JPS63287A - 酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素ムタロターゼ（ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ　
；変節光酵素）の生物学的活性を有する。ｔ？　ＩＪ−
？ブチＰをコードするＤＮＡ配列の製造に関する。

更に、本発明は、酵素ムタロターゼの生物学的活性を有
するポＩＪ　ＯブチＰの製造に用いられる組換えＤＮＡ
分子、すなわちクローニングおよび発現ベクター、およ
びかかるベクターで形質転換されたホスト生物、例えば
細菌、酵母、その他の菌類、および動物またはヒト細胞
に関する。

最後に、本発明は、アルドースの酵素検出反応または転
化速度を高めるために、酵素ムタロターゼの生物学的活
性を有する前記ポリペプチドを用いることに関する。

ムタロターゼ（アルドース１−エピメラーゼ、ＥＣ５，
１，３，３）はアルドヘキソースのα−およびβ−アノ
マーの間、例えばα−およびβ−グルコースまたはα−
およびβ−がラクトース間の平衡達成速度を高めること
が知られている。この酵素は主に、分析生化学において
、α−またはβ−型に特異な酵素によるアルドースの酵
素検出反応（これらにおいてそれら２種類のアンマー間
の平衡達成が律速段階である）の速度を高めるために用
いられており、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ、グ
ルコースオキシダーゼまたはガラクトースデヒドロゲナ
ーゼを用いた測定方法などに用いられている。

工業的用途も、例えばグルコアミラーゼ／グルコースイ
ソメラーゼ法にとって重要であろう。

ソノ理由は、酵素グルコアミラーゼは、変節光が生起す
るまではグルコースイソメラーゼによリα−型に転化さ
れ得ないβ−グルコースを遊離するからである。

ムタロターゼは天然に広く分布していて、様様な微生物
（細菌、酵母および線状菌類）、植物および動物組織に
存在している。

工業的規模でのムタロターゼ単離を可能とする唯一の相
当な酵素含量は今までに哩乳動物（畜牛、豚）の腎臓に
見出されていて；すべての既知の市販品は腎臓から調製
されている。牛腎臓の新鮮重量１ｆあたりのムタロター
ゼ活性含量は例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　）におけるよりも（イ）倍以上であることが
知られている（　Ｂａ１ｌｅｙ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、　１９７５．４７８　）。アスペルギルス・
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）の菌
株からのムタロターゼの微生物学的製造方法はＢｉｏｃ
ｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＡＣｔａ　６６２．２８５　
（１９ｆ３１　）に初めて記載された。これによれば、
最良の菌株から得られたムタロターゼ活性は、４．４ｍ
Ｕ／ｍｌ培養ブロスであり、ミバエリス（Ｍｉｃｈａｅ
ｌｉｓ　）　定数は５０ｍＭであり、そして至適−は５
〜７の範囲であった。

しかしながら、前述の微生物学的方法を用いた場合、酵
素ムタロターゼは、牛腎臓からの製造方法によるよりも
低収率で得られるにすぎない。その上、アスペルギルス
・ニガー由来の酵素の性質は、アルドースの酵素的測定
の範囲内で平衡を達成する目的には好ましくない。

従って、本発明の目的は、酵素ムタロターゼの生物学的
活性を有するポリ滅ブチドを利用可能とすること、およ
び、このタンパク質の工業的大量生産を可能とする遺伝
子工学的方法を提供することにある。

「酵素ムタロターゼの生物学的活性を有する、ｔ？　Ｉ
Ｊ　ヘブチド」という用語はそのアミノ酸配列がアシネ
トツクター・カルコアセチカス（Ａｃｉ−ｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　）よりの天然
ムタロターゼに相当し、このアミノ酸配列に類似し、ま
たはその一部を含むポリペプチドまたはタンパク質を意
味する。本発明によれば相当する融合タン・ぐり質も［
酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプチド
」と称される。

ムタロターゼを形成し、そして好適なものとして用いら
れる種はアシネトバクタ−属の微生物である。これらの
うちでも、アシネトツクター・カルコアセチカスの菌株
ＤＳＭ　３０００７、ＤＳＭ３０００８、ＤＳＭ　３０
０１０またはＤＳＭ　３００１１、特にＤＳＭ　３００
０８が、適宜の遺伝情報部分が導入されたそれらの突然
変異株または変異株と同様、好ましい。

ムタロターゼをコードするＤＮＡを移植できる適当なホ
スト生物は、主として微生物であるが、植物、動物また
はヒト細胞であってもよい。微生物、例えば細菌、酵母
および線状菌類、特に大腸菌系細菌が好ましい。

酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプチド
の遺伝子工学的製造方法を利用可能とするために、本発
明によれば次の段階がとられる。

まず、例えば微生物アシネトバクタ−・カルコアセチカ
ス株＋、ｌｎ　ＤＳＭ　３０００８を適当な培地で培養
する。次にその微生物の天然ムタロターゼをこの培養物
から単離し、そして生化学的タンパク質分析にかける。

そのムタロターゼのアミノ酸部配列を確定後、ムタロタ
ーゼホリ滅ブチドのアミノ酸位１２〜１７および３５３
〜３５９に相当するオリゴヌクレオチドを合成する。遺
伝コードは縮重（退）しているので、これらアミノ酸位
の各々に相当するオリゴデオキシヌクレオチドの配列に
は様々な可能性がある。従って、本発明によれば、各々
についていくつか異なるオリゴデオキシヌクレオチドが
合成され、またその後のハイブリッド形成においてオリ
ゴヌクレオチド混合物Ｉおよび■として用いられる（第
■表参照）。

この段階とは別に、適当な培地で培養されたアシネトバ
クタ−・カルコアセチカス微生物（株Ｎｕ　３０００８
　）から染色体ＤＮＡを単離する。次にその染色体ＤＮ
Ａを制限エンドヌクレアーゼＥＣ４１、Ｅｃｏ　Ｒ■お
よびＨｉｎｄｌで切断し、ニトロセルロース上にプロッ
トし、そしてオリゴヌクレオチド混合物Ｉおよび■でハ
イブリダイズさせる。これにより６４００１）ｐの大き
さのＢｃｔｉ　ＤＮＡ断片がオリゴヌクレオチド混合物
■と・・イブリダイズする。この断片を、次にプラスミ
ドｐＢＲ３２７のＢａｍＨ（切断部位にクローニングす
る。制限分析とクローン化されたＢｃｌ　ｌ断片の部分
配列決定との組合せにより、この断片はムタロターゼ、
ｎ　ＩＪ−２プチドのＮ−末端領域をコーＰしているこ
とが示される。

約１５００　ｂｐの大きさのアシネトバクタ−・カルコ
アセチカス（株ｍ　３０００８　）の染色体ＤＮＡ　（
７）Ｈｉｎｄｍ断片は、オリゴヌクレオチド混合物■と
ハイブリッド形成する。従ってこの断片は、バクテリオ
ファージＭ　１３　ｍｐｌｌのＨｉｎｄｍ切断部位にク
ローン化される。その後のマツピングおよび部分ヌクレ
オチド配列決定により、そのクローン化されだＨｉｎｄ
［ｌ断片は、ムタロターゼ、ｔ？　ＩＪはブチドのＣ−
末端領域をコーＰしていることが示される。

従って、本発明は、酵素ムタロターゼの生物学的活性を
有する。ｄ　リ、２ブチ□ドをコーＰする、第１０図に
示されたＤＮＡ配列に関する。

本発明は、更にまた、ムタロターゼ遺伝子の全暗号領域
がλ−ＰＬプロモーターの制御下にあり、そしてムタロ
ターゼ遺伝子の全ＤＮＡ配列を決定する組換え発現プラ
スミドに関する。ムタロターゼポリペプチドのＮ−末端
領域をコードするこのＤＮＡ断片は、前述の組換えｐＢ
Ｒ３２７クローンに由来し、そしてムタロターゼポリ啄
ブチＰのＣ−末端領域をコードするＤＮＡ断片は、前述
のＭ　１３　ｍｐ１１クローンに由来する。本発明によ
れば、発現制御配列としてのλ−ＰＬプロモーターに代
えて、大腸菌プロモーター系例えば大腸菌ＺａＣ系、大
腸菌β−ラクタマーゼ系、大腸菌ｔｒｐ系または大腸菌
リポタン・Ｑり質プロモーター、酵母発現制御配列、ま
たは他の真核発現制御配列などを用いることも等しく可
能である。

この意味合において唯一の重要な点は、遺伝子が発現制
御配列に機能的に連結されること、そして選択された発
現制御配列が特定のホスト生物に適していることである
。

本発明は、特に、本発明に従ってムタロターゼポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドｐＷ
Ｈ１３７２に関する。

組換え発現ベクターを構築した後、それは、常法により
、形質転換可能なホスト生物、例えば大腸菌糸細菌例え
ば大腸菌株Ｎ［１６９（Ｅ、　ｃｏｌｉＫ　１２△Ｈ１
）などに導入される。形質転換されたホスト生物は、次
いで自体知られた方法により適当な栄養培地で培養され
、そして発現時に形成される酵素ムタロターゼの生物学
的活性を有するポリペプチドがそこから標準的方法によ
り得られる。

従って、本発明は、前述の条件下での発現時に合成され
、ムタロターゼの生物学的活性を有しそして第１Ｉ図に
示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。

本発明は、また、本発明によるＤＮＡを含むホスト生物
、特にプラスミドｐＷＨＩ３７２←罪ト腓峙→で形質転
侯された大腸菌ＷＨ１：Ｒ罰腎啼匙する。

本発明によれば、アシネトバクタ−・カルコアセチカス
からのムタロターゼをコードする単離ＤＮＡ配列を、ム
タロターゼ−生成性微生物または哨乳動物のジー／・パ
ンクにおけるプローブ分子として用いることてより、関
連のムタロターゼ遺伝子を同定し、そしてそれをこれら
のジーン・パンクから単離することができる。このよう
にして、これら生物のムタロターゼをコードする配列を
適当な発現制御配列と機能的に接合することにより、咄
乳動物例えば畜生および豚、および微生物例えばアス・
ξ−シラス属微生物よりの３素ムタロターゼの生物学的
活性を有するポリペプチドを任意の所望量で製造するこ
とも可能である。本発明の方法により製造される酵素ム
タロターゼの生物学的活性を有するポリペプチドは、例
えば、矢のような諸性質により特徴付けられる。分子量
は約４０，０００である。

活性至適ｐＨは７〜８のｐＨ範囲にあり、また至適温度
は、１２°Ｃ−，１６°Ｃである。グルコースに対する
ミバエリス定数は６〜８ｍＭである。

その活性は、Ｈｇ　＋＋イオンおよびＦｅ＋＋＋イオン
により２ｍＭの濃度で略半減し；Ｃｕ”イオン、ｃｏ＋
＋＋イオンおよびＺｎ＋″イオンによる阻害は、同濃度
で完全である。

