CS114290A3

CS114290A3 - Specifically glycosylated insulin derivatives

Info

Publication number: CS114290A3
Application number: CS901142A
Authority: CS
Inventors: John Broberg Halstrom
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1992-02-19
Also published as: CA2049937A1; DK111489D0; NZ232808A; GR1000604B; HU902787D0; DD296933A5; FI914226A7; AU638701B2; ZA901737B; KR920701249A; YU45490A; PT93366A; HUT59942A; NO913517L; WO1990010645A1; NO913517D0; JPH04504117A; GR900100159A; AU5280790A; IL93674A0

Description

Vynález se týká specificky glykosylo-váných insulinových derivátů, které je možno zpracovat na •;í farmaceutické prostředky, jakož i způsobu jejich výroby. „ ,ť ...r , t V, posledních let ech byla navrhována__ řada insulinových analogů pro léčbu cukrovky. Účelem navr-hovaných derivátů bylo zlepšení léčby, při níž je nutnonahradit insulin tak, že by bylo použito dostupnějších in-sulinových analogů s rychlejším nebo protrahovanějším účin·»kem ve, srovnání s účinkem lidského insulinu. 1 Problém, který je spojen s vývojem insulinových analogů substitucí jedné nebo většího počtuzbytků aminokyselin v nativním insulinu spočívá v tom, že ♦ vznikající látky mohou vyvolat imunologickou reakci. MimotoČasto dochází také k problémům, které souvisí s neočekáva-nou rozpustností nebo nestálostí získané látky. ,

Insulin má poměrně krátký poločasv krevním oběhu, není však možno vyloučit, že dochází invivo ke glykosylaci malého podílu insulinu nejen u diabeti-ků, jak je uváděno v publikaci Nakayama a další, Nonenzyma-tic glycosylation of insulin, "Current topics in clinicaland experimental aspects of diabetes mellitus',' (1985), 201aŽ 204, Sakamoto, Min and Baba, Eds., Elsevier Science sPublishers B.V., nýbrž také u lidí, kteří tímto onemocněnímnetrpí. Je tedy možno, že organismus již vyvinul mechanismusk potlačení tvorby protilátek proti glykosylovanému insulinu

Je dále možné, Že by bylo možno provést některé změny na-sacharidové části k zakrytí přítomnosti antigenu. *

Vazba glukosy, manosy a některýcholigosacharidů na insulin byla podrobena'velkému počtu stu-dií in vitro, aby bylo možno prokázat, zda tvorba glykosy-lovaného insulinu in vivo může být příčinou pozdních kompli-kací u diabetiků. V publikaci Anzenbacljer a další, Biochemi-ca et Biophysica Acta 306 (1975), 603 až 607 se uvádí výsled-ky studií s vazbou D-glukosy na insulin při použití dialýzy

V s dosažením rovnovážného, stavu. Vazba nebyla příliš speci-fická a průměrně se na molekulu insulinu vázalo osm molekulglukosy.

Interakce mezi insulinem’a glukosoua mannosou je popsána v publikaci Dolhofer a další, FebsLetters 100 ¢1979), 133 až 136. Výsledky ukazují, že oběhexosy se mohou vázat kovalentně na molekulu insulinu v prů-běhu inkubace in vitro při teplotě 37 °C. Za zvolených reakč-ních podmínek se průměrně vázala 3,6 + 0,39 zbytků glukosya 5,0 + 0,43 zbytků mannosy na molekulu insulinu.

Systém, v němž bylo uvolňování insuli-"nu řízeno glukosou byl navrhován v publikaci Brownlee a CeramiScience 206 (1979), 1190 až 1191, a Diabetes (1983), 499 až 5Ο5, Šlo o syntézu glykosylovaných derivátů insulinu,schopných kompetice s glukosou při vazbě na lectiny. S in-sulinem byly uváděny,do reakce maltosa a jiné oligosacharidy.

