HUT59942A - Process for producing glycozylized inzulines - Google Patents
Process for producing glycozylized inzulines Download PDFInfo
- Publication number
- HUT59942A HUT59942A HU8727A HU278790A HUT59942A HU T59942 A HUT59942 A HU T59942A HU 8727 A HU8727 A HU 8727A HU 278790 A HU278790 A HU 278790A HU T59942 A HUT59942 A HU T59942A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- insulin
- glycosylated
- preparation
- human
- starting materials
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás specifikusan glikozilezet inzulinok előállítására és kombinációik előállítására, továbbá eljárás gyógyszerészeti formált alak előállítására, amely a fenti glikozilezett vegyületeket tartalmazza.
Az utóbbi években számos inzulin analógot javasoltak arra a célra, hogy diabetes mellitüs kezelésben alkalmazzák őket. Az ilyen inzulin analógok kidolgozásának célja az volt, hogy javítsák az inzulin helyettesítési terápiát úgy, hogy rendelkezésre álló inzulin analógokat készítsenek, amelyek vagy gyorsabb vagy hosszabb ideig tartó inzulin hatást fejtenek ki az emberi inzulinnal összehasonlítva.
Az inzulin analógok kidolgozása során jelentkező probléma, amely analóg kidolgozásban a természetes inzulin egy vagy több aminosav csoportját helyettesítik, a potenciális immunizáló hatása ezeknek a vegyületeknek. Továbbá előre nem látott oldhatósági és stabilitási problémák is jelentkezhetnek /
az ilyen helyettesítések következményeként.
Habár a vérben keringve az inzulin fél élettartama igen rövid, nem kizárható, hogy kis mennyiségű inzulin glikozileződik in vivő is nemcsak a diabetikus betegekben, mint ahogy ezt Nakayama és munkatársai kimutatták. (Nonenzymatic glycosylation of insulin in Current topics in clinical and experimental espects of diabetes mellitüs (1985), 201-204, Sakamoto, Min and Baba, Eds., Elsevier Science Publishers B.V.) hanem nem diabetikus egyénekben is. Ennélfogva lehetséges, hogy a szervezet kidolgozott egy mechanizmust, amely lecsökkenti a glikozilezett inzulin ellenes antitestek képződését. Továbbá • · • ·· ’ * * ?. .
• ·· * *··!·. ·····«« ··· «... · · · * · ··
- 3 lehetséges az is, hogy a szaccharid részben végbemenő konformáció változás a vegyületet képes álcázni az antigénnel szemben.
A korábbi kísérletek során az inzulinhoz glükózt, mannózt és bizonyos oligo-szaccharidokat kapcsoltak különféle in vitro tanulmányok során, abból a célból, hogy megvizsgálják, hogy vajon a glikozilezett inzulin in vivő képződése felelős lehet-e a diabetikus betegekben később jelentkező komplikációkért. Anzenbacher és munkatársai (Biochimica et Biophysica Acta 386 (1975),603-607) tanulmányozták 0-glükóz kötését inzulinhoz egyensúlyi diazilis segítségével. Azt találták, hogy a kötődés nem specifikus és az inzulinhoz kötött glükóz molekulák átlagos száma 8 volt.
Az inzulin kölcsönhatását glükózzal és mannózzal vizsgálta Dolhofer és munkatársai (Febs Letters 100 (1977) 133-136). A vizsgálatok eredményei azt mutatták, hog^ in vitro 37° C hőmérsékleten végzet inkubálás után mindkét hexóz kovalensen kapcsolódik az inzulin molekulához. A választott reakciókörülmények között átlagosan 3,6 + 0,39 glükóz és 5,0 + 0,43 mannóz csoport kapcsolódik az inzulin molekulához.
Brownlee & Cerami (Science 206 (1979), 1190-1190 és Diabetes 32 (1983), 499-505 közleményeikben) egy glükóz szabályozott inzulin szolgáltató rendszert javasoltak, amelyben glikozilezett inzulin származékok szintetizálódnak, amelyek képesek kompetitiv módon viselkedni a glükóz számára a lectin kötéssel szemben. Ebben a vizsgálatban maltózt és más oligoszaocharidokat reagáltattak inzulinnal.
Nakayama és munkatársai (a fenti közlemény) megvizs gálták az inzulin nem enzimatikus glikozilezését in vitro és in vivő (diabetikus betegekben) és azt találták, hogy in vivő pathológiás körülmények között a glüküz az inzulin molekulába épül. Az in vitro kísérletek során azt találták, hogy az inzulin molekulába molekulánként három molekula épült be.
