JP2018506576A - 多価リガンド−脂質構築物 - Google Patents
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Abstract
Description
好ましくは、Sは以下の構造の四アンテナ型スペーサーである:
好ましくは、Glycは、下記のものからなる群から選択されるグリカンである:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galβ1−3(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4GlcNAc;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN);Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN);SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAβ2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4(GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcandSAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc。より好ましくは、Glycは、下記のものからなる群から選択されるグリカンである:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Ga
lβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN)及びNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN)。最も好ましくは、GlycはGalα3Galβ4GlcNAcβ(Galili)及びGalNAcα3Galβ4GlcNAcβからなる群から選択されるグリカンである。
・本発明の第1の態様の細胞の多価リガンド−脂質構築物を細胞の膜に組み込ませることによって改変された前記細胞の第1の懸濁液と生物学的試料を接触させて、第2の懸濁液を提供する工程;
・ある量の抗被験体結合タンパク質を第2の懸濁液に添加し、前記細胞の凝集に十分な温度及び時間でインキュベートする工程;及び
・凝集の程度を決定する工程、
ここで、リガンド結合タンパク質は、本発明の第1の態様のリガンド−脂質構築物のFに結合する。
・被験体から得られた血清試料を、本発明の第1の態様の細胞の多価リガンド−脂質構築物を細胞の膜に組み込ませることによって改変されたO型赤血球の懸濁液と接触させる工程;その後
・溶血速度を監視する工程、
ここで、Fはリガンドである。
それでは、本発明を実施形態又は実施例、及び添付図面の図を参照して説明する。
(Boc−Gly2−HNCH2)4C(3)の調製(スキームIのステップi)
テトラアミン(H2N−CH2)4C(1)をLitherlandら(1938)の文献に開示された方法に従って合成した。1M NaHCO3水溶液(18.2ml)及びi−PrOH(9ml)の混合物中のテトラアミン1(500mg、1.52mmol)の撹拌溶液に、Boc−GlyGlyNos(2)(4012mg、12.18mmol)を添加した(CO2発生、発泡)。反応混合物を30分間撹拌し、次いで6mlの1M NaHCO3水溶液を加え、混合物を一晩撹拌した。(Boc−Gly2−HNCH2)4C(3)の沈殿を濾過し、メタノール/水混合物(1:1、20ml)で十分に洗浄し、真空で乾燥させた。収量1470mg(98%)、白色固体。
(Boc−Gly2−HNCH2)4C(3)(1450mg、1.466mmol)をCF3COOH(5ml)に溶解し、溶液を室温で2時間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で除去し、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(30mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去した。固体残留物を真空下で乾燥させ、最小量の水に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラムに通して水で溶出した。生成物4を含む画分を合わせ、c.5mlまで蒸発させて、凍結乾燥させた。収量1424mg(93%)、白色固体。TLC:Rf0.5(エタノール/濃NH3;2:1(v/v))。
DMF(15ml)中の(メトキシカルボニルメチル−アミノ)−酢酸メチルエステル塩酸塩(5)(988mg、5mmol)の撹拌溶液に、Boc−GlyGlyNos(2)(3293mg、10mmol)及び(CH3CH2)3N(3475μL、25mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いでo−キシレン(70ml)で希釈し、蒸発させた。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー(トルエン中に充填し、酢酸エチルで溶出)により粗生成物を得た。粗生成物をクロロホルムに溶解し、水、0.5M NaHCO3及び飽和KClで順次洗浄した。クロロホルム抽出液を蒸発させ、生成物をシリカゲルカラム(クロロホルム中に充填し、15:1(v/v)クロロホルム/メタノールで溶出)で精製した。画分を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥させて、無色の濃いシロップ状の生成物7を得た。収量1785mg、(95%)。TLC:Rf=0.49(7:1(v/v)のクロロホルム/メタノール)。
メタノール(25ml)中の7(1760mg、4.69mmol)の撹拌溶液に、0.2M NaOH水溶液(23.5ml)を加え、溶液を室温で5分間保持した。次いで、溶液を酢酸(0.6ml)で酸性化し、蒸発乾固させた。シリカゲルでの残留物のカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル中に充填し、2:3:1(v/v/v)のi−PrOH/酢酸エチル/水で溶出)により、回収された7(63mg、3.4%)と目的化合物8(1320mg)を得た。次いで、中間生成物をメタノール/水/ピリジン混合物(20:10:1、30ml)に溶解し、イオン交換カラム(Dowex(登録商標)50X4−400、ピリジン形態、5ml)に通して残留ナトリウムイオンを除去した。続いて、カラムを同じ溶媒混合物で洗浄し、溶離液を蒸発させ、残留物をクロロホルム/ベンゼン混合物(1:1、50ml)に溶解し、次いで蒸発させ、真空下で乾燥させた。生成物8の収量は1250mg(74%)、白色固体であった。TLC:Rf0.47(4:3:1(v/v/v)のi−PrOH/酢酸エチル/水)。
