DD296933A5 - Peptide - Google Patents
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Abstract
Es werden spezifisch glykosylierte Insuline und pharmazeutische Zubereitungen bereitgestellt. Die neuen Insuline sind vorzugsweise mono-, di- oder triglykosyliert und enthalten eine Monosaccharidgruppe oder eine Oligosaccharidgruppe mit zwei oder drei Zuckereinheiten. Die spezifisch glykosylierten Insuline weisen eine hohe Loeslichkeit mit einem schnelleren Beginn der Insulinwirkung auf als zum Beispiel Humaninsulin.{pharmazeutische Zubereitung; spezifisch glykolisiertes Insulin; Monosaccharidgruppe; Oligosaccharidgruppe; Zuckereinheit; Humaninsulin; mono-, di- oder triglykosyliert; Loeslichkeit}
Description
Peptide
Die vorliegende Erfindung betrifft spezifisch glykosylierte Insuline und deren Kombinationen, pharmazeutische Zubereitungen, die solche glykosylierte Verbindungen enthalten und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Insulinanaloga für die Behandlung von Diabetes mellitus vorgeschlagen. Ziel der Entwicklung solcher Insulinanaloga wares, die Insulinersatztheraphiezu verbessern, indem Insulinanaloga verfügbar gemacht wurden, mit entweder einer schnelleren oder verlängerten Insulinwirkung, verglichen mit speziellen Humaninsulin.
Ein Problem bei der Entwicklung von Insulinanaloga durch Substitution eines oder mehrerer der Aminosäurereste in nativem Insulin ist die potentielle Immunogenität solcher Verbindungen. Auch können sich durch solche Substitutionen unvorhersehbare Löslichkeits- und Stabilitätsprobleme ergeben.
Obgleich Insulin eine sehr kurze Halbwertszeit bei der Blutzirkulation hat, kann nicht ausgeschlossen werden, daß eine geringe Menge Insulin nicht nur bei Diabetespatienten in vivo glykosyliert wird, wie von Nakayama et al. postuliert (Nichtenzymatische Glykosylierung von Insulin in „Current topics in clinical and experimental aspects of diabetes mellitus", 1985,201-204, Sakamoto, Min and Baba, Hrsg., Elsevier Science Publishers B. V.), sondern auch bei Nichtdiabetikern. Es ist daher möglich, daß der Organismus Mechanismen entwickelt hat, die Bildung von Antikörpern gegen glykosyliertes Insulin zu unterdrücken. Es ist weiterhin möglich, daß die konformationellen Änderungen des Saccharidteiles das Antigen irreführen.
Die Bindung von Glukose, Mannose und bestimmter Oligosaccharide an Insulin ist in der Vergangenheit Gegenstand zahlreicher In-vitro-Untersuchungen gewesen mit dem Ziel, festzustellen, ob die In-vivo-Bildung von glykolysiertem Insulin für die Spätkomplikationen bei Diabetespatienten verantwortlich ist.
Anzenbacher et al. (Biochemica et Biophysica Acta 386,1975,603-607) studierten die Bindung von D-Glucose an Insulin durch Gleichgewichtsdialyse. Die Bindung wurde nicht als das wirklich spezifische gefunden und die durchschnittlichen an das Insulinmolekül gebundenen Glucosemotekülen betrugen gemäß Untersuchung acht.
Die Wechselwirkung von Insulin mit Glukose und Mannose wurde von Dolhoferet al. untersucht (Febs Letters 100,1979, 133-136). Oie Ergebnisse zeigten, daß beide Hexosen kovalent in das Insulinmolekül nach In-vitro-lnkubation bei 37°C eingebaut wurden. Unter den gewählten Reaklionsbedingungen wurde gefunden, daß durchschnittlich 3,6 ± 0,39 Glukose - und 5,0 ± 0,43 Mannosereste pro Insulinmolekül aufgenommen wurden.
Durch Brownlee & Cerami (Science 206,1979,1190-1191 und Diabetes 32,1983,499-505) wurde ein Glukose-gesteuertes Insulinfreisetzungssystem vorgeschlagen durch Synthetisieren glykosylierter Insulinderviate, die in der Lage sind mit Glukose für die Bindung an Lectine zu konkurrieren. Bei dieser Untersuchung wurden Maltose und andere Oligosaccharide mit Insulin umgesetzt.
