JP2013535467A - 組換えにより発現されたインスリンポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

組換えにより発現されたインスリンポリペプチドおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、Ｎ−結合グリカンモチーフを含む組換えにより発現されたインスリンポリペプチドを提供する。前記Ｎ−結合グリカンモチーフは野生型インスリンには存在せず、かつ（例えば、酵母細胞において）グリコシル化インスリンポリペプチドの組換え発現を可能とする。合成グリコシル化インスリンコンジュゲートで得られた結果に基づき、本発明者らは、これらの組換えグリコシル化インスリンポリペプチドが哺乳動物に投与された場合に、該グリコシル化インスリンポリペプチドの少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学特性が、グルコース（またはアルファ−メチルマンノースのような外因性糖）の血清中濃度に感受性であると予測する。例示的なインスリンポリペプチド、これらのインスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、グリコシル化インスリンポリペプチド、医薬製剤および徐放製剤が使用および調製の方法に加えて提供される。
【選択図】図１Ｂ

Description

先行技術（例えば、酵素的に不安定なカプセルからの薬物放出を記載するＳｅａｒｓによる米国特許第４，１４５，４１０号明細書）で知られた「制御−放出」薬物送達システムの大部分は、人体に存在する分子インジケーター（例えば、代謝産物）の量に直接比例する間隔および濃度にて患者に薬物を供給することができない。これらの先行技術システムにおける薬物は、かくして、文字通り「制御」されているのではなく、単に、外部または内部因子から独立した持続性放出様式で供される。インスリン注射剤での真性糖尿病の治療は、インスリンの制御されていない持続性放出が望ましくない、よく知られかつ研究された例である。事実、ホルモンの単純な置き換えは、この病気に関連する病理学的後遺症を予防するのに十分でないことは明らかである。これらの後遺症の開発は、患者によって経験された血中グルコース濃度の変化に比例した外因性インスリンを供する無能力を反映すると信じられている。この問題を解決するために、より多くの生理学的インスリン送達システムを開発するためのいくつかの生物学的およびバイオエンジニアリングアプローチが示唆されている（例えば、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，３４８，３８７号明細書；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，８３０，５０６号明細書、同第５，９０２，６０３号明細書および同第６，４１０，０５３号明細書、およびＺｉｏｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願公開第２００４−０２０２７１９号明細書参照）。
これらのシステムの各々は、多価グルコース結合分子（例えば、レクチンＣｏｎＡ）、および該多価グルコース結合分子によって可逆的に結合される糖ベースの成分の組合せに依拠する。あいにく、ＣｏｎＡおよび他の容易に入手可能なレクチンの多くは、リンパ球増殖を刺激する潜在能力を有する。あるタイプのリンパ球の表面の炭水化物受容体に結合することによって、これらのいわゆる「分裂促進性」レクチンは、潜在的に、リンパ球の有糸分裂を誘導することができ、それにより、それらを増殖させる。ＣｏｎＡを含めたほとんどの分裂促進性レクチンは選択的Ｔ−細胞有糸分裂促進因子である。少数のレクチンは選択性が低く、かつＴ―細胞およびＢ−細胞の双方を刺激する。分裂促進性レクチンへの局所的または全身的インビボ暴露の結果、炎症、細胞傷害性、マクロファージ消化、およびアナフィラキシを含めたアレルギー反応をもたらし得る。加えて、植物レクチンは特に免疫原性であることが知られており、抗−レクチン特異的抗体の高い力価の生成を生じさせる。分裂促進性レクチンは、従って、それらの放出を妨げるのに多大な注意を払うのでなければ、インビボ方法およびデバイスのためにそれらの天然の形態で用いることができないことは認識される。例えば、米国特許第５，８３０，５０６号明細書において、ＴａｙｌｏｒはＣｏｎＡの使用に関連する毒性の危険性を強調しており、およびグルコースおよびインスリン分子がデバイス中におよびデバイスから外へ自由に拡散することも必要とする薬物送達デバイス内にＣｏｎＡを含有する重要性および困難性を強調している。
レクチンのこれらおよび他のインビボ使用に関連する危険性および困難は、レクチンを必要としない代替制御薬物送達システムを提供できれば、かなり減少させることができる。
米国特許第４，３４８，３８７号明細書 米国特許第５，８３０，５０６号明細書 米国特許第５，９０２，６０３号明細書 米国特許第６，４１０，０５３号明細書 米国特許出願公開第２００４−０２０２７１９号明細書
本開示は、Ｎ−結合グリカンモチーフを含む組換えにより発現されたインスリンポリペプチドを提供する。該Ｎ−結合グリカンモチーフは野生型インスリンには存在せず、および（例えば、酵母細胞において）グリコシル化インスリンポリペプチドの組換え発現を可能とする。合成グリコシル化インスリンコンジュゲートで得られた結果に基づき、本発明者らは、これらの組換えグリコシル化インスリンポリペプチドが哺乳動物に投与されると、グリコシル化インスリンポリペプチドの少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性はグルコース（またはアルファ−メチルマンノースのような外因性糖）の血清中濃度に対して感受性になると予測する。例示的なインスリンポリペプチド、これらのインスリンポリペプチドをコードするポリペプチド、グリコシル化インスリンポリペプチド、医薬製剤および徐放性製剤が使用および調製の方法に加えて提供される。
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、およびグルコース（Ｇｌｃ）を含めた異なる糖の構造である。 Ｎ−結合グリカンモチーフに追加することができる代表的なＮ−グリカン構造である。 ヒトにおける代表的なＮ−グリコシル化経路である。 複雑なＮ−グリコシル化に至る酵母における代表的なＮ−グリコシル化経路。ＭｎＴはマンノシルトランスフェラーゼである。 酵母における代表的な修飾されたＮ−グリコシル化経路である。１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、Ｏｃｈｌｐ遺伝子が欠失された酵母における修飾された経路である。 酵母における代表的な修飾されたＮ−グリコシル化経路である。１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、Ｏｃｈｌｐ遺伝子および１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、ＡＬＧ３遺伝子が欠失した酵母における修飾された経路。ＭｎＳはマンノシダーゼである。 いくつかの例示的な合成インスリンコンジュゲートの化学構造である。 いくつかの例示的な合成インスリンコンジュゲートの化学構造である。 合成インスリンコンジュゲートＩ−６（Ｂ２９結合ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２）の化学構造である。 合成コンジュゲートＩ−６の長時間作用プロタミン亜鉛（ＰＺＩ）形成を伴う、時刻０における非―糖尿病雄ＳＤラット（用量当たりｎ＝３）における皮下注射、続いての、２４０分におけるグルコース（４ｇ／ｋｇ）のＩＰ注射に続いての血清中インスリン（◆）および血中グルコース（○）レベルのプロットである。示されるように、低血糖症は初期または後期の時点として観察されない。応答と５Ｕ／ｋｇ（左側）および１５Ｕ／ｋｇ（右側）用量との比較は、劇的な用量−依存性グルコース応答を示す。 合成コンジュゲートＩ−６の長期作用ＰＺＩ形成を伴う、時刻０における非糖尿病性（正常）および糖尿病性（ＤＭの）雄ＳＤラットにおける皮下注射に続いての血中グルコースレベルのプロットである。該コンジュゲートは５、１０および２０Ｕ／ｋｇで投与した。示されたように、非糖尿病性雄ＳＤラットはいずれの低血糖症も示さず、他方、糖尿病性雄ＳＤラットにおけるグルコースレベルは、最高用量において８時間にわたって継続した明瞭な用量比例応答を示した。 合成コンジュゲートＩ−６の長期作用ＰＺＩ形成を伴う、時刻０における非糖尿病性（正常）および糖尿病性（ＤＭの）雄ＳＤラットにおける皮下注射に続いての血中グルコースレベルのプロットである。該コンジュゲートは５、１０および２０Ｕ／ｋｇで投与した。示されたように、非糖尿病性雄ＳＤラットはいずれの低血糖症も示さず、他方、糖尿病性雄ＳＤラットにおけるグルコースレベルは、最高用量において８時間にわたって継続した明瞭な用量比例応答を示した。 合成コンジュゲートＩ−６または組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の注射に続いての（左側）およびグルコースまたはアルファ−メチルマンノースの有りおよび無しでの合成Ｉ−６の注射に続いての（右側）時間の関数としての血清中インスリン濃度のプロットである。 非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）におけるＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）または合成コンジュゲートＩ−６（１５ｍＵ／分）の一定の静脈内（ｉ．ｖ．）注入に続いての血清中インスリン（◆）および血中グルコース（○）レベルのプロットである。グルコース（１、２または４ｇ／ｋｇ）のＩＰ注射は２４０分において与えた。 非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）におけるＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）または合成コンジュゲートＩ−６（１５ｍＵ／分）の一定の静脈内（ｉ．ｖ．）注入に続いての血清中インスリン（◆）および血中グルコース（○）レベルのプロットである。グルコース（１、２または４ｇ／ｋｇ）のＩＰ注射は２４０分において与えた。 非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）におけるＲＨＩ（３．５ｍＵ／分）または合成コンジュゲートＩ−６（１５ｍＵ／分）の一定の静脈内（ｉ．ｖ．）注入に続いての血清中インスリン（◆）および血中グルコース（○）レベルのプロットである。グルコース（１、２または４ｇ／ｋｇ）のＩＰ注射は２４０分において与えた。 緩衝化（ＢＭＭＹ）および非緩衝化（ＭＭＹ）条件下で成長させたＧＳＩ１５株クローンからの精製されていない培養上清収量である。ＥＬＩＳＡ分析（ＩＳＯ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いる種々のクローン（「クローン番号」とは、異なるゲネチシンプレート抵抗レベルから得られたクローンをいう）からのｍｇ／Ｌで表したインスリンポリペプチド収量である。 緩衝化（ＢＭＭＹ）および非緩衝化（ＭＭＹ）条件下で成長させたＧＳＩ１５株クローンからの精製されていない培養上清収量である。生産されたインスリンポリペプチドの分子量を示すクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、収量比較目的での２５０ｍｇ／Ｌにおける、頂部右側ゲルのレーン１４において、および底部右側ゲルのレーン２において示される。 緩衝化条件下で成長させたＫＭ７１株クローンからの精製されていない培養上清収量である。ＥＬＩＳＡ分析（ＩＳＯ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いる種々のクローン（「クローン番号」とは、異なるゲネチシンプレート抵抗レベルから得られたクローンをいう）からのｍｇ／Ｌで表したインスリンポリペプチド収量である。 緩衝化条件下で成長させたＫＭ７１株クローンからの精製されていない培養上清収量である。生産されたインスリンポリペプチドの分子量を示すクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、収量比較目的で、頂部右側ゲル（６０から５００ｍｇ／Ｌ）のレーン１５から１８において、および底部右側ゲル（３０から５００ｍｇ／Ｌ）のレーン５から９において示される。 非緩衝化条件下で成長させたＫＭ７１株クローンからの精製されていない培養上清収量である。ＥＬＩＳＡ分析（ＩＳＯ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いる種々のクローン（「クローン番号」とは、異なるゲネチシンプレート抵抗レベルから得られたクローンをいう）からのｍｇ／Ｌで表したインスリンポリペプチド収量である。 非緩衝化条件下で成長させたＫＭ７１株クローンからの精製されていない培養上清収量である。生産されたインスリンポリペプチドの分子量を示すクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、収量比較目的で、頂部右側ゲル（２５０および１００ｍｇ／Ｌ）のレーン８および９において、および底部右側ゲル（２５０ｍｇ／Ｌ）のレーン１８に示される。 ＡＬＰ消化の前および後におけるＫＭ７１ ＲＨＩ−１ Ａ−Ｅブロスのウェスタンブロットである。「−」は酵素無しを示し「＋」は酵素消化を伴うことを示す。レーン：１蛋白質ラダー、２ペプチドラダー、３ＲＨＩ−、４ＲＨＩ＋、５ＲＨＩ−１ Ａ−、６ＲＨＩ−１ Ａ＋、７ＲＨＩ−１ Ｂ−、８ＲＨＩ−１ Ｂ＋、９ＲＨＩ−１ Ｃ−、１０ＲＨＩ−１ Ｃ＋、１１ＲＨＩ−１ Ｄ−、１２ＲＨＩ−１ Ｄ＋、１３ＲＨＩ−１ Ｅ−、１４ＲＨＩ−１ Ｅ＋。 ＡＬＰ消化の前および後におけるＧＳ１１５ ＲＨＩ−１ Ａ−Ｅブロスのウェスタンブロットである。「−」は酵素無しを示し「＋」は酵素消化を伴うことを示す。レーン：１蛋白質ラダー、２ペプチドラダー、３ＲＨＩ−、４ＲＨＩ＋、５ＲＨＩ−１ Ａ−、６ＲＨＩ−１ Ａ＋、７ＲＨＩ−１ Ｂ−、８ＲＨＩ−１ Ｂ＋、９ＲＨＩ−１ Ｃ−、１０ＲＨＩ−１ Ｃ＋、１１ＲＨＩ−１ Ｄ−、１２ＲＨＩ−１ Ｄ＋、１３ＲＨＩ−１ Ｅ−、１４ＲＨＩ−１ Ｅ＋。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 他の例示的な合成インスリンコンジュゲートＩ−１からＩ−５およびＩ−７からＩ−１８の化学構造である。これらの例示的な合成インスリンコンジュゲートのいくつかで得られた実験結果を図１６以降に示す。 ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＭ−２コンジュゲートＩ−１（３．５Ｕ／ｋｇ）での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射に続いての血清中インスリン（左側）および血中グルコース（右側）レベルのプロットである。 ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−２Ｉ−３コンジュゲート（５Ｕ／ｋｇ）での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射に続いての血清中インスリン（左側）および血中グルコース（右側）レベルのプロットである。 ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＢＭ−１ ＡＥＴＭ−１コンジュゲートＩ−４（５Ｕ／ｋｇ）での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射に続いての血清中インスリン（左側）および血中グルコース（右側）レベルのプロットである。 ＴＳＡＴ−Ｃ６−ＡＥＴＭ−２コンジュゲートＩ−２（５Ｕ／ｋｇ）での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射に続いての血清中インスリン（左側）および血中グルコース（右側）レベルのプロットである。 グルコース、アルファ−メチルマンノースまたは生理食塩水注入の間における非糖尿病性ミニブタにおけるβ−相消失半減期の結果である。 デュアル血管アクセスポート（実験当たりｎ＝３）を備えた非糖尿病性雄ユカタン（Ｙｕｃａｔａｎ）ミニブタへの０．１Ｕ／ｋｇ静脈内（Ｉ．Ｖ）注射に続いての組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）コンジュゲートＩ−１１の血清中濃度のプロットである。各実験において、動物には（◆）ｉ．ｖ．アルファメチルマンノース（ａ−ＭＭ）溶液（８０ｍｌ／時間の一定速度で注入された２５％ｗ／ｖ）を注入するか、または（▲）溶液を注入しなかった。データは、２−コンパートメント２重指数モデルに由来する曲線との平均値フィットとしてプロットした。 デュアル血管アクセスポート（実験当たりｎ＝３）を備えた非糖尿病性雄ユカタン（Ｙｕｃａｔａｎ）ミニブタへの０．１Ｕ／ｋｇ静脈内（Ｉ．Ｖ）注射に続いてのＤｉ−Ｓｕｂ−ＡＥＴＭ−２インスリンコンジュゲートＩ−１１の血清中濃度のプロットである。各実験において、動物には（◆）ｉ．ｖ．アルファメチルマンノース（ａ−ＭＭ）溶液（８０ｍｌ／時間の一定速度で注入された２５％ｗ／ｖ）を注入するか、または（▲）溶液を注入しなかった。データは、２−コンパートメント２重指数モデルに由来する曲線との平均値フィットとしてプロットした。 ｉ．ｖ．糖注入無しの条件下での０．１Ｕ／ｋｇにおけるコンジュゲートのｉ．ｖ．注射に続いての、デュアル血管アクセスポート（実験当たりｎ＝３）を備えた非糖尿病性雄ユカタンミニブタでの血中グルコース低下曲線である。（■）ＲＨＩ、（◆）Ｉ−６、（○）Ｉ−７、（▲）Ｉ−１５，および（●）Ｉ−１１。 ｉ．ｖ．アルファメチルマンノース（ａ−ＭＭ）注入（８０ｍｌ／時間の一定速度で注入された２５％ｗ／ｖ）の条件下での０．１Ｕ／ｋｇにおけるコンジュゲートのｉ．ｖ．注射に続いての、デュアル血管アクセスポート（実験当たりｎ＝３）を備えた非糖尿病性雄ユカタンミニブタでの血中グルコース低下曲線である。（■）ＲＨＩ、（◆）Ｉ−６、（○）Ｉ−７、（▲）Ｉ−１５，および（●）Ｉ−１１。 ０．２５、０．５０、および１．００Ｕ／ｋｇの用量の可溶性Ｄｉ−Ｓｕｂ−ＡＥＴＭ−２インスリンコンジュゲートＩ−１１での時刻０におけるｓｕｂ−Ｑ注射後の絶食条件下での（ａ、―、塗り潰した記号）アロキサン−糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）および（ｂ、‐‐‐‐、塗り潰していない記号）非糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）における血中グルコースレベルである。データは、平均値＋１標準偏差としてプロットする。 ０．２５、０．５０、および１．００Ｕ／ｋｇの用量の可溶性Ｄｉ−Ｓｕｂ−ＡＥＴＭ−２インスリンコンジュゲートＩ−１１での時刻０におけるｓｕｂ−Ｑ注射後の絶食条件下での（ａ、―、塗り潰した記号）アロキサン−糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）および（ｂ、‐‐‐‐、塗り潰していない記号）非糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）における血中グルコースレベルである。データは、平均値＋１標準偏差としてプロットする。スケールは明瞭性のために拡大されている。 （▲、△）０．０６３および（■、□）０．１２５Ｕ／ｋｇの用量の可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）での時刻０におけるｓｕｂ−Ｑ注射後の絶食条件下での、（ａ、―塗り潰した記号）アロキサン糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）および（ｂ、‐‐‐‐、塗り潰していない記号）非糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）における血中グルコースレベルである。データは平均値＋１標準偏差としてプロットされる。 （▲、△）０．０６３および（■、□）０．１２５Ｕ／ｋｇの用量の可溶性組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）での時刻０におけるｓｕｂ−Ｑ注射後の絶食条件下での、（ａ、―塗り潰した記号）アロキサン糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）および（ｂ、‐‐‐‐、塗り潰していない記号）非糖尿病性ユカタンミニブタ（用量当たりｎ＝３）における血中グルコースレベルである。データは平均値＋１標準偏差としてプロットされる。スケールは明瞭性のために拡大されている。 さらなるインスリンコンジュゲートについてのミニブタにおけるｉ．ｖ．半減期結果のまとめである。 糖尿病性および正常ミニブタにおける０．２５、０．５および１Ｕ／ｋｇインスリンコンジュゲートＩ−１１の単一皮下注射後における血清中インスリンレベルのプロットである。 ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３コンジュゲートＩ−１４での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射、続いての、１５分後のアルファ−メチルマンノース（左側）または生理食塩水（右側）のＩＰ注射に続いての、血清中インスリンおよび血中グルコースレベルのプロットである。アルファ−メチルマンノースは、ＣｏｎＡのようなレクチンへの結合に対してＡＥＭと競合することができる非常に高い親和性の糖である。示されたように、アルファ−メチルマンノースの注射に由来するＰＫ／ＰＤプロフィールの変化は有意である（ｐ＜０．０５）。 ＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３コンジュゲートＩ−１５での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（ｎ＝３）における皮下注射、続いての１５分後におけるアルファ−メチルマンノース（左側）または生理食塩水（右側）のＩＰ注射に続いての、血清中インスリンおよび血中グルコースレベルのプロットである。アルファ−メチルマンノースは、ＣｏｎＡなどのレクチンへの結合に対してＡＥＭと競合することができる非常に高い親和性の糖である。示されるように、アルファ−メチルマンノースの注射に由来するＰＫ／ＰＤプロフィールの変化は有意である（ｐ＜０．０５）。 長時間作用型コンジュゲート処方での時刻０における非糖尿病性雄ＳＤラット（用量当たりｎ＝３）における皮下注射、続いての２４０分におけるグルコース（４ｇ／ｋｇ）のＩＰ注射に続いての、血清中インスリン（◆）および血中グルコース（○）レベルのプロットである。コンジュゲートはＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３（Ｉ−１４）およびＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３（Ｉ−１５）である。
本出願は、特許および非特許文献を含めた多数の文献に言及する。これらの文献の各々の全体をここに引用して援用する。
一態様において、該開示は、グルコースなどの糖の全身濃度に対して応答性である様式で、組換えにより発現されたインスリンポリペプチドの薬物動態学的（ＰＫ）および／または薬力学的（ＰＤ）プロフィールを制御する方法を提供する。本明細書中で議論するように、これらの方法は、部分的には、高親和性糖リガンドを含むある種の合成インスリン−コンジュゲート（例えば、図５および６におけるもの参照）が、ＣｏｎＡのような外因性多価糖−結合分子の不存在下においてさえ、糖濃度変化に応答するＰＫ／ＰＤプロフィールを呈するという発見に基づいている。この知見は予期せぬことであり、単純なレクチン−遊離糖−応答性薬物システムを生じさせる先例のない機会を提供した。
Ｉ−６として知られたそのような合成インスリン−コンジュゲートの１つの例を図６に示す。コンジュゲートＩ−６は、２つのアミノエチルトリマンノース（ＡＥＴＭ）糖部位を持つ個別的な低分子量合成フレームワーク（トリススクシンイミジル（６−アミノカプロイル）アミノトリアセテートまたはＴＳＡＴ−Ｃ６）を含む。該フレームワークは、Ｂ２９イプシロン−アミノ基を介してインスリンに共有結合している（野生型ヒトインスリンは、位置Ｂ２９においてリシン残基を有する）。実施例において議論するように、コンジュゲートＩ−６はグルコース−応答性薬物動態学を呈する。その結果、コンジュゲートＩ−６の利用性および、従って、生物活性は内因性グルコースレベルに応答して変化する。本発明者らは、低血糖症を誘導することなく、要求に応じての基礎およびボーラスインスリン「送達」の双方を提供するプロタミンおよび亜鉛（ＰＺＩ処方）を用いてコンジュゲートＩ−６の徐放性製剤を調製した。対照的に、慣用的なインスリンは迅速−作用性（例えば、ＲＨＩ）または遅延−作用性（例えば、ランタス（Ｌａｎｔｕｓ））のいずれかであり、グルコースレベルの変化に応答してプロフィールを変化させることができない。糖尿病性および正常ラットにおける慣用的なインスリンと比較すると、コンジュゲートＩ−６は治療用量の４倍の低血糖症の最小危険性を伴って、実質的に改良された治療ウィンドウを示す。
重要なことには、本発明者らの研究は、コンジュゲートＩ−６によって使用されたＴＳＡＴ−Ｃ６フレームワークはグルコース−応答性活性で必要とされないことを示した。事実、本発明者らは、図１５に描かれたもののような他のインスリン−結合フレームワークが同様な結果を提供できることを見出した（例えば、実施例１３から１７参照）。本発明者らの研究は、結合された糖のタイプおよび数および、ある状況においては、インスリン分子上への結合の点はインビボグルコース−応答を変調するにおいて、より重要な役割を演じていることも示唆する。
いかなる特定の理論に拘束されるつもりはないが、Ｉ−６のようなコンジュゲートによって呈されるグルコース−応答性は内因性レクチンへの結合によって媒介されると考えられる。かくして、本発明者らは、身体中のグルコースレベルが低いと、内因性レクチンは合成インスリン−コンジュゲートによる結合で利用可能なグルコース結合部位を有し、コンジュゲートのインスリン様活性を実質的に不活化すると理論付ける。逆に、身体中のグルコースレベルが高いと、レクチン上の結合部位は内因性グルコースによって満足され、かくして、合成インスリン−コンジュゲートを循環させ、その効果を発揮させる。図５は、４種の糖の相対的なレクチン結合親和性を示し：ＡＥＴＭは示された４種の糖の最高親和性で持ってレクチンに結合する。本発明者らは、特定の糖のレクチン結合親和性は、少なくとも、部分的には、本発明者らの合成インスリン−コンジュゲートのインビボグルコース−応答性の変調を担うと理論付ける。
Ｉ−６のようなコンジュゲートは化学合成によって生産される。実施例１から３に記載されているように、合成プロセスは複雑であって、フレームワークがまず１以上の糖リガンドにコンジュゲートし、次いで、組換えインスリンにコンジュゲートする一連の工程を含む。加えて、コンジュゲーションプロセスは純粋なコンジュゲートを生じさせない。従って、生成物は、コンジュゲートしたおよびコンジュゲートしていない物質を分離するための適当な固相を用いるサイズ排除によって精製される。次いで、コンジュゲートをさらに精製して、分取用逆相ＨＰＬＣを用いて所望の生成物を得る。一旦収集すれば、溶液を回転蒸発させて、有機溶媒を除去し、および凍結乾燥する。そのような合成プロセスは大規模な生産のための課題を示す。本開示は、部分的には、生合性経路を介してインスリンコンジュゲートを生産する代替法がこれらの合成方法よりも優れた有意な利点を提供するという認識に由来する。
組換えインスリンポリペプチド
一態様において、本開示は、Ｎ−結合グリカンの共有結合を可能とするモチーフを含めるように作成された組換えにより発現されたインスリンポリペプチドを提供する。これはこれらのモチーフの１以上を持つインスリンポリペプチドを含むと認識される。当該分野で知られているように、これらの「Ｎ−結合グリカンモチーフ」の配列はＡｓｎ−Ｘａａ’［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：６７３−７０２，１９７２）。Ｎ−結合グリカンは、Ａｓｎ残基のようなデルタ−アミノ基を介してモチーフに共有結合することができる。
インスリン
ヒトインスリンの野生型配列は以下に示され、Ｎ−結合グリカンモチーフを含まない。
Figure 2013535467
 当該分野でよく知られているように、ヒトにおける膵臓島のβ−細胞はプロインスリンとして知られたインスリンの一本鎖前駆体を分泌する。ヒトにおいて、プロインスリンは配列：［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］を有し、ここにおいて、Ｃ−ペプチドは配列番号：２２：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの配列との連結ペプチドである。
ヒトにおいては、膵臓島のβ−細胞による生物活性インスリンポリペプチドの分泌に先立って、２つの二塩基部位、Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ａｒｇにおける開裂によってＣ−ペプチドはプロインスリンから除去される。先に示されたように、該開裂は生物活性インスリンポリペプチドを、Ａ−ペプチド内に１つのジスルフィド結合を持ち、２つのジスルフィド結合によって連結された別々のＡ−およびＢ−ペプチドとして放出する。
全ての生物がヒトプロインスリン配列を認識し、かつ正しく処理するのではない。例えば、ある実施形態において、酵母は代替プロインスリン配列：［リーダーペプチド］−［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］を利用することができる。
酵母のプロインスリン配列において、リーダーペプチドは、酵母におけるインスリンポリペプチドの適切な開裂を促進すると考えられており、例えば、配列：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号：２３）またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号：２４）を含むことができる。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドはＸａａ’’−Ｐｒｏ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］の配列を有し、ここにＸａａ’’は：
・長さが少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５アミノ酸であり、または
・長さが５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、５０以下のアミノ酸であり；および
・少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のを酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐおよび／またはＧｌｕ）を含む。
いくつかの実施形態において、リーダーペプチドはそのＣ−末端にアミノ酸Ｐｒｏ−Ｌｙｓを含有する。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドはそのＣ−末端にアミノ酸Ｐｒｏ−Ａｒｇを含有する。
加えて、ヒトプロインスリンで見出された長いＣ−ペプチド連結セグメントの代わりに、人工的に作り出した酵母プロインスリン配列はかなり短いＣ−ペプチド配列、例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号：１６）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号：１７）またはＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号：２５）を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドはＸａａ’’’−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］の配列を有し、ここにおいて、Ｘａａ’’’は：
・欠落しており、または長さが少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０アミノ酸であり；
・長さが２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、９以下、１０以下、１５以下、２０以下、または２５以下のアミノ酸であり；または
・長さが正確に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸である。
いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドはヒトプロインスリンで見出されるのと異なるアミノ酸配列を有する。一般に、Ｃ−ペプチドとは、インスリンＡ−鎖およびＢ−鎖の間で見出されるプロインスリン中のいずれかのアミノ酸配列をいう。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドとは、インスリンＡ−鎖およびＢ−鎖の間に見出され、かつ酵素により開裂されて、生物活性インスリン分子を生じるプロインスリン中のいずれかのアミノ酸配列をいう。
いかなる特定の理論にも拘束されるつもりはないが、これらのリーダー配列およびＣ−ペプチドリーダー配列の組合せは、酵母からの機能的インスリンの生産を可能とすると考えられる。
後により詳細に記載されるように、いくつかの実施形態において、プロインスリンは、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフ（例えば、１、２、３以上のＮ−結合グリカンモチーフ）を含む。いくつかの実施形態において、生物活性インスリンポリペプチド（すなわち、Ａ−ペプチド内の１つのジスルフィド結合を持ち、２つのジスルフィド結合によって連結された別々のＡ−およびＢ−ペプチド）は、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフ（例えば、１、２、３またはそれ以上のＮ−結合グリカンモチーフ）を含む。いくつかの実施形態において、プロインスリンは少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含み、酵素開裂の後に、生物活性インスリンポリペプチドは、プロインスリン配列に存在した全Ｎ−結合グリカンモチーフを依然として含む。いくつかの実施形態において、プロインスリンは、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含み、酵素開裂の後に、生物活性インスリンポリペプチドは全Ｎ−結合グリカンモチーフをもはや含まない。いくつかの実施形態において、プロインスリンは、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含み、酵素開裂の後に、生物活性インスリンポリペプチドは全Ｎ−結合グリカンモチーフをもはや含まないが、Ｎ−結合グリカンが共有結合されていてもよいＡｓｎ残基を依然として含む。これは、例えば、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフ内でプロインスリンの開裂が発生すれば起こり得る。例えば、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＸａａ’がＬｙｓであって、開裂がＬｙｓ残基のＣ−末端側で起これば、生物活性インスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフからのＡｓｎ−Ｌｙｓ残基を含むに過ぎない。同様に、Ｎ−結合グリカンモチーフ中のＸａａ’がＡｒｇであって、開裂がＡｒｇ残基のＣ−末端側で起こるならば、生物活性インスリンポリペプチドは、Ｎ−結合グリカンモチーフからのＡｓｎ−Ａｒｇ残基を含むに過ぎない。