Nakayama a další ve svrchu uvedené^publikaci sledovali neenzymatickou glykosylaci insulinu invitro a in vivo u diabetických nemocných a došli k závěru,^že-gluko sa- se^věleňuje ^do*molekuly- insulinu^in_vivo za pa-thologických podmínek. Pri pokusech in visto docházelo kvazbě tří molekul, glukosy na jednu molekulu insulinu. V publikaci Lapolla a další, Diabe-tes 37 (1988), 787 až 791 se popisuje snížená biologickáúčinnost in.tivo pro insulin, glykosylovaný in vitro. Insulinbyl glykosylován za přítomnosti vysoké koncentrace glukosypodle svrchu uvedené publikace Dolhoferovy ve vodném pro-středí 17 hodin při teplotě 37 °C a pH 7,4. Vázalo se prů-měrné množství 2 moly glukosy na 1 mol insulinu.

Vzhledem k tomu, že natývní insulinmá tři volné primární aminoskupiny v poloze B1 (Phe), Al(Gly) a B29 (Lys), je zřejmé, Že svrchu popsané glykosylo-vané insulinové deriváty byly nehomogenní směsí glykosylova-ných molekul insulinu. Až dosud nebyly podniknuty žádné po-kusy s frakcionací svrchu uvedených směsí na jejich jednotli-vé složky.

Glykosylované insulinové derivátypro samoregulující systémy uvolňování insulinu byly popsányv publikaci Kim a další, Journal of Controlled Release 2, (1984), 57 až 66 a v US patentových spisech č. 4 483 792, 4 478 830, 4 478 746 a 4 489 063. V těchto glykosylovaných 'ř insulinových derivátech byla glukosa nebo mannosa vázána na ,insulin přes skupinu, odvozenou od dikarboxylových kyselin,anhydridu kyselin nebo fenylaminu nebo kombinaci těchtoskupin. V evropské patentové přihlášce δ.84200328, uveřejněné pod číslem 119 65Ο se popisují galak-tosyl insulinové deriváty, které stejně jako glykosylovanéinsuliny, popsané v Kimově svrchu uvedené publikaci obsahu-jí mezi galaktosylovým zbytkem a molekulou insulinu skupinu,přes kterou jsou tyto zbytky vázány.

Vynález si klade za úkol navrhnoutinsulinové deriváty s dokonalejšími vlastnostmi. Zejména:bymělo jít o insulinové deriváty, které by nevyvolávaly imuno-logickou reakci. Dále by měly tyto deriváty zajistit rychlej-ší nástup účinku než u nativního insulinu a zlepšit rozpust-nost méně rozpustných insulinů a umožnit tak použití vysocekoncentrovaných roztoků, například u tak zvaných osmotickýcninsulinových čerpadel. Nové deriváty by také neměly mít sklonk tvorbě fibril. Předmětem vynálezu jsou tedy speci-ficky glykosylované insulinové deriváty. Pod tímto pojmemse rozumí deriváty, v nichž se uhlohydrátové skupina nacházíve specifické poloze v molekule insulinu. Jak nebylo možno očekávattakto specificky glykosylované insulinové deri-váty poskytují pro léčebné účely cenné výhody, jak budepatrné z dalšího popisu a z příkladové části. —_— ........................., V-yné-l-ez~se^tedy—týká-s pec-if-ícky—gly-- kosylovaných insulinových derivátů, v užším smyslu derivátů,které jsou monoglykosylovány v polohách AI, 31 nebo B29,diglykosylovány v polohách Al a Bl, AI a 329 nebo B1 a B29 ’ nebo triglykosylovány v polohách Al, Bl a B29.

Glykosylované insuliny, které bylypopsány ve svrchu uvedené publikaci Kima a dalších, jsouodlišné od insulinových derivátů podle vynálezu, v nichžse využívá vlastní aldehydové funkce cukru pro tvorbu ko-valentní vazby s insulinem bez použití jiných pomocnýchskupin. Další výhodou insulinových derivátů podle vynálezuve srovnání s deriváty podle uvedené publikace je zachovánínativní distribuce náboje insulinové molekuly. Aminoskupi-ny, které se účastní glykosylační reakce jsou převáděny nasekundární aminoskupiny a jsou nadále schopné protonacejako v běžném insulinu.

