CN102015762B

CN102015762B - 获得纯化的生物活性异源蛋白的方法

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Publication number: CN102015762B
Application number: CN200880127098.XA
Authority: CN
Inventors: 帕莎·海泽瑞; 尼特斯·戴夫; 薇薇柯南丹·柯南; 桑杰·缇瓦瑞; 阿努依·戈尔; 海瑞斯·伊尔; 妮塔·罗伊; 克里斯娜莫西·维克特桑; 安普·维苏德瓦; 阿努帕玛·贾格迪什; 戈迪·撒切德威; 缪科施·巴布帕·帕特勒
Original assignee: Biocon Ltd
Current assignee: Biocon Ltd
Priority date: 2008-02-19
Filing date: 2008-04-03
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2028-04-03
Also published as: CN102015762A; KR101556514B1; JP2015083019A; WO2009104199A1; EP2242767A1; BRPI0822775A2; MY161892A; US20110236925A1; EP2242767A4; JP2011514151A; RU2495131C2; IL207646A; KR20100117612A; IL207646A0; JP5781308B2; MX2010009033A; JP6077027B2; RU2010138656A; US8802816B2

Abstract

本发明涉及分离和/或纯化杂质，产生不含相关杂质或仅含实质上最低限度量的糖基化杂质的纯化的异源蛋白产品的方法。更具体而言，本发明涉及胰岛素类似物例如甘精胰岛素糖基化形式杂质的鉴别，其特征为在基于酵母的系统例如毕赤酵母属中表达后鉴定。本发明还涉及克隆编码蛋白甘精胰岛素的基因，将相关基因插入到适当的酵母宿主中；产生重组菌株的培养物，刺激异源多肽的表达、分泌和发酵后的纯化，以及有关的酶转化的方法。

Description

获得纯化的生物活性异源蛋白的方法

技术领域

本发明涉及分离和/或纯化杂质，产生不含相关杂质或仅含实质上最低限度量的糖基化杂质的纯化的异源蛋白产品的方法。更具体地说，本发明涉及胰岛素类似物例如甘精胰岛素糖基化形式杂质的鉴别，其特征为在基于酵母的系统例如毕赤酵母属中表达后鉴别。本发明还涉及克隆编码蛋白甘精胰岛素的基因，将相关基因插入到适当的酵母宿主中；产生重组菌株的培养物，刺激异源多肽的表达、分泌和发酵后的纯化，以及有关的酶转化的方法。

背景技术

重组形式的胰岛素、胰岛素类似物和/或衍生物已在多种微生物表达系统中生产。当前的生物体例如大肠杆菌、酿酒酵母已被用于重组人胰岛素或其衍生物的商业化生产。由于这些系统的某些缺点，例如低表达水平、下游纯化的困难等，使用甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母作为蛋白表达系统是有利的，该表达系统具有某些优点，例如高表达、简单加工、低生产成本、高密度培养(US6800606)。

酵母表达系统是普遍使用的，因为其易于生长，快速并且是大小可变的。然而，某些酵母表达系统产生不一致的结果，并且有时难以获得高产率。一种显示最有希望的酵母表达系统是甲醇营养型巴斯德毕赤酵母。与其他真核表达系统相比，毕赤酵母具有许多优点，因为其没有与细菌相关的内毒素问题或动物细胞培养物中生产蛋白的病毒污染问题(Cino，Am Biotech Lab，May 1999)。毕赤酵母的高生长速率使其易于放大至大规模生产，尽管扩大规模的挑战包括pH控制、氧限制、营养限制、温度波动和其他安全性考虑(Gottschalk，2003，BioProcess Intl 1(4)：54-61；Cino Am Biotech Lab，May 1999)。

虽然基于酵母的表达系统例如巴斯德毕赤酵母有很多优点，但该系统的一个主要缺点是所得蛋白的翻译后修饰，其后作为杂质存在于最终产品中并且难以纯化。尽管已知许多蛋白的翻译后修饰，最常见翻译后修饰的形式是糖基化(Hart G.W，Glycosylation，Curr.Opin.Cell.Biol 1992；4：1017)。糖基化可以是N连接或O连接的，取决于表达系统(GemmillTR等，Overview of N- and O- linked oligosaccharide structures found in various yeast species，Biochemica et Biophysica Acta，1999；1426：227)。糖基化影响蛋白构象的稳定性、免疫原性、清除率、蛋白水解的保护，并且改善蛋白的溶解性(Walsh G，Biopharmaceutical benchmarks2006，Nature Biotechnology，2006；24：769)。

尽管在生物技术制造业改进方面已经有了很大发展，还没有对每种蛋白通用的解决方案。为了解决对该蛋白或蛋白家族特异性的问题，特定的治疗性蛋白的制备方法需要新颖的和创新的方案。同样，成功的商业化应用通常依赖于蛋白或蛋白家族的特性组合，以及用于将该蛋白或蛋白家族制备成药品的生产方法。

本发明涉及胰岛素类似物、更具体为甘精胰岛素不同糖基化形式的鉴定，其通过质谱技术偶联的化学方法(例如电喷雾和基质辅助激光解析电离)鉴定。对最终产品中杂质性质的更好了解使本发明能够通过优化的下游纯化方法从上述杂质中选择性纯化产品，由此纯化的终产品将基本不含本发明所述的杂质。

US 4,444,683及其相关申请要求保护糖基化的胰岛素，其中葡萄糖或甘露糖通过衍生自二羧酸、酸酐或苯胺或其组合的空间基团与胰岛素偶联。

WO 90/10645特别要求保护含有一个或多个单糖基团或一个或多个具有多达3个糖单元的寡糖基团的糖基化胰岛素。单糖基化或三糖基化胰岛素位点为A1、B1或B29。

WO 99/52934要求保护从非糖基化的蛋白中分离糖基化蛋白的方法，其通过使用含Ca++的洗脱液色谱分离包含糖基化和非糖基化蛋白的溶液，获得包含非糖基化蛋白的组分，所述组分基本上不含糖基化蛋白。

甘精胰岛素的糖形式未公开于任何前述现有技术中。本发明讨论了通过基于酵母的表达系统发酵后，纯化具有少量所述特征性糖基化杂质的胰岛素类似物例如甘精胰岛素以获得100％纯的甘精胰岛素产品的方法。

发明内容

本发明的主要目的是开发获得在酵母表达系统中重组表达的纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，其特征在于所述纯化的蛋白不含或含有实质上最低限度量的糖基化副产物。

本发明的另一个目的是开发获得在宿主细胞中重组表达的纯化的、生物活性的异源蛋白的方法。

本发明的另一个目的是开发生产纯化的、生物活性的异源蛋白的方法。

本发明的又一个目的是获得纯化的、生物活性的异源蛋白产品，其纯度至少为96％。

本发明的再一个目的是获得纯化的、生物活性的异源蛋白产品，其纯度在97-100％之间。

本发明的另一个目的是获得纯化的甘精胰岛素，其纯度至少为96％。

本发明的又一个目的是获得纯化的甘精胰岛素，其含有低于1％的糖基化杂质。

本发明的另一个目的是获得不含糖基化杂质的纯化的甘精胰岛素。

本发明的另一个目的是获得不含糖基化杂质的纯化的甘精胰岛素，其中所述蛋白的糖基化形式可以是单糖基化、三糖基化或多糖基化。

因此，本发明涉及获得在酵母表达系统中重组表达的、纯化的生物活性的异源蛋白的方法，其特征在于所述蛋白不含或含有实质上最低限度量的糖基化副产物；获得在宿主细胞中重组表达的纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，该方法包括下列步骤：a)在适于该蛋白表达的条件下培养用含有式I定义的编码该异源蛋白的DNA序列的载体转化的宿主细胞；b)收集表达的蛋白，包括从宿主细胞分离所述蛋白，产生收集的蛋白；c)使步骤(b)中收集的蛋白结晶的步骤；d)在胰蛋白酶或类胰蛋白酶存在下进行酶转化的步骤；e)纯化含有至少一种相关杂质的所述蛋白，包括使所述蛋白混合物与色谱基质接触，其中使用极性有机溶剂，在含有有机酸缓冲液的水相中纯化；以及f)沉淀洗脱的蛋白；产生权利要求9的纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，其包括：a)用包含指导所述蛋白表达的表达载体的转化酵母株接种水性发酵培养基；以及b)在有效表达所述蛋白的条件下，在所述发酵培养基上生长转化株；纯化的、生物活性的异源蛋白，其纯度至少为96％；纯化的、生物活性的异源蛋白，其纯度范围为97-100％；纯化的甘精胰岛素，其纯度至少为96％；纯化的甘精胰岛素，其含有低于1％的糖基化杂质；不含糖基化杂质的纯化的甘精胰岛素；以及纯化的甘精胰岛素，其中所述蛋白的糖基化形式可以是单糖基化、三糖基化或多糖基化。