本開示は、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含むヒト・インスリン・ポリペプチド（すなわち、ヒトプロインスリンまたは生物活性ヒト・インスリン・ポリペプチド）に限定されない。一般に、本開示は、本開示に従って修飾されており、かつインスリン様生物活性を保有する（すなわち、適当な用量でインビボにて適当な種に投与した場合にグルコースにおいて検出可能な還元を引き起こすことができる）いずれかのヒトまたは非ヒトインスリンを含む。例えば、以下に議論するように、本開示は、少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含む修飾されたブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリン等も含む。
以下でより詳細に議論するように、Ｎ−結合グリカンモチーフは、（付加が挿入を含む場合）１以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって野生型インスリン配列内の種々の部位に導入することができる。本開示のインスリンポリペプチドは、Ｎ−結合グリカンモチーフを導入するように作成された突然変異に加えて、修飾を含んでもよいのは理解されるべきである。種々の修飾されたインスリンが、当該分野で公知である（例えば、Ｃｒｏｔｔｙ ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｍｅｒｇ．Ｃａｒｅ．２３：９０３−９０５，２００７およびＧｅｒｉｃｈ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：３０８−１６，２００２およびそこに引用された文献参照）。インスリンの修飾された形態は（例えば、以下に記載されるようなＰＥＧ基または脂肪アシル鎖のような化学的部位の付加によって）化学的に修飾されおよび／または（すなわち、Ｎ−グリカン結合モチーフを導入するように突然変異されているもの以外のアミノ酸の付加、欠失または置換によって）突然変異されていてもよい。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは１から１０（例えば、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３、１から２、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、２から４、２から３、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、３から４、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から９、５から８、５から７、５から６、６から９、６から８、６から７、７から９、７から８、８から９、９、８、７、６、５、４、３、２または１）のアミノ酸の置換、付加および／または欠失だけ野生型インスリンから異なる。ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはアミノ酸置換のみによって、野生型インスリンから異なる。ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはアミノ酸付加のみによって野生型インスリンから異なる。ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、アミノ酸の置換および付加の双方によって野生型インスリンから異なる。ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、アミノ酸の置換および欠失の双方によって野生型インスリンから異なる。
ある実施形態において、アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両性の性質における同様性に基づいてなすことができる。ある実施形態において、置換は保存的とすることができ、すなわち、１つのアミノ酸が同様な形状および電荷のものと置換される。保存的置換は当該分野でよく知られており、典型的には、以下の群グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アロゲニン；およびチロシン、フェニルアラニン内の置換を含む。ある実施形態において、アミノ酸の疎水性指標が適当な突然変異を選択するにおいて考慮してもよい。ポリペプチドに相互作用生物学的機能を付与するにおける疎水性アミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている。別法として、同様なアミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的になすことができる。ポリペプチドの相互作用生物学的機能を付与するにおける親水性の重要性は当該分野において一般的に理解されている。ポリペプチドの設計における疎水性指標または親水性の使用は、さらに、米国特許第５，６９１，１９８号明細書において議論されている。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは式Ｉにおいて以下に示された配列番号：２６のアミノ酸配列（Ａ−ペプチド）および配列番号：２７のアミノ酸配列（Ｂ−ペプチド）を含む。
Figure 2013535467
 ［ここにおいて、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、コード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落しており；位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１５、Ａ１８、Ａ２０およびＡ２１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸である；位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、およびＢ３０の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸であるか、または欠落しており；および位置Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３およびＢ２１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸であり、但し、配列番号：２６および／または配列番号：２７はモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。本明細書中で用いるように、「Ｘａａ’がＰｒｏでないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］」を含むアミノ酸配列への言及は、１以上のモチーフを持つアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、アミノ酸配列は単一の「Ｘａａ’がＰｒｏでないＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］」モチーフを含む。いくつかの実施形態において、配列番号：２６はモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏでない。いくつかの実施形態において、配列番号：２７はモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。
本明細書中で用いるように、「コード化可能なアミノ酸」は、標準的な遺伝子暗号によってポリペプチド合成のために直接的にコードされた２０アミノ酸のうちのいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から５０のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から２５のコード化可能なアミノ酸の配列であるかまたは欠落している。
ある実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から１０のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から９のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から８のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から７のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から６のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から５のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から４のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２から３のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸、２のコード化可能なアミノ酸の配列であるか、または欠落している。
以下により詳細に議論されるように、Ａ−およびＢ−ペプチドは（ａ）（プロインスリンにおけるように）単一の連続アミノ酸配列内に含まれ得るか、または（ｂ）（生物活性インスリンにおけるように）１以上のジスルフィド架橋を介して連結されている不連続ペプチドであってよいと理解される。種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、野生型インスリンに見出される３つのジスルフィド架橋を含む（すなわち、Ａ−ペプチドの位置７およびＢ−ペプチドの位置７の間の１つ、Ａ−ペプチドの位置２０およびＢ−ペプチドの位置１９の間の第二のもの、およびＡ−ペプチドの位置６および１１の間の第三のもの）。
かくして、本開示は、具体的には、配列番号：１および配列番号：２の不連続Ａ−ペプチドおよびＢ−ペプチド配列を有する式Ｉのインスリンポリペプチド、および式Ｉ’に示されたような３つのジスルフィド架橋も含む。
Figure 2013535467
 本開示は、Ａ−およびＢ−ペプチドが単一の連続アミノ酸配列内に含まれる式Ｉのインスリンポリペプチドも含む。例えば、ある実施形態において、Ａ−およびＢ−ペプチドは以下のように「Ｃ−ペプチド」によって分離されていてよい：［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］（ここにおいて、Ｃ−ペプチドはＢ−ペプチドのＣ−末端をＡ−ペプチドのＮ−末端と連結させる）。ある実施形態において、Ａ−およびＢ−ペプチドは「Ｃ−ペプチド」によって分離されていてよく、かつ以下のようにリーダーペプチド配列を含んでよい：［リーダーペプチド］−［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］。ここにおいて、リーダーペプチドは配列番号：２３のリーダーペプチド、配列番号：２４のリーダーペプチドまたはＸａａ’’−Ｐｒｏ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］の配列を有するリーダーペプチドであってよく、ここにおいて、Ｘａａ’’は：
・長さが少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５のアミノ酸であり、または
・長さが５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、５０以下のアミノ酸；
・少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐおよび／またはＧｌｕ）を含む。
いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドは配列番号：３のヒトプロインスリンＣ−ペプチドであってよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなある微生物においては、ヒトプロインスリンの発現は開裂された生物活性インスリンポリペプチド生産をもたらさない。その代わり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたプロインスリン前駆体は、Ａ−およびＢ−ペプチドの間のジスルフィド結合形成前に迅速な酵素開裂を受ける。これらの場合において、非ジスルフィド結合ポリペプチドは不活性であって、従って、非機能性インスリン分子である。
生物活性インスリンポリペプチドの生産において酵母を利用するために、プロテアーゼによって容易に消化されない代替プロインスリン配列が同定されており、従って、それを用いて機能的インスリンポリペプチドを生じさせることができる。これらの代替プロインスリン配列はＣ−ペプチドをより短いペプチド配列で、リシン、および／またはアルギニンいずれかの２つほどのアミノ酸で置き換える。かくして、いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドは配列番号：１６、配列番号：１７、または配列番号：２５のＣ−ペプチドであってよい。これらのプロインスリンポリペプチドはより安定であって、インビトロで処理して、生物活性インスリンポリペプチドを得ることができる（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：６７６６−６７７７０，１９８６）。これらおよび他の修飾されたプロインスリンポリペプチドは米国特許第５，９６２，２６７号明細書、同第６，５２１，７３８号明細書、同第６，５５８，９２４号明細書、同第６，６１０，６４９号明細書、同第６，７７７，２０７号明細書、同第７，１０５，３１４号明細書、同第７，０８７，４０８号明細書において、また、国際公開第９５／１６７０８号パンフレット、欧州特許第００５５９４５号明細書、同第１６３５２９号明細書、同第０３４７８４５号明細書および同第０７４１１８８号明細書において詳細に記載されている。本開示は、これらの代替Ｃ−ペプチド配列のうちの１つを含むいずれの［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］インスリンポリペプチドも含むと理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドはヒトプロインスリンに見出されるのと異なるアミノ酸配列を有する。一般に、Ｃ−ペプチドとは、インスリンＡ−鎖およびＢ−鎖の間に見出されるプロインスリンにおけるいずれのアミノ酸配列もいう。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドとは、インスリンＡ−鎖およびＢ−鎖の間に見出されているプロインスリンにおけるいずれのアミノ酸配列もいい、これは開裂され、および最終のインスリン生成物から除去される。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドはＸａａ’’’−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］の配列を有するＣ−ペプチドであり、ここにおいて、Ｘａａ’’’は：
・欠落しているか、または長さが少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０アミノ酸であり；
・長さが２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１５以下、２０以下、または２５以下のアミノ酸であり；または
・長さが、正確には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸である。
いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチド配列は酵母細胞中の組換えインスリンポリペプチドから開裂される。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチド開裂部位は２つの隣接する塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇ）。いくつかの実施形態において、Ｃ−ペプチドはインビトロで開裂される。Ｃ−ペプチドのインビトロ開裂は当該分野で知られたいずれかの開裂部位、例えば、臭化シアンによって開裂可能なＭｅｔ；トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼ、Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼによってまたはカルボキシペプチダーゼプロテアーゼによって開裂可能な単一の塩基性アミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基（ＬｙｓまたはＡｒｇ）の対を用いて達成することができる。ある実施形態において、Ｃ−ペプチド切断部位は単一の塩基性アミノ酸残基ＬｙｓまたはＡｒｇ、好ましくはＬｙｓである。
ある実施形態において、式ＩまたはＩ’におけるＡ−およびＢ−ペプチドの位置の１以上におけるＸａａは以下の表１および２に記載された選択肢から選択される。
Figure 2013535467
Figure 2013535467
 ある実施形態において、式Ｉのインスリンポリペプチドは、式ＩＩにおいて以下に示されたように、配列番号：２８のアミノ酸配列（Ａ−ペプチド）および配列番号：２９のアミノ酸配列（Ｂ−ペプチド）のアミノ酸配列を含む。
Figure 2013535467
 本開示は、式ＩＩ’において示されたように、不連続Ａ−およびＢ−ペプチド配列を有する式ＩＩのインスリンポリペプチド、および３つのジスルフィド架橋も具体的に含む。
Figure 2013535467
 いくつかの実施形態において、式Ｉ、Ｉ’、ＩＩまたはＩＩ’のインスリンポリペプチドは以下の表３に示されたものから選択された位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＢ３０におけるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、式Ｉ、Ｉ’、ＩＩまたはＩＩ’のインスリンポリペプチドは単一の種についての以下の表３に示されたものから（例えば、ヒト配列またはＡ８におけるＴｈｒ、Ａ９におけるＳｅｒ、Ａ１０におけるＩｌｅおよびＢ３０におけるＴｈｒから）選択される位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、およびＢ３０におけるアミノ酸を含む。
Figure 2013535467
 種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＢ−ペプチド配列のＢ２８および／またはＢ２９位置において突然変異している。例えば、インスリンリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））は迅速に作用するインスリン突然変異体であり、そこでは、Ｂ−ペプチドのＣ−末端の最後から二番目のリシンおよびプロリン残基は逆にされている（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）。この修飾はインスリンマルチマーの形成をブロックする。インスリンアスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））はもう１つの迅速に作用するインスリン突然変異体であり、そこでは、位置Ｂ２８におけるプロリンはアスパラギン酸で置換されている（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）。この突然変異体はマルチマーの形成も妨げる。いくつかの実施形態において、位置Ｂ２８および／またはＢ２９における突然変異はインスリンポリペプチド中の他の個所での１以上の突然変異によって達成される。例えば、インスリングルリシン（ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））はなおもう１つの迅速に作用するインスリン突然変異体である。そこでは、位置Ｂ３におけるアスパラギン酸はリシン残基によって置き換えられており、および位置Ｂ２９におけるリシンはグルタミン酸残基で置き換えられている（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）。
種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、ヒトインスリンに対してシフトされている等電点を有する。いくつかの実施形態において、等電点におけるシフトは、１以上のアルギニン残基をインスリンＡ−ペプチドのＮ−末端および／またはインスリンＢ−ペプチドのＣ−末端に付加することによって達成される。そのようなインスリンポリペプチドの例はＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、およびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンを含む。さらなる例として、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は例示的な長時間作用インスリン突然変異体であり、そこでは、ＡｓｐＡ２１はグリシンによって置き換えられており、および２つのアルギニン残基はＢ−ペプチドのＣ−末端に付加されている。これらの変化の効果は等電点をシフトさせて、ｐＨ４において完全に可溶性である溶液を生じさせることである。かくして、いくつかの実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、Ａ２１がＧｌｙであるＡ−ペプチド配列、およびＢ３１がＡｒｇ−ＡｒｇであるＢ−ペプチド配列を含む。本開示はこれらの突然変異の全ての単一および複数組合せ、および本明細書中に記載されているいずれの他の突然変異（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）も含むと理解されるべきである。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は欠失を含んでよい。例えば、ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドのＢ−ペプチド配列はＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９および／またはＢ３０を欠落している。
種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは切形されていてもよい。例えば、Ｂ−ペプチド配列は残基Ｂ（１−２）、Ｂ（１−３）、Ｂ（２９−３０）、Ｂ（２８−３０）、Ｂ（２７−３０）、および／またはＢ（２６−３０）を欠落していてもよい。いくつかの実施形態において、これらの欠失および／または切形は前記したインスリンポリペプチド（例えば、ΔＢ３０インスリンリスプロ、ΔＢ３０インスリンアスパルト、ΔＢ３０インスリングルリシン、ΔＢ３０インスリングラルギンなどを生じさえるのに限定されない。）。
いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドはＡまたはＢ−ペプチド配列のＮ−またはＣ−末端にさらなるアミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態において、１以上のアミノ酸残は位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０、および／またはＢ３１に位置する。いくつかの実施形態において、１以上のアミノ酸残基は位置Ａ０に位置する。いくつかの実施形態において、１以上のアミノ酸残基は位置Ａ２２に位置する。いくつかの実施形態において、１以上のアミノ酸残基は位置Ｂ０に位置する。いくつかの実施形態において、１以上のアミノ酸残基は位置Ｂ３１に位置する。ある実施形態において、インスリンポリペプチドは位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０、またはＢ３１においていずれかのさらなるアミノ酸残基を含まない。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、１以上のアミド化アミノ酸が酸性形態で置き換えられた突然変異を有してもよい。例えば、アスパラギンはアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられていてもよい。同様に、グルタミンはアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられていてもよい。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１、またはＡｓｎＢ３、またはそれらの残基のいずれの組合せもアスパラギン酸またはグルタミン酸によって置き換えられていてもよい。ＧｌｎＡ１５またはＧｌｎＢ４、または双方はアスパラギン酸またはグルタミン酸によって置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドは位置Ａ２１においてアスパラギン酸または位置Ｂ３においてアスパラギン酸、または双方を有する。
当業者であれば、生物学的活性を保持しつつ、インスリンポリペプチドにおいてなお他のアミノ酸を突然変異させるのは可能である。例えば、限定されるものではないが、以下の修飾も当該分野で広く受け入られている：位置Ｂ１０のヒスチジン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＨｉｓＢ１０→ＡｓｐＢ１０）；位置Ｂ１におけるフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＰｈｅＢ１→ＡｓｐＢ１）；位置Ｂ３０におけるスレオニン残基のアラニンでの置き換え（ＴｈｒＢ３０→ＡｌａＢ３０）；位置Ｂ２６におけるチロシン残基のアラニンでの置き換え（ＴｙｒＢ２６→ＡｌａＢ２６）；および位置Ｂ９におけるセリン残基のアスパラギン酸での置き換え（ＳｅｒＢ９→ＡｓｐＢ９）。
いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドは修飾されおよび／または突然変異されて、インスリン受容体に対するその親和性を低下させる。特定の理論に拘束されるつもりはないが、修飾（例えば、アシル化）または突然変異を介してインスリンポリペプチドの受容体親和性を減衰させるのは、インスリンポリペプチドが血清から排除される速度を減少させることができる。いくつかの実施形態において、減少したインスリン受容体親和性はインスリンコンジュゲートに対する優れたインビボ活性にインビトロにて移動する。他の実施形態において、インスリン分子が位置Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９またはＢ３０において突然変異させて、インスリン受容体に対するその親和性を低下させる（例えば、ＬｙｓＡ４、ＬｙｓＡ５、ＬｙｓＡ８、ＬｙｓＡ９、またはＬｙｓＢ３０）。
種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは作用の長引いたプロフィールを有する。かくして、ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは脂肪酸でアシル化されていてもよい。すなわち、アミド結合がインスリンポリペプチド上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間で形成される。アミノ基は、インスリンポリペプチドのＮ−末端アミノ酸のアルファ−アミノ基であってよく、またはインスリンポリペプチドのリシン残基のイプシロン−アミノ基であってよい。本開示のインスリンポリペプチドは、野生型インスリンに存在する３つのアミノ基の１以上においてアシル化されていてよく、または、野生型配列に導入されているリシン残基上にアシル化されていてもよい。ある実施形態において、インスリンポリペプチドは位置Ｂ１にアシル化されていてよい。ある実施形態において、インスリンポリペプチドは位置Ｂ２９においてアシル化されていてよい。ある実施形態において、脂肪酸はミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））は、ＴｈｒＢ３０が欠失されており、かつＣ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がＬｙｓＢ２９に結合されている長時間作用インスリン突然変異体である。
いくつかの実施形態において、本発明開示のインスリンポリペプチドにおける、Ａ−ペプチドのＮ−末端、Ｂ−ペプチドのＮ−末端、位置Ｂ２９におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基、またはいずれかの他の利用可能なアミノ基は一般式：
Figure 2013535467
 ［式中、Ｘはインスリンポリペプチドのアミノ基であって、ＲはＨまたはＣ１−３０アルキル基である。］
の部位に共有結合している。いくつかの実施形態において、ＲはＣ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基、Ｃ１２−１４アルキル基等である。ある実施形態において、インスリンポリペプチドはＡ１位置において該部位にコンジュゲートしている。ある実施形態において、インスリンポリペプチドはＢ１位置において該部位にコンジュゲートしている。ある実施形態において、インスリンポリペプチドは位置Ｂ２９のＬｙｓのイプシロン−アミノ基において該部位にコンジュゲートしている。ある実施形態において、インスリンポリペプチドの位置Ｂ２８はＬｙｓであって、ＬｙｓＢ２８のイプシロン−アミノ基は脂肪酸部位にコンジュゲートしている。ある実施形態において、インスリンポリペプチドの位置Ｂ３はＬｙｓであって、ＬｙｓＢ３のイプシロン−アミノ基は脂肪酸部位にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、脂肪酸鎖は８から２０炭素の長さである。いくつかの実施形態において、脂肪酸はオクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）、またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。ある実施形態において、脂肪酸はミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタドデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）、またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、Ｎ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリンアスパルト）、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリングルリシン）、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリングラルギン）、ＮεＢ２９−ミリストイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリンデテミル）、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、デス（Ｂ２７）−ヒトインスリン、デス（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、デス（Ｂ１）−ヒトインスリン、デス（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリソチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−デス（Ｂ３０）―ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフおよび以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−デス（Ｂ３０）―ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフ、および以下のインスリンポリペプチドのうちの１つの突然変異および／または化学的修飾を含む：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−デス（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−デス（Ｂ３０）−ヒトインスリン。
本開示は、Ｎ−結合グリカンモチーフ、および前記した突然変異および／または化学的修飾のうちのいずれか１つを含む非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリン等）の修飾された形態も含む。
これらおよび他の修飾されたインスリンポリペプチドは米国特許第６，９０６，０２８号明細書；同第６，５５１，９９２号明細書；同第６，４６５，４２６号明細書；同第６，４４４，６４１号明細書；同第６，３３５，３１６号明細書；同第６，２６８，３３５号明細書；同第６，０５１，５５１号明細書；同第６，０３４，０５４号明細書；同第５，９５２，２９７号明細書；同第５，９２２，６７５号明細書；同第５，７４７，６４２号明細書；同第５，６９３，６０９号明細書；同第５，６５０，４８６号明細書；同第５，５４７，９２９号明細書；同第５，５０４，１８８号明細書；同第５，４７４，９７８号明細書；同第５，４６１，０３１号明細書；および同第４，４２１，６８５号明細書；および米国特許第７，３８７，９９６号明細書；同第６，８６９，９３０号明細書；同第６，１７４，８５６号明細書；同第６，０１１，００７号明細書；同第５，８６６，５３８号明細書；および同第５，７５０，４９７号明細書に詳細に記載されている。
Ｎ−結合グリカンモチーフ
ある実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、Ｘａａ’がＰｒｏではない配列Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］によって特徴付けられる１以上のＮ−結合グリカンモチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフはインスリンポリペプチドの末端に結合している。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフはインスリンポリペプチドの配列内に取り込まれている。いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドは単一のＮ−結合グリカンモチーフを含む。いくつかの実施形態において、単一のＮ−結合グリカンモチーフはＡ−ペプチドに存在する。いくつかの実施形態において、単一のＮ−結合グリカンモチーフはＢ−ペプチドに存在する。いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドは１を超えるＮ−結合グリカンモチーフ（例えば、２、３、または４のモチーフ）を含む。