1988-ban Lapolla és munkatársai (Diabetes 37 (1988), 787-791) leírták, hogy az in vitro glikozilezett inzulin csökkentett in vivő biológiai aktivitású. Az inzulint szobahőmérsékleten glikozilezték nagy glükóz koncentráció mellett Dolhofer (lásd fenti szakirodalom) módszerével vizes oldatban 37° C hőmérsékleten 17 órán át pH 7,4 érték mellett. A beépült glükóz mennyisége átlagosan 2 mól glükóz/mól inzulin.
Figyelembe véve, hogy a természetes inzulin három szabad elsőrendű aminocsoportot tartalmaz, a B1 (Phe), az A1 (Gly) és a B29 (Lys) helyzetekben, nyilvánvaló, hogy az inzulin fent leírt glikozilezése inhomogén keverék glikozilezett inzulin molekulákat eredményez.
A szakirodalomban eddig nem történt kísérlet arra, hogy a fenti keveréket egyes komponensekre szétválasszák.
Glikozilezett inzulin származékokat írtak le önszabályozó inzulin szolgáltató rendszerekben Kim és munkatársai (Journal of Controlled Release 1^ (1984), 57-66, és 4,483,792 számú, 4,478,830 számú, 4,478,746 számú és 4,489,063 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmak). Ezekben a glikozilezett inzulinokban glükóz vagy mannóz molekula kapcsolt az inzulinhoz távtartó csoportokon keresztül, amelyek dikarbonsavakból, savanhidridekből vagy fenil-aminokból vagy ezek kombinációjából származtathatók le.
A 84000328 számú 119, 650 publikációs számú európai szabadalmi bejelentésben galaktozilBinzulinokat írtak le, amelyek esetében, mint a glikozilezett inzulinok Kim által leírt példáiban (lásd a fenti irodalmat) távtartó csoportot tartalmaztak.
A találmány tárgya eljárás inzulin származékok előállítására, amelyek javított jellemzőjűek. Részletesebben a találmány szerinti eljárás célja az, hogy nem immunizáló tulajdonságú inzulin származékokat állítsunk elő. A találmány tárgya tovább eljárás olyan inzulin származékok előállítására, amelyek gyorsabban kifejtik az inzulin hatást, mint a természetes inzulin, valamint javítják az oldhatóságát a kevésbbé oldható inzulinoknak, és így lehetővé teszik nagy koncentrációjú oldatok alkalmazását például inzulin szivattyúkban. A találmány célja továbbá olyan inzulin származékok előállítása, amelyek fibrillációval szemben nagyobb stabilitásúak.
A találmány tárgya eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására. A továbbiakban a specifikusan glikozilezett inzulinok alatt olyan inzulinokat értünk, amelyek az inzulin molekulában speciális helyzetben tartalmaznak szénhidrát szubsztituenst. Meglepő módon az ilyen specifikusan glikozilezett inzulinok bizonyos terápiás előnyökkel rendelkeznek, amint ez az alábbi leírásból és példákból kitűnik.
A legszélesebb értelmezésben a találmány tárgya eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására. Szűkebb értelemben a találmány tárgya eljárás olyan inzulin szár-
mazékok előállítására, amelyek vagy az Al, B1 vagy B29 helyzetben monoglikozilezettek vagy az Al és Bl, az Al és B29 vagy a B1 és B29 helyzetben diglikozilezettek vagy Az Al, Bl és B29 helyzetekben triglikozilezettek.
A Kim és munkatársai által leírt glikozilezett inzulinok, amelyeket ők megvizsgáltak és amelyeket a fentiekben idéztünk, távoliak a jelen találmány szerinti inzulinoktól, amelyek a cukor aldehid funkcióját alkalmazzák arra a célra, hogy az inzulinnal kötést hozzanak létre anélkül, hogy mesterséges távtartó csoportokat alkalmaznának. A jelen találmány további előnye a Kim és munkatársai által nyert inzulinokkal szemben az, hogy az inzulin molekula természetes töltéseloszlását megőrzi. így a glikozilezésben résztvevő aminocsoprtok (lásd a diagrammot) másodrendű aminocsoportokká alakulnak, amelyek továbbra is képesek protonálódásra, mint ahogy korábban ez a normális inzulinban történt.
A jelen találmány szerinti inzulin származékok mindhárom helyzetben monoszaccharid vagy oligoszaccharid csoportot tartalmaznak, amely oligoszaccharid három cukoregységből állhat maximálisan. Alkalmas monoszaccharidok a glükóz, a mannóz és a galaktóz. Alkalmas oligoszaccharidok a maltóz, az izomaltóz, a laktóz, a maltotrióz, a melibióz és a cellobióz.
