JPH0787791B2 - デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター - Google Patents

デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター

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JPH0787791B2
JPH0787791B2 JP5282983A JP28298393A JPH0787791B2 JP H0787791 B2 JPH0787791 B2 JP H0787791B2 JP 5282983 A JP5282983 A JP 5282983A JP 28298393 A JP28298393 A JP 28298393A JP H0787791 B2 JPH0787791 B2 JP H0787791B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換ＤＮＡ技術の分野に
関し、そして遺伝子操作が行われた真核細胞によるトロ
ンビン阻害剤デスルファトヒルジンの製造方法、この遺
伝子操作が行われた真核細胞、デスルファトヒルジンの
遺伝子を担持するハイブリドベクター、並びに上記真核
細胞および上記ハイブリッドベクターの製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒルジンは天然にはヒルすなわちヒルド
・メディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
ｉｓ）中に存在する抗凝血物質である。ヒルジンは単一
の蛋白質種ではなく、少なくとも３種の、ヒルジン変形
体１（ＨＶ１）、ヒルジン変形体２（ＨＶ２）（欧州特
許出願第１５８，５６４号明細書を参照されたい）およ
び「デス−（Val ）2 −ヒルジン」（欧州特許出願第１
５８，９８６号明細書を参照されたい）と命名された成
分から成っている。
【０００３】これ等の変形体は構造が互いに幾つかのア
ミノ酸において異なっている（特にＨＶ１のＮ−末端配
列がVal-Val-Tyr であり、ＨＶ２のＮ−末端配列がIle-
Thr-Tyr であり、「デス−（Ｖａｌ）2 −ヒルジン」の
Ｎ−末端配列がThr-Tyr である）が、Ｎ−末端の疎水性
アミノ酸、Ｃ−末端の極性アミノ酸、スルフェート・モ
ノエステルとして存在するチロシン残基（Tyr63 ）、３
個のジスルフィド・ブリッジおよび抗凝血活性を共通に
有する。
【０００４】Ｋｉ値（複合体解離定数）が６×１０-11
Ｍであるヒルジンは、既知の最も強力なトロンビン阻害
剤であり、トロンビンへの特異的な親和性を特徴とす
る。血液凝固カスケードのその他の酵素は、ヒルジンに
よって阻害されない。通常の抗凝血治療における好まし
い抗凝血剤であるヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直
接にトロンビンに対して阻害作用を行い、前者とは異な
りアンチトロンビンIIIを介して作用するものではな
い。精製したヒルジンの唯一の薬理学的に検出し得る効
果は、血液凝固の阻害と血栓症の予防である。
【０００５】犬に静脈内に投与した場合には、多量に投
与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板数、フィブリノ
ーゲンおよびヘモグロビンに対する効果は観察されなか
った。ラット、豚および犬での試験では、ヒルジンは、
（鬱血によってまたはトロンビンの注射によって誘発さ
れる）実験的血栓症、内毒素ショックおよびＤＩＣ（散
在性脈管内凝血）において有効であることが証明されて
いる。直接比較試験を行った場合には何時でも、ヒルジ
ンはヘパリンよりも優れていることが証明されている。
また、ヒルジンの毒性は極めて低く、非抗原性であり且
つ生物学的に活性な形で腎臓からのほぼ完全なクリアラ
ンスを示す。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ヒルジンはかなり以前
から知られてはいたが、その優れた生物学的特性から期
待される広汎な治療的利用は未だ達成されていない。そ
の極端に限定された入手可能性は、医薬における広汎に
使用する上での重要な欠点である。従来は、ヒルジン製
剤は本質的には天然物質（ヒル抽出液）から得られてお
り、入手には費用が掛かり且つ困難であり、またこの方
法は時間が掛かり且つ費用が掛かる分離および精製法を
用いている（Ｐ．ＷａｌｓｍａｎｎらのＰｈａｒｍａｚ
ｉｅ、第３６巻、６５３頁（１９８１年）；欧州特許出
願第１５８，９８６号明細書を参照されたい）。
【０００７】アミノ酸配列が６５と比較的長いという観
点からも、従来のペプチド合成では経済的理由から成功
の望みが少ない。それ故、ヒルジンの治療効果の詳細な
臨床試験及びその広汎な抗凝血治療での使用を可能にす
る適当な量のヒルジンを製造するには、新規な方法を用
いなければならない。
【０００８】かかる方法は、特に組換ＤＮＡ技術によっ
て提供される。この技術によれば、非常に多種の生理学
的に活性なポリペプチドは対応する遺伝学的に変性され
た宿主生物を培養することによって製造することが可能
である。これに関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸
化されるデスルファトヒルジンを介してヒルによって製
造されるものといわなければならない。ヒル以外の宿主
は特異的なスルフェート転移酵素系を欠いており、それ
ゆえヒルジンではなくデスルファトヒルジンを生成する
ものと予想される。
【０００９】しかしながら、対応するヒルジン蛋白質の
Tyr ６３残基のフェノール性ヒドロキシルからのスルフ
ェート基の酵素による除去によって得られるデスルファ
トヒルジンタンパクによって明らかなように、その生物
活性はスルフェート基の不在によっては損なわれない
（欧州特許出願第１４２，８６０号明細書を参照された
い）。
【００１０】近年に公開された欧州特許出願第１５８，
５６４号明細書には、それぞれのデスルファトヒルジン
変形体のための構造遺伝子を含有するプラスミドで形質
転換されＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によるデスルフ
ァトヒルジン変形体１および２、並びにそれ等の類似体
の製造が開示されている。培養されたＥ．コリ細胞の細
胞抽出液によって測定され且つ抗トロンビン単位（「Ａ
ＴＵ」）量で与えられる抗凝血活性は、３，０００〜
４，０００ＡＴＵ／ＯＤ600 ／Ｌ培養液であり、これは
（純粋なヒルジン１mgの理論的比活性を１５，０００〜
２０，０００ＡＴＵとして）０．２mgヒルジン／ＯＤ／
Ｌの濃度に相当する。
【００１１】形質転換されたＥ．コリ細胞から得られる
低収率のヒルジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の
不正確な折り畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不
活性な形で蓄積されることに起因するものと考えられ
る。正確な折り畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジ
ン分子内の３個のジスルフィドブリッジの形成によるも
のである（Ｐ．Ｗａｌｓｍａｎｎらの上記文献を参照さ
れたい）。
【００１２】その他の天然に分泌される哺乳類の蛋白
質、例えば子牛の成長ホルモン、ヒトの組織プラスミノ
ーゲン活性化因子およびヒトγ−インターフェロンも、
微生物の細胞質中に生産され且つ蓄積された場合には本
質的には不活性である〔Ｒ．Ａ．Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、第２２９巻、１２１９頁（１９８５年）を参
照されたい〕。ジスルフィドブリッジを有するほとんど
の蛋白質は細胞外性であるので、その分泌経路はジスル
フィド結合の形成に有利であろう。分泌を非常に好まし
くするその他の特徴がある。
【００１３】すなわち、分泌された蛋白質は、一般的に
細胞内に蓄積された生成物よりも容易に検出され且つ精
製され、所望の生成物が培地中に分泌されることによ
り、生成物を回収するために宿主生物を破壊する必要が
なく；幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対して毒性効果
を有し、分泌されると、それ等は正状な細胞機能を余り
妨害しなくなり；分泌された蛋白質は、細胞の崩壊時に
蛋白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積された蛋白
質よりもこれ等の酵素によって消化されにくい。
【００１４】ほとんどの分泌される蛋白質は、成熟アミ
ノ酸配列に付随するアミノ末端伸長部としてのシグナル
ペプチドを有するプレ蛋白質としてＤＮＡ上にコードさ
れている。シグナルペプチドは、小泡体（ＥＲ）の膜中
への蛋白質の翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な
役割を演じる。シグナルペプチダーゼはＥＲの管腔側で
早期にシグナルペプチドを開裂させる。外側細胞膜への
その後の輸送はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白
質はペリプラズム空間（例えば、酸性ホスファターゼ、
インベルターゼ）中へも、または培地（例えばα−ファ
クター、キラー・トキシン）中へも分泌される。
【００１５】総ての真核生物は遺伝情報を発現しそして
発現された蛋白質を分別する機構を共有すると思われる
ので、真核生物宿主ではＥ．コリよりもはるかに効率的
に真核遺伝子の発現が進行する。真核生物の中では、酵
母が最初に操作され且つ培養されるようになったもので
ある。多数の異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてき
た。しかしながら、付加されたシグナルペプチドの場合
を除き、媒質中に効率的に分泌させることができる蛋白
質の本質的な特徴を定義することは今までのところは不
可能であった。
【００１６】それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かにつ
いて確実に予測することは可能になっていない。例え
ば、（プレーグルコアミラーゼについての遺伝子情報を
有する）形質転換された酵母によって産生される総グル
コアミラーゼの９０％は培地中に分泌され（特許協力条
約に基づく特許出願第８４／２９２１号明細書）、高力
価の表皮成長因子（ＥＧＦ）が付随するαファクター・
シグナルペプチドを有するＥＧＦの遺伝子を含む培養酵
母の培地中に見い出されるが（欧州特許出願第１１６，
２０１号明細書）、β−エンドルフィン（α因子シグナ
ルペプチド、特許協力条約に基づく特許出願第８４／４
３３０号明細書）、真核生物のインターフェロンＡ（イ
ンベルターゼシグナルペプチド、欧州特許出願第１２
７，３０４号明細書）、
【００１７】ヒトγ−インターフェロン、ヒト血清アル
ブミン、ウシインターフェロンα１およびα２、組織プ
ラスミノーゲン活性化因子、レニンおよびヒトインシュ
リン様成長因子（α−ファクター・シグナルペプチド、
欧州特許出願第１２３，５４４号明細書）、白血球イン
ターフェロンＤおよびＡ、γ−インターフェロンおよび
ヒト成長ホルモン（ＭＧＨ）（それぞれインターフェロ
ンおよびＭＧＨシグナルペプチド、欧州特許出願第８
８，６３２号明細書）は少量または痕跡量しか培地中に
検出されず、形質転換された酵母では、シュドモナス・
カルボキシペプチダーゼＧ2 （ＣＰＧ2 ）〔Ｇ2 （ＣＰ
Ｇ2 ）シグナルペプチド、欧州特許出願第１２１，３５
２号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子
（ＰＨ０５シグナルペプチド、欧州特許出願第１４３，
０８１号明細書）の媒質中への分泌は見られない。
【００１８】したがって、付随のシグナルペプチドを有
する所定の蛋白質が酵母によって分泌されるか否かは予
測不可能であり、結局のところ選択される蛋白質によっ
て異る。また、付随のシグナルペプチドを有するヒルジ
ンの様な選択された蛋白質が酵母のような形質転換され
た宿主生物によって少なくともある程度まで分泌される
かどうかについては、不確実であった。
【００１９】驚くべきことには、デスルファトヒルジン
の構造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディ
ングフレームが合っているシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡを含有する真核宿主生
物によって、ヒルジン活性を有する蛋白質が倍地中に分
泌されることが見い出された。
【００２０】本発明の目的は、真核宿主生物においてヒ
ルジン活性を有する蛋白質の生産および分泌のための方
法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、
デスルファトヒルジンの構造遺伝子及びその上流にあり
そしてそれとリーディングフレームが合っているシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するハイブリ
ッドベクター、並びに上記ハイブリッド・ベクターによ
り形質転換された真核宿主生物を提供することである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】具体的な説明 １．デスルファトヒルジンの製造法。 本発明は、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であ
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡ
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るＤ
ＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタンパクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
【００２２】「成熟デスルファトヒルジンをコードする
ＤＮＡ配列」という用語は、ヒルゲノムに存在すること
が知られており、そして／または上記ゲノムから分離す
ることができる、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコ
ードする総ての構造遺伝子、例えば、成熟デスルファト
ヒルジン変形体ＨＶ１，ＨＶ２，ＰＡ、およびデス−
（Val ）2 −デスルファトヒルジン（ＨＶ１遺伝子の発
現の単なる人工産物ではない場合）の構造遺伝子を包含
することを意図する。「成熟デスルファトヒルジン」と
いう用語は、プレ−配列およびプロ−配列を欠いている
デスルファトヒルジンを指す。
【００２３】「ヒルジン活性を有する蛋白質」とは、ト
ロンビン阻害作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を
有し、そしてデスルファトヒルジンの一次構造を有する
分泌宿主細胞から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸
化の様な修飾がなされた対応するヒルジン化合物、およ
び短縮されたそれ等の誘導体、例えばＣ−末端の１〜７
個のアミノ酸を欠いているデスルファトヒルジンである
と理解すべきである。上記の蛋白質は、具体的には次の
式（Ｉ）：
【００２４】
【化１】
【００２５】〔式中、Ｘはジペプチド残基Val-Val-（Ｈ
Ｖ１）またはThr 〔デス−（Val ）2−ヒルジン〕であ
り、そしてＲはTyr のフェノール性ヒドロキシル基また
は式−Ｏ−ＳＯ3 Ｈで表わされる基である〕、で表わさ
れる蛋白質、並びにＣ−末端アミノ酸Gln ，Ｃ−末端ジ
ペプチド−Leu −Gln ，Ｃ−末端トリペプチド−Tyr
（Ｒ）−Leu −Gln またはＣ−末端テトラペプチド−Gl
u −Tyr （Ｒ）−Leu −Gln を欠いている誘導体；ある
いは、次の式（II）：
【００２６】
【化２】
【００２７】（ＨＶ２）（式中、Ｒは上記定義の通りで
ある）で表わされる蛋白質；あるいは、ヒルジンＰＡと
命名され、ヒルによって産生され（Ｊ．Ｄｏｄｔ、博士
論文、ミュンヘン大学、西ドイツ、１９８４年）、そし
て次の式（III ）：
【００２８】
【化３】
【００２９】（ＰＡ）（式中、Ｒは上記定義の通りであ
る）で表わされるもう一つのヒルジン変形体である。ヒ
ルジン活性を有する好ましい蛋白質は、式Ｉ（但し、Ｘ
は残基Val-Val-であり、ＲはTyr のフェノール性ヒドロ
キシル基である）を有する蛋白質、およびＣ−末端にお
いてアミノ酸が１〜７個、特に１〜４個だけ短縮されて
いるその誘導体である。
【００３０】好適な真核宿主生物は、高等生物、特に、
哺乳類の細胞、特にＶＥＲＯもしくはＨｅｒａ細胞また
はチャニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）セルラインの
ような樹立されたヒトまたは動物セルラインおよびサッ
カロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母である。本発
明の好ましい宿主生物は、酵母、特にサッカロミセス・
セレビシエーの株である。
【００３１】上記ＤＮＡ配列を有する真核宿主生物、特
に酵母は、当業界において既知の方法を用いて培養され
る。本発明により形質転換された酵母株は、資化可能な
炭素源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で
培養される。
【００３２】各種の炭素源が利用できる。好ましい炭素
源の例は、グリコース、マルトースまたはラクトースの
ような資化性炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢
酸塩であり、単独でまたは適当な混合物として用いるこ
とができる。好適な窒素源としては、例えばカザミノ酸
のようなアミノ酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等
の分解生成物、例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エ
キス、更に酵母エキス、マルトエキス、コーンスティー
プリカー、あるいはアンモニウム塩、例えば塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあ
り、単独でもまたは適当な混合物としても用いられる。
【００３３】使用することができる無機塩には例えば、
ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウム
の硫酸塩、塩化物、リン酸塩および炭酸塩がある。ま
た、培地は成長促進物質を含んでいてもよい。成長を促
進する物質には、例えば鉄、亜鉛、マグネシウムなどの
ような痕跡量の元素またはアミノ酸がある。
【００３４】自律複製プラスミド、例えば酵母２μプラ
スミドＤＮＡ（後記）で形質転換された酵母細胞は、導
入されたハイブリッドプラスミドを、種々の程度で失い
やすい。このため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、
すなわち増殖のためにプラスミドにコードされた遺伝子
の発現を要する条件下で生育させねばならない。一般に
用いられ、そして本発明のハイブリッドベクターに存在
するほとんどの選択マーカー（後述）は、アミノ酸また
はプリン生合成の酵素をコードする遺伝子である。
【００３５】これにより、対応するアミノ酸またはプリ
ン塩基を欠いている合成最少培地を用いることが必要に
なる。しかしながら、適当な殺生物剤に対する耐性を付
与する遺伝子（例えば、シクロヘキシミド、アミノグル
コシドＧ４１８、重金属などに対する耐性を付与する遺
伝子）も同様に用いられる。抗生物質耐性遺伝子を有す
るベクターで形質転換された酵母細胞を、対応する抗生
物質を含む複合培地中で生育させることにより、増殖速
度を速め、細胞密度を高くする。
【００３６】染色体に組み込まれるＤＮＡにより形質転
換された酵母細胞は、選択的増殖条件を必要としない。
これ等の形質転換細胞は十分に安定であり、選択圧なし
で増殖を行うことができる。これらの細胞は、複合培地
中で有利に増殖する。構成的プロモーター（例えばＡＤ
ＨＩ，ＧＡＰＤＨ）を有するハイブリッドプラスミドを
含む酵母細胞は、誘導なしに上記プロモーターによって
制御されたデスルファトヒルジン遺伝子を発現する。
【００３７】しかしながら、このデスルファトヒルジン
遺伝子が調節されるプロモーター（例えばＰＧＫまたは
ＰＨ０５）の制御下にある場合には、ｍＲＮＡ転写物の
水準を最高にするような増殖培地の組成を採用しなけれ
ばならない。すなわち、ＰＨ０５プロモーターを用いる
ときには、増殖培地はこのプロモーターを抑制解除する
ための低濃度の無機リン酸塩を含んでいなければならな
い。
【００３８】培養は、常用技術を用いることによって行
う。温度、培地のpHおよび醗酵時間のような培養条件
は、最高水準のデスルファトヒルジンが産生されるよう
に選択される。選択された酵母株を、約２５℃〜３５
℃、好ましくは約３０℃の温度で、４〜８のpH値、例え
ば約７のpHで、約４〜約２０時間、好ましくは最大収量
の蛋白質が得られるまで、振盪または攪拌を行いなが
ら、好気性条件下で液内培養で生育させるのが好まし
い。
【００３９】意外なことには、宿主生物および使用され
るシグナルペプチドとは無関係に、ほとんどの産生され
たヒルジン化合物は培地中に分泌され、極一部分だけが
細胞に結合したまま残ることが見い出された。分泌され
た化合物／細胞に結合した化合物の正確な比率は、醗酵
条件および用いた回収法によって変化する。一般的に
は、その比率は約９：１以上になる。したがって、分泌
されたヒルジンが常に圧倒的な割合を占める。
【００４０】ヒルジン化合物は、通常の方法によって培
地から分離することができる。例えば、第一の段階は、
遠心分離によって細胞を培地から分離することにある。
生ずる上澄液をポリエチレンイミンで処理して大部分の
非蛋白質性物質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウ
ムまたはトリクロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を
沈澱せしめることによって、ヒルジン化合物の濃度を高
くする。宿主蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性に
することによって（例えば、０．１％，pH４〜５）それ
を沈澱させることもできる。酢酸上澄液をｎ−ブタノー
ルで抽出することによって、ヒルジン化合物の濃度を更
に高くすることができる。
【００４１】他の精製工程は、例えば、脱塩、イオン交
換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、分配
クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィ法
などのクロマトグラフィ法である。混合物の成分の分離
は、透析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法による荷
電に従って、適当なセファデックスカラムによる分子サ
イズに従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用いるア
フィニティークロマトグラフィにより、あるいは適当な
担体に結合したトロンビンを用いるアフィニティークロ
マトグラフィにより、あるいはその他の方法、特に文献
公知の方法によって行うこともできる。
【００４２】細胞に結合しているヒルジン化合物、すな
わち細胞内またはペリプラズマ空間に蓄積した化合物を
も分離することが所望ならば、幾つかの補足的精製工程
を必要とする。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している
場合には、目的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞
内部から蛋白質を遊離させることである。ほとんどの処
理においては、最初に、グルコシダーゼ（後述）を用い
る酵素的消化によって細胞壁を取り除く。次いで、生成
するスペロプラストをＴｒｉｔｏｎのような洗剤で処理
する。
【００４３】また、剪断力（例えば、Ｘ−プレス、フレ
ンチ−プレス）またはガラス玉との振盪のような機械的
力も、細胞を破壊するのに好適である。ヒルジン化合物
が宿主、特に酵母細胞によってペリプラズマ空間中に分
泌される場合には、単純化された方法を用いることがで
きる。すなわち、蛋白質は、細胞壁を酵素的に除去する
ことにより、または化学的薬剤、例えばチオール試薬も
しくはＥＤＴＡを用いて処理し、細胞壁に損傷を与えて
産生した蛋白質が放出されるようにすることによって、
細胞を溶解することなく回収される。
【００４４】意外なことには、「成熟デスルファトヒル
ジンをコードするＤＮＡ配列」に対応するデスルファト
ヒルジン化合物とは別に、予想される化合物とはＣ−末
端においてアミノ酸が１〜４個欠けている点において異
なる幾つかのその他のデスルファトヒルジン化合物を培
養液から単離することができることが見出された。例え
ば、デスルファトヒルジン変形体ＨＶ１をコードする遺
伝子を有する酵母細胞を培養すると、この化合物と共
に、Ｃ−末端アミノ酸Gln を欠いているデスルファトヒ
ルジン化合物〔デス−（Gln65 ）−デスルファトヒルジ
ン〕、Ｃ−末端のジペプチド残基-Leu-Glnを欠いている
デスルファトヒルジン化合物〔デス−（Leu64 ，Gl
n65 ）−デスルファトヒルジン〕、
【００４５】Ｃ−末端のトリペプチド残基-Tyr-Leu-Gln
を欠いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−（Ty
r63 ，Leu64 ，Gln65 ）−デスルファトヒルジン〕、お
よびＣ−末端テトラペプチド残基-Glu-Tyr-Leu-Glnを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−（Gl
u62 ，Tyr63 ，Leu64 ，Gln65 ）−デスルファトヒルジ
ン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの化合物は、
一次発現生成物デスルファトヒルジンの（部分的）蛋白
質分解的な分解によって形成されたものと思われ、用い
た酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関係に、総て
の培溶液中に置いて同定された。
【００４６】デス−（Gln65 ）−デスルファトヒルジ
ン、デス−（Tyr63 ，Leu64 ，Gln65）−デスルファト
ヒルジン〕、およびデス−（Gln62 ，Tyr63 ，Leu64 ，
Gln65）−デスルファトヒルジンは新規であり、そして
やはり本発明の目的である。抗ヒルジン抗体または抗デ
スルファトヒルジン抗体（例えば、ハイブリドーマ細胞
から得られるモノクローナル抗体）を用いる試験、トロ
ンビン試験〔Ｍ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ監修、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ、第II巻、３１４〜３１６頁、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅ
ｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（西ドイツ）、１９８３
年〕、または凝血試験〔Ｆ．Ｍａｒｋｗａｒｄｔら、Ｔ
ｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、第４７巻、２２６頁
（１９８２年）〕を用いてヒルジン活性を検出すること
ができる。
【００４７】本発明の方法によってえられるヒルジン化
合物は、それ自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ
変換することができる。例えば、式（Ｉ）〜（III ）の
化合物（但し、ＲはTyr のフェノール性ヒドロキシル基
である）は硫酸二ナトリウムのような硫酸塩および例え
ばヒル細胞からえられるチロシンスルホトランスフェラ
ーゼと反応させて、式（Ｉ）〜（III ）（但し、Ｒは式
−ＯＳＯ3 Ｈで表わされる基である）を有する化合物へ
変換することができる。
【００４８】得られたデスルファトヒルジン化合物、例
えばデスルファトヒルジン変形体ＨＶ１を、例えば好適
なカルボキシペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダ
ーゼＹの作用によってＣ−末端において１〜７このアミ
ノ酸を欠いている誘導体へ変換することも可能である。
本発明によって形質転換された真核宿主生物は、次の工
程を含んで成る組換ＤＮＡ技術によって調製することが
できる。すなわち、
【００４９】◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファ
トヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームがあっている
シグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成
るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを有す
るＤＮＡ配列とを含有するＤＮＡ造成物を調製し； ◎上記ＤＮＡ造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し； ◎調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し；そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する；工程を含んで成る。
【００５０】２．シグナルペプチドおよびデスルファト
ヒルジンのコード領域を含んで成るＤＮＡ造成物 本発明は、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤ
ＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るＤＮＡ配列と含有するＤＮＡ造成物に関する。
【００５１】シグナルペプチドおよびデスルファトヒル
ジンをコードするＤＮＡ配列の発現を制御するために数
種類の発現制御配列を用いることができる。詳細には、
形質転換される宿主の高度に発現される遺伝子の発現制
御配列が用いられる。哺乳類の細胞に用いるには、発現
制御配列は好ましくはウイルスに由来する。例えば、哺
乳類の細胞に用いるのに好適な発現制御配列は、シミア
ン・ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ
４０）の初期および後記プロモーター、ワクシニアプロ
モーター、ＨＴＬＶプロモーター、またはポリオーマも
しくはアデノウイルス２に由来するプロモーターであ
る。
【００５２】本発明による最も好ましい宿主生物である
酵母の発現制御配列は、酵母、特にサッカロミセス・セ
レビシエーのゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高
度に発現される酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファ
トヒルジンの発現のために用いられる。
【００５３】例えば、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩまたは
ＡＤＨII遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝
子、イソチトクロームｃ遺伝子のプロモータ、あるいは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデ
カルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセ
レートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフェ
ートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよ
びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはａ−
またはα−ファクターをコードする酵母に適合するフェ
ロモン遺伝子のプロモーターを用いることができる。
【００５４】一つの酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡ
Ｓ）ともう一つの酵母遺伝子の機能性ＴＡＴＡボックス
を含有する下流プロモータ要素とを含んで成るハイブリ
ッドプロモーター、例えば酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳ
と酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含
有する下流プロモーター要素とを含有するハイブリッド
プロモーターを用いることもできる。
【００５５】本発明の好ましいベクターは、転写調節を
伴うプロモーターを含有する。この型のプロモーター、
例えばＰＨ０５遺伝子のプロモーターおよびＰＨ０５−
ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターは、増殖条件を変
えることによってターンオン又はターンオフすることが
できる。例えば、ＰＨ０５プロモーターは、単に培地中
の無機リン酸塩の濃度を増減させることによって、自由
に抑制したりまたは抑制を解除したりすることができ
る。本発明の他の好ましいプロモーターは、ＧＡＰＤＨ
遺伝子のプロモーター、特にヌクレオチド−３００〜−
１８０、特にヌクレオチド−２６３〜−１９９から始ま
り、そしてＧＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド−５で終了
する機能性フラグメントである。
【００５６】シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列 （「シグナル配列」）は、真核細胞性の、例えば酵母の
通常に分泌されるポリペプチドをコードする遺伝子から
得られる。好適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノム
ＤＮＡから得られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナ
ル配列、例えば酵母インベルターゼ、ａ−ファクター、
α−ファクター、フェロモンペプチダーゼ、「キラート
キシン」および抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）
遺伝子のシグナルおよびプレプロ配列、並びにアスペル
ギルス・アワモリからのグルコミラーゼシグナル配列で
ある。
【００５７】また、融合シグナル配列は（存在するとす
れば）用いるプロモーターに天然に結合している遺伝子
のシグナル配列の部分をヒルジンシグナル配列の部分に
連結することによって造成することができる。これらの
組み合わせは、シグナル配列と成熟デスルファトヒルジ
ンアミノ酸配列との間で正確に開裂できるものが好まし
い。追加の配列、例えば特異的なプロセシングシグナル
を担持するか又は担持しないプロ配列又はスペーサー配
列をも造成物中に含めることによって前駆体分子の正確
なプロセシングを容易にすることもできる。
【００５８】また、生体内または生体外での適切な成熟
を可能にする内部プロセシングシグナルを含有する融合
蛋白質を生成させることができる。例えば、プロセシン
グシグナルは、Lys-Arg 残基を含有し、これはゴルジ体
膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼによって認識さ
れる。本発明の好ましいシグナル配列は、次の式：Met
Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Le
u Ala Asn Ala 、で表わされるシグナルペプチドをコー
ドする酵母ＰＨ０５遺伝子のシグナル配列、および次の
式： Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
【００５９】成熟デスルファトヒルジンをコードするＤ
ＮＡ配列は、具体的には上記定義のデスルファトヒルジ
ンの構造遺伝子から選択される。好ましいＤＮＡ配列
は、デスルファトヒルジン変形体１（ＨＶ１）をコード
し、そして次の式：
【００６０】
【化４】 で表わされる。
【００６１】真核性の転写停止シグナルを有するＤＮＡ
配列は、好ましくは転写停止およびポリアデニル化のた
めの適当なシグナルを含有する真核性の遺伝子の３′−
フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列である。好適な
３′−フランキング配列は、例えば用いられる発現制御
配列に天然に結合している配列である。酵母が宿主生物
として用いられる場合には、好ましいフランキング配列
は酵母ＰＨ０５遺伝子の配列である。好ましくは、本発
明のＤＮＡ造成物は、クローニングベクターへの造成物
挿入及びクローニングを可能にする合成デオキシヌクレ
オチドリンカーを両端に備えている。
【００６２】真核性発現制御配列、シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列、成熟デスルファトヒルジンをコ
ードするＤＮＡ配列および真核性転写停止シグナルは互
いに作用可能に連結される。すなわち、それらの正常な
機能が維持されるように併置される。すなわち、この配
置においては、発現制御配列がシグナルペプチド−デス
ルファトヒルジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転
写停止シグナルが転写およびポリアデニル化の適切な停
止を行い、そしてデスルファトヒルジンの分泌が起るよ
うにシグナル配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結
合される。
【００６３】したがって、好ましくは、発現制御配列お
よびシグナル配列が異なる遺伝子に由来するものである
ときには、発現制御配列は大ｍＲＮＡ開始部位と発現制
御配列に天然に連結されている遺伝子のＡＴＧとの間で
シグナル配列に結合している。シグナル配列は、翻訳開
始のためのそれ自身のＡＴＧを有するべきである。これ
らの配列は、好ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配
列を有することができる合成オリゴデオキシヌクレオチ
ドリンカーによって連結されている。他方、シグナル配
列の最後のコドンはデスルファトヒルジンの遺伝子の最
初のコドンに直接連結される。
【００６４】本発明のＤＮＡ造成物は、当業界において
公知の方法、例えば真核性発現制御配列、デスルファト
ヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成る
ＤＮＡセグメント、および真核性転写停止シグナルを含
有するＤＮＡ配列を、ＤＮＡセグメントの適切な発現と
生成したデスルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物に
おいて行われるような態様で連結することにより調製さ
れる。
【００６５】各種ＤＮＡ配列を連結して本発明のＤＮＡ
造成物を形成する場合、この連結は平滑末端連結によっ
て、または適当な共通の制限部位によって、あるいは合
成リンカー分子を介して、正確な連結が生じてこれらの
ＤＮＡ配列の正常な機能が維持されるように特別の注意
を払いながら行う。すなわち、シグナル配列およびデス
ルファトヒルジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合
させることができる。シグナル配列とデスルファトヒル
ジン遺伝子とを正しく連結するためのもう一つの方法に
おいては、可能ならば、シグナル配列をその３′末端近
くで制限酵素切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝
子をその５′末端近くで制限酵素切断して各配列が所定
数の塩基対を欠くようにする。
【００６６】次に、制限切断されたシグナル配列と制限
切断されたデスルファトヒルジン遺伝子とを連結用オリ
ゴデオキシヌクレオチドを介して連結した場合に、欠損
した塩基対が修復されてデスルファトヒルジン遺伝子が
シグナル配列に関して適切なリーディンフレームになる
ように、合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを造
成することができる。
【００６７】デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ
配列はヒルのゲノムＤＮＡから単離することができ、ま
たは相補的二本鎖デスルファトヒルジンＤＮＡ（デスル
ファトヒルジンｄｓ ｃＤＮＡ）をデスルファトヒルジ
ンｍＲＮＡから調製するか、またはデスルファトヒルジ
ンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を化学的または酵
素的方法によって調製することができる。例えば、それ
自体公知の方法によって、ゲノム性デスルファトヒルジ
ンＤＮＡ、およびデスルファトヒルジンｄｓｃＤＮＡが
得られる。
【００６８】例えば、ゲノム性デスルファトヒルジンＤ
ＮＡは、デスルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺
伝子バンクから、ヒルＤＮＡフラグメントを微生物中で
クローン化し、デスルファトヒルジンＤＮＡを含有する
クローンを、少なくとも１５個の、好ましくは１５〜３
０個のデオキシヌクレオチドを含有する放射性ラベル化
デスルファトヒルジンＤＮＡ−特異的オリゴデオキシヌ
クレオチドを用いるコロニーハイブリダイゼーションに
よって同定することによって得られる。得られるＤＮＡ
フラグメントは、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の
他に不所望のその他のＤＮＡ成分を含むが、これらは適
当なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処
理することによって除去することができる。
【００６９】二本鎖デスルファトヒルジンｃＤＮＡは、
例えば、ヒルジンを産生するように適切に誘導された適
当なヒルの細胞からｍＲＮＡを分離し、それ自体公知の
方法で、生成するｍＲＮＡ混合物中のデスルファトヒル
ジンｍＲＮＡを濃縮し、このｍＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡ
を調製する場合の鋳型として用い、こうしてＲＮＡ依存
性のＤＮＡポリメラーゼによってｄｓ ｃＤＮＡを合成
し、これを適当なベクター中にクローン化することによ
って調製することができる。デスルファトヒルジンｃＤ
ＮＡを含むクローンは、例えば上記の方法で、放射性物
質の標識を有するデスルファトヒルジンＤＮＡ特異的オ
リゴデオキシヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダ
イゼーションによって同定される。
【００７０】デスルファトヒルジン遺伝子は、化学的合
成によっても製造することができる。この方法は、上記
遺伝子のコード鎖および相補鎖のセグメントを化学的に
合成して、生成するセグメントを酵素的にデスルファト
ヒルジンの構造遺伝子へと変換することを特徴とする。
ＤＮＡの化学的合成は、当業界において周知であり、常
用技術を用いる。適当な方法は、Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第３９巻、３頁、１９８３
年）によってまとめられている。詳細には、欧州特許第
１４６，７８５号明細書記載の方法が用いられ、詳細は
上記明細書を参照されたい。同様な方法でシグナル配列
は化学的合成によって調製することができ、または適当
な真核生物の染色体ＤＮＡから単離することもできる。
【００７１】３．シグナルペプチドおよびデスルファト
ヒルジンのコード領域を有するＤＮＡ造成物を含むハイ
ブリッドベクター 本発明によれば、真核性発現制御配列と、成熟デスルフ
ァトヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から
成るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上の
ＤＮＡインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
【００７２】本発明のハイブリッドベクターはハイブリ
ッドプラスミドおよび線状ＤＮＡベクターからなる群か
ら選択され、そして更に形質転換しようとする宿主生物
に依存して選択される。本発明は特に、真核性発現制御
配列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二の
ＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそれとリーディン
グフレームが合っているシグナルペプチドをコードする
第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであって上
記発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の
転写終止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれ
が含有する１個以上のＤＮＡインサートを含んで成る線
形ＤＮＡベクターであって、上記発現制御配列と上記転
写停止シグナルを含んで成る配列とが同じ真核細胞の遺
伝子に由来する上記ベクターに関する。
【００７３】特に、本発明は、酵母ＰＨ０５プロモータ
ー、上記ＤＮＡセグメントおよびＰＨ０５の３′フラン
キング領域を含んで成る線状ＤＮＡベクターに関する。
相同な３′フランキング配列および５′フランキング配
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状ＤＮＡベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母ＰＨ０５プロモ
ーターおよび酵母ＰＨ０５遺伝子の３′フランキング配
列の場合には、酵母染色体IIのＰＨ０５座に組み込まれ
る。
【００７４】本発明はまた特に、発現制御配列、上記Ｄ
ＮＡ配列、および転写停止シグナルを含む配列とは別
に、プロモータの機能、すなわちデスルファトヒルジン
遺伝子の発現には本質的ではないかまたは余り重要でな
いが、例えば上記ハイブリッドプラスミドで形質転換し
た細胞の増殖においては重要な機能を行うＤＮＡ配列を
有するハイブリッドプラスミドに関する。この追加のＤ
ＮＡ配列は、原核生物および／または真核生物の細胞に
由来するものでもよく、染色体ＤＮＡ配列および／また
は染色体外ＤＮＡ配列を含有するものでもよい。
【００７５】例えば、この追加のＤＮＡ配列はプラスミ
ドＤＮＡ、例えば細菌または真核生物のプラスミドＤＮ
Ａ、ウイルスのＤＮＡ、および／または染色体ＤＮＡ、
例えば細菌、酵母または高等真核生物の染色体ＤＮＡに
由来する（またはこれらから成る）ものでもよい。好ま
しいハイブリッドプラスミドは、細菌性プラスミド、特
にＥ．コリプラスミドｐＢＲ３２２、または関連するプ
ラスミド、バクテリオファージλ、酵母２μプラスミド
および／または酵母染色体ＤＮＡに由来するＤＮＡ配列
も含む。
【００７６】本発明による好ましいハイブリッドプラス
ミドにおいては、これらの追加のＤＮＡ配列は酵母複製
開始点および酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵
母複製開始点、例えば自律複製セグメント（ａｒｓ）を
含有するハイブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母
細胞内で染色体外に維持され、有糸分裂の際に自律複製
する。酵母２μプラスミドＤＮＡと相同な配列を有する
ハイブリッドプラスミドも、同様に用いられる。これら
のハイブリッドプラスミドは組換によって既に存在して
いる２μプラスミドに組み込まれ、または自律複製を行
う。
【００７７】酵母の選択遺伝子マーカーについては、マ
ーカーの表現型発現により形質転換体の選択を容易にす
るものであれば、いかなるマーカー遺伝子をも用いるこ
とができる。酵母に好適なマーカーは特に、抗生物質耐
性を発現するものであるか、または栄養要求酵母変異株
の場合には、宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対
応する遺伝子は、例えば抗生物質のシクロヘキサミドに
対する耐性を付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例
えばＵＲＡ１，ＵＲＡ３，ＡＲＧ４，ＵＥＵ２，ＨＩＳ
４，ＨＩＳ３，ＴＲＰ５またはＴＲＰ１遺伝子に原栄養
性を付与する。
【００７８】本発明のハイブリッドプラスミドに存在す
るその他のＤＮＡ配列はまた、細菌宿主、特にＥ．コリ
の複製開始点および選択遺伝子マーカーを含有するのが
有利である。酵母ハイブリッドプラスミド中にＥ．コリ
複製開始点およびＥ．コリマーカーが存在することに関
連する有用な特徴がある。第一に、Ｅ．コリにおける増
殖及び増幅により多量のハイブリッドプラスミドＤＮＡ
を得ることができ、第二に、Ｅ．コリに基礎を置くクロ
ーン化技術の全レパートリーを用いてＥ．コリ中でハイ
ブリッドプラスミドを便利に造成することである。
【００７９】ｐＢＲ３２２などのＥ．コリプラスミド
は、Ｅ．コリ複製開始点、並びに例えばテトラサイクリ
ンおよびアンピシリンのような抗生物質に対する耐性を
付与するＥ．コリ遺伝子マーカーを含み、酵母ハイブリ
ッドベクターの一部分として有利に用いられる。酵母お
よび細菌宿主（上記参照のこと）の複製開始点および遺
伝子マーカーを含有する追加のＤＮＡ配列は、これ以後
は「ベクターＤＮＡ」と称し、特に発現制御配列および
デスルファトヒルジン遺伝子を含む上記ＤＮＡ造成物と
共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成している。
【００８０】本発明のハイブリッドベクターは１個以上
のＤＮＡインサートを含有し、これらのインサートのそ
れぞれは特に、発現制御配列、シグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列、および成熟デスルファトヒルジンを
コードするＤＮＡ配列を含有するであろう。ハイブリッ
ドベクターが複数のＤＮＡインサート、好ましくは２〜
４個のＤＮＡインサートを含有する場合には、これらは
縦列（ｔａｎｄｅｍ）に並んでいてもよくまたはハイブ
リッドベクターの異なる部位に存在することもできる。
好ましいハイブリッドベクターは１個のＤＮＡインサー
トまたは縦列（ｔａｎｄｅｍ）に並んだＤＮＡインサー
トを含む。ＤＮＡインサートは、特に頭対尾に配置され
る。
【００８１】本発明によりハイブリッドプラスミドは、
当業界において公知の方法で調製される。ハイブリッド
ベクターの調製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟
デスルファトヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及
びその上流にありそしてそれとリーディングフレームが
合っているシグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ
配列から成るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配
列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写停止シグ
ナルを含有するＤＮＡ配列とを含有する１個又は複数個
のＤＮＡ造成物をベクターＤＮＡに導入するか、あるい
は上記ＤＮＡ造成物の構成成分を所定の順序でベクター
ＤＮＡ中に逐次的に導入することから成っている。本発
明のハイブリッドプラスミドは常用の連結技術を用いて
造成される。プラスミドの成分は、共通の制限部位を介
して、および／または合成リンカー分子により、および
／またはブラント末端連結によって連結される。
【００８２】本発明の線形ＤＮＡベクターは、本質的に
第２節に記載のＤＮＡ造成物に対応し、そして同様な方
法で調製される。
【００８３】４．形質転換された真核宿主生物 本発明のもう一つの観点は、真核生物の発現制御配列
と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のＤＮ
Ａ配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフ
レームが合っているシグナルペプチドをコードする第一
のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであって上記発
現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写
停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含
有する１個以上のＤＮＡインサートを含んで成るハイブ
リッドベクターで形質転換された真核生物およびそれら
の変異株に関する。
【００８４】好適な真核宿主生物は、特に上記のもので
あり、特に、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピヒア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サッ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シツオサ
ッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属および
関連の属（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ，Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ、
アムステルダム、１９７１年を参照されたい）であり、
特にサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株がある。
【００８５】形質転換された真核宿主細胞は、真核生物
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列と
をそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡインサートを含
んで成るハイブリッドプラスミドで形質転換され真核宿
主生物、並びに宿主の染色体に安定に組み込まれた上記
ＤＮＡインサートを有する真核宿主生物から選択され
る。
【００８６】上記形質転換された真核宿主生物の製造法
は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファトヒル
ジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にあり
そしてそれとリーディングフレームが合っているシグナ
ルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮ
Ａセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下に
あるものと、真核生物の転写停止シグナルを含んで成る
ＤＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡイ
ンサートを含んで成るハイブリッドベクターにより真核
宿主生物を形質転換することを含んで成る。
【００８７】真核宿主細胞の形質転換は、当業界におい
て知られている方法によって行われる。例えば、酵母の
ハイブリッドベクターを用いる形質転換は、Ｈｉｎｎｅ
ｎらの記載の方法により行うことができる〔Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，．，ＵＳＡ、第７５巻、
１９２９頁（１９７８年）〕。この方法は、３段階に分
けることができる。
【００８８】（１）カタツムリ消化管汁〔例えばＧｌｕ
ｓｕｌａｓｅ（登録商標）またはＨｅｌｉｃａｓｅ（登
録商標）〕のような各種グルコシダーゼ製剤、または微
生物から得られる酵素混合物〔例えばＺｙｍｏｌｙａｓ
ｅ（登録商標）〕を、浸透圧的に安定した溶液（例えば
１Ｍソルビトール）において用いる酵母細胞壁またはそ
の部分の除去。 （２）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびＣａ2+
イオンの存在での、ＤＮＡベクターによる「裸の」酵母
細胞（スフェロプラスト）の処理。
【００８９】（３）寒天の固相における細胞壁の再生お
よび形質転換された細胞の選定。この再生は、スフェロ