DMF(10ml)中の8(1200mg、3.32mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(420mg、3.65mmol)の氷冷した撹拌溶液中に、N、N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(754mg、3.65mmol)を加えた。混合物を0℃で30分間、次いで室温で2時間撹拌した。N,N’−ジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾別し、DMF(5ml)で洗浄し、濾液を最小体積まで蒸発させた。次いで、残留物を(CH3CH2)2O(50ml)と共に1時間撹拌し、エーテル抽出物をデカンテーションにより除去した。残留物を真空下で乾燥させ、エステル9(1400mg、92%)を白色の泡状物として得た。TLC:Rf0.71(40:1(v/v)のアセトン/酢酸)。
主異性体;δ,ppm:7.896(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.972(t,J=5.9Hz,1H;NHCOO),4.533(s,2H;NCH 2COON),4.399(s,2H;NCH 2COOCH3),3.997(d,
{Boc−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(10)の調製(スキームIIIのステップi)
DMSO(2ml)中の(CF3COOH・H−Gly2−HNCH2)4C(4)(277mg、0.265mmol)の撹拌溶液に、エステル9(1.591mmol、DMSO中の0.5Mの溶液3.18ml)及び(CH3CH2)3N(295μL、2.121mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、150μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出した(20mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)。固体残留物を最小量のアセトンに溶解し、シリカゲルカラムで分画した(アセトン中に充填し、アセトン、20:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水、及び15:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水で溶出)。選択した画分を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥させた。純粋な{Boc−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(10)の収量は351mg(68%)、白色固体であった。TLC:Rf0.38(15:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水)。
主異性体;δ,ppm:8.593(t,J=5Hz,1H;NHCO),8.335(t,J=5.4Hz,1H;NHCO),7.821(t,J=6.4Hz,1H;C−CH2−NHCO),7.786(t,J=5.1Hz,1H;NHCO),6.993(t,J=6Hz,1H;NHCOO),4.139(s,2H;NCH 2CO),4.074(s,2H;NCH 2COO(CH3)),3.985(d,J=5Hz,2H;COCH 2NH),3.887(d,J=5.4Hz,2H;COCH 2NH),3.726(d,J=5.1Hz,2H;COCH 2NH),3.634(s,3H;OCH 3),3.567(d,J=6Hz,2H;COCH 2NHCOO),2.686(broad.d,J=6.4Hz,2H;C−CH 2NH),1.379(s,9H;C(CH3)3)。
{Boc−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(10)(330mg、0.168mmol)をCF3COOH(2ml)に溶解し、溶液を室温で40分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空下で蒸発させ、残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出(20mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)することで残留CF3COOHを除去し、次いで真空下で乾燥させた。{CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]Gly2−NHCH2}4C(11)の収量は337mg(99%)、白色固体のであった。
主異性体;δ,ppm:4.370(s,2H;NCH 2CO),4.265(s,2H;NCH 2COOCH3),4.215(s,2H;COCH 2NH),4.138(s,2H;COCH 2NH),3.968(s,2H;COCH 2NH),3.919(s,2H;COCH 2NH2 +),3.775(s,3H;OCH 3),2.914(s,2H;C−CH 2NH)。
DMSO(2ml)中の(CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]Gly2−HNCH2)4C(11)(272mg、0.135mmol)の撹拌溶液に、エステル9(0.809mmol、DMSO中の0.5Mの溶液1.62ml)及び(CH3CH2)3N(112μL、0.809mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、70μLのAcOHで酸性化し、溶媒を真空下で除去した(凍結乾燥)。残留物を(CH3CH2)2Oで3回抽出した(15mlの(CH3CH2)2Oと共に30分間軽く撹拌し、続いてデカンテーション)。固体残留物を最小量の7:1(v/v)アセトン/メタノール混合物に溶解し、シリカゲルカラムで分画した(アセトン中に充填し、7:1(v/v)アセトン/メタノール、10:2:1(v/v/v)、9:2:1(v/v/v)、8:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水で溶出)。選択した画分を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥させた。純粋な{Boc−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−NHCH2}4C(12)の収量は279mg(71%)、白色固体であった。TLC:Rf0.42(8:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水)。