A találmány szerinti specifikusan glikozilezett inzulin származékok alkalmasak ilyen állapotban a diabetes mellitus kezelésére. Az inzulin terápia megfigyelése céljából választott adott specifikusan glikozilezett vegyületkeverékeket is alkalmazhatunk.
A leírásban az inzulin elnevezés alatt természetes inzulin formákat értünk, mint például emberi, marha és sertés inzulin, de beleértjük ebbe ezek származékait is, amelyek esetében egy vagy több aminosavat helyettesítünk, hozzáadunk vagy elhagyunk a molekulához a természetes inzulinban, például beleértjük azokat az anyagokat, amelyeket a 0194864A számú és a 0214826A számú európai szabadalmi bejelentésekben leírtak.
Mint korábban leírtuk, a természetes inzulinok három lehetséges.glikozilezési helyzettel rendelkeznek. Ezek a két N-terminális aminosavmaradék, az A- és B-láncokban, valamint a lizin a B29 helyzetben. Természetesen nyilvánvaló, hogy a potenciális glikozilezési helyzetek száma a fent leírt típusú inzulin analógokban kettőtől indulhat (a két N-terminális maradék) és ezután attól függ, hogy hány lizin maradék van jelen a módosított inzulin molekulában, mivel a lizin az egyedüli természetes aminosav, amely az oldalláncban szabad elsőrendű aminocsoporttal rendelkezik. A glikozilezési reakció sémáját az 1. illetve 2. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábrán a D-glükóz szerkezetét ábrázoljuk. A 2. ábrán a reaktív komponens lánc szerkezetét mutatjuk be. Az ábrán az insulin dezamino-insulint jelent.
A fenti reakció analóg módon történik meg más monoszaccharidok vagy oligoszaccharidok esetében, amelyek szabad aldehidcsoporttal rendelkeznek. A jelen találmány szerinti eljárással előállított glikozilezett inzulinok speciális példái az alábbiak:
Phe(Bl)-glükóz-humán-inzulin,
Phe(Bl)-mannóz humán-inzulin,
Gly(Al)-mannóz-humán-inzulin,
Lys(B29)-mannóz-humán-inzulin,
Phe(Bl)-galaktóz-humán-inzulin,
Gly(Al)-galaktóz-humán-inzulin,
Lys(B29)-galaktóz-humán-inzulin,
Phe(Bl)-laktóz-humán-inzulin,
Gly(Al)-glükóz-humán-inzulin,
Gly(Al)-maltóz-humán-inzulin,
Gly(Al)-laktóz-humán-inzulin,
Lys(B29)-glükóz-humán-inzulin,
Lys(B29)-maltóz-humán-inzulin,
Lsy(B29)-laktóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Phe(Bl)-diglükóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Lys(B29)-diglükóz-humán-inzulin,
PHe(Bl),Lys(B29)-diglükóz-humán-inzulin,
Phe(Bl)-izomaltóz-humán-inzulin,
Gly(Al)-izomallóz-humán-inzulin,
Lys(B29)-izomaltóz-humán-inzulin,
Phe(Bl)-maltotrióz-humán-inzulin,
Gly(Al)-maltotrióz-humán-inzulin,
Lys(B29)-maltoirioz-humán-inzulin, Gly(Al),Phe(Bl)-dimaltoz-humán-inzulin,
Gly(Al),Lys(B29)-dimaltóz-humán-inzulin,
Phe(Bl),Lys(B29)-dimaltóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Phe(Bl)-dilaktóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Lys(B29)-dilaktóz-humán-inzulin, • · ♦ • « . · · · · · ·
....... ·*· • ····· · ·*·.,*
- 9 Phe(Bl),Lys(B29)-dilaktóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Phe(Bl)-dimaltotrióz-humán-inzulin,
Gly(Al);Lys(B29)-dimaltotrióz-humán-inzulin,
Phe(Bl),Lys(B29)-dimaltotrióz-humán-inzulin, Phe(Bl),Gly(Al)-dimannóz-humán-inzulin,
Phe(Bl),Lys(B29)-dimannóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Lys(B29)-dimannóz-humán-inzulin, PHe(Bl),Gly(Al)-digalaktóz-humán-inzulin,
Phe(Bl),Lys(B29)-digalaktóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Lys(B29)-digalaktóz-humán-inzulin,
Phe(Bl),Gly(Al)-diizomaltóz-humán-inzulin, Phe(Bl),Lys(B29)-diizornaltóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Lys(B29)-diizomaltóz-humán-inzulin,
Gly(Al), Phe(B1),Lys(B29)-triglükóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Phe(B1),Lys(B29)-trimaltóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Phe(Bl),Lys(B29)-trilaktóz-humán-inzulin,
Gly(Al), PHe(Bl) ,Lys(B29)-trimaltotrióz-humán-inzulin,
Gly(Al),PHe(Bl),Lys(B29)-trirnannóz-humán-inzulin, Gly(Al),Phe(Bl),Lys(B29)-trigalaktóz-humán-inzulin,
Gly(Al),Phe(Bl),Lys(B29)-triizomaltóz-humán-inzulin,
R 1 Π
Phe(Bl)-glükóz-(Asp )-humán-inzulin,
G ly ( A1), Phe (Bl)-diglükóz—-(Asp^X - humán- inzulin.