本明細書中で議論されるＮ−結合グリカンモチーフの実施形態のいずれか１つが式Ｉ、Ｉ’、ＩＩまたはＩＩ’のインスリンポリペプチドのいずれか１つ内に含むことができるのは理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、酵素プロセッシングの間にインスリンポリペプチドからＮ−結合グリカンモチーフのＡｓｎ残基を開裂させる酵素開裂を回避するために、Ｎ−結合グリカンモチーフ内のＸａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフ内のＸａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフ内のＸａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。以下に議論するように、これらのモチーフは、例えば、Ａ−および／またはＢ−ペプチドのＮ−末端に向けて位置する場合に有用であり得る（例えば、位置Ａ０またはＢ０におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフ、またはＡ８、Ａ１０、Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、またはＢ１１位置において開始するＮ−結合グリカンモチーフ）。
いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、これは該モチーフのＣ−末端側にあるＳｅｒまたはＴｈｒ残基およびいずれかのアミノ酸残基をプロセッシングの間に酵素により開裂させる。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒによって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒによって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−Ａｒｇ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒによって特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは配列Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒによって特徴付けることができる。以下に議論するように、これらのモチーフは、例えば、Ａ−および／またはＢ−ペプチドのＣ−末端に向けて位置する場合に有用であろう（例えば、位置Ａ２２またはＢ３１におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフ、またはＡ１８、Ａ２０、Ａ２１、Ａ２２、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１位置で開始するＮ−結合グリカンモチーフ）。以下でより詳細に議論するように、本開示は、酵素開裂の結果としての、Ｎ−結合グリカンモチーフの部分（例えば、Ａｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］）を含むインスリンポリペプチドを含む。そのようなインスリンポリペプチドは依然としてグリコシル化されていてもよい。というのは、いずれのＮ−結合グリカンもＡｓｎ残基を介してインスリンポリペプチドに共有結合するからである。
ｉ．Ａ−ペプチド
ある実施形態において、Ａ−ペプチド配列はＮ−結合グリカンモチーフを含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフはＡ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２において開始してよい。
いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］である。
いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒである。
いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
いくつかの実施形態において、Ａ−ペプチドの位置Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］（例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｎ−Ａｒｇ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）である。
先に述べたように、いくつかの実施形態において、（さらなるアミノ酸を持ってもよい）Ｎ−結合グリカンモチーフは位置Ａ０またはＡ２２におけるＸａａ内に含まれる。いくつかの実施形態において、位置Ａ０またはＡ２２におけるＸａａはＮ−結合グリカンモチーフおよびインスリンポリペプチドの残りの間に（例えば、Ｎ−結合グリカンモチーフおよびＡ１の間、またはＡ２１およびＮ−結合グリカンモチーフの間）にスペーサーアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施形態において、位置Ａ０またはＡ２２におけるＸａａは１、１から２、１から３、１から４、または１から５のスペーサーアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ａ０またはＡ２２におけるＸａａはスペーサーアミノ酸として単一のＧｌｙ残基を含む。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。これらの実施形態のいくつかにおいて、位置Ａ０におけるＸａａはＮ−結合グリカンモチーフに対応する（すなわち、いずれかのさらなるアミノ酸を含まない）。これらの実施形態のいくつかにおいて、単一のＧｌｙ残基は：Ｘａａ’がＰｒｏではなく（かつ、Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇでなくてもよい）Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］−Ｇｌｙにおけるようにスペーサーアミノ酸として含まれる。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれるＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。これらの実施形態のいくつかにおいて、位置Ａ２２おけるＸａａはＮ−結合グリカンモチーフに対応する（すなわち、いずれのさらなるアミノ酸も含まない）。これらの実施形態のいくつかにおいて、単一のＧｌｙ残基が：Ｘａａ’がＰｒｏではなく（かつ、Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇでなくてもよい）Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］におけるようにスペーサーアミノ酸として含まれる。
いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ａ２２におけるＸａａはＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］（例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｎ−Ａｒｇ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）である。いくつかの実施形態において、さらなるＧｌｙ残基は：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］（配列番号：３０）におけるようにスペーサーアミノ酸として含まれる。
当業者であれば、これらは例示的な変形であって、本開示は他のＡ０またはＡ２２アミノ酸配列を含むことを認識する。
ｉｉ．Ｂ−ペプチド
ある実施形態において、Ｂ−ペプチド配列はＮ−結合グリカンモチーフを含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフはＢ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１で開始してよい。
いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］である。
いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒである。
いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
いくつかの実施形態において、Ｂ−ペプチドの位置Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１において開始するＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］（例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｎ−Ａｒｇ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）である。
先に述べたように、いくつかの実施形態において、（さらなるアミノ酸を持ってもよい）Ｎ−結合グリカンモチーフは位置Ｂ０またはＢ３１におけるＸａａ内に含まれる。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０またはＢ３１におけるＸａａはＮ−結合グリカンモチーフおよびインスリンポリペプチドの残りの間に（例えば、Ｎ−結合グリカンモチーフおよびＢ１の間に、またはＢ３０およびＮ−結合グリカンモチーフの間に）スペーサーアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０またはＢ３１におけるＸａａは１、１から２、１から３、１から４、または１から５のスペーサーアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０またはＢ３１におけるＸａａはスペーサーアミノ酸として単一のＧｌｙ残基を含む。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。これらの実施形態のいくつかにおいて、位置Ｂ０におけるＸａａはＮ−結合グリカンモチーフに対応する（すなわち、いずれのさらなるアミノ酸も含まない）。これらの実施形態のいくつかにおいて、単一のＧｌｙ残基は：Ｘａａ’がＰｒｏではなく（かつ、Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇでなくてもよい）Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］−Ｇｌｙにおけるようにスペーサーアミノ酸として含まれる。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ０におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］であり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。これらの実施形態のいくつかにおいて、位置Ｂ３１におけるＸａａはＮ−結合グリカンモチーフに対応する（すなわち、いずれのさらなるアミノ酸も含まない）。これらの実施形態のいくつかにおいて、単一のＧｌｙ残基は：Ｘａａ’がＰｒｏではなく（かつ、Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇではなくてもよい）Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］におけるようにスペーサーアミノ酸として含まれる。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｓｅｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＬｙｓではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｘａａ’−Ｔｈｒであり、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれたＮ−結合グリカンモチーフはＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
いくつかの実施形態において、位置Ｂ３１におけるＸａａはＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］（例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｎ−Ａｒｇ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）である。いくつかの実施形態において、さらなるＧｌｙ残基は：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］（配列番号：３０）におけるようにスペーサーアミノ酸として含まれる。
ｉｉｉ．単一および複数Ｎ−結合グリカンモチーフ
いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドは単一のＮ−結合グリカンモチーフを含む。いくつかの実施形態において、単一のＮ−結合グリカンモチーフはＡ−ペプチドに存在する（例えば、Ａ０またはＡ２２位置におけるＸａａ内に含まれ、またはＡ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２位置で開始する）。いくつかの実施形態において、単一のＮ−結合グリカンモチーフはＢ−ペプチドに存在し、（例えば、Ｂ０またはＢ３１位置におけるＸａａ内に含まれ、またはＢ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１位置で開始する）。
いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドは１を超えるＮ−結合グリカンモチーフ（例えば、２、３、または４モチーフ）を含む。いくつかの実施形態において、２以上のＮ−結合グリカンモチーフはインスリンポリペプチドのＡ−ペプチドに存在する（例えば、限定されるものではないが、Ａ０位置のＸａａ内に含まれた第一のモチーフ、およびＡ２２位置のＸａａ内に含まれた第二のモチーフ、またはＡ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２位置で開始）。いくつかの実施形態において、２以上のＮ−結合グリカンモチーフはインスリンポリペプチドのＢ−ペプチドに存在する（例えば、限定されるものではないが、Ｂ０位置のＸａａ内に含まれた、またはＢ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、またはＢ１１位置で開始する第一のモチーフ、およびＢ３１位置のＸａａ内に含まれた、またはＢ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１位置で開始する第二のモチーフ）。いくつかの実施形態において、２以上のＮ−結合グリカンモチーフはインスリンポリペプチドのＡ−ペプチドおよび／またはＢ−ペプチドに存在する。いくつかの実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドはＡ−ペプチド上のＮ−結合グリカンモチーフおよびＢ−ペプチド上のＮ−結合グリカンモチーフを含む（例えば、限定されるものではないが、Ａ０位置のＸａａ内に含まれた第一のモチーフおよびＢ３１位置のＸａａ内に含まれた、またはＢ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１位置で出発する第二のモチーフ；Ｂ０位置のＸａａ内に含まれた、またはＢ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、またはＢ１１位置で出発する第一のモチーフ、およびＡ２２位置のＸａａ内に含まれた、またはＡ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２位置で出発する第二のモチーフ；Ａ０位置のＸａａ内に含まれた第一のモチーフ、およびＢ０位置のＸａａ内に含まれた、またはＢ０、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ９、Ｂ１０、またはＢ１１位置で出発する第二のモチーフ；またはＡ２２位置のＸａａ内に含まれた、またはＡ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２位置で開始する第一のモチーフ、およびＢ３１位置のＸａａ内に含まれた、またはＢ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１位置で開始する第二のモチーフ）。例えば、本発明者らが種々の合成インスリン−コンジュゲートで行った実験は、１を超えるインスリンアミノ酸位置において（例えば、位置Ａ１およびＢ２９において）コンジュゲートされた糖リガンドを有することが、ある種の状況において有利であり得ることを示した。
ｉｖ．末端に位置したＮ−結合グリカンモチーフ
ある実施形態において、本開示の組換えインスリンポリペプチドは、Ａ−および／またはＢ−ペプチドの１以上の末端に位置するＮ−結合グリカンモチーフを含む。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＡ−ペプチドのＮ−末端に（例えば、位置Ａ０におけるＸａａ内に）位置する。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＢ−ペプチドのＮ−末端に（例えば、位置Ｂ０における、位置Ｂ０における、Ｂ０が欠落している場合には位置Ｂ１における、Ｂ（０−１）が欠落している場合には位置Ｂ２における、またはＢ（０−２）が欠落している場合には位置Ｂ３におけるＸａａ内に）位置する。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは（例えば、位置Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始する、または位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれた）Ａ−ペプチドのＣ−末端に位置する。ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフの一部のみがＡ−ペプチドのＣ−末端に位置する（例えば、Ｘａａ’がＰｒｏでない場合にはＡｓｎまたはＡｓｎ−Ｘａａ’）。本明細書中で議論するように、プロインスリンに存在したＮ−結合グリカンモチーフが酵素プロセッシングの間に開裂される場合、これが起こり得、例えば、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＸａａ’がＬｙｓまたはＡｒｇである場合、Ａ−ペプチドのＣ−末端はＡｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］で終了してもよい。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフは（例えば、Ｂ（２９−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２６で開始し、Ｂ（３０−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２７で開始し、Ｂ３１が欠落している場合には位置Ｂ２８で開始し、位置Ｂ２９で開始し、位置Ｂ３０で開始し、位置Ｂ３１で開始し、または位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれた）Ｂ−ペプチドのＣ−末端に位置する。ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフの一部のみがＢ−ペプチドのＣ−末端に位置する（例えば、ＡｓｎまたはＡｓｎ−Ｘａａ’、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない）。本明細書中で議論するように、プロインスリンに存在したＮ−結合グリカンモチーフが酵素プロセッシングの間に開裂される場合にこれは起こり得、例えば、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＸａａ’がＬｙｓまたはＡｒｇである場合、Ｂ−ペプチドのＣ−末端はＡｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］で終わることができる。
以下の実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフの「一部」はＡｓｎまたはＡｓｎ−Ｘａａ’を意味し、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフの「一部」はＡｓｎ−［Ｌｙｓ／Ａｒｇ］を意味する。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフはＡ−ペプチドのＮ−末端に位置し、（例えば、位置Ａ０におけるＸａａ内）および第二のＮ−結合グリカンモチーフ（またはその部分）は（例えば、位置Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始し、または位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれる）Ａ−ペプチドのＣ−末端に位置する。
ある実施形態において、第一のＮ−末端グリカンモチーフは（例えば、位置Ｂ０における、位置Ｂ０における、Ｂ０が欠落している場合には位置Ｂ１における、Ｂ（０−１）が欠落している場合には位置Ｂ２における、またはＢ（０−２）が欠落している場合には位置Ｂ３におけるＸａａ内の）Ｂ−ペプチドのＮ−末端に位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフ（またはその部分）は、（例えば、Ｂ（２９−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２６で開始し、Ｂ（３０−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２７で開始し、Ｂ３１が欠落している場合には位置Ｂ２８で開始し、位置Ｂ２９で開始し、位置Ｂ３０で開始し、位置Ｂ３１で開始し、または位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれた）Ｂ−ペプチドのＣ−末端に位置する。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフは（例えば、位置Ａ０におけるＸａａ内の）Ａ−ペプチドのＮ−末端に位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフは（例えば、位置Ｂ０におけるＸａａ内の、位置Ｂ０における、Ｂ０が欠落している場合には位置Ｂ１において、Ｂ（０−１）が欠落している場合には位置Ｂ２において、またはＢ（０−２）が欠落している場合には位置Ｂ３における）Ｂ−ペプチドのＮ−末端に位置する。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフは（例えば、位置Ａ０におけるＸａａ内の）Ａ−ペプチドのＮ−末端に位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフ（またはその部分）は（例えば、Ｂ（２９−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２６で開始し、Ｂ（３０−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２７で開始し、Ｂ３１が欠落している場合には位置Ｂ２８で開始し、位置Ｂ２９において開始し、位置Ｂ３０において開始し、位置Ｂ３１において開始し、または位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれた）Ｂ−ペプチドのＣ−末端に位置する。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフ（またはその部分）は（例えば、位置Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始し、または位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれた）Ａ−ペプチドのＣ−末端に位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフ（またはその部分）は（例えば、Ｂ（２９−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２６で開始し、Ｂ（３０−３１）が欠落している場合には位置Ｂ２７で開始し、Ｂ３１が欠落している場合には位置Ｂ２８で開始し、位置Ｂ２９で開始し、位置Ｂ３０で開始し、位置Ｂ３１で開始し、または位置Ｂ３１におけるＸａａ内に含まれた）Ｂ−ペプチドのＣ−末端に位置する。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフ（またはその部分）は（例えば、位置Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始し、または位置Ａ２２におけるＸａａ内に含まれた）Ａ−ペプチドのＣ−末端に位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフは（例えば、位置Ｂ０におけるＸａａ内の、位置Ｂ０における、Ｂ０が欠落している場合には位置Ｂ１における、Ｂ（０−１）が欠落している場合には位置Ｂ２において、またはＢ（０−２）が欠落している場合には位置Ｂ３における）Ｂ−ペプチドのＮ−末端に位置する。
ｖ．Ｃ−末端に向けて位置するＮ−結合グリカンモチーフ
ある実施形態において、本開示の組換えインスリンポリペプチドは、Ａ−および／またはＢ−ペプチドの１以上の末端に向けて位置するＮ−結合グリカンモチーフを含む。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎは（例えば、１、２または３アミノ酸内の）Ａ−ペプチドのＮ−末端の１から３のアミノ酸内に位置する。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＢ−ペプチドのＮ−末端の１から３アミノ酸内に（例えば、１、２または３アミノ酸内に）位置する。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３のアミノ酸）だけＡ−ペプチドのＣ−末端から分離されている。ある実施形態において、Ａ−ペプチドのＣ−末端は配列Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］で終了し、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。
ある実施形態において、Ｎ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３のアミノ酸）だけＢ−ペプチドのＣ−末端から分離されている。ある実施形態において、Ｂ−ペプチドのＣ−末端は配列Ａｓｎ−Ｘａａ’［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］で終了し、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＡ−ペプチドのＮ−末端の１から３アミノ酸内に（例えば、１、２または３アミノ酸内に）位置しており、および第二のＮ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３以下のアミノ酸だけ）だけＡ−ペプチドのＣ−末端から分離されている。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＢ−ペプチドのＮ−末端の１から３アミノ酸内に（例えば、１、２または３のアミノ酸内に）位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３以下のアミノ酸だけ）だけＢ−ペプチドのＣ−末端から分離している。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＡ−ペプチドのＮ−末端の１から３アミノ酸内に（例えば、１、２または３のアミノ酸内に）位置しており、および第二のＮ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＢ−ペプチドのＮ−末端の１から３アミノ酸内に（例えば、１、２または３のアミノ酸内に）位置する。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＡ−ペプチドのＮ−末端の１から３アミノ酸内に（例えば、１、２または３のアミノ酸内に）位置し、および第二のＮ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３以下のアミノ酸だけ）だけＢ−ペプチドのＣ−末端から分離している。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３のアミノ酸）だけＡ−ペプチドのＣ−末端から分離しており、および第二のＮ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３以下のアミノ酸だけ）だけＢ−ペプチドのＣ−末端から分離している。
ある実施形態において、第一のＮ−結合グリカンモチーフにおける［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］は１から３以下のアミノ酸（例えば、１、２または３以下のアミノ酸だけ）だけＡ−ペプチドのＣ−末端から分離しており、および第二のＮ−結合グリカンモチーフにおけるＡｓｎはＢ−ペプチドのＮ−末端の１から３のアミノ酸内に（例えば、１、２または３のアミノ酸内に）位置する。
これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ａ−および／またはＢ−ペプチドのＣ−末端は配列Ａｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］で終了してよく、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｒｇではない。
ｖｉ．末端に、および末端に向けて位置したＮ−結合グリカンモチーフ
ある実施形態において、本開示の組換えインスリンポリペプチドは、Ａ−および／またはＢ−ペプチドの２以上の末端に、または末端に向けて位置する２以上のＮ−結合グリカンモチーフを含む。本開示は先に提示した個々の実施形態の全ての組合せおよび順列（例えば、Ａ−ペプチドのＮ−末端の、およびＢ−ペプチドのＣ−末端に向けられたモチーフ、Ａ−ペプチドのＮ−末端に向けられ、およびＢ−ペプチドのＣ−末端にあるモチーフ等）を含むと理解されるべきである。
先のセクションで議論したように、ある実施形態において、野生型インスリンまたはプロインスリン配列へ１以上のＮ−結合グリカンモチーフを導入するのに必要であった突然変異は、インスリンポリペプチドおよび／または化学的修飾におけるいずれか他の個所の１以上の突然変異が伴い得ると理解されるべきである。いくつかの実施形態において、インスリンポリペプチドにおける他の個所における突然変異は表１から３に記載された選択肢から選択される。いくつかの実施形態において、野生型インスリンまたはプロインスリン配列へ１以上のＮ−結合グリカンモチーフを導入するのに必要とされた突然変異は、インスリンポリペプチドにおける唯一の突然変異である。
いくつかの実施形態において、プロ−リーダーペプチド配列もまた本開示のインスリンポリペプチドの配列内に（例えば、式ＩまたはＩＩにおけるＢ０におけるＸａａの定義内で）含まれ得る。プロ−リーダーポリペプチドは小胞体からのポリペプチド配列をゴルジ体に向け、さらに、培養基への分泌のために分泌小胞に向ける（すなわち、細胞壁を横切っての、または少なくとも細胞膜を通ってのポリペプチドの酵母細胞のペリプラズム空間への輸送）。プロ−リーダーポリペプチドは、米国特許第４，５４６，０８２号明細書および同第４，８７０，００８号明細書に開示されているように、酵母α−因子プロ−リーダーペプチドであってよい。別法として、プロ−リーダーペプチドは合成プロ−リーダーペプチドであってよく、これは、天然に見出されないプロ−リーダーペプチドと言われる。適当な合成プロ−リーダーペプチドは、米国特許第５，３９５，９２２号明細書；同第５，７９５，７４６号明細書；同第５，１６２，４９８号明細書および国際公開第９８／３２８６７号パンフレットに開示されている。いくつかの実施形態において、プロ−リーダーペプチドは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列またはいずれかのその機能的アナログのような、Ｃ−末端においてエンドペプチダーゼプロセッシング部位を含む。実施例で用いられた例示的なプロ−リーダーペプチドは配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号：８）を有する。
組換えインスリンポリヌクレオチド
一態様において、本開示のインスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、その天然の状態において、または当業者によく知られた方法によって操作された場合に、それが転写および／または翻訳されて、ポリペプチドについてのｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドを生産することができるならば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。アンチセンスストランドはそのような核酸の相補体であって、コーディング配列はそれから推測することができる。
ポリヌクレオチドはいずれかの方法によって調製することができる。例えば、ある実施形態において、ポリヌクレオチドは確立された標準的な方法、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６９，１９８１によって記載されたホスホアミダイト方法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３：８０１−８０５，１９８４によって記載された方法によって合成により調製することができる。ホスホアミダイト方法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成器において合成され、精製され、二本鎖とされ、および連結されて、合成ポリヌクレオチド構築体を形成する。ＤＮＡ構築体を調製する現在好ましい方法はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるものである。
本発明のポリヌクレオチド配列はｃＤＮＡ起源のものであってよい。例えば、リーダーペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を野生型Ａ−およびＢ−ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列に連結させることができ、その後、ＤＮＡ配列を、よく知られた手法に従って相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、または好ましくは、適当なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって所望の配列を生じさせることによって部位において修飾することができる。
