KR101949556B1 - 폴리펩티드의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

봉입체로부터 재조합 폴리펩티드를 제조하는 새로운 방법이 개시된다. 세포 배양 조건의 조정은 활성형의 재조합 폴리펩티드의 수율에 긍정적인 영향을 준다. 일 측면에서, 본 방법은 (a) 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계, (b) 배양 온도를 제1 온도로부터 제2 온도로 저하시키는 단계, 및 (c) 숙주 세포를 제2 온도에서 배양하는 단계를 포함한다.

Description

폴리펩티드의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF POLYPEPTIDES}

본 발명은 폴리펩티드 제조 분야, 특히 봉입체 중의 재조합 폴리펩티드를 생성하는 숙주 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.

숙주 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 발현은 생명공학 및 제약 산업에서 널리 이용되는 표준 기술이다. 특히, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)와 같은 미생물 숙주가 일반적으로 사용되며, 그 이유는 상대적으로 간단한 발현 시스템 및 세포 배양 조건을 이들 숙주 세포가 이용가능하기 때문이다. 따라서, 일반적으로 배양 공정은 비교할 수 있을 만큼 경제적이다.

그러나, 가용성 활성 형태의 관심있는 폴리펩티드를 미생물 세포에서 발현시킬 때 상기 폴리펩티드를 수득하는 것은 종종 어렵다. 종종, 재조합 폴리펩티드의 발현은 변성된 형태의 폴리펩티드의 난용성 세포내 응집체, 소위 봉입체를 생성하게 되는데(문헌[Baneyx, F. and Mujacic, M. (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1399-1408] 및 문헌[Sorensen, H.P. and Mortensen, K.K. (2005) Microb.Cell Fact.4, 1]), 이는 고전적 봉입체로도 칭해진다.

일반적으로 고전적 봉입체는 전형적으로 중간 정도의 속도의 원심분리에 의해 단리하는 것이 용이하다. 봉입체로부터 활성 폴리펩티드, 즉 올바르게 폴딩된(folded) 폴리펩티드를 회수하기 위하여, 봉입체는 가용회되어야 하고 단백질은 단리 후 재생되어야 한다. 몇몇 특허 출원 및 특허는 봉입체를 가용화하고 봉입체로부터 수득된 단백질을 재생시키는 측면을 다룬다. 예를 들어, 유럽 특허 제0512097호, 유럽 특허 제0364926호, 유럽 특허 제0219874호, 국제 특허 공개 제WO01/87925호, 문헌[Rudolph 1996], 문헌[Rudolph 1990], 문헌[Marston 1986] 및 문헌[Dietrich 2003]에는 변성된 단백질의 가용화 및 재생에 관련된 일반적인 기술이 기술되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 제0219874호에는 이. 콜라이 봉입체로부터의 재조합 단백질을 재폴딩시키는 일반적인 방법이 개시되어 있다. 가용화를 위하여 카오트로픽제(chaotropic agent)인 GuHCl 및 아르기닌이 고 pH에서 사용되었다. 유럽 특허 제0219874호에는 GSH/GSSG에 의해 제공되는 산화환원 조건 하에서의 디술피드 가교체의 형성이 기술되어 있다.

다수의 봉입체 단리 및 가용화 방법이 공지되어 있다는 사실에도 불구하고, 그 결과는 항상 만족스러운 것은 아니다. 1가지의 주요 문제점은 봉입체의 구조가 달라질 수 있다는 것이다. 봉입체의 형성 및 구조는 예를 들어 배지 조성, 성장 온도 및 생성률을 비롯한 세포 배양 공정의 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있음이 공지되어 있다. 국제 특허 공개 제WO2004/015124호에는 배양 조건의 조정에 의한 "비고전적" 봉입체의 형성이 기술되어 있다.

봉입체로부터의 재조합 단백질, 특히 활성형의 그리고 충분한 양의 재조합 단백질의 수득은 문제가 될 수 있다. 때때로, 봉입체의 구조는 너무 "연성"이며, 이는 원심분리에 의한 봉입체의 단리를 어렵게 하는 상황에 이르게 된다. 반면에, 봉입체는 너무 콤팩트(compact)하다는 것이 또한 가능하다. 이는 심지어 거친 조건 하에서도 가용화될 수 없는 봉입체를 생성한다.

이들 불리한 점을 극복하기 위하여 본 발명은 용이하게 단리 및 가용화될 수 있는 봉입체 중의 다량의 적당하게 폴딩된 단백질에 이르게 되는 새로운 세포 배양 공정을 제공하는데, 이는 증가된 수율의 재조합 단백질을 생성한다.

본 발명은 폴리펩티드 생성 분야, 특히, 봉입체 중의 재조합 폴리펩티드를 생성하는 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드를 생성하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 향상된 수율의 활성 단백질을 생성하는, 봉입체로부터의 재조합 폴리펩티드의 새로운 생성 방법을 제공한다. 본원에서 본 발명자는 세포 배양 조건의 조정이 활성형의 재조합 폴리펩티드의 수율에 긍정적으로 영향을 줌을 입증한다. 예를 들어, 본 발명자는 더욱 높은 제1 배양 온도 및 더욱 낮은 제2 배양 온도를 포함하는 2단계 배양법이 유익함을 알아냈다. 세포 성장 및 미생물 숙주 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 발현에 또한 긍정적으로 영향을 주는 다른 배양 파라미터가 본원에 기술되어 있다.

일 측면에서, 본 발명은 봉입체 중의 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은

(a) 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 미생물 숙주 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계,

(b) 배양 온도를 제1 온도로부터 제2 온도로 저하시키는 단계, 및

(c) 미생물 숙주 세포를 제2 온도에서 배양하는 단계를 포함한다.

미생물 숙주 세포는 이. 콜라이 세포일 수 있다. 제1 온도는 36℃ 내지 38℃, 바람직하게는 37℃일 수 있다. 제2 온도는 25℃ 내지 36℃, 더 바람직하게는 30℃ 내지 36℃, 더 바람직하게는 32℃ 내지 35℃일 수 있다. 제1 온도 및/또는 제2 온도에서의 배양 동안의 pH는 6 내지 8, 바람직하게는 6.8 내지 7.2일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 온도의 저하는 세포 배양물이 600 nm에서 10 내지 50, 더 바람직하게는 27 내지 33의 광학 밀도에 도달했을 때 수행된다.

일부 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 4개 나선 번들형(four-helix-bundle) 폴리펩티드이다. 재조합 폴리펩티드는 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor; G-CSF)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, G-CSF는 인간 또는 소 G-CSF로서, 이는 임의로, 각각 -1 위치에 처음의 메티오닌 아미노산 잔기를 갖는다.

일부 실시 양태에서, 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 핵산은 벡터, 예컨대 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단계 (a) 내지 (c)에는 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내에 도입하는 단계가 선행되며, 여기서, 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

유도성 프로모터는 T7 프로모터일 수 있다. 미생물 숙주 세포의 염색체는 lac 프로모터에 임의로 작동가능하게 연결된, 박테리오파지 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 용원성 박테리오파지 핵산 서열을 포함하지 않을 수 있다. 박테리오파지 RNA 폴리머라아제는 T7 폴리머라아제일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드의 발현은 유도제의 첨가에 의해 수행된다. 유도제는 온도의 저하와 동시에 또는 온도의 저하 후에 첨가될 수 있다. 유도제는 IPTG일 수 있다.

바람직한 실시 양태에서, 벡터는 서열 번호 4의 서열을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 (i) 서열 번호 3 또는 서열 번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 3에 나타낸 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도면 및 표의 간단한 설명
표 1: 다양한 제2 배양 온도를 이용한 세포 배양물로부터의 G-CSF의 수율
표 2: 2개의 재폴딩 단계를 포함하는 하류 프로세싱(processing)에 바람직한 조건의 목록.
표 3: 650 g의 세척되고 냉동된 봉입체로 출발한 3회의 생성 런(run)의 순도 및 수율. 수율의 계산은 봉입체의 습윤 질량을 나타낸다.
표 4: G-CSF의 정제 동안 총 순도 값 및 2가지의 선발된 공정 관련 불순물(사르코실, 내독소)의 값. 그 범위는 상이한 분석 방법을 이용한 3가지의 G-CSF 생성 로트(lot)의 분석 결과를 나타낸다.
표 5: 3가지의 G-CSF 생성 로트의 순도 및 활성
도 1: 도 1a, 실시예 1의 발현 벡터의 개략도; 도 1b, 서열 번호 4의 G-CSF 발현 벡터의 서열
도 2: 기준물(도 3a)로서의 상업적으로 입수가능한 필그라스팀(filgrastim) 약물 제품 및 본원에 개시된 정제된 생성물의 순도를 분석한 SEC-HPLC 크로마토그램.

본 발명은 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는데, 상기 재조합 폴리펩티드는 숙주 세포에서 봉입체 내에서 발현된다. 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 숙주 세포 내에 도입된다. 그 후, 숙주 세포를 배양하여 재조합 폴리펩티드를 발현시키며, 여기서, 숙주 세포는 재조합 단백질을 함유하는 봉입체를 형성한다. 제1 배양 기간 후, 그리고 연속 배양 후, 배양 온도는 더욱 높은 온도로부터 더욱 낮은 온도로 변화된다. 그 후, 숙주 세포의 배양은 상기 더욱 낮은 온도에서 계속된다.

본원에서 본 발명자는 세포 배양 조건의 조정이 활성형의 재조합 폴리펩티드의 수율에 긍정적으로 영향을 줌을 입증한다. 본 발명자는 놀랍게도, 숙주 세포의 배양 동안 세포 배양 온도를 저하시키면 재조합 단백질의 수율이 증가됨을 알아냈다. 또한 본 발명자는 다른 파라미터, 예컨대 유도 방식, pH, 하류 프로세싱, 및 특히 발현 시스템의 선택 등이 수율에 대하여 긍정적인 영향을 끼칠 수 있음을 알아냈다. 본원에 기술된 바와 같이 바람직한 온도와 바람직한 발현 시스템의 조합이 특히 유익한 것으로 밝혀졌다.

어떠한 이론에도 구애되지 않고서, 본 발명자는 본원에 기술된 바와 같이 배양 온도의 조정이 봉입체의 구조를 최적화하여, 봉입체 중 올바르게 폴딩된 단백질의 양을 증가시키고 따라서 봉입체로부터의 더욱 활성인 재조합 단백질의 회수를 용이하게 한다고 생각한다. 본 발명자는 봉입체의 구조 및 조성이 재생된 활성 폴리펩티드의 수율과 관련하여 제한 인자일 수 있다고 생각한다. 본원에 기술된 추가의 파라미터, 예컨대 유도 방식, pH, 하류 프로세싱, 및 특히 발현 시스템이 수율의 추가의 증가를 추가로 용이하게 한다. 본원에 기술된 다양한 추가의 파라미터는 본원에 기술된 방법에 개별적으로 적용될 수 있거나, 상기 파라미터 중 1가지 이상을 본원에 기술된 방법에 적용함으로써 조합될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 세포 성장을 향상시키고 미생물 숙주 세포에서의 재조합 폴리펩티드 발현을 향상시킨다.

본 발명의 제1 측면에서, 봉입체 내에서 발현되는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법이 제공되며, 본 방법은 (a) 미생물 숙주 세포로서, 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는, 미생물 숙주 세포의 세포 배양물을 제1 온도에서 배양하는 단계, (b) 배양 온도를 제1 온도로부터 제2 온도로 저하시키는 단계, 및 (c) 제2 온도에서 미생물 숙주 세포의 배양물을 배양하는 단계를 포함한다. 온도의 저하는 연속 배양 동안 수행된다. 핵산은 숙주 세포 내에 도입되었다. 핵산은 벡터 내에 포함될 수 있다. 핵산은 유도성 프로모터에 연결될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환가능하게 사용되어, 일련의 아미노산 잔기가 펩티드 결합에 의해 다른 것에 연결된 것을 표기한다.

"재조합 핵산"은 분자 공학 기술을 사용하여 유전 물질의 새로운 조합을 생성하는 것에서 생긴 핵산인데, 이는 생물학적 유기체에서는 달리 발견되지 않는 핵산을 생성한다. 생세포 내에서의 재조합 핵산의 발현에서 생긴 단백질은 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"로 칭해진다. 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산은 숙주 세포 내에 도입된다. 본원의 방법에서 사용되는 "핵산"은 이종성 핵산, 즉, 숙주 세포에 대하여 외래체인 핵산일 수 있다. 또는 핵산은 숙주로부터 유래될 수 있으며, 상기 숙주에 의해 천연적으로 발현되는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 제2 카피(copy)의 도입은 발현을 증가시킬 수 있다. 또는 핵산 서열은 숙주에 있어서 이 핵산에 대하여 보통 발견되는 전사 제어 이외의 전사 제어 하에 놓여진다. 따라서 그의 재조합 형태의 단백질은 상이한 발현 수준으로 발현되며, 예를 들어, 상기 단백질은 그의 내인적 발현 수준과 비교하여 과다발현되거나 과소발현될 수 있다.