Ugyancsak érdekesek más fajtákból, mint például disznóból származó specifikusan glikozilezett inzulinok.
A jelen találmány szerinti glikozilezett inzulinokat úgy állíthatjuk elő, hogy az inzulint vagy inzulin analógot felesleg választott monoszacchariddal vagy oligoszacchariddal • ·
- 10 reagálta!juk alkalmas szerves vagy vizes közegben. A hőmérséklet 20-60° C között változik. Szerves oldószerként kis szénatomszámú karbonsavakat például ecetsavat és propionsavat, kis szénatomszámú alifás alkoholokat például metanolt, etanolt és 2-propanolt, etilén-glikolt és propilén-glikolt alkalmazhatunk. Azonban fenolok is alkalmazhatók.
A reakció időtartama és a reakciókeverék összetétele függ attól, hogy mono-, di- vagy tri-glikozilezett végterméket kívánunk előállítani. A reakciót megfelelően követhetjük reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével (a továbbiakban RP HPLC) és így meghatározhatjuk azt a helyzetet, ahol az adott glikozilezett termékek legnagyobb koncentrációban keletkeztek.
A reakciót a reakcióelegy lehűtésével, például -20° C hőmérsékletre történő lehűtésével állítjuk le, majd a reakcióelegyet szárazra koncétráljuk és ezt követően a reakcióelegy fő komponenseit izoláljuk és preparatív RP HPLC segítségével tisztítjuk; A sómentesítés után a termékeket gyors atom bombázásos, tömegspektroszkópia (továbbiakban FAB-MS) segítségével jellemezhetjük, valamint kvantitatív aminosav analízissel jellemezhetjük, amelyet bórhidriddel végzett redukciója után végzünk, továbbá biológiai tesztvizsgálatokkal jellemezhetjük.
A jelen találmány szerinti glikozilezett inzulinokkal és ezek keverékeivel helyettesíthetjük az emberi és disznó inzulint az inzulin preparátumokban, amelyek eddig ismert szakirodalmi preparátumok, és így új inzulin preparátumokat állíthatunk elő. Az ilyen új inzulin preparátumok a glikozilezett • · • · · · · · · • * · * «*«··· • ··*·· · · · * ···· · ·· ·· ··
-11.inzulint vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazzák vizes oldatban előnyösen semleges pH érték mellett. Előnyösen a vizes közeget izotóniássá alakítjuk, például nátriumklorid, nátriumacetát vagy glicerol segítségével. Továbbá a vizes közeg tartalmazhat cink ionokat, puffer komponenseket, mint például acetát- vagy foszfát komponenseket és tartósítóanyagokat, mint például m-krezol, metil-parabén vagy fenol. A készítmény pH értékét a kívánt értékre állíthatjuk be és a készítményt szűrés segítségével sterilizálhatjuk.
A találmány szerinti eljárást az inzulin formált alak előállítására a szokásos inzulin formált alak előállítások szerint végezhetjük. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.
1. példa
Phe(B1)-glükóz-humán-inzulin
0,1 mmol emberi inzulint szuszpendálunk 30 ml metanolban és szobahőmérsékleten 5 ml jégecetet adunk az elegyhez. Az elegyet enyhén keverjük amíg az inzulin feloldódik, majd további 35 ml metanolt adunk hozzá. Ezt követően 2,2 mmol D-glükózt adunk az elegyhez, majd az elegyet enyhén keverjük 40° C hőmérsékleten 8 órán át, amikor a címbeli vegyület válik a főkomponenssé .
Az oldatot csaknem szárazra pároljuk rotációs bepárlón. A maradékot vízben oldjuk, majd RP HPLC preparatív kromatográfia segítségével frakciónáljuk. Oszlop: 16x250 mm, 7 yum 100 A C|8 részecskék. Hőmérséklet 30° C. Mozgó fázis; A: 0,04m foszforsav, 0,2m nátriumszulfát, 10 % acetonitril, pH érték • · * · · · · ♦ · * V · · ·«···· • ···· · · » · · ···· · ·· ·« ··
- 12 etanolaminnal 2,5 értékre beállított. B: 50 % acetonitril.