本開示は、本開示のインスリンポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチド配列を運ぶ細胞（例えば、酵母細胞）において複製することができる組換えベクターも提供する。組換えベクターは自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製から独立している染色体外の実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってよい。ベクターは自己−複製を確実とするためのいずれの手段を含有してもよい。別法として、ベクターは宿主細胞に導入した場合に、ゲノムに組み込まれ、およびそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミド、または一緒に宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを含有する２以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを用いてもよい。ベクターは線状または閉じた環状プラスミドであってよく、好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定な組込み、またはゲノムから独立した細胞におけるベクターの自律複製を可能とするエレメントを含有する。好ましい実施形態において、組換えベクターは酵母において複製することができる。
本開示のベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能とする１以上の選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーは、その産物が殺生物またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。酵母宿主細胞についての適当なマーカーはＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。酵母についての好ましい選択マーカーはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＴＰＩ遺伝子である（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ ４０：１２５−１３０，１９８５参照）。
ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は適当なプロモーター配列に操作可能に連結されている。プロモーターは、突然変異体、切形されたおよびハイブリッドプロモーターを含めた、選択される宿主細胞において転写活性を示すいずれの核酸配列であってもよく、宿主細胞にとって同種または異種いずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。酵母宿主において転写を指令するための適当なプロモーターの例はＭａｌ、ＴＰＩ、ＡＤＨまたはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、酵母細胞において遺伝子の転写を指令するのに用いられるプロモーター配列は外部酵母刺激および／または発酵条件によって調節される。いくつかの実施形態において、プロモーター配列はメタノールのメチロトローフ酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ等）への投与によって調節される。いくつかの実施形態において、外部酵母刺激に対するプロモーター応答および／または発酵条件の使用の結果、所望のインスリンポリペプチドの増大した収率がもたらされる。
該開示のポリヌクレオチドベクターは適当なターミネーターに操作可能にやはり連結され得る。酵母において、適当なターミネーターはＴＰＩターミネーター（Ａｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−４３４，１９８２参照）。
該開示のポリヌクレオチド、プロモーターおよびターミネーターを連結し、およびそれらを、酵母複製に必要な情報を含む適当な酵母ベクターに挿入するのに用いられる手法は当業者によく知られている。ベクターは、まず、本開示のプロインスリンをコードする全ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体を調製し、引き続いて、この配列を適当な発現ベクターに挿入することによって、または遺伝情報を含むＤＮＡ断片を順次挿入し、続いて、連結することによって構築することができると理解される。
Ｎ−結合グリカン
Ｎ−結合グリカンは、（酸素を介してポリペプチドに共有結合により連結されたＯ−結合グリカンとは異なり）窒素を介してポリペプチドに共有結合により連結された分岐した糖の重要なクラスである。ヒトにおいては、Ｎ−結合グリカンは、保存されたコア五糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３構造を共有し、糖残基の分岐および置換の変形を伴う（図１参照）。ポリペプチドグリコシル化は、ポリペプチド折り畳み、ポリペプチド安定性、オリゴマー化およびトラフィッキングを含めた鍵となる生物学的プロセスを調節する際に重要である。
Ｎ−結合グリカンは小胞体およびゴルジ体において一連の酵素を介してポリペプチド標的に共有結合される（図２参照）。典型的には、ヒトにおいて、グリカンは小胞体のルーメンにおいてポリペプチドに付加される。グリカンは、Ｘａａ’がＰｒｏを除いたいずれのアミノ酸であってもよいＮ−結合グリカンモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］内に含有されたアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に付加される。最初のグリカン鎖は、通常、小胞体における特異的なグリコシダーゼ酵素によってトリミングされ、その結果、２つのＮ−アセチルグルコサミンおよび３つのマンノース残基よりなる短い分岐したＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３コアがもたらされる。小胞体における最初のプロセッシングの後に、次いで、グリコシル化ポリペプチドがゴルジまで移送され、そこで、さらなるプロセッシングが起こり得る。トリミングされたＮ−結合グリカン部位は、いくつかのマンノース残基の付加によって修飾することができ、その結果、「高−マンノース」Ｎ−結合グリカンを得る。加えて、または別法として、Ｎ−アセチルグルコサミンの１以上の単糖ユニットをコアマンノースサブユニットに付加して、「複雑な」Ｎ−結合グリカンを形成することができる。ガラクトースをＮ−アセチルグルコサミンサブユニットに付加することができ、およびシアル酸サブユニットをガラクトースサブユニットに付加することができ、その結果、シアル酸、ガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミン残基のいずれかで終了する鎖がもたらされる（図２参照）。加えて、フコース残基をグルカンコアのＮ−アセチルグルコサミン残基に付加させることができる。これらの付加の各々は特異的なグリコシルトランスフェラーゼによって触媒される。
一態様において、本開示はＮ−結合グリカンモチーフ、Ｘａａ’がＰｒｏではないＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含む組換えインスリンポリペプチドを提供し、ここにおいて、モチーフ中のＡｓｎのデルタ−アミノ基はグリカンに共有結合している。
一般に、Ｎ−結合グリカンは少なくとも１つのβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンはＧｌｃＮＡｃ２構造を含み、そこでは、ＧｌｃＮＡｃはβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンである。
いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンは少なくとも１つのマンノース残基を含む。いくつかの実施形態において、グリカンはＢマンノース、トリマンノース、またはより高次のコンジュゲートされたマンノースを含む。いくつかの実施形態において、トリマンノースは線状トリマンノースである。いくつかの実施形態において、トリマンノースは分岐したトリマンノースである。
いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンは一般式：ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎｎの構造を含み、ここにおいて、Ｍａｎｎはマンノース残基の整数である。いくつかの実施形態において、Ｍａｎｎのｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、ｎは３、４、５、６、７、８、または９である。いくつかの実施形態において、ｎは３である。いくつかの実施形態において、ｎは５である。いくつかの実施形態において、ｎは８である。いくつかの実施形態において、ｎは９である。いくつかの実施形態において、一般式ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎｎからのマンノース残基は線状アレイに共有結合により連結されている。いくつかの実施形態において、マンノース残基は分岐したアレイに共有結合により連結されている。いくつかの実施形態において、糖残基の連結はβ１−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ、β１−４−ＧｌｃＮＡｃ、β１−２−ＧｌｃＮＡｃ、β１−４−Ｍａｎ、α１−６−Ｍａｎ、α１−２−Ｍａｎ、および／またはα１−３−Ｍａｎである。
これらのマンノシル化Ｎ−グリカンは、Ｉ−６のような合成インスリン−コンジュゲートでの本発明者らの経験に基づいた特別な興味のものである。注目すべきことには、これらのＮ−グリカンは（例えば、酵母においてグリコシル化ヒト治療蛋白質を再生させることを試みる場合に）酵母において生じさせることが他の者が試みた伝統的な「ヒト化」Ｎ−グリカンとは異なる。
いくつかの実施形態において、Ｎ−結合グリカンは一般式ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９Ｇｌｃ３の基を含み、ここにおいて、Ｇｌｃはグルコースである。再度、Ｎ−グリカン内に末端グルコース残基を含ませるのは、合成インスリン−コンジュゲートでの本発明者らの実験に基づいて特に興味がある。しかしながら、本開示は、Ｎ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ、またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である状況も含む。いくつかの実施形態において、グリカンはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２であり、ここにおいて、Ｇａｌはガラクトースである。いくつかの実施形態において、グリカンはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２であり、ここにおいて、Ｇａｌはガラクトースであって、ＮＡＮＡはα−２，３−結合および／またはα−２，６−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸である。いくつかの実施形態において、糖残基は線状アレイに共有結合により連結されている。いくつかの実施形態において、糖残基は分岐したアレイに共有結合により連結されている。いくつかの実施形態において、糖残基の連結はβ１，Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ、β１，４−ＧｌｃＮＡｃ、β１，２−ＧｌｃＮＡｃ、β１，４−Ｍａｎ、α１，６−Ｍａｎ、α１，２−Ｍａｎ、α１，３−Ｍａｎ、β１，４−Ｇａｌ、α２，３−ＮＡＮＡおよび／またはα２−６−ＮＡＮＡである。いくつかの実施形態において、本発明のＮ−グリカンは異なるタイプの連結を含むことができる（例えば、α１，６−Ｍａｎおよびα１，３−Ｍａｎ等）。
いくつかの実施形態において、本発明はグリコシル化インスリンポリペプチドの均一な集団を含む組成物（すなわち、同一のＮ−結合グリカンを持つかなり割合のグリコシル化インスリンポリペプチドを含む組成物）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明はインスリンポリペプチドの集団を含む組成物を提供し、ここにおいて、インスリンポリペプチドの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％は同一のＮ−結合グリカン（例えば、単一のＮ−結合グリカンモチーフが存在する場合は同一の単一のＮ−結合グリカン、または２以上のＮ−結合グリカンモチーフがインスリンポリペプチドに存在する場合は同一の２以上のＮ−結合グリカン）を含む。
組換えインスリンポリペプチドの酵母生産
酵母は、高収率発酵系において酵母を成長させる能力のため、（組換えインスリンの生産を含めた）ポリペプチド生産のための産業で用いられる。発酵−ベースのプロセスは（ａ）高濃度のポリペプチドの迅速な生産；（ｂ）滅菌されたよく制御された生産条件を用いる能力；（ｃ）単純な化学的に規定された（およびポリペプチド−フリーの）成長培地を用いる能力；（ｄ）遺伝的操作の容易性；（ｅ）ウイルスのような汚染性ヒトまたは動物病原体の不存在；（ｆ）毒性等による細胞培養において発現が芳しくなかったものを含めた、広く種々のポリペプチドを発現する能力；および（ｇ）（例えば、培地への分泌を介する）ポリペプチド回収の容易性を供する。加えて、酵母のための発酵施設は一般に細胞培養施設よりも構築するのがかなり低コストである。
高収率の組換えポリペプチドを有効に生じさせるための酵母の重要な利点にも拘わらず、酵母は、それがグリコシル化ポリペプチドの生産に関して不利点を１つ有する。酵母はヒトにおけるグリコシル化経路と比較してかなり異なるグリコシル化経路を有する（例えば、図２および３を比較されたし）。歴史的には、グリコシル化経路の差は、さもなければ哺乳動物発現系よりも顕著な利点にも拘わらず、組換えヒトグリコシル化ポリペプチドの生産のための宿主としての酵母の使用を妨げてきた。
酵母およびヒトはそれらのグリコシル化経路においていくつかの鍵となる差を有するが、該経路における最初の工程のいくつかは共有されている。例えば、最初の工程であるコアオリゴ糖構造の新生のポリペプチドへの移動は、酵母、真菌、植物およびヒトを含めた全ての真核生物において高度に保存されている（図２および３参照）。しかしながら、コアオリゴ糖の引き続いてのプロセッシングは酵母およびヒトの間でかなり異なる。酵母においては、オリゴ糖は進行して、マンノース糖の付加によって修飾される。マンノース糖のコアオリゴ糖への付加はゴルジに存在するマンノシルトランスフェラーゼによって触媒される（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１等）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＯＣＨＩは、マンノースをグリカン構造ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ８に付加させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９を得る１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。３つの１，６−マンノース残基を含有するＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９構造はさらなるインビボでの１，２−、１，６−、および１，３−マンノシルトランスフェラーゼのための基質であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特徴的であって、かつ典型的にはＮ−グリカン当たり３０から４０マンノース残基を有することができる過剰マンノシル化グリコシル化ポリペプチドに至る（図３参照）。
ヒト様グリコシル化パターンを持つグリコシル化ポリペプチドを提供する遺伝的修飾を持つ代替酵母株の開発においてかなりの進歩がなされてきた。これらの酵母株の開発は、機能的ヒトグリコシル化ポリペプチド治療剤の生成のための重要な進歩であった。
酵母遺伝的修飾のいくつかは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨＩホモログの欠失を含み、これは、国際公開第０２／００８５６号パンフレットおよび日本国特許出願公開第８−３３６３８７号に開示されている。加えて、マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠乏するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの突然変異体（例えば、ＯＣＨ１またはＭＮＮ９突然変異体）は非致死的であり、および酵母グリコシル化ポリペプチドのオリゴ糖におけるマンノース含有量の低下を呈することが示されている（図４参照）。酵母におけるグリコシル化経路のさらなる修飾については、米国特許第５，１３５，８５４号明細書、同第５，８３４，２５１号明細書、同第７，３８８，０８１号明細書、同第７，３２６，６８１号明細書、および米国特許出願公開第２００６／０１７７８９８号明細書、同第２００７／０１７８５５１号明細書、同第２００７／０１８４０６３号、および同第２００８／０２７４４９８号明細書を参照のこと。
一態様において、酵母細胞を用いて、本開示のインスリンポリペプチドを発現させる方法が提供される。酵母細胞は、本開示のインスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換される。いくつかの実施形態において、酵母細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ、および／またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ種から選択される。いくつかの実施形態において、酵母細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞である。
いくつかの実施形態において、酵母細胞は野生型酵母細胞である。いくつかの実施形態において、酵母細胞は遺伝子工学的に作成された酵母細胞である。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、１以上の遺伝子の付加、欠失または突然変異によって遺伝子的に修飾される。いくつかの実施形態において、酵母は遺伝子的に修飾されて、１以上の新しい遺伝子を取り込む。遺伝子的修飾は、当該分野で知られ、かつ前記した方法によって達成することができる。
いくつかの実施形態において、酵母細胞は正常なグリコシル化経路を有する。いくつかの実施形態において、酵母細胞は前記したような遺伝子的に修飾されたグリコシル化経路を有する。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、それが、伝統的な酵母グリコシル化経路によって生産されるＮ−グリカン構造とは異なるＮ−グリカン構造を持つポリペプチド末端産物を生じさせるように、正常な酵母グリコシル化経路において１以上の修飾を有する。例えば、いくつかの実施形態において、さらなるマンノース残基のグリカンコアへの移動はマンノシルトランスフェラーゼの突然変異および／または欠失によって妨げることができる。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、それがα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないように、遺伝子工学的に作成されている。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、マンノシルトランスフェラーゼを非機能的とする、α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼにおいて挿入、欠失および／または突然変異を保有する。
ポリペプチドの発現について酵母株を形質転換する方法は当該分野でよく知られている（例えば、欧州特許公開欧州特許第００８８６３２号明細書、同第０１１６２０１号明細書、同第０１２３２９４号明細書、同第０１２３５４４号明細書、同第０１６３５２９号明細書、同第０１２３２８９号明細書、同第０１００５６１号明細書、同第０１８９９９８号明細書および同第０１９５９８６号明細書、ＰＣＴ特許公開国際公開第９５／０１４２１号パンフレット、同第９５／０２０５９および国際公開第９０／１００７５号パンフレット、および米国特許第４，５４６，０８２号明細書および同第６，３５８，７０５号明細書参照）。
形質転換された酵母細胞を培養するのに用いられる培地は、酵母生物を成長させるのに適したいずれの慣用的な培地であってよい。いくつかの実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは酵母細胞から直接的に回収される。いくつかの実施形態において、酵母細胞は溶解させ、および標的インスリンポリペプチドは当該分野で知られた方法を用いて単離され、および精製される。
いくつかの実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは酵母細胞から培地に分泌される。これらのポリペプチドは、遠心または濾過による培地からの酵母細胞の分離、塩、例えば、硫酸アンモニウムによる上清または濾液のポリペプチド成分の沈澱、続いての、種々のクロマトグラフィー手法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等による精製を含めた慣用的な手法によって培地から回収することができる。
いくつかの実施形態において、培養基からの本開示のインスリンポリペプチドの回収の後、インスリンポリペプチドを種々のインビトロ手法に付して、可能なリーダーペプチドおよび／またはＣ−ペプチドを除去して、所望のインスリンポリペプチドを得ることができる。そのような方法はＬ−スレオニンエステルの存在下でのトリプシンまたはＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓポリメラプロテアーゼによる酵素変換、続いての、米国特許第４，３４３，８９８号明細書または同第４，９１６，２１２号明細書に記載された塩基性または酸性加水分解によるスレオニンエステルの変換を含む。
いくつかの実施形態において、（例えば、図１Ｂに示された）少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含むインスリンポリペプチドはエキソグリコシダーゼを用いてトリミングすることができる。いくつかの実施形態において、エキソグリコシダーゼはα−１，２−マンノシダーゼ、α−１，３−マンノシダーゼ、α−１，６−マンノシダーゼ、α−（１−２，３）−マンノシダーゼおよび／またはα−（１−２，３，６）−マンノシダーゼである。いくつかの実施形態においてエキソグリコシダーゼは酵母細胞によって発現され、およびトリミングはインビボで起こる。いくつかの実施形態において、酵母細胞からの精製の後、本開示のインスリンポリペプチドはインビトロにてエキソグリコシダーゼで処理される。いくつかの実施形態において、（例えば、図１Ｂに示されるように）少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む本発明のインスリンポリペプチドはそのまま用いられ、およびエキソグリコシダーゼを用いてトリミングされない。
徐放製剤
実施例において議論したように、ある実施形態においては、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドを維持様式で（すなわち、可溶性組換えヒトインスリンよりも維持される吸収プロフィールを呈する形態で）投与するのが有利である。これは、それが典型的なグルコース変動タイムスケール（すなわち、分よりもむしろ時間）により密接に関連するタイムスケールにてグルコースにおける変動に応答することができる維持されたレベルのグリコシル化インスリンポリペプチドを提供する。ある実施形態において、徐放製剤は、非高血糖症条件（すなわち、絶食させた条件）下で哺乳動物に投与した場合に、グリコシル化インスリンポリペプチドのゼロ次放出を呈することができる。
維持された吸収プロフィールを提供するいずれの製剤も用いることができるのは認識される。そのような実施形態において、これは、グリコシル化インスリンポリペプチドを、全身循環へのその放出特性を遅らせる他の成分と組み合わせることによって達成することができる。
例えば、ＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤をこの目的で用いることができる。実施例において記載したように、本発明者らは、ある実施形態において、本発明者らの合成インスリン−コンジュゲートで調製されたＰＺＩ製剤の吸収プロフィールおよび安定性は製剤に含まれたプロタミンおよび亜鉛の絶対的および相対的量に対して感受性であることを見出した。例えば、市販のＰＺＩおよびＮＰＨインスリン処方は約０．０５から約０．２ｍｇプロタミン／ｍｇインスリンを必要とし、いくつかのＰＺＩ−コンジュゲート製剤は、吸収プロフィールを効果的に維持するために約１から約５ｍｇプロタミン／ｍｇコンジュゲートを必要とした。さらに、商業的なプロタミンインスリン製剤は約０．００６ｍｇ亜鉛／ｍｇインスリンを含有するが、本発明者らは、プロタミン濃度と共に亜鉛濃度を上昇させると、ある実施形態において、合成インスリン−コンジュゲートのより安定した容易に分散可能な製剤に導くことを見出した。いくつかの場合において、亜鉛含有量は約０．０５から約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇコンジュゲートの範囲であった。
かくして、外挿によって、ある実施形態においては、本開示のＰＺＩ処方は約０．０５から約１０ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンポリペプチドを含むことができる。例えば、約０．２から約１０ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンポリペプチド、例えば、約１から約５ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンポリペプチド。ある実施形態において、本開示のＰＺＩ製剤は約０．００６から約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンポリペプチドを含むことができる。例えば、約０．０５から約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンポリペプチド、例えば、約０．１から約０．２５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンポリペプチド。
ある実施形態において、本開示のＰＺＩ製剤は約１００：１から約５：１の範囲の比率（ｗ／ｗ）でプロタミンおよび亜鉛を含んでよい。例えば、約５０：１から約５：１、例えば、約４０：１から約１０：１。
該実施例はＰＺＩ製剤に以下の成分の１以上を含む利点も記載する：抗微生物保存剤、等張剤、および非グリコシル化インスリンポリペプチド。
ある実施形態において、本開示のＰＺＩ製剤は抗微生物保存剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）を含む。ある実施形態において、抗−微生物保存剤はｍ−クレゾールである。例えば、ある実施形態において、ＰＺＩ製剤は約０．１から約１．０％ｖ／ｖのｍ−クレゾールを含むことができる。例えば、約０．１から約０．５％ｖ／ｖのｍ−クレゾール、例えば、約０．１５から約０．３５％ｖ／ｖのｍ−クレゾール。
ある実施形態において、本開示のＰＺＩ製剤はポリオールを等張剤（例えば、マンニトール、プロピレングリコールまたはグリセロール）として含む。ある実施形態において、等張剤はグリセロールである。ある実施形態において、等張剤は塩、例えば、ＮａＣｌである。例えば、ＰＺＩ製剤は約０．０５から約０．５Ｍ ＮａＣｌ、例えば、約０．０５から約０．２５Ｍ ＮａＣｌ、または約０．１から約０．２Ｍ ＮａＣｌを含むことができる。
ある実施形態において本開示のＰＺＩ製剤は一定量の非グリコシル化インスリンポリペプチドを含む。ある実施形態において、ＰＺＩ製剤は、約１００：１から１：１、例えば、約５０：１から２：１または約２５：１から２：１の範囲の非グリコシル化インスリンポリペプチドに対するグリコシル化インスリンポリペプチドのモル比率を含む。
本開示は、小分子製剤の当該分野でよく知られた標準的な徐放（延長されたとも言われる）製剤の使用も含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５参照）。本開示は、徐々にグリコシル化インスリンポリペプチドを送達するための束縛拡散に依拠するデバイスの使用も含む。ある実施形態において、長時間作用製剤は（加えて、または別法として）、グリコシル化インスリンポリペプチドにおけるある種の突然変異および／または化学的修飾を含めることによって提供することができる。例えば、インスリングラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））またはインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））の突然変異を含めることができよう。先に述べたように、インスリングラルギンは例示的な長時間作用インスリンアナログであり、そこでは、Ａｓｐ−Ａ２１がグリシンによって置き換えられており、および２つのアルギニン残基がＢ−ペプチドのＣ−末端に加えられている。これらの変化の効果は、等電点をシフトされることであり、ｐＨ４において完全に溶解する溶液を生じる。インスリンデテミルはもう１つの長時間作用インスリンアナログであり、そこでは、Ｔｈｒ−Ｂ３０が欠失されており、およびＣ１４脂肪酸鎖がＬｙｓ−Ｂ２９に結合されている。
インスリンポリペプチドの使用
別の態様において、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドを用いる方法が提供される。一般に、グリコシル化インスリンポリペプチドを用いて、糖（例えば、グルコース、または本明細書中に記載られた、マンノース、アルファ−メチルマンノース、Ｌ−フコース等のような外因性糖）に対して応答するインスリンを制御可能に提供することができる。該開示は、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドを投与することによる病気または疾患の治療を含む。グリコシル化インスリンポリペプチドを用いて、いずれの患者（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウス等）も治療することができるが、それらは最も好ましくはヒトの治療で用いられる。本明細書中で用いるように、用語「治療する」（または「治療している」、「治療された」「治療」等）とは、疾患（例えば、糖尿病）、疾患の兆候または複数兆候（例えば、制御されていないグルコースレベル）、または疾患に向かう素因を軽減し、救済し、変化させ、緩和し、改良し、影響する目的で、それを必要とする対象への本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドの投与をいう。
グリコシル化インスリンポリペプチドはいずれかの経路によって患者に投与することができる。一般に、投与の最も適切な経路は、治療すべき病気または疾患の性質、患者の状態等を含めた種々の因子に依存する。一般に、本開示は経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、心室内、肺、経皮、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏または点剤による）、頬によって、または経口または鼻スプレーまたはエアロゾルとしての投与を含む。これらの異なる経路についての医薬製剤の調製における一般的な考慮は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。種々の実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは、例えば、注射によって皮下投与してもよい。グリコシル化インスリンポリペプチドは送達の容易性のために担体に溶解させることができる。例えば、担体は、限定されるものではないが、滅菌水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水を含めた水性溶液であり得る。
一般に、治療上有効量のグリコシル化インスリンポリペプチドが投与される。グリコシル化インスリンポリペプチドの「治療上有効量」とは、グリコシル化インスリンポリペプチドの効力および毒性のバランスを含む、合理的な利点／危険性の比率において病気または疾患を治療するのに十分な量が意味される。一般に、治療効力および毒性は、例えば、ＥＤ５０（処置された対照の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（処置された対照の５０％において致死的な用量）を計算することによって、細胞培養における標準的な薬理学的手法によって、または実験動物を使用して、決定することができる。ＥＤ５０／ＬＤ５０はグリコシル化インスリンポリペプチドの治療指標を表す。ヒトへの投与のための用量の適切な範囲の最終的な選択は臨床試験の間に決定される。
種々の実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの平均日用量は１０から２００Ｕ、例えば、２５から１００Ｕの範囲である（ここにおいて、非グリコシル化インスリンの１ユニットは約０．０４ｍｇであって、単純な上向き調整はさらなるＮ−結合グリカンのモラー質量に基づいて適用することができる）。ある実施形態において、これらの用量でのグリコシル化インスリンポリペプチドの量は毎日投与される。ある実施形態において、５から１０回のこれらの用量でのグリコシル化インスリンポリペプチドの量は毎週投与される。ある実施形態において、これらの用量の１０から２０倍でのグリコシル化インスリンポリペプチドの量は毎二週間投与される。ある実施形態において、これらの用量の２０から４０倍でのグリコシル化インスリンポリペプチドの量は毎月投与される。
ある実施形態において、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドを用いて、患者（例えば、哺乳動物患者）において高血糖症を治療することができる。ある実施形態において、患者は糖尿病である。しかしながら、本方法は糖尿病患者を治療することに限定されない。例えば、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドを用いて、損なわれた血糖制御に関連する感染を持つ患者において高血糖症を治療することができる。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドを用いて、糖尿病を治療することができる。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチド、または本開示の製剤を患者（例えば、哺乳動物患者）に投与される場合、それはインスリンポリペプチドの非グリコシル化バージョンよりも低血糖症を誘導しない。ある実施形態において、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドまたは製剤もまた、問題とする種についての正常な範囲内のＨｂＡ１ｃ値も誘導する。ある実施形態において、製剤は、例えば、約４から約６％範囲の、７％未満のＨｂＡ１ｃ値に導く。
種々の実施形態において、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドは、少なくとも１つのさらなる療法を受けている患者に投与してもよい。種々の実施形態において、少なくとも１つのさらなる療法は、投与されたグリコシル化インスリンポリペプチドと同一の病気または障害を治療することが意図される。種々の実施形態において、少なくとも１つのさらなる療法は、グリコシル化インスリンポリペプチドの副作用を治療することが意図される。２以上の療法は、患者が双方の療法から利益を受けている場合の期間がある限り、同一の、重複するまたは非重複するタイムフレーム内で投与することができる。２以上の療法は、患者が双方の療法から利益を受けている場合の期間がある限り、同一または異なるスケジュールで投与することができる。２以上の療法は、患者が双方の療法から利益を受けている期間がある限り、同一から異なる製剤内で投与することができる。ある実施形態において、薬物は本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドと混合してもよい（例えば、医薬製剤におけるグリコシル化インスリンポリペプチドと単純に組み合わせた薬物）。例えば、ある実施形態において、これらのアプローチのいずれかを用いて、１を超える抗−糖尿病薬を対照に投与することができる。このアプローチについて特定の例示的な実施形態は以下により詳細に記載される。