관심있는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 서열은 하나 이상의 돌연변이(들), 삽입(들), 결실(들) 및/또는 치환(들)에 의해, 숙주 세포 내로의 도입 전에 변형될 수 있으며, 이는 그러한 변형된 서열이 상기 관심있는 단백질과 동일한 생물학적 기능을 갖는(즉, 관심있는 단백질의 기능적 등가체인) 활성 단백질을 코딩하기만 한다면 그러하다. 본원에서 언급되는 재조합 핵산 서열은 유기체의 상이한 도메인(엠파이어(empire))에서 기원하는, 예컨대 (진핵 기원의) 진핵 생물, 예컨대 인간 서열에서 기원하는 핵산 서열을 또한 포함하는데, 이는 숙주 세포에서의 발현의 최적화를 위하여 원핵 숙주의 "코돈 사용 빈도(codon usage)"에 따라 변형되었다.

본 발명은 봉입체 중에 생성되는 임의의 단백질에 적용될 수 있다. 봉입체는 일반적으로 상대적으로 소수성인 단백질(예컨대 G-CSF)에 의해 형성되며, 따라서 본 발명은 상대적으로 소수성인 단백질, 특히, 너무 많은 디술피드 결합을 갖는 것은 아닌(G-CSF와 유사한) 것에 쉽게 적용될 수 있다. 따라서 본 발명은 G-CSF와 유사한 특성, 예컨대 유사한 용해도, 유사한 소수성, 유사한 수의 시스테인 결합 등을 갖는 단백질에 특히 적합할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 방법은 소수성 단백질에 적용된다.

특히, 본 발명자는 소위 "나선 번들형 단백질", 특히 "4개 나선 번들형 단백질"이 본원에 개시된 방법에 의해 특히 향상된 높은 발현률을 나타낸다는 것을 알아냈다. 모든 나선 번들형 단백질은 코어 구조를 공통으로 갖는다. 상기 단백질은 그의 2차 구조 내에 몇몇 알파 나선을 보유하는데, 상기 알파 나선은 일반적으로 3차 구조 내에서 서로에 대하여 병렬 또는 역병렬 형성물 형태로 배향된다. 4개 나선 번들형 단백질은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 생성하기에 특히 적합하다. 문헌[Ricci et al, 2003] 및 문헌[Weber et al, 1980]에는 4개 나선 번들형 패밀리의 단백질의 공통 구조 및 구성원이 기술되어 있다. 본 발명에 특히 적합한 나선 번들형 단백질의 비제한적 예는 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자), GM-CSF(과립구 대식세포 콜로니 자극 인자), M-CSF(대식세포 자극 인자), hGH(인간 성장 호르몬), 인터페론, 예컨대 IFN-알파 2(인터페론 알파 2) 또는 인터페론 베타, 인터류킨, 예컨대 IL-2(인터류킨-2), IL-4(인터류킨-4), IL-7(인터류킨-7), 또는 IL-9(인터류킨-9), 에리트로포이에틴, 렙틴, MGDF(거핵구 성장 및 발달 인자), 및 다른 사이토카인을 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 G-CSF, GM-CSF, M-CSF, hGH, IFN-알파 2, IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF의 군으로부터 선택된다.

재조합 단백질을 코딩하는 핵산의 서열은 미생물 숙주 세포, 특히 이. 콜라이에서의 발현에 대하여 코돈 최적화될 수 있다.

일부 바람직한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 G-CSF이다. 인간 과립구 콜로니 자극 인자(hG-CSF)는 호중구의 형성에 있어서 결정적인 역할을 하는 조혈 성장 인자에 속한다. G-CSF는 혈액학 및 종양학 분야에서 의약에서 사용된다. 오늘날, 하기 2가지 형태의 임상용 G-CSF가 시장에 나와 있다: 글리코실화되고 포유류 세포, 구체적으로 CHO 세포주에서 생성되는 레노그라스팀(lenograstim)(문헌[Holloway CJ (1994) Eur J Cancer30A Suppl 3:S2-S6.], 유럽 특허 제169566호), 및 비글리코실화되고 이. 콜라이에서 생성되는 필그라스팀(유럽 특허 제237545호).

본 발명의 맥락에서, 본원에서 사용될 때, "G-CSF"는 G-CSF의 종 상동체, 예를 들어 인간 G-CSF, 소 G-CSF 등을 포함한다. 인간 G-CSF의 아미노산 서열은 하기 서열(서열 번호 1)이며, 이는 예를 들어 문헌[Holloway, 1994]에서 또는 드럭뱅크(Drugbank) 등록 번호 DB00099로 발견될 수 있다:

소 G-CSF의 아미노산 서열은 하기 서열(서열 번호 2)이며, 이는 예를 들어 미국 특허 제5849883호의 도 7, 또는 PDB 등록 번호 1BGC-A에서 발견될 수 있다:

일부 바람직한 실시 양태에서, G-CSF는 포유류 G-CSF이다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 폴리펩티드는 인간 G-CSF [드럭뱅크 등록 번호: DB00099], 소 G-CSF [PDB 등록 번호: 1BGC-A], 또는 이들의 기능성 변이체이다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 메티오닐-G-CSF(Met-G-CSF), 예컨대 인간 Met-G-CSF(r-met-hu-G-CSF = 필그라스팀)이다.

필그라스팀의 아미노산 서열은 하기 서열(서열 번호 3)이다:

소 G-CSF도 메티오닐-소 G-CSF로 제공될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 본원에서 사용될 때, "G-CSF"는 G-CSF의 기능성 변이체를 포함한다. 본원에서 "변이체"의 언급은 그 맥락이 달리 지시하지 않으면 "기능성 변이체"를 언급함을 의미한다. G-CSF 단백질의 변이체는 G-CSF 단백질 서열과는 상이하지만 여전히 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 나타낸다(기능성 변이체). G-CSF 단백질의 "변이체"는 1개 이상의 아미노산(들)이 (인간 G-CSF 서열과 같은) 기준 G-CSF 단백질 서열과 상이한 단백질을 나타낸다. 대안적으로 또는 게다가, "변이체"는 예를 들어 메틸화, 페길화(pegylation), 숙시닐화, 태그 또는 표지체의 부가 등과 같은 다른 변형을 가질 수 있다. 변이체는 효소적으로 또는 화학적으로 변형된 G-CSF일 수 있다. 이것은 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, G-CSF는 페길화된다.

변이체는 대립유전자 변이체를 포함하는 천연 변이체(예를 들어, 문헌[Zsebo 1986] 참조), 또는 합성에 의해 생성된 변이체일 수 있다. 종래 기술에서, 변형된 형태의 G-CSF가 봉입체 내에서 발현된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 변이체는 본원에 기술된 개선된 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 제0719860호에는 변형된 소 G-CSF의 구성 및 생성이 실시예 2 및 실시예 3에 기술되어 있다.

일부 실시 양태에서, G-CSF 변이체는 서열 번호 3의 서열(r-met-hu-G-CSF = 필그라스팀)과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 공유하는 단백질이다. 서열 동일성은 예를 들어 Clustal, BLAST 등과 같은 표준 서열 분석 도구, 또는 예를 들어 니들맨-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘 등과 같은 정렬 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 변이체는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환(들)을 가질 수 있다. 아미노산 치환은, 1개의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 아미노산과 교환될 경우, 예를 들어 극성 아미노산이 또 다른 극성 아미노산과 교환되거나 산성 아미노산이 또 다른 산성 아미노산과 교환되는 등의 경우에 보존적이다. 보존적 치환은 화학적 특성, 그리고 그에 따라 단백질의 기능에 영향을 줄 가능성이 더욱 적다. 따라서 G-CSF에 대한 "변이체"는 G-CSF의 변이체가 여전히 G-CSF와 동일한 생물학적 기능을 나타내기만 한다면(기능적으로 등가임), 서열 번호 3의 서열과 비교하여 1개 이상의 아미노산의 하나 이상의 돌연변이(들), 결실(들), 치환(들), 삽입(들) 및/또는 변형(들)을 갖는 단백질을 포함한다. 변이체가 동일한 생물학적 기능을 갖는지에 대한 것은 G-CSF의 생물학적 활성을 결정하는 검정법에서 테스트될 수 있다(예를 들어, 실시예 13에 열거된 방법 참조). 상업적으로 입수가능한 G-CSF는 기준 대조구로서 사용될 수 있다. 변이체는, 이것이 필그라스팀과 같은 상업적으로 입수가능한 G-CSF 기준물의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 활성을 가질 경우, "동일한 생물학적 활성"을 갖는 것으로 간주될 수 있으며, 즉, "생물학적으로 활성"이거나 "활성"인 것으로 간주될 수 있다.

따라서 본원에서 "G-CSF"에 대한 언급은 인간 G-CSF의 종 상동체 및 변이체, 즉, 기능성 변이체에 대한 언급을 포함한다.

본 발명에 따른 세포 배양 동안 조정될 수 있는 파라미터는 온도, pH, 광학 밀도, 용존 산소 수준(DO), 공급량(feed rate), 탄소원, 및 활성 재조합 단백질의 수율에 긍정적으로 영향을 주는 다른 파라미터를 포함한다.

온도

본 발명의 일부 실시 양태에서, 세포 배양물의 인큐베이션 온도는 더욱 높은 제1 온도로부터 더욱 낮은 제2 온도로 저하된다. 온도의 저하는 숙주 세포의 연속 배양 동안 수행된다. 더욱 낮은 온도에서, 세포는 성장기로부터 생성기로 변화된다. 일부 실시 양태에서, 제1 온도는 36℃ 내지 38℃이다. 바람직한 실시 양태에서, 제1 온도는 36.5℃ 내지 37.5℃, 또는 36.7℃ 내지 37.2℃이며, 더 바람직한 실시 양태에서 제1 온도는 약 37℃이며, 더 바람직한 실시 양태에서 제1 온도는 37℃이다.

본원에서 사용될 때, 값들의 범위가 본원에서 "x 내지 y"와 같은 것으로 언급된다면, 달리 명백하게 특정되지 않으면 상기 특정 값 x 및 y는 상기 범위 내에 포함된다.

숙주 세포의 세포 배양물은 제1 배양 기간의 지속 시간 동안 제1 온도에서 인큐베이션된다. 제1 배양 기간은 6 내지 48시간일 수 있지만, 실제 세포 배양물에 따라 더 짧거나 더 길 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 제1 배양 기간은 5 내지 40시간, 또는 10 내지 36시간, 또는 10 내지 32시간, 또는 14 내지 28시간, 또는 18 내지 24시간일 수 있다. 특히 제1 배양 기간은 10, 12, 12.5, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간일 수 있거나, 이들 값 중 두 값의 임의의 조합으로 정의되는 기간일 수 있다. 또한 제1 배양 기간의 지속 시간은 세포 배양물의 광학 밀도를 기반으로 하여 결정될 수 있다(하기 참조).

제1 배양 기간 후, 온도는 예를 들어 발효기 온도를 더욱 낮은 제2 온도로 단순히 재설정함으로써 저하된다. 일부 실시 양태에서, 제2 온도는 25℃ 내지 36℃, 또는 26℃ 내지 36℃, 또는 27℃ 내지 36℃, 또는 28℃ 내지 36℃, 또는 29℃ 내지 36℃일 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 제2 온도는 30℃ 내지 36℃, 또는 30.5℃ 내지 36℃, 또는 31℃ 내지 36℃, 또는 32℃ 내지 36℃, 또는 33℃ 내지 36℃, 또는 34℃ 내지 36℃, 또는 35℃ 내지 36℃, 또는 30℃ 내지 35℃, 또는 30.5℃ 내지 35℃, 또는 31℃ 내지 35℃, 또는 32℃ 내지 35℃, 또는 33℃ 내지 35℃, 또는 34℃ 내지 35℃, 또는 30℃ 내지 34℃, 또는 30.5℃ 내지 34℃, 또는 31℃ 내지 34℃, 또는 32℃ 내지 34℃, 또는 33℃ 내지 34℃일 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 제2 온도는 30℃, 30.5℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃ 또는 36℃일 수 있거나, 이들 온도 중 두 온도의 임의의 조합으로 정의되는 범위 이내일 수 있다. 바람직하게는, 제2 인큐베이션 온도는 30℃ 내지 35℃ 또는 30℃ 내지 34℃이다. 더 바람직하게는, 제2 인큐베이션 온도는 약 31℃ 내지 약 34℃, 또는 31℃ 내지 34℃,더 바람직하게는 31℃ 내지 33℃이다. 가장 바람직하게는, 제2 인큐베이션 온도는 약 32℃이거나 32℃이다.