Nakayama et al. (siehe oben) untersuchten die nichtenzymatische Glykosylierung von Insulin in vitro und in vivo (Diabetespatienten) und schlossen, daß Glukose in das Insulinmolekül in vivo unter pathologischen Bedingungen eingebaut wird. Durch die In-vitro-Studien wurde gezeigt, daß 3 Moleküle Glukose pro Molekül Insulin eingebaut wurden.
1988 berichteten Lapolla et al. (Diabetes 37,1988,787-791) über eine verringerte biologische Aktivität in vivo von in vitro glykosyliertem Insulin, Insulin wurde glykosyliert in umgebender hoher Glukosekonzentration gemäß Dolhofer (siehe oben) in wäßriger Lösung bei 37°C über 17 Stunden bei einem pH-Wert von 7,4. Es wurde gefunden, daß der Einbau von Glukose im Durchschnitt bei 2 Mol Glukoserest/Mol Insulin lag.
Unter Berücksichtigung, daß natives Insulin drei freie primäre Aminogruppen aufweist, nämlich an den Positionen B1 (Phe), A1 (GIy) und B29 (Lys), ist es offensichtlich, daß die oben beschriebenen glykosylierten Insulinpräparationen alles inhomogene Gemische von glykosylierten Insulinmolekülen darstellen.
Niemand hat bisher Schritte unternommen, das oben genannte Gemisch in seine Einzelkomponenten zu trennen.
Glykosylierte Insulinderivate für selbstregulierende Insulinfreisetzungssysteme wurden von Kim et al. beschrieben (Journal of Controlled Release 1,1984,57-66 und US-PS 4483792,4478830,4478746 und 4489063). Bei diesen glykosylierten Insulinen wird Glukose oder Mannose über eine Zwischengruppe von Dicarbonsäuren, Säureanhydriden oder Phenylaminen oder einer Kombination davon mit Insulin gekoppelt.
Die Europäische Patentanmeldung Nr.84200328 mit der Veröffentlichungsnummer 119650 betrifft Galaktosylinsuline, die wie die von Kim (siehe oben) beschriebenen glykosylierten Insuline eine Zwischengruppe enthalten.
Es ist das Ziel der Erfindung, Insulinderivate mit verbesserten Eigenschaften herzustellen. Ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, nichtimmunogene Insulinderivate zu entwickeln. Es ist weiterhin Ziel der Erfindung, Insulinderivate zu entwickeln mit einem schnelleren Beginn der Insulinwirkung als natives Insulin sowie die Löslichkeit weniger löslicher Insuline zu verbessern, um hochkonzentrierte Lösungen einsetzen zu können, beispielsweise in Insulinpumpen. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Herstellung von Insulinderivaten mit einer verbesserten Stabilität gegen Fibrillierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft spezifisch glykosylierte Insuline. Der nachfolgend benutzte Begriff „spezifisch glykosylierte Insuline" bezeichnet Insuline, bei denen der Kohlenhydratsubstitueni sich in einer spezifischen Stellung im Insulinmolekül befindet.
Überraschenderweise zeigen derart spezifisch glykosylierte Insuline bestimmte therapeutische Vorteile, wie aus der nachfolgenden Beschreibung und den Beispielen ersichtlich.
In ihrem breitesten Aspekt betrifft die Erfindung spezifisch glykosylierte Insuline. In einem engeren Apsekt betrifft die Erfindi r· Insulinderivate, die entweder in der Position A1, B1 oder B29 monoglykosyliert; in der Position A1 und B1 oder A1 und B29 diglykosyliert; oder in Position A1, B1 und B29 triglykosyliert sind.
Die von Kim et al. beschriebenen und oben abgehandelten glykosylierten Insuline sind von den Insulinen der vorliegenden Erfindung entfernt, da die erfindungsgemäßen die Aldehydfunktion des Zuckers selbst dazu verwenden, eine kovalente Bindung zum Insulin zu bilden ohne die Notwendigkeit des Einsatzes von Zwischengruppen. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung gebenüber den Insulinen von Kim et al. ist die Beibehaltung der natürlichen Ladungsverteilung des Insulinmoleküls.
So sind die miteinbezogenen Aminogruppen, die durch die Glykosylierungsreaktion (siehe Diagramm) in sekundäre Aminogruppen umgewandelt werden, noch in der Lage, protonisiert zu werden wie bei normalem Insulin.