インスリン増感剤（例えば、メトフォルミン、グリタゾンのようなビグアニド）は、所与の量のインスリンに対する患者の応答を増大させることによって作用する。インスリン増感剤を受けている患者は、従って、他の同一の患者が必要とするよりもより低い用量の本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドを必要とする。かくして、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは、インスリン増感剤でやはり治療されている患者に投与することができる。種々の実施形態において、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドは、インスリン増感剤の不存在下で要求される正常な用量の７５％までで投与することができる。種々の実施形態において、正常な用量の５０、４０、３０または２０％までを投与することができる。
インスリン抵抗性は、正常な量のインスリンが正常なインスリン応答を生じさせるのに不適切であるという障害である。例えば、インスリン−抵抗性患者は、それらの抵抗性を克服し、および十分はグルコース−降下効果を供するためには、高い用量のインスリンを必要とし得る。これらの場合において、インスリンは抵抗性が低い患者において低血糖症を通常誘導するインスリン用量は、高度に抵抗性の患者においてグルコース−降下効果を発揮さえしない。同様に、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドは、それらが適当なタイムフレームにて高いレベルの生物活性インスリンを提供する場合に患者のこのサブクラスに対して効果的であるに過ぎない。ある実施形態において、患者のこのサブクラスの治療は２つのアプローチを組み合わせることによって促進することができる。かくして、ある実施形態において、伝統的なインスリン−ベースの療法を用いて、ベースラインレベルのインスリンを提供し、および本発明のグリコシル化インスリンポリペプチドは投与されて、患者によって必要とされる場合に生物活性インスリンの制御された補充を供する。かくして、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは、インスリンでやはり治療されている患者に投与することができる。種々の実施形態において、インスリンは、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドの不存在下で必要とされる正常な用量の７５％までを投与することができる。種々の実施形態において、正常な用量の５０、４０、３０または２０％までを投与することができる。本組合せアプローチは、インスリン分泌促進物質（例えば、スルホニル尿素、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４等）および／またはインスリン増感剤（例えば、メトフォルミン、グリタゾンのようなビグアニド）を受けているインスリン抵抗性患者で用いてもよいことが認識される。
ＰＫおよびＰＤ特性
種々の実施形態において、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドの薬物動態学的および／または薬力学挙動は、糖の血清中濃度の変動によって修飾することができる。
例えば、薬物動態学的（ＰＫ）見込みから、血清中濃度曲線は、糖（例えば、グルコース）の血清中濃度が増加する場合、または糖の血清中濃度が閾値と交差する場合（例えば、正常なグルコースレベルよりもより高い）、上方にシフトすることができる。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清中濃度曲線は、絶食かつ高血糖症条件下で哺乳動物に投与した場合に実質的に異なる。本明細書中で用いるように、用語「実質的に異なる」は、２つの曲線がスチューデントのｔ−検定（ｐ＜０．０５）によって決定して統計学的に異なることを意味する。本明細書中で用いるように、用語「絶食された状態」は、血清中濃度曲線が、５人以上の絶食された非糖尿病性個体のデータを組み合わせることによって得られたことを意味する。ある実施形態において、絶食された非糖尿病性個体は、血液を採った時点において糖尿病兆候がなく、かつ血液を採る時間から１２時間以内に食べていないランダムに選択された１８から３０歳である。本明細書中で用いるように、用語「高血糖症状態」は、血清中濃度曲線が、高血糖症状態（絶食状態下で観察される平均グルコース濃度を超えた少なくとも１００ｍｇ／ｄＬのグルコースＣｍａｘ）がグリコシル化インスリンポリペプチドおよびグルコースの同時投与によって誘導された、５人以上の絶食した非糖尿病性個体からのデータを組み合わせることによって得られたことを意味する。グリコシル化インスリンポリペプチドおよびグルコースの同時投与は、単に、グリコシル化インスリンポリペプチドが血清中にて検出可能なレベルで存在する場合の期間の間にグルコースＣｍａｘが起こることを必要とする。例えば、グルコース注射（または摂取）は、グリコシル化インスリンポリペプチドが投与される少し前に、それと同時に、またはその後少したって起こるようなタイミングとすることができる。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドおよびグルコースは異なる経路によって、または異なる位置において投与される。例えば、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは、グルコースが経口または静脈内投与されるのに対し、皮下投与される。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清中Ｃｍａｘは絶食した状態と比較して高血糖症状態下でより高い。加えて、または別法として、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの曲線下血清面積（ＡＵＣ）は、絶食した状態と比較して、高血糖症状態下でより高い。種々の実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清中排除速度は、絶食された状態と比較して、高血糖症状態下でより低い。実施例において議論したように、本発明者らは、ある実施形態において、合成インスリン−コンジュゲートの血清中濃度曲線は、１つの短いおよび１つの長い半減期を持つ２−コンパートメント双指数関数モデルを用いてフィットさせることができる。長い半減期は、グルコース濃度に特に感受性であるように見える。かくして、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの長い半減期は絶食された状態と比較して高血糖症状態下でより長い。ある実施形態において、絶食された状態は１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ等）のグルコースＣｍａｘを含む。ある実施形態において、高血糖症状態は２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬ等）グルコースＣｍａｘを含む。平均血清中滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清中吸収時間（ＭＡＴ）のような他のＰＫパラメーターの、前記したパラメーターのいずれかに変えて、またはいずれかと組み合わせて用いることができることが認識される。
ヒト、イヌ、ネコ、およびラットにおけるグルコース濃度の正常な範囲は６０から２００ｍｇ／ｄＬである。当業者であれば、異なる正常な範囲を持つ種について以下の値を外挿することができよう（例えば、ミニブタにおけるグルコース濃度の正常な範囲は４０から１５０ｍｇ／ｄＬである）。６０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度は低血糖症であると考えられる。２００ｍｇ／ｄＬを超えるグルコース濃度は高血糖症であると考えられる。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドのＰＫ特性は、グルコースクランプ方法（実施例参照）を用いてテストすることができ、およびグリコシル化インスリンポリペプチドの血清中濃度曲線は、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬ等のグルコース濃度で投与した場合に実質的に異なり得る。加えて、または別法として、血清中Ｔｍａｘ、血清中Ｃｍａｘ、平均血清中滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清中吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清中半減期は、２つのグルコース濃度において実質的に異なり得る。以下に議論するように、ある実施形態において、１００ｍｇ／ｄＬおよび３００ｍｇ／ｄＬは比較グルコース濃度として使用することができる。しかしながら、本開示は、限定されるものではないが、以下の対５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬ等のいずれか１つを含めた比較グルコース濃度の代替の対を持つこれらの実施形態の各々を含むことは理解されるべきである。
かくして、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドのＣｍａｘは、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度で哺乳動物に投与した場合により高い。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドのＣｍａｘは、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度にて哺乳動物に投与した場合に少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）高い。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドＡＵＣは、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度で哺乳動物に投与した場合により高い。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドのＡＵＣは、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度にて哺乳動物に投与した場合に、少なくとも５０％（例えば、少なくとも、例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）より高い。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清排除速度は、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度において哺乳動物に投与した場合に、より遅い。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清排除速度は、２つのグルコース濃度（例えば、１００ ｖｓ．３００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより低い濃度にて哺乳動物に投与した場合に、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％または少なくとも１００％）より速い。
実施例で議論されているように、本発明者らは、ある実施形態において、合成インスリン−コンジュゲートの血清中濃度曲線が１つの短いおよび１つの長い半減期を持つ２−コンパートメント双指数関数モデルを用いてフィットさせることができることを見出した。長い半減期は、グルコース濃度に対して特に感受性であるように見える。かくして、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの長い半減期は、２つのグルコース濃度（例えば、３００ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度において哺乳動物に投与した場合に、より長い。ある実施形態において、長い半減期は、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のより高い濃度において哺乳動物に投与した場合に、少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）より長い。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清中濃度曲線は、高血糖症状態下で哺乳動物に投与した場合に、インスリンポリペプチドの非グリコシル化バージョンの血清中濃度曲線と実質的に同一である。本明細書中で用いるように、用語「実質的に同一」は、スチューデントｔ−検定（ｐ＞０．０５）によって決定して２つの曲線の間に統計学的な差はないことを意味する。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清中濃度曲線は、絶食させた条件下で投与した場合に、インスリンポリペプチドの非グリコシル化バージョンの血清中濃度曲線とは実質的に異なる。ある実施形態において、コンジュゲートの血清中濃度曲線は、高血糖症条件下で投与した場合、インスリンポリペプチドの非グリコシル化バージョンの血清中濃度曲線と実質的に同一であり、および絶食させた条件下で投与した場合には、実質的に異なる。ある実施形態において、高血糖症条件は２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬ等）グルコースＣｍａｘを含む。ある実施形態において、絶食させた条件は１００ｍｇ／ｄＬ未満の（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ等の）グルコースＣｍａｘを含む。血清中Ｔｍａｘ、血清中Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、平均血清中滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清中吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清中半減期のような前記したＰＫパラメーターのいずれも比較することができることが認識される。
薬物動態学的（ＰＤ）見通しから、グリコシル化インスリンポリペプチドの生物活性は、グルコース濃度が増加する場合、またはグルコース濃度が閾値と交差し、例えば、通常のグルコースレベルよりも高い場合に、増加し得る。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの生物活性は、高血糖症条件と比較して絶食させた条件下で投与した場合により低い。ある実施形態において、絶食させた条件は１００ｍｇ／ｄＬ未満の（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ等の）グルコースＣｍａｘを含む。ある実施形態において、高血糖症条件は２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬ等の）グルコースＣｍａｘを含む。
ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドのＰＤ特性は、定常的なグルコース濃度を維持するのに必要なグルコース注入速度（ＧＩＲ）を測定することによってテストすることができる。そのような実施形態によると、グリコシル化インスリンポリペプチドの生物活性は、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬ等のグルコース濃度で投与した場合に実質的に異なり得る。かくして、ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの生物活性は、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度で哺乳動物に投与した場合により高い。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドの生物活性は、２つのグルコース濃度（例えば、３００ ｖｓ．１００ｍｇ／ｄＬグルコース）のうちのより高い濃度で哺乳動物に投与した場合に、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％または少なくとも１００％）より高い。ある実施形態において、ＰＤ挙動は、最小血中グルコース濃度（Ｔ最低点）に到達する時間、その間に血中グルコースレベルが最初の値のあるパーセンテージ（例えば、最初の値の７０％、またはＴ７０％ＢＧＬ）等未満にとどまる持続を比較することによって観察することができる。
一般に、本セクションで議論されたＰＫおよびＰＤ特徴のいずれも、種々の公開された薬物動態学的および薬力学的方法のいずれかに従って決定することができる（例えば、皮下送達に適した方法についてはＢａｕｄｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３，１９９８参照）。
また、これまでのは、グルコース−応答性グリコシル化インスリンポリペプチドとの関係で記載したが、同一の特性およびアッセイは、外因性糖、例えば、マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アルファ−メチルマンノース等を含めた他の糖に対して応答性であるグリコシル化インスリンポリペプチドに適用されることが認識されるであろう。前記にておよび実施例においてより詳細に議論されるように、絶食された、および高血糖症条件下でＰＫおよび／またはＰＤ特性を比較する代わりに、ＰＫおよび／またはＰＤ特性は、外因性糖の投与の有りおよび無しにて、絶食させた条件下で比較することができる。所与の外因性糖の異なるＣｍａｘ値に応答するグリコシル化インスリンポリペプチドを設計することができることが認識される。
外因性トリガー
先に述べたように、本明細書中に記載された方法、グリコシル化インスリンポリペプチドおよび組成物は、グルコース応答性グリコシル化インスリンポリペプチドに制限されない。実施例で実証されるように、いくつかの例示的な合成グルコース−応答性コンジュゲートも、アルファ−メチルマンノースのような外因性糖に対して応答性であった。従って、ある実施形態においては、グリコシル化インスリンポリペプチドは、アルファ−メチルマンノースまたはＬ−フコースのようなグルコース以外の糖、またはグリコシル化インスリンポリペプチドのＰＫまたはＰＤ特性を改変することができるいずれかの他の糖の外因性投与によってトリガーすることができると認識される。本明細書中で用いるように、「外因性」糖は、患者に投与するのでなければ、患者において有意なレベルで存在しないものである。ある実施形態において、患者は哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ラット等である。本明細書中で用いるように、糖は、患者のそのタイプについての正常な血清が０．１ｍＭ未満の糖を含むならば、患者において有意なレベルで存在しない。ある実施形態において、患者についての正常な血清は０．０８ｍＭ未満、０．０６ｍＭ未満、または０．０４ｍＭ未満の糖を含むことができる。
一旦グリコシル化インスリンポリペプチドが（例えば、徐放製剤として）前記したように投与されたならば、それは適当な外因性糖の投与によってトリガーすることができる。ある実施形態において、トリガーリング量の外因性糖が投与される。本明細書中で用いるように、外因性糖の「トリガーリング量」は、グリコシル化インスリンポリペプチドの少なくとも１つのＰＫおよび／またはＰＤ特性（例えば、先に議論したようなＣｍａｘ、ＡＵＣ、半減期等）の変化を引き起こすのに十分な量である。グリコシル化インスリンポリペプチドについての投与の前記した方法のいずれも外因性糖に等しく適用されるのは理解されるべきである。また、グリコシル化インスリンポリペプチドおよび外因性糖についての投与の方法は同一または異なってもよいのも理解されるべきである。種々の実施形態において、投与の方法は異なる（例えば、説明の目的で、グリコシル化インスリンポリペプチドは毎週皮下注射によって投与することができ、他方、外因性糖は毎日経口投与される）。外因性糖の経口投与は特に価値があるものである。というのは、それは患者のコンプライアンスを促進するからである。例えば、グリコシル化インスリンポリペプチドのＰＫおよびＰＤ特性は外因性糖のＰＫプロフィールに関連することは認識される。かくして、グリコシル化インスリンポリペプチドＰＫおよびＰＤ特性は、外因性糖のＰＫプロフィールを制御することによって調整することができる。当該分野でよく知られているように、外因性糖のＰＫプロフィールは用いる用量、経路、頻度および製剤に基づいて調整することができる。例えば、グリコシル化インスリンポリペプチドの短くかつ強い活性化が望まれるならば、経口即時放出製剤を用いることができよう。対照的に、グリコシル化インスリンポリペプチドのより長くより弱い活性化が望まれるならば、経口延長放出製剤を代わりに用いることができよう。即時および延長放出製剤の処方および製造における一般的な考慮は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。
また、本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドおよび外因性糖の投与の相対的頻度は同一または異なってもよいことも認識される。ある実施形態において、外因性糖はグリコシル化インスリンポリペプチドよりもより頻繁に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のグリコシル化インスリンポリペプチドは毎日２回、または３回、またはそれ以上の回数投与することができる。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは毎日投与することができ、他方、外因性糖は１日につき１回を超えて投与される。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは毎週２回、毎週、毎二週または毎月投与することができ、他方、外因性糖は毎日投与される。ある実施形態において、グリコシル化インスリンポリペプチドは毎月投与され、および外因性糖は毎週２回、毎週、または毎二週投与される。これらのスキームについての他の変形は当業者によって認識され、用いるグリコシル化インスリンポリペプチドおよび処方の性質に依存して変化する。
実施例１から３は例示的な合成インスリン−コンジュゲートＩ−６を調製するのに用いるプロセスを記載する（コンジュゲートの構造については図６を参照のこと）。実施例４から７は、この例示的な合成インスリン−コンジュゲートのＰＫおよびＰＤ特性がどのようにして糖濃度（例えば、内因性グルコースレベル）に対して感受性であるかを示すために行った実験も記載する。実施例８および９は、どのようにしてこれらの実験が本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドで行われるかを記載する。実施例１０は、２つの異なる酵母株にＮ−結合グリカンモチーフを含めるように作成されていない例示的なインスリンポリペプチドの小規模および大規模生産、精製、およびインビトロ酵素プロセッシングを記載する。実施例１１は、２つの異なる酵母株にＮ−結合グリカンモチーフを含めるように作成された例示的なインスリンポリペプチドの小規模および大規模生産、精製、およびインビトロ酵素プロセッシングを記載する。実施例１２は、Ｎ−結合グリカンモチーフを含めるように作成されたいくつかの例示的なインスリンポリペプチドの配列を記載する。実施例１３から１７は、図１５の例示的な合成コンジュゲートのいくつかで行った実験を記載する。
実施例１−有機溶媒中での多価活性化エステルとのアミン−機能性化薬物のコンジュゲーション
Ｎ−末端活性化エステルを含有するフレームワークを１ｍｌの無水ＤＭＳＯ中に６０ｍＭで溶解させ、続いて、４００μｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。溶液を室温で迅速に１０分間攪拌する。並行して、リガンドの１２２ｍＭ溶液を適当な容量の無水ＤＭＳＯ中で調製する。一旦溶解すれば、十分なリガンド溶液を１０分間にわたって滴下して、正確に、フレームワーク上の活性化エステル基の数Ｎから１を引いたものと同等な多数の反応性同等物を供する。例えば、フレームワーク上にＮ−３活性化エステル基があれば、（１×（３−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝０．９８ｍｌのリガンド溶液を加える。フレームワーク上にＮ＝４の活性化エステル基があれば、（１×（４−１）×６０ｍＭ／１２２ｍＭ）＝１．５ｍｌのリガンド溶液を加え、等々する。リガンド溶液を加えた後、溶液を室温にて２時間攪拌する。
次いで、アミノ担持薬物を、８．１ｍＭの濃度にて７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに別々に溶解させる。一旦溶解されれば、全薬物溶液を１分間にわたってフレームワーク／ＤＭＳＯ／リガンド／ＴＥＡ溶液に加え、続いて、さらに２時間室温で混合して、完全な反応を確実とする。
次いで、得られた溶液を、０．１５０Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ ｐＨ ５．０ ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水に１０倍だけ高希釈し、続いて、希塩酸で８．０の最終ｐＨにｐＨ調整する。水溶液を、まず、コンジュゲートした、およびコンジュゲートしていない物質の所望の分離のために適切な固相を用いるサイズ排除によって精製する。次いで、カラムのボイド容量を通過した溶液を、適切なサイズとされた限外濾過膜を用いてほぼ１０ｍｌまで濃縮する。この溶液を、さらに精製して、Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７μｍカラム、１９×１５０ｍｍ上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて所望の生成物を得る。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であって、緩衝液Ｂは０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製の前に、カラムを、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて８０％Ａ／２０％Ｂ移動相で１５ｍｌ／分にて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、１５ｍｌ／分の流速にて２分間にわたってカラムに注射し、その後、次の５分間にわたる８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線形グラジエントを使用し、続いて、次の２２分間にわたる７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのより遅い線形グラジエントを使用する。所望のピークの保持時間は用いる薬物、フレームワークおよびリガンドに依存して変化する。一旦収集されると、溶液は回転蒸発させて、アセトニトリルを除去し、および凍結乾燥して純粋なコンジュゲートが得られ、その同一性はＬＣ−ＭＳによって立証することができる（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
実施例２−保護されていないインスリンからの有機溶媒中で生産された多価糖とのＢ２９−インスリンコンジュゲート
本実施例は、保護されていないインスリンの場合には、Ｌｙｓ−Ｂ２９イプシロン−アミノ部位が最も反応性のアミンであり、続いて、Ａ１であり、次いで、Ｂ１アルファ−アミノ部位であるという事実を利用する。従って、保護されていないインスリンがアミン−含有薬物として用いられる場合、得られたコンジュゲートは大部分Ｌｙｓ−Ｂ２９位置に置換されるべきである。実施例１に記載された方法およびアミン−含有薬物としての組換えヒトインスリン（ＭＷ＝５８０８ Ｄａ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用い、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入したＴＳＡＴ−Ｃ６活性化エステルフレームワーク、およびリガンドしてのＡＥＴＭを用いて合成インスリン−コンジュゲートＩ−６を調製した。適切なサイズとされたサイズ排除培地はＢｉｏｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）であって、適切なサイズとされた限外濾過膜分子量カットオフは３ｋＤａであった。
Ｎ−末端配列決定に従って、ＡＥＴＭ−含有フレームワークのほぼ８７％はＬｙｓ−Ｂ２９（８５％純度、ＭＷ（ＬＣ−ＭＳ）７３７８）を介してインスリンにコンジュゲートされた。
実施例３―水性溶媒中での多価活性化エステルとのアミン−機能性化薬物のコンジュゲーション
本実施例は、反応を有機溶媒の代わりに水性溶媒中で行う、実施例１に記載された方法に対する代替法を記載する。
Ｎ末端活性化エステルを含有するフレームワークを６．２５ｍｌの無水ＤＭＳＯに６０ｍＭで溶解させ、続いて、２ｍｌ（過剰）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加する。溶液を室温で１０分間迅速に攪拌する。並行して、リガンドの４４８ｍＭ溶液を適切な容量の無水ＤＭＳＯ中で調製する。一旦溶解すれば、十分なリガンド溶液を１０分間にわたって滴下して、フレームワーク上の活性化エステル基の数Ｎから１を引いたものの１．５倍と等しい多数の反応性当量を供する。例えば、フレームワーク上にＮ＝３の活性化エステル基があれば、（１．５×（３−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝２．５ｍｌのリガンド溶液を加える。フレームワーク上にＮ＝４の活性化されたエステル基があれば、（１．５×（４−１）×６０ｍＭ／４４８ｍＭ）×６．２５ｍｌ＝３．８ｍｌのリガンド溶液を加え、等々する。リガンド溶液が加えられた後、溶液を室温にて１時間攪拌する。
次いで、アミン担持薬物を２．６７ｍｌの０．１Ｍ、ｐＨ１１の炭酸ナトリウム緩衝液に１７．２ｍＭで別々に溶解させ、およびｐＨを１．０Ｎ水酸化ナトリウムで１０．８に調整する。一旦溶解すれば、全フレームワーク／ＤＭＳＯ／リガンド／ＴＥＡ溶液を７５分間にわたって薬物／炭酸緩衝液に滴下する。滴下の間、得られた混合物のｐＨを、希薄なＨＣｌまたはＮａＯＨを用いて、必要ならば、５分毎に１０．８に調整する。完全な反応を確実とするための滴下の後に、溶液をさらに１５分間攪拌する。
次いで、得られた溶液を、０．１５０Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ ｐＨ ５．０ ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水に１０倍だけ高希釈し、続いて、希薄なＨＣｌで８．０の最終ｐＨにｐＨを調整する。水溶液を、まず、コンジュゲートされた、およびコンジュゲートされていない物質の所望の分離のために適切な固相を用いるサイズ排除によって精製する。次いで、カラムのボイド容量を通過した溶液を、適切なサイズとされた限外濾過膜を用いてほぼ４０ｍｌまで濃縮する。この溶液をさらに精製して、Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ Ｃ１８、７μｍ、１９×１５０ｍｍカラム上の分取用逆相ＨＰＬＣを用いて所望の生成物を得る。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡを含有する脱イオン水であって、緩衝液Ｂは０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔｒａＰｒｅｐ ６００システムを用いて８０％Ａ／２０％Ｂ移動相で１５ｍｌ／分にて平衡化する。ほぼ５ｍｌの粗製溶液を、１５ｍｌ／分の流速で２分間にわたってカラムに注射し、その後、次の５分間にわたる８０％Ａ／２０％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂの線形グラジエントを使用し、続いて、次の２２分間にわたる７５％Ａ／２５％Ｂから６２％Ａ／３８％Ｂのより遅い線形グラジエントを使用する。所望のピークの保持時間は、用いる薬物、フレームワーク、およびリガンドに依存して変化する。一旦収集されれば、溶液を回転蒸発させて、アセトニトリルを除去し、および凍結乾燥して、純粋なコンジュゲートが得られ、その同一性はＬＣ−ＭＳ（ＨＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって実証することができる。
実施例４―長時間作用インスリンコンジュゲート−用量応答効果
長時間作用コンジュゲートを生じさせるために、実施例３に記載された方法に従って調製された合成インスリン−コンジュゲートＩ−６の溶液からＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤を調製した。該製剤で用いた賦形剤はプロタミン、亜鉛、ｍ−クレゾールおよび塩を含み、その全てはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から商業的に得た。
Figure 2013535467
 表４に記載された順序で成分を加えた後に、一旦製剤が調製されれば、それをインビボのテストに先立って３０分間穏やかに混合した。
徐放プロフィールならびにグルコース−応答性ＰＫプロフィールをテストするために、以下の実験を行った。該製剤は、絶食させた正常な非糖尿病性ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００−５００ｇｍ、ｎ＝３）の首の背後に５または１５Ｕ／ｋｇ（グラムで表した体重／１．８７＝注射容量のマイクロリットル）で注射した。２４０分の遅延後、グルコース容量（４ｇ／ｋｇ）をＩＰ注射した。血液試料を、０分にて、および最初のコンジュゲート注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、および３００分後に尾静脈出血を介して収集した。血中グルコース値は、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。加えて、各時点からの血液を４℃で遠心して、血清を集めた。血清中インスリン濃度は、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定した。
図７に示すように、合成インスリン−コンジュゲートは、グルコースが注射されるまで、平坦なＰＫプロフィールを呈した。グルコースの応答は劇的で、容量−依存性であった（合成インスリン−コンジュゲートの５Ｕ／ｋｇ（左側）および１５Ｕ／ｋｇ（右側）容量で得られたデータを比較されたし）。低血糖症は初期または後期の時点で観察されなかった。
実施例５−糖尿病および非糖尿病における長時間作用性コンジュゲート
長時間作用性合成インスリン−コンジュゲート製剤のインビボ利用性を確認するために、本発明者らはそれ（５、１０および２０Ｕ／ｋｇ）を正常なおよびＳＴＺ−誘導糖尿病ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００から５００ｇｍ、ｎ＝６）に投与した。該製剤は表５における手法を用いて調製した。