숙주 세포의 세포 배양물은 제2 배양 기간의 지속 시간 동안 제2 온도에서 인큐베이션된다. 제2 배양 기간은 1 내지 20시간일 수 있지만, 실제 세포 배양물에 따라 더 짧거나 더 길 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 제2 배양 기간은 1 내지 20시간, 또는 2 내지 16시간, 또는 3 내지 14시간, 또는 3 내지 10시간, 또는 3 내지 8시간, 또는 3 내지 6시간, 또는 4 내지 14시간, 또는 4 내지 10시간, 또는 4 내지 8시간, 또는 4 내지 6시간, 바람직하게는 5시간일 수 있다. 특히, 제2 배양 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20시간일 수 있거나, 이들 값 중 두 값의 임의의 조합으로 정의되는 기간일 수 있다.

pH

pH는 제1 및/또는 제2 배양 온도/기간 동안 특정 값 내에서 유지될 수 있다. 본 발명자는 6 내지 8의 pH가 특히 유익하며, 발현된 단백질의 높은 수율을 추가로 촉진함을 알아냈으며, 이때 6.8 내지 7.2의 pH가 특히 바람직하다. 따라서 본원에 개시된 방법은 pH를 측정하는 1개 이상의 단계(들)를 포함할 수 있다. pH는 제1 및/또는 제2 배양 온도/기간 동안 6 내지 8, 또는 6.5 내지 7.8, 또는 6.6 내지 7.4, 또는 6.7 내지 7.3, 또는 6.8 내지 7.2, 또는 6.9 내지 7.1, 또는 6.9 내지 7.0; 또는 6.6 내지 7.2, 또는 6.7 내지 7.2, 또는 6.8 내지 7.2, 또는 6.9 내지 7.2, 또는 7.0 내지 7.2, 또는 7.1 내지 7.2; 또는 6.6 내지 7.1, 또는 6.7 내지 7.1, 또는 6.8 내지 7.1, 또는 6.9 내지 7.1, 또는 7.0 내지 7.1; 또는 6.6 내지 7.0, 또는 6.7 내지 7.0, 또는 6.8 내지 7.0, 또는 6.9 내지 7.0의 범위 내에서 유지될 수 있다. pH는 제1 및/또는 제2 배양 온도/기간 동안 6.8 내지 7.2, 또는 6.9 내지 7.2, 또는 7.0 내지 7.2, 또는 7.1 내지 7.2; 또는 6.8 내지 7.3, 또는 6.9 내지 7.3, 또는 7.0 내지 7.3, 또는 7.1 내지 7.3, 또는 7.2 내지 7.3; 또는 6.8 내지 7.7, 또는 6.9 내지 7.7, 또는 7.0 내지 7.7, 또는 7.1 내지 7.7, 또는 7.2 내지 7.7, 또는 7.3 내지 7.7, 또는 7.4 내지 7.7, 또는 7.5 내지 7.7, 또는 7.6 내지 7.7의 범위 내에서 유지될 수 있다. 특히 pH는 (약) 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2일 수 있거나, 이들 값 중 두 값의 임의의 조합으로 정의되는 범위일 수 있다. 제1 배양 온도/기간에서의 pH는 제2 배양 온도/기간에서의 pH와 상이할 수 있다.

광학 밀도

배양 온도는 세포 배양물의 광학 밀도에 따라 제1 온도로부터 제2 온도로 저하될 수 있다. 본 발명자는 광학 밀도에 따른 온도의 변화가 발현된 단백질의 수율에 추가의 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 알아냈다. 600 nm에서의 OD가 10 내지 50일 때 온도를 저하시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌으며, 27 내지 33이 특히 유익하다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 광학 밀도(OD)의 측정 단계를 포함할 수 있다. 온도는, 세포 배양물이 600 nm에서 10 내지 50, 또는 15 내지 45, 또는 20 내지 40, 또는 24 내지 36, 또는 27 내지 33의 광학 밀도에 도달할 때 제1 배양 온도로부터 제2 배양 온도로 감소될 수 있다. 온도는, 세포 배양물이 600 nm에서 27 내지 32, 또는 27 내지 31, 또는 27 내지 30, 또는 27 내지 29 또는 27 내지 28; 또는 28 내지 32, 또는 28 내지 31, 또는 28 내지 30, 또는 28 내지 29; 또는 29 내지 32, 또는 29 내지 32, 또는 29 내지 31, 또는 29 내지 30, 또는 30 내지 32, 또는 30 내지 31, 또는 31 내지 32의 광학 밀도에 도달할 때 제1 배양 온도로부터 제2 배양 온도로 감소될 수 있다. 온도는, 세포 배양물이 600 nm에서 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35의 광학 밀도, 또는 이들 값 중 두 값의 임의의 조합으로 정의되는 밀도에 도달할 때 제1 배양 온도로부터 제2 배양 온도로 감소될 수 있다.

발현 시스템/벡터/숙주 세포

발현에 있어서 재조합 폴리펩티드는 숙주 세포에서 발현된다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 상기에 기술된 방법의 단계 (a), (b) 및 (c)는 핵산을 숙주 세포 내에 도입하는 단계가 선행될 수 있으며, 여기서, 핵산은 관심있는 재조합 폴리펩티드를 코딩한다. 핵산은 벡터의 일부로 도입될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 방법은 이미 재조합 핵산을 함유하는 숙주 세포를 이용하여 수행된다.

미생물 세포에서 단백질의 재조합적 발현에 적합한 다양한 발현 시스템 및 발현 벡터가 공지되어 있다. 임의의 적합한 발현 벡터 및 발현 시스템이 사용될 수 있다. "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 핵산 서열의 전사를 가능케 하는 일련의 특정한 폴리핵산 요소를 포함하는, 재조합적으로 또는 합성에 의해 생성된 폴리핵산 구성물이다. 전형적으로, 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사될 특정 핵산 서열을 포함하는 전사 단위를 포함한다. 프로모터는 외부 자극제, 예컨대 에이전트(agent)의 첨가, 온도 등에 의해 활성화될 수 있는 유도성 프로모터일 수 있다. 일반적으로 벡터는 "전사 개시 영역", "전사 종결 영역"을 포함하며, "인핸서"를 포함할 수 있다. 숙주에서 발현가능한 벡터는 예를 들어 자율 복제 또는 자가 복제 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 레트로바이러스일 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pBR322(퍼멘타스(Fermentas)), pET300 벡터, pDEST 벡터, 및 pET39b 벡터(노바겐(Novagen)) 및 이들의 유도체를 포함한다. 추가의 적합한 발현 벡터는 문헌[Laboratory handbook "Sambrook and Russel, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3^rd edition 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Chapter 15"]으로부터 취해질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 숙주 세포의 게놈 내에 통합되며, 즉, 통합 벡터이다. 일부 실시 양태에서, 벡터는 게놈 내에 통합되지 않으며, 세포 내에서 별도로 유지되고, 즉, 자율 벡터 또는 이원(binary) 벡터이다.

본원에서 사용될 때, "프로모터"는 전사 단위의 발현을 조절하는 핵산 서열을 나타낸다. "프로모터 영역"은 세포 내에서 RNA 폴리머라아제에 결합하여 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 조절 영역이다. 프로모터 영역은 일반적으로 RNA 폴리머라아제의 결합에 책임이 있는 단백질 결합 도메인(콘센서스(consensus) 서열), 예컨대 추정 -35 박스(box) 및 프립나우(Pribnow) 박스(-10 박스)를 포함한다. 또한, 프로모터 영역은 전사 시작 부위 및 조절 단백질의 결합 부위를 포함할 수 있다.

"전사 개시 영역"은 전사 개시를 촉진하고 리보좀 결합 부위의 서열, 예컨대 샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열을 포함하는 신호 영역이다. 전형적으로, 전사 개시 영역은 전사 개시 부위에 대하여 하류에 위치하며, 발현될 핵산(들)/유전자(들)에 작동가능하게 연결되어 있다.

"전사 종결 영역"은 RNA 폴리머라아제가 전사를 종결하게 하는 서열을 나타낸다. 일반적으로, 전사 종결 영역은 다른 인근 핵산/유전자의 원하지 않는 전사 또는 다른 잠재적인 프로모터로부터의 전사를 피할 수 있는 전사 단위의 일부로서, 이는 mRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.

"인핸서"는 전사 단위의 전사를 강화시키는 작용을 하는 핵산 서열로서, 상기 강화는 전사 단위의 아이덴티티(identity), 전사 단위에 대한 상기 서열의 위치 또는 상기 서열의 배향과는 관계없다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 벡터는 임의로 인핸서를 포함할 수 있다.

핵산 서열은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 두어질 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 전사 개시 영역, 예컨대 리보좀 결합 부위는 이것이 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 전사를 용이하게 하도록 위치할 경우 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 것이다. 연결은 예를 들어 편리한 제한효소 부위에서의 라이게이션(ligation)에 의해 성취될 수 있다.

본원에서 언급될 때, "핵산" 또는 "핵산 서열" 또는 "단리되고 정제된 핵산 또는 핵산 서열"은 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드(hybrid)일 수 있다. 핵산 또는 핵산 서열이 벡터 내에 위치할 경우, 이것은 일반적으로 DNA이다. 본원에서 언급되는 DNA는 예를 들어 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 한 가닥 또는 둘 모두의 가닥이 2개 이상의 단편으로 구성된 이중 가닥 DNA, 한 가닥 또는 둘 모두의 가닥이 개재되지 않은 포스포디에스테르 골격을 갖는 이중 가닥 DNA, 1개 이상의 단일 가닥 부분(들) 및 1개 이상의 이중 가닥 부분(들)을 함유하는 DNA, DNA 가닥들이 완전히 상보성인 이중 가닥 DNA, DNA 가닥들이 단지 부분적으로 상보성인 이중 가닥 DNA, 원형 DNA, 공유 결합으로 닫힌 DNA, 선형 DNA, 공유 결합으로 가교결합된 DNA, cDNA, 화학물질 합성된 DNA, 반합성 DNA, 생합성 DNA, 천연적으로 단리된 DNA, 효소 소화된 DNA, 전단된 DNA, 표지된 DNA, 예컨대 방사성 표지 DNA 및 형광 색소 표지 DNA, 1가지 이상의 비천연 화학종 또는 핵산을 포함하는 DNA를 비롯한 임의의 폴리데옥시뉴클레오티드 서열일 수 있다. DNA 서열은 표준 화학 기술, 예를 들어 포스포트리에스테르법에 의해 또는 자동 합성법 및 PCR법을 통하여 합성될 수 있다. 정제되고 단리된 DNA 서열은 효소적 기술에 의해 또한 생성될 수 있다. 본원에서 언급되는 RNA는 예를 들어 단일 가닥 RNA, cRNA, 이중 가닥 RNA, 한 가닥 또는 둘 모두의 가닥이 2개 이상의 단편으로 구성된 이중 가닥 RNA, 한 가닥 또는 둘 모두의 가닥이 비개재 포스포디에스테르 골격을 갖는 이중 가닥 RNA, 1개 이상의 단일 가닥 부분(들) 및 1개 이상의 이중 가닥 부분(들)을 함유하는 RNA, RNA 가닥들이 완전히 상보성인 이중 가닥 RNA, RNA 가닥들이 단지 부분적으로 상보성인 이중 가닥 RNA, 공유 결합으로 가교결합된 RNA, 효소 소화 RNA, 전단된 RNA, mRNA, 화학적으로 합성된 RNA, 반합성 RNA, 생합성 RNA, 천연적으로 단리된 RNA, 표지된 RNA, 예컨대 방사성 표지된 RNA 및 형광 색소 표지된 RNA, 1가지 이상의 비천연 핵산종을 함유하는 RNA일 수 있다.

발현 시스템은 유도성 발현 시스템일 수 있으며, 즉, 재조합 폴리펩티드의 발현은 유도제의 존재에 의존적일 수 있다. 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터를 포함하는 발현 벡터 상에 작동가능하게 연결될 수 있다. 관련 유도제는 예를 들어 이것을 세포 배양물에 첨가하거나 이것을 세포 배양물에 적용함으로써 직접적으로 공급될 수 있거나, 상기 유도제는 간접적으로, 즉, 숙주 세포 내의 제2 구성물을 통하여 공급될 수 있다. 숙주 세포 내의 이러한 제2 구성물은 유도시에 신호를 생성하여 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 제2 구성물은 미생물 숙주 세포의 게놈의 일부일 수 있거나 세포 내에서 자율적으로 유지될 수 있다.

유도성 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 공지된 유도제는 예를 들어 IPTG, 락토스, NaCl, 온도 등을 포함한다. 본원에 기술된 방법에서 특히 바람직한 것은 IPTG를 이용한 유도이다. IPTG가 유도제로서 사용될 경우, 이것은 0.1 mM 내지 1 mM, 더 바람직하게는 0.2 내지 0.6 mM, 더 바람직하게는 0.25 내지 0.5 mM, 더 바람직하게는 0.3 내지 0.35 mM의 범위의 농도, 더 바람직하게는 0.33 mM의 농도로 사용될 수 있다.

바람직한 실시 양태에서, 발현 벡터는 유도성 프로모터, 바람직하게는 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 핵산의 발현은 유도제의 존재에 의해 트리거링된다(triggered). T7 프로모터의 경우에, 발현은 T7 DNA 의존성 RNA 폴리머라아제의 존재에 의해 트리거링된다. 바람직한 실시 양태에서, 발현 벡터는 서열 번호 4의 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

이러한 발현 벡터에 상응하여, 숙주 세포는 적합한 발현 시스템을 함유할 수 있다. 예를 들어, 미생물 숙주 세포의 염색체는 박테리오파지 RNA 폴리머라아제, 예컨대 T7 RNA 폴리머라아제의 핵산을 포함할 수 있다. 박테리오파지 RNA 폴리머라아제는 예를 들어 lac 프로모터(lacZ 단백질 베타-갈락토시다아제 프로모터)와 같은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. lac 프로모터는 IPTG(이소프로필-1-티오-β-D-티오갈락토피라노시드)를 숙주 세포에 첨가함으로써 유도될 수 있다. 미생물 숙주 세포의 염색체에는 바람직하게는 용원성 박테리오파지 핵산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명자는 이러한 발현 시스템/발현 벡터의 사용이 본원에 기술된 방법에서 특히 유익하며 고수율의 재조합 단백질이 봉입체로부터 수득되게 함을 알아냈다. 특히, 본 발명자는 이러한 발현 시스템/발현 벡터를 본원에 기술된 배양 방법, 즉, (i) 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 상기 미생물 숙주 세포를 제1 온도에서 배양하는 것, (ii) 배양 온도를 제1 온도로부터 제2 온도로 저하시키는 것, 및 (iii) 미생물 숙주 세포를 제2 온도에서 배양하는 것과 병용하는 것이 특히 유익함을 알아냈다.