Nové insulinové deriváty mohou vkaždé z uvedených poloh obsahovat monosacharid nebo oligo-sacharid s obsahem až tří zbytků cukru. Vhodnými monosa-charidy jsou glukosa, mannosa a galaktosa, vhodnými oligo-sacharidy maltosa, isomaltosa, laktosa, maltotriosa, meli-biosa a cellobiosa. ..... Specificky glykosylováné insulinové deriváty podle vynálezu je možno použít k léčbě cukrovky» Při úpravě insulinové léčby je také možno použít zvláštních u·směsí jednotlivých specificky glykosylovaných sloučenin.

Pod pojmem insuliny se rozumí nativ-ní forma insulinu, například insulin člověka, skotu a vepře,avšak také deriváty těchto látek, v nichž bylo nahrazeno,přidáno nebo vypuštěno několik aminokyselin nebo alespoňjedna aminokyselina ve srovnání s přírodním insulinem, jakbylo popsáno v evropských patentových spisech č. 194 864A a214 826A.

Jak již bylo uvedeno, nativní in-suliny obsahují tři místa potenciální glykosylace, a todva N-terminální zbytky aminokyselin v řetězci A a 3 azbytek lysinu v poloze B29. Je zřejmé, že počet potenciál-ních míst pro glykosylaci u analogu insulinu svrchu popsa-ného typu se může pohybovat od dvou (dva N-terminální zbyt-ky) až do většího počtu v závislosti na tom, kolik zbytkůlysinu se nachází v modifikované molekule insulinu vzhledemk tomu, že lysin je jediná přírodně se vyskytující aminoky-selina s volnou primární aminoskupinou v postranním řetězci.

Glykosylace schematicky probíhápodle následujícího schématu, byla použita 3-glukosa. - 8 -

D-glukosa D-glukosa pyranosová struktura řetězec

Reaktivní složkou je struktura ve formě řetězce.

glukosoinsulin je možno vyjádřit také pojmem 1-deoxy--D-fruktosylinsulin, ve schématu se pod pojmem insulinrozumí desaminoinsulin.

Svrchu uvedená reakce bude analogic-kým způsobem probíhat také s použitím jiných monosacharidů nebo oligosacharidů, které budou obsahovat volnou aldehydo-vou skupinu. r Dále budou uvedeny specifické přikla- vdy glykosylovaných insulinů; jde vždy o deriváty lidskéhoinsulinu:

Phe(Bl) glukosoinsulin,

Phe(Bl) mannosoinsulin,

Phe(Bl), Lys(B29) digalaktosainsulin,

Gly(Al^ Lys(B29), digalaktosainsulin,

Phe(Bl), Gly(Al) diisomsltosoinsulin,

Phe(Bl), Lys(B29) diisomaltosoinsulin,

Gly(Al), Lys(B29) diisomaltosoinsulin,

Gly(Al), Phe(Bl), Lys(B29) triglukosoinsulin,

Gly(AI), Phe(Bl), Lys(B29) trimaltosoinsulin,

Gly (AI)Phe(Bl), Lys(B29)· trilaktosoinsulin,

Gly(Al), Phe(Bl), Lys(B29) trimaltotriosoinsulin,

Gly(AI), Phe(B1), Lys(B29) trimannosoinsulin, · “

Gly(AI), Phe(Bl), Lys(B29) trigalaktosoinsulin,

Gly(AI), PheíBl), Lys(B29) triisomaltosoinsulin,

Phe(Bl) glukoso [AspB^°] insulin,

Gly(AI), PheíBl) diglukoso [Αβρ^θ] insulin.