本発明により製造される酵素ムタロターゼの生物学的活
性を有するホリハブチドは、アルｒヘキンースに対して
特異的である。その活性は、次のようにして測定される
。

ムタロターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびＮＡ
Ｄを、用時調製されたα−グルコース溶液と反応させ、
そして形成されるＮＡＤＨ２を３６６ｎｌＺ＋における
吸光度測定により測定する。基準値に対する、ムタロタ
ーゼによるＮＡＤＨ２形成速度増加により使用溶液のム
タロターゼ活性を計算することができる。

このように、ムタロターゼ活性は、自体知られた方法に
より、グルコースデヒドロゲナーゼ測定を経由して測定
される。後者は、例えば臨床化学における標準的方法の
一つである。

ムタロターゼ酵素活性は、ブランク（ムタロターゼを含
有しない）と分析値（ムタロターゼを含有する）の間の
差から次式により与えられる： 酵素活性＝△△Ｅ／分Ｘ４．０９Ｕ（ムタロターゼ）／
ｍＪ（使用酵素溶液）（Ｅ＝３５５　ｎｍにおける吸光
度） 導入されるβ−グルコースはすべてこの試験法を妨害す
るので粗製ムタロターゼ検体は、グルコースが存在して
いないかどうか試験する必要がある。

クローニングに用いられ、また以上および以下において
記載されるすべての制限酵素および出発シラスミド、フ
ァージおよびホスト系は、それらの起源または製造の詳
細が明細書中に与えられていない場合は、既知であるか
または参照用文献中に詳述°されており、従って容易に
入手しうるものである。これらの、および使用される標
準的方法の一部の詳細なレビューが文献、３４（後掲）
にみられる。

以下に実施例として本発明の態様を例示的に示すが、例
中では以下の略号が用いられている。

ＡＴＰ　　　　アデノシントリホスフェートＢ　ｉ　ｓ
　　　　　　Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミドｂｐ　　　塩基対 ＢＳＡ　　　　牛血清アルビミ／ ＣＢ　　　　　　臭化シアン切断により生成した啄ブチ
ドＣｐｍ　　　　１分あたりの計数値 Ｄａ　　　　　ダルトン、ｆ／ｍｏｌ ＤＭＳＯジメチルスルホキシド ｄ　）Ｉ　Ｔ　Ｐ　　　　　デオキシヌクレオンｐ５’
−トリホスフェートＥＤＴＡ　　　　　エチレンジアミ
ンテトラアセテートＥ、ｃｏｌｉ　　　大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）ＨＰＬＣ高速液体クロ
マトグラフィ ＩＰＴＧ　　　　　イソプロピルチオガラクトシド３２
ｐ　　　　　相対質量３２の燐同位元素ＰＥＧ　　　　
ｆリエチレングリコールＰＶＰ　　　　ポリビニルピロ
リドン ＡＲＧ　　　　　エンドプロテイナーゼＡＲＧ　Ｃによ
る切断により生成した滅ブチド ｒｐｍ　　　　１分間あたりの回転数 ＳＤＳ　　　　ドデシル硫酸ナトリウムＦ　　　　　　
トリプシンによる切断により生成した滅ブチＰＴｒｉｅ
）リスヒドロキシメチルアミノメタンＴｒｙｐｔＯｎｅ
　　）リプシンで切断されたカゼインＵ　　　　酵素活
性の単位 ＵＶ　　　紫外光 Ｘ−ＧＡＬ　　　　５−プｏモー４−７ｏｏ−３−イン
ｌ’ｌＪルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇ　　　ヌクレオチド：アデニン（Ａ）、
チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ） なお、引用した文献番号の各文献は、本明細書の発明の
詳細な説明の項の末尾に、その番号の文献名を列記しで
ある。

実施例１ 発酵槽にまず次の組成の滅菌栄養培地１００すットルを
仕込む： カゼインからのＲプトン　　　　　　０．５％酵母エキ
ス　　　　　　　　　　　　１．０％トウモロコシデン
プ／粉　　　　　　０．３％燐酸水素二カリウム　　　
　　　　　０．８％硫酸マグネシウム・７水和物　　　
　　　　　　０．０４１グルコース　　　　　　　　　
　　　１．２％シリコーン消泡剤　　　　　　　　１０
ｍ１ｐＨ６，８ このようにして調製された発酵槽に、同じ栄養溶液中で
１８時間インキュベートして調製されたアシネトバクタ
−・カルコアセチカス株３０００８の深部培養物１リツ
トルを接種する。

この培養物を穏やかに通気しながら３４”Ｃで１８時間
インキュベートする。

濁度として測定される生物量は最初の２〜１０時間増加
した後一定となる。１０時間後に培養物は４３　Ｕ　／
　Ｌにて最大ムタロターゼ活性に達する。

次の方法を用いて、その細菌からムタロターゼを遊離さ
せ、そして活性を測定する：発酵槽からの十分に混合さ
れたグルコース不含のサンプル３ｍ７！を５，００Ｏｒ
ｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を捨てる。細菌
ベレットを３ｍ７！の０．Ｉ　Ｍホスフェート緩衝液（
ｐｉ（６，５）およびＯ，１ｍｌノＥＤ、ＴＡ溶液（１
，８ｆ／ｌ　）に懸濁し、そしてその遠沈管中のその懸
濁液をアセトン／ドライアイス冷浴中で迅速に凍結し、
次いで４０°Ｃの水浴で融解する。１滴の洗剤および５
〜３０■のりゾチームを添加しく約１５．０００　Ｕ　
７ｍＬｉ　）　、そシテソノ混合物を％°Ｃで１５分間
攪拌する。次いでそれを４５°Ｃで５分間加熱してＮＡ
ＤＨオキシダーゼを失活させ、破砕を行い、そしてその
反応混合物を遠心分離により清澄化する。このようにし
て得られた透明上清中の酵素の測定を前述の方法によシ
行う。

培養物が最大活性に達したら粗製ムタロターゼ抽出液を
調製する。０．５チの洗剤と０．１　ｍｏｔ／ｌの塩化
カリウムを１００リツトルの細菌懸濁液に添加する。菌
体を高圧ホモジナイザーを用いて５００パールで破砕す
る。この間、細菌懸濁液を冷却する必要がある。３００
０　ｘ　ｙで３時間遠心分離して菌体破片を除去する。

沈殿を捨て、そして２０チのポリエチレングリコールを
曇った遠心液に添加して随伴物質を沈殿させる。その混
合物を次いで３０分間攪拌し、そして沈殿を遠心分離に
より除去する。依然として曇った上清は、約２　Ｕ　／
　ｍｌのムタロターゼを含有しそしてこれを３ＸＩＯ−
３８の伝導度となるまで水に対する透析濾過（ｄｉａｆ
ｉ１℃ｒａｔｉｏｎ　）にかける。透析濾過後、ムタロ
ターゼをパッチ・プロセッサーで、ｐＨ５，５で乾燥イ
オン交換体に吸着させる。２０，０００Ｕに対しては５
〜１０９のイオン交換体材料が必要である。負荷された
イオン交換体を吸引濾過により取出しそしてＰ液が透明
となるまで０．０２５　Ｍ燐酸カリウム緩衝液（１）ｔ
（５，５）で洗浄する。次いでその負荷されたイオン交
換体をカラムに詰め、そして０．０２５　Ｍ燐酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ５，５）を用いて吸光匣がゼロとなるま
で洗浄し、次いで浴出を塩化カリウム濃度勾配を用いて
行う。

酵素含有画分を集め、限外濾過により濃縮し、次いで凍
結乾燥する。このようにして得られた粗製抽出液の比活
性は約１６．ＩＵ／■（タン・Ｑり質）である。

得られた粗製抽出液２４２０ｍ？　（＝　３４．８００
０　）を５ｅｐｈａａｅｘ　Ｇ　１００分子ふるいのカ
ラム（２０Ｘ　）（５ｃｒｎ）にかける。２０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ、　Ｈｃｔ　（ｐＨ７，２）を用いて７０　ｍ
ｌ　７時の流速で溶出を行い、１４　ｍｌ容の画分を集
める。それら溶出液画分にムタロターゼ活性が認められ
る。それら画分を、溶出時に重なり合う分子量２１ｋＤ
ａのタン・？り質が排除されるように合一させる。これ
は、後者が以後の精製段階によっては除去され得ないだ
めである。

合一画分をＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅｘカラム（２Ｘ　”
Ｘ）ｃｍ　）にかける。負荷されたカラムを２５０ｍＪ
の２０　ｍＭＫ２ＨＰＯ，／　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ９，
０）で洗浄する。流速は２０　ｍｌ　７時とし、５　ｍ
ｌ容の両分を集める。直線的濃度勾配（３５０ｍＡ’の
２０１１１Ｍ、および３５０　ｍｌの１７０ｍＭ　Ｋ２
ＨＰＯ，／ＫＨ８ＰＯ４、ｐＨ９，０）を溶出に用いる
。

ムタロターゼは８ＱｍＭホスフェートで溶出される。

集めたサンプルを１：４希釈し、そしてヒドロキシアノ
？タイト（球状）カラム（４Ｘ　１ＯＣｒｎ）にかける
。流速は９．２ｍ１１時とし、２．３ｍ／容の両分を集
める。その方ラムをｌｏｏｍ／！の２０　ｍＭＫ２ＨＰ
Ｏ，／ＫＨ２ＰＯ，（ｐＨ９，Ｑ　）　テ洗浄する。溶
出は、３００ｍ１の２０　ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ，／ＫＨ２
ＰＯ４（ｐＨ９，０）より３００ｍ１の３００　ｍＭ　
Ｋ２ＨＰＯ４／　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ９，０）までの直
線的濃度勾配を用いて行われ、ムタロターゼは、カラム
材料により８５ｍＭにて放出される。

次いで精製をＳＤＳゲル（文献５参照）で行う（第１図
）。第３カラム段階の後は、４０　ｋＤａの分子量に相
当する唯一のバンドを検出し得るにすぎない。０１００
分子ふるいカラムでの泳動挙動から、自然条件ではその
タンパク質はオリゴマーの形態にあるものと推論するこ
とができる。

第　　　Ｉ　　　表 ムタロターゼの精製スキーム 活　性　比活性　収率 （Ｕ）　　　（Ｕ／■）　　チ 粗製抽出液　　　　３４８００　　１６．５　１００ヒ
Ｐロキシアパタイト　　２７８８５　　　６８．０　　
　８０ＣＭ−８ｅｐｈａｄｅｘ　　　　　　１９８４１
　　　１０７．０　　　５７ヒドロキシアパタイト　　
　１５６５６　　２３３．０　　　４５実施例２ ムタロターゼの啄ブチド配列の部分的決定後述する方法
を用いて、ムタロターゼ滅ブチドの（ＤＮＡよ如の可及
的少数の異なるコドンによりコードされるアミノ酸を含
む）部分配列を決定する。このタイプの配列は、後の相
当するオリゴヌクレオチＰの選択に特に好適である（実
施例３参照）。