Die vorliegenden Insulinderivate können in jeder der drei Positionen ein Monosaccharid oder ein Oligosaccharid mit bis zu drei Zuckerresten enthalten. Geeignete Monosaccharide sind Glucose, Mannose und Galaktose. Geeignete Oligosaccharide sind Maltose, Isomaltose, Lactose, Maltotriose, Melibiose und Cellobiose.
Die spezifisch glykosylierten erfindungsgemäßen Insulinderivate können als solche für die Behandlung von Diabetes mellitus eingesetzt werden. Im Hinblick auf eine Beobachtung der Insulintherapie können auch ausgewählte Gemische der individuell spezifisch glykosylierten Verbindungen verwendet werden.
Unter dem hier verwendeten Begriff „Insuline" werden native Formen von Insulin verstanden wie Human-, Rinder- und Schweine-Insulin sowie auch Derivaie davon, worin ein oder mehrere Aminosäurereste substituiert hinzugefügt oder abgetrennt wurden, im Vergleich mit nativem Insulin, wie beispielsweise in den Europäischen Patentanmeldungen 194864-Aund214826-A beschrieben.
Wie oben genannt, weist natives Insulin drei potentielle Glykosylierungsstellen auf, nämlich die beiden N-terminalen Aminosäurereste in der A- und B-Kette und den Lysinrest in der Position B29. Es ist offensichtlich, daß die Anzahl der potentiellen Glykosylierungsstellen in Insulinanaloga des oben beschriebenen Typs zwischen zwei (der beiden N-terminalen Reste) und darüber, je nach Anzahl der vorhandenen Lysinreste im modifizierten Insulinmolekül, liegen kann, wobei Lysin die einzige natürlich auftretende Aminosäure mit einer freien primären Aminogruppe in der Seitenkette ist.
Die Glykosylierung läuft schematisch in folgender Weise ab, wobei D-Glukose eingesetzt wird.
IHUuko·· PyrAnoet-Struktur
Die Kettenstruktur ist die reaktive Komponente.
CH2OH CII2OH
fc0H Η° J< 0
o + H2N-"xnsulin"
N0 NH-"insulin" OH
HO
CH2-NH-"insulin"
-Desoxy-D-fructosylinsulin (Glukoseinsulin).
„Insulin" bezeichnet Desamino-Insulin.
Die obige Reaktion erfolgt in analoger Weise mit anderen Monosacchariden oder Oligosacchariden mit einer freien Aldehydgruppe.
Spezielle Beispiele der vorliegenden glykosylierten Insuline sind:
Phe(B D-Glukosehumaninsulin, Phe(B 1 )-Mannosehumaninsulin, GIy(A 1 )-Mannosehumaninsulin, Lys(B29)-Mannosehumaninsulin, Phe(B 1 )-Galactosehumaninsulin, GIy(A 1 )-Galactosehumaninsulin, Lys(B29)-Galactosehumaninsulin, Phe(B 1 )-Maltosehumaninsulin, Phe(B 1 )-Lactosehumaninsulin, GIy(A D-Glucosehumaninsulin, GIy(A 1 (-Maltosehumaninsulin, GIy(A 1)-Lac1osehumaninsulin, Lys(B29)-Glucosehumaninsulin, Lys(B 29)-Maltosehumaninsulin, Lys(B29)-Lactosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1 )-Diglucosehumaninsulin, Phe(B 1 Hsomaltosehumaninsulin, GIy(A 1 (-Isomaltosehumaninsulin, Lys(B29)-lsomaltosehumaninsulin, Phe(B 1 )-Maltotriosehumaninsulin, GIy(A 1 )-Maltotriosehumaninsulin, Lys(B29)-Maltotriosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1 )-Dimaltosehumaninsulin, GIy(AD, Lys(B29)-Dimaltosehumaninsulin, Phe(BD, Lys(B29)-Dimaltosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1 (Dilactosehumaninsulin, GIy(AD, Lys(B29)-Dilactosehumaninsuiin, PHe(B 1), Lys(29)-Dilactosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1 )-Dimaltotriosehumaninsulin, GIy(AD, Lys(B29)-Dimaltotriosehumaninsulin, Phe(B 1), Lys(B 29)-Dimaltotriosehumaninsulin, Phe(BD, Gly(AD-Dimannosehumaninsulin, PHe(BD, Lys(B29)-Dimannosehumaninsulin, GIy(AD, Lys(B29)-Dimannosehumaninsulin, PHe(B 1), GIy(A 1 (-Digalactosehumaninsulin, Phe(BD,Lys(B29)-Digalactosehumaninsulin,
GIy(AD, Lys(B29)-Digalactosehumaninsulin, Phe(B 1), GIy(A 1 )-Düsomaltosehumaninsulin, PHe(B 1), Lys(B29)-Diisomaltosehumaninsulin, GIy(AD, Lys(B29)-Diisomaltosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1), Lys(B29)-Triglucosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1), Lys(B29)-Trimaltosehumaninsulin, GIy(AD, Phe(B 1), Lys(B29)-Trilactosehumaninsulin, GIy(AD, Phe(B 1), Lys(B29)-Trimaltotriosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1), Lys(B29)-Trimannosehumaninsulin, GIy(A 1), Phe(B 1), Lys(B29)-Trigalactosehumaninsulin, GIy(AD, Phe(BD, Lys(B29)-Triisomaltosehumaninsulin, Phe(B 1), Glucose [Asp810] Humaninsulin GIy(A 1), Phe(B 1 )-Diglucose [AspB 10J Humaninsulin.