DMSO(2ml)中の(CF3COOH・H−[Gly2(MCMGly)]2Gly2−HNCH2)4C(13)(175mg、58.5μmol)の撹拌溶液に、エステル9(0.351mmol、DMSO中の0.5Mの溶液0.702ml)及び(CH3CH2)3N(49μL、0.351mmol)を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、30μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を最小量の1:1(v/v)アセトニトリル/水の混合物に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(1:1(v/v)アセトニトリル/水で溶出)で分画した。選択した画分を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させた。純粋な{Boc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(14)の収量は279mg(71%)、白色固体であった。TLC:Rf0.42(8:2:1(v/v/v)のアセトン/メタノール/水)。{Boc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4C(14)を含む画分を合わせ、c.2ml体積まで蒸発させて凍結乾燥した。最初の収量は215mg(94%)であった。シリカゲルカラムでの更なる精製(アセトニトリル中に充填し、4:5:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水で溶出)により、169mgのBoc−[Gly2(MCMGly)]3Gly2−NHCH2}4Cを得た(収率74%、白色固体)。TLC:Rf0.45(4:5:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水)。
DMSO(1ml)中の(CF3COOH・H−Gly2(MCMGly)]3−HNCH2)4C(15)(68mg、17.16μmol)の撹拌溶液に、エステル9(0.137mmol、DMSO中の0.5Mの溶液0.275ml)及び(CH3CH2)3N(14.3μL、0.103mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、100μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を最小量の1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)の混合物に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)で溶出)で分画した。{Boc−[Gly2(MCMGly)]4Gly2−NHCH2}4C(16)を含有する画分を合わせ、c.2ml体積まで蒸発させて凍結乾燥した。収量は81mg(96%)、白色固体であった。TLC:Rf0.24(4:5:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水)。
DMSO(1ml)中の(CF3COOH・H−Gly2(MCMGly)]4−HNCH2)4C(17)(16.8mg、3.403μmol)の撹拌溶液に、エステル9(27.2mmol、DMSO中の0.5Mの溶液63μl)及び(CH3CH2)3N(3μl、21.6μmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、100μLのAcOHで酸性化し、真空下で溶媒を除去した(凍結乾燥)。残留物を最小量の1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)の混合物に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(1:1(v/v)アセトニトリル/水(0.25%AcOH)で溶出)で分画した。{Boc−[Gly2(MCMGly)]5Gly2−NHCH2}4C(18)を含有する画分を合わせ、c.1ml体積まで蒸発させて凍結乾燥した。収量は19mg(95%)、白色固体であった。TLC:Rf0.15(4:3:2(v/v/v)のi−PrOH/アセトニトリル/水)。
水(26mL)中の生成物19(463mg、0.07835mmol)の溶液に、Et3N(523μL、3.761mmol)を添加し、溶液を室温で18時間維持した。蒸発させた後の残留物を真空中で凍結乾燥した。生成物20の収量は587mg(98%)、白色固体であった。TLC:Rf0.39(1:2:1(v/v/v)のCHCl3/MeOH/水)。
無水N,N−ジメチルホルムアミド(1.5ml)中のビス(N−ヒドロキシスクシンイミジル)アジペート(21)(70mg、205mmol)の溶液に、クロロホルム(1.5ml)中の1,2−O−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(22)(40μmol)を、次いでトリエチルアミン(7μl)を加えた。混合物を室温で2時間維持し、次いで酢酸で中和し、真空下で部分的に濃縮した。残留物のカラムクロマトグラフィー(Sephadex(登録商標)LH−20、1:1のクロロホルム−メタノール、0.2%酢酸)により、生成物23(37mgの95%)を無色シロップとして得た。
水/2−プロパノール混合物(16mL、2:3)中の生成物20(522mg、0.06821mmol)の撹拌溶液に、ジクロロエタン(368μL)中の1M NaHCO3(547μL、0.547mmol)及びDE−Ad−OSu(23)(66.1mg、0.06821mmol)の溶液を加え、溶液を室温で1.5時間撹拌した。AcOH(94μL)で酸性化した後、溶液を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させた。乾燥混合物を3mLの水/MeOH(15:1)に溶解させ、C18逆相カラム(75%MeOH、次いで15:1の水/MeOHで洗浄した約45mLの相)に置いた。物質を水/MeOH(15:1−50mL;9:1−50mL;7.5:2.5−50mL;1:1−50mL;2.5:7.5−100mL)で順次溶出した。未反応の20を、15:1の水/メタノール(NMRデータによりNa塩、116mg、30.8%の回収率)及び9:1の水/メタノール(NMRデータによりEt3N塩、63mg、13.6%の回収率)で溶出した。目的の(H−CMG5)3C(CMG5−Ad−DE)(24)を1:1の水/メタノールで溶出した。純粋な凍結乾燥生成物24の収量は135mg((24)で25.5%)、白色固体であった。TLC(1:2:1(v/v/v)のMeOH/酢酸エチル/水):20 Rf0.06;24 Rf0.17。