附图说明

图1：胰蛋白酶化的甘精胰岛素的产率-时间(小时)图和不同浓度下的反应。

图2：酶处理前后不同时间点的反应分析色谱图。

图3：胰岛素-甘精胰岛素的HPLC图谱。

图4：分离杂质与最终产品的保留时间比较。

图5：胰岛素-甘精胰岛素最终产品的RP-HPLC图谱。

图6：胰岛素-甘精胰岛素最终产品的SEC-HPLC图谱。

图7：甘精胰岛素、单糖基化甘精胰岛素(mGIG)和三糖基化甘精胰岛素(tGIG)的电喷雾离子化质谱。

图8：单糖基化甘精胰岛素(mGIG)的基质辅助激光解析电离质谱。

图9：三糖基化甘精胰岛素(tGIG)的基质辅助激光解析电离质谱。

具体实施方式

本发明涉及获得在酵母表达系统中重组表达的、纯化的生物活性的异源蛋白的方法，其特征在于所述蛋白不含或含有实质上最低限度量的糖基化副产物。

在本发明的另一个实施方案中，DNA编码异源性蛋白用式I表示：

X-B-Y-A

其中：

X是包含至少一个氨基酸的前导肽序列；

B是胰岛素分子的B链氨基酸序列，其衍生物或类似物；

Y是包含至少两个氨基酸的连接肽；

A是胰岛素分子的A链氨基酸序列，其衍生物或类似物，并且A和B链可通过氨基酸取代、缺失或添加进行修饰。

在本发明的又一个实施方案中，所述连接肽可以是包含至少两个氨基酸的任何序列，条件是开头两个氨基酸为“RR”。

在本发明的再一个实施方案中，所述蛋白由SEQ ID：1或SEQ ID：2定义。

在本发明的再一个实施方案中，酵母表达系统的宿主细胞选自毕赤酵母属。

在本发明的再一个实施方案中，酵母表达系统的宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母。

在本发明的再一个实施方案中，蛋白的糖基化形式可以是单糖基化、三糖基化或多糖基化。

在本发明的再一个实施方案中，所述纯化的蛋白含有低于1％的糖基化杂质。

本发明还涉及获得在宿主细胞中重组表达的纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

a)在适于该蛋白表达的条件下培养用含有式I定义的编码该异源蛋白的DNA序列的载体转化的宿主细胞；

b)收集表达的蛋白，包括从宿主细胞分离所述蛋白，产生收集的蛋白；

c)使步骤(b)中收集的蛋白结晶的步骤；

d)在胰蛋白酶或类胰蛋白酶存在下进行酶转化的步骤；

e)纯化含有至少一种相关杂质的所述蛋白，包括使所述蛋白混合物与色谱基质接触，其中使用极性有机溶剂，在含有有机酸缓冲液的水相中纯化；以及

f)沉淀洗脱的蛋白。

X-B-Y-A

其中：

X是包含至少一个氨基酸的前导肽序列；

B是胰岛素分子的B链氨基酸序列，其衍生物或类似物；

Y是包含至少两个氨基酸的连接肽；

在本发明的再一个实施方案中，SEQ ID：1或2定义的基因与信号肽在框内克隆。

在本发明的再一个实施方案中，SEQ ID：1或2定义的基因与mat-α-信号肽在框内克隆。

在本发明的再一个实施方案中，所述宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母。

在本发明的再一个实施方案中，所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。

在本发明的再一个实施方案中，所述宿主菌株是GS115。

本发明还涉及产生纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，其包括：

a)用包含指导所述蛋白表达的表达载体的转化酵母株接种水性发酵培养基；以及

b)在有效表达所述蛋白的条件下，在所述发酵培养基上生长转化株；

本发明还涉及产生纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，其中使用离子交换色谱从发酵液中捕获表达的该蛋白。

在本发明的再一个实施方案中，所述方法包括添加氯化锌和苯酚结晶蛋白的步骤。

本发明还涉及产生纯化的、生物活性的异源蛋白的方法，所述方法包括在胰蛋白酶存在下在水可混溶有机溶剂中进行的酶转化步骤。

在本发明的再一个实施方案中，所述水可混溶有机溶剂选自DMSO、DMF、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物。

在本发明的再一个实施方案中，所述方法包括含有至少一种相关杂质的蛋白混合物的RP-HPLC纯化步骤，其通过使所述蛋白混合物与色谱树脂基质接触进行，其中使用极性有机缓冲溶剂，在含有有机酸缓冲液的水相中纯化。

在本发明的再一个实施方案中，所述极性缓冲溶剂是乙腈。

在本发明的再一个实施方案中，所述有机酸缓冲液选自柠檬酸、乙酸、硼酸、甲酸、盐酸和磷酸。

本发明还涉及根据任一前述权利要求获得的纯化的、生物活性的异源蛋白产品，其纯度至少为96％。

本发明还涉及纯化的、生物活性的异源蛋白，其纯度在97-100％之间。

在本发明的再一个实施方案中，纯化的甘精胰岛素的纯度至少为96％。

在本发明的再一个实施方案中，纯化的甘精胰岛素含有低于1％的糖基化杂质。

在本发明的再一个实施方案中，纯化的甘精胰岛素不含糖基化杂质。

在本发明的再一个实施方案中，纯化的甘精胰岛素，其中所述蛋白的糖基化形式可以是单糖基化、三糖基化或多糖基化。

现在将对本发明优选的实施方案进行详细参考，与下述实施例一起，用于诠释本发明的原理。

下述实施例用于帮助理解本发明，但不意味着以任何方式限制其范围。实施例不包括用于构建载体、在所述载体中插入编码多肽的基因或将所得质粒导入宿主的常规方法详细描述。实施例也不包括用于测定由所述宿主载体系统产生的多肽的常规方法的详细描述。这些方法对本领域普通技术人员来说是公知的，描述于包括实施例方式的多种出版物中。

根据本发明的一个方面，获得在宿主细胞中重组表达的纯化的、生物活性的异源蛋白的方法包括下列步骤：

a)在适于该蛋白表达的条件下培养用含有SEQ ID 1或2定义的编码该异源蛋白的DNA序列的载体转化的宿主细胞；

c)使步骤(b)中收集的蛋白结晶的步骤；

d)在胰蛋白酶或类胰蛋白酶存在下进行酶转化的步骤；

f)沉淀洗脱的蛋白。

定义：

“细胞”或“细胞培养物”或“重组宿主细胞”或“宿主细胞”通常在根据上下文清楚的情况下可交换地使用。这些术语包括表达本发明所需蛋白的直接对象细胞，以及其子代。应当理解，由于偶然突变或环境差异，并非所有子代均确切地等同于母细胞。然而，所述改变的子代也包括在这些术语内，只要该子代保留了原始转化细胞所具有的相关性质。