따라서, 본 발명의 일 측면에서, (숙주 세포에서) 봉입체 중에 생성되는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법이 제공되며, 본 방법은 (i) 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로서 프로모터, 바람직하게는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내에 도입하는 단계, (ii) 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 상기 미생물 숙주 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계, (iii) 배양 온도를 제1 온도로부터 제2 온도로 저하시키는 단계, 및 (iv) 미생물 숙주 세포를 제2 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 유도성 프로모터는 T7 프로모터일 수 있다. 미생물 숙주 세포의 염색체는 예를 들어 lac 프로모터와 같은 유도성 프로모터에 임의로 작동가능하게 연결된, 박테리오파지 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 용원성 박테리오파지 핵산 서열을 포함하지 않는다. 박테리오파지 RNA 폴리머라아제는 T7 폴리머라아제일 수 있다. 폴리펩티드의 발현은 (예를 들어 IPTG와 같은) 유도제의 첨가에 의해 수행된다.

상기에 기술된 발현 시스템은 본원에 기술된 방법에서 특히 잘 작용한다는 것이 밝혀진 것은 놀라운 것이었다. 당업계에서 고온에 의한 유도가 가장 일반적인 유도 기작으로서 흔히 기술되었다. 그러나, 본 발명자는 상기에 기술된 T7 구동 발현 시스템을 본원에 기술된 2가지 온도 배양법과 병용하는 것이, 활성형의 발현된 단백질의 수율과 관련하여 특별한 개선으로 이어짐을 알아냈다.

가장 바람직한 실시 양태에서, 숙주 세포의 게놈은 lac 프로모터에 작동가능하게 연결된, 박테리오파지 RNA T7 폴리머라아제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 용원성 박테리오파지 핵산 서열을 포함하지 않는다. 벡터는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서, 핵산은 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다. IPTG의 첨가시에, lac 프로모터는 T7 폴리머라아제의 발현을 유도하며, 이는 그 후 T7 프로모터를 통하여 재조합 단백질의 발현을 유도한다.

본 발명자는 인큐베이션 동안 특정 시점에, 예컨대 배양 온도를 제1 배양 온도로부터 더욱 낮은 제2 배양 온도로 저하시키는 것과 동시에 또는 그 후에 유도제를 첨가하면 고수율의 재조합 단백질이 봉입체로부터 수득되는 것이 추가로 촉진됨을 알아냈다. 유도제는 배양 온도를 제1 배양 온도로부터 더욱 낮은 제2 배양 온도로 저하시키는 것과 동시에 또는 그 후에 첨가될 수 있다. 환언하면, 유도제는 온도가 저하되고 있는 그 시점에 첨가될 수 있거나, 상기 유도제는 이후에, 즉, 제2 배양 온도에서의 제2 배양 기간 동안 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 유도제는 온도가 저하되고 있는 그 시점에 첨가된다.

핵산의 숙주 세포 내로의 도입

관심있는 재조합 폴리펩티드를 함유하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 숙주 세포 내에 도입될 수 있다.

"형질전환", "형질전환된" 또는 "핵산을 숙주 세포 내에 도입하는"이라는 용어는 세포외 핵산, 예컨대 벡터가 수반되는 물질과 함께, 또는 수반되는 물질 없이, 숙주 세포에 들어가는 임의의 과정을 나타낸다. "형질전환된 세포" 또는 "형질전환 세포"라는 용어는 핵산이 도입된 그리고 그에 따라 그 핵산을 품고 있는 세포 또는 그 자손을 나타낸다. 핵산은, 핵산이 염색체 통합체로서 또는 염섹체외 요소로서 복제가능하도록 세포 내에 도입될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터를 이용한 적절한 숙주 세포의 형질전환은 공지된 방법, 예컨대 미세주입법, 전기천공법, 입자 충격법(particle bombardment)에 의해 또는 예를 들어 문헌[Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory] 또는 문헌[Ausubel et al. 1994, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons]에 기술된 인산칼슘 매개 형질전환과 같은 화학적 방법에 의해 달성될 수 있다.

숙주 세포

봉입체 중의 재조합 단백질의 발현을 허용하는 임의의 미생물 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 봉입체를 생성하는 미생물 세포는 예를 들어 박테리아 및 효모 세포와 사상균 세포를 포함한다. "숙주 세포" 또는 "숙주"는 임의의 미생물 세포, 예컨대 박테리아, 효모 또는 사상균 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 바람직한 숙주 세포이며, 이때 그람 음성(gram-negative) 박테리아가 특히 바람직하다. 예는 C2523, C2523, 및 BL21(DE3)(모두 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))과 같은 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 특정 발현 시스템에 적합한 숙주 세포가 상기에 또한 기술되었다.

본원에서 "숙주", "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 1가지 이상의 벡터 또는 단리되고 정제된 핵산 서열이 도입된 미생물 세포를 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 단수형 "숙주 세포"의 사용은, 그 맥락이 달리 나타내지 않으면, 복수의 세포가 사용될 수 있음을 또한 나타낸다. 실제는, 재조합 숙주 세포의 생성에 있어서, 복수의 숙주 세포가 세포 배양에서 사용된다.

"단리되고 정제된 핵산 서열"이라는 용어는, 시험관내 또는 생체내에서 실시되는 재조합 기술에 의해 제조되었을 때 핵산들이 제조되는 환경(예를 들어, 세포 배양) 또는 천연적인 환경에서 발견되는 다른 핵산들과 같이 천연적으로 결부된 물질을 핵산 서열이 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않는 상태를 나타낸다.

"숙주", "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손도 나타내는 것으로 이해된다. 특정한 변형이 돌연변이 또는 환경적인 영향 중 어느 하나로 인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 실제, 이러한 자손은 모(parent) 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 상기 자손이 활성형의 재조합 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 생성하기만 한다면, 본원에서 사용되는 상기 용어의 범주 내에 여전히 포함된다(상기 기능성 변이체에 대한 논의 참조).

숙주가 원핵 종 유래의 것인 경우에, 재조합 핵산 서열은 상이한 속 또는 과, 상이한 목 또는 강, 상이한 문(디비전(division)) 또는 상이한 도메인(엠파이어)의 유기체에서 기원할 수 있다.

형질전환된 숙주 세포는 냉동되어 보관될 수 있다. 마스터(master) 세포 은행 및 제조용 세포 은행(working cell bank)이 제조될 수 있으며, 이는 생존성, 아이덴티티, 순도 및 안정성에 대하여 테스트될 수 있다.

추가의 세포 배양 조건

미생물 세포를 배양하기 위한 일반적인 셋업(set up) 및 배양 조건은 잘 확립되어 있으며, 본원에서 단지 요약될 것이다. 표준 세포 배양 파라미터는 당업계의 공통의 일반적인 지식을 기반으로 하여 조정될 수 있다.

세포 배양 배지에는 형질전환된 미생물 숙주 세포의 샘플이 접종된다. 적합한 배양 배지는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어 GBA 배지, SOC(초 최적 탄소(Super optimal carbon)) 배지, LB(루리아(Luria)) 배지, 또는 RBY 배지를 포함한다. 다양한 양의 배양 배지가 접종될 수 있다. 배양은 예를 들어 실험실용의 소규모 배양, 예를 들어 1 ml 내지 1 L의 배양 배지일 수 있다. 기술된 방법은 또한 공업적 규모, 즉, 제조용 규모까지의 큰 부피용으로 특히 유용하다. 따라서 본원에 기술된 방법은 공업용의 대규모 프로세싱을 비롯하여 더욱 큰 세포 배양물 부피에 의해 수행될 수 있다. 배양물은 1-5 L, 또는 1-10 L, 또는 1-100 L, 또는 1-500 L, 또는 1-1000 L의 범위이거나 그보다 더 클 수 있다. 배양물은 5-5000 L, 또는 10-5000 L, 또는 50-5000 L, 또는 100 내지 5000 L, 또는 5-1000 L, 또는 10-1000 L, 또는 50-1000 L, 또는 100-1000 L의 범위일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 먼저 시드(seed) 배양물이 접종된다. 시드 배양물은 특정한 광학 밀도가 달성될 때까지 배양된다. 시드 배양물은 600 nm에서의 광학 밀도가 0.5 내지 1.5, 또는 0.6 내지 1.4, 또는 0.7 내지 1.3, 또는 0.8 내지 1.2, 또는 0.9 내지 1.1의 범위 이내가 될 때까지 배양될 수 있다. 바람직한 광학 밀도는 0.9 내지 1.1의 범위 이내이다. 그 후 시드 배양물은 신선한 배지를 포함하는 더욱 큰 생물반응기로 옮겨질 수 있다.

당업자라면, 예를 들어 세포 배양물 중 용존 산소 수준 및 영양소를 모니터링하여 효율적인 세포 성장을 보장하는 것이 필요함을 알고 있다.

공급량은 선형일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 용존 산소(DO) 수준이 탄소원의 고갈에 의해 야기되어 설정점 수준으로부터 급격하게 증가하기 시작할 때, 선형 공급물 첨가가 시작될 수 있다. DO 설정점은 10% 내지 50%, 20% 내지 45%, 30% 내지 45%, 35% 내지 45%, 37% 내지 42%, 또는 39% 내지 40%일 수 있다. DO는 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% 또는 45%일 수 있거나, DO는 이들 값 중 두 값의 임의의 조합일 수 있다. 바람직하게는, DO는 40%이다.

적합한 영양소는 당업계에 공지되어 있다. 탄소원으로서 당 알코올, 바람직하게는 글리세롤이 배지 중에 사용될 수 있다. 본 발명자는 탄소원으로서의 글리세롤이 높은 성장 속도 및 높은 바이오매스(biomass)를 생성함을 알아냈다. 공급 배지의 조성은 특히 아미노산(주로 L-메티오닌, L-글루타민 및 L-류신) 및 미네랄(예를 들어, 염, 포스페이트, 술페이트)을 포함할 수 있다. 사용되는 모든 물질은 동물 성분 미사용(animal-free source) 공급원으로부터의 것이다.

1가지 이상의 소포제(들) 또는 선발제(들)가 사용될 수 있다. 소포제로서 PPG2000, JM633, SB2020이 사용될 수 있다. 발효 브로스(broth)는 선발제로서 카나마이신 모노술페이트(아미노글리코시드계 항생제)를 추가로 포함할 수 있다.

사용되는 실제 숙주 세포에 따라 추가 성분이 존재할 수 있다.

하류 프로세싱

"하류 프로세싱"은 배양물로부터 수확된 세포의 추가의 프로세싱을 포함한다. 세포는 재조합 단백질을 포함하는 봉입체를 함유한다.

형질전환된 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물의 배양 후, 세포는 저속 원심분리 또는 분리기를 사용하여 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 세포의 용해(lysis) 후, 재조합 단백질을 함유하는 봉입체가 수득된다. 따라서, 본원에서 어디든 기술되어 있는 방법은 봉입체를 숙주 세포(들)로부터 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

봉입체는 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 봉입체를 숙주 세포로부터 수득하는 방법은 일반적으로 세포의 용해 및 파괴, 이어서 원심분리를 포함한다. 봉입체는 분리기에서 세포를 수확하고(예를 들어, 원심분리에 의해, 예를 들어 약 11　000 g), 예를 들어 고압 균질화기(예를 들어 약 1000바(bar))를 이용하여 세포를 기계적으로 파괴하고, 그 후 분리기에서 봉입체를 세포 잔사로부터 분리함으로써(예를 들어 원심분리에 의해, 예를 들어 약 11　000 g) 수득될 수 있다. 고전적 봉입체의 대부분을 포함하는 펠렛은 일반적으로 세제를 포함하는 적합한 완충제로 세척된다. 봉입체는 적합한 완충제 중에 보관될 수 있다. 적합한 완충제는 임의의 생물학적으로 허용가능한 완충제, 예를 들어 포스페이트-, 시트레이트-, 아세테이트-, 타르트레이트 완충제 또는 물이다. 봉입체는 -80℃에서 8개월 이상 동안 적합한 완충제 중에 보관되거나, 유지 단계 없이 추가로 확대될 수 있다.

G-CSF의 단리를 위하여, 예를 들어 1% 데옥시콜레이트(문헌[Zsebo KM et al (1986) Immunobiology 172:175-184], 유럽 특허 제237545호; 미국 특허 제5849883호) 또는 0.1% 트윈(Tween) 80이 첨가된 1.0 M NaCl의 용액(문헌[Gelunaite L et al (2000) J Chromatogr A 904:131-143])을 이용한 고전적 봉입체의 세척이 편리한 것으로 보고되었다.

봉입체가 수득된 후, 재조합 단백질은 봉입체로부터 가용화되어야 한다. 일부 실시 양태에서, 본원에서 어디든 기술되어 있는 방법은 (i) 봉입체를 수득하는 단계 및 (ii) 재조합 단백질을 봉입체로부터 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는 재조합 단백질을 제공한다.

봉입체의 수득은 상기에 개시된 바와 같이 일반적인 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 올바르게 폴딩된 생물학적 활성 단백질을 천연 조건 하에서, 일반적인 수성 완충제 또는 수계 액체 중에 불용성인 봉입체로부터 제조하기 위하여, 봉입체는 세포로부터 단리되며, 세척되고, 가용화되며, 그 후 시험관내에서 재생이 수행된다.