A fő csúcs központi részének megfelelő franciókat sómentesítjük és liofilizáljuk. A termelés 0,2 mmol. A terméket FAB-MS spektroszkópia és bórhidriddel végzett redukció után kvantitatív aminosav analízis segítségével azonosítjuk. Az aminosav analízis két fenil-alanin maradék jelenlétét mutatja (azaz eggyel kevesebb fenil-alanin maradék, mint az emberi inzulinban), amely azt mutatja, hogy szubsztitúció történt a Phe(Bl) helyzetben. A molekulatömeg mért: 5970 (számított: 5970).
2. példa
Phe(Bl),Gly(Al)-diglükóz-humán-inzulin
A címbeli vegyületet az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelően állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy 8 óra helyett 16 óra reakcióidőt alkalmazunk, amely időpontban a címbeli vegyület válik a fő termékké.
A termelés 0,06 mmol.
Az aminosav analízis eggyel kevesebb Phe és eggyel kevesebb Gly maradék jelenlétét mutatja, amely azt jelzi, hogy szubsztitúció történt az A1 és B1 helyzetekben.
A molekulatömeg, mért: 6132 (számított: 6132).
A szubkután abszorpciót disznókban mértük 1251-jelzett Phe(Bl),Gly(Al)-diglükóz-inzulin alkalmazásával injekcióban, amelyet jódat eljárással állítunk elő lényegében a szakirodalomban leírt eljárásnak megfelelően (Jörgensen és munkatársai, Diabetológia 19 (1980), 546-554). A disznóba történő • · szubkután injekció utáni abszorpció sebessége a 1251-humán-inzulinnak és a 125l-Phe(Bl), Gly(Al)-diglükóz-humán-inzulinnak az alábbi 1. Táblázatban bemutatott. A táblázatban mutatott T^q és T?5 értékek órában azok az időtartamok, amelyek a minta injekciójától telt el addig, aming az injekció helyén mért rádióaktivás az eredi érték 75 %-ára, 50 Vára, illetve 25 %-ára csökkent. Az 1. Táblázatból kitűnik, hogy a glikozilezett-inzulin jelentősen gyorsabb abszorpciót mutat mint a humán inzulin.
1. Táblázat
| T75 | T50 | T25 | |
| humán inzulin | 1.12 | 2.33 | 3.69 |
| diglükóz-humán-inzulin | 0.65 | 1.47 | 2.76 |
A vér glükóz tartalom csökkentésében kifejtett hatását mértük a humán-inzulinnak (Actrapid™) és a Gly(Al), Phe(Bl)-diglükóz-humán inzulinnak disznókban szubkután injekció segítségével (átlagban 5 állatott alkalmazva), amelynek során 0,1 U/kg dózist alkalmaztunk, és ennek eredményét a
2. Táblázatban mutatjuk be. A 2. Táblázatban a glükóz koncentrációt mmol/1 értékben adjuk meg.
« · « * · » · « » · * ·** ··· « ····· · · · ···· ♦ ·· *· *·
- 14 2. Táblázat diglükóz-humánidő, humán-
| óra | inzulin | inzulin |
| -0,33 | 5,30 | 5,24 |
| 0 | 5,36 | 5,32 |
| 0,33 | 4,78 | 4,76 |
| 0,67 | 4,72 | 4,06 |
| 1 | 4,12 | 3,34 |
| 1,5 | 3,60 | 2,98 |
| 2 | 3,24 | 2,84 |
| 2,5 | 3,28 | 2,96 |
| 3, | 3,18 | 3,14 |
| 4 | 3,34 | 3,96 |
A 2. Táblázat mutatja, hogy a diglükóz-inzulin gyorsabb hatást fejt ki az emberi inzulinnal összehasonlítva.
Nyulakban (10 állaton mérték értékek átlaga) immun választ vizsgáltunk humán inzulin, marha inzulin és 'Gly(Al),
Phe(B1)-diglükóz-humán-inzulin esetében. Az eredményeket az alábbi 3. Táblázatban adjuk meg. Megadjuk a nyúl szérumhoz való kötődés százalékát (eljárás: Schlichtkrull és munkatársai, Horm. Metab. Rés. Suppl. ser. 5_ (1974), 134-143).