プラストを寒天中に埋め込むことによって好都合に行わ
れる。例えば、溶融した寒天（５０℃）をスフェロプラ
ストと混合する。溶液を酵母の増殖温度（約３０℃）に
まで冷却することにより固層が得られる。この寒天層は
スフェロプラストからの必須の高分子の速やかな拡散と
損失を防止するためのものであり、それにより細胞壁の
再生が促進される。しかしながら、細胞壁の再生は、予
め形成しておいた寒天層の表面にスフェロプラストをプ
レートすることによっても（効率は低いが）得ることが
できる。
【００９０】再生寒天は、形質転換された細胞の再生と
選定が同時に起るような方法で調製するのが好ましい。
一般的には選択マーカー（上述）としてアミノ酸生合成
経路の酵素をコードする酵母遺伝子が用いられるので、
再生は好ましくは酵母の最少寒天中で行われる。極めて
高効率の再生が必要とされる場合には、次の２段階処理
が有利である。すなわち、（１）高濃度の複合培地中で
の細胞壁の再生、および（２）選択寒天平板上に細胞層
をレプリカプレートすることによる形質転換された細胞
の選定。
【００９１】上記線状ＤＮＡベクターを用いて真核宿主
細胞を形質転換する場合には、形質転換は好ましくは、
酵母の選択マーカーを有する第二のベクターの存在下で
行われる。この同時形質転換によると、直接的には選択
することができないＤＮＡを取り込んだ宿主細胞を濃縮
することができる。コンピテント細胞はいかなる型のＤ
ＮＡをも取り込むので、選択ベクターで形質転換された
細胞はその他のＤＮＡ（例えば上記線形ＤＮＡベクタ
ー）をも高い比率で担持するであろう。
【００９２】形質転換された真核宿主生物、特に形質転
換された酵母株であって、本発明のハイブリッドプラス
ミドを含有するか、または宿主染色体に安定に組み込ま
れたデスルファトヒルジン遺伝子を含んで成る線状ＤＮ
Ａベクターを有するものは、当業界において知られてい
る方法を用いて変異および選択によってデスルファトヒ
ルジンの産生を向上させることができる。突然変異は、
例えば、紫外線照射または適当な化合物によって行うこ
とができる。特に好ましいものは、プロテアーゼを欠損
した変異体、特に酵母変異体であって、細胞内で生成し
たデスルファトヒルジン蛋白質の分解を避けるようにし
たものである。好適な変異体は、常用の手段で選定して
単離することができる。
【００９３】本発明は、特に、デスルファトヒルジン遺
伝子を含有するＤＮＡ造成物、ハイブリッドベクター、
形質転換された真核宿主生物およびそれらの調製法、並
びに実施例に記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋
白質の製造方法に関する。以下の実験の部では、本発明
の各種態様を添附図面に言及しながら説明する。次の実
施例は本発明を説明するためのものであり、発明の範囲
を制限することを意図するものではない。
【００９４】実験の部 実施例に用いた略号の意味は次の通りである。 ＴＮＥ：１００mMＮａＣｌ，５０mMトリス・ＨＣｌ（pH
７．５）および５mMＥＤＴＡを含む溶液、 ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、 ＤＴＴ：１，４−ジチオスレイトール（１，４−ジメル
カプト−２，３−ブタンジオール）、 ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、 ＥｔＢｒ：エチジウムブロミド、 ｔｒｉｓ：トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン、 ｔｒｉｓ・ＨＣｌ：トリス・一塩酸塩。
【００９５】
【実施例】実施例１．保護されたヌクレオシド−ポリス
チレン樹脂 の製造
【００９６】
【化５】 無水コハク酸７５０mgおよび４−ジメチルアミノピリジ
ン９１０mgを、５′−（４−メトキシトリチル）−チミ
ジン（ＭＭＴ−Ｏ−Ｔ−ＯＨ）２．５７ｇ（５ミリモ
ル）を無水ピリジン２０mlに溶解したものに加え、混合
物を室温で１６時間放置する。ピリジン溶液を濃縮した
後、酢酸エチル２００mlに入れ、０．１Ｍリン酸緩衝液
２００mlずつに１０mlの飽和塩化ナトリウム溶液を加え
たもので２回振盪することによって抽出し、飽和塩化ナ
トリウムで再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてヘキサ
ンを滴下して加える。
【００９７】沈澱した生成物を分離して、エーテルと共
に２回すりつぶした後、０℃で０．１Ｍ硫酸水素カリウ
ム（pH２．５）１８０mlと共に振盪して抽出する。水で
２回洗浄した後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾
燥し、濾過して、ピリジン０．５mlを加え、混合物を濃
縮し、ヘキサンを滴下して加えることによって希釈す
る。沈澱したコハク酸誘導体を濾別する。
【００９８】この化合物１．０ｇをＮ−ヒドロキシスク
シンイミド１９０mgと共に酢酸エチル４mlおよびジメチ
ルホルムアミド２mlに溶解し、３７０mgのＮ，Ｎ′−ジ
シクロヘキシルカルボジイミドを０℃で加える。冷蔵庫
に一晩放置した後、沈澱したＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシ
ル尿素を濾別し、濾液を酢酸エチルで希釈し、０．１Ｍ
重炭酸ナトリウムと水で抽出して、乾燥し、真空で蒸発
させて濃縮乾固する。残渣をシリカゲル上で酢酸エチル
によりクロマトグラフ処理する。ＴＬＣ：Ｒf ＝０．４
５（ジクロロメタン／メタノール＝９：１）。
【００９９】このＮ−スクシンイミドイルコハク酸エス
テル（１００mg）を、アミノメチルポリスチレン（１
ｇ、アミン含量１１０μＭ／ｇ）をジクロロメタン２ml
およびジメチルホルムアミド４mlに入れたものと共に２
０時間攪拌する。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルム
アミド、メタノール、ジクロロメタンおよびメタノール
で洗浄することによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリ
ジン６ml中で無水酢酸１mlおよび４−ジメチルアミノピ
リジン１００mgと共に３０分間攪拌することによって、
反応しなかったアミノ基をアセチル化する。
【０１００】ポリマー樹脂を、ジクロロメタン、ジメチ
ルホルムアミド、メタノールおよびジクロロメタンで洗
浄することによって抽出し、恒量に達するまで乾燥す
る。メトキシトリチル（ＭＭＴ）の分光分析によれば５
７μＭ／ｇの付加量である。
【０１０１】実施例２．次の保護されたヌクレオシド／
ポリスチレン樹脂を、実施例１と同様の方法で製造す
る。５′−（４−メトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリ
ル−デオキシグアノシンから。３２μＭ／ｇの付加量。
【０１０２】
【化６】 実施例３．トリヌクレオチドの合成
【０１０３】
【化７】 （ａ）ジヌクレオチドの合成 ５′−（４−メトキシトリチル）−チミジン（ＭＭＴ−
Ｏ−Ｔ−ＯＨ）７．７３ｇ（１５ｍモル）を無水ピリジ
ンと共に蒸発させることによって２回濃縮する。残渣を
無水テトラヒドロフラン２０mlに溶解し、０．２Ｍの２
−クロロフェニル−ジ−（１−ベンゾトリアゾリル）−
ホスフェート／テトラヒドロフラン溶液８０mlに、攪拌
しそして水分を除きながら滴下して加え、反応混合物を
１時間室温で攪拌する。生成する２−クロロフェニル−
１−ベンゾトリアゾリル−５′−（４−メトキシトリチ
ル）−チミジン３′−ホスフェートを３つの部分に分割
する。
【０１０４】（α）トリエチルアンモニウム−２−クロ
ロフェニル−５′−（４−メトキシトリチル）−チミジ
ン３′−ホスフェートへの加水分解 ０．５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム１００mlを上記
２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−
（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフェ
ートの溶液の３分の１に、冷却しながら加える。１５分
後に、ジクロロメタンで抽出を行う。ジクロロメタン溶
液を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しなが
ら加える。生成する沈澱を吸引濾別し、エーテル／石油
エーテル＝１：１で洗浄し、真空で乾燥する。 ＴＬＣ：Ｒf ０．３５（ジクロロメタン／メタノール／
水＝７５：２２：３）。
【０１０５】（β）４−メトキシトリチル保護基の除去
及び２−シアノエチル−２−クロロフェニル−５′−
（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフェ
ートへのエステル化 ２−シアノエタノール１．３mlおよびピリジン２mlを、
２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−
（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフェ
ートの溶液の３分の１に加える。混合物を室温で一晩放
置する。溶媒を真空で留去し、残渣を酢酸エチルに溶解
し、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７）と水で振盪すること
によって繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮し
て、ヘキサンに滴下して加える。
【０１０６】沈澱を濾別して、ジクロロメタン／メタノ
ール（７：３）５０mlに溶解し、０℃でｐ−トルエン−
スルホン酸一水和物３．８ｇをジクロロメタン／メタノ
ール（７：３）７５mlに溶解した溶液を加える。２時間
後、反応溶液をジクロロメタンで希釈して、冷重炭酸ナ
トリウム溶液と共に振盪して抽出する。有機相を濃縮
し、そしてヘキサンを加える。沈澱した２−シアノエチ
ル−２−クロロフェニル−チミジン−３′−ホスフェー
トを、シリカゲル上でジクロロメタン／メタノール（９
６：４）を用いてクロマトグラフ処理する。 ＴＬＣ：Ｒf ０．４５（ジクロロメタン／メタノール＝
９：１）。
【０１０７】（γ）５′−（４−メトキシトリチル）−
３′−シアノエチル−ビス−チミジンジヌクレオチドへ
の縮合 ２−シアノエチル−２−クロロフェニル−チミジン−
３′−ホスフェート２．２ｇを、無水ピリジンで２回蒸
発させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テ
トラヒドロフラン２０mlに溶解して、残りの３分の１の
２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−
（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフェ
ートに加える。
【０１０８】室温にて１８時間後に、水１０mlおよび酢
酸エチル２００mlを、氷冷しながら反応溶液に加える。
有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと水とで洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃縮する。ホ
スフェート残基と５′−および３−末端が保護されたジ
ヌクレオチドを、エーテル／ヘキサン＝１：１に滴下し
て加えることによって沈澱させる。 ＴＬＣ：Ｒf ０．４８（ジクロロメタン／メタノール
９：１）。
【０１０９】（ｂ）トリヌクレオチドの合成 上記の完全に保護されたジヌクレオチド１．１７ｇ（１
ｍモル）をジクロロメタン／メタノール（７：３）３０
mlに氷冷しながら溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸・一
水和物１．９ｇをジクロロメタン／メタノール（７：
３）２０mlに溶解したものを加える。２時間後に、氷冷
した重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタンで抽
出を行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに滴下
して加える。沈澱した遊離の５′−ヒドロキシ基を有す
る粗製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で２〜８％の
メタノール／ジクロロメタンのグラジエントによりクロ
マトグラフ処理する。
【０１１０】ＴＬＣ：Ｒf ０．３３（ジクロロメタン／
メタノール９：１）。 この５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド８５０mgとトリ
エチルアンモニウム−２−クロロフェニル−５′−（４
−メトキシトリチル）−チミジン３′−ホスフェート
１．０６ｇ〔（ａ）（α）節を参照されたい〕をピリジ
ンと共に蒸発させて２回濃縮し、次いで無水ピリジン１
０mlに溶解し、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ
−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）５６０mgを加
える。２時間後に、氷冷水２mlを加え、更に１時間後に
ジクロロメタンを用いて抽出を行う。有機相を飽和の重
炭酸ナトリウムと水とで洗浄し、乾燥して、濃縮し、エ
ーテルを加える。沈澱したトリヌクレオチドを、シリカ
ゲル上でクロマトグラフィによって精製する。 Ｒf ０．４５（ジクロロメタン／メタノール９：１）。
【０１１１】実施例４．実施例３と同様にして、下記の
一般式
【０１１２】
【化８】
【０１１３】を有し、Ｂ1 Ｂ2 Ｂ3 と略記される保護さ
れたトリヌクレオチドを製造する。以下の略号をヌクレ
オシドＢ1 ，Ｂ2 ，Ｂ3 に用いる。すなわち、 Ａ＝Ｎ−ベンゾイル−デオキシアデノシン、 Ｃ＝Ｎ−ベンゾイル−デオキシシチジン Ｇ＝Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシン、 Ｔ＝チミジン。
【０１１４】
【表１】 ａ）シリカゲル上でのジクロロメタン／メタノール９：
１での薄層クロマトグラム。
【０１１５】実施例５．ＤＮＡ鎖９６／９７の第９６番
目の塩基から第１６２番目の塩基までの６７個の塩基の
長さのＤＮＡフラグメントの合成 （ａ）トリヌクレオチドからの２−シアノエチル保護基
の除去 実施例３または４からのトリヌクレオチド１０μモル
を、水分を除いて、ピリジン／アセトニトリル／トリエ
チルアミン（１：１：１）６０μｌに溶解する。室温で
１時間後に過酸化物のないエーテル０．７mlを滴下して
加え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエ
チルアンモニウム塩をピリジン５０μｌに溶解し、エー
テル０．５mlで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で１
５時間乾燥する。
【０１１６】（ｂ）部分的に保護されたトリヌクレオチ
ドとポリスチレン樹脂に結合したオリゴヌクレオチドと
のカップリング 総ての操作を、容量が２２０μｌの反応容器中でマイク
ロプロセッサーで制御して溶媒および試薬を添加するこ
とにより水分を除いて行う。チミジン／ポリスチレン樹
脂（実施例１）１３mg（０．７４μモル）を反応容器に
入れて、次の操作を行う。
【０１１７】１．塩化メチレン、２ml／分、４分間、 ２．塩化メチレン／イソプロパノール（８５：１５）、
２ml／分、２分間、 ３．塩化メチレン／イソプロパノール（８５：１５）中
に臭化亜鉛１Ｍおよび１，２，４−トリアゾール０．０
２Ｍ，２ml／分、２〜３．５分間、 ４．塩化メチレン／イソプロパノール（８５：１５）、
２ml／分、４分間、 ５．０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム／ＤＭＦ，２
ml／分、５分間、 ６．モレキュラーシーブ乾燥ピリジン、２ml／分、３分
間 ７．テトラヒドロフラン（過酸化物なし、モレキュラー
シーブ乾燥）、２ml／分、３分間、 ８．窒素気流、１０分間、
【０１１８】９．１０μモルのトリヌクレオチドＧＴＣ
（（ａ）節からのトリメチレンアンモニウム塩）および
８．９mg（３０μモル）の１−メシチレンスルホニル−
３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）を
１５０μｌのピリジンに溶解したものを注入、 １０．４５℃，２０分間、 １１．ピリジン、２ml／分、４分間、 １２．ピリジン中に無水酢酸５％および４−ジメチレン
アミノピリジン２．５％，２ml／分、４分間、 １３．ピリジン、２ml／分、４分間、 １４．ピリジン／イソプロパノール（１：１）、２ml／
分、３分間。
【０１１９】１４段階の総ての操作を２１回繰り返す
が、９段階目の操作では、ＧＴＣの代わりに次のような
トリヌクレオチドをそれぞれトリエチルアンモニウム塩
〔（ａ）節〕の形で次のような順序で用いる。 GCA,ACC,GAA,CCC,TAC,AGG,TGA,CGC,TAC,CGT,GTG,CCA,AA
A,AAA,TGA,CGG,TGA,TTC,GGG,CCT,CAT. 平均カップリング収率は９７％である。最終生成物は次
のような構造を有する。 MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAA
GGTACCCCGAAACCGCAGTCT- ポリスチレン
【０１２０】（ｃ）担体からのＤＮＡフラグメントの切
り離しおよび保護基の除去 ４０．０mg（約０．６０μモル）のＤＮＡ合成樹脂９６
／６７を、６６mg（０．４０ミリモル）のｏ−ニトロベ
ンズアルドキシムおよび５０μｌ（０．４０ミリモル）
の１，１，３，３−テトラメチルグアニジンを４００μ
ｌの９５％ピリジンに溶解したものと共に５０℃で３時
間および室温で１２時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛
ばして除去した後、残渣に１．６mlのアンモニア水（３
３％）を加え、混合物を閉鎖容器中で５０℃で２４時間
保つ。
【０１２１】分離した液相から真空でアンモニアを除去
し、過酸化物を含まないジエチルエーテルそれぞれ３ml
を用いて３回洗浄する。Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ６カラム〔１
００〜２００メッシュ、３×66cm、０．０１モル重炭酸
トリメチルアンモニウム（pH７．５）１．５ml／分〕上
で低分子量成分を除去した後、２８５ＯＤs （２６０n
m）のＤＮＡが単離される。
【０１２２】６０ＯＤの全量をＨＰＬＣカラム（ＰＲＰ
−１／Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２５０×４．６mm）上で分離
する。グラジエント〔溶液Ａ：０．０５Ｍ酢酸トリエチ
ルアンモニウム（pH７．０）；溶液Ｂ：溶液Ａ／アセト
ニトリル＝１：１〕：３０％Ｂ／Ａ，６０％Ｂ／Ａ，５
０℃および２ml／分で２０分間。親油性の主ピーク（保
持時間、約１４分間）を集め、ＤＥ５２セルロース（Ｗ
ｈａｔｍａｎ）カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエ
タノールで沈澱させる。
【０１２３】４−メトキシトリチル保護基を外すため
に、沈澱を５０μｌの酢酸／Ｈ2 Ｏ（４：１）に溶解
し、室温で４５分間維持する。反応生成物を凍結乾燥
し、エタノールで沈澱させ、そして精製のため８％ポリ
アクリルアミドゲル（７Ｍ尿素）上で電気泳動によって
分離する。所望のＤＮＡの大きさに対応するバンドを切
り取り、生成物を電気溶出し、ＤＥ５２ セルロース上
で濃縮し、下記の構造： ５′-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGA
AGGTACCCCGAAACCGCAGTCT- ３′ を有するＤＮＡ９６／９７をエタノールで沈澱させる。
【０１２４】実施例６．下記のＤＮＡフラグメント
（５′−３′）を、実施例５と同様に製造する。 １／５８ CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCT
GTGCCTGT ４６／６４相補体 CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCG
CACAGGCACAGGTT １５４／６４相補体 CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCG
TTGTGACACTGCGG
【０１２５】実施例７．フラグメント１／５８、相補体
４６／６４、相補体９６／６７および１５４／６５のリ
ン酸化 ５′−末端のリン酸化および放射能標識を、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編集）、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，１９８２
年、１２５頁に記載の方法で〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅ
ｒ）を用いて行う。
【０１２６】実施例８．デュプレックスII（デスルファ
トヒルジンＨＶ１遺伝子のフラグメントＦ2 ）への重合 キナーゼ処理したフラグメント９６／６７およびキナー
ゼ処理したフラグメント１５４／６４それぞれ５０ｐモ
ルを、水２４μｌに溶解し、溶液を９０℃で３分間加熱
し、５分以内に１２℃まで冷却する。
【０１２７】４μｌのエンド−Ｒ緩衝液（０．１Ｍトリ
ス・ＨＣｌ，pH７．５，６６mM ＭｇＣｌ2 ，６６mMの
β−メルカプトエタノール、０．６Ｍ ＮａＣｌ）、１
０μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合物
（dATP, dCTP, dGTP, TTP であって、それぞれ２×１０
-3Ｍで、ＮＨ3 でpH７．０に調整）、および２μｌ（１
０単位）のＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｋｌｅｎｏｗフラグ
メント（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）を添加した後、１２℃で
３０分間インキュベートする。９０℃で３分間加熱して
反応を停止させ、更に処理するまで−８０℃で貯蔵す
る。同様にして、キナーゼ処理されたフラグメント１／
５８および４６／６４を反応させてデュプレックス（デ
スルファトヒルジン遺伝子のフラグメントＦ1 ）を形成
させる。デュプレックスＩおよびIIは、下記の構造を有
する。
【０１２８】
【化９】 およびＦ2 の製造を、下記のスキーム１に示す。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】実施例９．フラグメント１／５８、キナー
ゼ処理した４６／６４、キナーゼ処理した９６／６７、
および１５４／６４の重合および連結；デスルファトヒ
ルジンＨＶ１遺伝子の製造 フラグメント１／５８、キナーゼ処理したフラグメント
４６／６４、キナーゼ処理した９６／６７、および１５
４／６４をそれぞれ５０ｐモルを、水４８μｌに溶解
し、溶液を９０℃で３分間加熱し、５分以内に１２℃ま
で冷却する。８μｌのエンド−Ｒ緩衝液（実施例８参照
のこと）、２０μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェート混合物（dATP, dCTP, dGTP, TTP であって、それ
ぞれ２×１０-3Ｍで、ＮＨ3 でpH７．０に調整）および
２μｌ（１０単位）のＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｋｌｅｎ
ｏｗフラグメント（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）を添加した
後、１２℃で３０分間インキュベートする。
【０１３１】９０℃で３分間加熱して反応を停止させ、
フェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノールで
沈澱させてＤＮＡを単離する。生成するＤＮＡ混合物を
１００μｌのリガーゼ／緩衝液〔６６mMトリス・ＨＣｌ
（pH７．５）６．６mM ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレ
イトール、５mM ATP〕に溶解し、５０単位（２μｌ）の
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、全量を
２０℃で２０時間インキュベートする。
【０１３２】７０℃で５分間加熱することにより、反応
を停止させ、フェノール／クロロホルムで抽出した後、
エタノールで沈澱させることによりＤＮＡを単離する。
混合物を８％ポリアクリルアミドゲル（変性）上で電気
泳動によって分離した後、２１７個の塩基対を有する連
結生成物を電気溶出させ、ＤＥ５２セルロースカラム上
で濃縮し、溶出後にエタノールで沈澱させることによっ
て単離する。デスルファトヒルジン遺伝子は、次のよう
な構造を有する。
【０１３３】
【化１０】 ４個のフラグメントからのデスルファトヒルジン遺伝子
の製造を、下記のスキーム２に示す。
【０１３４】
【表３】
【０１３５】実施例１０．デスルファトヒルジンＨＶ１
遺伝子のＦ1 −ＤＮＡを有するプラスミドｐＭＬ３００
の造成（図１） （ａ）線状化したベクターｐＢＲ３２２／ＥｃｏＲＩ／
ＰｖｕIIの製造 ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（５μｇ）を、５単位の
ＰｖｕII制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を
１００μｇ／mlゼラチンの溶液２００mlとしたもので、
３７℃で１時間消化する。次いで、この溶液を１００mM
のトリス・ＨＣｌ（pH７．５）および５０mMのＮａＣｌ
に調整し、そしてこのＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限エンドヌ
クレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）３０単位で３７℃で２時
間消化する。
【０１３６】次いで、この溶液を５０mMトリス・ＨＣｌ
（pH８）に調整し、１０μｇ／μｌのＤＮＡ濃度におい
て、２単位のウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｒ
ｉｎｇｅｒ）を用いて、３７℃で３０分間インキュベー
トする。この溶液を６５℃で６０分間加熱することによ
って、酵素を不活性化する。次いで、この溶液をＴＮＥ
で標準化して、１容量のフェノールおよびクロロホルム
で抽出し、消化されＤＮＡを−２０℃で２容量のアルコ
ールを用いて一晩沈澱させる。
【０１３７】ｐＢＲ３２２のＤＮＡから切り取られたベ
クター（ｐＢＲ３２２／ＥｃｏＲＩ／ＰｖｕII，２２９
７塩基対）を、１％低融点アガロース（Ｂｉｏｒａｄ）
／トリス−アセテート−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８）上でゲ
ル電気泳動を行うことによって小ＤＮＡフラグメント
（２０６７個の塩基対）から分離する。アガロースゲル
中のＤＮＡをＥｔＢｒで染色した後、ｐＢＲ３２２／Ｅ
ｃｏＲＩ／ＰｖｕIIベクター（＝２２９７塩基対）のＤ
ＮＡバンドを含むゲルの領域をゲルから切り取り、６５
℃で１０分間液化する。
【０１３８】２０容量のＴＮＥをこのＤＮＡ溶液に加え
て、Ｍｕｅｌｌｅｒら、〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第
１２４巻、343 頁、１９７８年〕の方法に準じて、ＤＥ
−５２クロマトグラフィを行ってＤＮＡを精製し、フェ
ノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをアルコールで
−２０℃において一晩沈澱させる。ＤＮＡの沈澱を５０
μｌの０．０１Ｍトリス・ＨＣｌ（pH８），０．１mM
ＥＤＴＡに溶解し、使用するまで−２０℃で貯蔵する。
１．４μｇ（＝３．２ｐモルの末端）のＤＮＡを得る。
【０１３９】（ｂ）Ｆ1 −ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩの製造 化学的に合成されたＦ1 −ＤＮＡ（実施例８を参照）２
４ng（＝１．３ｐモルの末端）を、５０μｌ １００mM
トリス・ＨＣｌ（pH７．５），５０mM ＮａＣｌおよび
１００μｇ／mlのゼラチン中で５単位のＥｃｏＲＩ制限
エンドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃
で３０分間消化する。次に、線状化したベクターｐＢＲ
３２２／ＥｃｏＲＩ／ＰｖｕII（実施例１０ａ）０．０
６μｇ（＝０．１４ｐモルの末端）を溶液に加える。次
いで、酵素を６５℃で加熱することにより１０分後に不
活性化し、溶液をＴＮＥで標準化して、フェノール／ク
ロロホルムで抽出する。沈澱したＤＮＡを、更に処理す
るまで、−２０℃で貯蔵する。
【０１４０】（ｃ）ｐＢＲ３２２／ＥｃｏＲＩ／Ｐｖｕ
IIベクターＤＮＡとＦ1 −ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩとの連結
およびプラスミドｐＭＬ３００の造成 ２個の上記ＤＮＡフラグメントを含有する、実施例１０
（ｂ）で得られたＤＮＡ沈澱を、２０μｌの５０mMトリ
ス・ＨＣｌ（pH，７．８），１０mM ＭｇＣｌ 2 ，１０
mM ＤＴＴ，０．５mM ＡＴＰおよび１００μｇ／１の
ゼラチンの溶液に溶解し、２０単位／μｌＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で１５℃で３時間処理する。
この方法で、Ｆ1 −ＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐ
ＭＬ３００が、溶液中に得られる。
【０１４１】（ｄ）プラスミドｐＭＬ３００を用いる
Ｅ．コリＨＮ１０１の形質転換 形質転換に必要なカルシウム前処理したＥ．コリＨＢ１
０１細胞を、Ｍａｎｄｅｌら〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，第５３巻、１５９頁、１９７０年〕により記載さ
れた方法で調製する。組み換えプラスミドｐＭＬ３００
を含む（ｃ）で得られた溶液を６５℃で１０分間加熱し
て、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを不活性化して、そして次に３
７℃に冷却する。この反応混合物１０μｌを、カルシウ
ム処理したＥ．コリ ＨＢ１０１／１０mM ＭｇＣｌ2
および１０mMのトリス・ＨＣｌ（pH７．５）１５０μｌ
に加えて全量を２００μｌとする。
【０１４２】次いで、この混合物を３０分間氷冷し、４
２℃で２分間加熱した後、Ｌ−培地（実施例１８を参照
されたい）１ml中で３７℃で５０分間放置する。この混
合物を６０μ／mlのアンピシリン（Ｓｅｒｖａ）を含む
５個の寒天平板（ＭｃＣｏｎｋｅｙ Ａｇａｒ，Ｄｉｆ
ｃｏ）上に０．２mlずつ塗布する。次に、寒天平板を３
７℃で１６〜１８時間保持する。形質転換されたＥ．コ
リ ＨＢ１０１の４８４個のアンピシリン耐性コロニー
が得られる。
【０１４３】（ｅ）Ｆ1 −ＤＮＡを含むコロニーのスク
リーニング ４７０個の形質転換されたコロニー（実施例１０ｄ）
を、ニトロセルロースフィルターＢ８５（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）に押圧する。Ｍ．Ｇ
ｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｈｏｇｎｅｓｓ
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、
第７２巻、３９６１頁、１９７９年〕の方法に準じて、
コロニーを溶解し、そして変性したＤＮＡをフィルター
上に固定する。
【０１４４】次いで、フィルターのプレハイブリダイゼ
ーションを、２０ml（フィルター当たり）の４×ＳＥＴ
〔３０mMトリス・ＨＣｌ（pH８），１５０mM ＮａＣｌ
および１mM ＥＤＴＡの溶液〕、０．１％（ｗ／ｖ）Ｆ
ｉｃｏｌ１４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），０．５％Ｓ
ＤＳ，５０μｇ／ml変性したウシ胸腺ＤＮＡ中で６４℃
で４時間行う。次いで、ニトロセルロースフィルターを
２０ml（フィルター当たり）の５×ＳＥＴ（ｗ／ｖ）Ｆ
ｉｃｏｌｌ ４００，０．２％ＳＤＳおよび５０μｇ／
ml変性したウシ胸腺ＤＮＡ中で、32Ｐ放射能標識したプ
ローブ（フィルター当たり約１０3 〜１０4 セーレンコ
フｃｐｍ）を用いて処理する。相補的なオリゴヌクレオ
チド４６／６４（実施例６参照）をプローブとして使用
する。
【０１４５】次いで、フィルターを２×ＳＥＴ，０．２
％ＳＤＳで２回室温で洗浄し、次いで２×ＳＥＴ，０．
５％ＳＤＳで２回６０℃で洗浄する。（最初は３０分
間、次に６０分間）。次に、フィルターを３ＭＭ紙（Ｗ
ｈａｔｍａｎ）の間で乾燥し、−８０℃で強調用スクリ
ーン（Ｉｌｆｏｒｄ）を有するＸ線フィルム（フジ）上
に１〜２日間置く。得られるオートラジオグラムは、そ
の後の処理に用いることができる７１個の陽性のコロニ
ーを示し、その一つをｐＭＬ３００と命名する。
【０１４６】実施例１１．デスルファトヒルジンＨＶ１
遺伝子のＦ2 −ＤＮＡを含むプラスミドｐＭＬ３０５の
造成（図２） （ａ）線状化したベクターｐＢＲ３２２／ＢａｍＨＩ／
ＮｒｕＩの造成 ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（５μｇ）を、３０単位
のＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで、１００mM Ｎ
ａＣｌ，６mMトリス・ＨＣｌ（pH７．９），６mM Ｍｇ
Ｃｌ2 および１００μｇ／mlゼラチンの溶液中で、３７
℃で３０分間消化する。次いで、ＰｖｕII制限エンドヌ
クレアーゼ１５単位を溶液に加え、３７℃で２時間消化
する。
【０１４７】反応混合物を７０℃で１０分間加熱して、
酵素を不活性化する。次いで、１％低融点アガロース／
トリス−アセテート−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８）上でゲル
電気泳動を行うことによって２つのＤＮＡフラグメント
を互いに分離する（実施例１０ａ参照）。ｐＢＲ３２２
ＢａｍＨＩ／ＰｖｕIIベクター（＝２６７２塩基対）
のＤＮＡバンドを含むゲルの領域をゲルから切り取り、
液化し、そしてＭｕｅｌｌｅｒら（上記）の方法に準じ
て、ＤＥ−５２クロマトグラフィを行ってＤＮＡを精製
する。０．７５μｇ（１．５ｐモルの末端）のＤＮＡが
得られる。
【０１４８】（ｂ）Ｆ2 −ＤＮＡ／ＢａｍＨＩの製造 化学的に合成されたＦ2 −ＤＮＡ（実施例８を参照）２
５μｇ（＝１．３ｐモルの末端）を、２０μｌの１５０
mM ＮａＣｌ，６mMトリス・ＨＣｌ（pH７．９），６mM
のＭｇＣｌ2 および１００μｇ／mlのゼラチン中で１６
単位のＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）を用いて３７℃で３０分間消化する。次に、線状
化したベクターｐＢＲ３２２／ＢａｍＨＩ／ＰｖｕII
（実施例１１ａ）６０ng（＝９６ｎモルの末端）を溶液
に加え、全溶液をＴＮＥで標準化して、フェノール／ク
ロロホルムで抽出し、ＤＮＡを２容量のアルコールで沈
澱させる。沈澱したＤＮＡを、更に処理するまで、−２
０℃でアルコール中に貯蔵する。
【０１４９】（ｃ）ｐＢＲ３２２／ＢａｍＨＩ／Ｐｖｕ
IIベクターＤＮＡとＦ2 −ＤＮＡ／ＢａｍＨＩとの連結
およびプラスミドｐＭＬ３０５の造成 ２個の上記ＤＮＡフラグメントを含有する実施例１１
（ｂ）で得られたＤＮＡ沈澱を、２０μｌの５０mMトリ
ス・ＨＣｌ（pH，７．８），１０mM ＭｇＣｌ2，１０m
M ＤＴＴ，０．５ｍＭＡＴＰおよび１００μｇ／１ml
のゼラチンの溶液に溶解し、１５単位／μｌのＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で１５℃で３時間処理す
る。この方法で、Ｆ2 −ＤＮＡを含む組み替えプラスミ
ドｐＭＬ３０５が溶液中に得られる。
【０１５０】（ｄ）プラスミドｐＭＬ３０５を用いる
Ｅ．コリＨＢ１０１の形質転換 カルシウム処理されたＥ．コリＨＢ１０１細胞の形質転
換は、実施例１０（ｄ）に記載のようにして行う。実施
例１１（ｃ）で得られる反応混合物１０μｌを用いる。
３１３個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
【０１５１】（ｅ）Ｆ2 −ＤＮＡを含むコロニーのスク
リーニング ６５個の形質転換されたコロニー（実施例１１ｄ）を、
実施例１０（ｅ）に記載の方法でＦ2 −ＤＮＡについて
試験する。相補的オリゴヌクレオチド１５４／６４（実
施例６を参照されたい）を、放射能プローブとして用い
る。オートラジオグラムにおいて２個の陽性のコロニー
が得られ、その一つをｐＭＬ３０５と命名する。
【０１５２】実施例１２．クローンｐＭＬ３００および
ｐＭＬ３０５の特性決定 組換プラスミドｐＭＬ３００およびｐＭＬ３０５のＤＮ
Ａを、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚ〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，１９８２年，３６８
頁〕の方法に準じて単離する。Ｆ1 −ＤＮＡおよびＦ2
−ＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を、Ｍａｘａｍ
およびＧｉｌｂｅｒｔ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，第７４巻，５６０頁，１９７７
年；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，第６５巻，４９９頁，１
９８０年も参照されたい〕の方法に準じて確認する。
【０１５３】このためには、それぞれの場合に、１０μ
ｇのｐＭＬ３００のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限
エンドヌクレアーゼで開裂し、そして１０μｇのｐＭＬ
３０５のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ制限エンドヌク
レアーゼで開裂し、線状化されたＤＮＡをアガロースゲ
ル〔実施例１０（ａ）参照〕からゲル溶出によって単離
する。次に、単離されたＤＮＡをアルカリ性ホスファタ
ーゼで消化して、そしてＤＥ−５２上でクロマトグラフ
ィを行う（実施例１１ａを参照されたい）。
【０１５４】次に、ＤＮＡを５′−末端で〔γ−32〕Ａ
ＴＰ（比活性、５０００Ｃｉ／ｍモル、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）およびＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ−Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、放射能標識する。
放射能標識したＤＮＡを、次いで第二の制限エンドヌク
レアーゼ（ＥｃｏＲII）を用いて開裂する。生成するＤ
ＮＡフラグメントを、アガロースからゲル溶出によって
単離する。
【０１５５】ｐＭＬ３００の場合には、Ｆ1 −ＤＮＡの
ヌクレオチド配列をＥｃｏＲII−ＥｃｏＲＩ* フラグメ
ント（約１０９塩基対）から決定し、ｐＭＬ３００の場
合には、Ｆ2 −ＤＮＡのヌクレオチド配列をＥｃｏＲII
−ＢａｍＨＩ* フラグメント（約１２２塩基対）におい
て決定する（* は放射能標識されているＤＮＡ末端を意
味する）。Ｆ1 −ＤＮＡおよびＦ2 −ＤＮＡについて決
定されるヌクレオチド配列は、実施例８に示したものと
同じである。
【０１５６】実施例１３．発現プラスミドｐＭＬ３１０
の造成 （ａ）ｔｒｐプロモーター−オペレーターを有する線状
化されたベクターｐＨＲｉ１４８／ＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ
ＨＩの造成（図３及び図４） Ａ．プラスミドｐ１５９の造成 １０μｇのプラスミドｐＢＲＨｔｒｐ〔ＤＥ−ＯＳ３１
１１４０５〕を５０単位のＥｃｏＲＩ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を用いて３７℃で６０分間開裂させ、消化混合物を
フェノール抽出した後、ＴＳＴ４１（Ｋｏｎｔｒｏｎ
ＡＧ）ローター中で５０mMトリス・ＨＣｌ（pH８．０）
および１mMのＥＤＴＡにおいて、サッカロース密度勾配
（５〜２３％）で分画する。遠心分離は、４０，０００
ｒｐｍ，１５℃で１４時間継続する。
【０１５７】０．３mlずつの画分を、ＩＳＣＯ勾配コレ
クターを用いて１ml／分で集める。小さなフラグメント
を含む画分をまとめ、この溶液をＴＮＥで標準化し、−
２０℃で２容量のエタノールを用いて沈澱させる。Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で遠心分離した後、ＤＮＡ
を１００μｌの１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５）およ
び０．５mM ＥＤＴＡに溶解する。このＤＮＡフラグメ
ント５μｇを５単位のＢｇｌII（Ｂｉｌａｂｓ）を用い
て、３７℃で６０分間開裂させる。
【０１５８】反応混合物をフェノールおよびクロロホル
ムで抽出し、ＤＮＡを２容量のエタノールと共に−８０
℃で１０分間インキュベートし、ＤＮＡを遠心分離によ
って集めて、５０μｌの５０mMトリス・ＨＣｌ（pH８．
０）に再度溶解させる。この溶液の２μｌを採取して
（ＤＮＡ０．２μｇ），５０mMトリス・ＨＣｌ（pH８．
０）中で１０ng／μｌのＤＮＡ濃度で１単位のウシ腸ア
ルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）と共に
３７℃で３０分間インキュベートする。溶液を６５℃で
６０分間加熱することによって酵素を不活性化する。
【０１５９】０．０４μｇのＤＮＡを採取し、そして
５′−末端を、５０mMのトリス・ＨＣｌ（pH９．５），
１０mMのＭｇＣｌ2 および５mMのＤＴＴの反応容積２０
μｌ中１０μＣｉ〔γ−32Ｐ〕−ＡＴＰ（５０００Ｃｉ
／mM，Ａｍｅｒｃｈａｍ、および５単位のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｌｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）と共に３７℃で３０分間インキュベートして標識す
る。放射性試料を非標識試料（上記参照）と混合して、
ＤＮＡフラグメントをＴＳＴ６０ローター中で５０mMト
リス・ＨＣｌ（pH８．０）および１mM ＥＤＴＡ中で５
〜２３％サッカロース密度勾配によって分画する。
【０１６０】遠心分離を、６０，０００ｒｐｍ，１５℃
で５時間行う。０．２mlずつの画分を集める。それぞれ
の画分の放射能活性をセレンコフ放射線を測定すること
によって計測し、それによってフラグメントを同定す
る。小さなＤＮＡフラグメントを含む所望のフラグメン
トをまとめて、ＤＮＡを２容量のエタノールを用いて沈
澱させ、遠心分離した後、２０μｌの１０mMトリス・Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）および０．５mM ＥＤＴＡに再度溶解
する。
【０１６１】32Ｐ−標識されたＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIＤ
ＮＡフラグメントを、５０μｌの容量中で０．２単位の
ＴａｑＩ（Ｂｉｌｌａｂｓ）を用いて、３７℃で１０分
間部分的に開裂させる。反応混合物を、０．２％ＳＤ
Ｓ，１０％グリセリン，１０mMＥＤＴＡ，０．０５％ブ
ロモフェノール−ブルーに調整し、そしてＤＮＡフラグ
メントをトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ中で６％ポリアクリ
ルアミド上で分離する〔Ａ．Ｃ．Ｐｅａｃｏｃｋら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６巻、１８１８頁、１９６
７年〕。所望のＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩ（最大の部分消化
フラグメント）を含むバンドをオートラジオグラム上で
同定する。このフラグメント（Ｌ．，第３図参照）をゲ
ルから抽出して、精製し（Ｗ．Ｍｕｅｌｌｅｒら、上
記）、そして１０μｌの１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．
５）および１mM ＥＤＴＡに溶解する。
【０１６２】アクセプタープラスミドとして、ＣｌａＩ
およびＥｃｏＲＩで消化されるｐＢＲ３２２を用いる。
２μｇのｐＢＲ３２２を２０μｌの反応容量中で４単位
のＣｌａＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で６０分
間消化される。蛋白質をフェノールで抽出し、次いでＤ
ＮＡを２容量のエタノールを用いて−８０℃で１０分間
沈澱させる。ＤＮＡを遠心分離によって集め、次いで２
０μｌの反応容積において３７℃で１０単位のＥｃｏＲ
Ｉ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３０分間消化する。
【０１６３】次いで、０．１Ｍトリス・ＨＣｌ（pH８．
７）２容量を溶液に加え、全量を１単位のアルカリ性ウ
シホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）と共に３７℃
で３０分間インキュベートする。次いで、６５℃で６０
分間インキュベートすることによってホスファターゼを
不活性化する。アクセプタープラスミド１００ngを、１
０mM ＭｇＣｌ2 ，２０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．
８），１０mM ＤＴＴ，０．５mM ＡＴＰ中、１５μｌ
の反応容積中で、５μｌのフラグメントＬ−ＤＮＡと共
に、１μｌの反応容積当たり３０単位のＴ4 ＤＮＡリガ
ーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、２時間インキュベー
トする。
【０１６４】この溶液５μｌを、１０mM ＭｇＣｌ2 ，
１０mM ＣａＣｌ2 および１０mMトリス・ＨＣｌ（pH
７．５）中塩化カルシウムで処理したＥ．コリＨＢ１０
１を含む１５０mlの混合物に加えて全体を２００μｌと
する。この混合物を２０分間氷冷し、４２℃で１分間加
熱し、２０℃で１０分間インキュベートする。トリプト
ン培地〔蒸留水１リットル中に、１０ｇのバクト−トリ
プトン（Ｄｉｆｃｏ），１ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃ
ｏ），１ｇのグルコース、８ｇのＮａＣｌおよび２９４
mgのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏを含む〕１mlを加えて、混合
物を３００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で３０分間イン
キュベートする。混合物を、２個の５０μｇ／mlのアン
ピシリン（Ｓｉｇｍａ）を加えた寒天平板（ＭｃＣｏｎ
ｋｅｙ Ａｇａｒ， Ｄｉｆｃｏ；０．６ml／平板）に
塗布した。これらの平板を３７℃で１２〜１７時間イン
キュベートする。
【０１６５】１０個の異なるコロニーのプラスミドＤＮ
Ａを、次のようにして単離する。上記のコロニーを、２
５mlの三角フラスコ中５０μｇ／mlのアンピシリンを補
填したトリプトン培地１０mlに接種するのに用いる。培
地を３７℃，３００ｒｐｍで１５〜１８時間攪拌する。
細胞を遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ，ＨＳ−４ローター，４
℃，４０００ｒｐｍで１０分間）によって回収する。約
０．１ｇの細胞が得られ、これらを１mlの５０mMのトリ
ス・ＨＣｌ（pH８．０）に再分散する。
【０１６６】０．２５mlのリゾチーム溶液〔５０mMのト
リス・ＨＣｌ（pH８．０）１ml当たり１０mg、リゾチー
ムはＳｉｇｍａ社より発売されている〕を加え、０℃で
１０分間インキュベートした後、０．５mM ＥＤＴＡ
（pH７．５）０．１５mlを加える。０℃でさらに１０分
置いた後に、６０μｌの２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
（Ｍｅｒｃｋ）を加える。０℃で３０分後に、試料をＳ
ｏｒｖａｌ ＳＡ−６００ローター中で４℃で１５，０
００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上澄液を、１容量
のフェノール（ＴＮＥで飽和）で脱蛋白する。
【０１６７】４℃で５０００ｒｐｍで、遠心分離（Ｓｏ
ｒｖａｌ ＨＢ−４ローター）することによって、相を
分離する。上相を１容量のクロロホルムで抽出する。ス
イ臓ＲＮＡアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ；１０mg／１mlＴＮ
Ｅ，８５℃で１０分間前加熱）を加えて最終濃度を２５
μｇ／mlとして、混合物を３７℃で４０分間インキュベ
ートする。次いで、溶液を１Ｍ ＮａＣｌおよび１０％
ポリエチレングリコール６０００（Ｆｌｕｋａ、オート
クレーブ中で１２０℃で２０分間処理）に調整して、−
１０℃で２時間インキュベートする。
【０１６８】沈澱をＳｏｒｖａｌ ＨＢ−４ローター
（０℃，１０，０００ｒｐｍで２０分間）中で集め、１
００μｌのＴＮＥに再度溶解する。ＤＮＡ溶液を１容量
のフェノールで抽出して、ＤＮＡを２容量のエタノール
により−８０℃で１０分間沈澱させる。沈澱をＥｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ遠心分離機で遠心分離によって集め、ＤＮＡ
を２０μｌの１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５）および
０．５mM ＥＤＴＡに再溶解する。１０mlの培養液か
ら、８〜１０μｇのプラスミドＤＮＡが得られる。
【０１６９】プラスミドＤＮＡは以下の制限酵素を用い
る消化の後、分析する。それぞれの場合に、酵素業者の
指示に従い、標準的方法によってＨｐａｌ（Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）およびＨｐａＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）とＥｃｏＲＩ
（Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＣｌａＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）
を用いて切断する。ＤＮＡを、４０mMトリス・ＨＣｌ
（pH７．８），１mM ＥＤＴＡおよび０．５μｇ／mlの
臭化エチジウム中１％アガロースゲル上で分画する。所
望のプラスミドはＨｐａｌ部位を含み、３回消化した
後、大きなＤＮＡフラグメントの他に２種類の小さなフ
ラグメントであってｐＢＲ３２２の小さなＥｃｏＲＩ−
ＣｌａＩフラグメントよりも大きなフラグメントを生じ
る。これらのプラスミドの一つをｐ１５９と命名する
（図３参照）。
【０１７０】Ｂ．プラスミドｐＨＲｉ１４５の造成 ２μｇのｐ１５９ ＤＮＡを、１０単位のＥｃｏＲＩ
（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で３０分間消化す
る。ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、遠心分離の後、１０μｌの１０mMトリス・ＨＣｌ
（pH７．５）および０．５mM ＥＤＴＡに溶解する。Ｅ
ｃｏＲＩで消化されたＤＮＡを、更に１０mMＭｇＣ
ｌ2 ，１０mM β−メルカプトエタノール，５０mM Ｎ
ａＣｌ，０．１mMdATP（Ｐ＆Ｌ Ｂｉｌｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ），０．１mM dTTP （Ｐ＆Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）中５単位のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメント）（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）で１２℃で１５
分間処理する。
【０１７１】次いで、８５℃で５分間インキュベートし
てポリメラーゼを不活性化する。反応混合物を、２０mM
トリス・ＨＣｌ（pH７．８），１０mMのＭｇＣｌ2 ，１
０mMのＤＴＴ，０．５mMのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）で１０
倍に希釈し、１μｌの反応混合物当たり３０単位のＴ4
ＤＮＡリガーゼを用いて、１５℃で１時間インキュベー
トする。５０ngのＤＮＡを（上記方法で）Ｅ．コリ中に
形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシリンを補填したＭ
ｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板上に塗布する。
【０１７２】１０個の異なるコロニーのプラスミドＤＮ
Ａを上記の方法で単離する。プラスミドＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで消化することによって分析する。所望のプラスミ
ドはＥｃｏＲＩ耐性である。分析は、上記の方法で行
う。所望のプラスミド１つをＨＲｉ１４５と命名する
（図３参照）。
【０１７３】Ｃ．プラスミドｐＨＲｉ１４８の造成 ２μｇのｐＨＲｉ１４５−ＤＮＡを、５単位のＣｌａＩ
（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）を用いて３７℃で６０分間処理
し、次いでフェノール抽出によって脱蛋白する。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱させた後、２０μｌの１０mMトリス
・ＨＣｌ（pH７．５）および０．５mM ＥＤＴＡに溶解
する。突出した末端を、dATPおよびdTTPの代りにdCTP
（Ｐ＆Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびdGTP（Ｐ
＆Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いることを除
き、上記と同様にしてＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎ
ｏｗフラグメント）で処理する。
【０１７４】８５℃で５分間インキュベートすることに
よってポリメラーゼを不活性化する。２容量の０．１Ｍ
トリス・ＨＣｌ（pH８．７）を反応混合物に加え、０．
５単位のウシホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）と
共に３７℃で３０分間インキュベートする。反応混合物
をフェノールで抽出することによって脱蛋白する。ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、８μｌの１０mMトリス・Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）および０．５mM ＥＤＴＡに溶解す
る。
【０１７５】次の式： ５′-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-３′ を有する化学的に合成したＤＮＡリンカーを、０．１mM
rATP（Ｓｉｇｍａ），５０mMトリス・ＨＣｌ（pH９．
５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mM ＤＴＴおよび２単位
のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ＆Ｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）を含む反応容積８μｌ中で、８ｐモル
のリンカーを５μＣｉ〔γ−32Ｐ−ＡＴＰ（５５００Ｃ
ｉ・mM-1，Ａｍｅｒｓｈａｍ〕と共に３７℃で３０分間
インキュベートすることによって５′−末端をリン酸化
する。−８０℃で凍結することによって反応を停止させ
る。
【０１７６】放射能標識したリンカーを次に１μｇのＣ
ｌａＩおよびホスファターゼで処理し、そして０．５mM
rATP（Ｓｉｇｍａ），１０mM ＤＴＴ（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ），２０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．８），１mM