本文所用术语“载体”是指能转运与之连接的另一核酸分子的核酸分子。术语“表达载体”包括能合成由所述载体各自携带的重组基因编码的对象蛋白的质粒、粘粒或噬菌体。优选的载体是能自主复制和/表达其连接的核酸的那些。在本申请中，“质粒”和“载体”可交换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。而且，本发明意图包括起等价功能的其他形式的表达载体，其在本领域中是已知的。

本文所指具有甘精胰岛素活性的多肽，例如甘精胰岛素应当理解为具有通过重组DNA技术产生的人胰岛素结构两处变化的氨基酸序列：在人胰岛素A链的A21位的天然天冬氨酸被甘氨酸取代，以及在人胰岛素B链的NH2末端添加2个精氨酸分子。任何胰岛素，包括甘精胰岛素的主要功能是调节葡萄糖代谢。胰岛素及其类似物通过刺激外周、尤其是骨骼肌和脂肪内葡萄糖摄取以及抑制肝葡萄糖生成降低血糖水平。

DNA编码异源性蛋白用式I表示：

X-B-Y-A

其中：

X是包含至少一个氨基酸的前导肽序列；

B是胰岛素分子的B链氨基酸序列，其衍生物或类似物；

Y是包含至少两个氨基酸的连接肽；

本文所用术语“C-肽”或“连接肽”包括了所有形式的胰岛素C-肽，包括天然或合成肽。所述胰岛素C-肽可以是人肽，或可来自其他动物种属，优选哺乳动物。因此天然胰岛素C-肽的变体和修饰也包括在内，只要它们保留了胰岛素C-肽的活性。修饰蛋白或多肽序列的同时保留其有用的活性是本领域已知的，其可以通过使用作为本领域标准或在文献中广泛描述的技术完成，例如随机或定向诱变、核酸的切割和连接等。因此，天然胰岛素C-肽序列的功能性等价变体或衍生物可根据本领域公知的技术方便地制备，包括具有天然胰岛素C-肽功能性，例如生物学活性的肽序列。所有这些胰岛素C-肽类似物、变体、衍生物或片段均特别包括在本发明范围内，并包含在术语“胰岛素C-肽”中。

连接序列可以是任何具有至少2个氨基酸的序列。尽管长度不是关键的，可方便或根据需要选取，连接区域可包含2到25、2到15、2到12或2到10个氨基残基。

连接肽可以是包含至少2个氨基酸的任何序列，条件是开头两个氨基酸为“RR”。此外，通常应当理解，在某些情况下，提供同源形式的甘精胰岛素蛋白是有利的，其仅是所述蛋白某个亚型生物活性的激动剂或拮抗剂。因此，特定的生物学效应可通过使用限制功能的同源物引发，其具有较少的副作用。

在一个实施方案中，本发明的核酸编码这样的多肽：其是人甘精胰岛素蛋白的激动剂或拮抗剂，包括SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。优选的核酸编码具有甘精胰岛素蛋白活性和具有与SEQ ID No：2所示氨基酸序列至少90％同源性的肽，更优选95％同源性和最优选97％同源性。编码与SEQ ID No：2所示序列具有至少约98-99％同源性的甘精胰岛素蛋白的激动剂或拮抗剂形式的核酸也包括在本发明的范围之内。优选地，所述核酸是包含至少部分编码SEQ ID No.1所示甘精胰岛素蛋白的核苷酸序列的cDNA分子。

本文所讨论的“操作元件”包括至少一个启动子、至少一个操纵子、至少一个前导序列、至少一个S-D序列，至少一个终止密码子以及其他对适当转录和随后翻译载体DNA需要和优选的任何DNA序列。具体而言，应当理解这些载体将含有至少一个宿主微生物识别的复制起始位点和至少一个可选择标记物以及至少一个能起始合成DNA序列转录的启动子序列。在一个实施方案中，所述载体还优选含有能作为调节器起作用的特定DNA序列，以及能编码调节器蛋白的其他DNA序列。在一个实施方案中，这些调节器用于防止DNA序列在特定环境条件下表达，以及在其他环境条件下允许转录和该DNA序列编码蛋白的随后表达。

此外，优选在载体内或DNA序列的5’端具有适当的分泌前导序列。该前导序列具有这样的位置：其允许前导序列与能指导所需蛋白抑制剂表达的核苷酸序列起始部分直接相邻而不干扰翻译终止信号。前导序列的存在部分缘于下列一个或多个因素：

1)前导序列的存在可帮助宿主将起始产品加工为成熟重组蛋白产品；

2)前导序列的存在可通过将蛋白酶抑制剂导出胞浆外帮助纯化重组蛋白产品；

3)前导序列可通过将蛋白导出胞浆影响重组蛋白折叠成其活性结构的能力。

“转录调控序列”是贯穿说明书使用的通用术语，其表示这样的DNA序列，例如起始信号、增强子以及诱导或控制与之可操作连接的蛋白编码序列转录的启动子。在优选的实施方案中，重组甘精胰岛素基因的转录在启动子序列(或其他转录调控序列)控制下进行，其控制重组基因在预期表达的细胞类型中的表达。

“控制序列”是指在特定的宿主有机体中表达可操作连接的编码序列所需要的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点，以及可能的其他仍难以理解的序列。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

“转化”表示将DNA导入有机体内，由此该DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合进行复制。依赖于使用的宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般性模式由Axel描述于1983年8月16日授权的U.S.专利4,399,216中。酵母中的转化通常按照Van Solingen，P等的方法进行，Van Solingen，P.，等.，J.Bact.，130：946(1977)and Hsiao，C.L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)。

重组表达系统选自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)、哺乳动物细胞或植物细胞。细菌和真核细胞可从多种来源获得，包括本领域技术人员所知的商业来源，例如美国标准菌库(ATCC；Rockville，Md.)。用于重组蛋白表达的商用细胞来源同时提供了细胞的使用说明书。表达系统的选择依赖于要表达多肽需要的特征。

因此，本发明的主题是在衍生自酵母的细胞内具有功能性的表达系统或表达盒，所述酵母选自毕赤酵母株，尤其选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和栗酒裂殖酵母，允许其需要的多肽编码蛋白片段的部分表达，位于其表达所需要的元件控制的位点。

本文用于描述蛋白或多肽的术语“重组”表示通过表达重组多核苷酸产生的多肽。本文用于描述细胞的术语“重组”表示细胞可被或已经被用作重组载体或其他转化DNA的受体，包括被转染的原始细胞的子代。应当理解，由于偶然或故意的突变，单个母细胞的子代在形态学或基因组或总DNA元件方面与原始母细胞可能并不完全相同。通过相关性质鉴别与母细胞足够相似的母细胞的子代，例如存在编码所需多肽的核苷酸序列，也是考虑的子代。

“有关基因”(GOI)是任何需要增加转录表达的核酸序列。GOI可编码功能性的核酸分子(例如RNA，例如反义RNA分子)，或更典型的编码需要增加产量的肽、多肽或蛋白。本发明的载体可用于表达“异源”蛋白。本文所用术语“异源”表示来源于外来种属的核酸序列或多肽，或如果来源于同一种属，其相对于原始形式具有实质性改变。此外，在细胞中非正常表达的修饰或未修饰的核酸序列或多肽被认为是异源性的。本发明的载体具有在同一或不同插入位点插入的一个或多个GOI，其中各个GOI与调控核酸序列可操作地连接，后者允许GOI的表达。

术语从包含肽和一种或多种污染物的组合物中“纯化”肽，由此通过减少至少一种污染物在肽组合物中的量来增加所述肽在组合物中的纯度。更具体而言，本发明的纯化方法产生在酵母表达系统中重组表达的生物活性异源蛋白，其特征在于所述纯化的蛋白不含或含有实质上最低限度量的糖基化副产物。