Auch spezifisch glykosylierte Insuline anderer Spezies, wie beispielsweise Schweine, sind von Interesse.
Die vorliegend glykosylierten Insuline können hergestellt werden durch Umsetzen von Insulin oder eines Insulinanalogen mit
einem Überschuß an ausgewähltem Monosaccharid oder Oligosaccharid in einem geeigneten organischen oder wäßrigen Medium. Die Temperatur kann zwischen 20 und 600C liegen. Als organische Lösungsmittel können niedere Carbonsäuren, beispielsweise Essigsäure und Propionsäure, niedere aliphatische Alkohole, beispielsweise Methanol, Ethanol und 2-Propanol, Ethylenglykol und Propylenglykol eingesetzt werden. Es können allerdings auch Phenole verwendet werden.
Die Reaktionsdauer und die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches hängt davon ab, ob ein mono-, di-oder triglykosyliertes Endprodukt gewünscht wird. Die Reaktion kann üblicherweise mit einer Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (hier als RP HPLC bezeichnet) verfolgt werden, um den Punkt der maximalen Bildung jedes einzelnen glykosylierten Produktes zu bestimmen.
Die Reaktion wird durch Abkühlung, beispielsweise auf — 20°C, unterbrochen und das Reaktionsgemisch bis zur Trockne eingeengt, wonach die Hauptkomponenten des Reaktionsgemisches isoliert und durch präparative RP HPLC gereinigt werden.
Nach dem Entsalzen werden die Produkte durch Schnell-Atombeschuß-Massenspektrometrie (hier als FAB-MS bezeichnet), quantitative Aminosäureanalyse nach Borhydridreduktion und Bioassays charakterisiert.
Die vorliegenden glykosylierten Insuline und deren Gemische können substituiert werden für das Human- oder Schweineinsulin in Insulinpräparationen, wie das bei der Herstellung neuer Insulinpräparationen aus dem Stand der Technik bekannt ist. Derartige neue Insulinpräparationen enthalten das glykosylierte Insulin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in wäßriger Lösung, vorzugsweise bei einem neutralen pH-Wert. Das wäßrige Medium wird vorzugsweise isotonisch gemacht, beispielsweise mit Natriumchlorid, Natriumacetat oder Glycerol.
Darüber hinaus kann das wäßrige Medium Zink-Ionen, Pufferkomponenten wie Acetat oder Phosphat und ein Schutzmittel wie m-Kresot, Methylparaben oder Phenol enthalten. Der pH-Wert der Präparation kann auf den gewünschten Wert eingestellt werden und die Präparation kann durch Filtration sterilisiert werden.
Die Insulin-Zubereitung der vorliegenden Erfindung kann in ähnlicher Weise verwendet werden wie das für die bekannten Insulin-Zubereitungen üblich ist.
Ausführungsbeispiel
Phe(B 1 )-Glucosehumaninsulin
Humaninsulin (0,1 mMol) wurde in Methanol (30ml) suspendiert und Eisessigsäure (5ml) wurde bei Umgebungstemperatur hinzugesetzt. Das Gemisch wurde mäßig gerührt bis zur Auflösung des Insulins. Danach wurde eine weitere Menge Methanol (35 ml) hinzugesetzt, und nach dem Zusatz von D-Glukose (2,2 mMol) wurde das Gemisch mäßig bei 40°C, über 8 Stunden gerührt, währenddessen die Titelverbindung sich als Hauptkomponente bildete.