ＭｇＣｌ2 および８００単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ
（Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む２０μｌの反応容積中でｐＨ
Ｒｉ１４５−ＤＮＡ（上記を参照されたい）と連結す
る。インキュベーションを１５℃で２時間行う。８５℃
で１０分間インキュベートすることによってリガーゼを
不活性化する。
【０１７７】次に、２容量の水を加え、塩化ナトリウム
濃度を１０mMに調整し、２０単位のＫｐｎＩ（Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）を３７℃で３０分間にわたって加える。フェノ
ールおよびクロロホルムで抽出した後、混合物を、４０
mMトリス・酢酸（pH７．８），１mM ＥＤＴＡおよび
０．５μｇ／mlの臭化エチジウム中０．９％の低融点ア
ガロースゲル（Ｂｉｏｒａｄ）を通して分画する。紫外
線照射によって目視出来且つ同じ大きさのマーカーＤＮ
Ａと同じ移動度を示すバンドを小刀で切り取る。ゲルの
部分を６５℃で５分間溶融した後、３７℃に冷却する。
約２０μｌの容量が得られる。
【０１７８】この溶液５μｌを採取して、０．５mM Ａ
ＴＰ，１０mM ＤＴＴ，１０mM ＭｇＣｌ2 ，２０mMト
リス・ＨＣｌ（pH７．８）に調整しておいた１０μｌの
反応容積中４００単位のＴ４リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）と共に１５℃で１２時間インキュベートする。１０
０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．８），１００mM ＣａＣｌ
2 および１００mM ＭｇＣｌ2 から成る溶液１／１０容
量を、リガーゼ混合物（１５℃で固化）に加え、全量を
６５℃で５分間インキュベートする。次に、この溶液
を、上記と同様にして、カルシウム処理したＥ．コリＨ
Ｂ１０１細胞を形質転換するのに用いる。５０μｇ／ml
のアンピシリンを加えたＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板上に
塗布する。
【０１７９】１０個の異なるプラスミドＤＮＡが上記と
同様に単離され、このＤＮＡを次の制限酵素分析に付す
る。すなわち、それぞれの場合に、０．５μｇのプラス
ミドＤＮＡを、酵素製造業者の指示にしたがってＫｐｎ
Ｉ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＮｃｏＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）お
よびＥｃｏＲＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて次々と切断
する。開裂生成物を、４０mMトリス・酢酸（pH７．
８）、１mM ＥＤＴＡ，０．５μｇ／mlの臭化エチジウ
ム中１％アガロースゲル上で分画する。総てのプラスミ
ドは、それぞれ所望なようにこれらの酵素切断部位の１
つを示す。１つをＨＲｉ１４８と命名する。
【０１８０】このプラスミドＨＲｉ１４８は、トリプト
ファンプロモーター−オペレーターおよびＡＴＧ（これ
も含む）までのリボゾーム結合部位を含む。ヒルジンお
よびその他の異種遺伝子も、このプラスミド中に１個存
在するＥｃｏＲＩ，ＮｃｏＩ，ＫｐｎＩ部位を介して直
接にカップリングすることができる。また、この構造
は、対応する遺伝子上に存在しなければならない翻訳の
開始に必要なＡＴＧを伴わない異種遺伝子の直接のカッ
プリングおよび発現を行うことが可能である。これは、
上記のように、ＮｃｏＩで切断しそしてＤＮＡポリメラ
ーゼで突出する末端を修復することにより、またはＫｐ
ｎＩで切断してヌクレアーゼＳ1 によって突出末端を除
去することにより容易に達成することができる。したが
って、プラスミドＨＲｉ１４８は、広い用途を有する発
現プラスミドである。
【０１８１】Ｄ．線状化ベクターｐＨＲｉ１４８／Ｅｃ
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩの製造 ５μｇのｐＨＲｉ１４８のプラスミドＤＮＡを、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化す
る。切り取られたベクターｐＨＲｉ１４８／ＥｃｏＲＩ
／ＢａｍＨＩを、密度勾配遠心分離によって単離する。
【０１８２】（ｂ）Ｆ1 −ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ
ＲIIおよびＦ2 −ＤＮＡ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲIIの製
造 Ｉ．Ｆ1 −ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲIIの製造 ５μｇのｐＭＬ３００のプラスミドＤＮＡを、最初に１
００mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５），５０mM ＮａＣｌ
および１００μｇ／mlのゼラチンの溶液５０μｌ中で、
１０単位のＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを用い
て、３７℃で１時間消化する。この線状化したプラスミ
ドＤＮＡ／ＥｃｏＲＩの一部（０．５μｇ）をアガロー
スゲル（実施例１０ａ参照）からゲル溶出によって単離
し、そして〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰで放射能標識する（実施
例１２参照）。
【０１８３】次に、主要量のプラスミドＤＮＡ／Ｅｃｏ
ＲＩをこの放射能標識したＤＮＡと混合して、ＥｃｏＲ
II制御エンドヌクレアーゼを用いて消化し、ＥｃｏＲII
−ＥｃｏＲＩ* ＤＮＡフラグメント（１０９塩基対）を
８％ポリアクリルアミド上でゲル電気泳動によって分離
する。２００μｇのＦ１−ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ* ／Ｅｃ
ｏＲIIを、ゲル溶出によって単離する。
【０１８４】II．Ｆ2 −ＤＮＡ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ
IIの製造 ５μｇのｐＭＬ３０５のプラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ１０単位を用いて切断する。
この線状化したプラスミドＤＮＡ／ＢａｍＨＩをアガロ
ースゲル（実施例１０ａ参照）からゲル溶出することに
よって単離し、〔γ−32Ｐ〕（実施例１２参照）を用い
て放射能標識する。次に、主要量のプラスミドＤＮＡ／
ＢａｍＨＩをこの放射能標識したＤＮＡと混合し、Ｅｃ
ｏＲII制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＥｃｏＲII−
ＢａｍＨＩ* ＤＮＡフラグメント（１２２塩基対）を８
％ポリアクリルアミド上でゲル電気泳動によって分離す
る。２５０μｇのＦ２−ＤＮＡ／ＢａｍＨＩ* ／Ｅｃｏ
ＲIIが単離される。
【０１８５】（ｃ）Ｆ1 −ＤＮＡとＦ2 −ＤＮＡとの連
結および発現プラスミドｐＭＬ３１０の造成 実施例１０ｃに既に記載の方法で、１０ng（＝４７３ｎ
モルの末端）のＦ1 −ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲII
および９ng（＝４９５ｎモルの末端）のＦ2 −ＤＮＡ／
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲIIを、２０μｌの容量中でＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで処理する。次に、この混合物をフェノー
ル／クロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡをアルコール
で沈澱させる。次いで、このＤＮＡ沈澱を実施例１０ｃ
に記載のように溶解させ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
制限エンドヌクレアーゼで消化させる。
【０１８６】次いで、この溶液をＴＮＥで標準化して、
３０ng（＝５０ｎモルの末端）のベクターＤＮＡ ｐＨ
Ｒｉ１４８／ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ（実施例１３ａＤ
参照）を加える。次に、この溶液をフェノール／クロロ
ホルムで再度抽出し、そしてＤＮＡをアルコールで沈澱
させる。沈澱したＤＮＡ混合物を実施例１０ｃに記載の
方法でＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理す
る。この方法で、インサートとしてＦ1 −Ｆ2 −ＤＮＡ
（デスルファトヒルジン遺伝子）を含む組み替えプラス
ミドが溶液中に生成する。
【０１８７】（ｄ）プラスミドｐＭＬ３１０によるＥ．
コリＨＢ１０１の形質転換 カルシウムで処理したＥ．コリＨＢ１０１細胞の形質転
換を、実施例１０ｄに記載の方法で行う。実施例１３ｃ
で得られた反応混合物１０μｌを用いる。４２０個のア
ンピシリン耐性のコロニーが得られる。
【０１８８】（ｅ）Ｆ1 −Ｆ2 −ＤＮＡを含むコロニー
のスクリーニング １８個の形質転換されたコロニー（実施例１３ｄ）を実
施例１０ｅに記載の方法でＦ１−Ｆ２−ＤＮＡ含有につ
いて検討する。実施例５および６において記載したオリ
ゴデオキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとし
て用いる。オートラジオグラムにおいて、１２個のコロ
ニーが得られ、そのうちの５個をｐＭＬ３１０，ｐＭＬ
３１１，ｐＭＬ３１２，ｐＭＬ３１３およびｐＭＬ３１
４と命名する。
【０１８９】実施例１４．クローンｐＭＬ３１０の特性
決定 Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ（上記）にしたがってＦ
1 −Ｆ2 −ＤＮＡを配列決定することによって、実施例
１２に記載の方法で組換プラスミドｐＭＬ３１０に於け
るＦ1 −Ｆ2 −ＤＮＡ配列の特性決定を行う。１０μｇ
のＦ1 −Ｆ2 −ＤＮＡを検討する。Ｆ１−Ｆ２−ＤＮＡ
のヌクレオチド配列は、合成デスルファトヒルジン遺伝
子について記載された配列と同一である。
【０１９０】実施例１５．酵母におけるデスルファトヒ
ルジンＨＶ１の発現 ヒルジンについて化学的に合成された遺伝子を、プラス
ミドｐＭＬ３１０に於ける２０６ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩインサートとして増幅する。この遺伝子をプラス
ミドから切除して、制御可能なＰＨ０５プロモータの制
御下に酵母において発現せしめる。この造成物は、欧州
特許出願第１４３，０８１号明細書に記載のように、５
４１ｂｐＰＨ０５プロモータ配列および完全なＰＨ０５
シグナル配列（１７個のアミノ酸をコードする５１個の
ヌクレオチド）を含有する。
【０１９１】この配列は、天然の成熟ヒルジンのＮＨ2
−末端アミノ酸としてのバリンのコドンから始まるヒル
ジンの成熟コード配列にインフレーム融合している。ヒ
ルジン遺伝子は、その３′−末端にＰＨ０５転写停止シ
グナルを提供するＤＮＡフラグメントを有する。この発
現プラスミドのベクター部分は酵母２μ配列、酵母にお
ける選択用酵母ＬＥＵ２遺伝子およびＥ．コリにおける
選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝子およびＥ．コリ
の複製開始点を含む。方法は、図５，６および７に示
す。
【０１９２】デスルファトヒルジン遺伝子の５′末端の
ヌクレオチド配列の調整 デスルファトヒルジンをコードするヌクレオチド配列
は、最終の遺伝子生成物においては、ＮＨ2 −末端バリ
ンのためのＧＴＴから始まる。Ｅ．コリにおけるサブク
ローン化および発現を好都合にするため、コード配列は
５′末端においてＥｃｏＲＩ制限部位およびＡＴＧ開始
コドンを含む８個のヌクレオチドにより延長されてい
る。ヒルジンコード配列をＰＨ０５シグナルペプチドを
コードする配列に正確にインフレーム融合させるために
は、これらの追加のヌクレオチドを除去しなければなら
ない。これは、ＥｃｏＲＩ制限部位を平滑末端部位に変
換し、ＨｇａＩによるその後の切断がＧＴＴコドンの直
ぐ上流に起こるような位置にＨｇａＩ認識部位を含有す
る合成オリゴヌクレオチドを付加することによって達成
される。
【０１９３】デスルファトヒルジン遺伝子の前のＨｇａ
Ｉ認識部位の導入（図５参照） ８μｇのプラスミドｐＭＬ３１０（実施例１３ｃ参照）
を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に消化す
る。ＤＮＡ（ｐＭＬ３１０／ＥｃｏＲＩ）をフェノール
／クロロホルムで抽出して、エタノールで沈澱させる。
ヌクレアーゼＳ 1 によって、５′突出末端を除去する。
４μｇのｐＭＬ３１０／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡを、１００
μｌの２５０mM ＮａＣｌ，１mM ＺｎＳＯ4 ，３０mM
酢酸ナトリウム（pH４．６）および２０単位／mlのヌク
レオチドＳ1 （Ｓｉｇｍａ）中で、３７℃で４５分間消
化する。
【０１９４】ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出
して、エタノールを用いて沈澱させる。ＤＮＡ（ｐＭＬ
３１０／ＥｃｏＲＩ／Ｓ1 ）を１００μｌの５０mMトリ
ス・ＨＣｌ（pH８．０）に再分散させ、２単位のウシ腸
アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ，Ｂｏｅｒｉｎｇ
ｅｒ）と共に３７℃で１時間インキュベートする。酵素
を、６５℃で１．５時間インキュベートして不活性化す
る。
【０１９５】培養混合物中のＮａＣｌ濃度を１５０mMに
調整する。デスルファトヒルジンＤＮＡ（ｐＭＬ３１０
／ＥｃｏＲＩ／Ｓ1 ／ＣＩＡＰ）を、低塩緩衝液〔１５
０mMＮａＣｌ，１０mMトリス・ＨＣｌ（pH８．０），１
mM ＥＤＴＡ〕中でＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ）イオン
交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝溶液
〔１．５Ｍ ＮａＣｌ，１０mMトリス・ＨＣｌ（pH８．
０），１mM ＥＤＴＡ〕を用いて溶出させる。ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、水に再分散させて０．８mg／ml
の濃度にする。
【０１９６】次の式： ５′-AGCGTCGACGCT-３′ を有するオリゴヌクレオチドを、ホスホトリエステル法
〔板倉ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１０３
巻、７０６頁（１９８１年）〕によって合成する。オリ
ゴヌクレオチドの配列は制限エンドヌクレアーゼＨｇａ
Ｉの認識部位-GACGC- を有する自己相補性である。２本
の単鎖をアニーリングすることにより、１２個の塩基対
を有する２本鎖ＤＮＡリンカーになる。
【０１９７】１．２μｇの合成の単鎖オリゴデオキシヌ
クレオチドを、１０μｌの６０mMトリス・ＨＣｌ（pH
７．５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mM ＤＴＴ，３０μ
Ｃｉの〔γ−32ｐ〕ＡＴＰ（３０００Ｃｉ・mM-1，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）および６単位のＴ4 ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中で３７℃で３０分
間、次いで０．５mM ＡＴＰの存在下で３７℃で１５分
間リン酸化する。混合物を７５℃で１０分間更にインキ
ュベートして酵素を不活性化して、次いで室温に冷却し
てアニーリングする。
【０１９８】０．６μｇ（１７０ｐモル）の32ｐで標識
したリンカーＤＮＡを２．４μｇ（１．７５ｐモル末
端）のｐＭＬ３１０／ＥｃｏＲＩ／Ｓ1 ／ＣＩＡＰと混
合し、２０μｌの６０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５），
１０mMのＭｇＣｌ2 ，５mM ＤＴＴ，３．５mM ＡＴ
Ｐ，８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）中で１５℃で２０時間連結する。リガーゼを８５℃
で１０分間で不活性化し、過剰のリンカー分子を１０mM
ＥＤＴＡ（pH７．５），３００mM酢酸ナトリウム（pH
６．０）および０．５４容のイソプロパノールの存在で
ＤＮＡを沈澱させることによって除去する。室温で３０
分後にＤＮＡをペレットにして、４５μｌの連結混合物
（上述）に再分散し、１５℃で６時間連結させて、環状
のＤＮＡを形成させる。
【０１９９】１μｌおよび３μｌの連結混合物を、１０
０μｌのカルシウム処理した形質転換コンピテントＥ．
コリＨＢ１０１細胞〔Ｄ．Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第１６６巻、５５７頁、１９８
３年）によって調製〕に加える。細胞を氷上で３０分間
放置し、次いで４２℃で３分間インキュベートし、氷上
で２分間冷却した後、４００μｌのＳＯＣ培地中で３７
℃で１時間インキュベートする。細胞をそれぞれ１００
μｌに濃縮し、５０μｇ／mlのアンピシリンを有するＬ
Ｂ寒天平板に塗布する。
【０２００】１２個の形質転換したａｍｐR コロニー
を、それぞれ１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ
培地で増殖させる。プラスミドＤＮＡをＤ．Ｓ．Ｈｏｌ
ｍｅｓらの方法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１
４巻、１９３頁、１９８１年〕にしたがって調製する。
合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は、プライマー
としてヒルジンのコード鎖にハイブリダイズする単鎖Ｄ
ＮＡフラグメントを用いるＤＮＡ配列決定によって確か
められる。ヒルジン遺伝子の前の正確な位置にリンカー
ＤＮＡを含有するクローンを、ｐＭＬ３１０Ｌと称す
る。
【０２０１】実施例１６．ＰＨ０５シグナル配列とデス
ルファトヒルジン構造遺伝子の融合 （ａ）０．２ｋｂデスルファトヒルジンフラグメントの
単離（図５） １２μｇのプラスミドｐＭＬ３１０Ｌを、制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨＩを用いて完全に消化する。ＤＮＡ
をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノー
ルで沈澱させた後、２つの制限フラグメントをトリス−
ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中１．２％アガロ
ースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色した０．８
４ｋｂ ＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをゲルスラ
イス中で単離する。ＤＮＡを３mlの０．２×ＴＢＥ緩衝
液を満たした透析ベッドで電気溶出する。
【０２０２】閉じたバッグをＴＢＥ緩衝液（pH８．３）
（９０mMトリス−塩基、９０mMホウ酸、２．５mMのＥＤ
ＴＡ）中に浸漬する。１００mAで３０分間電流を通じた
後、電流の極性を４５秒間反転させ、ＤＮＡを透析膜か
ら剥離させる。透析バッグのゲルスライスを取り巻く緩
衝液を回収して、１５０mM ＮａＣｌに調整し、ＤＥ５
２（Ｗｈａｔｍａｎ）イオン交換カラムを通過させる。
ＤＮＡを高塩緩衝液〔１．５Ｍ ＮａＣｌ，１０mMトリ
ス・ＨＣｌ（pH８．０），１mM ＥＤＴＡ）を用いて溶
出させ、エタノールで沈澱させ、水に再溶解させて０．
１mg／mlの濃度にする。
【０２０３】ｐＭＬ３１０Ｌの０．８４ｋｂ ＰｖｕＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼ
ＨｇａＩで更に消化する。この消化により、成熟デスル
ファトヒルジンの完全なコード配列を含有する１９８ｋ
ｂ ＨｇａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが生じる。次の
ＡｌｕＩによる消化では、１９８ｂｐ ＨｇａＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントには触れないが、同様な大きさのそ
の他のＨｇａＩフラグメントを除去する。
【０２０４】０．２ｋｂ ＨｇａＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メントはＴＢＥ緩衝液中１．５％アガロースゲル上で他
のフラグメントから分離され、（上記のように）電気溶
出によって単離される。ＤＮＡはＤＥ５２イオン交換ク
ロマトグラフィおよびエタノール沈澱によって精製され
る。ＤＮＡを水に再分散して、３０μｇ／ml（０．２ｐ
モル／μｌ）の濃度にする。
【０２０５】（ｂ）ＰＨ０５シグナル配列の一部分を有
するＰＨ０５プロモーター領域の単離 プラスミドｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８（欧州特許出
願第１４３，０８１号明細書参照）は、ＰＨ０５プロモ
ーターおよび外来構造遺伝子（ｔ−ＰＡ）にインフレー
ム融合したＰＨ０５シグナル配列を有する。５８４ｂｐ
ＢａｍＨＩ−ＢａｌＩフラグメントはＰＨ０５、およ
び３′末端の８個のヌクレオチドを除くＰＨ０５シグナ
ル配列の総てを含有する。
【０２０６】８μｇのｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８
ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｌＩで消化する
（３７℃で１６時間）。ＤＮＡをフェノール／クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱によって精製する。ＤＮ
Ａを水に再分散させ、０．７mg／mlの濃度にする。ＰＨ
０５シグナル配列とデスルファトヒルジンをコード領域
との間の正確な連結は、次の式：
【０２０７】
【化１１】 の合成リンカーによって行われる。
【０２０８】リンカー（５′-CCAATGCA ）の５′末端の
８個のヌクレオチドはＢａｌＩ部位からプロセシング部
位へのＰＨ０５シグナル配列の一部分を表す。オリゴヌ
クレオチド（２）の５′一の突出している５個のヌクレ
オチドは、デスルファトヒルジンコード配列の５′末端
のＨｇａＩ切断部位に対合する。個々の単鎖オリゴヌク
レオチド（１）および（２）は、ホスホトリエステル法
（板倉ら、上記）によって合成される。オリゴヌクレオ
チド（１）および（２）のそれぞれ１．１μｇおよび
１．８μｇを、実施例１５に記載のようにそれらの５′
末端でリン酸化し、等量を混合して、そしてアニーリン
グする。
【０２０９】１．３μｇ（２００ｐモル）のリン酸化し
た２本鎖リンカーＤＮＡを、４０μｌの６０mMトリス・
ＨＣｌ（pH７．５）１０mM ＭｇＣｌ2 ，３．５mM Ａ
ＴＰ，５mM ＤＴＴおよび１４００単位のＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で７μｇ（１．８ｐＭ）の
ＢａｌＩ開裂ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８に、１５℃
で１６時間で連結する。リガーゼを、８５℃で１０分間
不活性化する。過剰のリンカーを、１０mM ＥＤＴＡ，
３００mM酢酸ナトリウム（pH６．０）および０．５４容
のイソプロパノールの存在でＤＮＡを沈澱させることに
よって除去する。
【０２１０】ＤＮＡを再分散して、制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩで更に消化する。ＤＮＡをフェノール／
クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた後、２個
の制限フラグメントをトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液
（pH８．３）中１．２％アガロースゲル上に分離させ
る。ＤＮＡを電気溶出させ、ＤＥ５２イオン交換クロマ
トグラフィおよびエタノール沈澱によって更に精製す
る。０．６ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｈｇａ９ＤＮＡフラグメ
ントを水に再分散し、４０μｇ／mlの濃度にする。
【０２１１】（ｃ）ｐＪＤＢ２０７酵母ベクターフラグ
メントの単離（図６） ９μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＲ
Ａ（１２−２）ＤＮＡ（欧州特許出願第１４３，０８１
号明細書参照）を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
で消化する。完全に消化し終わった後、ＤＮＡをフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱せしめ
る。ＤＮＡを５０mMのトリス・ＨＣｌ（pH８．０）に再
分散し、そして０．１mg／mlの濃度にして、７単位のウ
シ腸アルカリ性ホスファターゼで３７℃で１時間消化す
る。
【０２１２】ホスファターゼを６３℃にて１．５時間で
不活性化して、ＤＮＡをＤＥ５２イオン交換クロマトグ
ラフィ（実施例１３参照）およびエタノール沈澱によっ
て精製する。６．８ｋｂの大きなＢａｍＨＩフラグメン
トを、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中
１．２％アガロースゲル上で分離する。ＤＮＡを、電気
溶出し、そしてＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィお
よびエタノール沈澱によって精製する。ＤＮＡを水に溶
解し、そして０．４mg／ml（０．１ｐＭ／μｌ）の濃度
にする。
【０２１３】（ｄ）ＰＨ０５プロモータフラグメントお
よびデスルファトヒルジン構造遺伝子のｐＪＤＢ２０７
酵母ベクターフラグメントへの連結（図６） ｐＪＤＢ２０７酵母ベクター、ＰＨ０５シグナル配列を
有するＰＨ０５プロモータフラグメント、およびデスル
ファトヒルジン構造遺伝子は、総て連結されて発現プラ
スミドを形成するＤＮＡフラグメント（実施例１６ａ〜
ｃ参照）として単離される。
【０２１４】ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８の０．６ｋ
ｂ ＢａｍＨＩ−ＨｇａＩフラグメント０．３ｐモル、
およびｐＭＬ３１０Ｌの０．２ｋｂ ＨｇａＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメント０．３ｐモルを、１０μｌの６０mMト
リス・ＨＣｌ（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mM
ＤＴＴ，１mM ＡＴＰおよび４００単位のＴ4 ＤＮＡ
リガーゼ中で、０．１ｐモルのｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ
０５−ＴＰＡ（１２−２）の６．８ｋｂ ＢａｍＨＩフ
ラグメントに１５℃で２０時間連結させる。
【０２１５】連結混合物１μｌを、Ｈａｎａｈａｎ（上
記）により調製した形質転換可能なＥ．コリＨＢ１０１
細胞１００μｌに加える。形質転換の処理法も、上記文
献から採用する。細胞を、５０μｇ／mlのアンピシリン
を含むＬＢ寒天平板状に塗布する。２４個のａｍｐR コ
ロニーを、別々に１００μｇ／mlのアンピシリンを有す
るＬＢ培地で増殖させる。プラスミドＤＮＡを、制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩで切断することによって、イ
ンサートの大きさおよび方向について分析する。インサ
ートの正確な方向を有する単一クローンを、ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−ＨＩＲと称する。
【０２１６】実施例１７．サッカロミセス・セレビシエ
ー株ＧＲＦ１８の形質転換 プラスミドｐＨＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲを、Ｈｉ