除糖基化形式外，存在的非极性杂质可通过MALDI确认(m/Z：6089)。该非极性杂质在最终产品中的含量为0-0.5％，其在加工甘精胰岛素的过程中产生。甘精胰岛素(m/z：6063)和非极性杂质(m/z：6089)的质量数差异为26个单位。基于分子量的化学同一性表明氨基酸中水的缺失和酰化的可能。

术语“色谱”是指由于在一定流动相影响下，混合物中的各溶质通过固相介质的速率不同，或者在结合和洗脱过程中从混合物中的其他溶质中分离混合物中有关溶质的方法。

本文所用术语“高效液相色谱”是指这样的色谱方法，其中用于填充柱的介质(固定相)小(3和50微米之间)且规则，相对于选定的尺寸几乎没有差异。该色谱通常可采用相对较高的进气压力(约500-3500psi)。

选择宿主生物体后，使用本领域技术人员公知的方法将载体转移至宿主生物体内。所述方法的实例可参见R.W.Davis等人的Advanced Bacterial Genetics，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1980)，其特别引入本文作为参考。在一个实施方案中，优选所述转化在低温下进行，温度调节被认为是通过使用之前所述的元件调节基因表达的方法。

在适于甘精胰岛素前体表达的条件下培养宿主微生物。这些条件通常是宿主特异性的，可由本领域技术人员根据关于此类有机体生长条件的出版文献方便地确定，例如Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，第8版，Williams & Wilkins Company，Baltimore，Md.，其特别引入本文作为参考。

因此，编码序列与控制序列“可操作地连接”是指这样的结构，其中编码序列可在这些序列的控制下表达，并且其中所连接的DNA序列是连续的，在分泌前导物的情况下，是连续的并位于阅读相内。

根据本发明的一个方面，式X-甘精胰岛素B链[B1-B30]-Y-甘精胰岛素A链[A1-A21]的甘精胰岛素前体，其中X是前导序列，B链是甘精胰岛素B链序列B1-B30，Y是B链和A链之间的连接肽序列，A链是甘精胰岛素的A链。该GIP-A前体可以通过在宿主表达系统中表达产生，所述系统包括除大肠杆菌外的细菌，酵母例如酿酒酵母和克鲁维酵母，其方法是本领域技术人员已知的(Methods in Enzymology vol.194)；以及真菌，例如曲霉、链孢霉和木霉属，其方法是本领域技术人员已知的，例如描述于AppliedMolecular Genetics of Fungi，Peberdy，Caten，Ogden，and Bennett，eds.(CambridgeUniversity Press，N.Y.1991)，其中许多能从美国标准菌库获得，Rockville，Md.，其由本领域技术人员常规使用。优选地，宿主菌株选自酵母例如酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、甲醇毕赤酵母和巴斯德毕赤酵母，其能够表达高水平的重组蛋白。甚至更优选地，宿主菌株是巴斯德毕赤酵母。

特别地，本发明提供了制备甘精胰岛素蛋白的方法，包括发酵过程、回收过程以及纯化过程。本文提供的方法包括发酵过程，其中上述蛋白在具有至少一种编码所述蛋白的序列整合到基因组中的巴斯德毕赤酵母中产生，其中发酵过程包括种子发酵以生长宿主细胞至需要的细胞密度，以及包括甘油分批发酵、甲醇诱导发酵和最终生产的生产发酵过程。

随后使用阳离子交换色谱从发酵液中捕获甘精胰岛素前体，本文提供的回收过程能捕获甘精胰岛素前体并除去细胞和细胞碎片，其中本文提供的回收过程提供了95％的产率。或者，本领域技术人员可检测和评价备选的方法以捕获需要的蛋白产品并除去细胞和细胞碎片，其包括但不限于多种其他色谱方法、离心、过滤、示差沉淀以及其他要确定的方法。

从发酵液捕获的甘精胰岛素前体进一步进行结晶以除色并保存。晶体形式的甘精胰岛素前体在pH3.0-8.0、优选4.0-6.0、最优选4.0-5.0的水性载体中适当地沉淀，水性载体中的蛋白浓度在1-80g/L，优选2-50g/L，最优选8-14g/L。结晶过程可以在温度2-30℃进行。所述前体晶体可通过离心、倾泻或过滤从上清液中分离出来。

甘精胰岛素前体GIP-A的结晶除去了发酵液到阳离子洗脱中形成的杂质和用于将产品从色谱柱上洗脱下来的乙酸铵盐。纯的晶态前体还有助于降低后续步骤的成本和提高反应的效率。晶体形式可冷冻储存，其储存在-20℃时可长时间保持稳定。

可通过酶转化从甘精胰岛素前体制备甘精胰岛素。该转化使用胰蛋白酶或植物、动物或微生物来源的类胰蛋白酶进行。反应优选在水可混溶性有机溶剂例如DMSO(二甲亚砜)、DMF(二甲基甲酰胺)、乙醇、丙酮、乙腈或乙酸乙酯，尤其是DMF和DMSO存在下进行，优选的有机溶剂占反应混合物的比例约为0-65％，尤其是约40-60％。

通过用胰蛋白酶处理前体GIP-A产生甘精胰岛素。前导物(如果存在)将被胰蛋白酶从前体上切割下来。胰蛋白酶反应以这样的方式控制，使得C末端“RR”C-肽的切割最大化。但该反应不能消除胰蛋白酶在其他胰蛋白酶切割位点的不需要的切割。可能的其他胰蛋白酶切割位点在“RR”之间和B-22(Arg)的C末端之间。

有机溶剂的使用根据原材料的溶解性、酶变性的倾向及其水解活性而定，本领域技术人员将了解，也可使用有机溶剂混合物。加入有机溶剂降低了反应混合物的水浓度从而预防了产品的水解，还显著提高了产品的溶解性。

前体的浓度通常为约5-50g/L，反应在约pH 5-12进行，优选约pH8-10。反应温度约为0-40℃，优选约2-25℃。可使用不同离子强度的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)或其他缓冲系统以维持需要的pH。反应时间是可变的，受其他反应条件的影响。反应可持续进行，直到产物浓度由于产物水解开始下降。需要约30分钟至24小时，大多数情况下需要约4-10小时。

酶的浓度依赖于底物浓度和酶活性而定。例如，商用晶体胰蛋白酶优选以约10-100mg/L反应混合物的浓度使用。

所述纯化方法包括使所述甘精胰岛素样品在足以获得几乎98-99％纯度、优选100％纯度的所述肽色谱条件下，通过包括基于聚合物的树脂基质的反相色谱纯化的步骤。

由此形成不需要的产品相关杂质，在连续的反相色谱法中纯化以产生纯的甘精胰岛素。糖基化的(单或三)杂质仅在第一步纯化后检测到，因此，在第二步RP-HPLC纯化步骤中特别注意纯化糖基化的杂质。发酵过程中产生的糖基化杂质被完全特征化，最终从终产品终纯化至最大限度。

在一个重要方面，发明特征是纯化蛋白的方法，该方法包括将所述蛋白加载到反相HPLC柱上，用有机溶剂在允许化合物与树脂结合的条件下洗脱包括肽的样品，以及用水性缓冲溶液将有机溶剂从树脂上洗脱下来的步骤。本发明的有效性需要所使用色谱基质、pH值和缓冲液离子强度的正确组合，以进行有效的纯化。

色谱方法的每个属性在获得需要的蛋白产品中都具有重要作用。色谱柱中使用的适当基质是C8 Daisogel。

根据本发明的一个方面，纯化的甘精胰岛素的产率是75％-80％，根据本发明的另一个方面，纯化的甘精胰岛素产品的产率是80％-85％，根据本发明的又一个方面，纯化的甘精胰岛素产品的产率是85％-90％，根据本发明的另一个方面，纯化的甘精胰岛素产品的产率是90％-95％，根据本发明的再一个方面，纯化的甘精胰岛素产品的产率是95％-100％。