実施例１における如きカラムクロマトグラフィによる最
終精製段階の後ホスフェート緩衝液中にあるタンノξり
質をその％容の１００チ酢酸およびその％容のｎ−プロ
・Ｑノールと混合し、そしてその混合物を回転蒸発器で
蒸発乾個する。

塩類を除去するために、残留物をＰ　１０分子ふるいカ
ラム（２，５Ｘ　２５ｃｍ　）にかけ、そして７０％酢
酸を用いて溶出を行う。個々の画分中のタン・Ｑり質を
２８０　ｎｍにおける吸収の測定により検出する。タン
・Ｑり含有画分を合一し、そしてその溶液を回転蒸発器
で蒸発乾個する。このようにして得られたタン・９り質
（ムタロターゼ）を、次のＮ−末端アミノ酸の配列決定
および、臭化シアンおよびトリプシン切断に用いた。

臭化シアンによる、および酵素トリプシンおよびエンド
プロテイナーゼＡＲＧ　Ｃによる切断を行ってムタロタ
ーゼ中アミノ酸の部分配列を決定する。

臭化シアンによる切断は、ＧｒｏｓｓおよびＷｉｔｔ−
ｋｏｐｐ　（文献１２参照）の手順により行う。前述の
如く塩類を除去済みで蒸発済みの１５ｍｇのタンパク質
を３　ｍｉの７０多蟻酸にとり、１００倍モル過剰の臭
化シアンを添加し、そしてその混合物を暗所で７時間イ
ンキュベートする。蟻酸を回転蒸発器で除去し、そして
残留物を’ｌ　ｍｌの７０％酢酸にとる。次いで、切断
生成物を、ｐ　ｔｏおよびＰ　３０分子ふるいカラム（
２，５ｘ　５０ｙｙ＋　）で分離する。

個々の切断生成物（断片）をＣＢＩ−５と呼ぶ。

第２図は、個々の断片が記載のカラムクロマトグラフィ
において溶出されている画分を示している。

今夕／・Ｑり質をトリプシンで消化するために、塩を除
去してあり、かつ蒸発乾個させである２■のタンパク質
を２　ｍｌの１Ｍ重炭酸アンモニウムに溶解し、そして
１重量％のプロテイナーゼを添加する。全タン、ｅり質
はこれらの条件下では溶解しないので、その混合物をＳ
ＤＳ濃度が０．０５％となるように調節する。トリプシ
ンは全部で４回添加する必要がある。最後の添加の後−
夜インキユベーションする。依然として不溶物を含有す
る反応混合物を１００μｔアリコートとしてＨＰＬＣカ
ラムにかける。

Ｂｅｃｋｍａｎ　ＨＰＬＣ系は、２つの溶媒ディスＲン
サ（型式１００Ａおよび１１０　Ａ　）　、可変波長検
出器（型式１６５）および濃度勾配混合器より成る。

溶出は溶液Ａ（水中０．０５％　ト＋Ｊフルオロ酢酸）
を１０分間用いることによって開始する。次いで、濃度
勾配を適用し、溶媒Ｂの濃度（アセトニトリル中０．０
２５４　）リフルオロ酢酸）を切分内に５０％まで高め
る。流速は１．６ｍ１１分とし、そして温度は関°Ｃと
する。カラム（０，７２Ｘ２５ｃｒｎ）に球状シリカブ
／Ｌ／　（Ｎｕｋｌｅｏｓｉｌ　５　ＣＩＢ　、　Ｍａ
ｃｈｅｒｙ　＆Ｎａｇｅｌ、　Ｄ；１ｒｅｎ　）を詰め
る。２１６ｎｍにおける吸収の測定によりペプチドを同
定する。配列決定のために、７〜１０クロマトグラフイ
実験よりの両分を集める。

このようにして、特に、全ムタロターゼポリ滅ブチドの
トリプシン断片Ｆ３８およびＦ’４２を単離する（第３
図参照）。

全タンパク質のトリプシン消化により、場合によっては
分離困難な切断生成物が得られる。

酵素消化に全タン・♀り質に代えて臭化シア：／断片を
用いれば分離上の問題は、単純化される。

タン・Ｑり質のＣ−末端領域に関する更なる情報を得る
ために、臭化シアン断片ＣＢ５をエンドプロテイナーゼ
ＡＲＧ　Ｃを用いてそのアルギニン位で切断した。

そのＡＲＧ　Ｃ切断もまた、１Ｍ重炭酸アンモニウム（
ｐＨ７〜８）中、１重量％のプロテイナーゼの存在下に
３７°Ｃで行われる。

消化混合物を回転蒸発器で蒸発させ、残留物を２罰の９
０％蟻酸に溶解し、そしてその溶液をｌ　ｍｌの水で希
釈しそしてＰＩＯカラム（２，５Ｘ　１００Ｃｒｎ）に
かけた。溶出は２０％蟻酸を用いて行った。

このようにして３画分Ｉ〜■を溶出し、そしてこれらの
うち、画分Ｉを２．５Ｘ５０ｃｒｎ長のＰ　１０カラム
で再度クロマトグラフィにかけた（第３ａ図）。

アミノ酸分析 全ムタロターゼホリペプチドのアミノ酸分析を最初に行
う。このために、５　ｎｍｏｚのタン・ξり質を、２ｍ
ｌの６　Ｍ　ＨＣｌ　、　０．０５％チオグリコール中
１５０°Ｃで２時間還元条件下に加水分解する。

２１ｒＬｔの５　Ｍ　ＩＣｔｌｌ、５％ＤＭＳＯ中、１
１０°Ｃで加時間酸化条件下に加水分解を行う。次にサ
ンプルを回転蒸発器で蒸発させ、そして、製造元の指示
に従ってＬＣ５ＱＱ　（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ、　Ｆｒａ
ｎｋｆｕｒｔ　）アミノ酸分析器を用い、０．６　Ｘ　
２１　ｃｒｎＤＣ５Ａ樹脂カラムで分析する。

このようにして測定された全ポ１７　波ブチｒのアミノ
酸組成を第■表に示す。ＤＮＡ配列から推論されるアミ
ノ酸組成は「配列」欄に掲げられている。これより計算
されうるムタロターゼの分子ｔｉｄ、３９，５００　Ｄ
＆である。

第　　　■　　　表 アミノ酸　酸化条件　還元条件　配　　　　列ＡＳＸ　
　　　４８．５６　　５１．７１　　　５３　ＡＳＮ　
３３ＳＰ　２０ ＴＨＲ２３，１３２２，４５２７ ＳＫＲ１９，８９１８，２５２３ ＧＬＸ　　　　３８．６２　　３８．１２　　　３３　
ＧＬＮ　２５ＬＵ　　８ ＰＲＯ１９，５７１８，７８１８ ＧＬＹ　　　　３６．３２　　３８．４６　　　３３Ａ
ＬＡ　　　　２７．００　　２４．３８　　　２０ＹＳ ＶＡＬ　　　　２３．３４　　２７．８２　　　３１Ｍ
ＥＴ　　　　４．７０　　　４．０４　　　４工ＬＥ　
　　　１３．５０　　１５．５２　　　１５ＬＥＵ　　
　　２９．３０　　２９．８８　　　３０ＴＹＲ１３，
０８１３，７１１５ ＰＨＦ２１４．６５　　１５．２５　　　１５Ｈ工Ｓ　
　　　１２．６６　　　７．０１　　　６ＬＹＳ　　　
　２３．２３　　２４．２３　　　２５ＡＲＧ　　　　
１１．２０　　　９．３０　　　９前述の実験条件では
、トリプトファンは測定できない。

第■表から、タン・Ｑり質が４個のメチオニン残基を含
んでいることがわかる。従って臭化シアン切断時には５
個の断片が期待される。すなわち、前述の（第２図参照
）臭化シアン切断およびその後の切断生成物の分離の結
果と、アミノ酸分析の結果（第■表参照）とが合致する
。

適切な場合には、臭化シアン、トリプシンおよびエンド
プロテイナーゼＡＲＧ　Ｃ切断により得られる啄ブチド
のアミノ酸組成も前述の如くに測定する。

アミノ酸配列の決定 まず、ムタロターゼのＮ−末端アミノ酸を自動液相配列
決定装置（Ｂθｃｋｍａｎ型式８９０Ｃ）を用いて測定
する。アミノ酸の２−アニリノ−１，３−チアゾリン−
５−オン誘導体を２０チドリフルオロ酢酸中５５°Ｃで
加分間インキュベートする。

フェニルチオヒダントイン誘導体をＨＰＬＣ系で同定す
る（文献８参照）。

次に、断片ＣＢ１、ＣＢ２、Ｆ４２、ＣＢ３、ＣＢ４、
ＣＢ５、Ｆ３８、ＡＲＧ　ｌ、ＡＲＧ　２およびＡＲＧ
　３　　のアミノ酸配列を決定する（第４図参照）。

これら断片を固相法により関°ＣでＬＫＢ型式４０２０
装置を用いて配列させる。それら断片のＣ−末端をＩＤ
Ｃ（１−エチル−３−（３−ジエチルアミノ−プロビル
）カルボジイミド、ＨＣＬ）を用いて３−アミノゾロピ
ル−グラスに結合させる（文献９参照）。次にＥｄｍａ
ｎ分解をＬａｕｒｓｏｎ法により行う（文献【０参照）
。アミノ酸のフェニルヒダントン誘導体をＭｅｒｃｋ　
ＨＰＴＬＣプレート（シリカゲル６０７　Ｇ　２５４　
）での薄層クロマトグラフィによシ同定する（文献１１
参照）。

このようにして得られる前記ムタロターゼ断片のアミノ
酸配列に対しムタロターゼの全体のアミノ酸配列におけ
る相対的位置を付与する。

これは、次のようにして行われる。

臭化シアン断片ＣＢＩおよびＣＢ２　　の位置は、それ
らのアミノ酸配列と全ポ１７．９プチドのＮ−末端アミ
ノ酸配列とが合致するところから明白である（第４図参
照）。

臭化シアン断片ＣＢ３の最初の５個のアミノ酸を測定す
る。臭化シアン切断後のクロマトグラフィよりの、第１
吸収極大の物質をＰ６０カラム（２，５Ｘ　５０ｃｙｎ
　）を用いて再度クロマトグラフィにかける。配列決定
は、Ｎ−末端配列（すなわち前記極太は未切断物質を含
有した）および臭化シアン断片ＣＢ２の最初の６個のア
ミノ酸を並行的に示す。ムタロターゼポリ滅ブチド中の
ＣＢ３の相対位置は、相当する構造遺伝子のＤＮＡ配列
が決定されるまで確定できない（第４図参照）。