Zajímavé jsou také specificky gly-kosylované insuliny jiných živoCišných druhů, napříkladinsulin vepře. - 10 - ” 'Specificky glykosylované’insulinovéderiváty je možno získat reakcí insulinu nebo jeho analogůs přebytkem zvoleného monosacharidu nebo oligosacharidu vevhodném-organ-iGkém-nebo*v-odném-prostředí-.-Teplota- se-může—~měnit v rozmezí 20 až 60 °C. Z organických rozpouštědel jemožno užít nižší k&rboxylové kyseliny, například kyselinuoctovou a propionovou, nižší alifatické alkoholy, jakomethanol, ethanol a 2-propanol, ethylenglykol a propylen-glykol, je však možno užít taká fenoly.

Reakění doba a složení reakění směsibude záviset na tom, zda je požadován monoglykosylovaný,digiykosylovaný nebo triglykosylované produkt. Reakci jemožno sledovat vysokotlakou kapalinovou chromatografií vreversní fázi ídále RP HPLC) ke stanovení okamžiku maximál- ní tvorby jednotlivých glykosylovaných produktů.

Reakce se zastaví zchlazením, napří-klad na—20 °C, reakění směs se pak odpaří do sucha, hlav-ní složky reakění směsi se pak izolují a ěistí preparativníRP HPLC. Po odstranění solí je možno charakterizovat výsled-ný produkt hmotovou spektrometrií, s použitím bombardovánírychlými atomy (dále FAB-MS), kvantitativní analýzou amino-kyselin po redukci borohydrideo a biologickými zkouškami.

Glykosylované insulinové derivátya jejich směsi je možno použít místo insulinu člověka nebovepře ve známých farmaceutických prostředcích s obsahem - 11 - insulinu za vzniku nových-farmaceutických prostředků. Tytofarmaceutické prostředky budou obsahovat glykosylovaný in-sulin nebo jeho sůl, vhodnou z farmaceutického hlediska vevodném roztoku, s výhodou s neutrální hodnotou pH. Vodnéprostředí může obsahovat látku, zajištující isotonicitu,jako chlorid sodný, octan sodný nebo glycerol. Mimoto můževodné prostředí obsahovat zinečnaté ionty, pufry, jako ace-tátový nebo fosfátový pufr a konzervační prostředky, jakom-kresol, methylparaben nebo fenol. Hodnota pH se upravína vhodnou hodnotu a výsledný prostředek je možno sterili-zovat filtrací.

Nové prostředky s obsahem insulinu.podle vynálezu je možno užít obdobným způsobem jako známéprostředky s obsahem.insulinu.

Praktické provedení vynálezu budeosvětleno následujícími příklady. P.ř í kl ad 1

Phe(Bl) glukoseinsulin 0,1 mmol lidského insulinu se uvededo suspenze ve 30 ml methanolu a při teplotě místnosti sepřidá 5 ml ledové kyseliny octové. Směs se opatrně míchá 12 - i •á až do rozpuštění insulinu. Pak se přidá další množství 35 ml methanolu a po přidání 2,2 mmol I>-glukosy se směs opatrně míchá 8 hodin při teplotě 40 °C, po této· době se stává výsledný produkt hlavní složkou reakční směsi.

Roztok se zahustí téměř do sucha narotačním odpařovačí. Pak se odparek rozpustí ve vodě a po-drobí se frakcionaci pomocí preparativní RP HPLC. Užije sesloupec o rozměru 16 x 250 mm se 7/um 100 i částic.

Teplota je 30 °C, mobilní fáze. A: 0,04 M kyseliny fosfo-rečné, 0,2 M síranu sodného, 10 56 acetonitrilu, pH 2,5 po í- úpravě ethanolaminem. B: 5056 acetonitril.

Frakce, odpovídající centrální částihlavního vrcholu se zbaví solí a lyofilizuje. Výtěžek je0,02 mmol. Produkt byl charakterizován FAB-MS a kvantita- . / tivní analýzou aminokyselin po redukci hydroborátem. Analý-za aminokyselin prokázala dva zbytky fenylalaninu, to jesto jeden zbytek fenylalaninu méně než v lidském insulinu,patrně v důsledku substituce na Phe(Bl). Molekulová hmotnostbyla 5970, teoretická hodnota je 5970. - 13 - ................. P. r í.k.l ad .2.. ................ ...