·· · l> « 4>* • ♦ * * % · ♦ » • ·««· ♦ · • · 4 · 4 « «
| 3. Táblázat | harha | diglükóz-humán- | |
| idő , | humán | ||
| nap | inzulin | inzulin | -inzulin |
| 0 | 1,9 | -0,4 | 1,2 |
| 13 | 2,3 | 0,6 | 1,3 |
| 27 | 3,0 | 28,5 | 1,5 |
| 41 | 3,2 | 29,7 | 1,4 |
| 55 | 4,3 | 30,7 | 1,1 |
| 69 | 3,9 | 32,7 | 2,2 |
| 83 | 2,4 | 30,1 | 1,1 |
| 97 | 2,0 | 32,6 | 1,5 |
| A 3. Táblázatból | kitűnik, hogy | a diglükóz-humán- | |
| -inzulin | meglepően alacsony | immunválaszt | ad a humán-inzulinnal |
összehasonlítva .
3. példa
Az alábbi vegyületeket analóg eljárással állítjuk elő. A molekulatömegeket FAB-MS spektroszkópia segítségével vagy plazma desszorpiós tömegspektroszkópia segítségével mérjük és a számított molekulatömeget is megadjuk.
n · »««· »* ·· • « φ · φ · « ί » · «1 »·Φ ··· • ···* ♦ · * · · • ·· · · · φ »* » *
| vegyület | molekulatömeg | |
| mért | számított | |
| Phe(Bl)-galaktóz-hümán-inzulin | 5956 | 5970 |
| Phe(Bl)-maltóz-humán-inzulin | 6119 | 6132 |
| Phe(Bl)-laktóz-humán-inzulin | 6125 | 6132 |
| Phe(Bl)-maltotrióz-humán-inzulin | 6288 | 6294 |
| G-ly(Al),Phe(Bl)-dimaltóz-humán-inzulin | 6444 | 6456 |
| Gly(Al),Phe(Bl)-dilaktóz-humán-inzulin | 6446 | 6456 |
| Gly (A1),Phe(Bl)-dimaltotrióz-humán-inzulin | 6771 | 6780 |
| Gly (Al),Phe(Bl)-Lys(B29)-triglükóz-humán-inzulin | 6294 | 6294 |
| Gly (Al),Phe(Bl)-diglükóz-(AspB10)-humán-inzulin | 6112 | 6110 |
A kötött cukor csoportok helyzetét bórhidrid redukció után kvantitatív aminosav analízis segítségével állípítottuk meg.
Claims (14)
1. Eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő inzulint vizes vagy szerves közegben monoszacchariddal, amely szabad aldehidcsoporttal rendelkezik, vagy oligoszacchariddal, amely szabad aldehidcsoporttal rendelkezik, reagáltatjuk és maximálisan 3 cukor egységet kötünk a molekulához, majd a kívánt terméket a reakcioelegyből izoláljuk.
2. Ez 1. igénypont szerinti eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására, amelyek egy vagy több monoszaccharid csoportot vagy egy vagy több oligoszaccharid csoportot tartalmaznak, és maximálisan három cukor csoportot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására, amelyek egy monoszaccharid csoportot vagy egy oligoszaccharid csoportot tartalmaznak és maximálisan három cukor csoportot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására, amelyek két monoszaccharid csoportot vagy két oligoszaccharid csoportot, összesen maximálisan három cukor csoportot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
···« · ·· ·· ··
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás specifikusan glikozilezett inzulinok előállítására, amelyek három monoszaccharid csoportot vagy három oligoszaccharid csoportot tartalmaznak és maximálisan három cukorcsoportot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk .
6. A 3. igénypont szerinti eljárás monoglikozilezett inzulin származékok előállítására, amelyek az Al, Bl vagy B29 helyzetekben glikozilezettek, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
7. A 4. igénypont szerinti eljárás glikozilezett inzulin előállítására, amely diglikozilezett, az Al és Bl; az Al és B29; vagy a Bl és B29 helyzetben, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás glikozilezett inzulin előállítására, amely triglikozilezett, az Al, Bl és
B29 helyzetekben, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
9. A fenti igénypontok bármelyike szerinti eljárás glikozilezett inzulin előállítására, amely Asp tartalmú, a BIO helyzetben, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
10. A fenti igénypontok bármelyike szerinti eljárás glikozilezett inzulin előállítására, amely esetben az alapanyag inzulin humán inzulin, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiin- te ·· te • · * te te • ·«·* te··· · te··* ·*-·* • te · · te ······ « te · ·· ·· ··<· dulási anyagokat alkalmazzuk.
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás Phe(Bl)-glükóz-humán-inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás Phe(Bl),Gly(Al)-diglükóz-humán-inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
13. Eljárás formált alak előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább 90 %, előnyösen legalább 95 %, legelőnyösebben legalább 99 % specifikusan glikozilezett inzulint, amely a fenti igénypontok szerinti bármely vegyület, készítménnyé feldolgozunk.
14. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti igénypontok szerinti bármely specifikusan glikozilezett inzulin származékot vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját, kívánt esetben gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokkal és adalékanyagokkal, valamint tartósítóanyagokkal gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK111489A DK111489D0 (da) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | Peptider |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU902787D0 HU902787D0 (en) | 1991-11-28 |
| HUT59942A true HUT59942A (en) | 1992-07-28 |
Family
ID=8101165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU8727A HUT59942A (en) | 1989-03-08 | 1990-03-06 | Process for producing glycozylized inzulines |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0462192A1 (hu) |
| JP (1) | JPH04504117A (hu) |
| KR (1) | KR920701249A (hu) |
| CN (1) | CN1045586A (hu) |
| AU (1) | AU638701B2 (hu) |
| CA (1) | CA2049937A1 (hu) |
| CS (1) | CS114290A3 (hu) |
| DD (1) | DD296933A5 (hu) |
| DK (1) | DK111489D0 (hu) |
| FI (1) | FI914226A0 (hu) |
| GR (1) | GR1000604B (hu) |
| HU (1) | HUT59942A (hu) |
| IL (1) | IL93674A0 (hu) |
| NO (1) | NO913517L (hu) |
| NZ (1) | NZ232808A (hu) |
| PT (1) | PT93366A (hu) |
| WO (1) | WO1990010645A1 (hu) |
| YU (1) | YU45490A (hu) |
| ZA (1) | ZA901737B (hu) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2552043A1 (en) | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Novo Nordisk A/S | Transglutaminase mediated conjugation of peptides |
| US7597884B2 (en) | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
| US8846103B2 (en) | 2009-01-28 | 2014-09-30 | Smartcells, Inc. | Exogenously triggered controlled release materials and uses thereof |
| WO2010088294A1 (en) | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Smartcells, Inc. | Conjugate based systems for controlled drug delivery |
| CA2750269A1 (en) | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Smartcells, Inc. | Crystalline insulin-conjugates |
| US8569231B2 (en) | 2009-03-20 | 2013-10-29 | Smartcells, Inc. | Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof |
| AU2010226243A1 (en) | 2009-03-20 | 2011-09-22 | Smartcells, Inc. | Terminally-functionalized conjugates and uses thereof |
| EP2598170A4 (en) | 2010-07-28 | 2016-07-06 | Smartcells Inc | MEDICAMENT-LIGAND CONJUGATES, THEIR SYNTHESIS AND CORRESPONDING INTERMEDIATES |
| JP2013535467A (ja) | 2010-07-28 | 2013-09-12 | スマートセルズ・インコーポレイテツド | 組換えにより発現されたインスリンポリペプチドおよびその使用 |
| JP2013541500A (ja) | 2010-07-28 | 2013-11-14 | スマートセルズ・インコーポレイテツド | 組換えレクチン、結合部位修飾レクチンおよびそれらの用途 |
| US9624287B2 (en) | 2012-07-17 | 2017-04-18 | Case Western Reserve University | O-linked carbohydrate-modified insulin analogues |
| EP2877200B1 (en) * | 2012-07-17 | 2019-05-08 | Case Western Reserve University | O-linked carbohydrate-modified insulin analogues |
| AU2013346624B2 (en) | 2012-11-13 | 2018-08-09 | Adocia | Quick-acting insulin formulation including a substituted anionic compound |
| CA2890048C (en) | 2012-12-03 | 2022-05-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | O-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues |
| JP6410790B2 (ja) | 2013-03-14 | 2018-10-24 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ−２調節因子およびその使用方法 |
| AU2014329567B2 (en) | 2013-10-04 | 2019-07-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Glucose-responsive insulin conjugates |
| US9795678B2 (en) | 2014-05-14 | 2017-10-24 | Adocia | Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound |
| FR3020947B1 (fr) | 2014-05-14 | 2018-08-31 | Adocia | Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations |
| FR3043557B1 (fr) | 2015-11-16 | 2019-05-31 | Adocia | Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue |
| CN105709207A (zh) | 2016-01-29 | 2016-06-29 | 徐宝贞 | 一种用于治疗痛风的药物 |
| CN105535927A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-05-04 | 山东中海制药有限公司 | 一种用于治疗流感、上呼吸道感染、病毒性肺炎的药物 |
| CN105597080A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-05-25 | 程潜 | 一种用于治疗尿毒症和尿蛋白的药物 |