臭化シアン断片ＣＢ４の配列はトリプシン切断よりの断
片Ｆ３８中に完全に保持されている。それは１１個のア
ミノ酸より成る（第４図参照）。

臭化シアン断片ＣＢ５は、臭化シアン断片ＣＢ３から、
２．５Ｘ５０Ｃｒｎ犬のＰ３０カラムでのクロマトグラ
フィに再度かけることにより分離することができる。ホ
モセリノはアミノ酸分析で認められないので、臭化シア
ン断片ＣＢ５はＣ−末端断片でなければならない。ＣＢ
５の４２個のアミノ酸の配列を決定する（第４図参照）
。

臭化シアン断片ＣＢ４およびＣＢ５の確立された配列の
ムタロターゼの全、ｔ？　ＩＪペプブチにおける相対的
帰属は、ムタロターゼポリ啄ブチドのトリプシン切断よ
りの断片の配列決定およびムタロターゼポリ啄ブチドの
臭化シアン断片ＣＢ５のトリプシン切断よりの断片の配
列決定により決定する。

臭化シアン断片ＣＢ５を更に細かく断片化することによ
り得られる画分Ｉ、ｎおよび■（第３ａ図）の配列決定
を行った。両分■の滅ゾチドの配列は、ＣＢ５の最初の
２０個のアミノ酸と一致する。

臭化シアン断片内のそれらの配列に従って、啄ブチドに
ＡＲＧ　ｌ〜ＡＲＧ　３の番号を付与した。画分ＩＩ（
ＡＲＧＩ）の啄ブチドの配列は、ＣＢ５の最初のｍ個の
アミノ酸と一致した。画分■よりのＲブチｒは、その配
列がＣＢ５の位置２１〜４２と重複しただめ、ＡＲＧ　
２として同定された。それは、この配列のほかにアミノ
酸８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇを有していた。ＡＲＧ３は、
ＣＢ５のＣ−末端配列である。

ＡＲＧ　ｌ、ＡＲＧ　２およびＡＲＧ３の配列は第４図
に示されている。

臭化シアン断片ＣＢ５は、ムタロターゼのＣ−末端ペプ
チド断片であるので、これによりムタロターゼポリペプ
チドのＣ−末端アミノ酸配列が確定する（第４図参照）
。

全タンパク質のトリプシン切断よりの断片Ｆ３８の５個
のアミノ酸の配列決定により、臭化シアン断片ＣＢ４お
よびＣＢ５の相対的位置が与えられる。Ｆ３８がＣＢ４
およびＣＢ５と重複するところから、ＣＢ４とＣＢ５は
直接に隣接しているはずである（第４図参照）。

最後に、全ムタロターゼポＩＪ　、９プチドのトリプシ
ン切断に由来する断片Ｆ４２のアミノ酸配列を決定する
。５アミノ酸鎖長であるその配列の相対的位置は、ムタ
ロターゼ構造遺伝子のヌクレオチ′ド部分配列が決定さ
れるまで確定することはできない（第Ｖ表参照）。

実施例３ オリゴヌクレオチドの合成 ムタロターゼをコードする遺伝子は、実施例５に記載さ
れるようなジーン・パンクから単離する。

オリゴデオキシヌクレオチド（オリゴヌクレオチドと略
記される）は、とのジーン・・ミンクをスキャニングす
るためのプローブ分子として働かせるために、化学合成
により製造する。

これらのオリゴヌクレオチドの配列は、実施例２におけ
る如く決定されたムタロターゼポリ滅ブチドの部分アミ
ノ酸配列のアミノ酸１２〜１７、および３５３〜３５９
（最後の７個のアミノ酸）から推定する。

遺伝暗号は縮重しているので、同じアミノ酸配列をコー
ドする様々なオリゴヌクレオチドを合成する必要がある
。各場合につき関連するオリゴヌクレオチＰを第■表に
掲げる。

−１ｅ　　Ｉｌｌ　　　ｌ　　　ｔ　　　　　　１廿　
１１１１　　　大前記三文字コードおよび一文字コード
は、天然に存在する２０１［１ｉ１の生物アミノ酸につ
いて通常使用される省略形である。

第■表に示されるオリゴヌクレオチド配列のすべての組
合せを用時に合成する。その合成は、Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、（文献【４．１５参照）により開発さ
れたホスホルアミダイト法を用い、官能性ｎ−プロピル
アミノ基を備えたシリカゲルより成る担体で行われる。

個々のトリプレットの第３位に、相互に水素結合を形成
し得ない２個のヌクレオチドを持たせることが可能なと
きは、等モル量のホスホルアミダイトをカップリングに
利用可能とする。挿入される二者択一物がＧとＣ１また
はＡとＴである場合には、この特定のカップリング段階
に対しては担体材料を分ける。合成終了時に、脱トリチ
ル段階は行われない。何故ならば、目的とするオリゴヌ
クレオチドはその方が、５′−末端のトリチル保護基に
より副生物からより明瞭に区別され得るからである。ホ
スフェート保護基を除いた後、担体材料に対する共有結
合を加水分解し、そして塩基保護基を除去する。次いで
溶液を回転蒸発器で蒸発乾個し、そして残留物を緩衝液
（ＩＱｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ＨＣｔ　、　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）にとる
。懸濁液および担体残留物を、このようにして得られた
オリゴヌクレオチドの粗製混合物から、遠心分離によっ
て除去する。各実験において、５〜１５　Ａ２６０単位
をＨＰＬＣカラムを通して精製する。このカラムクロマ
トグラフィにおける溶出は、５分間溶１Ａ（０，１Ｍト
リエチルアンモニウムアセテート中２０％アセトニトリ
ル）を用いることから開始される。次に、濃度勾配を適
用し、アセトニトリル濃度をＩ分間内に３０％まで高め
る。流速は１５ｍ１／分とし、そして温度は４５°Ｃと
する。オリゴヌクレオチド含有溶出液を合一し、そして
蒸発乾個し、４００μｔの８０％　（ｖ／ｖ　）酢酸を
添加し、そして室温で５分後に、その混合物を蒸発乾個
する。残留物を５００μＬの水に再懸濁し、そして５％
から２０％アセトニトリルの勾配を用いて再びクロマト
グラフィにかける。このクロマトグラフィにおいて、脱
トリチルされたオリゴヌクレオチドは１３〜１７％のア
セトニトリル濃度で溶出される。

最後に、最終的収率をＨＰＬＣ緩衝液を基準として用い
て、２６０　ｎｍで測定し、そして得られた２つのオリ
ゴヌクレオチド混合物■および■を水から２度凍結乾燥
し、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ、　ＨＣｌ（ｐＨｓ、
ｏ）、Ｑ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁する。

実施例４ アシネトバクタ−・カルコアセチカス（ＤＳＭ３０００
８　）の菌体を実施例１における如く培養する。

５７の菌体を５Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ６，５Ｑ　ｍＭ　ｇＤ
ＴＡ　、　３Ｑ　ｍＭＴｒｉｓ、　ＨＣｌ　（ｐｔ（７
，９）に懸濁し、そして２００７ｎ９のリソチームと共
に３７゛Ｃで加分間インキュベートする。懸濁液をＳＤ
Ｓ濃度が１％となるまで調整し、そして５ｍ９のプロテ
イナーゼＫ　（Ｍｅｒｃｋ　）と共に３７°Ｃで更に閣
分間インキュベートする。

次ニソノ混合物を（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、Ｈ（ｔ（ｐＨ
８，０）、Ｑ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡した）フェノ
ールで６回、次いでクロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２０：１）で４回、注意深く抽出する。

得られたＤＮＡを次に、三倍容のエタノールを添加する
ことにより沈殿させる。ＤＮＡを遠心分離により沈殿さ
せ、そして沈降物を乾燥させ、そして５　ｍｌの１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＨＣｔ　（ｐＨ８，０）、０，１ｍＭ
　ＫＤＴＡに再懸濁する。次いで恥μ７のＤＮアーゼ不
含ＲＮアーゼＡ　（Ｓｉｇｍａ　）を添加する。ＤＮア
ーゼは、１００　ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ　（ｐＨ５，５）中
で１０分間沸騰することにより前もって失活させである
。ＲＮＮアーゼで加分間インキュベーション後、２５０
μ２のプロテイナーゼＫを添加し、そしてその混合物を
更に加分間インキュベートする。次にそれを再び、やは
りフェノールと共に６回、そしてジエチルエーテルと共
に３回振盪することにより抽出する。次いで３イ容の１
．５ＭＮａＣ６中３０％ＰＥＧ溶液を添加することによ
り沈殿させ、エタノールで洗浄しそしてデシケータ中で
乾燥させる。

実施例５ 材料と方法 酵　　素　： 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＥ、ｃｏ１ｉポリ
メラーゼおよび、Ｅ、　ｃｏｌｉ、＋？リメラーゼのＫ
ｌｅｎｏｗ断片をＢｏｅｈｒｉｎｇ、　ＢＲＬまたはＢ
ｉｏｌａｂｓ社から購入し、そして製造元の指示に従っ
て使用した。ＦＪｃｏＲ）はＧｒｅｅｎｓ　ａｔ　ａｌ
、　（文献１６参照）の手順により調製する。

ゲル電気泳動：制限分析のために、１．０００　’ｂｐ
までの鎖長のＤＮＡ断片を、ＴＥＢ緩衝ｆｉ、　（６Ｑ
ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

５ＱｍＭホウ酸、ｔ　ｍＭＥＤＴＡ　、　ｌ）Ｈ８，３
）および１０％グリセロール（文献１７参照）中５％ポ
リアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアクリル
アミド２０：１）で分画する（文献Ｌ７参照）。

ｓｏｏ　ｂｐ〜９，０ＯＯｂｐ　の頭髪のＤＮＡ断片の
分画には、ＴＡＢ緩衝ｆｊ、　（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
、　１５　ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ　。

１．２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｌ）８８．３　）中１
％アガロースゲルを用いる（文献１８参照）。垂直アガ
ロースゲル電気泳動には、高さ３ｃｒｎの８チポリアク
リルアミド支持ブロックを装置の下側部分に設定（ｃａ
ｓｔ　）する。アガロースゲルから単離されたＤＮＡは
、クローニング実験には適していないので、分取する目
的には、グリセロールの添加されていない３％ポリアク
リルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアクリルアミド
５０：ｌ）を用いる。ゲル電気泳動後、ゲルを装置から
取り出し、そして０．００１％臭化エチジウム溶液中で
１０分間染色する。これによってＤＮＡ含有バンドはＵ
Ｖ先光下可視となる。