Phe(Bl) .Gl.v(Al) diglukosoinsulin

Svrchu uvedená sloučenina byla získá-na způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že reakční dóbabyla 16 hodin místo 8 hodin, čímž se výsledný produkt stalhlavní složkou reakční směsi. Výtěžek byl 0,06 mmol.

Analýza aminokyselin prokázala o je-den zbytek Phe ato jeden.zbytek Gly méně vzhledem k substi- tuci v poloze AI a Bl.

Molekulová hmotnost byla 6132, teore-tická hodnota je 6132.

Absorpce po podkožním podání bylastanovena u vepřů při injekčním podání značeného Phe(Bl),

Gly(AI) diglukosoinsulinu, získaného způsobem podle publikaceJefrgensen a další, Diabetologia 19 (1980), 546 až 554. Rych-lost absorpce po podkožní injekci ^^I-lidského insulinu a

Phe(Bl),Gly(Al) diglukosoinsulinu lidského původu jeuvedena v následující tabulce 1. Hodnoty a T2«j v tabulce 1 znamenají čas v hodinách, který uplynul od okam-žiku injekčního podání vzorku do změření radioaktivity ado jejího poklesu v místě podání na 75 5θ % a 25 % po-čáteční 'hodnoty. Z tabulky 1 je zřejmé, že glykosylovanýinsulin se vstřebává rychleji než lidský insulin. - 14 ---- 1 ,a u 1 k a 1 *5

.....«·»*» '.íw '< ·;4. , -7'vy.··' ,ť·"·».,,,.,ι^· lidský insulin lidský diglukosoinsulin **ÍI*>· .1.1,-,,1. φ . ,|t , ^ΙΙ,^Ι^Ι» » * 1,12 2,33 3,690,65 1,47 2,76 Účinek lidského insulinu (Actrapid^)a lidského Gly(Al),Phe(Bl) diglukosoinsulinu po podkožnímpodání u vepřů (průměr z pěti zvířat) v množství 0,1 jed-notka/kg je uveden v následující tabulce 2, která uvádíglukosu v mraol/1. tabulka 2 čas v h lidský insulin lidský diglukosoinsulin -0,33 5,30 5,24 0 5,36 5,32 0,33 4,78 4,76 0,67 4,72 4,06 1 4,12 3,34 1,5 3,60 2,98 2 3,24 2,84 2,5 3,28 2,96 3 3,18 3,14 4 3,34 3,96 - 15 - .....Tabulka 2 prokazuje rychlejší účinek diglukosoinsulinu ve srovnání s lidským insulinem.

Imunologická odpověčí u králíků(průměr z 10 králíků) pro lidský insulin, insulin Skota alidský Gly(AI),Phe(Bl) diglukosoinsulin je uvedena v tabul-ce 3, kde jsou uvedeny hodnoty vazby v králičím seru v pro-centech podle publikace Schlichtkrull a další, Horm. Metab.Res. Suppl. ser. £ (1974), 134 až 143.

Tabulka3 čas, dny lidský insulin insulin skotu lidský diglu-kosoinsulin . 0 1,9 -0,4 1,2 · 13 2,3 0,6 . 1,3 ' ' ’ 27 3,0 28,5 1,5 41 3,2 29,7 1,4 55 4,3 30,7 1,1 69 3,9 32,7 2,2 Θ3 2,4 30,1 1,1 97 2,0 32,6 1,5 Z tabulky 3 je zřejmé, že lidský diglukosoinsulin vyvolává neočekávaně nízkou imunologickou odpověd, srovnatelnou s odpovědí na lidský insulin. - 16 - ....... · -----'Přík la d ·’ 3 -

