Tier beteiligt ist, kann es dazu verabreicht werden, die kognitive
Funktion in Tieren und Menschen zu verbessern (siehe Alzheimer'sche Krankheit unten).
-
10. Aglyco-Produkte in
Alzheimer'scher
Krankheit
-
Alzheimer'sche Krankheit ist
eine vernichtende Krankheit, bei der sich ein Nervenzellenverlust
durch kognitive Störungen,
vornehmlich durch Erinnerungsverlust in frühen Phasen, manifestiert. Bestimmte
Derivate des Amyloidvorläuferproteins
(APP) sind verantwortlich für
die abnormalen Gehirnablagerungen, die für diese Krankheit charakteristisch
sind. Obwohl APP bekanntermaßen
ein Glycoprotein ist, wurde den Kohlenhydraten in APP bislang keine
Aufmerksamkeit geschenkt. Aufgrund dieser Erfindung können Aglyco-Produkte
1) direkt durch Isolierung und Charakterisierung der Derivate von
APP in cerebrospinaler Flüssigkeit,
welche verminderte Kohlenhydratbestandteile aufweist, und 2) indirekt
durch Feststellen und Quantifizieren von Antikörpern gegen Aglyco-APP in Patientenserum
detektiert werden.
-
Frühe prä-amyloide
Ablagerungen im Gehirn wurden sichtbar gemacht, bevor die neurofibrillären Plaques,
die Produkte von Nervenzellzerstörung,
erschienen sind und sich mit den „reifen" Alzheimer-Plaques vereinigt haben.
Diese prä-amyloiden
Ablagerungen, wie auch die reifen Plaques, enthalten Ab-Peptide,
39–42 Aminosäurereste
lange Abbauprodukte von APP. Während
der Übergang
von prä-amyloiden
zu reifen Amyloid-Plaques häufig
ist, weil Prä-Amyloid-Ablagerungen
Jahre vor einem Abbau vorhanden sind, erscheinen Neuriten im Gehirn
von Patienten mit Down'schem
Syndrom. Prä-Amyloid-Ablagerungen
können
einer Behandlung zugänglicher
sein, d.h. einer Auflösung
und Ausscheidung, bevor ein Schaden für Nervenzellen auftritt. Schutz
gegen weitere Akkumulation von Plaques kann durch Verabreichung
von Diphenylhydantoin (DPH) erreicht werden, was, wie diese Erfindung
zeigt, die Konzentration von proteingebundener Hexose erhöht (siehe
Beispiel 8 oben).
-
Beispiele
für andere
Zustände,
in welchen neue Aglyco-Antigene exponiert werden können und
Aglyco-Antikörper
liefern, sind Parkinson'sche
Krankheit und multiple Sklerose, und diese Erfindung sollte auf
diese und andere Störungen
sowohl des Gehirns als auch anderer Organe sowohl in Bezug auf Diagnose
als auch Behandlung anwendbar sein, wie es oben angegeben ist.