ＤＮＡの調製：アシネトノミフタ−・カルコアセチカス
からの染色体ＤＮＡの調製は実施例４に記載されている
。

プラスミドＤＮＡ、およびＭ　１３フアージの複製型の
ＤＮＡの単離をＨａｒｄｉｅｓ　ｅｔ　ａｍ、の方法（
文献１９参照）により行う。単鎖Ｍ１３　ＤＮＡはＭｅ
ｓｓｉｎｇ（文献加参照）の記載するところに従って調
製する。ゲル電気泳動による分画またはハ１プリ１５分
間沈殿させることにより５倍濃縮する。

プラスミドＤＮＡ０分取目的での単離は、次のような形
質転換体の迅速分析方法によって行わ−れる。

単一の細菌コロニーを選抜プレートに拡げる。

接種用白金耳を用いて約１　ｒｍ”の細菌集塊を取り出
し、そしで８０μｔの’ｒｒｉｔｏｎ緩衝液（８チシユ
ークロース、５　％　ＴｒｉｔＯｎ　Ｘ　１００．５Ｑ
　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、Ｈｃｔ、
　ｐＨ８，０）に懸濁する。７μｔのリンチーム緩衝液
（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、５
Ｑ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中１０　Ｗ　／　ｍｌリソチーム）
の添加後、サンプルを室温で５分間インキュベートする
。

次にそれらを１００°Ｃで４０秒間加熱し、次いで氷上
に２分間置く。微量遠心分離器で１５分間遠心分離後、
細菌の粘着性残留物を接種用白金耳で除去する。次に（
資）μｔのインプロパツールを上清に添加し、そして混
合物を加分量水浴中に置く。

これによって生じる沈殿を、１５分間遠心分離すること
により沈降させ、そして、上清を捨てた後、それを２回
６００μｔのエタノールで洗浄し、そして真空乾燥する
。得られたプラスミ１−”ＤＮＡを４０　μｔのＴＫ緩
衝Ｑ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ＨＣＬ、　ｐＨ８，Ｑ
、Ｑ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）に溶解し、そしてアがロ
ースゲルで分析する。

ゲルの溶出： ポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡ断片の溶出をＭａ
ｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの方法（文献２］参照）に
よって行う。５チおよび２０チホリアクリルアミドゲル
片をまずＴｅｆｌｏｎ杆を用いて機械的に粉砕する。３
チポリアクリルアミドゲル片を使い捨て２０ｍ１シリン
ジを用いて直径０．８　ｍｍのカニユーレに押し通す。

溶出されたＤＮＡを、２００μを容のカラム材料を有す
るＤＥ５２カラムにかけ、そして４００μｔの２Ｍｈｒ
ａｃｔで溶出する（文献加参照）。オリゴヌクレオチド
をｌ　Ｍ　ＮａＣ４で溶出し、次いで直接７、イブリダ
イゼーションに用いる。そのＤＢ５２カラムから溶出後
、二本鎖ＤＮＡをエタノールで２回沈殿させる・。

形質転換： Ｅ、　ｃｏｌｉ株をＣａ　Ｃ７２法（文献１７参照）に
より形質転換する。

ＤＮＡの放射性標識： オリゴヌクレオチドの５′−末端をＴ４−４リヌクレオ
チドキナーゼおよび〔γ−”Ｐ　〕−ＡＴＰを用いて放
射性標識する（文献２１参照）。これに要する８、ＱＱ
Ｑ　Ｃ１／ｍｍｏｔの比活性を有する［”　７−３２Ｆ
　］　−ＡＴＰはＷａユ５ｅｔｈおよびＪＯｈＯｎＳＯ
ｎの方法（文献ム参照）により合成する。得られる標識
オリゴヌクレオチドの比活性を、４０ｃｒ１１長２０％
８Ｍ尿素ゲルで非ホスホリル化オリゴヌクレオチドを除
去することにより増大させる。このゲル電気泳動は遊離
ＡＴＰおよび無機ホスフェートをも除去する。

プラスミドＤＮＡはＷｅｉｎｓｔｏｃｋ　（文献２４参
照）のニック・トランスレーション法により放射性標識
される。次に、反応混合物中に残存する過剰のトリホス
フェートをＰａ５ｔｅｕｒピ滅ット中Ｇ５Ｑ分子ふるい
カラムを用いて除去する。

ハイブリダイゼーション： サザーンプロット分析： 染色体ＤＮＡの、または組換えプラスミドのＤＮＡの切
断により得られた制限断片をアがロースゲルで分離しそ
して５ｏｕｔｈｅｒｎ　（文献５参照）法ニよりニトロ
セルロース上にプロットする。

ニトロセルロースフィルタラ台所用フィルム内にシール
し、そしてフィルタ表面積４０ｃｒｒ１２あたシ１　ｍ
ｌのハイブリダイゼーション溶液１　ｍｌを用いて（イ
）°Ｃで４時間予備的にハイブリッド形成させる（　５
　ｘ　ＮＥＴ　、　１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、
Ｑ、ｌ　％　ＳＤＳ　ｉＩ　Ｘ　ＮＥＴ　＝　０．１５
Ｍ　ＮａＣｔ、　１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ　、ｐＨ
８，３、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　；　Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液＝０．０２溶液面０アルブミン、０．０２％
ポリビニルピロリドン４０．０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ　
）。次に、標識オリゴヌクレオチド（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ
計数により約１〜２ＸＩＯ６Ｃｐｍ）を添加する。両オ
リゴヌクレオチド混合物に対し選択されるハイブリッド
形成温度は４０°Ｃである。３〜５時間ノ・イブリッド
形成後、フィルタを１５分間４°Ｃで２回洗浄する。次
にそれらを４０°Ｃで１分間洗浄する。次にオートラジ
オグラフィを一７０°Ｃで１２時間行う。非特異的ノ・
イブリッド形成信号は高められた温度でもう１分間洗浄
手順をふむことにより除去することができる。

次に、関連のニトロセルロースフィルタをもう一度前述
の如く露出させる。

ドツト−プロット分析： 前述の如く調製された組換えプラスミドのＤＮＡ、３％
ポリアクリルアミドゲルから溶出された染色体ＤＮＡ、
および単鎖ファージ上清をＰットープロット分析にかけ
る。このために、５μｔのＤＮＡ　全ニトロセルロース
フィルタ上にヒＡットで移し、そして送風機を用いて乾
燥させる。

二本鎖ＤＮＡの場合には、そのフィルタを湿らせたクロ
マトグラフィ紙上で室温にて処理する。

クロマトグラフィ紙の含浸に用いられた以下の溶液を順
次用いる： ２５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ＨＣｌ（ｐＨ７，５）を５
分間；５００ｍＭ　ＮａＯＨを５分間；　５ＱＱ　ｍＭ
　ＮａＯＨ／　１．５　Ｍ　ＮａＣｚを５分間；　Ｉ　
Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ＨＣｌ（ｐＨ７，５）を２×２分間；
５ＱＱ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ＨＣＬ　（ｐＨ７，５）　
／　１，５Ｍ　ＮａＣｔにそのフィルタを減圧下に２時
間オーブン中（資）°Ｃで焼き付ける。それらフィルタ
と放射性標識オリゴヌクレオチド混合物Ｉおよび■との
ノ・イブリッド形成を前述の如く行う。フィルタとニッ
ク・トランスレーションを施したプラスミドとのハイブ
リッド形成はＷａｈｌθｔ　ａｌ、の方法（文献２６参
照）により行う。

コロニーハイフリタイゼータ３フ１ ２個の寒天プレート（４０ｍ９／ｌアンぎシリンで富化
）　（２４，３Ｘ　２４．３　ｃｍ、　　ｕｕｎｃ工ｎ
ｔｅｒｍｅｄ、スクリーニング用プレート）の各々にニ
トロセルロースフィルタ（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎ
ｄ　５ｃｈｆｆｉｌｌＢＡ−８５）を被せる。次に１，
０００個の細菌コロニーを滅菌つまようじを用いて同じ
パターンで、一方のプレートのニトロセルロースフィル
タおよび他方のプレートの寒天に移し、そして３７°Ｃ
で１８時間インキュベートする。次にそれらコロニーを
有するフィルタをドツト−プロット分析法（前記参照）
と同様に処理する。それらフィルタを減圧下に２時間８
０°Ｃで焼き付けた後、それらを６　Ｘ　ＮＥＴ　、　
ＩＱ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、Ｑ、１％ｓＤｓで３
回洗浄し、そして同じ緩衝液中４０°Ｃで５時間、２４
　Ｘ　１０’　ｃｐｍの標識オリゴヌクレオチドとノ・
イブリッド形成させる。それらフィルタを次いで２回６
ＸＳＳＣを用いて４°Ｃで１５分間、次に４０“Ｃで５
〜８分間、そして最後に４２°Ｃで１分間洗浄する。Ｘ
線フィルムの最初の感光の後、それらフィルタを再び６
　ｘ　ＳＳｃを用いて４４゛Ｃで２分間洗浄し、そして
別のＸ線フィルムの感光に用いる。最後に、それらフィ
ルタを６　Ｘ　ＳＳｃ中４６°Ｃで１分間洗浄し、そし
て再びＸ線フィルムの感光に用いる。

配列分析： 大体において、ＤＮＡ配列はＭａｘａｍおよびＧ１１−
ｂｅｒｔ　（文献２１参照）の方法により決定される。

適切な場合、例えば適轟な制限切断部位が存在しない場
合には、ＤＮＡ断片はｐＵＲ２５０中にサブクローン化
される（文献路参照）。Ｍ　１３クローンの同定には、
Ｍ　１３法（文献ｒ参照）による配列決定を行う。

前述の諸方法は、本質的に分子生物学の標準的方法であ
り、また実験室マニュアル例えば”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎ翁ｕａｌ”。

ＴｌＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、著、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９
８２年などに記載されている。

ゲノム・ムタロターゼ配列のクローニングアシネトバク
タ−・カルコアセチカス（ＤＳＭ３０００８　’）より
の染色体ＤＮＡサンプル４００μｍを制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏ　Ｒ■、Ｈｉｎｄ［［およびＢｃＬＩで切
断する。次に加μ７を１チアガロ−スプルでの電気泳動
にかけ、そしてニトロセルロース上にプロットする（い
わゆるトータルＤＮＡプロット）。前述の如くノ・イブ
リッド形成を行った後、オリゴヌクレオチド混合物■に
対しては４４°Ｃで短時間、そしてオリゴヌクレオチド
混合物■に対しては４６°Ｃで短時間、洗浄を行う。

ＢＣ１ｌ切断をオリゴヌクレオチド混合物Ｉとハイブリ
ッド形成すると６４００　ｂｐの大きさの領域に再現性
のある信号が得られる。Ｅｃｏ　ＲＩ切断をオリゴヌク
レオチド混合物■とハイブリッド形成させると２０００
　ｂｐの大きさの領域に、そしてＨ１ｎｄｍ切断の場合
には１５００ｂｐの大きさの領域に再現性のある信号が
生じる。