| CN109562185A (zh) | 2016-06-02 | 2019-04-02 | 赛诺菲 | 药剂与能够结合葡萄糖感应蛋白的部分的新颖缀合物 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3847890A (en) * | 1971-11-01 | 1974-11-12 | A Green | Acidic monosaccharide-substituted proteins |
| US4444683A (en) * | 1982-11-17 | 1984-04-24 | University Of Utah | Glycosylated insulin derivatives |
| EP0119650A3 (en) * | 1983-03-21 | 1987-09-30 | THE PROCTER & GAMBLE COMPANY | Galactosyl-insulin conjugates useful in treating diabetics |
| HU206890B (en) * | 1986-10-13 | 1993-01-28 | Sandoz Ag | Process for producing sugar-modified somatostatin peptide derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active components |
-
1989
- 1989-03-08 DK DK111489A patent/DK111489D0/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-03-06 HU HU8727A patent/HUT59942A/hu unknown
- 1990-03-06 KR KR1019910701014A patent/KR920701249A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-03-06 NZ NZ232808A patent/NZ232808A/en unknown
- 1990-03-06 JP JP2504720A patent/JPH04504117A/ja active Pending
- 1990-03-06 AU AU52807/90A patent/AU638701B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-06 EP EP19900904777 patent/EP0462192A1/en not_active Ceased
- 1990-03-06 CA CA002049937A patent/CA2049937A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-06 WO PCT/DK1990/000062 patent/WO1990010645A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-03-07 ZA ZA901737A patent/ZA901737B/xx unknown
- 1990-03-07 CN CN90101282A patent/CN1045586A/zh active Pending
- 1990-03-07 GR GR900100159A patent/GR1000604B/el unknown
- 1990-03-07 DD DD90338488A patent/DD296933A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-07 IL IL93674A patent/IL93674A0/xx unknown
- 1990-03-07 YU YU00454/90A patent/YU45490A/xx unknown
- 1990-03-07 PT PT93366A patent/PT93366A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-03-08 CS CS901142A patent/CS114290A3/cs unknown
-
1991
- 1991-09-06 NO NO91913517A patent/NO913517L/no unknown
- 1991-09-06 FI FI914226A patent/FI914226A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR1000604B (el) | 1992-08-26 |
| CN1045586A (zh) | 1990-09-26 |
| AU638701B2 (en) | 1993-07-08 |
| AU5280790A (en) | 1990-10-09 |
| KR920701249A (ko) | 1992-08-11 |
| WO1990010645A1 (en) | 1990-09-20 |
| EP0462192A1 (en) | 1991-12-27 |
| NZ232808A (en) | 1992-04-28 |
| JPH04504117A (ja) | 1992-07-23 |
| GR900100159A (en) | 1990-07-31 |
| IL93674A0 (en) | 1990-12-23 |
| NO913517L (no) | 1991-11-06 |
| YU45490A (en) | 1991-10-31 |
| PT93366A (pt) | 1990-11-07 |
| NO913517D0 (no) | 1991-09-06 |
| DK111489D0 (da) | 1989-03-08 |
| DD296933A5 (de) | 1991-12-19 |
| ZA901737B (en) | 1990-11-28 |
| CA2049937A1 (en) | 1990-09-09 |
| HU902787D0 (en) | 1991-11-28 |
| FI914226A0 (fi) | 1991-09-06 |
| CS114290A3 (en) | 1992-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT59942A (en) | Process for producing glycozylized inzulines | |
| US20220133898A1 (en) | Derivatisation of Insulin with Polysaccharides | |
| US9452224B2 (en) | Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation | |
| KR102497726B1 (ko) | 인슐린 저항성에 대한 개선된 펩티드 제약 | |
| EP1409006B1 (en) | Monodispersed mixtures and methods of treating diabetes | |
| US20020160938A1 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| ZA200406332B (en) | ACC inhibitors. | |
| JP2008540565A (ja) | Ｇｌｐ−１ｐｅｇ化化合物 | |
| HUT67853A (en) | Insulin formulation | |
| EP1620465A2 (en) | Insulin analogs having protracted time action | |
| EP0119650A2 (en) | Galactosyl-insulin conjugates useful in treating diabetics | |
| TW201620930A (zh) | 新穎胰島素衍生物及其醫療用途 | |
| NZ237176A (en) | Insulin cobalt iii complex compositions | |
| CN114901680B (zh) | 长效glp-1化合物 | |
| US6686177B1 (en) | Insulin analogs with enhanced zinc binding | |
| Paselk et al. | Preparation of several trifluoroacetyl insulin derivatives | |
| EP2852400B1 (en) | An insulin analogue or its pharmaceutically acceptable salt, pharmaceutical composition with prolonged therapeutic effect, use of the insulin analogue, dosage method and method of treatment of diabetes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC9 | Refusal of application |