Die Lösung wurde in einen Rotationsverdampfer nahezu bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand in Wasser gelöst und durch
präparative RP HPLC fraktioniert. Säule: 16mm χ 250 mm mit 7 Mikrometer 100ÄC18-Teilchen; Temperatur 30°C; mobile Phase; A: 0.04M Phosphorsäure, 0,2 M Natriumsulfat, 10% Acetonitril, pH-Wert auf 2,5 mit Ethanolamin eingestellt; B: 50% Acetonitril.
Die dem zentralen Teil des Hauptpeaks entsprechende Fraktion wurde entsalzen und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 0,02 mMol. Das Produkt wurde durch FAB-MS charakterisiert sowie durch quantitative Aminosäureanalyse nach Borhydridreduktion. Die Aminosäureanalyse zeigte das Vorhandensein von zwei Phenylalaninresten (d.h. ein Phenylalaninrest weniger im Vergleich mit Humaninsulin) nachweislich als Substitution in Phe(B 1). Das Molekulargewicht wurde mit 5970 ermittelt (berechnet: 5970).
PHe(B 1), GIy(A 1 )-Diglukosehumaninsulin
Die obige Verbindung wurde wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Reaktionszeit 16 Stunden anstatt 8 Stunden betrug. Dabei erhielt man die Titelverbindung als Hauptkomponente. Die Ausbeute betrug 0,06 mMol. Die Aminosäureanalyse zeigte das Vorhandensein von einem Phe-Rest weniger und einem Gly-Rest weniger, wobei eine Substitution in Position A1 und B1 nachgewiesen wurde.
Die subkutane Absorption wurde bei Schweinen gemessen durch Injektion von '"!-markiertem Phe(B 1), GIy(AI )-Diglukoseinsulin, hergestellt nach der lodatmethode, die im wesentlichen von Jorgensen et al. (Diabetologia 19,1980,546-554) beschrieben wurde. Die Absorptionsrate nach subkutaner Injektion bei Schweinen von 125l-Humaninsulin und l26l-Phe(B1), GIy(A 1)-Diglukosehumaninsulin ist in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Die T75-, T50- und T25-Werte in Tabelle 1 sind die verstrichene Zeit (in Stunden) vom Moment der Injektion der Probe bis die an der Injektionsstelle gemessene Radioaktivität 75%, 50% und 25% des ursprünglichen Wertes erreicht hatte. Aus Tabelle 1 ist entnehmbar, daß das glykosylierte Insulin eine signifikant schnellere Absorption als Humaninsulin hat.
Tts T50 T2S
Humaninsulin 1,12 2,33 3,69
Diglukosehumaninsulin 0,65 1,47 2,76
Die Blutglukose-erniedrigende Wirkung von Humaninsulin (Actrapidw2) und GIy(AI ),Phe(B 1)-Diglukosehumaninsulin durch subkutane Injektion bei Schweinen (Mittelwert von 5 Tieren) in einer Menge von 0,1 Einheiten/kg ist aus der folgenden Tabelle
ersichtlich. Tabelle 2 zeigt die Werte für Glukose in mMol/l
Tabelle 2 | Humaninsulin | Diglukose- |
Zeit | Humaninsulin | |
Stunden | 5,30 | 5,24 |
-0,33 | 5,36 | 5,32 |
0 | 4,78 | 4,76 |
0,33 | 4,72 | 4,06 |
0,67 | 4,12 | 3,34 |
3,60 | 2,98 | |
1,5 | 3,24 | 2,84 |
2 | 3,28 | 2,96 |
2,5 | 3,18 | 3,14 |
3 | 3,34 | 3,96 |
4 | ||
Tabelle 2 zeigt die schnelle Wirkung von Diglukoseinsulin verglichen mit Humaninsulin.
Die Immunreaktion in Kaninchen (Mittelwertefür 10 Tiere) von Humaninsulin, Rinderinsulin und GIy(AI), Phe(BD-Diglukosehumaninsulin ist aus der folgenden Tabelle 3 zu entnehmen, die die Werte für die prozentuale Bindung an Kaninchenserum zeigt (Methode: Schlichtkrull et al., Horm. Metab. Res. Suppl. ser. 5,1975,134-143).