約１５００　ｂｐの大きさのＢｉｎｄＢｌ断片はオリゴ
ヌクレオチド混合物■とハイブリッド形成する。

次に、アシネトバクター・カルコアセチカスＤＮＡのＢ
Ｃ４Ｉ断片とプラスミドｐＢＲ３２７（ＡＴＣＣ３１３
４４）のＢａｍＨＩ切断ＤＮＡを用いてジ−７−バンク
を構成する。

このために、アシネトバクタ−・カルコアセチカスのＢ
ｃｔＩ切断染色体ＤＮＡ　１２０μ２を、３８００ｂｐ
長の断片がゲルの下端に達するまで、３％ポリアクリル
アミドゲルでの電気泳動にかける。

３８００　ｂｐより上方のアクリルアミドを９個の幅狭
の帯状片に切断し、そして各個のゲル画分からＤＮＡを
溶出する。溶出されたＩＱＪＡの各々のＫをドツト−プ
ロット分析でノ・イブリッド形成させる。

二番目に大きな断片を有するゲル帯状片よりの画分が最
強の信号を与える。それ故に、この画分の溶出ＤＮＡの
１１１０を、Ｂａｍ　Ｈｌで切断されそして脱ホスホリ
ル化された（文献四参照）　ｐＢＲ３２７プラスミドＤ
ＮＡ　２００　ｎｆと連結する。続＜　Ｅ。

ｃｏｌｉＲＲＩの形質転換（文献間参照）により３００
０個のテトラサイクリン感受性コロニーが得られる。こ
れらのコロニーのうち１０００個について前述のコロニ
ーハイブリダイゼーション法によシ調べる。

次いで、コロニーハイブリダイゼーションで最強の信号
を与えた２５個のコロニーからのプラスミドＤＮＡを前
述の如く単離し、そしてドツト−プロット分析にかけ″
る。

調べた５個のプラスミドのうち１０個は、陽性信号を与
える。そこで、以後の実験のために、陽性信号を与える
プラスミドのうち６個からのＤＮＡを２５０ｍ／の培養
物から単離する。それらプラスミドの各々についてＥＣ
０ＲＩおよびＨ１ｎｄＩＩＩ切断を行い、アガロ−スケ
°ルで分画する。

そのＤＮＡをサザーン法によりニトロセルロースに固定
し、そして放射性標識オリゴヌクレオチド混合物Ｉとハ
イブリダイズさせる。３つの１分段階における洗浄温度
は５２℃に上げる。この温度ではｐＷＨ１３１８と称さ
れるプラスミドのＥｃ。

ＲＩ断片（２０００ｂｐの大きさ）およびＨｉｎｄｍ断
片（１５００ｂｐの大きさ）のハイブリッド形成がある
のみである。これらの断片の大きさは全染色体ＤＮＡを
用いたハイブリダイズした結果と合致する。

オリゴヌクレオチド混合物■とハイブリッド形成させて
も陽性信号は存在しない。

第５ａ図は、適宜の制限ヌクレアーゼによる切断によっ
て得られた組換えプラスミドｐＷＨ１３１８の制限地図
を示している。

組換えプラスミドｐＷＨ１３１９け、ｐＷＨ１３１８よ
りのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片（１５００ｂｐの大きさ）を
プラスミ’ｆ　ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ［ｌＩ切断部位
にりｏ　−＝　７　ｆする（文献３１参照）ことにより
得られる（第５図参照）。

プラスミＦ′ｐＷＨ１３１９のＮａｅ　Ｊ切断部位から
出発して、挿入部の最初の配列決定をＭａｘａｍおよび
Ｑｉｌｔ）ｅｒｔ法（文献２１参照）により行う。

このようにして得られたＤＮＡ配列はムタロターゼ、ｔ
？　ＩＪ　ヘブチドの最初の１８個のアミノ酸と完全に
一致する（第■表および第４図参照）：このように、配
列決定結果は、前記ジーン・ｔンクから単離された組換
えプラスミドｐＷＨ１３１８が、ムタロターゼボＩＪ　
ＯブチドのＮ−末端領域をコードするＤＮＡ配列を含有
することを示している。

シラスミドｐＷＨ１３１８は、ムタロターゼポ１７　ｄ
ブチドのＣ−末端領域をコードするＤＮＡ配列を含み得
ない。何故ならこのプラスミドはオリゴヌクレオチド混
合物■とハイブリダイズしないからである。それ故、ア
シネトバクタ−・カルコアセチカスの全ＤＮＡから、Ｈ
ｉｎｄｍ断片（これＵ　１５００　ｂｐの大きさであり
、そしてオリゴヌクレオチド混合物■とも、また約１２
５ｂｐ長であって組換えプラスミドＩ）ＷＨ１３１８の
ＨｉｎｄｍとＢＣ４１切断部位の間に含まれている領域
ともハイブリダイズする）がクローンされる（第６ａ図
および第６ｂ図参照）。

２００μ７のＨｉｎｄ　Ｉｌｒ切断染色体ＤＮＡを３％
４す７クリルアミドケ゛ルで分画する。１５００　ｂｐ
あたりの大きさの領域にあるＤＮＡを溶出する。そのＤ
ＮＡのＡを前述の如くニトロセルロースに固定スる。

この両分は、オリゴヌクレオチド混合物ｕとも、まだプ
ラスミドｐＷＨ１３１８のＤＮＡともハイブリダイズす
る。

単離された画分よりの）（ｉｎｄ　ｉｌｌｌｌ切断染色
体ＤＮＡ２００全’２００Ｍ’の、Ｈｉｎｄ［ｌ切断さ
れ脱ホスホリル化されたＭ１３ｍｐ１１　ＲＦ　ＤＮＡ
と連結する。得られる連結生成物を用いてＩＰＴＧおよ
びＸ　−ＧＡＬ　　を含有する軟寒天中にプレートされ
たコンビタントな（受容能を有する）　Ｋ、　ｃｏｌｉ
　ＢＭＨ７］　−１８を形質転換する。この形質転換を
数回繰り返す。

最終的には５４１個の組換えファージ（白色プラーク）
が存在する。

Ｋ、ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１−１８の培養物ｌ　ｒｎｌず
つを用いて各々を５個のプラークで感染させる。沈殿す
る鉢させる。１３１個のファージ上清のうち２個が両方
のプローブ分子に対し陽性信号を示す。それらファージ
を、２リツトル容の培養液がらそれらの複製型（二本鎖
ＤＮＡ　）として個別に調製する。それら組換・えファ
ー：）ＤＮＡの制限分析は、いずれの陽性Ｍ　１３クロ
ーンとも同じ挿入部を有しＫＣＯＲＩ切断部位を予測さ
れた位置に有することを示している（第７図参照）。こ
れら２個のＭ　１３クローンの一方を以後の実験に用い
、そしてｐＷＨ１３０１と称する。

Ｍ　１３法（文献２７　参照）　Ｋ　ヨルｐｗａ　１３
０１（７）　ＤＮＡ配列決定は、トリプシン切断よシの
断片Ｆ　４２の啄ブチド配列と合致する転写解読枠を示
す（第７表）。

これら配列決定結果は、第６ａおよび６ｂ図のムタロタ
ーゼ遺伝子について仮定された制限地図を確認するもの
である。何故なら見出された配列は事実Ｂｃｔｌ切断部
位を含んでいるからである（第Ｖ表参照）。

すなわち、クローンｐＷＨ１３１８およびｐＷＨ１３１
９、およびＩ）ＷＨ１３０１は全体として、アシネトバ
クタ−・カルコアセテカス（ＤＳＭ　３０００８　）よ
りの完全なムタロターゼを含有する（第５図、第６図お
よび第７図参照）。

実施例６ ムタロターゼ遺伝子の全配列を含む発現プラスミドの構
築 使用発現プラスミドはプラスミドｐＷＨ７旧である。こ
れは、プラスミドｐＵＲ２５０（文献間参照）よりのポ
リリンカーがＥｃｏ　ＲＩおよびＨｉｎｄ［ｌ切断部位
間に挿入されたプラスミドｐＰＬｃ　２３６（文献３２
参照）の容易に入手しうる誘導体である。プラスミドｐ
ＷＨ’　７０１は強力なλ−ＰＬプロモーターを含有す
る（第８図、黒矢印参照）。

以後のクローニング工程は、すべて、λ−ＰＬプロモー
ターがＣＩリプレッサーにより抑制されているホスト細
菌Ｆ！、　ｃｏｌｉ　Ｗ５　（文献３２参照）で行われ
る。ｐＰＬｃ　２３６、λ−ＰＬプロモーターおよびホ
スト微生物Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｗ　５はヨーロツ・Ｑ特許
出願第０．０４１，７６７号明細書にも開示されている
。

組換えプラスミドｐＷＨ１３１９よりのＤＮＡ　２０μ
２を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍおよびＳｃａ　
ｌで切断し、そして５％ポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動にかける。次いでそのポリアクリルアミドゲルか
ら５７４ｂｐの大きさの断片を溶出する。

発現プラスミドｐＷＨ７０１よりのＤＮＡ　ｔｏμ７を
制限エンドヌクレアーゼＫｃｏ　ＲＩで切断し、そして
突出末端をｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの存在下にＫｌｅｎ
ｏｖポリメラーゼで埋める。そのＫｌｅｎｏｗ　ｆ：リ
メラーゼを反応混合物を（３）°Ｃで５分間加熱するこ
とにより失活させ、次いでエタノール沈殿全行ツタ後、
かく得られたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄ
ｌＩＩで切断する。この切断で得られた３１　ｂｐの大
きさの断片を３チポリアクリルアミドデルでの電気泳動
により除去する。

このようにして調製されたプラスミドＤＮＡ２００Ｍ、
および前述の如く単離された５７４　ｂｐの大きさのＤ
ＮＡ断片２００Ｍを共に連結しそしてＥ。

ｃｏｌｉＷ５の形質転換に用いる。このようにして得ら
れた形質転換体のプラスミドを前述の如きアガロースゲ
ルでの迅速分析により調べる。これにより、組換え発現
プラスミド分子は、挿入のない発現プラスミドよりも大
きい分子量を有していることがわかる。

組換え発現プラスミドの一方を以後の実験に用い、また
ＰＷＨ１３０７と称する。それを制限エンドヌクレアー
ゼＨｉｎｄＬＩＩおよび５ａｔＩで切断しそして前述の
如くゲルから溶出する。次に、組換えファージＤＮＡ　
ｐＷＨ１３０１を同じく制限エンドヌクレアーゼＨｉｎ
ｄ［ｌおよび５ａｔｉで切断する。これにより得られる
１４００　ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を前述の如くゲル
から溶出する。　　　゛次いで、ｐＷＨ１３０１よυの
１４００　ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、発現プラスミ
ドｐＷＨ１３０７の大きなＨｌｎｄｌｌｌ　−５ａｔＩ
断片に挿入する。連結、形質転換および所望の連結生成
物の同定は、組換え発現プラスミドｐＷＨ１３０７の構
築に従って行われる。