Figure 2013535467
 コンジュゲートの生物活性をトリガーするのにグルコースの外部ＩＰ注射は用いなかった。その後、本発明者らは、コンジュゲート製剤のＰＫおよびＰＤプロフィールを制御するのにラットにおけるグルコースの内因性レベルに依拠した。最初のコンジュゲート注射の後の種々の時点において、血液試料を、尾静脈出血を介して収集した。血中グルコース値は、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。図８に示されたように、低血糖症は正常なまたは糖尿病ラットについて初期または後期の時点に観察しなかった。糖尿病ラットで観察されたグルコースプロフィールは劇的であって、コンジュゲートはより高いグルコース濃度によって活性化され、および長時間にわたって（最高容量にて８時間にわたって）容量比例的にそれらのグルコース−降下効果を発揮したことを示す。
実施例６−インビボ半減期／排出速度比較
コンジュゲートＩ−６がグルコースまたはアルファ−メチルマンノース（ａ−ＭＭ）のような阻害性糖の存在下または不存在下でインビボにて血清から除去される速度を決定するために、以下の実験を行った。各場合において、コンジュゲートＩ−６（または対照としてのＲＨＩ）を０．４ｍｇコンジュゲート／ｋｇ体重にて２つの頚静脈にカニューレを挿入した雄Ｓｐａｒｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０から４００ｇ、ｎ＝３）に投与した。
上昇したグルコースレベルの存在下で排出速度を決定するために、実験の開始から１時間前に、１つのラットカニューレを、滅菌された５０％ｗ／ｖグルコース溶液を含有するシリンジ注入ポンプに連結させた。ポンプ注入速度は実験によって調整して、動物における血中グルコースレベルが実験の間の全ての時点において３００ｍｇ／ｄＬを超えたままであることを確実とした。血中グルコースは商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。典型的な実験において、動物を３００ｍｇ／ｄＬを超えて維持するのに必要な注入ポンプ速度は、典型的には、８５μＬ／分よりも大きいことが判明した。血液試料はｔ＝０分において採取し、その後、滅菌コンジュゲート溶液または対照インスリンを第二のラットカニューレを介して静脈内注射し、直ちに続いて、ヘパリン−生理食塩水の追加溶液を注射して、コンジュゲート容量の全てが動物に投与されたことを確実とした。ヘパリン−生理食塩水でのカニューレラインの追加のフラッシュの後、第二のカニューレを用いて、ｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０、および１８０分のポスト−用量において血液試料を収集した。
ａ−ＭＭの存在下で排出速度を決定するために、実験の開始から１時間前に１つのラットカニューレを、滅菌された２５％ｗ／ｖ ａ−ＭＭ溶液を含有するシリンジポンプに連結した。ポンプに注入速度は実験によって調製したが、典型的には、８５μＬ／分に設定された。血液試料をｔ＝０分に採取し、その後、滅菌コンジュゲート溶液または対照インスリンを第二のラットカニューレを介して静脈内注射し、その後直ちに、ヘパリン−生理食塩水の追加溶液を注射して、コンジュゲート用量の全てが動物に投与されたことを確実とした。ヘパリン−生理食塩水でのカニューレラインの追加のフラッシュ後に、第二のカニューレを用いて、ｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０、および１８０分ポスト−用量において血液試料を収集した。
実験を通じて、血中グルコースは商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。各時点からの血液を４℃にて遠心して、血清を収集し、および血清インスリンまたは血清コンジュゲートの濃度を、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定した。インスリンまたはコンジュゲート血清中濃度 ｖｓ．時間データは、２−コンパートメントモデルに従って、２つの独立した崩壊指数関数（Ｃ（ｔ）＝ａ ｅｘｐ（−ｋａｔ）＋ｂ ｅｘｐ（−ｋｂｔ））の和と最良にフィットし、ここにおいて、ｔ１／２（ａ）＝（ｌｎ２）／ｋａおよびｔ１／２（ｂ）＝（ｌｎ２）／ｋｂである。結果を図９に示す。左側パネルはａ−ＭＭまたはグルコースの不存在下におけるコンジュゲートＩ−６−対−ＲＨＩについての有意により高い（＞５×）排出速度を示す。右側パネルは、排出速度がグルコース（Ｇ４００注入）の存在下において幾分（約５０％）減少し、およびａ−ＭＭおよびａ−ＭＭ（ａ−ＭＭ注入）の存在下においてかなり実質的に（約４００％）減少したことを示す。
実施例７−コンジュゲートＩ−６静脈内（ｉ．ｖ．）注入についてのグルコース−応答性ＰＫ
この実施例において、実施例６に記載されたｉ．ｖ．排出速度実験は、０．４ｍｇコンジュゲート／ｋｇ体重の単一のｉ．ｖ．ボーラスから連続的ｉ．ｖ．注入へ修飾された。実験の目標は、４時間の時点に投与されたグルコースの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射での６時間のコンジュゲート（または対照としてのＲＨＩ）の一定の入力速度を維持して、血清中コンジュゲート（またはＲＨＩ）濃度に対する得られた効果を決定することであった。２つの頚静脈にカニューレが挿入された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ ＪＶ／ＪＶ、３５０−４００ｇ、ｎ＝３）を、１つの頚静脈ラインをコンジュゲートまたはＲＨＩ注入のために用い、および他の頚静脈ラインを血液収集のために用いるように各実験で用いた。
ＲＨＩでは、５０ｍＵ／ｍｌの溶液を０．２μｍ濾過膜を通して滅菌濾過し、および０．０７ｍｌ／分で注入して、全６時間の実験のために３．５ｍＵ／分の一定の入力速度を供した。血液試料は、ｔ＝０分に採取し、その度一定のｉ．ｖ．注入を開始した。第二のカニューレを用いて、ｔ＝３０、６０、１２０、１８０および２４０分において血液試料を収集した。ｔ＝２４０分において、４ｇ／ｋｇ用量のグルコースをｉ．ｐ．注射を介して投与し、続いて、ｔ＝２５５、２７０，３００、３３０および３６０分において血液試料を収集した。
コンジュゲートＩ−６では、１５０ｍＵ／ｍｌ溶液を、０．２μｍ濾過膜を通して滅菌濾過し、および０．１０ｍｌ／分で注入して、全６時間実験のための１５ｍＵ／分の一定入力速度を供した。血液試料をｔ＝０分に採取し、その後、一定のｉ．ｖ．注入を開始した。第二のカニューレを用いて、ｔ＝３０、６０、１２０、１８０、および２４０分において血液試料を収集した。ｔ＝２４０分において、１、２または４ｇ／ｋｇ用量のグルコースをｉ．ｖ．注入を介して投与し、続いて、ｔ＝２５５、２７０、３００、３３０および３６０分において血液を収集した。
実験を通じて、血中グルコースは、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。各時点からの血液を４℃において遠心して、血清を収集し、および血清中インスリンまたは血清中コンジュゲート濃度を、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定した。
図１０の最初の２つのパネルは、４ｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．グルコース注射の前および後における、ＲＨＩの３．５ｍＵ／分注入およびコンジュゲートＩ−６の１５ｍＵ／分注入についての血中グルコースおよび血清中インスリン／コンジュゲート濃度プロフィールを比較する。ＲＨＩ注入は、Ｉ−６注入と比較して、グルコース注射に先立って有意な低血糖症を引き起こす。血中グルコース濃度が減少するにつれて、血中グルコース濃度は増加し、続いてベースラインレベルに迅速に復帰するので、ｉ．ｐ．グルコース注射に続いて、コンジュゲートＩ−６血清中濃度は３００％を超えて直ちに増加する。他方、ｉ．ｐ．グルコース注射後に血清中ＲＨＩ濃度に有意な変化はない。図１０の次の３つのパネルは、ｉ．ｐ．グルコース注射の間に血清中コンジュゲート濃度が増加する程度は、投与されたグルコースの用量および得られた血中グルコースレベルに直接的に関連することを示す。例えば、血清中コンジュゲート濃度のベースライン変化に対して５０％ピークのみが１ｇ／ｋｇグルコース注射で観察され、他方、ベースライン変化に対する３００％ピークは４ｇ／ｋｇ用量について観察される。
実施例８−インビボ半減期／排出速度比較
本開示のグリコシル化インスリンポリペプチドが、グルコースまたはアルファ−メチルマンノース（ａ−ＭＭ）のような阻害性糖の存在下または不存在下においてインビボにて血清から除去される速度を決定するために以下の実験を行う。各場合において、グリコシル化インスリンポリペプチド（または対照としてのＲＨＩ）は、０．４ｍｇ／ｋｇ体重にて、２つの頚静脈にカニューレを挿入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０−４００ｇ、ｎ＝３）に投与する。
上昇したグルコースレベルの存在下で排出速度を決定するために、実験の開始から１時間前に、１つのラットカニューレを、滅菌された５０％ｗ／ｖグルコース溶液を含有するシリンジ注入ポンプに連結させる。ポンプ注入速度は実験によって調整して、動物における血中グルコースレベルが実験の間の全ての時点において３００ｍｇ／ｄＬを超えたままとすることを確実とする。血中グルコースは、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定する。血液試料はｔ＝０分に採取し、その後、滅菌グリコシル化インスリンポリペプチド溶液または対照ＲＨＩ溶液を、第二のラットカニューレを介して静脈内に注射し、続いて直ちに、ヘパリン−生理食塩水の追加液を注射し、グリコシル化インスリンポリペプチドの用量の全てが動物に投与されたことを確実とする。ヘパリン−生理食塩水でのカニューレラインの追加のフラッシュ後に、第二のカニューレを用いて、ｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０、および１８０分ポスト−用量において血液試料を収集する。
ａ−ＭＭの存在下で排出速度を決定するために、実験の開始から１時間前に、１つのラットカニューレを、滅菌された２５％ｗ／ｖ ａ−ＭＭ溶液を含有するシリンジ注入ポンプに連結する。ポンプ注入速度は実験者によって調整される。血液試料はｔ＝０分に採取し、その後、滅菌されたコンジュゲート溶液または対照インスリンを第二のラットカニューレを介して静脈内に注射し、続いて直ちにヘパリン−生理食塩水の追加液を注射して、コンジュゲート用量の全てが動物に投与されたことを確実とする。ヘパリン−生理食塩水でのカニューレラインの追加のフラッシュ後に、第二のカニューレを用いて、ｔ＝１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０、および１８０分ポスト−用量において血液試料を収集する。
実験を通じて、血中グルコースは商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定する。各時点からの血液を４℃で遠心して、血清を収集し、および血清中インスリンまたは血清中コンジュゲートの濃度を、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定する。ＲＨＩまたはグリコシル化インスリンポリペプチド血清中濃度−対−時間データは、２−コンパートメントモデルに従った２つの独立した崩壊指数関数（Ｃ（ｔ）＝ａ ｅｘｐ（−ｋａｔ）＋ｂ ｅｘｐ（−ｋｂｔ））の和と最良にフィットし、ここにおいて、ｔ１／２（ａ）＝（ｌｎ２）／ｋａおよびｔ１／２（ｂ）＝（ｌｎ２）／ｋｂである。ａ−ＭＭまたはグルコースの不存在下におけるグリコシル化インスリンポリペプチド−対−ＲＨＩについてのより高い排出速度が予測される。高濃度のグルコースまたはａ−ＭＭの添加は、グリコシル化インスリンポリペプチドの排出速度を遅らせると予測される。
実施例９−グリコシル化インスリンポリペプチド ｉ．ｖ．注入についてのグルコース−応答性ＰＫ
本実施例において、実施例８に記載されたｉ．ｖ．排出速度実験は、０．４ｍｇ／ｋｇ体重の単一のｉ．ｖボーラス．から連続的なｉ．ｖ．注入に修飾される。実験の目標は、４時間の時点において投与されたグルコースのｉ．ｐ．注射と共に６時間のグリコシル化インスリンポリペプチド（または対照としてのＲＨＩ）の一定の入力速度を維持して、血清中グリコシル化インスリンポリペプチド（またはＲＨＩ）濃度に対する得られた効果を決定することである。２つの頚静脈カニューレが挿入された雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０−４００ｇ、ｎ＝３）を、１つの頚静脈ラインはグリコシル化インスリンポリペプチドまたはＲＨＩ注入のために用いられ、他の頚静脈ラインは血液収集のために用いられるように、各実験で使用される。
ＲＨＩについては、５０ｍＵ／ｍｌ溶液は０．２μｍ濾過膜を通して濾過し、および０．０７ｍｌ／分で注入して、全６時間の実験のために３．５ｍＵ／分の一定入力速度を供する。血液試料はｔ＝０分に採取し、その後、一定のｉ．ｖ．注入を開始する。第二のカニューレを用いてｔ＝３０、６０、１２０、１８０および２４０分において血液試料を収集する。ｔ＝２４０分において、４ｇ／ｋｇ用量のグルコースはｉ．ｐ．注射によって投与され、続いて、ｔ＝２５５、２７０、３００、３３０および３６０分において血液を収集する。
グリコシル化インスリンポリペプチドについては、１５０ｍＵ／ｍｌ溶液を、０．２μｍ濾過膜を通じて滅菌濾過し、および０．１０ｍｌ／分に注入して、全６時間実験のために１５ｍＵ／分の一定入力速度を供する。血液試料ｔ＝０分に採取し、その後、一定ｉ．ｖ．注入が開始される。第二のカニューレを用いて、ｔ＝３０、６０、１２０、１８０および２４０分において血液試料を収集する。ｔ＝２４０分において、１、２、または４ｇ／ｋｇ用量のグルコースをｉ．ｐ．注射を介して投与し、続いて、ｔ＝２５５、２７０、３００、３３０および３６０分において血液を収集する。
実験を通じて、血中グルコースは商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定する。各時点からの血液を４℃で遠心して、血清を収集し、および血清中ＲＨＩまたは血清中グリコシル化インスリンポリペプチドの濃度を、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定する。
ＲＨＩ注入は、グリコシル化インスリンポリペプチド注入と比較して、グルコース注射に先立って有意な低血糖症を引き起こすと予測される。グルコース濃度が減少するにつれて、血中グルコース濃度は増加し、続いて、ベースラインレベルに迅速に戻るので、ｉ．ｐ．グルコース注射に続いて、グリコシル化インスリンポリペプチドの血清中濃度は増加すると予測される。ｉ．ｐ．グルコース注射後の血清中ＲＨＩ濃度の有意な変化は予測されない。血清中コンジュゲート濃度がｉ．ｐ．グルコース注射の間に増加する程度は、投与されたグルコースの用量および得られた血中グルコースレベルに直接的に関連すると予測される。
実施例１０−組換えインスリンポリペプチド：酵母での生産、蛋白質精製およびインビトロ酵素プロセッシング
本実施例は、小規模および大規模の双方での、２つの異なる酵母株（ＫＭ７１およびＧＳ１１５）における数種の例示的なインスリンポリペプチドの組換え生産を示す。これらのインスリンポリペプチドはＮ−結合グリカンモチーフを含むように作成されなかった。組換えにより生産されたインスリンポリペプチドは予測された分子量を有し、および抗−インスリン抗体によって認識された。本実施例に記載された実験は、酵母において製造されたインスリンポリペプチドが商業的規模の収率を生じたことを示す。本実施例は、（Ｃ−ペプチドおよびリーダーペプチドを除去するための）組換えにより生産されたインスリンポリペプチドのインビトロ酵素プロセッシングで用いた手法も記載する。
材料および方法
エレクトロコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株調製
ＫＭ７１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をＹＰＤブロス中で３０℃にて培養した（リットル当たり：１０ｇ酵母エキス、２０ｇヘプトン、および２０ｇグルコース、ｐＨ６．５）。株の再生に成功後、エレクトロコンピテントＫＭ７１を、ＷｕおよびＬｅｔｃｈｗｏｒｔｈ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：１５２−４）によって記載されているように調製した。エレクトロコンピテントＫＭ７１は−８０℃のフリーザーに保存した。エレクトロコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は同一の手法によって調製した。
遺伝子構築体を発現するインスリンポリペプチドの調製
インスリンポリペプチド構築体の遺伝子合成は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ国）で行った。簡単に述べると、インスリンポリペプチドの発現をコードする注目する遺伝子を表６にリストする。該遺伝子はＧｅｎｅＡｒｔで合成し、次いで、ＢａｍＩ（５’部位）およびＥｃｏＲ１（３’部位）酵素で切断し、次いで、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）における同一の部位に挿入した。次いで、得られたプラスミドを培養フラスコ中のＥ．ｃｏｌｉにおいて増幅させ、次いで、抽出し、精製し、ＴＥ緩衝液中のプラスミドＤＮＡの約１ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
Figure 2013535467
Figure 2013535467
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換のためのＤＮＡ調製
４種の遺伝子構築体をＧＳ１１５およびＫＭ７１を形質転換するために最初に用いた。エレクトロポレーションによる形質転換に先立って、各構築体をＳａｌＩによって線状化した。各構築体の完全な線状化はアガロースゲル電気泳動によって確認した。次いで、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＳａｌＩおよび塩を線状化プラスミドから除去した。線状化されたプラスミドを、オートクレーブ処理した脱イオン水を用いてスピンカラムから溶出させた。
一旦ＤＮＡが酵母株に形質転換されたならば、得られた遺伝子構築体は表７に示されたアミノ酸配列につきコードする。プロ−リーダーペプチド配列は培地への蛋白質分泌に先立って酵母内のＫｅｘ−２エンドプロテアーゼによって開裂されるように設計する（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：７９−８６）。かくして、培地に分泌された得られたインスリンポリペプチドは［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］配列に結合したリーダーペプチド配列のみを含む。
Figure 2013535467
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Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換
線状化プラスミドを、ＷｕおよびＬｅｔｃｈｗｏｒｔｈによって報告された手法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：１５２−４）に従ってエレクトロコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５およびＫＭ７１（双方はＨｉｓ−株）に個々に形質転換した。エレクトロポレーションに付された細胞を１ｍＬの氷冷、１Ｍソルビトールに再懸濁させ、および最小デキストロース−ソルビトール寒天（アンモニアおよびアミノ酸を含まない１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、２％デキストロース、１Ｍソルビトール、および２％寒天）プレート上で平板培養した。寒天プレートを３０℃にて４から７日間インキュベートした。ＧＳ１１５およびＫＭ７１ゲノムに組み込まれた発現プラスミドはＨｉｓ＋表現型を形質転換体とし、形質転換体がヒスチジン補足無しの最小デキストロース−ソルビトール寒天で成長するのを可能とする。
高−コピー数の発現カセットでのクローンについてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体のためのスクリーニング
前記工程において４の発現プラスミドでのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの２株において導かれたクローンを、高−コピー数の遺伝子構築体の組込みについて個々にスクリーニングした。全ての形質転換体は、ヒスチジン補足なくして最小デキストロース−ソルビトール寒天で選択した。各形質転換は５００を超えるＨｉｓ＋形質転換体を生じさせた。これらの形質転換体のいくつかは、発現プラスミドの多数コピーを含有すると予測される。というのは、多数の組込み事象はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて天然で起こるからである。これらの高−コピー数の形質転換体は、より高いレベルのインスリンポリペプチドを生じさせることができた。従って、全ての形質転換体はゲネチシンに対するそれらの抵抗性に基づいてスクリーニングして、最高コピー数を持つものについて選択した。というのは、発現プラスミドの全てはｐＰＩＣ３．５Ｋ−誘導体であって、ゲネチシン−抵抗性マーカーを含有するからである（すなわち、より高いコピーのクローンはゲネチシン抵抗性のより高い取込みにつながるはずである）。
Ｈｉｓ＋形質転換体は最小デキストロース−ソルビトール寒天で成長させ、一緒にプールし、およびゲネチシンを含有するＹＰＤ寒天（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロースおよび２％寒天）上で以下の手法に従って平板培養した：
・１から２ｍｌの滅菌水を、各最小デキストロース−ソルビトールプレート上の（各発現プラスミド−株組合せからの）Ｈｉｓ＋形質転換体上にピペットで注いだ。
・Ｈｉｓ＋形質転換体は、滅菌スプレッダーを用い、およびそれを寒天の頂部を横切って泳動させることによって水に再懸濁させた。
・細胞懸濁液を移動させ、および滅菌した５０ｍｌ円錐遠心管に移動させ、およびプールし、および軽く渦巻かせた。
細胞懸濁液の細胞密度は分光光度計（１ＯＤ６００ユニット≒５×１０７細胞／ｍｌ）を用いて決定した。
・１０５の細胞を、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、および４．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にてゲネチシンを含有するＹＰＤプレート上で平板培養した。
・プレートを３０℃でインキュベートし、および毎日チェックした。ゲネチシン−抵抗性コロニーは出現するのに３から５日を要した。
ＹＰＤ−ゲネチシンプレート上で成長したコロニーを、同一濃度のゲネチシンを含有するＹＰＤ寒天上で純度のために画線培養して単離されたコロニーが高濃度のゲネチシンに対して抵抗性であることを確実とした。種々のゲネチシン濃度レベルにおける数種のコロニーを、次いで、振盪フラスコ中でのインスリンポリペプチド発現実験のために選択した。
振盪−フラスコ実験
振盪フラスコ実験を、合計８０の振盪培養フラスコについて、２つの緩衝液条件（緩衝化−対−非緩衝化培地）にて４０のゲネチシン−抵抗性クローン（４発現プラスミド×２株×５形質転換体）で行った。
形質転換体の半分はＫＭ７１誘導体であり、これはＭｕｔｓ表現型を有する。前記で調製した画線培養プレートからの単離されたＫＭ７１形質転換体コロニーを用いて、１００ｍＬの非緩衝化ＭＧＹブロス（１％酵母エキス、２％ペプトン、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセロール）または１００ｍＬ ＢＭＧＹブロス（１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６を含むのを除いてＭＧＹと同一）を接種した。これらの種子培養を、２５０ｒｐｍで１６時間、またはＯＤ６００値が２から６に到達するまで、軌道振盪にて３０℃でインキュベートした。次いで、各ＭＧＹ培養の小さなアリコットを用いて、グリセロールストックを調製した。次いで、残りのＭＧＹ培養を４０００×ｇでの５分間の遠心によって回収した。培養上清を捨て、各細胞ペレットを２０ｍＬ ＭＭＹブロス（グリセロールを０．５％メタノールで置き換えた以外はＭＧＹと同一）に再懸濁させた。同様に、ＢＭＧＹ種子培養は４０００×ｇでの５分間の遠心によって回収した。培養上清を捨て、各細胞ペレットを２０ｍＬのＢＭＭＹブロス（グリセロールを０．５％メタノールによって置き換えた以外はＢＭＧＹと同一）で再懸濁させた。
ＭＭＹおよびＢＭＭＹブロス中のメタノールは蛋白質の発現を誘導する。ＭＭＹおよびＢＭＭＹ培養は２５０ｒｐｍでの９６時間の軌道振盪にて３０℃でインキュベートした。２４時間毎にメタノールを各培養に０．５％の最終濃度まで加えた。培養の０．５−ｍＬのアリコットも、誘導の開始後２４時間毎に各振盪フラスコからやはり除去した。これらの試料については、ミクロ遠心によって培養上清から細胞を分離し、双方の画分を−８０℃で貯蔵した。
形質転換体の第二の半分はＧＳ１１５誘導体であり、これはＭｕｔ＋であると予測された。先に記載されたように調製された画線培養されたプレートからの単離されたＧＳ１１５形質転換体コロニーを用いて、２５ｍＬのＭＧＹブロスおよび２５ｍＬのＢＭＧＹブロスを接種した。これらの種子培養を、２５０ｒｐｍにおいて１６時間、またはＯＤ６００値が２から６に到達するまで、軌道振盪にて３０℃でインキュベートした。次いで、各ＭＧＹ培養の小さなアリコットを用いて、グリセロールストックを調製した。残りの細胞のもう１つのアリコットを、出発ＯＤ６００値が約１であるように、２０ｍＬのＭＭＹブロスを接種するために遠心によって回収した。同様に、ＢＭＧＹ種子培養を用いて、出発ＯＤ６００値が約１であるように、２０ｍＬのＢＭＭＹブロスを接種した。ＭＭＹおよびＢＭＭＹ培養を、２５０ｒｐｍで９６時間、軌道振盪にて３０℃においてインキュベートした。２４時間毎に、メタノールを０．５％の最終濃度となるように各培養に加えた。培養の０．５−ｍＬのアリコットを、誘導の開始後２４時間毎に各振盪フラスコから除去した。細胞を、ミクロ−遠心によって培養上清から分離し、および双方の画分を−８０℃で貯蔵した。
誘導の９６時間後、全ての培養を遠心によって回収した。細胞ペレットを捨てた。誘導の間に種々の時点において収集された最終の培養上清み＋培養上清みを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌａｄｄｅｒ：ＳｅｅＢｌｕｅ＠Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅｓｔａｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（１×）；Ｓｔａｉｎ：ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ；Ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ：Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ １６．５％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ／Ｐｅｐｔｉｄｅ；Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：１× Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ／ＳＤＳ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｒｉｃｉｎｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）または酵素−酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｒｃｏｄｉａ Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）によってインスリンポリペプチド発現の収率について分析した。
酵母における大規模なインスリンポリペプチド発現のための培地
ＢＭ Ｙ＝ＢＭ Ｙ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｅｋｎｏｖａ，カタログ番号Ｂ８００１）
ＢＭＧＹ＝ＢＭ Ｙ＋０．１％グリセロール（ｖ／ｖ）
ＢＭＭＹ＝ＢＭ Ｙ＋メタノール
酵母における大規模なインスリンポリペプチド発現のためのＭＤＳ寒天プレートの調製
３１９ｇのソルビトールおよび３５ｇの寒天を１．４Ｌのジ−Ｈ２Ｏに溶解させた。混合物を３０分間オートクレーブ処理した。温度を６０℃まで降下させ、その後、処置を行った。次に、脱イオン水中の硫酸アンモニウムを含有する１７５ｍＬの滅菌１３．４％（ｗ／ｖ）の酵母−窒素ベース（ＹＮＢ）を加えた。この混合物に、脱イオン水中の１７５ｍＬの滅菌２０％グルコースおよび脱イオン水中の３．５ｍＬの滅菌０．０２％ビオチン溶液の一部を加えた。溶液を均質になるまで混合し、次いで、プレートに注いだ。
酵母におけるインスリンポリペプチドの大規模な発現および培養
滅菌ループを用い、凍結された細胞のアリコットをＭＤＳプレートに移し、および画線培養して、単一のコロニーを得た。プレートを３０℃にて２から４日間インキュベートして酵母のコロニーを解明した。１つのコロニーを滅菌ループでランダムに拾い、それを用いて、２５ｍＬのＢＭＧＹ培地（２４．１７ｍＬのＢＭ Ｙ＋０．８３ｍＬの３０％グリセロール）を接種した。この培地を３０℃のインキュベータ−／シェーカー（約１５０ｒｐｍ）で２４時間インキュベートした。
この時点の後、７５ｍＬのＢＭＧＹ（７２．５ｍＬのＢＭ Ｙ＋２．５ｍＬの３０％グリセロール）を培養に加えて、約１００ｍＬの最終容量を得た。インキュベーションは同一条件下でさらに２４時間継続した。翌日、光学密度（ＯＤ）をアッセイして、どれくらい多くプレ培養が１０００ＯＤアリコットを得るのに必要かを決定した（例えば、ＯＤ＝１５であれば、１０００ＯＤ／１５ＯＤ＊ｍＬ−１＝＞６６．７ｍＬのプレ培養が１０００ＯＤを得るのに必要であった）。
次いで、プレ培養の計算された容量を遠心し（４０００ｒｐｍ、１０分間の４℃）、および上清をデカントした。ペレットを９９０ｍＬのＢＭ Ｙ培地に再懸濁させた。ＯＤを再度チェックし（それは１．０程度であるはずである）、および培養容量を、必要であれば、それに従って調製した。次いで、１０ｍＬの生化学グレードのメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ＃４９４４３７）をフラスコに加え、およびフラスコを約１５０ｒｐｍのインキュベータ／シェーカー中で３０℃にて２４時間インキュベートした。メタノールを、蛋白質発現の所望のレベルに依存して、２４時間毎に２から６日間加えた。
酵母成長の所望のレベルが達成された後、培養を遠心し（１０，０００ｒｐｍ、３０分間の４℃）、上清をデカントし、および清浄な容器中に保ち、および必要となるまで−８０℃で凍結させた。
インスリンポリペプチドの大規模な精製
培養フラスコからの細胞を４０００×ｇの遠心機を介して４℃にて１０分間回転沈降させた。得られた上清を清浄なフラスコにデカントした。１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨを用いて上清のｐＨを約３．３に調製し、続いて、上清を等用量の脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で希釈した。
得られた培養上清を０．２ミクロンの低結合フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通した濾過を介して清澄化させた。別途、イオン−交換カラム（１．４２ｃｍ×１．４２ｃｍ×５．０ｃｍ）は、２５ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．３（洗浄緩衝液）中で調製した、調製されたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流動培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。一旦カラムが適切に充填されれば、カラムを蠕動ポンプに連結して、培養上清のイオン交換カラムへの負荷を可能とした（約１０ｍＬ／分）。一旦培養上清の全てがカラムに負荷されたならば、ほぼ１０のカラム容量（ＣＶ）の洗浄緩衝液を、蠕動ポンプを用いてカラムに通した。これを行った後、精製されたインスリンポリペプチドを、ほぼ２から５のＣＶの溶出緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６および２００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてカラムから溶出させた。
得られた精製されたインスリンポリペプチド溶液を濃縮し、およびＭａｓｔｅｒＦｌｅｘモデル７５２３−８０ポンプ（ＣｏｌｅＰａｌｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、イリノイ州）に連結された透析濾過設定（８８ｃｍ２および０．１１ｍ２のカセットホルダー、５ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３ ０．１１ｍ２カセットフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて脱塩した。溶液をまず濃縮し、またほぼ２５０ｍＬの容量まで希釈し、次いで、ほぼ８から１０の透析容量のためのＭｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水に対して透析濾過した。
次いで、脱塩された精製されたインスリンポリペプチド溶液を凍結乾燥するか、または引き続いての酵素処理工程で直接的に用いた。
インビトロ酵素処理
Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼ（ＡＬＰ）を、１ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ中の２Ｕの酵素を溶解させることによって調製した。作動溶液は、酵素ストック溶液を０．２Ｕ／ｍＬの濃度のためにＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏでさらに１：９希釈することによって調製した。
全ての１０ ＲＨＩ−１突然変異体からのブロスを用いた（ＧＳ１１５ ＲＨＩ−１ Ａ−ＥおよびＫＭ７１ ＲＨＩ−１ Ａ−Ｅ）。各ブロス試料の２つの２００μＬのアリコットを調製し、４０μＬの２Ｍ Ｔｒｉｓの添加によってｐＨ約１０に調整した。約５４０μｍＬのヒトＲＨＩの２つのアリコットを同様な方法で調製して、対照として作用させた。２．４μＬの作動酵素溶液をアリコットの各対の１つに加えた。２．４μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏを他方に加えて、対照として供した。試料をロッカー上で室温にて４．５時間インキュベートし、次いで、分析まで−８０℃で凍結させた。