根据本发明的一个方面，纯化的甘精胰岛素产品不含或含有实质上最低限度量的糖基化副产物。根据本发明的一个方面，纯化的甘精胰岛素产品纯度至少是96％，根据本发明的又一个方面，纯化的甘精胰岛素产品纯度至少是97％，根据本发明的又一个方面，纯化的甘精胰岛素产品纯度至少是98％，根据本发明的又一个方面，纯化的甘精胰岛素产品纯度至少是99％，根据本发明的又一个方面，纯化的甘精胰岛素产品产率是100％。

本发明通过下列实施例进行进一步说明。然而，这些实施例不应认为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：

GIP-A代表式X-[甘精胰岛素B链(B1-B30)]-Y-[甘精胰岛素A链(A1-A21)]的甘精胰岛素前体，其中X是前导序列，B链是甘精胰岛素B链序列B1-B30，Y是B链和A链之间的连接肽序列，A链是甘精胰岛素的A链。该序列可以不含前导或其他前导肽。连接肽Y可以是RR、RRDADDR中任一个。所述GIP-A前体可通过任何适当的表达系统产生，例如大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、CHO细胞等。

所述GIP-A前体与Mat-alfa信号肽在框内克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K中，用所述重组质粒转化巴斯德毕赤酵母宿主菌株GS115，获得克隆表达甘精胰岛素前体。分泌的前体用胰蛋白酶处理以制备甘精胰岛素和其他相关杂质。使用反相色谱纯化甘精胰岛素。

SEQ ID 1代表甘精胰岛素前体的序列，预测分子量为6045Da，估计的pI值为6.88。该序列具有159个核苷酸和53个氨基酸。

SEQ ID 2代表用于再巴斯德毕赤酵母中表达的序列，其预测分子量为6428.4da，估计的pI值为7.78。该序列具有171个核苷酸和57个氨基酸。

甘精胰岛素前体GIP-A由巴斯德毕赤酵母分泌至培养基中。离心发酵液，从上清分离细胞。包括离子交换色谱和疏水色谱在内的数种方法可用于捕获前体GIP-A，本发明使用阳离子交换色谱和HIC捕获GIP-A。

实施例2：

构建携带甘精胰岛素前体基因的重组载体：

将甘精胰岛素前体(GIP-A)与mat α-信号肽在框内克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中。用所述重组质粒转化巴斯德毕赤酵母宿主菌株GS115，分泌的GIP-A即为甘精胰岛素前体，其将进行下游纯化过程以制备最终产品。

用携带甘精胰岛素前体基因的重组载体转化毕赤酵母宿主：

用Bgl II消化具有重组质粒DNA的pPIC9K/IGP-A克隆，用于转化巴斯德毕赤酵母GS115(his4)宿主的电感受态细胞。Invitrogen手册提供了转化方法的详细方案。

筛选多拷贝整合体：

在适当的控制下，将约2000个转化体在384孔微量滴定板中用YPD培养基孵育，将板在30℃下孵育24小时，随后压至含0.5mg/mL Geniticin(G418)的YPD琼脂平板上。选择49个克隆进一步压制到平板1、2和3mg/mL G418上进行第二轮筛选。最后选择7个对1-3mgl/ml G418耐药的克隆用于表达研究。

通过PCR确认基因整合到基因组中：

使用基因特异性引物对来自选定重组毕赤酵母克隆的基因组DNA进行PCR扩增，以确认GIP-A整合到基因组内。

巴斯德毕赤酵母中的小规模表达研究

按照Invitrogen手册中给出的方案进行巴斯德毕赤酵母内的小规模表达研究。简言之，将克隆在BMGY中于30℃下生长，随后在BMMY中用甲醇在24℃诱导。甲醇诱导共进行3天。

实施例3：

发酵程序

重组甘精胰岛素的发酵过程在实验室规模优化。下面是该过程的简要叙述。

种子制备

种子培养基含有下列成分：酵母氮碱基、硫酸铵、甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以及D-生物素。

使用从冷冻箱中取出的单个小瓶接种种子烧瓶。小瓶解冻至环境温度后在无菌条件下接种。接种物以无菌的方式分散于最小甘油(MGY)培养基中。

确定每个烧瓶中加入的量，使得接种前烧瓶中起始OD600为0.1-0.2。烧瓶随后在摇床上于30℃孵育20-24小时，速度为230RPM。

发酵罐批式条件

发酵过程包括两个阶段，生长期(产生生物菌体)和随后的诱导期。在甲醇批式培养期间，产品分泌至发酵液中。在原位灭菌发酵罐中进行发酵。发酵培养基包括正磷酸、硫酸钾、氢氧化钾、硫酸镁、硫酸钙和甘油。将这些化学物在发酵罐中溶于饮用水中，在设定的121℃灭菌特定的时间。单独制备痕量盐和生物素的储备液，无菌过滤，培养基灭菌，用氢氧化铵将pH调节到5.0后无菌加入到发酵罐中。

采用生产/发酵程序。发酵罐用来自种子摇瓶的5％种子接种物接种，发酵开始时设定以下参数：pH：5.0，温度：30℃，DO2：30％。

实施例4：

有关的转化和纯化方法：

纯化巴斯德毕赤酵母发酵产生的甘精胰岛素前体，纯化过程的步骤如下：

用50mM乙酸平衡SP Sepharose fast flow基质(GE Biosciences)填充的柱。将无细胞上清液用正磷酸调节至pH3.8，加载到阳离子交换柱上。柱上样量＜50g/L。使用乙酸铵洗脱。该步骤在＜50g/L上样量的情况下回收率为95％。

前体结晶

将使用阳离子交换色谱步骤从发酵液中捕获的甘精胰岛素前体结晶以除色并储存。结晶开始时的前体浓度为约2-20g/L，优选8-14g/L。加入ZnCl2 &苯酚，随后调节pH至3.0-8.0，优选3.5-5.5进行结晶。苯酚以0.1-0.5％ CIEX洗脱液体积加入，以3-15％CIEX洗脱液体积加入4％的4％ ZnCl2溶液。pH可使用任何碱调节，优选NaOH或TRIS。结晶过程在温度2-30℃之间进行，浆液储存一段时间，以使得晶体完全形成。通过离心或倾泻将前体晶体从上清液中分离出来。

实施例4a：取463ml洗脱液(前体浓度13.8g/L)，适当解冻后加入2.315ml苯酚(0.5％ EP体积)。随后添加57.875ml 4％ ZnCl2溶液(12.5％EP体积)。此时pH为4.08，通过加入420ml 2.5N的NaOH将其调节为4.8。母液在缓慢搅拌的条件下保存15分钟，随后转移至冷库中(2-8℃)，保存过夜。随后将全部混合物在Beckman Coulter Avanti J-26XP离心机中以5000rpm离心20分钟。上清液损失为1.55％。

实施例4b：取500ml洗脱液(前体浓度2.9g/L)，适当解冻后加入0.625ml苯酚(0.125％EP体积)。随后添加15.625ml 4％ ZnCl2溶液(3.125％EP体积)。此时pH为4.08，通过加入315ml 2.5N的NaOH将其调节为4.8。母液在缓慢搅拌的条件下保存15分钟，随后转移至冷库中(2-8℃)，保存5小时。随后通过离心分离上清液。上清液损失为4％。