봉입체로부터의 재조합 단백질의 수득은 일반적인 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 제0219874호에는 이. 콜라이 봉입체로부터의 재조합 단백질의 일반적인 재폴딩 방법이 개시되어 있다. 가용화를 위하여, 카오트로픽제인 GuHCl 및 아르기닌이 고 pH에서 사용되었다. 유럽 특허 제0219874호에는 GSH/GSSG에 의해 제공되는 산화환원 조건 하에서의 디술피드 가교체의 형성이 기술되어 있다. 단량체형 용해성 G-CSF의 수득 방법이 예를 들어 문헌[Zsebo 1986], 국제 특허 공개 제WO87/01132호, 문헌[Devlin 1988], 문헌[Holloway 1994], 국제 특허 공개 제WO01/04154호, 미국 특허 제5055555호에 기술되어 있다. 추가의 방법이 국제 특허 공개 제WO89/10932호, 문헌[Lu 1992], 문헌[Heidari 2001], 문헌[Wingfield 1988], 문헌[Kang 1998], 국제 특허 공개 제WO98/53072호, 문헌[Wang 2005], 국제 특허 공개 제WO01/87925호, 국제 특허 공개 제WO2004/015124호, 국제 특허 공개 제WO2004/001056호, 국제 특허 공개 제WO2006/097944호, 국제 특허 공개 제WO2006/135176호, 유럽 특허 제1630173호, 유럽 특허 제1837346호, 문헌[Rao 2008], 문헌[Khalilzadeh 2008], 국제 특허 공개 제WO2008/096370호, 국제 특허 공개 제WO2010/146599호에 기술되었다.

예를 들어, 국제 특허 공개 제WO89/10932호 및 유럽 특허 제0719860호에는 미생물로부터의 재조합 G-CSF의 단리 및 정제 방법이 기술되어 있다. 국제 특허 공개 제WO89/10932호 및 유럽 특허 제0719860호에 기술된 방법은 미생물을 용해시켜서 G-CSF를 함유하는 불용성 물질을 용해성 단백질성 물질로부터 분리하는 단계; 가용화제 및 산화제의 존재 하에서 G-CSF를 가용화하고 산화시키는 단계; 가교결합된 스티렌-디비닐벤젠 중합체 매트릭스를 갖는 도웩스(DOWEX) 이온 교환 수지를 사용하여 가용화제를 제거하는 단계; G-CSF를 이온 교환 크로마토그래피에 처하는 단계; 및 정제된 G-CSF를 회수하는 단계를 포함한다. 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography; AEX), 이어서 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography; CEX)일 수 있다. 세포 용해는 가울린(Gaulin) 균질화기를 이용하여 수행될 수 있으며, 이때 후속적으로 원심분리하여 펠렛을 수집한다. 봉입체의 세척은 예를 들어 데옥시콜레이트 또는 또 다른 담즙산염 또는 비이온성 세제를 이용하여 수행될 수 있다. 가용화제는 사르코실(Sarkosyl)일 수 있으며, 산화제는 황산구리일 수 있다. 그 후, 사르코실은 도웩스 또는 다른 이온 교환 수지를 이용하여 뱃치식 흡착을 이용하여 제거될 수 있다. 그 후, 후속적인 AEX 및/또는 CEX 크로마토그래피가 폴리싱(polishing)에 사용될 수 있다.

이러한 정제 절차는 봉입체로부터 용해성의 단량체형의 올바르게 폴딩된 형태로 G-CSF가 수득되게 하며, 즉, 본원에 기술된 방법에 의해, 재폴딩된 G-CSF가 수득된다. 상기 단백질은 추가로 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 단지 단량체형의 산화된 형태로 정제될 수 있다. 응집체, 이량체형 또는 다르게는 부정확하게 폴딩된 단백질은 침전되고 필터 중에 그리고 컬럼 상에 잔존한다. 올바르게 폴딩된 단량체 형태의 G-CSF가 생물학적 활성을 갖는다.

따라서, 본원에 기술된 방법으로부터 수득된 단량체형 가용화 G-CSF는 올바르게 폴딩되고 따라서 생물학적 활성을 갖는다고 추정될 수 있다. G-CSF의 생물학적 활성은 실시예 13에 개시된 방법을 이용하여 테스트될 수 있다.

본원에서 본 발명자는 새로운 그리고 독창적인 하류 프로세싱 방법을 기술하며, 이는 본원에 기술된 상류 세포 배양(발효)와 병용될 수 있다. 이것은 올바르게 폴딩된 재조합 단백질의 수율을 추가로 증가시킨다. 하류 프로세싱 방법은 재조합 단백질을 가용화하는 단계, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 수행하는 단계, 가용화제를 제거하는 단계 및 제2 재폴딩 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 특히, 본원에 기술된 배양 방법은 봉입체로부터의 재조합 단백질의 재폴딩 방법과 조합되어 수행될 수 있으며, 이는

a) 가용화제의 존재 하에 재조합 단백질을 가용화하는 단계;

b) 산화제 및 가용화제의 존재 하에서 재조합 단백질을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 수행하는 단계;

c) 이온 교환 수지 흡착 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 가용화제를 제거하고, 임의로, 산 침전을 수행하는 단계; 및

d) 가용화제의 부재 하에서 단계 (c)의 재조합 단백질을 희석시키고 인큐베이션하는 것을 포함하는, 제2 재폴딩 단계를 수행하는 단계를 포함한다.

봉입체는 미생물, 바람직하게는 이. 콜라이로부터 수득될 수 있다. 가용화제는 N-라우로일사르코신일 수 있다. 산화제는 CuSO₄일 수 있다. 가용화는 pH 7 초과의 pH 값에서 수행될 수 있다. 가용화제는 약 0.5% 내지 약 1.5%의 농도의 N-라우로일사르코신일 수 있다. 산화 및 제1 재폴딩 단계는 2시간 이상 동안 수행될 수 있다. 산화 및 제1 재폴딩 단계는 기류 하에 그리고 냉각 없이 수행될 수 있다. 산화 및 제1 재폴딩 단계는 약 7-9의 pH 값에서 및/또는 약 20-28℃의 온도에서 및/또는 약 15-25시간 동안 수행될 수 있다.

상기 단계 (c)에서의 가용화제의 제거는 AEX(음이온 교환) 및 CEX(양이온 교환)를, 임의로 이 순서로 포함할 수 있다. 상기 단계 (c)에서의 가용화제의 제거는 하기를 포함할 수 있다:

a) 재조합 단백질 용액을 현탁 수지 물질과 혼합함으로써 음이온 교환 수지 물질에 결합시키고 상기 수지 물질을 여과에 의해 제거함, 및/또는

b) 가용화제가 수지에 결합하고 재조합 단백질이 통과액(flow through) 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피 및/또는

c) 재조합 단백질이 수지에 결합하고 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피.

가용화제 및 다른 불순물은 하기 단계의 순차적 적용에 의해 제거될 수 있다: AEX, 산 침전, AEX, 및 CEX. 가용화제 및 다른 불순물은 하기 단계의 순차적 적용에 의해 제거될 수 있다:

a) 재조합 단백질 용액을 현탁 수지 물질과 혼합함으로써 가용화제를 음이온 교환 수지 물질에 결합시키고 상기 수지 물질을 여과에 의해 제거함;

b) pH를 pH 5 미만으로 저하시킴으로써 불순물을 침전시키고 여과에 의해 침전물을 제거함;

c) 잔여 가용화제가 수지에 결합하고 재조합 단백질이 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서 행해지는 음이온 교환 크로마토그래피;

d) 재조합 단백질이 수지에 결합하고 잔여 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서 행해지는 양이온 교환 크로마토그래피; 및

e) pH 또는 염 농도가 증가된 용출 완충제를 이용한 양이온 교환 수지로부터의 결합 재조합 단백질의 단계별 용출 또는 구배 용출.

제2 재폴딩 단계는 저 전도도 완충제 중에서 및/또는 냉각 조건 하에서 및/또는 12시간 초과의 시간 동안 수행될 수 있다. 제2 재폴딩 단계는 2.0 mS/cm 미만의 전도도에서 및/또는 약 2-8℃의 온도에서 및/또는 24시간 이상 동안 수행될 수 있다. 제2 재폴딩 단계는 pH 7 초과의 pH 값에서 수행될 수 있다.

상기에 기술된 봉입체로부터 재조합 단백질을 재폴딩하는 방법은 폴리싱 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 1가지 이상의 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 폴리싱 단계에서의 상기 1가지 이상의 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

이제 다양한 단계를 기술한다:

가용화: IB 분획물의 재조합체는 가용화제의 존재 하에 가용화된다. 임의의 적합한 가용화제가 사용될 수 있다. 예를 들어 이러한 가용화제는 예를 들어 GuHCl 또는 우레아와 같은 (그러나 이로 한정되는 것은 아닌) 변성제 또는 카오트로픽의 군, 또는 예를 들어 N-라우로일사르코신(사르코실), 라우르산, 소듐 도데실 술페이트(SDS) 또는 N-세틸트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 (그러나 이로 한정되는 것은 아닌) 세제, 텐시드(tenside) 또는 계면활성제의 군으로부터 선택될 수 있다 (그러나 이로 한정되는 것은 아니다). 바람직한 실시 양태에서, 가용화는 알칼리 pH, 우선적으로 pH 8에서, 바람직하게는 0.2-2.0%(w/v), 더 바람직한 실시 양태에서 약 0.5%-1%(w/v), 가장 바람직하게는 약 1%(w/v) 또는 1%(w/v)의 사르코실의 농도의 사르코실을 이용하여 수행된다. 가용화에 바람직한 완충제는 트리스(Tris)-HCl/pH 8, 우선적으로 40 mM의 트리스-HCl/pH 8이다. 가용화 후, 희석 단계는 물 또는 저 전도도(즉, 적어도 2 mS/cm 미만, 더 바람직하게는 1 mS/cm 미만의 전도도)의 완충제를 이용하여 수행될 수 있다.

제1 재폴딩(산화적 폴딩): 산화적 제1 재폴딩 단계는 유효량의 가용화제, 예컨대 사르코실, 및 산화제, 예컨대 CuSO₄(또는 다른 것, 예컨대 산소 또는 기류(버블링(bubbling)), GSSG(글루타티온-ox), 금속 이온(Cu^{2 +}, Fe^{2 +}, Zn^{2 +},..), 과산화물(H₂O₂))의 존재 하에 수행된다. 본 발명자는 가용화제, 예컨대 사르코실의 존재 하에서는 재조합 단백질의 폴딩이 완전히 달성가능한 것은 아님을 알아냈다. 본 발명자는 가용화제의 완전한 제거, 이어서 가용화제의 부재 하에서의 제2 폴딩 단계가 재조합 단백질의 수율을 향상시킴을 알아냈다.

가용화제 및 산화제의 제거와 다른 오염물질의 제거: 임의의 적합한 제거 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 충분한 제거는 이온 교환 수지 흡착 및/또는 산 침전 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 이들 기술 중 어느 하나 또는 이들 기술의 조합의 적용은 가용화제, 예컨대 사르코실을 농축시키며, 이는 바람직하게는 0.01 mg/ml 미만, 바람직하게는 검출 한계 미만에서는 제2 재폴딩 단계에서의 재폴딩을 간섭하지 않는다. (잔여 가용화제의 농도는 HPLC에 의해 측정되고 UV에 의해 검출될 수 있다. 상기 방법은 문헌[Burgess, R. R. 1996. Purification of over produced E. coli RNA polymerase σ factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sarkosyl. Methods Enzymol. 273:145-149.]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.) 이들 정제 단계는, 이것이 가용화제를 완전히 제거하기만 한다면, 임의의 순서로 및/또는 임의의 조합으로 적용될 수 있다. 다른 적합한 정제 방법이 또한 사용될 수 있다. 가용화제는 하기 단계의 순차적 적용에 의해 제거될 수 있다: AEX, 산 침전, AEX, 및 CEX. 이온 교환 수지 흡착, 산 침전 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 AEX 또는 CEX를 수행하는 데 적합한 재료 및 조건은 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수가능하다.

제2 재폴딩(폴딩의 완료): 제2 재폴딩 단계는 희석, 예컨대 물 또는 저 전도도 완충제를 이용한 2배 희석, 및 그 후 부분적으로 재폴딩된 G-CSF를 바람직하게는 약알칼리 pH, 예컨대 pH 8에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 제2 재폴딩 단계에 바람직한 완충제는 트리스-HCl/pH 8, 우선적으로 10 mM 트리스-HCl/pH 8이다.

최종 정제(폴리싱 단계(들)): 요망되는 정도의 순도의 재조합 단백질이 성취될 때까지, 임의로 AEX 및/또는 CEX를 포함하는 추가의 폴리싱 단계가 임의로 수행될 수 있다.