グリコシル受容体(3−トリフルオロアセトアミドプロピル)−2−アセトアミド−3−O−アセチル−6−O−ベンジル−2−デオキシ−4−O−(2,4−ジ−O−アセチル−6−O−ベンジル−β−D−ガラクトピラノシル)−β−D−グルコピラノシド(25)を、Pazyninaら(2008)の文献に開示された方法に従って調製した。グリコシル受容体25(500mg、0.59mmol)、チオガラクトピラノシド26(576mg、1.18mmol)、NIS(267mg、1.18mmol)、無水CH2Cl2(25ml)及びモレキュラーシーブ4Å(500mg)の混合物を、−45℃で30分間、Ar雰囲気下で撹拌した。次いで、無水CH2Cl2(0.5ml)中のTfOHの溶液(21μl、0.236mmol)の溶液を添加した。反応混合物を−45℃で2時間撹拌し、続いて温度を4時間かけて−20℃に上昇させた。混合物を一晩−20℃に維持した。次に、追加量のチオガラクトピラノシド26(144mg、0.295mmol)、NIS(66mg、0.295mmol)及びTfOH(5μl、0.06mmol)を添加し、−20℃で2時間の撹拌を続けた後、室温までゆっくりと温度上昇させた(1時間)。次いでNa2S2O3飽和水溶液を添加し、混合物を濾過した。濾液をCHCl3(300ml)で希釈し、H2O(2×100ml)で洗浄し、脱脂綿を通して濾過することにより乾燥させ、濃縮した。LH−20(CHCl3−MeOH)でのゲル濾過により、生成物27(600mg、80%)を白色泡状物として得た。
生成物27(252mg、0.198mmol)をZemplenに従って脱アセチル化し(8時間、40℃)、AcOHで中和し、濃縮した。得られた生成物のTLC(CH3Cl−MeOH、10:1)分析は、2つのスポットを示した:Rf0.45のメインスポットと、トリフルオロアセチルの部分的な損失を示す、スタートライン上の別のスポット(ニンヒドリン陽性スポット)。したがって、生成物をMeOH(10ml)中のCF3COOMe(0.1ml)及びEt3N(0.01ml)で1時間処理することによりN−トリフルオロアセチル化し、濃縮し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(CHCl3−MeOH、15:1)に供して生成物28を白色泡状物として得た(163mg、77%)、Rf0.45(CH3Cl−MeOH、10:1)。生成物28を水素化分解し(200mgのPd/C、10mlのMeOH、2時間)、濾過し、N−脱フルオロアセチル化し(N−defluoroacetylated)(5%のEt3N/H2O、3時間)、濃縮した。Dowex(登録商標)50X4−400(H+)での陽イオン交換クロマトグラフィー(5%アンモニア水で溶出)により、生成物29(90mg、98%)を白色泡状物として得た。
塩化グリコシルの3,4,6−トリ−O−アセチル−2−アジド−2−デオキシ−β−D−ガラクトピラノシルクロリド(30)を、Paulsenら(1978)の文献に開示された方法に従って調製した。グリコシル受容体25(420mg、0.5mmol)、銀トリフラート(257mg、1.0mmol)、テトラメチル尿素(120μl、1.0mmol)及び無水ジクロロメタン(20ml)中の新しく焼成したモレキュラーシーブ4Åの溶液を、室温、暗所で30分間撹拌した。別量のシーブ4Åを加え、さらに無水ジクロロメタン(3ml)中の塩化グリコシル30(350mg、1.0mmol)の溶液を添加した。混合物を室温で20時間撹拌した。樹脂を濾過し、メタノールで洗浄した後(4×10ml)、溶媒を蒸発させた。シリカゲルでのクロマトグラフィー(クロロホルム中の5〜7%イソプロパノールで溶出)により、407mg(70%)の生成物31をアノマーの混合物(1H−NMR分光法で測定してα/β=3.0)として得た。
マススペクトルを、マトリックスとしてジヒドロキシ安息香酸を使用して、MALDI−TOF Vision−2000分光計に登録した。
無水DMSO中の化合物34(5mg、6μmol)の撹拌溶液に、化合物24(4.3mg、5μmol)及びEt3N(0.5μl)を1.5時間かけて3回に分けて添加した。混合物を室温で24時間撹拌し、次いでカラムクロマトグラフィー(Sephadex(登録商標)LH−20、MeOH−H2O、3:7)にかけて粗生成物35を得た。生成物を水から凍結乾燥させ、残留物を3mlの水に溶解し、NaHCO3の水溶液(10mM)を加えてpH6.5にし、溶液を凍結乾燥して3.7mgの化合物35をNa塩として得た。
4mLの25%水性イソプロピルアルコール(IPA)中の25.3mg(3.3μmol)の化合物24の溶液に、MeCN(500μL)中のN−マレオイル−β−アラニンN’−ヒドロキシスクシンイミドエステル(36)(5.3mg、20μmol)の溶液を添加する。反応混合物のpHを、NMM(IPA中1:10(v/v)、約20μL)の添加により7〜8に調整する。透明な溶液を室温で一晩維持し、反応終了点を定性的スポットニンヒドリン試験により確認する。(試験における陰性の結果は、アミノ成分が消費されたことを示す)。ロータリーエバポレータを用いて溶媒を真空中で除去し、油状残留物をMeCN(500μL)でトリチュレートし、混合物を10分間超音波処理する。得られたスラリーをエッペンドルフチューブに移し、遠心分離する。固体を超音波処理しながら無水エーテル及びMeCN(3×400μL)で繰り返し洗浄し、続いて出発試薬(Mal−βAla−ONSu)がTLC(CHCl3−MeOH−AcOH、90:8:2 v/v)で検出されなくなるまで遠心分離する。最後のエーテル洗浄後の沈殿物を、真空中、4Åモレキュラーシーブ上で一定重量まで乾燥させる。18.9mg(70%)の量の(Mal−βAla−CMG3−NHCH2)3CCH2NH−CMG3−Ad−DOPE(37)が、非晶質の白色粉末として得られた。単離された物質は、1モルの37当たり約17モルの第三級アミン及び1モルのナトリウムイオン(Na+)のモルを含み得る。
1H NMR(700MHz、[D2]H2O/[D4]CH3OH 1:1(v/v)、30℃)のNa/Et3N塩(約7.3M/MのEt3N)δ、ppm:7.038(s、6H;3CH=CH)、5.542(m、4H;DEの2つのシスCH=CH)、5.446(m、1H;DEのOCH2−CH(OCO)CH2O)、4.635(dd、1H、J=12.2Hz/2.3Hz;DEのOCH2−CH(OCO)CHOCO)、4.516−4.041(181H;20NCH 2CO、20NCH 2COOH、48COCH 2NH、DEのOCH 2−CH(OCO)CHOCO、DEのOCH 2CH2NH)、3.985(t、J=6.8Hz、6H;Alaの3NCH2)、3.594(t、2H、J=4.5Hz;DEのOCH2CH 2NH)、3.384(q、44H、J=7.3Hz;22NCH 2CH3)、3.079(broad.s、8H、4C−CH 2NH)、2.777(t、6H、J=6.8Hz;Alaの3CH2CO)、2.548、2.522、2.515及び2.449(三重項、合計8H;4CO−CH 2CH2)、2.195(約dd、8H、J=11.5Hz/5.8Hz;DEの2CH 2−CH=CH−CH 2)、1.812及び1.776(多重項、8H;4CO−CH2CH 2)、1.484及び1.454(重複するt及びm、合計106H;t、J=7.3Hz、22NCH2CH 3;m、DEの20CH2)、1.061(t、6H、J=7.1Hz;DEの2CH3)。
MUT21と命名された、ある量(12.5mg、7.4μmol)の14マーのオリゴペプチド(m.w.1693.17Da):
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrProCys(配列番号01)