产率优化的前体结晶条件：

将SP-Sepharose洗脱收集液冷却至20°+5℃，每升洗脱液加入5mL(0.5％V/V)苯酚。将需要量的苯酚加入到等分洗脱液中，最后加入到主池中进行适当的再溶解。加入苯酚继续搅拌一段时间后添加下一种试剂进行适当的再溶解。现在加入12.5体积％的40g/L氯化锌(4％w/v)以诱导结晶。随后用2.5N NaOH(约85-90％SP-EP体积)调节pH至4.8+0.1。搅拌该整体混合物30分钟以保证均一性，随后在2-8℃保留至少8小时后离心。

基于上清液的损失，该步骤产率约为90％。

实施例5：

胰蛋白酶消化

通过酶转化从甘精胰岛素前体制备甘精胰岛素。该转化使用胰蛋白酶或植物、动物或微生物来源的类胰蛋白酶进行。反应优选在水可混溶性有机溶剂例如DMSO、DMF、乙醇、丙酮、乙腈或乙酸乙酯，尤其是DMF和DMSO存在下进行，优选的有机溶剂占反应混合物比例约为0-65％，尤其是约40-60％。

有机溶剂的比例根据原材料的溶解性、酶变性的倾向及其水解活性而定，也可使用有机溶剂混合物。加入有机溶剂降低了反应混合物的水浓度从而预防了产品的水解，还显著提高了产品的溶解性。

前体的浓度通常为约5-50g/L，反应在约pH 5-12进行，优选约pH8-10。反应温度约为0-40℃，优选约2-25℃。可使用不同离子强度的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)或其他缓冲系统以维持需要的pH。反应时间是可变的，受其他反应条件的影响。反应可持续进行，直到产物浓度由于产物水解开始下降。通常需要约30分钟至24小时，大多数情况下需要约4-10小时。

酶的浓度依赖于底物浓度和酶活性而定。例如，商用晶体胰蛋白酶优选以约10-100mg/L的浓度使用。

实施例5a：将1g甘精胰岛素前体溶于1.5ml 1M TRIS溶液中。各取1ml该溶液置于2支试管中，标记为样品A和样品B。向样品A中加入3ml水和166.6mg TRIS。向样品B中加入2ml DMF、1ml水和166.6mg TRIS。各样品分成4份，调节pH至4个不同的pH。在所有样品中加入浓度为50μg/ml的牛胰蛋白酶进行反应。采用的条件如下：

表1

所有条件下得到了不同比例的产品。样品B1获得约40％的最佳转化。而条件A1、A2、A3和A4转化低于15％。其他样品的甘精胰岛素转化率为15％-40％之间。

实施例5b：将1.6g甘精胰岛素前体溶于2ml 1M TRIS溶液中。各取1ml该溶液置于3支试管中，标记为样品A、样品B和样品C。向样品A中加入1.8ml水、1.2ml DMF和161mg TRIS。向样品B中加入0.6ml水、2.4ml DMF和161mg TRIS。向样品C中加入1ml水、2.0ml DMF和161mg TRIS。将样品A和B分成4份，样品C分成2份，调节至不同的pH。在所有样品中加入浓度为50μg/ml的牛胰蛋白酶进行反应。采用的条件如下：

表2

所有条件下得到了不同比例的产品。样品C1和C2获得约40％的最佳转化，而其他条件获得低于15％的转化。

实施例5c：将1.5g甘精胰岛素前体溶于2ml 1M TRIS溶液中。各取0.75ml该溶液置于3支试管中，标记为样品A、样品B和样品C。向样品A中加入0.75ml水、1.5ml乙醇和106mg TRIS。向样品B中加入0.75ml水、1.5ml DMF和106mg TRIS。向样品C中加入0.75ml水、1.5ml DMF和106mg TRIS。样品A和B分成2份调节至不同的pH。样品C调节至pH9.0。在所有样品中加入浓度为50μg/ml的牛胰蛋白酶进行反应。采用的条件如下：

表3

所有条件下得到了不同比例的产品。样品C1获得约40％的最佳转化，随后是B1(～30％)，而其他条件获得低于15％的转化。

实施例5d：将1.5g甘精胰岛素前体溶于2ml 1M TRIS溶液中，取0.75ml该溶液，加入0.75ml水、1.5ml乙醇和106mg TRIS。调节pH至9.0。随后将溶液分成2份-A和B。样品A在室温(20-25℃)下反应，而样品B在2-8℃下反应。加入浓度为50μg/ml的牛胰蛋白酶开始反应。

两个样品的转化率均在40％左右。低温下的反应(样品B)需要更长的时间，但产率略高。

实施例5e：将1g甘精胰岛素前体溶于1ml 1M TRIS溶液中，各取0.75ml该溶液置于2支试管中，标记为样品A和样品B。向样品A中加入0.75ml水、1.5ml DMF和130mgTRIS。向样品B中加入0.75ml水、1.5ml DMSO和130mg TRIS。样品A和B均在调节pH至8.7后分成2份。在所有4个样品中加入浓度为50μg/ml的牛胰蛋白酶进行反应。样品A和B各有一份在2-8℃反应，采用的条件如下：

表4

所有样品均获得类似的转化(～40％)。样品在室温下进行的反应在1小时内完成，而在冷库中进行的反应在5-6小时内完成。

实施例5f：将2g甘精胰岛素前体溶于含有0.5g TRIS、2ml水和2ml DMF的溶液中。从该溶液制备6份3.08ml的样品，各含有50％ DMF & 0.5M TRIS，pH 8.7。这些样品中的前体浓度为10g/L至60g/L。向各样品中加入5mg胰蛋白酶/g前体开始反应。所有样品均在2-8℃下反应。采用的条件如下：

表5

所有样品均显示转化，但较低温度的样品反应更快。条件B认为是最佳的。各样品中获得的最大产率为约40-45％。结果如图1所示。

产率和纯度优化的过程条件：

实施例5g：

将湿的前体晶体保存在-20℃深度冷冻箱中，其取出溶解时是完好的。在搅拌条件下，将这些晶体加入TRIS溶液(TRIS-50％ w/w前体晶体和水-2L/kg前体晶体)中溶解。例如，将1kg前体晶体加入到含有500克TRIS的2L TRIS溶液中。随后添加DMF(2L/kg前体晶体)。使混合物完全溶解，作为供试液。使用C18对称分析RP-HPLC方法分析所得供试液的产品含量。

根据供试液中的产品含量，制备胰蛋白酶消化反应的对照溶液，使反应混合物中重组甘精胰岛素前体的浓度为10g/L。为制备对照液，加入需要量的TRIS水溶液，使反应混合物中最终TRIS浓度为500mM。随后添加DMF，使最终DMF浓度为50％。该溶液温度随后降至6℃±2℃，轻微搅拌条件下使用冰醋酸将pH调节至8.7(约2％总体积)。该溶液用作对照液。

反应混合物以非常缓慢的搅拌速度维持在6℃±2℃。完全混合后，加入50mg/L胰蛋白酶起始反应。一旦胰蛋白酶通过混合完全溶解后即开始酶反应。

酶反应在6℃±2℃以非常缓慢的搅拌速度进行。使用C18对称分析RP-HPLC方法每小时检查重组甘精胰岛素和未反应前体的百分比监测反应进度。酶反应通常在10小时内完成。当未反应前体百分比低于5％时，使用冰醋酸调节反应混合物pH至5.0终止反应。

反应预期产生约40％重组甘精胰岛素，获得的纯度为约35-50％。

不同时间点反应的分析色谱如图2 & 3所示。

实施例6：RP-HPLC纯化

实施例6a：

纯化经巴斯德毕赤酵母发酵产生的甘精胰岛素前体，该过程步骤如下：

用50mM乙酸平衡SP Sepharose fast flow基质(GE Biosciences)填充的柱。将无细胞上清液用正磷酸调节至pH3.8，加载到阳离子交换柱上。柱上样量＜50g/L。使用乙酸铵洗脱。在＜50g/L上样量的情况下该步骤回收率为95％。结晶洗脱液，晶体用于胰蛋白酶消化。用10％的乙腈(缓冲液B)在250mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。胰蛋白酶消化液用水1∶5稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量＜10g/L的情况下产率为75％，纯度为94.5％。用10％的乙腈(缓冲液B)在200mM pH5.0的乙酸钠(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物稀释至含有10％的乙腈后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，产率为80％，纯度为98.5％，糖基化杂质为0.29％。用6％的乙醇(缓冲液B)在50mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物用水1∶3稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量35g/L情况下产率为85％，纯度为99.4％。