このようにして得られる本発明の新しい組換え発現プラ
スミドはｐＷＨ１３７２と称され、そして以後の発現に
用いられる。

第８図は、組換え発現プラスミドの構築概略図を示す。

実施例７ この遺伝子の配列をＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの
方法により決定した。配列決定手法を第■表に示す。　
　　　　　第■表 図中の垂直線は、配列決定のために放射性標識の置かれ
た制限部位を示す。矢印は、配列を読み得る範囲を示す
。

Ｓｅａ　ＩおよびＨｉｎｄｌ１部位間の配列はｐＷＨ１
３１８およびｐＷＨ１３７２で決定した。２個のＲｓａ
　■部位間の配列は、ｐＵＲ２５０（文献路参照）にク
ローニング後決定した。

そのヌクレオチド配列は、第１０図に示されたＤＮＡ配
列に相当する。そのＤＮＡ配列は、Ｎ−末端アミノ酸配
列により決定されるコド／の上流にシグナル配列が存在
することを示している。

従って、組換え発現プラスミドｐＷＨ１３７２より形成
され、そして酵素ムタロターゼの生物学的活性を有する
ポリペブチｒのアミノ酸配列は第１１図に示されるもの
である。

実施例８ Ｅ、ｃｏ１１株次５９　（Ｅ、　ｃｏユ１Ｋ１２△Ｈ１
）を本発明による新しい組換えプラスミドｐＷＨ１３７
２で形質転換する。ホスト細菌のこの株は熱不安定リプ
レッサーＣ工８５７をコードする座位をその染色体上に
含む。従って、この菌株では、λ−ＰＬプロモーターに
より制御される転写は、３２°Ｃでは完全に抑制される
が４０°Ｃでは、熱不安定リプレッサーＣ工８５７がこ
の温度では不活性な形にあるために、抑制されない。

典型的な発現手順では、２００　ｍｌのＬＢ培地（１０
ＳＦ　／　ｔＯ’ｒｒｙｐｔｏｎｅ、８２／ｌのＮａＣ
ｔ、５２／ｌの酵母エキス、ｐＨ７，８）を、Ｋ、　ｃ
ｏｌｉ　５９　／ｐＷＨ１３７２の一夜培養液３　ｒｎ
ｌで接種し、そして、菌体密度が０．６８０Ｄとなるま
で路°Ｃで培養を続ける。次いで培養液を水浴中４０°
Ｃで振盪器中で更に振盪する。次いで菌体を破砕した後
に、ムタロターゼ活性を検出する。

１　ｍｌの菌体培養液を遠心分離し、そして菌体を１０
０μｔの破砕緩衝液（５Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ
−、ｐＨ８，０、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５〜８％　
ｔｒｉｔｏｎ　）に再懸濁する。１０μＬのリソチーム
（２５ｍ？　／　ｍｌ　、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ＨＯ２，ｐＨ３，Ｑ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中）を添加後
、菌体を四°Ｃで１０分間、および４５°Ｃで５分間イ
ンキュベートする。次に菌体を遠心分離し、そして上清
のムタロターゼ活性を調べる。測定される６０００Ｕ／
ｌ（培地）という発現は、振盪フラスコ中での細菌アシ
ネト／ｌフタ−の発現の約６０倍を超える。

菌株Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｎｎ　６９　／　ｐＷＨ１３７２
（ＤＢＭ　３４４２　）は培地１ｔあたり約２０ｍＶの
ムタロターゼを形成する。工業的規模での発酵に至適化
すれば、発現ムタロターゼの収量は、上記の値に比べ３
〜５０倍に設定することができる。

実施例９ Ｅ、ｃｏｌｉ　で発現されたムタロターゼの精製および
分析 第９図に示されるように、産生ムタロターゼの約９０４
は培地中に存在する。

培地ｌｔ中のタンパク質を９０％硫酸アンモニウムで沈
殿させ、再懸濁し、２０　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ，／に２Ｈ
ＰＯ。

（ｐＨ９，０）に対し透析し、そしてＣＭ　−５ｅｐｈ
ａｄｅｘカラム（１ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ　）に吸着する
。実施例１に記載されているものと同じ塩条件を用いて
溶出を行い、ムタロターゼを５Ｑ　ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ，
／　ＫＨ２ＰＯ。

（ｐＨ９，０）でカラム材料から放出される。第４表は
精製スキームをまとめたものである。精製工程の前およ
び後でのムタロターゼの純度は、ＳＤＳデルのトラック
ＭＵＴおよびＰから明白である（第９図）。ここではタ
ン、ｅり質の測定にＢｒａｄｆｏｒａ法を用いた。

（Ｕ）　　（Ｕ／ＴＩＮ？）　　　（Ｗｉ）　　　（チ
）培地　　４７００　　ＮＤ　　ＮＤ　　１００硫酸ア
ンモニウム沈殿　　４６９０　　　６９　　　　６８　
　　　９９透析　　２８００　５４　５２　６０ ＣＭ−８ｅｐｈａａｅｘ　　　　２４００　　２００　
　　　１２　　　　５２１回の沈殿工程および１回のカ
ラムクロマトグラフィによる精製工程により１ｔの培地
から１２■のタン・ｑり質が単離される。比活性は、ア
シネトバクタ−・カルコアセチカスから単離さレタムタ
ロターゼのそれよりも約１４ｑ６低い。Ｅ。

ｃｏｌｉから単離された産生物は、変性ポリアクリルア
ミドゲルで測定した場合、４０　ｋＤａの分子量を有す
る。この分子量は、アシネトバクタ−・カルコアセチカ
スから単離されたタフ　、ｅり質のそれに合致する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ培地から単離されたムタロターゼのＮ−
末端アミノ酸の配列決定により、この調製によりＮ−末
端配列が、次のとおり、すなわち、Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇ４
ｙである均質生成物が得られたことがわかった。

それら２つの生成物のＮ−末端アミノ酸は一致する。し
かしながら７位にはセリンがあるのに対し、アシネトバ
クター・カルコアセチカスからのムタロターゼは、この
位置にプロリンを有する。

次の性質は、Ｒ，ｃｏｌｉ　で発現されたムタロターゼ
およびアシネトバクタ−・カルコアセチカスで発現され
たムタロターゼについて類似している。

１、比活性の相違はわずか約１４％にすぎない。

２、それら２種類のタン・♀り質は、変性ポリアクリル
アミドゲルにおいて同じ分子量を有する。

３、いずれのタンパク質も２０　ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ，／
ＫＨ２ＰＯ。

（ｐＩ（９，０）でＣＭ　−５ｅｐｈａａｅｘ　　イオ
ン交換体材料に結合する。

４、それら２種類のタン、Ｑり質ば、同じアミノ酸組成
を有する。

５、それら２種類の夕／・？り質は、同じＮ−末端配列
を有する。

６、いずれのタン・Ｑり質も内膜を通過する。しかしな
がら、ムタロターゼは、Ｅ、ｃｏｌｉにおいてのみ培地
中に放出される。

このことは、目的生成物がＥ、　ｃｏｌｉ　において発
現されうることを実証するものである。比較可能な条件
下において、Ｅ、ｃｏｌｉ菌株は、最初に用いられたア
シネトバクタ−・カルコアセチカスよ、９５０〜１００
倍も多くのムタロターゼを産生ずる。Ｅ、ｃｏｌｉから
は、生成物を精製工程をより少くして調製することがで
きる。

８照用文献 １．　　Ｚａｂｅａｕ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔ
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　Ｒ，Ｂ、、　Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｈ，Ｍ、、　ａｎｄ
　Ｂｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｗ。

（１９７４）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、貝、　　１２３５
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　ａｎｄ　Ｗｅｌｌｓ、　Ｒ，Ｄ、　　（１９７５）Ｎ
ａｔｕｒｅ　２５７，４２１−４２２１９、　　Ｈａｒ
ｄｉｅｓ、　Ｓ、Ｃ，、Ｐａｔｉｅｎｔ、　Ｒ，に、、
　　Ｋｌｅｉｎ、　　Ｒ，Ｄ、、　Ｈｏ、　Ｅ、ＩＲｅ
ｚｎｉｋｏｆｆ、　Ｗ、Ｓ、、　ａｎｄ　Ｗｅｌｌｓ、
　Ｒ，Ｄ、　　（１９７９）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ　２５４，５５２７−５５３４２０、　　Ｍｅ
ｓＳｉｎｇ、　Ｊ＋（１９８３）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、　１０１．２０−７８２１、　　Ｍａｘａｍ、
　Ａ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　　（１９８
０）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５．４９９−５
８０２２、　　Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、、　５ｃｈ
ｏｌｄ、　Ｍ、、　Ｊｏｈａｎｓｏｎ、　Ｍ、Ｊ、。

Ｄｅｍｂｅｄ、　Ｐ、、　ａｎｄ　Ｉｔａｋｕｒａ、　
Ｋ、　（１９８１）、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ、９．３６３７−３６５６２３、　　Ｗａｌｓｅｔ
ｈ、　Ｔ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、
　（１９７９）Ｂｉｏｃｂｔｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾
ｃｔａ　５２６．１１−３１２４、　　Ｗｅｉｎｓｔｏ
ｃｋ、　Ｒ，、Ｓｗｅｅセ、　Ｒ＋、　Ｗｅｉｓｓ、　
Ｍ＋、　Ｃｅｄａｒ、　Ｈ，、ａｎｄＡｘｅｌ、　Ｒ，
（１９７８）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５゜２５、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、
　Ｅ−Ｍ、　　（１９７５）Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、
　９８．５０３−５１７２６、　　Ｗａｈｌ、　Ｇ、Ｍ
、、　５ｔｅｒｎ、　Ｍ、、　ａｎｄ　５ｔａｒｋ、　
Ｇ、Ｒ，（１９７９）Ｐｒｏｃ、　　Ｎａａｌ、　八ｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　ヱ６．　３６８３−
３６８７２７、　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｃｒｅ
ａ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｈ，（１９８
１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．　：
３０９−３２１２Ｂ、　Ｒ１１ｔｈｅｒ、肌（１９８２
）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０．５７
６５−５７７２２９、　５ｏｂｅｒｏｎ、　Ｃ，、Ｃｏ
ｖｅｒｒｕｂａｉｓ、　Ｌ、、　ａｎｄ　Ｂｏｌｉｖａ
ｒ、　Ｆ、　　（１９８０）Ｇｅｎｅ　９，２Ｂ？−３
０５ ３０、Ｂｏｌｉｖａｒ、　　Ｆ、、　Ｒｏｄｒｉｑｕｅ
ｚ、　　Ｒ，Ｌ、、　Ｇｒｅｅｎｅ、　　Ｐ、Ｊ、。