試料を、２０μＬのＴｒｉｃｉｎｅ試料緩衝液（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を１０μＬの調製されたブロスに加え、および５分間沸騰させることによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングのために調製した。ペプチドおよび蛋白質ラダーと共に試料を、室温にて１．７５時間の間１２５Ｖで泳動させた１６．５％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル上で分解した。次いで、蛋白質を、ｉＢｌｏｔ乾燥移動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プログラムＰ３を用いるニトロセスロース膜に５．５分間で移動させた。膜をＰＢＳ中の０．２５％グルタルアルデヒドで１５分間固定し、次いで、ＴＢＳで３×５分洗浄した。ブロッキングは、室温のロッカー上で、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）中の５％粉乳中で１時間行った。次いで、ブロットを、シェーカーで、ＰＢＳＴ中の１％粉乳に１：１０００希釈したマウス抗−ヒトプロインスリン／インスリン抗体（Ａｂｃａｍ）中で４℃にて一晩インキュベートした。ブロットをＰＢＳＴで２×１０分洗浄し、ＰＢＳＴ中の１％乳に１：３０００希釈したＨＲＰコンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ中で室温にて２時間インキュベートした。ブロットをＰＢＳＴ中で２×１０分洗浄し、続いて、ｄＨ２Ｏ中で２分間洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）中で室温にて２時間インキュベートし、続いて、ｄＨ２Ｏで強く洗浄することによって、バンドを発色させた。
結果
酵母中でのインスリンポリペプチドの生産
本実施例は酵母におけるインスリンポリペプチドの生産を示す。特に、本実施例は、２つの異なる酵母株におけるインスリンポリペプチド（具体的にはＲＨＩ−１、ＲＨＩ−２、ＲＨＩ−３、およびＲＡＴ−１の生産）の生産を明示的に示す。本開示は、これらの手法が、（実施例１１にさらに詳しく記載された）少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含有するように突然変異されたインスリンポリペプチドのような、いずれかの他の組換えインスリンポリペプチドを発現し、およびそれを精製するのに有用であり得るという認識を含む。本開示ｎは、酵母の他の株がインスリンポリペプチドの発現で適当であるという認識も含む。
図１１は、緩衝化（ＢＭＭＹ）および非緩衝化（ＭＭＹ）条件下で成長させたＧＳ１１５株クローンからの未精製培養上清収率を表す。図１１の左側パネルは、ＥＬＩＳＡ分析（ＩＳＯ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いる種々のクローン（「クローン＃」とは、異なるゲネチシンプレート抵抗性レベルから得られたクローンを言う）からのｍｇ／Ｌで表したインスリンポリペプチド収率を表す。図１１の右側パネルは、クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表し、生産されたインスリンポリペプチドの分子量を示す。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、収率比較目的で、２５０ｍｇ／Ｌにおける、頂部右側ゲルのレーン１４において、および底部右側ゲルのレーン２において示される。予測されるように、インスリンポリペプチドは、リーダーペプチドおよび連結ペプチド（「Ｃ−ペプチド」）により、インスリンポリペプチドはＲＨＩ標準のそれよりも高いＭＷを有する。
図１２は、緩衝化条件下で成長させたＫＭ７１株クローンからの未精製培養上澄収率を表す。図１２の左側パネルは、ＥＬＩＳＡ分析（ＩＳＯ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いる種々のクローン（「クローン＃」とは、異なるゲネチシンプレート抵抗性レベルから得られたクローンを言う）からのｍｇ／Ｌで表したインスリンポリペプチド収率を表す。図１２の右側パネルはクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表し、生産されたインスリンポリペプチドの分子量を示す。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、収率比較目的で、頂部右側ゲルのレーン１５から１８（６０から５００ｍｇ／Ｌ）において、および底部右側ゲルのレーン５から９（３０から５００ｍｇ／Ｌ）において示される。予測されるように、インスリンポリペプチドは、リーダーペプチドおよび連結ペプチド（「Ｃ−ペプチド」）のため、ＲＨＩ標準のそれよりも高いＭＷを有する。
図１３は、非緩衝化条件下で成長させたＫＭ７１株クローンからの未精製培養上清収率を表す。図１３の左側パネルは、ＥＬＩＳＡ分析（ＩＳＯ−インスリンＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いる種々のクローン（「クローン＃」とは、異なるゲネチシンプレート抵抗性レベルから得られたクローンを言う）からのｍｇ／Ｌで表したインスリンポリペプチド収率を表す。図１３の右側パネルはクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表し、生産されたインスリンポリペプチドの分子量を示す。組換えヒトインスリン標準（ＲＨＩ標準）は、収率比較目的で、頂部右側ゲルのレーン８および９（２５０および１００ｍｇ／Ｌ）において、および底部右側ゲルのレーン１８（２５０ｍｇ／Ｌ）において示される。予測されるように、インスリンポリペプチドは、リーダーペプチドおよび連結ペプチド（「Ｃ−ペプチド」）のため、ＲＨＩ標準のそれよりも高いＭＷを有する。
図１１から１３に表された結果は、種々のプラスミド構築体によって生産されたインスリンポリペプチドが正しいＭＷのものであったことを示す。加えて、これらのデータは、インスリンポリペプチドがインスリン様であることを示す。というのは、それらは、ヒトインスリンに対して特異的な抗体を用いる商業的インスリンＥＬＩＳＡキットによって測定可能であり、かつ検出可能であるからである。これらのデータは、さらに、インスリンポリペプチドが商業的に有用なレベル（例えば、＞２５ｍｇ／Ｌ）において酵母で発現できることを示す。最後に、これらのデータは、粗製培養上清からの、ＥＬＩＳＡ−測定収率およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ−測定収率の間に良好な相関を示した。換言すれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの強度が増加すると、ＥＬＩＳＡ測定もまた増加する傾向がある。この相関は、さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での適当な分子量における注目するバンドが、事実、インスリンポリペプチドであったことを示す。
精製されたインスリンポリペプチドのインビトロ酵素処理
本実施例は、（Ｃ−ペプチドおよびリーダーペプチドを除去するための）組換えにより生産されたインスリンポリペプチドのインビトロ酵素処理で用いた手法も記載する。本開示は、これらの手法が、例えば、粗製細胞培養ブロスからの、清澄化上清からの、精製されたインスリンポリペプチド産物からの、等の、生産プロセスのいずれかの工程でインスリンポリペプチドの精製で利用することができるという認識を含む。
遺伝子ＲＨＩ−１を含有するメタノール誘導突然変異体からのブロスをＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼ（ＡＬＰ）で消化した。ＡＬＰはＣ−末端リシンプロテアーゼであり、それ自体が、インスリンポリペプチドのＡ−およびＢ−ペプチドの間のペプチドリンカー、ならびにＢ−ペプチドのＮ−末端に連結されたリーダーペプチド配列を開裂させると予測される。乾燥された膜をスキャンし、およびそれを図１４に表す。２つのバンドが、ブロスを含有するほとんどのレーンに存在し、および双方のバンドを、対照と比較して酵素消化後により低い分子量にシフトした。各消化された対におけるより低いＭＷバンドは、ＲＨＩ対象とほぼ同一の位置にある。ＲＨＩ対照は消化に続いてＭＷを変化させなかった。これらの結果は、適当なサイズのインスリンポリペプチドが酵素処理後に生じたことを示す。インスリンポリペプチドのＡＬＰでの消化は、表８に表された生成物を生産すると予測される（ここにおいて、該生成物中のＡ−およびＢ−ペプチドは式Ｉ’およびＩＩ’’に示された３つのジスルフィド架を介して連結されている）。
Figure 2013535467
 実施例１１−Ｎ−結合グリカンモチーフを含有する組換えインスリン：酵母における生産、蛋白質精製、およびインビトロ酵素処理
本実施例は、小規模および大規模双方の、２つの異なる酵母株（ＫＭ７１およびＧＳ１１５）において少なくとも１つのＮ−結合グリカンモチーフを含む例示的なインスリンポリペプチドの組換え生産を記載する。ある実施形態において、これらのインスリンポリペプチドはグリコシル化されている。本実施例は、（Ｃ−ペプチドおよびリーダーペプチドを除去するために）組換えにより生産されたインスリンポリペプチドのインビトロ酵素処理で用いられる手法も記載する。
材料および方法
インスリンポリペプチド構築体の遺伝子合成は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。簡単に述べれば、インスリンポリペプチドの発現をコードする注目する遺伝子は表９にリストされている。
Figure 2013535467
Figure 2013535467
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換のためのＤＮＡ調製は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。一旦ＤＮＡが酵母株に形質転換されたならば、得られた遺伝子構築体は表１０に示されたアミノ酸配列をコードする。プロ−リーダーペプチドは、培地への蛋白質分泌に先立って酵母内のＫｅｘ−２エンドプロテアーゼによって開裂されるように設計されている（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：７９−８６）。かくして、培地に分泌された得られたインスリンポリペプチドは、［Ｂ−ペプチド］−「Ｃ−ペプチド」−［Ａ−ペプチド］配列に結合されたリーダーペプチド配列のみを含む。
Figure 2013535467
 エレクトロコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は実質的に実施例１０に記載されたように生産される。インスリンポリペプチド構築体でのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。高−コピー数の発現カセットでのクローンについてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体についてのスクリーニングは実施例１０に実質的に記載されたように行われる。振盪−フラスコ実験は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。
大規模なインスリンポリペプチドに発現は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。グリコシル化インスリンポリペプチドの精製は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。インビトロ酵素処理は、実質的に実施例１０に記載されたように行われる。
結果
酵母におけるインスリンポリペプチドの生産
本実施例は、１以上のＮ−結合グリカンモチーフを含有するインスリンポリペプチドの２つの異なる酵母株からの生産を記載する。本実施例は、インスリンポリペプチドの数種の代表的な例を提供するが、本発明は、これらの手法が、いずれかの他の組換えインスリンポリペプチド（例えば、他のまたは追加のＮ−結合グリカンモチーフをもたらす異なるアミノ酸配列を持つインスリンポリペプチド）を発現させ、および精製するのに有用であり得るという認識を含む。
これらの手法からの結果は、種々のプラスミド構築体によって生産されたインスリンポリペプチドが正しいＭＷのものであることを示すと予測される。加えて、これらの手法からの結果は、インスリンポリペプチドがインスリン様である（すなわち、ヒトインスリンに対して特異的な抗体を用いる商業的インスリンＥＬＩＳＡキットによって測定可能であって検出可能である）ことを示すと予測される。これらのデータは、さらに、インスリンポリペプチドが商業的に興味深いレベル（例えば、＞２５ｍｇ／Ｌ）において酵母において発現できることを示すと予測される。最後に、これらのデータは、ＥＬＩＳＡ−測定収率、および粗製培養上清からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ−測定収率の間の良好な相間を示すと予測される。換言すれば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド強度が増加すると、ＥＬＩＳＡ測定もまた増加する傾向がある。
精製されたインスリンポリペプチドのインビトロ酵素処理
本実施例は、（Ｃ−ペプチドおよびリーダーペプチドを除去するために）組換えにより生産されたインスリンポリペプチドのインビトロ酵素処理で用いられる手法を記載する。本開示は、これらの手法が、例えば、粗製細胞培養ブロスからの、清澄化上清からの、精製されたインスリンポリペプチド生成物からの、等の、生産プロセスのいずれかの工程においてインスリンポリペプチドの精製で利用することができるという認識を含む。インスリンポリペプチドのＡＬＰでの消化は、Ｎ−結合グリカンモチーフが下線を施して示される表１１に表された生成物を生じさせると予測される。ＲＨＩ−５Ｇ構築体において、Ｎ−結合グリカンモチーフＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒは、Ｂ−およびＣ−ペプチドにわたり位置する（従って、プロインスリンが生物活性インスリンに変換され、Ｂ−ペプチドのＣ−末端にＡｓｎ−Ｌｙｓを残す場合に開裂される）。
Figure 2013535467
 本開示は、表１１のＡ−およびＢ−ペプチドが、以下のように対応するＣ−ペプチドによって分離された（プロインスリンにおけるような）単一の連続アミノ酸配列に含まれるインスリンポリペプチドを含むと理解されるべきである：［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］（ここにおいて、Ｃ−ペプチドはＢ−ペプチドのＣ−末端をＡ−ペプチドのＮ−末端と連結させる）。また、本開示は、表１１のＡ−およびＢ−ペプチドが対応するＣ−ペプチドによって分離され、および以下のようにリーダーペプチド配列を含むインスリンポリペプチドを含むと理解される：［リーダーペプチド］−［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］（ここにおいて、リーダーペプチドは本明細書中に記載されたリーダーペプチド配列のいずれか１つであってよい）。また、本開示は、表１１のＡ−およびＢ−ペプチドが（生物活性インスリンにおけるように）１以上のジスルフィド架橋を介して連結された不連続ペプチドであるインスリンポリペプチドを含むのも理解されるべきである。種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは、（式Ｉ’およびＩＩ’に示されるように）野生型インスリンで見出される３つのジスルフィド架橋を含む。
実施例１２−Ｎ−結合グリカンモチーフを持つ例示的なインスリンポリペプチドの配列
本実施例は、Ｎ−結合グリカンモチーフを持ついくつかの例示的なインスリンポリペプチドの配列を記載する。個々の構築体のＢ−、Ｃ−およびＡ−ペプチド配列は表１２に表され、そこでは、Ｎ−結合グリカンモチーフに下線が施されて示される。ＲＨＩ−５Ｇシリーズにおいて、Ｎ−結合グリカンモチーフはＢ−およびＣ−ペプチドにわたり位置し、従って、プロインスリンが生物活性インスリンに変換されると開裂される。本開示は、表１２のＡ−およびＢ−ペプチドが以下のように対応するＣ−ペプチドによって分離された（プロインスリンにけるように）単一の連続アミノ酸配列内に含まれるインスリンポリペプチドを含むと理解されるべきである。［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］（ここにおいて、Ｃ−ペプチドはＢ−ペプチドのＣ−末端をＡ−ペプチドのＮ−末端と連結させる）。また、本開示は、表１２のＡ−およびＢ−ペプチドが対応するＣ−ペプチドによって分離され、および以下のようにリーダーペプチド配列を含むインスリンポリペプチドを含むと理解されるべきである：［リーダーペプチド］−［Ｂ−ペプチド］−［Ｃ−ペプチド］−［Ａ−ペプチド］（ここにおいて、リーダーペプチドは本明細書中に記載されたリーダーペプチド配列のいずれか１つであってよい）。また、本開示は、表１２のＡ−およびＢ−ペプチドが、（生物活性インスリンにおけるように）１以上のジスルフィド架橋を介して連結された不連続ペプチドであるインスリンポリペプチドを含むと理解されるべきである。種々の実施形態において、本開示のインスリンポリペプチドは（式Ｉ’およびＩＩ’に示されるように）野生型インスリンに見出される３つのジスルフィド架橋を含む。
Figure 2013535467
Figure 2013535467
ある実施形態において、位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１５、Ａ１８、Ａ２０およびＡ２１の各々におけるＸは独立してコード化可能アミノ酸であり；位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０の各々におけるＸは独立して、コード化可能なアミノ酸であるか、または欠落しており；位置Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３およびＢ２１の各々におけるＸは、独立して、コード化可能アミノ酸である。ある実施形態において、位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１５、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１の各々におけるＸは表１および／または３に記載された選択肢から選択される。ある実施形態において、位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ２１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０の各々におけるＸは、表２および／または３に記載された選択肢から選択される。このナンバリングのスキームは、ある構築体においては、Ｎ−結合グリカンモチーフが（例えば、ＲＨＩ−８およびＲＨＩ−１０シリーズの場合においては）位置Ａ０内に、および／または（例えば、ＲＨＩ−７およびＲＨＩ−９シリーズの場合には）位置Ｂ０内に含まれるという事実を考慮していると理解されるべきである。
実施例１３から１７は、図１５の例示的な合成コンジュゲートのいくつかで行われた実験を記載する。
実施例１３−生物活性に対するリガンドの効果
本実施例は、一連の皮下投与された例示的コンジュゲートについて得られた血中グルコースプロフィールを比較する。リガンド粗製はコンジュゲートにわたって変化して、一定範囲の親和性をカバーする：ＡＥＭ−２、ＡＥＢＭ−２、ＡＥＴＭ−１−ＡＥＢＭ−１およびＡＥＴＭ−２（最低から最大親和性）。インスリンコンジュゲートは図１５において、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、およびＩ−４として示される。各場合において、コンジュゲートは、絶食された正常な非糖尿病性ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００から５００ｇｍ、ｎ＝６）の首の背後に５Ｕ／ｋｇ（ＡＥＭ−２については３．５Ｕ／ｋｇ）にて注射した。血液試料は、０分において、および注射から３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、および３００分後に尾静脈出血を介して収集した。血中グルコース値は、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。加えて、各時点からの血液を４Ｃで遠心して、血清を収集した。血清中インスリン濃度を、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定した。
図１６から１９は、テストした４つのコンジュゲートの各々についての血清中インスリンレベルと共に血中グルコースレベルを示す。これらの結果は、より高い親和性リガンドとのコンジュゲートに対する低下したグルコース応答はコンジュゲートの低下したＰＫプロフィールに由来することをかなり明瞭に示す（ＡＥＭ−２についての図１６とＡＥＴＭ−２についての図１９を比較されたし）。
実施例１４−ミニチュアブタにおけるメカニズムの実証およびグルコース−応答性性能
本実施例は、本明細書中においては「ミニブタ」とも言われるヒト−代表的な非糖尿病性雄ミニチュアブタ（Ｙｕｃａｔａｎ株）におけるある種の例示的なコンジュゲートの糖依存性インビボ排出速度を調べる。図１にまとめたインスリン−コンジュゲートのサブセットをテストして、糖−依存性排出速度に対する糖親和性および多価の効果を最初に決定した。コンジュゲートは図６および１５においてＩ−６、Ｉ−７およびＩ−１１として示される。
各実験において、インスリン−コンジュゲートは０．１Ｕ／ｋｇにおいて非糖尿病性ヂュアル−血管アクセスポートを形成したミニブタにｉ．ｖ．投与し、および血液を注射後に頻繁な時間間隔で収集した。グルコースの存在下における血清中排出速度を決定するために、滅菌５０％ｗ／ｖグルコース溶液を、インスリン−コンジュゲートを投与するのに１時間先立って、シリンジポンプを用いて、１つのポートにｉ．ｖ．注入し、および速度は全実験を通じて調整して、動物における血中グルコースレベルが４００ｍｇ／ｄｌにおいて、またはその近くで（典型的には、８０から１５０ｍｌ／ｈ）とどまることを確実とした。ａ−ＭＭの存在下での血清排出速度を決定するために、グルコース溶液を滅菌２５％ｗ／ｖ ａ−ＭＭ溶液で置き換え、およびポンプ注入速度を、８０ｍＬ／ｈの実験を通じて一定に保持した。各場合において、得られたインスリン−コンジュゲート濃度−対−時間データは、２−コンパートメントモデルに従って、２つの独立した崩壊指数関数の和（Ｃ（ｔ）＝αｅｘｐ（−ｋαｔ）＋βｅｘｐ（−ｋβｔ））とフィットした。
４００ｍｇ／ｄｌにおいて、高レベルの内因性グルコース−誘導ブタインスリンは、本発明者らのインスリン−コンジュゲートイムノアッセイと交差反応した。それ自体、グルコース注入実験からのＰＫ結果は、特にデータの「ノイズがある」組に導くブタインスリン−のみのアッセイから得られた値を差し引くことを必要とする。ａ−ＭＭは内因性ブタインスリン分泌を誘導しないので、ａ−ＭＭ注入実験からのデータをインスリン−コンジュゲート半減期における糖−応答性変化の本発明者らの一次インジケーターとして用いた。興味深いことには、ブタにおいてＡＥＴＭ−２インスリン−コンジュゲート（Ｉ−６）は、ラットにおける４．０×増加（データは示さず）と比較して、ａ−ＭＭの存在下においてｔ１／２における中程度の１．７×増加を示したに過ぎない。しかしながら、ブタにおいては、Ａ１，Ｂ２９−ジ−置換ＡＥＴＭ−２インスリン−コンジュゲート（Ｉ−１１）は、ａ−ＭＭの存在下においてｔ１／２のほとんど１０倍の増加を示した（図２０および２１）。他のコンジュゲートの表の結果は図２５に示される。
ａ−ＭＭの存在下におけるジ−置換ＡＥＴＭ−２インスリン−コンジュゲート（Ｉ−１１）のｉ．ｖ．用量についてのグルコース降下曲線上の面積は、糖の不存在下においてほぼ２．６×より高かった。（図２２）
コンジュゲートＩ−１１は、非糖尿病性、正常血糖およびアロキサン−糖尿病性高血糖症ミニブタにおいて０．２５、０．５０および１．００Ｕ／ｋｇの用量にて可溶性溶液としてサブ−Ｑ注射して、非糖尿病性動物において低血糖症を引き起こすことなく、糖尿病におけるグルコースを降下させるその能力を決定した。インスリン−コンジュゲートは、非糖尿病におけるグルコース−降下の絶対的低血糖症または兆候がない、糖尿病における血中グルコースレベルの有意な用量依存性低下を示す（図２３）。比較として、０．０６３および０．１２５Ｕ／ｋｇで注射したＲＨＩは、認識可能な低血糖症を持つ糖尿病性動物において有意なグルコース−降下、および非糖尿病性動物において有意なグルコース−降下および低血糖症を引き起こした（図２４）。これらの予備的な結果に基づき、ほぼ０．５Ｕ／ｋｇの可溶性インスリン−コンジュゲートＩ−１１の単一の注射は、糖尿病性ミニブタにおいて６から８時間の低血糖症−フリーグルコース制御を提供した。サブ−Ｑ注射Ｉ−１１の血清排出速度は、糖尿病性および正常なミニブタにおいて決定した（図２６）。同様なＰＫプロフィールが、全ての用量について糖尿病および正常の間で観察された。
一緒にすると、これらの結果は、内因性レクチン−ベースのメカニズムが、糖親和性および多価性の選択を通じて開発することができるミニブタに存在することを示す。より高い親和性および多価性を持つインスリン−コンジュゲートは、ラットと比較して、ミニブタにおいて改良された低血糖症−フリー血糖症制御を提供するようである。
実施例１５−コンジュゲートＩ−１４およびＩ−１５のＰＫおよび生物活性に対するａ−ＭＭの効果
本実施例において、本発明者らは、コンジュゲートＩ−１４およびＩ−１５の薬物動態学的および薬力学的挙動を決定することに着手した（コンジュゲートの構造については図１５を参照のこと）。各場合において、コンジュゲートの同一用量（５Ｕ／ｋｇ）を絶食させた正常な非糖尿病性ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、４００から５００ｇｍ、ｎ＝３）の首の背後に注射した。１５分の遅れの後、４ｇ／ｋｇ用量のａ−ＭＭがＩＰ注射された。血液試料を、０分において、および最初のコンジュゲート注射後３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０および３００分において尾静脈出血を介して収集した。血中グルコース値は、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。加えて、各時点からの血液を４Ｃにて遠心して、血清を収集した。血清中のインスリン濃度は、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（ＩＳＯ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定した。対照は、１５分後にａ−ＭＭの代わりに生理食塩水を注射することによって行った。
図２７は、Ｉ−１４のサブ−Ｑ注射から１５分後にＩＰ注射することによってａ−ＭＭを投与した場合に得られた結果を示す。示されるように、ａ−ＭＭの注射から得られたＰＫ／ＰＤプロフィールの増加は、生理食塩水注射対照群と比較した場合に、Ｉ−１４について非常に有意であった（ｐ＜０．０５）。
図２８は、Ｉ−１５のサブ−Ｑ注射から１５分後にａ−ＭＭをＩＰ注射によって投与した場合に得られた結果を示す。示されるように、ａ−ＭＭの注射から得られたＰＫ／ＰＤプロフィールの増加は、生理食塩水注射対照群と比較した場合にＩ−１５について非常に有意であった（ｐ＜０．０５）。
実施例１６−インビボ半減期／排出速度の比較
実施例１５で得られた結果は、競合糖の存在によって破壊され得るレクチン依存性メカニズムを介して身体から排出される例示的なコンジュゲートと合致する。より詳細にこのメカニズムを探求するために、本発明者らは、例示的なコンジュゲートについて以下の実験を行って、それらが血清インビボ−対−非コンジュゲーテッドインスリンから除去される速度を決定した。
各場合において、可溶性コンジュゲートは０．４ｍｇコンジュゲート／ｋｇ体重にて、２つの頚静脈にカニューレを挿入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＪＶ／ＪＶ、３５０から４００ｇ、ｎ＝３）に投与した。滅菌コンジュゲート溶液または対照インスリンを１つのＪＶカニューレを介して静脈内注射し、続いて直ちに、ヘパリン−生理食塩水の追加液を静脈内注射して、コンジュゲート用量の全てが動物に投与されることを確実とした。第二のカニューレを用いて、ｔ＝０において（プレ用量）、および１、２、４、８、１５、３０、６０、９０、１２０、および１８０分ポスト−用量において血液試料を収集した。
血中グルコース値は、商業的に入手可能なテスト片（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘｔｒａ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を用いて測定した。加えて、各時点からの血液を４Ｃにおいて遠心して、血清を収集した。血清中インスリンまたは血清中コンジュゲート濃度は、引き続いて、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｓｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）で測定した。
ＲＨＩまたはコンジュゲートいずれかの血清中濃度を、静脈内に注射に続いての時間の関数としてプロットした。データは、以下の一般式：Ｃ（ｔ）＝Ａ０ＥＸＰ（−ａｔ）＋Ｂ０ＥＸＰ（−ｂｔ）での２−コンパートメント双指数関数モデルを用いてフィットさせ、ここにおいて、ｔは時間であり、Ｃ（ｔ）は時間の関数としての血清中の濃度であり、Ａ０は第一のコンパートメント濃度定数であり、ａは第一のコンパートメント指数関数時定数であり、Ｂ０は第二のコンパートメント濃度定数であり、およびｂは第二のコンパートメント指数関数時定数である。
以下の表はテストされたＲＨＩおよびコンジュゲートについてのｔ１／２パラメーターをまとめる。
Figure 2013535467
 このデータは、コンジュゲートされていないインスリンよりも例示的なコンジュゲートが血清からより迅速に排出され、その程度は、内因性レクチンについては特定のコンジュゲートの親和性、およびコンジュゲート当たり置換されたリガンドの数によって支配されるという仮定に合致する。さらに、実施例１５で示されたＰＫ／ＰＤプロフィールにおけるａ−ＭＭ誘導増加は、テストしたコンジュゲートの各々についての相ｂ半減期の低下とよく相関する。
実施例１７−変化するリガンドの親和性および多価性を持つコンジュゲートから調製された長時間作用性コンジュゲートの性能
本実施例においては、本発明者らは、コンジュゲートＩ−１４およびＩ−１５の長時間作用性製剤の時間作用およびグルコース−応答性ＰＫプロフィールを決定することを開始した（コンジュゲートの構造については図１５を参照のこと）。以下の長時間作用性製剤を各コンジュゲートで用いた。
Figure 2013535467
 ４時間のＩＰグルコース注射（４ｇ／ｋｇ）実験は、前記したコンジュゲートの各々の１５Ｕ／ｋｇ（グラムで表した体重／１．８７＝注射容量のマイクロリットル）を投与することによって行った。図２９に示されるように、双方のコンジュゲートは、４時間のグルコース注射に続いての測定された血清中インスリン濃度の増加のいくつかのエレメントを持つ延長された吸収プロフィールを呈した。長時間作用性ＴＳＰＥ−ＡＥＴＭ−３コンジュゲートＩ−１５の注射から最初の４時間後においていくらかの有意なコンジュゲート吸収があったように見える。ＴＳＰＥ−ＡＥＭ−３コンジュゲートＩ−１４は平坦な吸収プロフィールを呈した。これらの結果は、これらのコンジュゲートの半減期は、全て、実施例１６に記載された修飾されていないインスリンよりも短く、およびそれらの各々は実施例１５に記載されたようなＰＫ／ＰＤプロフィールのａ−ＭＭ−誘導増加を示すという事実によく相関する。
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、明細書の考慮、または本明細書中に開示された発明の実施から当業者に明らかである。明細書および実施例は例示的のみとして考慮されることが意図され、発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって指示される。

Claims (167)

  1. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含む組換えにより発現されたインスリンポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが式Ｉ：
    Figure 2013535467
     ［式中：
    位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能アミノ酸、コード化可能アミノ酸の配列であるか、または欠落しており；
    位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１５、Ａ１８、Ａ２０およびＡ２１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能アミノ酸であり；
    位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸であるか、または欠落しており；および
    位置Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３およびＢ２１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能なアミノ酸であり、但し、配列番号：２６および／または配列番号：２７はＸａａ’がＰｒｏでないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含むものとする。］
    に示される、配列番号：２６のアミノ酸配列（Ａ−ペプチド）および配列番号：２７のアミノ酸配列（Ｂ−ペプチド）を含む請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドが、配列番号：１（Ａ−ペプチド）および配列番号：２（Ｂ−ペプチド）の不連続アミノ酸配列、および式Ｉ’：
    Figure 2013535467
     に示された３つのジスルフィド架橋を含む請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＩｌｅであり、およびＢ３０がＳｅｒであり；
    位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＩｌｅであり、およびＢ３０がＡｌａであり；
    位置Ａ８におけるＸａａがＡｌａであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＶａｌであり、およびＢ３０がＡｌａであり；または
    位置Ａ８におけるＸａａがＡｌａであり、Ａ９がＧｌｙであり、Ａ１０がＶａｌであり、およびＢ３０がＡｌａである；
    請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＩｌｅであり、およびＢ３０がＴｈｒである請求項３に記載のポリペプチド。
  6. 位置Ｂ２８におけるＸａａがＬｙｓであり、およびＢ２９がＰｒｏである請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 位置Ｂ２８におけるＸａａがＡｓｐである請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 位置Ｂ３におけるＸａａがＬｙｓであり、およびＢ２９がＧｌｕである請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 位置Ａ２１におけるＸａａがＧｌｙであり、およびＢ３１がＡｒｇ−Ａｒｇである請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 位置Ｂ３０におけるＸａａが欠失されており、および位置Ｂ２９におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基がミリスチン酸に共有結合している請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒまたはＡｌａである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  12. 位置Ａ９におけるＸａａがＳｅｒまたはＧｌｙである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  13. 位置Ａ１０におけるＸａａがＩｌｅまたはＶａｌである請求項２または３のいずれかに記載のポリペプチド。