ｎｎｅｎら（上記）により記載された形質転換法を用い
て、サッカロミセス・セレビシエー株ＧＲＦ１８（α，
ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅ
ｕ２−１１２，ｃａｎR ）に導入する。５μｇのプラス
ミドＤＮＡを１００μｌのスフェロプラスト懸濁液に加
え、この混合物をポリエチレングリコールで処理する。
スフェロプラストを１０mlの再生寒天と混合して、ロイ
シンを欠く酵母最少培地平板上に塗布する。形質転換し
た単一酵母コロニーを取り出し、そしてロイシンを欠く
酵母最少培地中で増殖させる。このコロニーを、サッカ
ロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／
ＰＨ０５−ＨＩＲと称する。
【０２１７】実施例１８．Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲの培養 Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０
５−ＨＩＲの細胞を、２０mlの酵母最少培地（Ｄｉｆｃ
ｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎベース、２％グルコ
ースおよび２０mg／ｌのＬ−ヒスチジンを添加し、アミ
ノ酸なし）中で３０℃で攪拌し、細胞密度３×１０7 個
／mlまで培養する。細胞を０．９％ＮａＣｌで洗浄した
後、低Ｐi −最少培地中に５０ml培養液を接種するのに
用いる。
【０２１８】低Ｐi −最低培地は、Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａ
ｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ培地（アミノ酸な
し）の組成に対応して調製されるが、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ，２％のグルコースおよび１ｇ／ｌのＬ−ヒスチジン
の代わりに０．０３ｇ／ｌのＫＨ2 ＰＯ4 ，１ｇ／ｌの
ＫＣｌおよび１０ｇ／ｌのＬ−アスパラギンを含む。培
養液を４×１０6 個／mlの細胞密度まで接種して、３０
℃で２００ｒｐｍで４２時間まで攪拌する。
【０２１９】実施例１９．Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲからのデスルファ
トヒルジン化合物の単離 （ａ）培養液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 Ａ．ＲＰ−Ｃ１８カラム上でのヒルジン化合物の濃縮 それぞれ１８時間、２６時間および４２時間の醗酵時間
の後に、それぞれ１０mlの１０個の試料を培養液から採
取して、脱塩およびＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ−１８カラ
ム（（１ml，Ａｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ）上での濃縮により富化する。試料をカラ
ムに入れ、そして液体を真空で除去した後、カラムを
１．５mlの水−アセトニトリル（９：１）−０．１％ト
リフルオロ酢酸（９：１）で２回洗浄する。
【０２２０】ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニ
トリル−０．１％トリフルオロ酢酸（６：４）で溶出す
る。２mlの溶出液を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮機（Ｓａ
ｖａｎｔ）で４００μｌの最終濃度まで濃縮する。ヒル
ジン化合物をＨＰＬＣ分析で標準デスルファトヒルジン
と比較することにより、及びトロンビン阻害測定法によ
り同定する。試料には、約０．２〜２μｇ／mlのヒルジ
ン化合物が含まれる。
【０２２１】Ｂ．ＤＥＡＥセルロースカラム上でのイオ
ン交換クロマトグラフィ ４２時間の醗酵時間の後に１リットルの培養液を回収
し、そして遠心分離する。上澄液を、pH７．５で、ＤＥ
５３セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）のアニオン交換カラ
ムに入れる〔条件：カラム２．５×１５．５cm（７６m
l）；溶出緩衝液Ａ：２０mM酢酸アンモニウム、１００m
M ＮａＣｌ（pH７．５）；溶出緩衝液Ｂ：２０mM酢酸
アンモニウム、４Ｍ ＮａＣｌ（pH５．０）；流速：６
６ml／時間〕。
【０２２２】カラムを２２８ml緩衝液Ａで洗浄した後、
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂのそれぞれ２２８mlの線形塩勾
配で溶出する。２２mlずつの画分を集める。ヒルジン化
合物は、分画７１〜７４（８８ml）に溶出し、トロンビ
ン阻害分析法によって同定する。活性な画分を、一晩４
℃で２０mM酢酸アンモニウムに対して透析する。次い
で、透析物を、２回凍結乾燥する。凍結乾燥生成物は、
逆相ＨＰＬＣによれば、デスルファトヒルジン化合物を
含む。
【０２２３】Ｃ．Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でのゲ
ル濾過およびＨＰＬＣによる最終的精製 トロンビン阻害試験で活性な主分画（８０mlの溶出液）
を、２０mM酢酸アンモニウム（pH７．５）に対して４℃
で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレーターを
用いて３５℃で濃縮して、最終容積を５mlとする。得ら
れる透明な水溶液を、ベッド容積が１６０mlのＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０精密カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
であって、カラム（２．５×６４cm，Ｂｉｏｒａｄ）を
５％酢酸で予備平衡化させておいたものに加える。
【０２２４】５０mlの溶出液（分画５〜７、流量５０ml
／時間、２５分／分画）に含まれる主活性成分をロータ
リー・エバポレーターを用いて濃縮して、次いで逆相Ｈ
ＰＬＣ分離を行う。各分画の一部分（５００μｌ）を、
「Ｓｐｅｅｄ ｖａｃ」濃縮機（Ｓａｖａｎｔ）を用い
て１０分の１に濃縮して、逆相ＨＰＬＣによってそのデ
スルファトヒルジン化合物の含量を分析する。溶液は、
デスルファトヒルジン化合物を含む。分画６（１８ml）
は極めて少量の第二の成分を含み、半調製用逆相ＨＰＬ
Ｃによって更に精製する。
【０２２５】実験条件：Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５１０
ＲＰ−ＨＰＬＣカラム、１０×２５０mm；分離毎の分画
６の一部（２００μｌ，１：１０に濃縮）；２２０nmで
０．５以下（ＡＵＦＳ）；流速：２ml／分；溶出液：
Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリル／
水（８：２）＋０．０７％トリフルオロ酢酸、１分間１
６％のＢ、次いで４０分間に６４％のＢまで増加。得ら
れる画分を水で１：１に希釈して、凍結乾燥する。残渣
は、純粋なデスルファトヒルジン化合物から成る。
【０２２６】（ｂ）Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲの細胞抽出液からのデス
ルファトヒルジン化合物の単離 細胞は、常法に従い破壊する（欧州特許出願第１００，
５６１号明細書参照）。２％酢酸で処理した上澄液を遠
心分離する（１２，０００ｒｐｍ，１０℃）。アンモニ
アを加えて最終pHを７．５として、僅かに不透明な溶液
（５０ml）を更に上記の様に処理する（実施例１９
ａ）。ヒルジン化合物は上記のようにして、すなわちト
ロンビン阻害法および逆相ＨＰＬＣによって同定する。
【０２２７】実施例２０．Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲの醗酵からの生成
混合物の分析 （ａ）上記のように（実施例１９ｂ参照）調製した上澄
液２mlを、高真空下で「Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ」濃縮機上
で乾燥する。試料をそれぞれ１００μｌの水に溶解し、
ＨＰＬＣ分析を行う（実験条件１、下記を参照された
い）。個々の画分のトロンビン阻害を試験する。保持時
間が１６．５分および１７．７分の画分が、トロンビン
阻害を示す。これらの２分画の比率（発現収率）は、約
４：１である。アミノ酸組成によれば、これらの画分は
デスルファトヒルジンである。 （ｂ）トロンビン阻害試験で活性である、実施例１９ａ
に記載の方法で得られる分画を、異なる２種類の条件下
でＨＰＬＣ分析にかける。
【０２２８】実験条件１：ヌクレオシル（ＭＮ）Ｃ１
８，５μｍ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム、４．６×１２０m
m：５０μｌヒルジン化合物／分離、２１４nmでａｔ
ｔ．６；流速１．２ml／分；溶出液：Ａ：０．１％トリ
フルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリル／水（８：２）＋
０．０８％トリフルオロ酢酸、２分間は１６％のＢ、次
いで５０分間を要して６４％のＢへ増加。逆圧：６６バ
ール。
【０２２９】実験条件２：２分間２０％のＢで、それ以
後４０分間を要して８０％のＢへ増加する勾配であるこ
とを除いて、上記と同じ条件。分画は１分間の間隔で採
取し（全部で４５）、そしてトロンビン阻害試験を行
う。画分１７〜１９は、活性である。更に、アミノ酸組
成、Ｎ−末端基およびＮ−末端配列を、画分１７および
１８の活性なヒルジン化合物について決定する。一つの
画分（第１７）は、更に、ヒルからの天然のヒルジンを
酵素アリールスルファターゼと反応させることによって
得られる標準のデスルファトヒルジンと比較する。これ
らの結果を、以下の表４にまとめる。
【０２３０】
【表４】
【０２３１】分画１７および１８の収量の比率は、約
４：１である。 （ｃ）上記（実施例１９ａ参照）と同様に調製した上澄
液２００mlについて、ＨＰＬＣ分析（条件３、以下を参
照）およびＦＰＬＣ分離（条件４）を行う。個々の分画
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が８．０分（ピ
ーク１）、１１．１分（ピーク２）および１２．１分
（ピーク３）である分画は、強力なトロンビン阻害を示
す。これらの３種類の化合物の比率（発現収率）は、約
１：４：１である。ＨＰＬＣ分析によれば、ピーク２お
よび３に対応する化合物は実施例２０ｂ（分画１７およ
び１８）に記載したヒルジン化合物と同一である。結果
を表５に示す。
【０２３２】
【表５】
【０２３３】実験条件３：Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ−Ｂ
５ＲＰ−ＨＰＬＣカラム、４．０×１２０mm，１５μｇ
のヒルジン化合物／分離、２１４nmでａｔｔ．７、流速
１．２ml／分；溶出液：Ａ：０．１％トリフルオロ酢
酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．０８％トリフルオロ酢
酸、２分間は１６％のＢ、次いで２０分間を要して４０
％のＢへ増加。逆圧：８０バール。
【０２３４】実験条件４：Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｎ
ｏＱ ＦＰＬＣアニオン交換カラム、５．０×５０mm，
１５μｇヒルジン化合物／分離、２８０nmでＡＵＦＳ
０．０１、流速１．０ml／分、勾配溶出緩衝液Ａ：２０
mMのトリス・ＨＣｌ（pH７．５）、緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ
＋１ＭのＮａＣｌ（pH７．５）、９分間は１５％のＢ
で、次いで２１分間を要して７０％のＢに増加。
【０２３５】実施例２１．Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲ株の醗酵からのデ
スルファトヒルジン化合物の特性決定 ＨＰＬＣ分析によれば、培地（実施例２０、表１および
２参照）から単離される分画１７（またはピーク１）お
よび１８（またはピーク２）のヒルジン化合物は、細胞
抽出液から単離された対応する化合物（細胞内ヒルジン
化合物）と同じである。これらの化合物およびピーク３
（表２を参照）は、次のようにして特性決定する。
【０２３６】（ａ）アミノ酸組成の決定 約２．５μｇの純粋なヒルジン化合物を、６ＮのＨＣｌ
を用いて１１０℃で２４時間加水分解し、次いでＣｈａ
ｎｇらの記載の方法〔ＤＡＢＳ−Ｃｌ法；Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第９１巻、４１頁、
（１９８３年）〕と同様にして分析する。加水分解物
は、次のような組成を有する。
【０２３７】
【表６】
【０２３８】
【表７】
【０２３９】
【表８】
【０２４０】（ｂ）部分配列の分析 １８μｇ（２．５nM）の純粋なヒルジン化合物を、Ｅｄ
ｍａｎの方法による通常の配列分析を行い、Ｎ−末端フ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸をＲＰ−
ＨＰＬＣによって決定する。結 果
【０２４１】
【表９】
【０２４２】ピーク１（表５を参照されたい） 上記のサイクル１からサイクル２９までの配列。ピーク３（分画１８、表１および５を参照されたい） 上記のサイクル１からサイクル２７までの配列。 したがって、検討した生合成ヒルジン化合物のＮ−末端
配列は、標準（真正）試料の配列と同じである。
【０２４３】（ｃ）Ｃ−末端分析 ヒルジン化合物をカルボキシペプチダーゼＹで消化し、
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する（Ｊ．
Ｙ．Ｃｈａｎｇ，Ｒ．Ｋｎｅｄｅｌ、及びＤ．Ｇ．Ｂｒ
ａｕｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第１９９巻、５４７頁
を参照されたい）。
【０２４４】結 果 ピーク１（表５を参照） Ｃ−末端アミノ酸：-Glu-Tyr、ピーク２（分画１７、表１および２参照） Ｃ−末端アミノ酸：-Glu-Tyr-Leu-Gln、ピーク３（分画１８、表４および５参照） Ｃ−末端アミノ酸：-Glu-Tyr-Leu。
【０２４５】（ｄ）見掛けの分子量 デスルファトヒルジン化合物（３０μｇ）を、ＳＤＳ尿
素ゲル上で分析する〔ＳＵＤＳゲル、Ｋｙｔｅら、Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１３３巻、５１５頁、（１
９８３年）参照〕。クマシーブルー染色の前に、１２％
のトリフルオロ酢酸で固定を行う。見掛けの分子量が６
０００〜７０００ダルトンに相当する単一バンドが観察
される。
【０２４６】（ｅ）ＦＡＢ−ＭＳによる分子量決定 デスルファトヒルジン化合物を、迅速原子衝撃陽イオン
マススペクトル分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）に付す。 分析機器：ＺＡＢ−ＨＢマススペクトル分析計（ＶＧ−
ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｔｄ．、マンチェスター）、マ
トリックス：チオグリセロール・キセノン衝撃；イオン
エネルギー； １０ＫｅＶ、外部標準：Ｃｓ26Ｊ25（分子量：６８８
７．９）およびＣｓ28Ｊ27（７１４７．７６）。
【０２４７】結 果 ピーク１（表２参照） 実験式：Ｃ276 Ｈ421 Ｎ77Ｏ107 Ｓ6 分子量（計算値）：６７２２．２３ 分子量（実測値）：６７１９．３。ピーク２（分画１７、表１および２参照） 実験式：Ｃ287 Ｈ440 Ｎ80Ｏ110 Ｓ6 分子量（計算値）：６９６３．５１８ 分子量（実測値）：６９６３．４４ 分子量は２つの異なる測定値の平均である。
【０２４８】ピーク３（分画１８、表１および２参照） 実験式：Ｃ282 Ｈ432 Ｎ78Ｏ108 Ｓ6 分子量（計算値）：６８３５．３９ 分子量（実測値）：６８３２．９。 上記のデーターに基づき、ピーク１の化合物はデスルフ
ァトヒルジン（１−６３）であり、ピーク２の化合物は
標準デスルファトヒルジン（１−６５）と同一であり、
ピーク３の化合物は新規なデスルファトヒルジン（１−
６４）である。
【０２４９】（ｆ）ヒト・トロンビン−ヒルジン解離定
数 ヒト・トロンビン−デスルファトヒルジン複合体の解離
定数ＫD は、Ｓ．Ｒ．Ｓｔｏｎｅ及びＪ．Ｈｏｆｓｔｅ
ｅｎｇｅの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５
巻、４６２２〜４６２８頁、（１９８６年）〕にしたが
って決定され、下記の表にまとめてある。表には、３種
類の得られたデスルファトヒルジン化合物の比活性（Ａ
ＴＵ／mgで表した）も示している。
【０２５０】
【表１０】
【０２５１】（ｇ）形質転換した酵母から得られるその
他のデスルファトヒルジン化合物 実施例１９に記載の方法で醗酵を行い、精製したデスル
ファトヒルジン化合物の混合物を、更に分離して、詳細
に特性決定する。Ｖｙｄａｃ ２１８ ＴＰ ５１０
ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で、半調製的分離を行うと、上
記デスルファトヒルジン化合物（実施例２１ｅ参照）の
他に、保持時間が８．１分でカラムから溶出するデスル
ファトヒルジン様化合物が生じる。
【０２５２】この物質は迅速原子衝撃マススペクトル分
析法（ＦＡＢ−ＭＳ）およびアミノ酸分析、部分配列決
定法およびＣ−末端分析によって特性決定される。ＦＡ
Ｂ−ＭＳは、この物質が、分子量がそれぞれ６４２９．
５および６５５６．８である２種類の化合物の混合物で
あることを示している。アミノ酸組成は、次のようであ
る。
【０２５３】
【表１１】 これらのデーターによれば、この混合物は、デスルファ
トヒルジン（１−６１）とデスルファトヒルジン（１−
６２）とから成る。実施例２２ ．シグナル配列のないデスルファトヒルジン
遺伝子を有する酵母におけるデスルファトヒルジン化合
物の発現（図７） （ａ）ｐＪＤＢ２０７ベクターフラグメントの単離 ６μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−３）
（ＥＰ １００，５６１）を、制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩを用いて完全に消化する。生成するＤＮＡフ
ラグメント（６．８５ｋｂおよび１．１５ｋｂ）をエタ
ノールで沈澱させ、４００μｌの５０mMのトリス・ＨＣ
ｌ（pH８．０）中で処理する。４．５単位のウシ腸ホス
ファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハイム）を加
える。混合物を３７℃で１時間インキュベーションした
後、ホスファターゼを６５℃で１．５時間で不活性化す
る。
【０２５４】溶液を１５０mM ＮａＣｌに調整した後、
１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mM ＮａＣ
ｌおよび１mM ＥＤＴＡで予め平衡にしておいたＤＥ５
２（Ｗｈａｔｍａｎ）アニオン交換カラム（１００μｌ
容量）に適用する。同じ緩衝液で洗浄操作を行った後、
ＤＮＡを４００μｌの１．５Ｍ ＮａＣｌ，１０mMトリ
ス・ＨＣｌ（pH７．５），１mM ＥＤＴＡで溶出させ、
エタノールで沈澱させる。６．８５ｋｂの大きなＢａｍ
ＨＩフラグメントが、トリス・ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液
（pH８．３）中１．２％アガロースゲル上で小さなフラ
グメントから分離される。
【０２５５】（ｂ）５３４ｂｐ ＰＨ０５プロモーター
フラグメントの単離 ６μｇのプラスミドｐ３１／Ｒ（ＥＰ１００，５６１）
を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化する。生成する３種のＤＮＡフラグメントを、
トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中１．２
％アガロースゲル上で分離する。５３４ｂｐ ＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントが単離される。このフラグ
メントは、転写開始部位を有するＰＨ０５プロモーター
を含んでいる。
【０２５６】（ｃ）デスルファトヒルジンをコードする
配列を有する２０６ｂｐ ＤＮＡフラグメントの単離 ９μｇのプラスミドｐＭＬ３１０（実施例１３ｃ参照）
を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化
する。生成する２種類のＤＮＡフラグメントを、トリス
−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中１．２％アガ
ロースゲル上で分離する。２０６ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントが、単離される。
【０２５７】（ｄ）ＤＮＡフラグメントの連結 第ａ〜ｃ項で述べた３種類のＤＮＡフラグメント（上記
参照）を、電気溶出によってアガロースゲルから得、Ｄ
Ｅ５２（Ｗｈａｔｍａｎ）アニオン交換体上で精製し、
エタノールで沈澱し、水に再分散する。０．１ｐモル
（０．４５μｇ）の６．８５ｋｂ ＢａｍＨＩベクター
フラグメント、０．３ｐモル（０．１μｇ）の５３４ｂ
ｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＰＨ０５プロモーターフ
ラグメントおよび０．２５ｐモル（３４ng）のｐＭＬ３
１０の２０６ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメン
トを、１５μｌの６０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５），
１０mM ＭｇＣｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＴお
よび６００単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）中で１５℃で１６時間連結させる。
【０２５８】２４個の形質転換したａｍｐR コロニー
を、１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中で
別々に培養する。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅｓら
（上記）の方法によって単離し、ＨｉｎｄIII −Ｅｃｏ
ＲＩ二重消化によって分析する。約６００ｂｐの大きな
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントの出現は、関連
するクローンではＰＨ０５プロモーター−ヒルジンＤＮ
Ａフラグメントがベクター上の転写停止シグナルに対し
て正確な方向にあることを示している。予想されるよう
に、約５０％のクローンはインサートの正確な方向を有
する。これらのクローンの一つをｐＪＤＢ２０７Ｒ／Ｐ
Ｈ０５−ＨＩＲと命名する。
【０２５９】（ｅ）サッカロミセス・セレビシエーＧＲ
Ｆ１８の形質転換 サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８株（α，ｈｉ
ｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２
−１１２，ｃａｎR ）を、Ｈｉｎｎｅｎら（上記）の方
法にしたがってプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５
−ＨＩＲを用いて形質転換する。形質転換された酵母細
胞の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天
平板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離さ
れ、サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤ
Ｂ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＨＩＲと命名する。
【０２６０】（ｆ）Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
ＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＨＩＲの培養 Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ
０５−ＨＩＲの細胞を、２０mlの酵母最低培地（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ培養基、アミノ酸
なし、２％グルコースおよび２０mg／ｌのＬ−ヒスチジ
ンを添加）中で３０℃で攪拌し、細胞密度が３×１０7
個／mlになるまで培養する。細胞を０．９％ＮａＣｌで
洗浄し、次いで低Ｐi −最低培地中に５０ml培養液を接
種するのに用いる。
【０２６１】低Ｐi −最低培地は、Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａ
ｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ培地（アミノ酸な
し）の組成に対応して調製されるが、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ，２％グルコースおよび１ｇ／ｌのＬ−ヒスチジンの
代わりに０．０３ｇ／ｌのＫＨ 2 ＰＯ4 ，１ｇ／ｌのＫ
Ｃｌ、および１０ｇ／ｌのＬ−アスパラギンを含む。培
養液を接種して細胞密度を４×１０6 個／mlとし、３０
℃で４２時間２００ｒｐｍで攪拌する。
【０２６２】（ｇ）Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
ＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＨＩＲの醗酵からの生成混合
物の分析 細胞（実施例２２ｆ参照）を、通常の方法にしたがって
破壊する（例えば、欧州特許出願第１００，５６１号明
細書参照）。１．５％酢酸で処理した上澄液を遠心分離
し、そしてそれぞれ２mlの透明な溶液を「Ｓｐｅｅｄ
Ｖａｃ」濃縮機上で高真空で乾燥する。試料をそれぞれ
１００μｌの水に溶解して、ＨＰＬＣ分析を行う（条件
は実施例２０と同じ）。それぞれの分画のトロンビン阻
害を試験する。
【０２６３】保持時間が１６．５分の分画がトロンビン
阻害活性を有する。アミノ酸組成によれば、この分画は
デスルファトヒルジンである。ＨＰＬＣ分析によれば、
この力価は約１０μｇ／リットルである。培地には、ヒ
ルジン活性は検出されない。付帯のシグナル配列を持た
ないかまたは有するデスルファトヒルジン遺伝子を担持
する酵母株から得られる細胞内および細胞外ヒルジン活
性の収量を、表３にまとめてある。ヒルジン活性はトロ
ンビン阻害法によって測定する。
【０２６４】
【表１２】
【０２６５】実施例２３．ＰＨ０５プロモーター欠落体
の造成 （ａ）Ｂａｌ３１消化 図８に示されるＰＨ０５のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグ
メントを含有する組換ファージＭ１３ｍｐ９／ＰＨ０５
Ｂａｍ−Ｓａｌを、ＰＨ０５プロモーター源として用
いる（欧州特許出願第１４３，０８１号明細書参照）。
２０μｇのファージＤＮＡ（ＲＦ：複製形）を制限エン
ドヌクレアーゼＳａｌＩで消化して、約９ｋｂの線状Ｄ
ＮＡを生成せしめる。フェノール／クロロホルムで抽出
の後、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡを、
１０mMのトリス（pH８．０）に再分散させて、濃度を
０．５μｇ／mlとする。
【０２６６】１６μｇのＳａｌＩ開裂したＤＮＡを、１
００μｌの２０mMトリス（pH８．０），１９９mM Ｎａ
Ｃｌ，１２mM ＭｇＣｌ2 ，１２mM ＣａＣｌ2 および
１mMのＥＤＴＡ中で２単位のエキソヌクレアーゼＢａｌ
３１（ＢＲＬ）で消化する。３０℃で１，２，３４，５
および６分間インキュベートした後に２μｇずつのＤＮ
Ａを採取して、直ちに５０μｌのフェノールおよび６０
μｌのＴＮＥと混合する。
【０２６７】フェノール／クロロホルムで抽出し、エタ
ノール沈澱した後、ＤＮＡを１００μｇ／mlの濃度で１
０mMのトリス（pH８．０）に再分散する。Ｂａｌ３１に