Ｂｅｔｌａｃｈ、　Ｍ、Ｃ，、Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ、　
Ｈ，Ｌ−、ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ、　Ｎ、Ｗ。

（１９７７）、　Ｇｅｎｅ　２．９５−１１３３１　５
ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、（１９７８）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、シ２７２１−２７２８３２、
　　Ｒｅｍａｕｔ、　Ｅ、、　５ｔａｕｓｓｅｎｓ、　
Ｐ、、　ａｎｄ　Ｆｉｅｒｓ、　Ｗ、　（１９８１）Ｇ
ｅｎｅ　　１５，８１−９３ ３３、　　Ｂｅｒｎａｒｄ、　Ｈ，Ｕ、　ａｎｄ　Ｈｅ
１ｉｎｓｋｉ、　Ｄ、Ｒ，（１９７９）Ｍｅｔｈ、　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ−６８，４８２−４９２３４、Ｗｉｎｎａ
ｃｋｅｒ、　Ｅ、Ｌ、　　（１９８５）、　Ｇｅｎｅ　
ｕｎｄ　Ｋｌｏｎｅ。

ｖｃＨ−ｖｅｒｉａｇ

【図面の簡単な説明】

第１図は、ムタロターゼの精製において、ＳＤＳゲル電
気泳動による図である。 レーン１：粗製抽出液； ｖ　−７’ｌ　：　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　ＩＱＱでの
クロマトグラフィ後； レ−７３：　ＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　　でのりＯ’
？トグラフイ後； レーン４：ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィ
後； レーンＳ：分子量標準 第２図は、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｂ　ｔｏおよび−Ｐ３Ｑを通
してのデル濾過による臭化シアン断片の分離を示すグラ
フであり、Ｍｕｔは未切断物質を示し、またＣＢＩ−５
は、タン、ｅり質内臭化シアン断片の配列を示し、ＣＢ
４は、１１個のアミノ酸を有しく第４図参照）、従って
小さすぎて溶出時には検出されない。 第３図は、逆相高速液体クロマトグラフィによるトリプ
シン切断よシの滅ブチドの分離を示すグラフであシ、 第３ａ図は、Ｐ　１０カラムでのＣＢ　５　ｃｒ）　Ａ
ＲＧ　Ｃ断片の溶出クロマトグラムを示す。 第４図は、ムタロターゼポリ啄ブチドお↓び部分ホリハ
ブチド配列の配列決定手法を表わす図であり、アミノ酸
は一文字コードで示されている。“★”はアミノ酸が未
規定の位置を示している。臭化シアン、トリプシンまた
はエンドプロテイナーゼＡＲＧ　Ｃによる切断によって
生成させた啄ブチドをＣＢ、ＦまたはＡＲＧと称した。 Ｆ４２の位置は構造遺伝子の配列が決定されるまでは決
まらなかった。 第５図は、組換えシラスミｒｐｗＨ１３１８およびＰＷ
Ｈ１３１９の制限地図である。組換えプラスミドｐＷＨ
１３１９は、１５００１）ｐの大きさで構造遺伝子のＮ
末端部分を含むｐＷＨ１３１８よりのＨｉｎｄｌｌｌ断
片をｐＢＲ３２２に挿入することにより得た。 第６ａ図は、ムタロターゼ遺伝子およびその側部の制限
地図を示す図であり、白抜き（ｕｎ−ｓｈａｄｅｄ　）
ゾーンは、第５ａ図（プラスミドｐＷＨ１３１９）にお
ける白抜きゾーンと同じ領域を示す。 矢印は、ムタロターゼ遺伝子のｓ／　　３／方向を示し
ている。この領域は、１５００ｂｐの大きさのＨｉｎｄ
ｍ断片を含み、そしてオリゴヌクレオチド混合物Ｉと・
・イブリッド形成する。 第６ｂ図は、１５００　ｂｐの大きさを有し、ｋｔ１切
断部位の近位に位置するＨｉｎｄＩ］Ｉ切断部位の下流
にあり、そしてゲノムＤＮＡの分析（トータルＤＮＡプ
ロット）の際にオリゴヌクレオチド混合物■とハイブリ
ッド形成するＨｉｎｄ［ｌ断片を示す図である。下線を
施した領域は、第６ａ図に示されるＤＮＡ断片との重複
部を示す。図示された２個のＤＮＡ断片は、この重複領
域のだめに相互にハイブリダイズする。 第７図は、Ｍ１３　ｍｐｌｌり０−　ンｐＷＨ１３旧の
制限地図を示す図である。 第８図は、組換え発現プラスミドｐＷＨ１３７２の構築
概略図を示す。 第９図は、培地からの酵素ムタロターゼの生物活性を有
するポリ啄ブチドの後処理の結果を示す図である。単一
のクロマトグラフィ工程で、ＥＩＩＩＳゲル上、ムタロ
ターゼ中に不純物が全く検出され得ない程の純度が得ら
れる。 Ｌ／　−：ｙ　「Ｍｕｔ　Ｊ　　：培地より（ＮＨ４）
２６Ｏ４テ沈殿させた後： ｖ　−ン「Ｐ　ｊ　　：　ＣＭ−８ｅｐｈａｄｅｘでの
クロマトグラフィ後： レーン「Ｓ」　：標準の目盛定め用タン・Ｑり質。 第１０図は、アシネトバクタ−・カルコアセチカス（Ｄ
ＳＭ　３０００８　）よりのムタロターゼ遺伝子のＤＮ
Ａ配列を示す図である。 第１１図は、ＰＷＨ１３７２の発現産生物のアミノ酸配
列を示す図である。 特許出願人　メルク・／Ｑテント・ゲゼルシャフト・ミ
ツト・ペシュレンクテル・ハフソング化　理　人　弁理
士　　南　　　　孝　　夫　１−０−・　： 図面の；）Ｑ＜６各に変更なし） 第　　９　　　図 のΣ ４ｋＤａ− ＦＩＧ、２ 画分査号 ＦＩＧ、３ 時間（分） ＦＩＧ、　３Ｑ ■分番号 ＦＩＧ、５ ｎ）　　　　　　　　　　ｂ） ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ｐＷＨ＋３０１ ＦＩＧ、８ ｐＷＨ１３７２ 画面の浄丑（内容に変更なし） 第　　　１　　　図 ５１２３４　　Ｓ ゛　　　”′：□　　　□／／／′　　　　　　　　　
　’＃Ｊ　−６５ｋＤ。 ６、−４Ｌ　しＣ○ 、−，’４　ン）・′ｊ 必　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　り密ＦＩＧ、１０ ＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＣＴＩＴＣＣ
：ＧＴＣＴＡＣ声＋ＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣ入ＡＡＴＣ
ＡＡＡＣＴｒＡＴＡＡＣＡＧＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴ
ＴＡＡＧＴＴτＣｒＣＴＣ＋Ｔ”：ＣλＡＡＡＡ手続補
正書（方式） 昭和６２年７月１４日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２０６０８６号 ２、発明の名称 アシネトバクタ−・カルコアセチカスからの酵素ムタロ
ターゼの製造のためのＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ分子お
よび方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 （ｆ　所　　ドイツ連邦共和国Ｄ−６１００ダルムシュ
タット、フランクフルチル、シュトラ−上２５０名称　
メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミツト・ベシュレ
ンクテルパハフッング４、代理人 住所　東京都千代田区１町３丁目２番地相互第一ビル 電話　（２６５）９６４９ （発送日：昭和６１年１１月２５日） ６、補正の対象　　　図面（第１図、４図および９図）
及び明細書の図面の簡単な説明の欄 ７、補正の内容 １１図面 １）図面第１図を添付の第１図（写真）と差し換えます
。 ２）図面第４図を添付の第４図と差し換えます。 ３）図面第９図を添付の第９図（写真）と差し換えます
。 １！１図面の簡単な説明 １）明細書７５頁３行の「図である。」の記載を「図に
代る写真である。」と訂正します。 ２）同７８頁１行の「示す図である。」の記載を「示す
図に代る写真である。」と訂正します。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプ
   チドをコードする 【遺伝子配列があります】 よりなるＤＮＡ配列。 ２、ムタロターゼ−生成性微生物または哺乳動物のゲノ
   ムに由来しそして酵素ムタロターゼの生物学的活性を有
   するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ
   配列。 ３、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）
   属の微生物のゲノムに由来することを特徴とする、特許
   請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ４、アシネトバクター・カルコアセチカス （Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉ
   ｃｕｓ）ＤＳＭ３０００７、ＤＳＭ３０００８、ＤＳＭ
   ３００１０またはＤＳＭ３００１１の株のいずれかのゲ
   ノムに由来することを特徴とする、特許請求の範囲第３
   項記載のＤＮＡ配列。 ５、特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のＤＮ
   Ａ配列とハイブリダイズし、また突然変異により特許請
   求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のＤＮＡ配列に関
   連付けられ、そして酵素ムタロターゼの生物学的活性を
   有するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮ
   Ａ配列。 ６、特許請求の範囲第１〜５項に記載のＤＮＡ配列を含
   むクローニング用組換えＤＮＡ分子。 ７、発現制御配列に機能的に接続された特許請求の範囲
   第１〜５項のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むことを
   特徴とする組換えＤＮＡ分子。 ８、発現制御配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモータ
   ーシステムである特許請求の範囲第７項記載の組換えＤ
   ＮＡ分子。 ９、寄託番号ＤＳＭ３４４３Ｐを有するＰＷＨ１３７２
   と称されるプラスミドおよびその突然変異体。 １０、特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の組
   換えＤＮＡ分子の少くとも一つで形質転換されているこ
   とを特徴とするホスト生物。 １１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする
   、特許請求の範囲第１０項記載のホスト生物。 １２、寄託番号ＤＳＭ３４４２を有する大腸菌（Ｅ．ｃ
   ｏｌｉ）ＷＨ１３７２と称される特許請求の範囲第１０
   または１１項記載のホスト生物およびその突然変異体。 １３、酵素ムタロターゼの生物学的活性を有し、【遺伝
   子配列があります】 よりなるアミノ酸配列を有するポリペプチド。 １４、特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のＤ
   ＮＡ配列によりコードされていることを特徴とする、酵
   素ムタロターゼの生物学的活性を有するポリペプチド。 １５、微生物を栄養培地で培養しそして発現により形成
   されたポリペプチドを単離することにより酵素ムタロタ
   ーゼの生物学的活性を有するポリペプチドの製造方法で
   あつて、使用微生物が特許請求の範囲第５〜７項のいず
   れかに記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換されたホスト
   生物であることを特徴とする前記製造方法。 １６、アルドースの酵素反応速度を高めるための、特許
   請求の範囲第１３または１４項記載のポリペプチドの使
   用。