Tabelle 3 | Human- | Rinder | Jiglukosehuman- |
Zeit | insulin | insulin i | nsulin |
Tage | 1,9 | -0,4 | 1,2 |
0 | 2,3 | 0,6 | 1,3 |
13 | 3,0 | 28,5 | ,5 |
27 | 3,2 | 29,7 | 1,4 |
41 | 4,3 | 30,7 | ,1 |
55 | 3,9 | 32,7 | 2,2 |
69 | 2,4 | 30,1 | Μ |
83 | 2,0 | 32,6 | 1,5 |
97 | |||
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß Diglukosehumaninsulin eine überraschend niedrige Immunreaktion aufweist, die mit der von Humaninsulin übereinstimmt.
Die folgenden Verbindungen wurden analog hergestellt. Das Molekulargewicht, gemessen durch FAB-MS oder Plasmadesorptions-Massenspektroskopie, ist zusammen mit dem berechneten Molekulargewicht für jede der Verbindungen angegeben.
Verbindung Molekulargewicht
gemessen berechnet
Phe(B 1 )-Galactosehumaninsulin Phe(B 1 )-Maltosehumaninsulin Phe(B 1 )-Lactosehumaninsulin Phe(B1)-Maltotriosehumaninsulin GIy(AI ),Phe(B1)-Dimaltosehumaninsulin GIy(AI ),Phe(B1)-Dilactosehumaninsulin GIy(A 1 ),Phe(B 1 )-Dimaltoriosehumaninsulin GIy(A 1),Phe(B1),Lys(B29)-Triglucosehumaninsulin GIy(A 1 ),Phe(B 1 )-Diglucose[Asp" 10]-humaninsulin
Der Bindungsort der Zuckerreste wurde durch Borhydridreduktion gefolgt von quantitativer Aminosäureanalyse bestätigt.
5956 | 5970 |
6119 | 6132 |
6125 | 6132 |
6288 | 6294 |
6444 | 6456 |
6446 | 6456 |
6771 | 6780 |
6294 | 6294 |
6112 | 6110 |
Claims (15)
1. Spezifisch glykosylierte Insuline, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere Monosaccharidgruppen oder eine oder mehrere Oligosaccharidgruppen mit bis zu drei Zuckereinheiten enthalten.
2. Glykosyliertes Insulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Monosaccharidgruppe oder eine Oligosaccharidgruppe mit bis zu drei Zuckereinheiten enthält.
3. Glykosyliertes Insulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zwei Monosaccharidgruppen oder zwei Oligosaccharidgruppen mit bis zu drei Zuckereinheiten enthält.
4. Glykosyliertes Insulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß drei Monosaccharidgruppen oder drei Oligosaccharidgruppen mit bis zu drei Zuckereinheiten enthält.
5. Glykosyliertes Insulin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Position A1, B1 oder B29 monoglykosyliert ist.
6. Glykosyliertes Insulin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Position A1 und B1; A1 und B29; oder BI und B29diglykosyliertist.
7. Glykosyliertes Insulin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es in Position A1, B1 und B29triglykosyliertist.
8. Glykosyliertes Insulin nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in Position B10 Asp aufweist.
9. Glykosyliertes Insulin nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es von Human-Ausgangsinsulin herrührt.
10. Phe(B1)-Glukosehumaninsulin.
11. Phe(B1), GIy(A 1)-Diglykosehumaninsulin.
12. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, insbesondere 99% eines spezifisch glykosylierten Insulins nach einem der vorangegangenen Ansprüche enthält.
13. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein spezifisch glykosyliertes Insulin nach einem der vorangegangenen Ansprüche oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Begleitstoffen und Additiven und Schutzmitteln enthalten.
14. Verfahren zur Herstellung von spezifisch glykosylierten Insulinen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende Insulin in einem wäßrigen oder organischen Medium mit einem Monosaccharid mit einerfreien Aldehydgruppe oder einem Oligosaccharid mit einer freien Aldehydgruppe und mit bis zu drei Zuckereinheiten umgesetzt wird, wonach das gewünschte Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird.
15. Ein beliebiges neues Merkmal oder eine Merkmalskombination, die hier beschrieben wurde.
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