实施例6b：

用10％的乙腈(缓冲液B)在250mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。胰蛋白酶消化液用水1∶5稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量＜10g/L的情况下产率为75％，纯度为94.5％。用10％的乙腈(缓冲液B)在200mM pH5.0的乙酸钠(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物稀释至含有10％的乙腈后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，产率为80％，纯度为98.5％，糖基化杂质为0.29％。用6％的乙醇(缓冲液B)在10mM柠檬酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物用水1∶3稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量35g/L情况下产率为79.2％，纯度为98.5％。

实施例6c：

用10％的乙腈(缓冲液B)在250mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。胰蛋白酶消化液用水1∶5稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量＜10g/L的情况下产率为75％，纯度为94.5％。用10％的乙腈(缓冲液B)在100mM pH8.5的Tris+20mM CaCl2(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物稀释至含有10％的乙腈后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，产率为71％，纯度为97.4％，糖基化杂质为0.22％。用6％的乙醇(缓冲液B)在10mM柠檬酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物用水1∶3稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量35g/L情况下产率为75.0％，纯度为98.0％。

实施例6d：

用10％的乙腈(缓冲液B)在250mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。胰蛋白酶消化液用水1∶5稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量＜10g/L的情况下产率为75％，纯度为94.5％。用10％的乙腈(缓冲液B)在100mM pH5.0的乙酸铵(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物稀释至含有10％的乙腈后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，产率为60.7％，纯度为98.0％，糖基化杂质为0.91％。用6％的乙醇(缓冲液B)在10mM柠檬酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物用水1∶3稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量35g/L情况下产率为75.0％，纯度为98.5％。

实施例6e：

用10％的乙腈(缓冲液B)在250mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。胰蛋白酶消化液用水1∶5稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量＜10g/L的情况下产率为75％，纯度为94.5％。用10％的乙腈(缓冲液B)在20mM pH3.0的高氯酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物稀释至含有10％的乙腈后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，产率为37.4％，纯度为96.2％，糖基化杂质为0.28％。用6％的乙醇(缓冲液B)在10mM柠檬酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物用水1∶3稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量35g/L情况下产率为70.0％，纯度为97.0％。

实施例6f：

用10％的乙腈(缓冲液B)在250mM乙酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。胰蛋白酶消化液用水1∶5稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量＜10g/L的情况下产率为75％，纯度为94.5％。用10％的乙腈(缓冲液B)在100mM pH8.5的硼酸缓冲液(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物稀释至含有10％的乙腈后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，产率为79.4％，纯度为98.3％，糖基化杂质为0.11％。用6％的乙醇(缓冲液B)在10mM柠檬酸(缓冲液A)中的溶液平衡RP-HPLC树脂(C8 Daisogel 120孔，10μm颗粒大小)填充的柱。将上一步骤的RP洗脱物用水1∶3稀释后上样。使用线性梯度的缓冲液B洗脱纯化的甘精胰岛素，上样量35g/L情况下产率为75.0％，纯度为98.8％。

实施例7：

最终纯化：

加入柠檬酸缓冲液和ZnCl2溶液，沉淀通过不同反相色谱步骤纯化的甘精胰岛素并调节pH(该柠檬酸缓冲液包含15.4g/L柠檬酸(无水)，90g/L磷酸氢二钠(无水)缓冲液，pH用正磷酸调节至6.3.+0.1)。沉淀在pH 4.0-10.0范围进行，优选6.0-8.0。产物浓度优选为2-20g/L。沉淀后，通过离心或倾析上清从透明上清液中分离产物而不干扰已有的沉淀。由此获得的沉淀物用冷水洗涤以除去未结合的离子。

整个过程的产率为85-90％，产物纯度为约99％。

实施例8：

沉降后倾析最终混悬液，将浆液无菌转移至冻干槽内，冻干浆液，获得干燥粉末状的甘精胰岛素，其可被储存和后续配制。

实施例9：

糖基化杂质的分离鉴定：

从内部活性药用成分中分离糖基化形式的甘精胰岛素：

实施例9a：

为鉴定杂质的糖基化形式用半制备反相色谱分离mGIG(单糖基化甘精胰岛素)和tGIG(三糖基化甘精胰岛素)。使用Prochrome C18(250x8.0mm)柱在Agilent 1100色谱系统(CA，USA)上鉴定杂质。流动相溶剂是0.1％TFA(A)和0.1％TFA在乙腈中的水溶液(B)。使用线性梯度程序洗脱甘精胰岛素的杂质：0min 25％B；0-10min 27％B；10-15min 29％B；15-21min 30％B；21-27min 33％B和27-35min 25％B，恒定流速为1.5mLmin^-1。进样体积保持为20μl，柱温维持在40℃。在214nm处监测洗脱液。使用Agilent 1100系列LCMSD SL离子阱质谱仪(Agilent Technologies，USA)在线分析相应于糖基化杂质的色谱峰。质谱仪在ESI模式下操作。喷雾气体维持在60psi，干燥气体在12.0Lmin^-1并且干燥温度维持在350℃。在质量范围600-2200m/z中以MS模式记录阳性离子电喷雾质谱。

手动收集相应于mGIG和tGIG的峰。由于在制剂中观察到痕量水平的mGIG(1.0％)和tGIG(0.3％)，使用浓度100mg mL^-1的本发明甘精胰岛素活性药物成分(API)纯化工艺杂质。

最终纯化产品的鉴定：

实施例9b：

最终产品的RP-HPLC和SEC-HPLC图谱：

获得的最终蛋白产品的RP-HPLC图谱和SEC-HPLC图谱如图5和图6所示。

实施例9c：

甘精胰岛素、单糖基化甘精胰岛素(mGIG)和三糖基化甘精胰岛素(tGIG)的电喷雾质谱分别如图7、图8和图9所示。

样品	时间	面积	高度	宽度	面积％	对称
							批号1	18.192	190417	399.4	0.9616	100	0.881

由于极性增加，质量单位增加了162个单位，在甘精胰岛素中引入单糖单元减少了保留时间。类似的，引入3个单糖进一步增加了极性并增加了486个单位的质量。糖基化形式的分子量通过重叠ESI-MS中的多电荷峰获得。

表6.电喷雾和基质辅助激光解析电离技术观察到的分子量比较

获得的mGIG和tGIG的MALDI质谱显示其分子量分别为6225.6和6549.8，观察到的mGIG和tGIG分子量数据与ESI-MS观察到的一致。IG、mGIG和tGIG间的分子量差异为162质量单位的倍数，表明葡聚糖与甘精胰岛素共价连接。

图8.单糖基化甘精胰岛素(mGIG)的基质辅助激光解析电离质谱

进行还原和烷化实验以鉴别糖基化发生的链位置。该方法使用甘精胰岛素作为标准物进行标准化。将1.1mg甘精胰岛素溶于500μl 8M的盐酸胍、0.1M TRIS和1mM EDTA缓冲液中，pH维持在9.0。向该溶液中加入10μl 1M二硫苏糖醇(DTT)。混合成分，在37℃孵育2小时。孵育的样品回复至室温，加入10μl碘乙酰胺。样品用铝箔覆盖以避光，在37℃孵育2小时，用LCMS分析。以类似的方法还原并烷化mGIG和tGIG以鉴定糖基化。