を、30%水性イソプロピルアルコール(pH6.6)中の4mL 0.1M NMM中の溶液として調製する。溶液を、ある量(13.5mg、1.64μmol)の37を溶解させた5mLの同じバッファーと合わせる。反応混合物を室温で一晩撹拌し、遠心分離する。上清を、分画分子量3.5kDaの透析バッグ(Spectra/Por3)を用いて、緩衝化していない30%(v/v)IPA−水に対して24時間、及びMilli−Q水に対して透析し、残留オリゴペプチド物質を除去する。次いで、得られたスラリーを凍結乾燥用フラスコに移し、一定重量まで凍結乾燥させる。18.4mg(84%)の量の構築物38が、非晶質の白色粉末として得られる。構築物のペプチドと脂質部分の特徴を示す低磁場プロトンの予期される信号の比が1H NMRで明らかにされる(D2O/CD3OD 2:1中3mg/mL、303K、700MHz)(図8)。
{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸メチルエステル(7)の調製(比較スキームIのステップi)
化合物7を調製する代替法を採用した。150mlの塩化メチレン中のBoc−グリシル−グリシン(23.2g、0.1mol)の撹拌懸濁液に、N−メチルモルホリン(11.0ml、0.1mol)を添加し、溶液を−15℃に冷却してクロロギ酸イソブチル(13.64g、0.1mol)を10分間にわたって加えた。次いで、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び50mlのDMF中の(メトキシカルボニルメチルアミノ)−酢酸メチルエステル(7)(16.1g、0.1mol)の溶液を、化合物39を含有する同じ温度の反応混合物に添加した。得られた混合物を0℃で30分間、次いで周囲温度で2時間撹拌し、蒸発乾固させた。残留物を200mlの塩化メチレンに溶解し、100mlの0.5M HCl及び200mlの2%NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を真空中で蒸発させ、残留物をシリカゲル(CHCl3中の3%MeOH)でのカラムクロマトグラフィーで精製し、純粋な化合物7(34.08g、91%)を無色ガラスとして得た。TLC:Rf=0.40(CHCl3中の5%MeOH)、Rf=0.49(7:1(v/v)のクロロホルム/メタノール)。
メタノール(325ml)中の{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸メチルエステル(8)(24.42g、65.12mmol)の撹拌溶液に、0.2MのNaOH水溶液(325ml)を加え、反応混合物を周囲温度で15分間維持し、酢酸(5ml)で酸性化し、蒸発乾固させた。シリカゲルでの残留物のカラムクロマトグラフィー(メタノール−酢酸エチル 1:1)により、目的化合物をNa塩(20.44g)として得、これをメタノール/水/ピリジン混合物(20:10:1、350ml)に溶解し、イオン交換カラム(Dowex(登録商標)50X4−400、ピリジン形態、300ml)に通してNaカチオンを除去した。カラムを同じ混合物で洗浄し、溶出物を真空中で蒸発及び乾燥させて、純粋な化合物8(20.15g、86%)を白色固体として得た。TLC:Rf=0.47(iPrOH/酢酸エチル/水 4:3:1)。
N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(14.03g、68.10mmol)を、DMF(210ml)中の{[2−(2−tert−ブトキシカルボニルアミノ−アセチルアミノ)−アセチル]−メトキシカルボニルメチル−アミノ}−酢酸(26.40g、73.13mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(8.70g、75.65mmol)の氷冷撹拌溶液に加えた。混合物を0℃で30分間、次いで周囲温度で2時間撹拌した。析出したN,N’−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、DMF(80ml)で洗浄した。濾液及び洗浄液を濃縮し、残留物をEt2O(500ml)と共に1時間撹拌した。エーテル抽出物をデカントし、残留物を濃縮して化合物9を白色の泡状物として得た(32.57g、97%)。TLC:Rf=0.71(アセトン/酢酸 40:1)。1H NMR(500MHz、DMSO[D6]、30℃)、N−カルボキシメチルグリシンユニットのシス異性体及びトランス異性体のc.3:2の混合物。
H2N−CMG2−NH2(45)の調製(比較スキームII及びIII)
DMSO(50ml)中のBoc−Gly2−(MCM)Gly−OSu(9)(15.42g、33.68mmol)の撹拌溶液に、DMSO(5ml)中のエチレンジアミン(40)(808mg、13.47mmol)及びEt3N(1.87ml、13.5mmol)の溶液を添加した。反応混合物を周囲温度で30分間撹拌し、酢酸(1.2ml)で酸性化し、次いでSephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量1200ml、溶離剤−MeOH/水 2:1+0.2%AcOH)で分画した。化合物のBoc2MCMG(41)を含む画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物を真空中で濃縮した。生成物を、溶離剤として2−プロパノール/酢酸エチル/水(2:6:1)を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。純粋なBoc2MCMG(41)を含む画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させて、目的のBoc2MCMG(41)を無色の泡状物(8.41g、84%)として得た。TLC:Rf=0.48(iPrOH/酢酸エチル/水 2:3:1)。
トリフルオロ酢酸(25ml)を塩化メチレン(25ml)中のBoc2MCMG(41)(4.88g、6.535mmol)の撹拌溶液に添加し、溶液を周囲温度で1時間維持した。次いで、反応混合物を濃縮し、残留物を無水メタノール(50ml)を用いて3回蒸発させ、その後、残留物をEt2O(100ml)で3回抽出して微量のトリフルオロ酢酸を除去した。(白色固体として)生じた沈殿物を乾燥させて、5.06g(約100%)のMCMG(42)をビス−トリフルオロ酢酸塩として得た。TLC:Rf=0.23(エタノール/水/ピリジン/酢酸 5:1:1:1)。
DMSO(17ml)中のBoc−Gly2−(MCM)Gly−OSu(9)(7.79g、16.994mmol)及びEt3N(2.83ml、20.4mmol)の溶液を、DMSO(13ml)中のH2N−MCMG−NH2(42)(5.06g、6.796mmol)の撹拌溶液に添加した。反応混合物を周囲温度で2時間撹拌した後、酢酸(4.0ml)で酸性化し、Sephadex(登録商標)LH−20カラムクロマトグラフィー(カラム容量1200ml、溶離剤−MeOH/水 2:1+0.2%AcOH)で分画した。純粋なBoc2MCMG2(43)を含む画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させて、目的のBoc2MCMG2(43)を無色の泡状物(8.14g、97%)として得た。TLC:Rf=0.25(iPROH/酢酸エチル/水 2:3:1)。