실시예

실시예 1:

G- CSF 의 제조

재료 및 방법

1. 숙주 세포주의 생성

T7 RNA 폴리머라아제 카세트(cassette)의 제조

기능성 T7 RNA 폴리머라아제(등록 번호: AY264774, 단백질 AAP33914 .1 ]를 함유하는 4.44 kb 유전자 카세트가 lac 오페론의 조절 도메인에 작동가능하게 연결된 것을 단리하기 위하여, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3) 균주 유래의 게놈 DNA(노바겐)를 사용하였다. 상기 DNA를 표준 프로토콜을 사용하여 퀴아젠(Quiagen) 게노믹 팁(Genomic tip)-20 키트(퀴아젠, 독일 힐덴)를 이용하여 준비하였다. 그 후, T7 카세트를 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 증폭은 KOD HiFi DNA 폴리머라아제(머크(Merck), 독일 다름스타트)를 이용하여 100 ㎕의 반응 부피로 실시하였다. 반응 혼합물은 DNA 폴리머라아제 완충제, 5 U의 KOD HiFi DNA 폴리머라아제, 2 mM MgCl₂, 250 μM의 dNTP, 100 ng의 DNA 주형, 10 μM의 정방향 프라이머(IntLambd 1), 10 μM의 역방향 프라이머(IntLambd 2)를 함유하였다. 반응에 있어서, PCR 사이클러(cycler)[엠제이 리서치(MJ Research) PTC-200]를 하기 설정치를 이용하여 사용하였다: 98℃에서 30초 동안 변성, 이어서 98℃, 30초(변성), 65℃, 30초(어닐링(annealing)), 72℃, 2분(합성)을 이용한 35 사이클. 최종 합성을 72℃에서 10분 동안 수행하였다.

람다 파지의 Int 유전자로부터의 하기 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:

DNA를 밀리포어 몽타주 PCR 클린업 키트(Millipore Montage PCR Cleanup Kit)를 이용하여 상기 PCR 용액으로부터 정제하였다. 퀴아퀵(Qiaquick) 겔 추출 키트로부터의 3배 부피의 겔 가용화 용액을 상기 반응 용액에 첨가하고, 그 후, 샘플을 원심분리하였다. 그 후, 물과 겔 가용화 용액의 혼합물(1:3의 비율로 혼합) 400 ㎕를 첨가하였다. 원심분리 후, 필터 상에 보유된 DNA를 400 ㎕ TE 완충제로 3회 세척하고, 그 후, DNA를 45 ㎕의 살균수 중에 취하였다. 5 ㎕의 BamHI 완충제를 단리한 PCR 생성물에 첨가하고, 상기 혼합물을 10 단위의 BamHI 제한 효소를 이용하여 37℃에서 4시간 동안 소화하고, 그 후, 상기에 기술한 절차에 따라 정제하였다. pBR322 플라스미드를 하이스피드 플라스미드 미디 키트(HiSpeed Plasmid Midi Kit)를 사용하여 XL1-블루(Blue) MRF 세포로부터 정제하였다. 1 ㎍의 정제된 플라스미드를, BamHI 완충제를 이용하여 제조한 20 ㎕ 반응 혼합물 중에서 5 단위의 BamHI 효소를 이용하여 37℃에서 4시간 동안 소화하였다. 벡터의 자가 닫힘을 피하기 위하여, 말단에 연결된 포스페이트기를 0.5 단위의 BAP(박테리아 알칼리 포스파타아제) 효소를 이용한 소화에 의해 절단하였다(60℃에서 30분 동안 인큐베이션). 벡터를 1% TAE 아가로스 겔에서 분리하고, 퀴아퀵 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 정제는 KIT 프로토콜에 따라 수행하였으며, 마지막에는 벡터를 50 ㎕ 부피로 용출하였다. 정제된 벡터 및 인서트(insert)를 혼합하고, 200 ㎕ 반응 혼합물 중에서 16℃에서 하룻밤 T4 DNA 리가아제로 처리하였다. 처리 후, DNA를 3배 부피의 에탄올로 침전시키고, 증발 후 이것을 50 ㎕의 살균수에 용해시켰다.

통합 구성물의 생성

상기 단리된 T7 RNA 폴리머라아제 카세트를 변형 BL21 이. 콜라이 균주 C2523H(뉴 잉글랜드 바이오랩스)의 염색체 DNA 내에 도입하기 위하여, 상기 단리된 T7 RNA 폴리머라아제 카세트를 705-pmj 플라스미드 내에 클로닝하였다. 이 플라스미드는 감온성 복제 기점을 포함한다.

통합 구성물을 제조하기 위하여, 하이스피드 플라스미드 미디 키트를 사용하여 XL1-블루 MRF 세포[스트라타진(Stratagene)]로부터 수득한, 4μg의 pBR322/T7 플라스미드로부터의 인서트를 50 ㎕ SalI 완충액 중 ClaI/SalI 효소로 절단하였다. 상기 소화는 37℃에서 4시간 계속되었다. 상기 소화는 2개의 단편, pBR322의 Cla/SalI 단편 및 T7 폴리머라아제 함유 단편을 생성하였다.

pLacZ 벡터를 하이스피드 플라스미드 미디 키트를 사용하여 XL1-블루 MRF 세포로부터 얻었다. LacZ 유전자의 말단은 37℃에서 4시간 동안 EcoRI/ClaI 효소를 적용함으로써 pLacZ 벡터로부터 제거하였다. 하이스피드 플라스미드 미디 키트를 이용하여 정제한, 2 ㎍의 DH5α[인비트로겐(Invitrogen)] 형질전환 705-pMJ 플라스미드[진 브리지즈 게엠베하(Gene Bridges GmbH)]를 0,01 단위의 EcoRI 효소를 포함하는 EcoRI 완충제 중에서 30분 동안 부분적으로 소화시켰다. 상기 부분적으로 소화시킨 플라스미드 DNA를 퀴아퀵 겔 추출 키트로 정제하고, 그 후 이것을 SalI 효소를 포함하는 SalI 완충제 중에서 37℃에서 4시간 동안 소화시키고, 그 후, 상기 플라스미드를 0,5 단위의 BAP 효소(박테리아 알칼리 포스파타아제)를 이용하여 60℃에서 30분 동안 탈포스포릴화하였다.

인서트 및 벡터를 1% TAE 아가로스 겔 상에서 러닝시키고(run), 각각 퀴아퀵 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, 그 후 혼합하고 200 ml 부피로 16시간 동안 라이게이션시켰다.

그 후, 상기 DNA를 에탄올로 침전시키고, 증발 후 이것을, RFP 단백질의 유전자가 pET3d. 벡터 내에 삽입된 것을 함유하는 DH5α 세포 내로 전기천공시켜 넣었다(705-pMJ 플라스미드 및 그 유도체의 배가에 있어서, DH5α 세포를 사용하여 이것을 적절한 양으로 수득하였다). 적색 세포 중 4개를 증대시키고, 플라스미드가 전체 인서트를 함유하는지에 대하여 플라스미드를 분석하였다. 수득된 구성물을 pMJ-LacI-LacUV-T7Pol-LacZ로 표기하였다. 후속적으로, pMJ-LacI-LacUV-T7Pol-LacZ 플라스미드를 하이스피드 플라스미드 미디 키트(퀴아젠)를 이용하여 정제하고, 그 후, 이것으로 C2523 변형 BL21 세포를 형질전환시켰다.

2. G-CSF 발현 벡터 및 형질전환된 숙주 세포의 생성

G-CSF 발현 벡터:

G-CSF의 특정 발현 벡터를 구성하였다. N-(L-메티오닐) 과립구 콜로니 자극 인자(metHuG-CSF)의 525 bp 길이의 전장 인간 cDNA 서열은 추가의 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 인간 G-CSF의 174개 아미노산의 이소형과 동일한 단백질을 코딩하며, 이는 예를 들어 유럽 특허 제0 401 384호에 공개된 바와 같다.

상기 발현 구성물은 r-metHuG-CSF DNA[등록 번호: AR049895]를 변형 pET39b 벡터(뉴 잉글랜드 바이오랩스)의 NdeI-XhoI 위치 내에 삽입하여 pRG/GCSFa 플라스미드를 생성함으로써 생성하였으며, 이는 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)] 및 문헌[Glover, D.M., IRL Press, Oxford, 1985]에 기술된 바와 같다.

5234 bp 길이의 pRG/GCSFa 벡터는 하기를 함유한다: 항생제(카나마이신) 내성 유전자(Kan), 위치: 822-7, T7 프로모터, 합성 r-metHuG-CSF 유전자(G-CSF), T7 종결자, lacI 리프레서(repressor)(LacI), 및 복제 기점(Ori). 상기 벡터의 도식적 개관이 도 1에 도시되어 있다.

전기천공을 이용하여 포인트(point) 1 하에서 수득한 숙주 세포를 상기 벡터로 형질전환시켰다.

3. 세포 배양

무균 조건 하에서 WCB(제조용 세포 은행) 박테리아 세포 현탁액을 100 ml의 살균 시드 배양 배지(RBY)에 접종하였다. 접종된 시드 배양물을 24시간 동안 185 rpm에서 일정하게 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 시드 배양물의 광학 밀도가 600 nm에서 1.0의 광학 밀도에 도달했을 때, 시드 배양물을 20 L의 생물반응기(이때 작업량(working volume)은 15 L임)로 옮긴다. 접종된 시드 배양물을 400 rpm에서 일정하게 교반하면서 그리고 15 L/분의 속도로 통기시키면서 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 600 nm에서 시드 배양물의 광학 밀도가 약 0.9에 도달했을 때, 수집된 시드 배양물을 탄소원으로서 글리세롤 및 합성 성분을 함유하는 GBA 배지를 포함하는 1000 L 생물반응기(이때 작업량은 500 L임)로 옮긴다. 배양은 37℃에서 액중 배양(submerged culture)으로 엄격한 호기성 조건(DO≥30%) 하에서 수행하였다. 전체 배양 기간 동안 pH 값을 6.8 내지 7.2의 범위로 유지하였다.

용존 산소(DO) 수준이 설정점(DO=40%)으로부터 급격하게 증가하기 시작할 때, 선형 공급물 첨가를 시작하였다. 배양물의 광학 밀도가 600 nm에서 30의 광학 밀도에 도달했을 때, 발효 온도를 32℃의 온도로 감소시켰다. 온도를 저하시킨 후 IPTG를 상기 배양물에 첨가하여 고수준의 표적 단백질 발현을 유도하였다. 유도 기간 후 5시간 후에, 탄소원 공급을 정지시키고 교반 및 통기를 감소시킴으로써 발효를 중지시키고, 세포 배양물을 15℃ 미만으로 냉각시키고, 세포를 수확하였다. 주 발효는 총 21시간 걸렸다.

탄소원으로서 글리세롤을 배지 중에 사용하였다. 탄소원으로서의 글리세롤은 높은 성장 속도 및 높은 바이오매스를 생성하였다. 공급 배지의 조성은 아미노산(L-메티오닌, L-글루타민 및 L-류신) 및 미네랄(예를 들어, 염, 포스페이트, 술페이트)을 포함하였다. 사용한 모든 재료는 동물 성분 미사용 공급원으로부터의 것이었다. 소포제로서 SB2020을 사용하였다. 발효 브로스는 선발제로서 카나마이신 모노술페이트(아미노글리코시드계 항생제)를 추가로 포함하였다.

4. 중류 프로세싱

1. 봉입체(IB)의 제조

발효 후, 봉입체의 제조를 수행하였다. 교반, 통기 및 탄소원의 공급을 중지하고, 배양물을 15℃ 미만으로 냉각시키고, 박테리아를 11　000 g에서의 분리에 의해 수확하였다. 세포는 회전자에서 침강되었으며, 이를 물에 의해 세출하였다(배출하였다). 박테리아 세포 농축물을 수집하고, 물로 다시 절반 부피로 희석시키고, 0.5 M NaH₂PO₄를 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 균질화기에 3회 통과시킴으로써 가압(100 MPa) 하에 파괴하였다. 11　000 g에서 분리기에서 침강시킴으로써 봉입체를 세포 잔사로부터 분리하였다. 침강된 봉입체를 5 mM DTT, 10 mM NaH₂PO₄, 5 mM EDTA, 및 2% 트윈 20(pH 7.2)을 함유하는 세척 완충제 중에 배출하였다. 진한 IB 현탁액을 동일 완충제로 2배 희석시키고, 다시 침강시켰다. 이러한 세척 절차를 희석 없이 제2 절차의 마지막에 10 mM NaH₂PO₄ 완충제를 사용하여 2회 반복하였다. IB의 최종 침강물을 -80℃에서 냉동 보관하였으며, 이는 8개월 동안 안정하였다.

봉입체를 해동시킨 후, G-CSF를 가용화하고, 재폴딩시키고, 추가로 정제할 수 있는데, 이는 당업계에 잘 확립된 기술에 의한 것이다. 적합한 방법이 예를 들어 미국 특허 제5849883호에 기술되어 있다.

결과

표 1은 상기에 기술된 형질전환된 숙주 세포의 발효 결과를 제시하며, 여기서, 제1 배양 온도는 37℃이고, 제2 배양 온도는 각각 25℃, 30℃, 32℃, 35℃ 또는 37℃였다.

결과는, 배양 동안 온도를 저하시키면 가용화 G-CSF의 수율이 증가함을 명백하게 나타낸다. 특히, 32℃ 내지 35℃의 제2 배양 온도에서의 인큐베이션은 수율을 증가시킴이 자명하다. 32℃의 제2 인큐베이션 온도가 특히 효과적이다.