  14. 位置Ａ１５におけるＸａａがＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項２または３のいずれかに記載のポリペプチド。
  15. 位置Ａ１８におけるＸａａがＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項２または３のいずれかに記載のポリペプチド。
  16. 位置Ａ２０におけるＸａａがＣｙｓである請求項２に記載のポリペプチド。
  17. 位置Ａ２１におけるＸａａがＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＡｌａである請求項２または３のいずれかに記載のポリペプチド。
  18. 位置Ｂ１におけるＸａａがＰｈｅまたはＡｓｐである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  19. 位置Ｂ２におけるＸａａがＶａｌである請求項２または３のいずれかに記載のポリペプチド。
  20. 位置Ｂ３におけるＸａａがＡｓｎ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  21. 位置Ｂ４におけるＸａａがＧｌｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  22. 位置Ｂ５におけるＸａａがＨｉｓである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  23. 位置Ｂ９におけるＸａａがＳｅｒまたはＡｓｐである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  24. 位置Ｂ１０におけるＸａａがＨｉｓまたはＡｓｐである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  25. 位置Ｂ１１におけるＸａａがＬｅｕである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  26. 位置Ｂ１２におけるＸａａがＶａｌである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  27. 位置Ｂ１３におけるＸａａがＧｌｕまたはＴｈｒである請求項２または３のいずれかに記載のポリペプチド。
  28. 位置Ｂ２１におけるＸａａがＧｌｕまたはＡｓｐである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  29. 位置Ｂ２６におけるＸａａがＴｙｒまたはＡｌａである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  30. 位置Ｂ２７におけるＸａａがＴｈｒである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  31. 位置Ｂ２８におけるＸａａがＰｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｓｐである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  32. 位置Ｂ２９におけるＸａａがＬｙｓ、ＰｒｏまたはＧｌｕである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  33. 位置Ｂ３０におけるＸａａがＴｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇである請求項２または３に記載のポリペプチド。
  34. 位置または複数の位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ（１−２）、Ｂ（１−３）、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３０、Ｂ（２９−３０）、Ｂ（２８−３０）、Ｂ（２７−３０）またはＢ（２６−３０）におけるＸａａが欠落している請求項２または３に記載のポリペプチド。
  35. 位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０またはＢ３１におけるＸａａが欠落している請求項２または３に記載のポリペプチド。
  36. 位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１におけるＸａａが欠落している請求項２または３に記載のポリペプチド。
  37. Ａ−ペプチドおよびＢ−ペプチドが連続するアミノ酸配列内に含まれる請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. Ｂ３１がコード化可能アミノ酸配列であり、および、ここにおいて、Ｂ３１のＣ−末端がペプチド結合を介してＡ０のＮ−末端に連結されている請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  39. Ｂ３１がアミノ酸配列：Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号：１６）、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号：１７）、またはＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号：２５）を含む請求項３８に記載のポリペプチド。
  40. 位置Ａ０におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’はＰｒｏではない請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  41. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始する請求項２または３に記載のポリペプチド。
  42. 位置Ａ２２におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’がＰｒｏではない請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  43. 位置Ｂ０におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’がＰｒｏではない請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  44. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２またはＢ３で開始する請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  45. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９またはＢ３１で開始する請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  46. Ｘａａ’がＰｒｏではないＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ｂ３０で開始する請求項２から３に記載のポリペプチド。
  47. 位置Ｂ３１におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’がＰｒｏではない請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  48. 前記ポリペプチドが位置Ａ６およびＡ１１、Ａ７およびＢ７、および／またはＡ２０およびＢ１９におけるシステイン残基の間にジスルフィド架橋を含む請求項２に記載のポリペプチド。
  49. 前記ポリペプチドが、位置Ａ６および１１、Ａ７およびＢ７、およびＡ２０およびＢ１９におけるシステイン残基の間にジスルフィド架橋を含む請求項２に記載のポリペプチド。
  50. 前記Ａ−ペプチドおよびＢ−ペプチドが不連続アミノ酸配列である請求項４８または４９に記載のポリペプチド。
  51. Ａ−ペプチドのＮ−末端、Ｂ−ペプチドのＮ−末端、位置Ｂ２９におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基またはいずれかの他の利用可能なアミノ基が一般式：
    Figure 2013535467
     ［式中：
    Ｘはポリペプチドのアミノ基であり、および
    ＲはＨまたはＣ１−２０アルキル基である。］
    の部位に共有結合した請求項１から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 前記ポリペプチドがＡ１位置における部位にコンジュゲートされている請求項５１に記載のポリペプチド。
  53. 前記ポリペプチドがＢ１位置における部位にコンジュゲートされた請求項５１に記載のポリペプチド。
  54. 前記ポリペプチドが位置Ｂ２９におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基における部位にコンジュゲートされた請求項５１に記載のポリペプチド。
  55. 位置Ｂ２８におけるＸａａがＬｙｓであり、および前記ポリペプチドが位置Ｂ２８のＬｙｓのイプシロン−アミノ基における部位にコンジュゲートされた請求項５１に記載のポリペプチド。
  56. 位置Ｂ３におけるＸａａがＬｙｓであって、前記ポリペプチドが位置Ｂ３におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基における部位にコンジュゲートされた請求項５１に記載のポリペプチド。
  57. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］におけるＡｓｎのデルタ−アミノ基がＮ−結合グリカンにコンジュゲートされている請求項１から５６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  58. 前記Ｎ−結合グリカンがβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンを含む請求項５７に記載のポリペプチド。
  59. 前記Ｎ−結合グリカンが少なくとも１つのマンノースを含む請求項５８に記載のポリペプチド。
  60. 前記Ｎ−結合グリカンがビマンノースを含む請求項５８に記載のポリペプチド。
  61. 前記Ｎ−結合グリカンがトリマンノースを含む請求項５８に記載のポリペプチド。
  62. 前記Ｎ−結合グリカンが線状トリマンノースを含む請求項５８に記載のポリペプチド。
  63. 前記Ｎ−結合グリカンが分岐したトリマンノースを含む請求項５８に記載のポリペプチド。
  64. 前記Ｎ−結合グリカンが一般式：ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎｎの基を含み、ここにおいて、ＧｌｃＮＡｃはβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミンであり；Ｍａｎはマンノースであり；およびｎは１から１００の整数である請求項５８に記載のポリペプチド。
  65. ｎが３から９の整数である請求項６４に記載のポリペプチド。
  66. ｎが３である請求項６４に記載のポリペプチド。
  67. ｎが５である請求項６４に記載のポリペプチド。
  68. ｎが８である請求項６４に記載のポリペプチド。
  69. ｎが９である請求項６４に記載のポリペプチド。
  70. ｎが９から１００の整数である請求項６４に記載のポリペプチド。
  71. 前記Ｎ−結合グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９Ｇｌｃ３であり、ここにおいて、Ｇｌｃがグルコースである請求項６４に記載のポリペプチド。
  72. 前記Ｎ−結合グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃである請求項６４に記載のポリペプチド。
  73. 前記Ｎ−結合グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃである請求項６４に記載のポリペプチド。
  74. 前記Ｎ−結合グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である請求項６４に記載のポリペプチド。
  75. 前記Ｎ−結合グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２であり、ここにおいて、Ｇａｌはガラクトースである請求項６４に記載のポリペプチド。
  76. 前記Ｎ−結合グリカンがＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２であり、ここにおいて、Ｇａｌはガラクトースであり、およびＮＡＮＡはα−２，３−結合および／またはα−２，６−結合Ｎ−アセチルノイラミン酸である請求項６４に記載のポリペプチド。
  77. 前記ポリペプチドが、Ｘａａ’はＰｒｏである少なくとも２つのモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、少なくとも２つのモチーフにおけるＡｓｎのデルタ−アミノ基は、各々、独立して、Ｎ−結合グリカンにコンジュゲートされている請求項５７に記載のポリペプチド。
  78. 前記ポリペプチドが酵母細胞において発現される請求項１から７７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  79. 前記酵母細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種からのものである請求項７８に記載のポリペプチド。
  80. 前記酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ種からのものである請求項７８に記載のポリペプチド。
  81. 前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種からのものである請求項７８に記載のポリペプチド。
  82. 前記酵母細胞がＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ種からのものである請求項７８に記載のポリペプチド。
  83. 前記酵母細胞が、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないか、またはα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの発現を破壊する突然変異を有する請求項７８に記載のポリペプチド。
  84. 前記酵母細胞がα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないか、またはα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼの発現を破壊する突然変異を有する請求項７８に記載のポリペプチド。
  85. 前記酵母細胞がα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないか、またはα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼの発現を破壊する突然変異を有する請求項７８に記載のポリペプチド。
  86. 請求項１から７７のいずれか一項に記載のインスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  87. 請求項８６に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターは酵母細胞において発現することができるベクター。
  88. 請求項８７に記載のベクターを含むように遺伝子的に作成された酵母細胞。
  89. 前記酵母細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種からのものである請求項８８に記載の酵母細胞。
  90. 前記酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ種からのものである請求項８８に記載の酵母細胞。
  91. 前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種からのものである請求項８８に記載の酵母細胞。
  92. 前記酵母細胞がＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ種からのものである請求項８８に記載の酵母細胞。
  93. 前記酵母細胞がα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないか、またはα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの発現を破壊する突然変異を有する請求項８８に記載の酵母細胞。
  94. 前記酵母細胞がα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないか、またはα−１，３−マンノシルトランスフェラーゼの発現を破壊する突然変異を有する請求項８８に記載の酵母細胞。
  95. 前記酵母細胞がα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼを発現しないか、またはα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼの発現を破壊する突然変異を有する請求項８８に記載の酵母細胞。
  96. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含むインスリンポリペプチドの生産に導く条件下で、請求項８８から９５のいずれか一項に記載の酵母細胞を培養することを含む方法。
  97. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］におけるＡｓｎのデルタ−アミノ基がＮ−結合グリカンにコンジュゲートされている請求項９６に記載の方法。
  98. インスリンポリペプチドをエキソグリコシダーゼと接触させることをさらに含む請求項９７に記載の方法。
  99. 前記エキソグリコシダーゼがα−１，２−マンノシダーゼである請求項９８に記載の方法。
  100. 前記エキソグリコシダーゼがα−１，３―マンノシダーゼである請求項９８に記載の方法。
  101. 前記エキソグリコシダーゼがα−１，６−マンノシダーゼでさる請求項９８に記載の方法。
  102. 前記エキソグリコシダーゼがα−（１−２，３）−マンノシダーゼである請求項９８に記載の方法。
  103. 前記エキソグリコシダーゼがα−（１−２，３，６）−マンノシダーゼである請求項９８に記載の方法。
  104. 前記エキソグリコシダーゼが酵母細胞によって発現される請求項９８に記載の方法。
  105. 酵母細胞からのインスリンポリペプチドを単離し、次いで、単離されたインスリンポリペプチドをエキソグリコシダーゼと接触させることをさらに含む請求項９７に記載の方法。
  106. 請求項５７から７７のいずれか一項に記載のインスリンポリペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬製剤。
  107. 治療上有効量の請求項１０６に記載の医薬製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、血中糖レベルを制御する方法。
  108. 治療上有効量の請求項１０６に記載の医薬製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病を治療する方法。
  109. 請求項５７から７７のいずれか一項に記載のインスリンポリペプチドを含む徐放製剤。
  110. 前記製剤が、絶食条件下で哺乳動物に投与される場合にコンジュゲートのゼロ次放出を呈する請求項１０９に記載の製剤。
  111. 前記製剤が、絶食条件下で哺乳動物に皮下投与される場合にコンジュゲートのゼロ次放出を呈する請求項１０９に記載の製剤。
  112. 製剤がプロタミンおよび亜鉛を含む請求項１０９に記載の製剤。
  113. 治療上有効量の請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、血中糖レベルを制御する方法。
  114. 治療上有効量の請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病を治療する方法。
  115. 請求項５７から８５のいずれか一項に記載のインスリンポリペプチドの集団を含む組成物であって、該インスリンポリペプチドの少なくとも３０％が同一のＮ−結合グリカンを含む組成物。
  116. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも４０％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  117. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも５０％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  118. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも６０％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  119. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも７０％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  120. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも８０％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  121. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも９０％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  122. 前記インスリンポリペプチドの少なくとも９５％が同一のＮ−結合グリカンを含む請求項１１５に記載の組成物。
  123. 式Ｉ’：
    Figure 2013535467
     ［式中：
    位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能アミノ酸、コード化可能アミノ酸配列であるか、または欠落しており；
    位置Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１５、Ａ１８、Ａ２０およびＡ２１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能アミノ酸であり；
    位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０の各々におけるＸａａは独立してコード化可能アミノ酸であるか、または欠落しており；および
    位置Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３およびＢ２１の各々におけるＸａａは、独立して、コード化可能アミノ酸であり、但し、配列番号：１および／または配列番号：２のＣ−末端はモチーフＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］で終了するものとする。］
    に示されるように、配列番号：１（Ａ−ペプチド）および配列番号：２（Ｂ−ペプチド）のアミノ酸配列、および３つのジスルフィド架橋を含む組換えにより発現されたインスリンポリペプチド。
  124. 位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＩｌｅであり、およびＢ３０がＳｅｒであり；
    位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＩｌｅであり、およびＢ３０がＡｌａであり；
    位置Ａ８におけるＸａａがＡｌａであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＶａｌ、およびＢ３０がＡｌａであり；または
    位置Ａ８におけるＸａａがＡｌａ、Ａ９がＧｌｙであり、Ａ１０がＶａｌであり、およびＢ３０がＡｌａである；
    請求項１２３に記載のポリペプチド。
  125. 位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒであり、Ａ９がＳｅｒであり、Ａ１０がＩｌｅであり、およびＢ３０がＴｈｒである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  126. 位置Ａ８におけるＸａａがＴｈｒまたはＡｌａである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  127. 位置Ａ９におけるＸａａがＳｅｒまたはＧｌｙである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  128. 位置Ａ１０におけるＸａａがＩｌｅまたはＶａｌである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  129. 位置Ａ１５におけるＸａａがＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  130. 位置Ａ１８におけるＸａａがＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  131. 位置Ａ２１におけるＸａａがＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＡｌａである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  132. 位置Ｂ１におけるＸａａがＰｈｅまたはＡｓｐである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  133. 位置Ｂ２におけるＸａａがＶａｌである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  134. 位置Ｂ３におけるＸａａがＡｓｎ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  135. 位置Ｂ４におけるＸａａがＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  136. 位置Ｂ５におけるＸａａがＨｉｓである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  137. 位置Ｂ９におけるＸａａがＳｅｒまたはＡｓｐである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  138. 位置Ｂ１０におけるＸａａがＨｉｓまたはＡｓｐである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  139. 位置Ｂ１１におけるＸａａがＬｅｕである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  140. 位置Ｂ１２におけるＸａａがＶａｌである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  141. 位置Ｂ１３におけるＸａａがＧｌｕまたはＴｈｒである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  142. 位置Ｂ２１におけるＸａａがＧｌｕまたはＡｓｐである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  143. 位置Ｂ２６におけるＸａａがＴｙｒまたはＡｌａである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  144. 位置Ｂ２７におけるＸａａがＴｈｒである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  145. 位置Ｂ２８におけるＸａａがＰｒｏ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｓｐである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  146. 位置Ｂ２９におけるＸａａがＬｙｓ、ＰｒｏまたはＧｌｕである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  147. 位置Ｂ３０におけるＸａａがＴｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇである請求項１２３に記載のポリペプチド。
  148. 位置または複数位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ（１−２）、Ｂ（１−３）、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３０、Ｂ（２９−３０）、Ｂ（２８−３０）、Ｂ（２７−３０）またはＢ（２６−３０）の各々におけるＸａａが欠落している請求項１２３に記載のポリペプチド。
  149. 位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０またはＢ３１におけるＸａａが欠落している請求項１２３に記載のポリペプチド。
  150. 位置Ａ０、Ａ２２、Ｂ０およびＢ３１におけるＸａａが欠落している請求項１２３に記載のポリペプチド。
  151. 位置Ａ０におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにＸａａ’がＰｒｏではない請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  152. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ａ８、Ａ１０、Ａ１８、Ａ２０、Ａ２１またはＡ２２で開始する請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  153. 位置Ａ２２におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’がＰｒｏではない請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  154. 位置Ｂ０におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにおいて、Ｘａａ’がＰｒｏではない請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  155. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ｂ０、Ｂ１、Ｂ２またはＢ３において開始する請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  156. Ｘａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］が位置Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０またはＢ３１で開始する請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  157. 位置Ｂ３１におけるＸａａがモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含み、ここにＸａａ’がＰｒｏではない請求項１２３から１５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  158. 配列番号：１のＣ−末端がモチーフＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］で終了する請求項１２３から１６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  159. 配列番号：２のＣ−末端がモチーフＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］で終了する請求項１２３から１６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  160. Ａ−ペプチドのＮ−末端、Ｂ−ペプチドのＮ−末端、位置Ｂ２９におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基、またはいずれかの他の利用可能なアミノ基が一般式：
    Figure 2013535467
     ［式中：
    Ｘはポリペプチドのアミノ基であり、および
    ＲはＨまたはＣ１−３０アルキル基である。］
    の部位に共有結合されている請求項１２３から１６６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  161. 前記ポリペプチドがＡ１位置における部位にコンジュゲートしている請求項１６７に記載のポリペプチド。
  162. 前記ポリペプチドがＢ１位置における部位にコンジュゲートされている請求項１６７に記載のポリペプチド。
  163. 前記ポリペプチドが位置Ｂ２９におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基における部位にコンジュゲートされている請求項１６７に記載のポリペプチド。
  164. 位置Ｂ２８におけるＸａａがＬｙｓであり、および前記ポリペプチドは位置Ｂ２８におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基における部位にコンジュゲートされている請求項１６７に記載のポリペプチド。
  165. 位置Ｂ３におけるＸａａがＬｙｓであり、および前記ポリペプチドは位置Ｂ３におけるＬｙｓのイプシロン−アミノ基における部位にコンジュゲートされている請求項１６７に記載のポリペプチド。
  166. モチーフＡｓｎ−［Ａｒｇ／Ｌｙｓ］における、およびＸａａ’がＰｒｏではないモチーフＡｓｎ−Ｘａａ’−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］におけるＡｓｎのデルタ−アミノ基がＮ−結合グリカンにコンジュゲートされている請求項１２３から１７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  167. 前記Ｎ−結合グリカンが請求項５８から８５のいずれか一項において定義された請求項１７３に記載のポリペプチド。
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