Boc2MCMG2(43)(606mg、0.491mmol)をCF3COOH(2ml)に溶解し、溶液を室温で30分間維持した。トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発させ、残留物をEt2Oで3回抽出して(25mlのEt2Oでのトリチュレーションの後に濾過)、残留CF3COOHを除去し、得られた白色粉末を真空中で乾燥させた。粉末を4mLの水に溶解し、次いで凍結乾燥させた。H2N−MCMG2−NH2(44)(TFA塩)の収率は定量的に推定された(実際の重量は水和物の安定性のために理論値よりも約10%大きかった)。TLC:Rf=0.21(エタノール/水/ピリジン/酢酸 5:1:1:1)。
水(20mL)中のH2N−MCMG2−NH2(44)(約0.49mmol)の溶液に、Et3N(0.5mL)を添加し、溶液を室温で15時間維持した。反応混合物を蒸発乾固させ、残留物をSephadex(登録商標)LH−20カラムで脱塩した(2つの方法):方法A.残留物を水(3ml)に溶解し、溶液をSephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量250mL、溶離剤−MeOH/水1:1+0.05M酢酸ピリジン)で脱塩した。塩で汚染されたH2N−CMG2−NH2(45)を含む画分を、別々に合わせ、蒸発させ、残留物を再度脱塩した。純粋なH2N−CMG2−NH2(45)を含む合わせた画分を、約4mLの体積まで蒸発させ、凍結乾燥させた。H2N−CMG2−NH2(45)(内部塩)の収量は431mg(90%)であった。方法B.残留物を水(3ml)に溶解し、溶液をSephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量250mLの溶離液−MeOH/水 1:1+1%濃度NH3水溶液)で脱塩した。純粋なH2N−CMG2−NH2(45)を含む画分を、約4mlの体積まで蒸発させ、凍結乾燥させた。残留物(H2N−CMG2−NH2(45)のアンモニア塩)をiPrOH/水 1:1混合物(10mL)に溶解し、Et3N(0.2mL)を加え、溶液を蒸発乾固させた。この手順を2回繰り返した。残留物を4mLの水に溶解し、凍結乾燥させた。H2N−CMG2−NH2(45)のジ−Et3N塩の収量は549mg(95%)であった。
H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)の調製(比較スキームIV)
激しく撹拌したi−PrOH/水混合物(i−PrOH/水 3:2、10mL)中のH2N−CMG2−NH2(45)(425mg、0.435mmolの内部塩)に、1MのNaHCO3水溶液(0.435mL、0.435mmol)を、次いでジクロロエタン(0.4mL)中のDOPE−Ad−OSu(23)(211mg、0.218mmol)を加えた。反応混合物を2時間撹拌し、次いで0.2mLのAcOHで酸性化し、35℃で最小体積まで蒸発させた。固体残留物を真空中で乾燥させ(固体の泡)、次いでCHCl3/MeOH混合物で十分に抽出した(CHCl3/MeOH 4:1、10mLで数回、TLC対照)。抽出された残留物は未反応のH2N−CMG2−NH2(45)及び塩から構成された(H2N−CMG2−NH2(45)合成に記載の手順に従うシリカゲルでのクロマトグラフィー後の画分及び残留物を合わせたものの脱塩により、H2N−CMG2−NH2(45)の約50%が回収された)。合わせたCHCl3/MeOH抽出物(H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)、DOPE−Ad−CMG2−Ad−DOPE、N−オキシスクシンイミド、及び一部のH2N−CMG2−NH2(45)の溶液)を真空中で蒸発させ、乾燥させた。得られた混合物をシリカゲルカラム(CHCl3/MeOH 5:1中の2.8×33cm、約200mLのシリカゲル)で分離した。混合物をMeOH/CHCl3/水混合物(MeOH/CHCl3/水: 6:3:1+0.5%のピリジン)中のカラム上に置き、成分を段階的に、三元濃度勾配で溶出した。すなわち、6:3:1から6:2:1、次いで6:2:2(全てピリジン0.5%を含む)までのMeOH/CHCl3/水組成物である。DOPE−Ad−CMG2−Ad−DOPEが最初に溶出し(Rf=0.75、MeOH/CHCl3/水 3:1:1)、目的のH2N−CMG2−Ad−DOPE(46)が続き(Rf=0.63、MeOH/CHCl3/水 3:1:1)、最後に溶出したのがH2N−CMG2−NH2(45)であった(Rf=0.31、MeOH/CHCl3/水 3:1:1)。純粋なH2N−CMG2−Ad−DOPE(46)を含む画分を合わせ、蒸発乾固させた。低分子量の不純物及び可溶化したシリカゲルを除去するために、残留物をiPrOH/水 1:2混合物(2mL)に溶解し、Sephadex(登録商標)LH−20カラム(カラム容量130mL、溶離液−iPrOH/水 1:2+0.25%のピリジン)を通過させた。純粋なH2N−CMG2−Ad−DOPE(46)を含む画分を合わせて蒸発乾固させ(発泡を防止するために約20%の2−プロパノールを添加した)、残留物を水(約4mL)に溶解し、凍結乾燥させた。H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)の収量は270mg(DOPE−Ad−OSuで68%又はH2N−CMG2−NH2(45)で34%)であった。
Galili−CMG2−Ad−DOPE(47)の調製(比較スキームV)
無水DMSO(6mL)中の化合物34(66mg、0.079mmol)の撹拌溶液に、15μlのEt3N及び粉末H2N−CMG2−Ad−DOPE(46)(95mg、0.0495mmol)を3回に分けて添加した。混合物を室温で24時間撹拌し、次いでカラムクロマトグラフィー(Sephadex(登録商標)LH−20、i−PrOH−H2O、1:2、0.5体積%のPy、0.25体積%のAcOH)にかけて粗化合物47をPy塩の形態で得た。化合物を水から2回凍結乾燥し、その後再び10mlの水に溶解し、化合物47をNa塩の形態で得るために、NaHCO3の水溶液(50mM)をpH6.5になるまで添加して、溶液を凍結乾燥させた。化合物47(Na塩)の収量は114mg(NH2−CMG2−DEに基づくと86%)、Rf0.6(i−PrOH−MeOH−MeCN−H2O、4:3:6:4)であった。1Н NMR(700MHz,D2O−CD3OD,1:1(v/v),40℃;選択されたシグナル)δ,ppm:1.05(t,J7.03Hz,6H;2CH 3 ),1.40−1.58(m,40H;20CH 2 ),1.73−1.87(m,12H;2×−COCH2CH 2CH 2CH2CO及び2×−COCH2CH2−),1.90−1.99(m,2H;OCH2CH 2CH2N),2.15−2.25(m,11H;2×−CH 2CH=CHCH 2−,−NHC(O)CH3),2.39−2.59(2m,合計12H,2×−COCH2CH 2CH 2CH2CO−及び2×−COCH2CH 2−)4.63(dd,1H,J2.51,J12.20,C(O)OCHHCHOCH2O−),4.67及び4.69(2d×1H,J1,27.81,J1,27.95,H−1I,H−1II),5.30(d,1H,J1,23.88,H−1III),5.42−5.46(m,1H,−OCH2−CHO−CH2O−),5.49−5.59(m,4H,2×−CH=CH−);MALDI TOFマススペクトル,M/Z:2567(M+Na);2583(M+K);2589(MNa+Na);2605(MNa+K);2611(MNa2+Na)。