表7.还原和烷化糖基化甘精胰岛素以鉴别糖基化发生的链位置

实施例9d：

肽谱法：

酶消化甘精胰岛素的糖基化形式以鉴定发生糖基化的氨基酸位点。将0.65mg天然甘精胰岛素溶于200μl 1M TRIS中(pH＝9.0)。向该溶液中加入新鲜制备的50μl 1mg mL-1 V8蛋白酶(Glu-C)，在37℃孵育2小时。IG、mGIG和tGIG的胰蛋白酶消化液在C18 250x4.6mm，5μ，300°(Waters；symmetry)上分离，流速为0.8mL min-1。柱温维持在40℃。使用下列梯度0-60min，5-80％B，60-65min，80-5％B。溶剂A＝0.1％ TFA水溶液，溶剂B＝乙腈。进样20μl，在220nm处监测洗脱峰。通过Agilent 1100 LCMS GLU-C片段分析在线分析样品。进行IG、mGIG和tGIG的比较研究以发现其保留时间和分子量的差异。

表8.糖基化甘精胰岛素的完整、片段保留时间和质量数比较

发明概述：本发明目的是提供生产和纯化编码具有成熟甘精胰岛素免疫和生物学活性的多肽的重组蛋白的方法。所述纯化的蛋白发现具有类似于成熟甘精胰岛素的所有生理学、免疫学和生物化学性质。

本发明的另一个优选的方面是鉴定最终产品中获得的甘精胰岛素的糖基化杂质。

本发明的最终和最重要的目的是获得纯的甘精胰岛素蛋白。本发明因此允许甘精胰岛素简单的大规模生产和随后的纯化。

因此，本发明的一个目的在于纯的甘精胰岛素制备的改进方法。

根据本发明的第一方面，该生产甘精胰岛素的重组方法包括：

(a)制备能指导宿主微生物生产具有甘精胰岛素活性的蛋白的DNA序列；

(b)将所述DNA序列克隆至能转移到宿主微生物并在其中复制的载体内，所述载体含有该DNA序列的操作元件；

(c)将含有该DNA序列和操作元件的载体转移到能表达甘精胰岛素蛋白的宿主微生物中；

(d)在适于所述载体扩增和蛋白表达的条件下培养微生物；

(e)收集蛋白。

本发明的第二个方面是提供构建携带有关基因的重组载体的方法，包括下列步骤：将甘精胰岛素前体基因与信号肽在框内克隆至适当的表达载体内，用含有有关基因的载体转化宿主细胞，筛选多拷贝整合体，选择基因组内成功整合甘精胰岛素前体的重组克隆。

本发明的第三方面涉及甘精胰岛素前体的小规模表达，使用HPLC分析检测所需有关蛋白的表达水平。

本发明的第四方面涉及发酵过程，包括在生长培养基中生长重组细胞的步骤，所述细胞是用含有编码所需蛋白的DNA的表达载体转化的微生物或细胞培养物，所需蛋白在本发明中为甘精胰岛素。

本发明的第五方面涉及发酵后产生的甘精胰岛素产品的结晶。

本发明的第六方面涉及胰蛋白酶消化过程。甘精胰岛素可从甘精胰岛素前体通过酶转化制备。该转化在胰蛋白酶或植物、动物或微生物来源的类胰蛋白酶存在下进行。

本发明的一个重要方面涉及用于纯化具有与天然甘精胰岛素蛋白类似的生物活性的分离蛋白的过程和方法；更具体而言，涉及利用RP-HPLC或其他色谱方法从其他不具有这种活性的物质(由此认为是杂质)中分离活性肽物质的方法。

本发明最优选的方面涉及胰岛素类似物、更具体是甘精胰岛素的糖基化形式的鉴定，其通过与质谱技术例如电喷雾和基质辅助激光解析电离偶联的化学方法进行鉴定。本发明可通过更好的了解最终产品中杂质的性质而优化的下游纯化方法从上述杂质中选择性纯化产品。

本发明的其他目的和优点部分将在说明书中阐明，部分根据说明书的描述是显而易见的，或可在实施本发明过程中获知。所述目的和优点可通过所附权利要求中特别指出的方法和组合完成和实现。本发明涉及获得纯化的、生物活性的异源蛋白的方法。

本文所附的附图是本申请的一部分，图解了本发明中有用的性质，其与说明书一起用于解释本发明的原理。

序列表

<110>Biocon Ltd

Hazra，Partha

<120>获得纯化的生物活性异源蛋白的方法

<130>170108

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的甘精胰岛素前体序列

<221>多肽

<222>(1)..(53)

<400>1

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Gly

50

<210>2

<211>57

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>密码子优化的甘精胰岛素前体序列

<221>多肽

<222>(1)..(57)

<400>2

Gly Ala Val Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val

1 5 10 15

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

20 25 30

Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

35 40 45

Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

50 55

Claims

1.在酵母表达系统中，获得纯度不低于96％，并含有少于1％的糖基化杂质的重组甘精胰岛素的方法，该方法包括下列步骤：

a)培养用载体转化的酵母细胞，所述载体含有甘精胰岛素前体的DNA序列；其中：所述甘精胰岛素前体由多肽序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2定义；

b)收集酵母表达的甘精胰岛素前体，包括从酵母细胞分离所述甘精胰岛素前体，产生收集的甘精胰岛素前体；

c)使步骤(b)中收集的甘精胰岛素前体结晶的步骤；

d)在胰蛋白酶或类胰蛋白酶存在下，使步骤(c)中的晶体在pH8-10，水可混溶有机溶剂浓度40％-60％下，获得含有至少一种相关杂质的甘精胰岛素；

e)纯化含有至少一种相关杂质的所述甘精胰岛素，包括使所述甘精胰岛素与PR-HPLC色谱基质接触，其中，所述的纯化包括以下步骤：

i.平衡所述基质的第一步，用浓度为10％的乙腈，在浓度为250mM的乙酸中，然后用所述乙腈洗脱所述甘精胰岛素；

ii.再平衡所述基质的第二步，用浓度为10％的乙腈，在浓度为20mM、100mM或200mM，pH为3、5或8.5的缓冲溶液A中，然后用所述乙腈洗脱所述甘精胰岛素；

iii.再平衡所述基质的第三步，用浓度为6％的乙醇，在浓度为10mM或50mM的缓冲溶液A中，然后用所述乙醇洗脱所述甘精胰岛素；

其中所述步骤ii用于除去糖基化杂质；

f)加入柠檬酸缓冲液和ZnCl2溶液，在pH6-8下沉淀步骤e)中得到的纯化甘精胰岛素，以获得纯度不低于96％，并含有少于1％的糖基化杂质的甘精胰岛素。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母菌株GS115。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述糖基化形式是单糖基化、三糖基化或多糖基化。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2定义的DNA序列编码甘精胰岛素前体与核苷酸序列编码信号肽在框内克隆，所述信号肽为mat-α-信号肽。

5.根据权利要求1的方法，其包括：

a)用包含指导所述甘精胰岛素表达的表达载体的转化酵母株接种水性发酵培养基；以及

b)在有效表达所述甘精胰岛素的条件下，在所述发酵培养基上生长转化株。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤b)通过阳离子交换色谱完成。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤c)通过添加氯化锌和苯酚，在pH3-8、温度2℃-30℃下完成；且

步骤d)在pH8-10、温度2-25℃下完成，且

所述的水可混溶有机溶剂选自由DMSO、DMF、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物组成的组。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤c)在pH3.5-5.5下完成。

9.根据权利要求1的所述的方法，其特征在于，步骤e)通过RP-HPLC完成，及

所述缓冲液A选自柠檬酸、乙酸、硼酸、甲酸、盐酸、乙酸钠、Tris‐氯化钙、乙酸铵、高氯酸和磷酸组成的组。