Analogickým způsobem byly získánytaké.následujícíSloučeniny. Molekulová hmotnost bylazjištována FAB-MS nebo hmotovou spektrometrií s plasmatickoudesorpcí, tyto hodnoty jsou spolu s vypočítanou molekulovouhmotností uvedeny v tabulce pro každou látku. sloučenina molekulová hmotnost vypočítáno nalezeno

Phe(Bl) galaktosoinsulin 5956 5970 Phe(Bl) maltosoinsulin 6119 6132 Phe(Bl) laktosoinsulin 6125 - ' 6132 Phe(Bl) maltotřiosoinsulin 6288 6294 Gly(AI),The(31) dimaltosoinsulin 6444 6456 Gly(Al),Phe(Bl) dilaktosainsulin 6446 6456

Gly(AI),Phe(Bl) dimaltotriosoinsulin 6771 6780

Gly(Al),Phe(Bl),Lys(B29) triglukoso- insulin Gly(Al),Phe(Bl) diglukoso [AspB^°) 6294 6294 insulin 6112 6110 Šlo vždy o deriváty lidského insulinu.Uložení zbytků cukrů bylo potvrzeno redukcí hydroborétem snáslednou kvantitativní analýzou aminokyselin.

Claims

-17 -

vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo větší počet mono-sacharidových zbytků nebo jeden nebo větší počet oligosacha-ridovýeh skupin s. až třemi zbytky cukru.
2. Specificky glykosylovaný insulinpodle bodu 1, vyznačující se tím, že obsahuje jeden zbytek *mono sacharidu nebo jednu oligosacharidovou skupinu s až tře- mi zbytky cukru.
3. Specificky glykosylovaný insulinpodle bodu 1, vyznačující se tím, že obsahuje dva zbytkymonosacharidu nebo dvě oligosacharidové skupiny s až třemizbytky cukru. 4TSpeciTÍcky~gly kosy lo váný-insul-inpodle bodu 1, vyznačující setím, že obsahuje tři zbytkymonosacharidu nebo tři oligosacharidové skupiny s; až třemizbytky cukru. 5* podle bodu 1, vyznačující »·. v poloze Ál, B1 nebo B29. Specificky glykosylovaný insulinse tím, že je monoglykosylován

- 18 -
6, Specificky glykosylovaný insuliny,podle bodu 3, vyznačující se tím, Se je diglykosylován vpolohách Al a Bl, Al a B29 nebo Bl a B29. 77^Specíficky' glykosylovaný^insurin1podle bodu 4, vyznačující se tím, Že je triglykosylován vpolohách Al, Bl a B29.
8. Specificky glykosylovaný insulinpodle bodÍL 1 aS 7, vyznačující se tím, že v poloze BIO obsa-huje Asp.
9. Specificky glykosylovaný insulinpodle bodů 1 až 8, vyznačující se tím, Že je odvozen odlidského insulinu. <
10. Lidský PheíBl) glukosoinsulin.
11. Lidský Fhe(Bl),Gly(Al) diglukoso- insulin.
12. Prostředek, vyznačující se tím,že obsahuje alespoň 90 s výhodou alespoň 95 %, a zvláštěalespoň 99 % specificky glykosylovaného insulinu podle bodů1 až 11.
13. Farmaceutický prostředek, vyzna-čující se tím, že obsahuje specificky glykosylovaný insulinpodle bodů 1 až 12, nebo jeho sůl, přijatelnou z farmaceutic - 19 - kého hlediska, popřípadě spolu s obvyklými pomocnými látka-mi, přísadami a konzervačními látkami.
14. Způsob výroby specificky glyko-sylovaného insulinu podle bodů 1 až 9, vyznačující se tím,Se se odpovídající insulin uvede do reakce ve vodném neboorganickém prostředí s monosacharidem, který obsahuje vol-nou aldehydovou skupinu nebo oligosacharidem, který obsahu-je volnou aldehydovou skupinu, a až tři zbytky cukru, načežse výsledný produkt z reakční směsi izoluje. 59 O28/K1

> Ifo.4· •ř Jl

I