N,N−ジメチルホルムアミド(1ml)中の生成物23(33μmol)の溶液に、30μmolの3−アミノプロピルトリサッカライド33及び5μlのトリエチルアミン(ET3N)を添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2−EtOH−H2O;6:5:1)により収率81%の構築物48を得た。
構築物49を構築物48の調製に用いたのと同じ方法に従って調製した。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーのための溶離液:CH2Cl2−EtOH−H2O;6:5:1、構築物49の収率−84%;
49:1H NMR(700MHz,CDCl3−CD3OD,1:1v/v,選択されたシグナル),δ,ppm:1.05(t,6H,J6.98,2CH 3 ),1.36−1.55(m,40H,20CH 2 ),1.73−1.84(m,8H,COCH2CH 2CH 2CH2CO及び2×(COCH2CH 2−),1.85−1.96(m,2H,O−CH2CH 2CH2−NH),2.14−2.22(m,11H,2×(−CH 2−CH=CH−CH 2−),NHC(O)CH 3),2.45−2.52(m,4H,2×−CH 2−CO),2.36−2.45(m,4H,2×−CH 2−CO),3.29−3.35(m,1H,−CH2−CHH−NH),3.52−3.62(m,3H,PO−CH2−CH 2−NH,−CH2−CHH−NH),4.13−4.18(m,2H,−CHO−CH 2OP−),4.19(d,1H,J3,42.48,H−4II),4.36(dd,1H,J6.8,J12.00,−C(O)OCHHCHOCH2O−),4.56(d,1H,J1,28.39,H−1I),4.60(dd,1H,J2.87,J12.00,C(O)OCHHCHOCH2O−),4.61(d,1H,J1,27.57,H−1II),5.18(d,1H,J1,22.52,H−1III),5.34−5.43(m,1H,−OCH2−CHO−CH2O−),5.45−5.54(m,4H,2×−CH=CH−)Rf0.45(CH2Cl2−EtOH−HF2O;6:5:1)。
コデサイトの調製
構築物(35、47、48及び49)のストック溶液を、赤血球(RBC)保存溶液(CELPRESOL(商標)、CSL社)中1mg/mLの濃度で調製した。希釈する前に、各ストック溶液を室温(rt)で45秒間ボルテックスした。100μLの体積の希釈ストック溶液を、100μLの体積の、遠心で押し固められたRBC(血球容積;PCV)に添加した。合計200μLの体積の懸濁RBCを37℃で2時間インキュベートした後、CELPRESOL(商標)で洗浄し、この改変させたRBC(「コデサイト」)を、CELPRESOL(商標)中5%のPCV濃度に再懸濁させた。
200mgのフェリシアン化カリウム(K3Fe(CN)6)、50mgのシアン化カリウム(KCN)及び140mgのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)及び1mLの非イオン性界面活性剤(Triton(登録商標)X−100)を脱イオン水に溶解し、1Lの体積にした。溶液をガラス瓶中で暗所で貯蔵し、使用前にpHが7.0〜7.4の範囲にあることを確認した。
4.45gのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)をその二カリウム塩(K2H2EDTA)として、及び0.3gの水酸化ナトリウム(NaOH)を、脱イオン水に溶解し、100mLの体積にした。
異なる構築物を用いて調製されたコデサイトが血漿試料中の抗体の存在を検出する能力を、Bovinら(2009)に記載の方法に類似した方法により比較した。結果は表1に示されており、対象の血清中のMUT21結合抗体(存在する場合)に対するアビディティの増大と一致している。
使用前にコデサイトを洗浄し、リン酸緩衝食塩水(PBS)中5%PCVに再懸濁した。1mLの体積のドラブキン溶液に40μLの体積のコデサイト懸濁液を添加し、540nmで測定されたドラブキン溶液(ブランク)に対する吸光度により、RBCの濃度の均一性を確認した。測定された吸光度の変動は、懸濁体積の調整によって10%未満に減少した。
参考文献
Claims (15)
- 下記構造の構築物であって:
Fはリガンドであり、Sはテトラアンテナスペーサであり、Lは共役ホスファチジルエタノールアミドである、構築物。 - Sは下記構造:
のテトラアンテナスペーサであり、ここで、mは1、2又は3の整数であり、Rは下記構造:
のものであり、ここで、Mは一価のカチオン又は置換基であり、nは2、3、4、5、6又は7の整数であり、*はF又はLの結合箇所である、請求項1に記載の構築物。 - MはH+であり、nは整数5である、請求項2に記載の構築物。
- Lは下記構造:
の共役ホスファチジルエタノールアミドであり、ここで、M’は一価のカチオンであり、pは3、4又は5の整数であり、W1及びW2は独立してC16〜20アルキルあるいはモノ−又はジ−不飽和C16〜20アルケニル基から選択され、*はSの結合箇所である、請求項3に記載の構築物。 - 多価リガンド−脂質構築物が、下記の部分構造:
を有する、請求項4に記載の構築物。 - 前記構築物が下記の部分構造:
を有する、請求項5に記載の構築物。 - Fはアミノアルキルグリコシドであり、多価リガンド−脂質構築物が下記構造:
のものであり、ここで、Glycはグリカンであり、q及びrは1、2、3及び4から独立に選択される整数である、請求項6に記載の構築物。 - Glycは、単糖、二糖、三糖及びオリゴ糖:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galβ1−3(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−3GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;Galβ1−4GlcNAc;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN);Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN);SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAβ2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−3GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4Gal;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4(GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−3GlcNAcβ1−4Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAc;SAα2−6Galβ1−4(Fucα1−3)GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcandSAα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−3(Fucα1−4)GlcNAcの群からなる群から選択されるグリカンである、請求項7に記載の構築物。
- Glycは、単糖、二糖、三糖及びオリゴ糖:(Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ2Manα)23,6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ(YDS);Fucα2Galβ(Hdi);Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Leb);Fucα2Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNFPI);Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Ley);Fucα2Galβ4GlcNAcβ(H2);Galα;Galα3(Fucα2)Galβ(Btri);Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Bleb);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(B3);Galα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(B4);Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(B1);Galα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Bley);Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(B2);Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili);Galα4Galβ4GlcNAcβ(P1);Galα4Galβ4Glcβ(Gb3(Pk));Galα4GlcNAcβ(α−LN);GalNAcα3(Fucα2)Galβ(Atri);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(ALeb);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcα(A3);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GalNAcβ(A4);GalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ(A1);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(ALey);GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ(A2);GalNAcα3GalNAcβ(Fs2);GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(Fs5);GalNAcα3Galβ(Adi);GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ;GalNAcβ;GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ(P);GalNH2α3(Fucα2)Galβ(AcqB);Galβ;Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ(Lea);Galβ3GalNAcα(TF);Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ(GA1);Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ(Lex);Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ(i(LN2));Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ(LNnT);Galβ4Glcβ(Lac);GlcAβ3[GlcNAcβ4GlcAβ3]nGlcNAc−aminoalditol(hyaluronate);Manα6(Manα3)Manβ(Man3);Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac3’LN);Neu5Acα3Galβ4Glcβ(Neu5Ac3’Lac);Neu5Acα6GalNAcαβ(SiaTn);Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ(Neu5Ac6’LN)及びNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ(Neu5Gc3’LN)の群からなる群から選択されるグリカンである、請求項8に記載の構築物。
- Glycは、Galα3Galβ4GlcNAcβ(Galili)及びGalNAcα3Galβ4GlcNAcβのうちから選択されるグリカンである、請求項9に記載の構築物。
- Fは、N−マレオイル−β−アラニン結合Cys残基であり、多価リガンド−脂質構築物は下記構造:
のものであり、ここで、Xaaはアミノ酸残基であり、i及びjは独立してゼロ又は整数であり、ただしその合計は5〜30の範囲内にある、請求項6に記載の構築物。 - iは5〜30の範囲の整数であり、jはゼロである、請求項11に記載の構築物。
- iは整数13であり、jはゼロである、請求項12に記載の構築物。
- オリゴペプチドが配列番号01のペプチドである、請求項13に記載の構築物。
- 1つ以上の請求項1〜14のいずれか一項に記載の構築物から本質的になる組成物の腫瘍内注射により、腫瘍を有する患者を治療する方法。
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