よるエンドヌクレアーゼ切断の程度を分析するため、そ
れぞれの時間に採取した０．５μｇずつのＤＮＡをエキ
ソヌクレアーゼで消化して、トリス−ホウ酸緩衝液（pH
８．３）〔９０mMトリス・ＨＣｌ（pH８．３），９０mM
ホウ酸、２．５mM ＥＤＴＡ〕中、１．５％アガロース
ゲル上で分析する。
【０２６８】（ｂ）Ｂａｌ３１で処理したＤＮＡへのＥ
ｃｏＲＩリンカーの付加 ２個のＡ260 単位のＥｃｏＲＩリンカー（５-GGAATTCC-
3 ）を、２５０μｌの１０mMトリス（pH８）および１mM
ＥＤＴＡに再分散する。２μｇのＥｃｏＲＩリンカー
を７５μｌの６０mMトリス（pH７．５），１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 ，１５mMＤＤＤＴ，１０μＭ ＡＴＰおよび３３
単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ）中でキナーゼ処理する。３７℃で１時間後に、
混合物を室温に冷却して、次いで−２０℃で貯蔵する。
【０２６９】アニールした２本鎖ＥｃｏＲＩリンカー
を、それらの平滑端により、Ｂａｌ３１で処理したＤＮ
Ａフラグメントに連結する。０．５μｇのＢａｌ３１で
処理したＤＮＡ（実施例２３ａ参照）を、２０μｌの６
０mMトリス（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，１０mM
ＤＤＴ，４mM ＡＴＰおよび６００単位のＴ4 ＤＮＡ
リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で、５０倍過剰量のキナ
ーゼ処理したＥｃｏＲＩリンカーと共に室温で１６時間
インキュベートする。Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを不活性化し
た後（６５℃，１０分間）、過剰のＥｃｏＲＩリンカー
を、５０μｌの容量中でＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）５０単位で切断する。
【０２７０】ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出
して、エタノールで沈澱させ、１０mMトリスおよび１mM
ＥＤＴＡ（＝ＴＥ）中に再分散する。次いで、ＤＮＡ
を５単位のＢａｍＨＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断し、混
合物を１．５％の低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）
／トリス−ホウ酸緩衝液（上記参照）に適用する。バン
ドを臭化エチジウムで染色し、３６６nmの長波長紫外線
下で可視化する。約１００ｂｐ〜６００ｂｐの幅広い拡
散バンドパターンをゲルから切り取り、ＤＮＡを次のよ
うにして抽出する。
【０２７１】すなわち、アガロースの切片を６５℃で液
化し、そして５００mM ＮａＣｌに調整し、そして６５
℃で２０分間インキュベートする。１容のフェノール
〔１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５），１mM ＥＤＴＡ
および５００mM ＮａＣｌで平衡にしたもの〕を加え
る。水相をフェノールで２回再抽出し、クロロホルムで
１回抽出する。ＤＮＡを２．５容の冷無水エタノールで
沈澱させ、遠心分離によって集める。ＤＮＡのペレット
を冷８０％エタノールで洗浄し、次いで真空で乾燥す
る。ＤＮＡを１０μｌのＴＥに再分散する。
【０２７２】（ｃ）Ｍ１３ｍｐ９中への連結 ３μｇのＭ１３ｍｐ９のＲＦを、５０μｌの容積中、１
５単位のＥｃｏＲＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）および１５単位
のＢａｍＨＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて消化す
る。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡ
を５０μｌのＴＥに再分散する。５μｌの切断されたベ
クターＤＮＡ（約２００ng）を１０μｌの上記試料（実
施例２３ｂに記載の方法で各種のＢａｌ３１消化物から
得られるＤＮＡフラグメント）と混合して、６０mMトリ
ス・ＨＣｌ（pH７．５），６mMＭｇＣｌ2 ，１０mM Ｄ
ＴＴ，１mM ＡＴＰおよび２００単位のＴ4 ＤＮＡリガ
ーゼの存在で総量２０μｌ中で１５時間リガーゼ処理す
る。
【０２７３】Ｅ．コリＪＭ１０１株のコンピテント細胞
の形質導入は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ発行のマニュアル「Ｍ１３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ」に準じて行
う。多数の白色プラークからのファージを増殖させ、制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断することによ
って、ＤＮＡインサートの大きさを分析する。
【０２７４】（ｄ）Ｓａｎｇｅｒ配列決定法によるＢａ
ｌ３１欠失末端の決定（ＳａｌＩ部位からの欠失） 配列決定は、上記のマニュアルに記載のようにＳａｎｇ
ｅｒらのジデオキシＤＮＡ配列決定方式〔Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、第７４巻、５４６
３頁（１９７７年）〕を用いて行う。欠失末端部を、以
下に示す。
【０２７５】
【表１３】
【０２７６】（ｅ）Ｓａｎｇｅｒ配列決定法によるＢａ
ｌ３１欠失末端の決定（ＢａｍＨＩ部位からの欠失） Ｍ１３ｍｐ９ ＰＨ０５ Ｂａｍ−ＳａｌをＢａｍＨＩ
によって切断することを除いて、同様なセットのＢａｌ
３１欠失を、前記（ａ）〜（ｃ）に記載したのと同様に
行う。Ｂａｌ３１で消化された分子を、ＥｃｏＲＩおよ
びＳａｌＩによって切断し、生成したフラグメントをＥ
ｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化したＭ１３ｍｐ９中にク
ローン化する。欠失末端点を、以下に示す。
【０２７７】
【表１４】
【０２７８】（ｆ）内部ＰＨ０５プロモータ欠失の構成 （ｄ）に記載のＢａｌ３１欠失セットはＥｃｏＲＩで終
わる「左腕」ＰＨ０５プロモーターフラグメントを生成
し、（ｅ）に記載のＢａｌ３１欠失セットはＥｃｏＲＩ
で終わる「右腕」ＰＨ０５プロモーターフラグメントを
生成する。各種位置の「左腕」と「右腕」を組み合わせ
ることにより、欠失したＤＮＡの位置にＥｃｏＲＩリン
カーセグメントを含む内部欠失が生成される。
【０２７９】それぞれの内部欠失は、制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（左腕）、またはＥ
ｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（右腕）よってＭ１３ｍｐ９か
ら「左腕」および「右腕」を切断し、（ｂ）に記載した
のと同様にソフトアガロース電気泳動法により対応する
フラグメントを単離することによって構成される。等モ
ル量の「左腕」、「右腕」、および２００ngのＢａｍＨ
ＩおよびＳａｌＩ消化したＭ１３ｍｐ９ベクターＤＮＡ
を（ｃ）に記載したのと同様に連結する。Ｅ．コリＪＭ
１０１に形質導入した後、白色プラグを採取して、ＲＦ
を生成させて、制限分析（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，Ｅｃ
ｏＲＩ）によって分析する。次の腕を組み合わせて、
（ヌクレオチドの番号に対する、図８参照）特異的内部
欠失を形成する。
【０２８０】
【表１５】
【０２８１】（ｇ）ＰＨ０５プロモータの内部欠失の生
体内分析 野生型のＰＨ０５ Ｂａｍ−Ｓａｌフラグメントを欠失
した対応物に置き換えることによって、実施例２３
（ｆ）に記載の各種欠失を、プラスミドｐＪＤＢ２０７
／ＰＨ０５〔Ｒ．Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ−Ｔｓａｐｉｓ
及びＡ．ＨｉｎｎｅｎのＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、２６６８
〜１６７５頁（１９８４年）〕中にクローン化する。酵
母Ｓ．セレビシエＡＨ２１６株を形質転換した後（欧州
特許出願第１４３，０８１号明細書参照）、酸性ホスフ
ァターゼ活性をＴｏｈ−ｅらにより記載された方法
〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１１３巻、７２７頁、
（１９７３年）〕によって決定する。
【０２８２】欠失△１１および△１２は、ＰＨ０５活性
の約１０分の１への低下を示し、ＰＨ０５発現に本質的
な上流領域（「上流活性化部位」、ＵＡＳ）を定義して
る。同様な低下効果は、欠失△１７（約５分の１へ低
下）およびＴＡＴＡボックス欠失△２３〜△２６（約３
０分の１へ低下）で観察される。総てのその他の欠失
は、ほぼ野生株の水準の活性を示す。これらの結果は、
ＰＨ０５の発現に本質的な情報の３種類の部分は次の位
置に配置されていることを示唆する。
【０２８３】 １．−３４９〜−３８３の位置（ＵＡＳ１）、 ２．−２２５〜−２６３の位置（ＵＡＳ２）、 ３．− ８７〜−１２５の位置（ＴＡＴＡボックス）。ＰＨ０５ のＵＡＳ１またはＵＡＳ２またはＵＡＳ１およ
びＵＡＳ２を含むＤＮＡフラグメントは、組換ファージ
Ｍ１３ｍｐ９／ＰＨ０５ Ｂａｍ−Ｓａｌ（上記参照）
から適当な制限エンドヌクレアーゼで切断することによ
って生成させることができる。ＵＡＳ１は、次の式：
【０２８４】
【化１２】 を有する２６８ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメン
トに含まれる。ＵＡＳ２は、次の式：
【０２８５】
【化１３】 を有する１００ｂｐ ＣｌａＩ−ＢｓｔＥIIフラグメン
トに含まれ、そしてＵＡＳ１およびＵＡＳ２は共に、次
の式：
【０２８６】
【化１４】 を有する３６８ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥIIフラグメ
ントに存在する。
【０２８７】実施例２４．融合したＰＨ０５−ＧＡＰＤ
Ｈハイブリッドプロモーターの制御下でのデスルファト
ヒルジンの発現 実施例２３は、ＰＨ０５遺伝子の位置−３６５付近の領
域〔ＵＡＳ１（ＰＨ０５）〕、および位置−１８０付近
のもう一つの領域〔ＵＡＳ２（ＰＨ０５）〕を、調節機
能を有するＵＡＳの可能な候補とする。ＵＡＳ１（ＰＨ
０５）は、２６８ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントに含まれ、他方ＵＡＳ１（ＰＨ０５）およびＵＡＳ
２（ＰＨ０５）は共に３６８ｂｐ ＢａｍＨＩ−Ｂｓｔ
ＥIIフラグメントに含まれる。これらの２種類のフラグ
メントはそれぞれ、ＴＡＴＡボックスおよびＧＡＰＤＨ
の転写開始部位を含む２種類の異なるＧＡＰＤＨ下流の
プロモーター要素に融合する。
【０２８８】（ａ）酵母遺伝子ライブラリーの構成 野生型サッカロミセス・セレビシエーＳ２８８Ｃ株から
得られる総量が３０μｇの高分子量酵母ＤＮＡ〔Ｍ．
Ｖ．Ｏｌｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１３２
巻、３８７頁（１９７９年）〕を、２単位のＥｃｏＲＩ
メチラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を用いて、供給業者が勧める方法に従って、２５０
μｌのＥｃｏＲＩ ｕチル化緩衝液中で３７℃で３０分
間インキュベートする。
【０２８９】ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、５００μ
ｌの２５mMトリス・ＨＣｌ（pH８．５），２．５mM Ｍ
ｇＣｌ2 （ＥｃｏＲＩ* 緩衝液）〔Ｈ．Ｍｅｙｅｒ，Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第９０巻、３４１頁（１９７９
年）〕に再分散し、そしてＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ）で消化して、ＤＮＡフラグメントの分布が３０
〜５０ｋｂの範囲に最大値を有するようにする（λＤＮ
ＡのＸｈｏＩ消化は適当な３３ｋｂおよび１７ｋｂマー
カーを提供する）。ＥｃｏＲＩ* 条件下で消化される酵
母ＤＮＡはシュークロース勾配〔５〜２０％シュークロ
ース／１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．５）および１mM
ＥＤＴＡ〕で、ＳＷ４０ローター中で３８，０００ｒｐ
ｍにて６時間サイズ分画する。
【０２９０】０．４mlずつの３０個の分画を、勾配の上
部から集める。分画１６は、大きさが３０〜４０ｋｂの
ＤＮＡフラグメントを含む。この分画のＤＮＡ（３μ
ｇ）をエタノールで沈澱させ、ＥｃｏＲＩで線状化され
た１μｇのコスミドベクターｐＹｃｌ〔Ｂ．Ｈｏｈｎ
ら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、第
２巻、１６９頁、ニューヨーク、１９８０年〕に、合計
容量１５μｌ中で、１５℃で１６時間連結させる。連結
は、３００単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、業者により記載
されている緩衝液系を使用して行う。
【０２９１】ＤＮＡを生体外でバクテリオファージλ
〔Ｂ．Ｈｏｈｎ，「Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ」、第６８巻、２９９頁、ニューヨーク、１９
７９年〕にパッケージし、そして集成されたファージを
用いてＥ．コリＨＢ１０１株を形質導入する（ｒ k - ，
ｍ k - ，ｌｅｕ - ，ｐｒｏ - ，ｒｅｃＡ）。形質導入の
効率は、１μｇのｐＹｃｌベクター当たり約５０００個
のアンピシリン耐性コロニーである。３０００個のａｍ
ｐR コロニーを採取し、そして１００μｇ／mlのアンピ
シリンを含むＬＢ培地〔１０ｇのＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ），５ｇのＢａｃｔｏ Ｙｅａｓ
ｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）および１０ｇのＮａ
Ｃｌ〕中でマイクロタイター・ディッシュのウェルでそ
れぞれ増殖させる。
【０２９２】（ｂ）酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子の単離 上記の遺伝子ライブラリーを、次の構造： ５′-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-３′ を有する合成オリゴヌクレオチド〔ホスホトリエステル
法を用いて調製：Ｋ．Ｉｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃｌ．Ｔ
ｒａｖ．Ｃｈｉｍ．，Ｐａｙｓ−Ｂａｓ，９８，５３７
（１９７９）〕によりスクリーニングする。１０μｇの
オリゴヌクレオチドを、Ｍａｎｉａｔｉｓらにより記載
された方法〔「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂ．，１９８２年、１２５頁〕により、Ｔ4 ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と共に１０μ
ｌのγ−32Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／mM，１０μＣｉ
／μｌ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて全容積５０μｌ中
でキナーゼ処理をする。コロニーハイブリダイゼーショ
ンは、上記文献（３１２頁）に記載の方法で行う。
【０２９３】Ｋｏｄａｋ Ｋ−５Ｘ線フィルムを用いる
オートラジオグラフィにより、陽性クローンを検出す
る。プラスミドＤＮＡを単離して、ＧＡＰＤＨをコード
する２１００ｂｐ ＨｉｎｄIII フラグメントを含むハ
イブリッドクローンを得る〔Ｊ．Ｐ．Ｈｏｌｌａｎｄ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，９８３９（１９
７９）〕。
【０２９４】クローン化されたＤＮＡが真性であること
は、２本鎖ＤＮＡについてＧ．Ｆ．Ｈｏｎｇ〔Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ １，２４３（１９８
１）〕により記載されたジデオキシ配列決定法との組み
合わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるＤＮ
Ａ配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化
ＧＡＰＤＨ遺伝子（第９図参照）は、Ｈｏｌｌａｎｄら
が報告しているｇａｐ４９１と同じ配列を有する〔Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，２５９６（１９８
０）〕。
【０２９５】（ｃ）ＧＡＰＤＨ下流プロモーター要素の
調製 ＧＡＰＤＨ遺伝子のＡＴＧからの位置−２７〜−６７５
を含む６４９ｂｐ ＴａｑＩフラグメント（図９参照）
を、ＴａｑＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で上記ハイブリッドプラスミドを消化し、ＤＮＡフ
ラグメントを１．２％ソフト・アガロースゲル上で分離
し、そして熱フェノールによりＤＮＡを抽出することに
より単離する（実施例２３参照）。ＴａｑＩフラグメン
トのクローン化はｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位中に為さ
れる。すなわち、１μｇのｐＢＲ３２２を３単位のＣｌ
ａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用
いて、業者により記載された方法で切断する。
【０２９６】３００ngのフェノール処理されそして切断
されたベクターを２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて、約３００ngのインサートＤＮＡ（６４９ｂｐ Ｔ
ａｑフラグメント）に全容積２０μｌ中で連結する。
Ｅ．コリＨＢ１０１を形質転換してアンピシリン耐性に
し、プラスミドＤＮＡを調製し、そして制限分析によっ
て分析する。〔ＴａｑＩ，ＤｒａＩ〕。ＴａｑＩフラグ
メントの方向は、制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩをプ
ラスミドのＢａｍＨＩ部位と組み合わせて用いることに
より確立され、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII 部位の近く
に位置−６７５の部位を有するＴａｑＩプラスミドを選
択する。
【０２９７】ｐＢＲ３２２／ＧＡＰＤＨと命名されるこ
のプラスミドを、ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状化し、そしてＢａｌ３
１を用いる消化を、ＢｇｌIIリンカー（５-CAGATCTG-
３，Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いる
ことを除き、実施例２３と同様にして行い、そして消化
されたプラスミドを５μｇ／mlの濃度で、全容量２０μ
ｌ中で直接環状化する。Ｂａｌ３１で短縮されたＴａｑ
Ｉフラグメントの大きさを、（ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄ
III を用いる）制限分析により決定する。
【０２９８】２つのクローンが選択され、これらはそれ
ぞれＡＴＧ上流からＧＡＰＤＨプロモータへと２００ｂ
ｐおよび２６５ｂｐ伸びるＤＮＡフラグメントを含む。
これらのフラグメントは、約−１４０ｂｐに仮定のＴＡ
ＴＡボックスを有する。これらのクローンはなお、ＤＮ
ＡのｐＢＲ３２２由来部分に複製開始点を含み、それぞ
れｐＧＡＰＤＨ−ＦおよびｐＧＡＰＤＨ−Ｅと命名され
る。
【０２９９】（ｄ）ＰＨ０５のＵＡＳ１（ＰＨ０５）を
伴う下流ＧＡＰＤＨプロモーター要素とデスルファトヒ
ルジン蛋白質コード領域との結合 Ｉ）ＧＡＰＤＨ要素 −２７の位置のＴａｑＩ部位からＧＡＰＤＨ遺伝子のＡ
ＴＧに直接隣接する位置までＧＡＰＤＨプロモーター要
素を延長するため、次の構造を有する２個の合成相補的
オリゴヌクレオチドを合成する。
【０３００】５′ CGAATAAACACACATAAATAAAG ３′ ３′ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA ５′ これらのオリゴヌクレオチドは、位置−２６から位置−
５への純粋なＧＡＰＤＨプロモータを提供し、末端Ｅｃ
ｏＲＩ部位を生じさせる。２μｇの２種類のＢａｌ３１
単離体（実施例２４ｃから）（プラスミドｐＧＡＰＤＨ
−Ｅおよび−Ｆ）を６単位のＴａｑＩを用いて５０μｌ
中で消化し、生成する混合物をフェノール抽出し、エタ
ノール沈澱し、そして１０μｌの水に再分散する。合成
オリゴヌクレオチドを、１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．
５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５０mM ＮａＣｌを含有す
る１００μｌ溶液中で各単鎖２μｌを混合し、９０℃で
３分間加熱し、溶液を徐々に室温にまで冷却することに
より（約３時間以内）アニールする。
【０３０１】ＴａｑＩ消化された各プラスミド１μｇを
約２０倍モル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレオ
チドと、８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、２
０μｌの容積中で１８時間混合する。全混合物を３単位
のＢｇｌII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で消化し、ＤＮＡフラグメントを１．５％ソフトア
ガロースゲル上で分離する。約２００ｂｐおよび２６５
ｂｐのＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメントをゲルから切
り取り、抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
【０３０２】プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＥをＢｇｌIIお
よびＥｃｏＲＩを用いて消化し、大きな（約３．５ｋ
ｂ）フラグメントを単離する。このフラグメントをベク
ターとして用いて、上記のような連結、形質転換および
プラスミド単離条件を用いながら、前記２６５ｂｐおよ
び２００ｂｐのＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメントをク
ローン化する。生成したプラスミドは、ｐＧＡＰＤＨ−
ＥＬおよびｐＧＡＰＤＨ−ＦＬと命名される。プラスミ
ドｐＧＡＰＤＨ−ＥＬおよびｐＧＡＰＤＨ−ＦＬ中のク
ローン化ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメントのＤＮＡ配
列を第１１図に示す。フラグメントの正確な大きさはそ
れぞれ６６ｂｐおよび２０１ｂｐである。
【０３０３】II）ＵＡＳ１（ＰＨ０５）制御要素 ３μｇのプラスミドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願第１０
０，５６１号明細書参照）を６単位のＣｌａＩ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化す
る。３′の欠損端を、Ｍａｎｉａｔｉｓ（上記）の方法
に従いて、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗフラグメント（Ｂｅｔｈｅｄｓａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてフィルインす
る。ＢｇｌIIリンカー（５′-CAGATCTG-３′）を、例２
３に記載したのと同様に付加する。ＤＮＡをＳａｌＩお
よびＢｇｌII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で消化し、１％ソフトアガロースゲル上で処理す
る。５４８ｂｐフラグメントをゲルから切り取り、フェ
ノール抽出して、上記のようにエタノール沈澱する。
【０３０４】III ）デスルファトヒルジンをコードする
ＤＮＡ プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（Ｅｃｏ）−ＨＩ
Ｒの造成（第１２図参照） ＵＳＡ（ＰＨ０５）−ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモー
ター要素をＰＨ０５シグナル配列を含むデスルファトヒ
ルジンのコード領域に好都合に接続するため（プラスミ
ド ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲのように）、Ｅ
ｃｏＲＩ制限部位を、ｍＲＮＡ開始部位とコード領域の
ＡＴＧとの間の５′非翻訳領域に導入する。
【０３０５】１５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−ＨＩＲ（実施例１６ｄ参照）を、制限エンドヌ
クレアーゼＤｒａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化す
る。生成する４個のフラグメントを０．８％アガロース
ゲル上トリス・ホウ酸・ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中
で分離する。ゲルから４．２ｋｂのＤＮＡフラグメント
を回収し、電気溶出し、エタノール沈澱する。ＤＮＡを
水に再分散して、０．６mg／mlの濃度にする。次の式：
【０３０６】
【化１５】
【０３０７】の２種類の合成オリゴヌクレオチド（２．
３μｇおよび２．９μｇ）をそれぞれ２０μｌの６０mM
トリス（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mM ＤＴ
Ｔ，０．５mM ＡＴＰおよび２０単位のＴ4 ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中でキナーゼ
処理をする。３７℃で４５分後に、これらの反応混合物
を一緒にし、７５℃で１０分間加熱し、そして室温に放
冷する。アニールしたオリゴヌクレオチドリンカーを−
２０℃で貯蔵する。
【０３０８】６．５μｇ（２．３ｐモル）の４．２ｋｂ
ＤｒａＩ ＤＮＡフラグメントを７０倍過剰量のキナ
ーゼ処理してアニーリングしたオリゴヌクレオチドリン
カーと共に５０μｌの６０mMトリス（pH７．５），１０
mM ＭｇＣｌ2 ，５mM ＤＴＴ，３．５mM ＡＴＰおよ
び８００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）
中でインキュベートする。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを８５℃
で１０分間不活性化した後、過剰のリンカーを１０mM
ＥＤＴＡ，３００mM酢酸ナトリウム（pH６．０）および
０．５容のイソプロパノールの存在でＤＮＡを沈澱させ
ることにより除去する。ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
III とで消化する。
【０３０９】生成するフラグメントを１％アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で
分離する。６４３ｂｐフラグメントを、電気溶出および
エタノール沈澱によりゲルから回収する。ＤＮＡを再分
散させて、濃度を０．１ｐＭ／μｌにする。ＥｃｏＲＩ
−ＨｉｎｄIII フラグメントはＰＨ０５シグナル配列、
デスルファトヒルジンのコード配列およびＰＨ０５転写
ターミーネーターを含む。５３４ｂｐ ＰＨ０５プロモ
ーターフラグメントをプラスミドｐ３１／Ｒ（欧州特許
出願第１００，５６１号明細書）から単離する。
【０３１０】１０μｇのｐ３１／Ｒを制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化する。生成する
３個のフラグメントを０．６％の低融点アガロースゲル