실시예 2: 발효 및 발현

G-CSF(필그라스팀)를 재조합 이. 콜라이 C2523 T7 pol pRG/GCSFa 클론(G-CSF를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이)을 이용하여 생성하였다. 무균 조건 하에서, 액체 질소 중에서 보관한 해동시킨 제조용 세포 은행 바이알로부터 수득한 0.10-0.15cm³의 세포 현탁액을 제조된 시드 배양 배지에 접종하였다. 접종된 시드 배양 플라스크를 37℃에서 185 rpm에서 24-28시간 동안 선회 진탕기 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 600 nm에서 6개의 진탕 플라스크 배양물의 광학 밀도(OD)의 평균 값이 0.9-1.1에 도달했을 때, 플라스크의 내용물을 실리콘 튜브를 갖춘 살균 5 dm³ 유리 플라스크 내에 수집하였다. 수집된 3 dm³ 부피의 시드 배양물을 WM323U/R 펌프를 이용하여, 살균 보충 생산 배지(GBA, 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 합성 배지)로 75 dm³까지 충전된 100 dm³ 발효기로 옮겼다. 37℃에서 액중 배양으로 엄격한 호기성 조건 하에서 배양을 수행하였다. 탄소원이 배지로부터 고갈되게 되었을 때, 글리세롤 공급 용액을 적절한 속도로 상기 배양물에 첨가하였다. 전체 배양 기간 동안 용존 산소 장력을 30% 이상의 수준으로 유지하였다. 배양물의 OD 값이 30에 도달하였을 때, 온도를 32℃로 감소시키고, 0.33 mM IPTG를 첨가하여 G-CSF의 발현을 유도하였다. 80-95의 OD까지 5시간 동안 박테리아를 추가로 배양하여 G-CSF를 생성하였다.

실시예 3: 박테리아의 수확

교반, 통기 및 탄소원의 공급을 중지하고, 배양물을 15℃ 미만으로 냉각시키고, 박테리아를 11000 g에서의 분리에 의해 수확하였다. 세포는 회전자에서 침강되었으며, 이를 물에 의해 세출하였다(배출하였다). 박테리아 세포 농축물을 수집하고, 물로 다시 그의 절반 부피로 희석시키고, 0.5 M NaH₂PO₄를 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 습윤 박테리아 세포의 총 질량(바이오매스)은 약 10-11.5 kg이었다.

실시예 4: 박테리아의 용해 및 봉입체의 제조

분리하고 세척한 박테리아를 균질화기에 3회 통과시킴으로써 가압(100 MPa) 하에 파괴하였다. 11000 g에서 분리기에서 침강시킴으로써 봉입체를 세포 잔사로부터 분리하였다. 침강된 봉입체를 5 mM DTT, 10 mM NaH₂PO₄, 5 mM EDTA, 및 2% 트윈 20(pH 7.2)을 함유하는 세척 완충제 중에 배출하였다. 진한 IB 현탁액을 동일 완충제로 2배 희석시키고, 다시 침강시켰다. 이러한 세척 절차를 희석 없이 제2 절차의 마지막에 10 mM NaH₂PO₄ 완충제를 사용하여 2회 반복하였다. IB의 최종 침강물을 -80℃에서 냉동 보관하였다.

실시예 5: 봉입체의 가용화

냉동된 봉입체(650 g의 습윤 질량)를 해동시키고, pH 8의 40 mM 트리스-HCl, 및 1%(w/v) N-라우로일사르코신(사르코실)을 함유하는 가용화 완충제 중에 32.5 dm³의 총 부피로 용해시켰다. 상기 현탁액을 연속 교반 하에 실온에서 인큐베이션하였다.

실시예 6: 산화적 재폴딩(제1 재폴딩)

가용화된 IB 현탁액을, 최종 농도로서 0.5% 사르코실 및 20 mM 트리스-HCl이 되도록 65 dm³의 총 부피로 물로 2배 희석시켰다. CuSO₄를 40 μM의 최종 농도로 첨가하였다. G-CSF를 연속 교반 및 상부 공간에서의 공기 유동 동안 실온에서 20시간 이상 동안 산화시키고 부분적으로 재폴딩시켰다. EDTA를 1 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 산화를 종결시켰다.

실시예 7: AEX 뱃치식 흡착에 의한 사르코실의 제거

사르코실을 뱃치식으로 음이온 교환(AEX) 수지에 흡착시켰다. 사르코실 1 g당 20 g의 양의 AG 1-X8 수지(바이오라드(BioRad), 미국)를 상기 용액에 적용 및 첨가하였다. 상기 현탁액을 2시간 동안 교반시켜 대부분의 사르코실에 결합시켰다. 100 μm의 기공 크기의 나일론 백 필터 메시를 통한 여과에 의해 상기 수지를 제거하였다. 여과액 중 잔존 사르코실을 후속적인 정제 단계(실시예 8 및 실시예 9)에 의해 생성물로부터 완전히 제거하였다.

실시예 8: 산성 pH에서의 오염물질의 침전

pH 4.3-4.5에서의 산성 침전에 의해, 일부 불순물을 용이하게 제거한 반면, G-CSF는 용해성으로 잔존한다. G-CSF의 임의의 잠재적인 비특이적인 그리고 요망되지 않는 동시침전을 1 M의 최종 농도의 우레아의 첨가에 의해 방지하였다. 우레아를 6 M 원액에 의해 제공하였으며, 1 dm³/min의 속도로 실시예 6의 여과액에 서서히 첨가하였다. 후속적으로, 1/20의 부피의 pH 4.8의 1 M 아세트산나트륨의 첨가에 의해 상기 pH를 감소시켰다. 50% 아세트산으로 적정함으로써 상기 pH를 4.3-4.5로 추가로 저하시켰다. 1시간 이상 동안 침전시켰다. 그 후, 침전된 물질을 뎁스 필터(depth filter)(폴(Pall) K700/KS50 이중층)를 통한 여과에 의해 제거하였다.

실시예 9: 시리즈로 연결된 AEX + CEX 크로마토그래피에 의한 잔여 사르코실의 제거 및 완충제의 교환

50 mM/pH 4.5의 아세트산나트륨 완충제를 1) DEAE 마크로-프렙(Macro-Prep)(바이오라드, 미국) AEX 수지가 패킹된(packed) 4 dm³ 컬럼, 및 2) 토요펄(Toyopearl) SP-650C(토소(Tosoh), 일본) CEX 수지가 패킹된 8 dm³ 컬럼의 평형화에 사용하였다. 상기 둘 모두의 컬럼을 AEKTA 공정 크로마토그래피 시스템(지이 헬스케어(GE Healthcare), 스웨덴)에 평행 배열로 직접적으로 연결하였다. 0.2 ㎛ 살균 필터를 통한 클리어런스(clearance) 후, 실시예 7의 여과액을 제1 컬럼 상에 로딩하였다. 잔여 사르코실이 DEAE 수지에 결합된 반면, G-CSF는 여전히 결합되지 않은 채 있었고(비결합 모드) 제1 컬럼의 통과액 중에 나타났다. 이러한 통과액을 제2 컬럼(SP 수지) 상에 직접적으로 로딩하였는데, 이는 G-CSF에 결합하였다(결합 모드). 20 mM 트리스-HCl/pH 8을 이용한 간단한 단계의 용출은 G-CSF를 상기 수지로부터 탈리시켰다. 잔여 사르코실의 제거 외에, 아세트산나트륨/pH 4.5로부터 트리스-HCl/pH 8로의 완충제 교환을 이 방법에 의해 또한 달성하였다.

실시예 10: 제2 재폴딩(폴딩의 완료)

이 단계에서, 약 절반의 단백질 분획물의 폴딩이 완료된 반면, 잔존 단백질은 불완전하게 폴딩되거나 잘못 폴딩되었다(misfolded). G-CSF 용액을 pH 8의 20 mM 트리스-HCl 중 토요펄 SP-650C로부터 용출시키고, 0.2 μm 살균 필터에 통과시켜 스테인리스 강 용기 내에 넣었다. 여과시킨 용액을 물로 2배 희석시켰다. 단백질 폴딩을 위한 제2 인큐베이션(제2 재폴딩)을 2-8℃에서의 냉각 하에 32-42시간 동안 pH 8에서 저 전도도 환경(< 1 mS/cm)에서 실시하였다.

실시예 11: AEX 크로마토그래피에 의한 정제(폴리싱 단계 1)

컬럼에 DEAE 마크로-프렙(바이오라드, 미국)을 패킹시키고, 이를 10 mM 트리스-HCl/pH 8로 평형화하였다. 제2 재폴딩(실시예 9)에서 생긴 용액을 상기 DEAE 컬럼에 로딩하였다. 올바르게 폴딩된 G-CSF를 10 mM 트리스-HCl/pH 8 중의 0 mM로부터 200 mM까지의 증가하는 선형 NaCl 구배에 의해 용출시켰다. 용출된 G-CSF를 풀링하고(pooled), 물로 2배 희석시켰다. 50% 아세트산을 이용한 적정에 의해 pH를 4.5로 조정하였다.

실시예 12: CEX 크로마토그래피에 의한 정제(폴리싱 단계 2)

최종 폴리싱 단계를 위하여, 올바르게 폴딩된 단백질로 이루어진, AEX 크로마토그래피(실시예 10)로부터 수집한 G-CSF 풀을 토요펄 CM-650S 수지가 패킹된 CEX 컬럼 상에 직접적으로 적용하였다. 상기 컬럼을 pH 5.3의 20 mM 아세트산나트륨으로 평형화하였다. 결합된 G-CSF를, pH 5.3에서 24배의 컬럼 부피 내에서 20 mM로부터 400 mM까지의 아세트산나트륨의 증가하는 선형 염 구배에 의해 용출시켰다. 순수 G-CSF를 포함하는 분획물을 제형화용으로 수집 및 풀링하였다.

실시예 12b: 겔 크로마토그래피에 의해 정제된 G-CSF의 제형화

CEX 컬럼으로부터 용출된 정제된 G-CSF(실시예 11)를 0.2 μm 살균 필터를 통하여 여과시키고, 제형화 완충제(10 mM 아세트산나트륨, pH 4, 5% 소르비톨, 및 0.006% 폴리소르베이트 80)로 평형화한, 세파덱스(Sephadex) G-25 미세 수지가 패킹된 14 dm³ 컬럼에 통과시켰다. 동일 완충제를 러닝 완충제로서 사용하였다. G-CSF는 제형화 완충제 중 공극 부피 내에 용출되었다. 전체 뱃치(35-48 g의 G-CSF)에 있어서, 러닝 각각이 여과 CEX 용출액의 1/3을 포함하는 세파덱스 G-25에서의 3회의 후속 제형 러닝을 수행하였다. 제형화된 G-CSF를 제형화 완충제를 이용한 희석에 의해 0.9-1.0 mg/ml의 농도로 조정하고, 마지막으로, 0.2 μm 살균 필터 캡슐을 통하여 여과하였다. 살균 용액으로 제형화된 G-CSF는 매우 안정하며, 수년간은 아니라 해도, 몇 달 동안은 2-8℃에서 보관될 수 있다.

실시예 13: 분석 방법

공지된 표준 분석 방법을 유럽 약전(European Pharmacopoeia; Ph. Eur.)에 따라 수행하였는데, 상기 유럽 약전은 특정 분석 방법을 기술한 필그라스팀에 대한 모노그래프를 포함한다(문헌[European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (EDQM) (2010): Filgrastim concentrated solution. European Pharmacopoeia 7.0, 2015-2018]). 기본적인 기술에 있어서, 상기 모노그래프는 유럽 약전 내의 다른 장(chapter)과 교차 참고된다. 상기 기술의 더욱 상세한 설명을 제공하는 이러한 구체적으로 언급된 장은 하기 실시예에서 꺾쇠 괄호 내에 인용되어 있다. 이용한 기준 표준물은 유럽 연합에 의해 의약용으로 승인된, 상업적으로 구매된 인가된 약물 제품(필그라스팀), 또는 이러한 상업적 기준물을 사용하여 보정된 사내(in-house) 표준물 중 어느 하나였다. 국제 단위(IU) 면에서의 상대적인 효력의 분석을 위하여, 세계 보건 기구(WHO)의 국제 G-CSF 표준물을 추가로 사용하였다. 순도, 특정 불순물, G-CSF 관련 단백질 및 생물학적 활성(효력)의 분석에 사용한 테스트 방법은 유럽 약전의 모노그래프를 단지 약간 변형한 것에 따라 적용하였다. 따라서, 하기에서, 당업계에 공지된 이러한 표준 분석 방법을 단지 간략하게 설명한다.

실시예 13.1: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDDS-PAGE): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.31]. SDS-PAGE를 사용하여 G-CSF의 분자 크기, 아이덴티티 및 순도를 결정하였다. 겔은 12%의 PA를 가졌으며, 소듐 도데실술페이트(SDS)를 포함한다. 상기 방법을 환원 및 비환원 조건 하에서 사용하였다. 겔을 사이프로 루비(Sypro ruby)로 염색하였다. 상대적인 분자 질량(Mr)을 계산하기 위하여, 규정된 질량을 갖는 마커 단백질의 패널을 사용하였다.

실시예 13.2 - 고성능 크기 제외 크로마토그래피(SEC-HPLC): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.30]. SEC를 이용하여 필그라스팀(이량체, 응집체)의 분자 질량보다 더 큰 분자 질량을 갖는 불순물 또는 G-CSF 관련 물질을 검출하였다. 단백질의 검출은 UV 흡광도를 기반으로 하였다. 순도(주 피크) 및 불순물(이량체, 응집체)을 각각의 성분에 있어서의 활성 물질의 면적(%)으로 표현하였다. 테스트 결과를 반복 측정치의 평균으로부터 계산하였다. 도 2는 정제된 G-CSF의 뱃치(3b)를 기준 표준물(3a)과 비교한 SEC 크로마토그램의 예를 나타낸다. 응집체의 자취가 주 피크로부터 좌측에 보인다. 주 피크로부터의 우측의 피크는 용매에 의해 야기된 것으로서, 불순물에 의해 야기된 것이 아니다.

실시예 13.3 - 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.29]. RP-HPLC를 이용하여 G-CSF의 아이덴티티를 결정하고, G-CSF의 함량 및 순도를 계산하였다. 또한 상기 방법을 이용하여 생성물 관련 물질을 확인 및 정량화하였다. 단백질의 검출은 UV 흡광도를 기반으로 하였다. 관련 단백질 불순물을 활성 물질의 백분율(면적(%))로 표현하였다. 테스트 결과를 반복 측정치의 평균으로부터 계산하였다.

실시예 13.4 - 등전 집속 겔 전기영동(IEF): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.54]. 이 방법을 이용하여, G-CSF와 상이한 전하를 갖는 불순물 또는 생성물 관련 물질(예를 들어, 탈아미드화 G-CSF)을 검출하였다. 양성전해질(ampholyte)을 기반으로 한 고정화된 pH 구배를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔에서 분리를 실시하였다. 추가로, 각각의 단백질 밴드의 등전점(pI)을 규정된 pI를 갖는 마커 단백질 세트를 사용하여 계산하였다.

실시예 13.5 - 효소 결합된 면역흡착 검정법(ELISA): 이 방법을 이. 콜라이 숙주 세포 단백질(HCP) 수준의 정량적 측정에 사용하였다. 상업적으로 구매한 (일반) 면역효소적 검정 키트(사이그누스 테크놀로지즈(Cygnus Technologies), 번호: F410)를 사용하여 상기 테스트를 수행하였다. 마이크로타이터(microtiter) 스트립의 고체상을 친화성 정제된 폴리클로날 항-이. 콜라이 항체로 코팅하였는데, 상기 항체는 테스트 샘플로부터의 HCP를 포착하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)로 표지한 트레이서(tracer) 항-이. 콜라이 항체는 HCP에 동시에 결합하였으며, 생성된 샌드위치(sandwich)는 세척 절차를 견뎌냈다. 결합된 HCP, 각각의 HRP는 과산화수소의 존재 하에 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)의 산화에 의해 검출하였다. 광학 밀도를 ELISA 판독기로 측정하였다. 상이한 농도의 HPC 보정자(키트에 의해 제공됨)의 측정에 의해 수득된 보정 그래프를 이용하여 정량화를 수행하였다. 공급자의 지시에 따라 상기 방법을 정확하게 수행하였다. HCP 농도를 ng/ml 또는 ng/mg(ppm)의 단위로 표현하였다.

실시예 13.6 - 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응(qPCR): 이 검정법을 이. 콜라이 숙주 세포 DNA의 결정에 사용한다. 상업적으로 입수가능한 키트를 적용하였는데, 이는 "resDNASEQ^TM 이. 콜라이 잔여 DNA 정량화 시스템"으로 표기되고, 이는 실시간 탁맨(TaqMan)^® qPCR 기술(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 기반으로 한다. 상기 방법은 DNA 오염의 검출에 있어서 매우 민감하고 특이적이다. 상기 검정법은 서열 특이적 프라이머(SSP) 및 형광 표지된 혼성화 프로브(탁맨^®)를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의한 명확한 DNA 단편의 서열 특이적 증폭 및 실시간 형광 검출을 기반으로 한다. 기구류, 시약, 샘플링 및 소프트웨어 기반의 계산을 포함하는 전 방법을 공급자의 지시에 따라 수행하였다.

실시예 13.7 - 박테리아 내독소: 문헌[Ph. Eur. 7, 2.6.14, method C]. 그람 음성 박테리아의 내독소의 검출은 투구게(리물루스 폴리페무스(Limulus polyphemus))로부터의 변형세포(amoebocyte) 용해물을 기반으로 한 전세계적으로 맞추어진 표준 방법이다. 이러한 리물루스 테스트("LAL 테스트")를 유럽 약전에 따라 동역학적 비탁 기술(turbidimetric kinetic technique)(방법 C)을 이용하여 실시하였다. 그 결과를 국제 내독소 표준 BRP에 관련된 국제 단위(IU)로 표현하였다.

실시예 13.8 - 생물학적 활성(상대적인 효력)의 검정: 하기와 같이 변형시킨, 필그라스팀 모노그래프에 기술된 세포 기반 시험관내 증식 검정법으로 G-CSF 샘플의 생물학적 활성을 테스트하였다. 상기 생물검정법은 쥐과 골수아구 세포주에서 기원한 NFS-60 세포의 세포 증식의 변화의 비교를 기반으로 하였다. NFS-60 세포를 연속 희석시킨 테스트 샘플 및 기준 용액으로 동시에 처리하였다. NFS-60 세포의 증식은 G-CSF에 의해 유의하게 그리고 특이적으로 자극될 수 있다. 상기 세포의 번식을 마이크로테스트(microtest) 플레이트에서 72시간 동안 수행하였다. 생존성 세포에 의해 형광 염료 레소루핀으로 전환되는 기질인 레사주린(알라마르(alamar)^® 블루)을 사용하여 증식 효과를 검출하였다. 형광 신호는 고감도로 검출되었다. 용량 응답 곡선의 평행선 검정 계산을 통계학적 평가로서 사용하였으며, 이때 상기 곡선의 선형 부분에서의 3개의 점을 이용하였다. 허용 범위는 기준 용액과 비교하여 80% 내지 125%였다. 상대적인 효력을 국제 단위(IU)로 표현하였는데, 상기 국제 단위는 필그라스팀의 국제 WHO 표준물에 대하여 보정한 내부 표준물에 의해 정의되었다. 완전 활성형 순수 인간 G-CSF는 1.0 x 10⁸ IU/mg의 생물학적 비활성을 보유한다.

실시예 13.9 - 펩티드 지도화(mapping): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.55]. 펩티드 지도화, 이어서 질량 분광(MS) 분석을 디술피드 가교체의 분석에 사용하였다. 펩티드 결합의 효소적 절단의 절차는 필그라스팀에 대한 유럽 약전의 모노그래프를 기반으로 하여 개발되었다. 절단에 사용한 프로테아제는 글루타밀 엔도펩티다아제(엔도Glu-C)였다. 인큐베이션을 37℃에서 24시간 동안 실시하고, 8 M GuHCl의 첨가 및 비등에 의해 중지하였다. 펩티드 지도화 절차를 환원 및 비환원 조건 하에서 수행하였다. 환원 및 비환원 조건에 있어서 펩티드의 MS 스펙트럼의 프로파일의 생성된 차이는 디술피드 결합의 위치를 입증한다. 완전히 폴딩된 온전한 G-CSF(필그라스팀)는 Cys37- Cys43 및 Cys65- Cys75 위치에 2개의 디술피드 가교체를 갖는 반면, 1개의 시스테인 잔기는 18 위치에서 자유롭다.

대안적으로, 단백질 분해적 소화 후 G-CSF 샘플로부터 수득된 펩티드를 RP-HPLC 시스템에서 분리하고 UV로 검출할 수 있다. 이 방법은, 테스트 용액에서 수득되는 핑거프린트 유사 크로마토그램을 기준 물질에서 수득되는 크로마토그램과 비교할 때 비교 데이터를 제공한다.

참고 문헌의 목록

표:

SEQUENCE LISTING <110> Richter Gedeon Nyrt. <120> Method for the production of polypeptides <130> HE 162 843 <150> HU P1200171 <151> 2012-03-19 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 2 <211> 174 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 2 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met 35 40 45 Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Arg Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala Pro 115 120 125 Ala Val Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Gln Leu His Arg Phe 145 150 155 160 Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Gly Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro 165 170 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 65 70 75 80 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 175 <210> 4 <211> 5234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the G-CSF vector <400> 4 caattcttag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt 60 atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca 120 gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat 180 acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt 240 gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac 300 aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg 360 tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg 420 aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc 480 aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca 540 tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag 600 ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt 660 cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg cacctgattg 720 cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa 780 tcgcggccta gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc ttgtattact 840 gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 900 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 960 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 1020 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 1080 caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 1140 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 1200 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 1260 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 1320 acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 1380 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 1440 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 1500 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 1560 tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 1620 tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 1680 agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta 1740 cgcatctgtg cggtatttca caccgcaatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 1800 cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc 1860 cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 1920 tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 1980 ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag 2040 atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt taatgtctgg 2100 cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac tgatgcctcc 2160 gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc 2220 acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa 2280 ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc 2340 gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg 2400 aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg 2460 aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt 2520 cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg 2580 gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc acccgtgggg ccgccatgcc ggcgataatg 2640 gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga cgaaggcttg agcgagggcg 2700 tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg tcgcgctcca gcgaaagcgg 2760 tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc ctacgagttg catgataaag 2820 aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact 2880 gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt 2940 acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 3000 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 3060 ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 3120 gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 3180 ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 3240 gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 3300 atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 3360 ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 3420 gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 3480 gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 3540 cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 3600 aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 3660 cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt 3720 acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 3780 ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 3840 ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 3900 gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 3960 ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 4020 gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca 4080 tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct 4140 tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg 4200 ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg 4260 ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc 4320 catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg 4380 ccacgatgcg tccggcgtag aggatcgaga tcgatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac 4440 tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt ttgtttaact 4500 ttaagaagga gatatacata tgactccatt aggtcctgct tcttctctgc cgcaaagctt 4560 tctgctgaaa tgtctggaac aggttcgtaa aatccagggt gacggtgctg cactgcaaga 4620 aaaactgtgc gctacttaca aactgtgcca tccggaagag ctggtactgc tgggtcattc 4680 tcttgggatc ccgtgggctc cgctgtcttc ttgtccatct caagctcttc agctggctgg 4740 ttgtctgtct caactgcatt ctggtctgtt cctgtatcag ggtcttctgc aagctctgga 4800 aggtatctct ccggaactgg gtccgactct ggacactctg cagctagatg tagctgactt 4860 tgctactact atttggcaac agatggaaga gctcggtatg gcaccagctc tgcaaccgac 4920 tcaaggtgct atgccggcat tcgcttctgc attccagcgt cgtgcaggag gtgtactggt 4980 tgcttctcat ctgcaatctt tcctggaagt atcttaccgt gttctgcgtc atctggctca 5040 gccgtaataa gctcgagcac caccaccacc accaccacca ctaattgatt aatacctagg 5100 ctgctaaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta 5160 gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact 5220 atatccggat ctag 5234 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence IntLambd 1 <400> 5 gtccgactta tgcccgagaa gatgttgagc aaacttatcg cttatc 46 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence IntLambd 2 <400> 6 tgcaaagaga ttcttggcgg agaaaccata attgcatcta ctcg 44

Claims (26)

1. 봉입체 중의 재조합 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
   (a) 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 미생물 숙주 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계,
   (b) 배양 온도를 제1 온도로부터 제2 온도로 저하시키는 단계, 및
   (c) 미생물 숙주 세포를 제2 온도에서 배양하는 단계
   를 포함하고, 상기 핵산이 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 (b) 단계는 세포 배양물이 600 nm에서 10 내지 50의 광학 밀도에 도달했을 때 수행하는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 미생물 숙주가 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 온도가 36℃ 내지 38℃인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 온도가 37℃인 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 온도가 25℃ 내지 36℃인 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 온도가 30℃ 내지 36℃인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 온도 및/또는 제2 온도에서의 배양 동안의 pH가 6 내지 8인 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 온도 및/또는 제2 온도에서의 배양 동안의 pH가 6.8 내지 7.2인 방법.
9. 삭제
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양물이 600 nm에서 27 내지 33의 광학 밀도에 도달했을 때 온도의 저하를 수행하는 것인 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 폴리펩티드가 4개 나선 번들형(four-helix-bundle) 폴리펩티드인 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 폴리펩티드가 G-CSF인 방법.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 인간 또는 소 G-CSF인 방법.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a) 내지 단계 (c)에 앞서, 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내에 도입하는 단계를 실시하며, 상기 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 유도성 프로모터는 T7 프로모터인 방법.
16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물 숙주 세포의 염색체는 박테리오파지(bacteriophage) RNA 폴리머라아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 용원성 박테리오파지 핵산 서열을 포함하지 않는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 박테리오파지 RNA 폴리머라아제는 T7 폴리머라아제인 방법.
18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드의 발현을 유도제의 첨가에 의해 수행하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 유도제를 온도의 저하와 동시에 또는 온도의 저하 후에 첨가하는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, 유도제가 IPTG인 방법.
21. 제14항에 있어서, 벡터가 서열 번호 4의 서열을 포함하는 것인 방법.
22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이
    (i) 서열 번호 3 또는 서열 번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 및
    (ii) 서열 번호 3에 나타낸 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
23. 제6항에 있어서, 제2 온도가 30℃ 내지 35℃인 방법.
24. 제6항에 있어서, 제2 온도가 31℃ 내지 33℃인 방법.
25. 제13항에 있어서, 인간 또는 소 G-CSF는 각각, -1 위치에 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 갖는 것인 방법.
26. 제16항에 있어서, 박테리오파지(bacteriophage) RNA 폴리머라아제를 코딩하는 핵산 서열은 lac 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.

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