上トリス−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で分離
する。５３４ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメン
トを分離する。これはｍＲＮＡ開始部位を含むＰＨ０５
プロモーターを含有する。
【０３１１】ベクターフラグメントをプラスミドｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲから単離する（実施例１６
ｄ）。このプラスミド６μｇをＢａｍＨＩとＨｉｎｄII
I とで消化する。大きな６．５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄIII フラグメントを、０．６５低融点アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で
小さなフラグメントから分離する。
【０３１２】適切な接着末端を有する上記の３個のＤＮ
Ａフラグメントを以下の反応で連結する。０．２ｐモル
（７０ng）の５３４ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ Ｐ
Ｈ０５プロモーターフラグメント、０．２ｐモル（８５
ng）の６４３ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグメ
ント、０．２ｐモル（８５ng）の６４３ｂｐ ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄIII フラグメント（ヒルジンコード配
列）、および０．１ｐモル（０．４μｇ）の６．５ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII ベクターフラグメントを、
１０μｌの６０mMトリス（pH７．５），１０mM ＭｇＣ
ｌ2 ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰおよび４００単位の
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ中で１５℃で６時間連結する。
【０３１３】連結混合物１μｌを１００μｌのカルシウ
ム処理した形質転換コンピテントＥ．コリＨＢ１０１細
胞に加える。１２個の形質転換したａｍｐR コロニーを
それぞれ１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地
で増殖させる。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅｓらの方
法により調製し〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，
（１９８１）１９３〕、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限
酵素により分析する。予想される制限フラグメントを有
するクローンを単離し、そしてｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０
５（Ｅｃｏ）−ＨＩＲと命名する。
【０３１４】IV）ＵＡＳ１（ＰＨ０５）−ＧＡＰＤＨハ
イブリッドプロモーターのデスルファトヒルジン蛋白質
コード領域への連結 １５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（Ｅｃ
ｏ）−ＨＩＲ（実施例２４ｄIII 参照）を、ＥｃｏＲＩ
とＨｉｎｄIII とで消化する。ＤＮＡフラグメントを１
％アガロースゲル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液
（pH８．３）中で分離する。６４３ｂｐフラグメントを
ゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノールで沈澱
される。ＤＮＡを水に再分散し、０．１ｐＭ／μｌの濃
度とする。
【０３１５】６μｇのプラスミドｐＨＤＢ２０７／ＰＨ
０５−ＨＩＲを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII
とＳａｌＩとで完全に消化する。６．３ｋｂフラグメン
ト（ベクター部分）をソフトアガロースゲル電気泳動、
フェノール抽出、およびエタノール沈澱により単離す
る。ベクターＤＮＡフラグメントを水に再分散し、０．
０５ｐモル／μｌの濃度にする。１０μｇのプラスミド
ｐＧＡＰＤＨ−ＥＬ（実施例２４ｄＩ参照）をＢｇｌII
とＥｃｏＲＩとで消化する。２６６ｂｐ ＢｇｌII−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを１．２％アガロースゲル上トリ
ス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で分離し、
ゲルから電気溶出し、そしてエタノールで沈澱させる。
ＤＮＡを水に再分散され、０．３ｐモル／μｌの濃度に
する。
【０３１６】０．３ｐモルのＵＡＳ１（ＰＨ０５）（実
施例２４ｄII）を含んで成る５４８ｂｐ ＳａｌＩ−Ｂ
ｇｌIIフラグメント、０．３ｐモルのｐＧＡＰＤＨ−Ｅ
Ｌの２６６ｂｐ ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメント、
０．３ｐモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５（Ｅｃ０）−
ＨＩＲの６４３ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メント、および０．１２ｐモルの６．３ｋｂ ＳａｌＩ
−ＨｉｎｄIII ベクターフラグメントを、２０μｌの５
０mMトリス（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ2，５mM
ＤＴＴ，１mM ＡＴＰおよび４００単位のＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で１５℃で６時間連結させ
る。
【０３１７】連結混合物１μｌおよび３μｌを１００μ
ｌのカルシウム処理したＥ．コリＨＢ１０１細胞に加え
る。ａｍｐR コロニーからのプラスミドの単離およびＳ
ａｌＩ，ＢｇｌＩ，ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII を用
いる制限分析を、上記のように行う（実施例２４ｄIII
参照）。１個の陽性クローンを選択し、ｐＪＤＢ２０７
／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１）と命名する。同様な
造成を、ｐＧＡＰＤＨ−ＦＬから分離される２０１ｂｐ
ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメントを用いて行う。１
個の選択されたプラスミドをｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦ
Ｌ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１）と命名する。
【０３１８】（Ｖ）ＵＡＳ１（ＰＨ０５）−ＵＡＳ２
（ＰＨ０５）−ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターの
デスルファトヒルジン蛋白質コード領域への連結 ３μｇずつのプラスミドｐＨＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−
ＨＩＲ（ＵＡＳ１）およびｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ
−ＨＩＲ（ＵＡＳ１）を、それぞれＢｇｌIIで消化す
る。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓらの方法に従い、ＤＮＡの３′欠損末端を、
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメン
ト、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）との反応によりフィルインする（上
記）。
【０３１９】酵素を７０℃で１０分間不活性化させる。
ＤＮＡを更にＳａｌＩで消化して、大きな７．２ｋｂフ
ラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱により単離する。各フラグ
メントを水に再分散させ、０．０５ｐモル／μｌの濃度
にする。フラグメントはヒルジンコード領域、ほとんど
のベクター配列およびｐＧＡＰＤＨ−ＥＬまたはｐＧＡ
ＰＤＨ−ＦＬから単離される２種類の異なるＧＡＰＤＨ
プロモーター要素を含む。
【０３２０】プラスミドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願第１
００，５６１号明細書）を、上記のようにＢｓｔＥIIで
消化し、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフ
ラグメント）と共にインキュベートし、そしてＳａｌＩ
で切断する。６４９ｂｐフラグメントをソフトアガロー
スゲル上で分離し、フェノール抽出およびエタノール沈
澱により回収する。
【０３２１】ＵＡＳ１−ＵＡＳ２（ＰＨ０５）プロモー
ター要素を含んで成るｐ３１／Ｙの６４９ｂｐフラグメ
ント０．３ｐモル、および０．１５ｐモルの７．２ｋｂ
フラグメントの一方を、上記のように連結して、Ｅ．コ
リＨＢ１０１中に形質転換する。プラスミドをａｍｐR
コロニーから調製し、そして制限酵素により分析する。
単一クローンを選択し、それらのプラスミドＤＮＡをｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ
２）およびｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ＵＡ
Ｓ１＋ＵＡＳ２）と命名する。
【０３２２】実施例２５．デスルファトヒルジン蛋白質
コード配列に融合されるＧＡＰＤＨプロモーター要素 （実施例２４ｄＩに記載のように）異なる長さの２個の
ＧＡＰＤＨプロモーター要素をＰＨ０５シグナル配列を
含むデスルファトヒルジン蛋白質コード領域に連結す
る。
【０３２３】２個の要素（２６６ｂｐおよび２０１ｂ
ｐ）は、それぞれＧＡＰＤＨ ＴＡＴＡボックス、ｍＲ
ＮＡ開始部位およびＡＴに富む５′非翻訳領域を含んで
成る。これらの要素のヌクレオチド配列を、図１０に示
す。これらの要素の３′末端はいずれも、ＧＡＰＤＨ遺
伝子のＡＴＧ（これにＥｃｏＲＩ認識部位（実施例２４
ｄＩにおいて導入されるオリゴヌクレオチドリンカー参
照）が続く）からの位置−５にあり、５′末端はそれぞ
れＡＴＧから位置−１９８および−２６３にありこれら
の位置でＢｇｌIIリンカーが付加されている。
【０３２４】ＢａｌII−ＥｃｏＲＩプロモーターフラグ
メントを、ＰＨ０５シグナル配列およびデスルファトヒ
ルジンをコードする配列を有するＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
IIIフラグメント、およびＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩベ
クターフラグメントに連結する。６μｇのプラスミドｐ
ＨＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲを制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで完全に消化する。
大きな６．５ｋｂフラグメント（ベクター部）を０．８
％アガロースゲル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液
（pH８．３）中で分離し、ゲルから電気溶出し、フェノ
ール抽出し、そしてエタノール沈澱する。ベクターＤＮ
Ａフラグメントを水に再分散して、０．０５ｐモル／μ
ｌの濃度にする。
【０３２５】０．３ｐモルのｐＧＡＰＤＨ−ＥＬの２６
６ｂｐ ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメント（実施例２
４ｄIV）、０．３ｐモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
（Ｅｃｏ）−ＨＩＲの６４３ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメント（実施例２４ｄIII ）、および０．
１ｐモルの６．５ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩベク
ターフラグメントを、１０μｌの６０mMトリス（pH７．
５），１０mM ＭｇＣｌ 2 ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴ
Ｐおよび４００単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）中で１５℃で６時間連結させる。
【０３２６】連結混合物１μｌを、１００μｌのカルシ
ウム処理したＥ．コリＨＢ１０１細胞に加える。ａｍｐ
R コロニーからのプロモーターの単離およびＥｃｏＲＩ
を用いる制限分析を、実施例２４ｄIII に記載したのと
同様に行う。一つの陽性クローンを選択して、そのプラ
スミドＤＮＡをｐＨＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲと
称する。同様な造成をｐＧＡＰＤＨ−ＦＬから単離した
２０１ｂｐ ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメントを用い
て行う。一つの選択されたクローンのプラスミドＤＮＡ
をｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲと呼ぶ。
【０３２７】実施例２６．分泌されるデスルファトヒル
ジンのコード配列の２本鎖インサートを有する発現プラ
スミドの造成 以下の造成は、直列（タンデム）の頭と尾の配置で重複
されたＤＮＡフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、（それぞれ実施例２４および２５に記載の
ように）ＧＡＰＤＨプロモーターまたはハイブリッドＰ
Ｈ０５−ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＨ０５シグナル配
列、デスルファトヒルジンのコード配列、およびＰＨ０
５転写ターミネーターからなる。
【０３２８】７μｇのプラスミドｐＨＤＢ２０７／ＧＡ
ＰＥＬ−ＨＩＲを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄII
I で消化する。３′欠損末端を、Ｍａｎｉａｔｉｓ（上
記）の方法によりＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメント、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）との反応によりフィル
インする。１．８５μｇのＳａｌＩリンカー５′-HGGTC
GACC- ３′（Ｂｉｏｌａｂｓ）を、５０μｌの６０mMト
リス（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mMＤＴＴ，
０．５mM ＡＴＰおよび５０単位のＴ4 ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中でキナーゼ処理
する。
【０３２９】３７℃で４５分間処理の後、混合物を７５
℃で１０分間加熱し、室温に放冷する。７μｇ（１．５
ｐモル）の平滑末端（上記）に変換されたＨｉｎｄIII
部位を有する線状化したプラスミドｐＪＤＢ ２０７／
ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲを、８０倍過剰量のキナーゼ処理さ
れそしてアニーリルされたＳａｌリンカーと共に、３０
μｌの６０mMトリス、（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ
2 ，５mM ＤＴＴ，３．５mMのＡＴＰおよび８００単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で１５℃で
１６時間インキュベートする。
【０３３０】Ｔ４ＤＮＡリガーゼを７５℃で１０分間不
活性化した、後過剰のリンカーを１０mM ＥＤＴＡ，３
００mM酢酸ナトリウム（pH６．０）および０．５４容の
イソプロパノールの存在下でＤＮＡを沈澱させることに
より除去する。ＤＮＡをＳａｌＩで消化する。生成する
フラグメントを１％アガロースゲル上トリス−ホウ酸−
ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で分離する。１．１ｋｂ
のＳａｌＩフラグメントを、ゲルからの電気溶出、フェ
ノール抽出およびエタノール沈澱により回収する。ＤＮ
Ａを０．１ｐモル／μｌの濃度で再分散させる。
【０３３１】５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡ
ＰＥＬ−ＨＩＲをＳａｌＩで完全に消化する。フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡを１００μｌ
の５０mMのトリス（pH８．０）中に再分散させる。４．
６単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）を加える。３７℃で１時間置いた後、ホス
ファターゼを、１００mM ＮａＣｌ，５mM ＥＤＴＡお
よび０．５％のＳＤＳの存在下で６８℃にて１５分間不
活性化する。
【０３３２】ＤＮＡ溶液を、１０mMトリス（pH７．
５），１５０mM ＮａＣｌ，および１mMＥＤＴＡで平衡
化したＤＥ５２アニオン交換体（Ｗｈａｔｍａｎ）の１
００μｌのベッドに加える。カラムを同じ緩衝液で洗浄
した後、ＤＮＡを４００μｌの１．５Ｍ ＮａＣｌ，１
０mMトリス（pH７．５），１mM ＥＤＴＡで溶出し、エ
タノールで沈澱せしめる。線状化したプラスミドを０．
６％のアガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断
されていないＤＮＡから分離する。ゲルから線状の７．
３ｋｂ ＤＮＡフラグメントを回収し、電気溶出し、フ
ェノール抽出し、エタノールで沈澱させ、そして０．１
ｐモル／μｌの濃度で再分散させる。
【０３３３】０．２ｐモルの１．１ｋｂ ＳａｌＩフラ
グメントおよび０．１ｐモルの線状化したベクターを１
０μｌの６０mMトリス（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ
2 ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰおよび２００単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼ中１５℃で１６時間連結させる。連結
混合物１μｌを、１００μｌのカルシウム処理し形質転
換コンピテントＥ．コリ細胞に加える。
【０３３４】２４個の形質転換したａｍｐR コロニー
を、別々に１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培
地中で増殖させる。Ｈｏｌｍｅｓらの方法〔Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４（１９８１）１９３〕に従い、
プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲＩ制限消化
によって分析する。予想される制限フラグメントを有す
る一つのクローンを単離し、そしてｐＪＤＢ２０７／
〔ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲ〕Ｄと命名する。
【０３３５】同様な造成を、プラスミドｐＪＤＢ２０７
／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲおよびｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦ
Ｌ／ＩＥＲ（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）を用いて行う。一つ
の選択されたクローンの得られるプラスミドＤＮＡは、
それぞれｐＪＤＢ２０７／〔ＦＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｄお
よびｐＪＤＢ２０７／〔ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１
＋ＵＡＳ２）〕Ｄと呼ばれる。
【０３３６】実施例２７．分泌されるデスルファトヒル
ジンのコード配列の４個のインサートを有する発現プラ
スミドの造成 ＧＡＰＤＨ−プロモーター、ＰＨ０５シグナル配列、デ
スルファトヒルジンのコード配列、およびＰＨ０５転写
ターミネーターを含んで成るＤＮＡフラグメントの４個
のコピーを、直列（タンデム）の頭と尾の配置で酵母発
現ベクターに挿入する。
【０３３７】１０μｇのプラスミドｐＨＤＢ２０７／
〔ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｄ（実施例２６参照）をＳａｌ
Ｉで消化する。生成する線状フラグメントの接着末端
を、Ｍａｎｉａｔｉｅｓら（上記）の方法により、Ｅ．
コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメン
ト、ＢＲＬ）との反応においてフィルインする。０．９
４μｇのＨｉｎｄIII リンカー〔５′-CAAGCTTG-３′，
Ｂｉｏｌａｂｓ〕をキナーゼ処理し、セルフアニーリン
グし、そして平滑末端へ変換されたＳａｌＩ部位を有す
る線状化したプラスミドｐＪＤＢ２０７／〔ＧＡＰＦＬ
−ＨＩＲ〕Ｄに連結する。リンカーの連結およびイソプ
ロパノールによる沈澱は、実施例２６に記載されている
のと同様である。次に、ＤＮＡをＨｉｎｄIII を用いて
切断し、そして生成する２．２ｋｂのフラグメントを電
気溶出し、そしてフェノール抽出およびエタノール沈澱
により単離する。ＤＮＡを０．１ｐモル／μｌの濃度に
再分散する。
【０３３８】５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／〔Ｇ
ＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｄを、ＨｉｎｄIII を用いて完全に
消化する。ＤＮＡをウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて脱リン酸化し、ＤＥ
５２イオン交換クロマトグラフィによって精製し、実施
例２６に記載のように電気溶出によって０．６％アガロ
ースゲルから単離する。０．２ｐモルの２．２ｋｂ Ｈ
ｉｎｄIII フラグメントおよび０．１ｐモルの線状化し
たベクターを上記のように連結する。１μｌの連結混合
物を、１００μｌのカルシウム処理した形質転換コンピ
テントＥ．コリＨＢ１０１細胞に加える。
【０３３９】１２個の形質転換したａｍｐR コロニー
を、１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で別
々に生育させる。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＳ
ａｌＩ＋ＸｂａＩおよびＡｖａＩ＋ＸｂａＩの二重消化
およびＢａｍＨＩ消化によって分析する。１．１ｋｂ
ＢａｍＨＩ−連結フラグメントは、インサートがプラス
ミド上に既存の２個のコピーに対して頭と尾の配置で存
在することを示唆している。インサートのこの方向を有
する一つのクローンを、ｐＪＤＢ２０７／〔ＧＡＰＦＬ
−ＨＩＲ〕Ｔと称する。
【０３４０】実施例２８．ＰＨ０５プロモーター、イン
ベルターゼシグナル配列およびデスルファトヒルジンコ
ード領域を含む酵母発現ベクターの造成 （Ａ）インベルターゼシグナル配列のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの合成 ４種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉ−１，Ｉ
−２，Ｉ−３，Ｉ−４）を、ＤＮＡ合成機（３８０Ｂ
型，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって
合成する。脱ブロッキングの後、合成フラグメントを８
Ｍ尿素含有する１２％ポリアクリルアミドゲルで精製す
る。塩を含有しない純粋なオリゴデオキシリボヌクレオ
チドが、Ｓｅｐ．Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ）を用いて得られる。これらのフラグメント
は、頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルター
ゼシグナル配列をコードするデュープレックスを構成す
る。
【０３４１】
【化１６】
【０３４２】（Ｂ）インベルターゼシグナル配列のサブ
クローン化 （ａ）ベクターの調製 １．５μｇのｐ３１Ｒ／ＳＳ−ＴＰＡΔ２（欧州特許出
願第１４３，０８１号明細書）を、５０μｌの１０mMト
リス・ＨＣｌ（pH７．５），６mM ＭｇＣｌ2，１００m
M ＮａＣｌ，６mMメルカプトエタノール中で、１０単
位のＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて、３
７℃で１時間消化する。１μｌの２．５Ｍ ＮａＣｌを
加えた後、１０単位のＸｈｏＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）を加え、３７℃で１時間インキュベートする。
【０３４３】４．２ｋｂベクターを、０．８％調製用ア
ガロースゲル上で単離する。ゲルスライスをＭｉｃｒｏ
Ｃｏｌｌｏｉｄｏｒチューブ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
ＧｍｂＨ）に写して、２００μｌのＴＥで覆い、そして
電気溶出する（９０mAで５０分間電気泳動する）。ＴＥ
溶液を集めて、０．１容の１０×ＴＥＮを添加した後、
２．５容の無水エタノール中で沈澱させる。ＤＮＡペレ
ットを冷８０％エタノールで洗浄し、そして真空中で乾
燥する。ＤＮＡを、６μｌのＴＥに再分散する（４０ｐ
モル／μｌ）。
【０３４４】（ｂ）オリゴデオキシリボヌクレオチド
（Ｉ−１，Ｉ−２，Ｉ−３，Ｉ−４）のアニーリング、
キナーゼ処理およびベクターとの連結 １０μｌの０．５Ｍトリス・ＨＣｌ（pH８）中にそれぞ
れ１０ｐモルの４種類のデオキシリボヌクレオチドを含
む溶液を、水浴上で９５℃で５分間インキュベートす
る。水浴を、５時間にわたって３０℃まで徐々に冷却す
る。このアニーリング混合物に、それぞれ２μｌの０．
１Ｍ ＭｇＣｌ2 ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，３０mM ＤＴ
Ｔ，４mM ＡＴＰおよび８単位（１μｌ）のポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を加える。キ
ナーゼ処理は、３７℃で１時間行う。
【０３４５】アニーリングし、キナーゼ処理されたオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド、および６０ｐモルのＥｃ
ｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断ベクター（１．５μｌ）を、４０
０単位（１μｌ）のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を用いて１４℃で１７時間連結させる。６５℃で１
０分間インキュベートすることによって、反応を停止さ
せる。１０mlのこの連結混合物を、Ｅ．コリＨＢ１０１
Ｃａ++細胞の形質転換に用いる〔Ｍ．Ｄａｇｅｒｔお
よびＳ．Ｄ．Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｇｅｎｅ，５６，２３−
２８（１９７９）〕。２０個のａｍｐR コロニーを採取
する。ＤＮＡを迅速単離法により調製する〔Ｄ．Ｓ．Ｈ
ｏｌｍｅｓおよびＭ．Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１１４，１９３−１９７（１９８１）〕。
【０３４６】ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用い
て消化し、ＥｃｏＲＩ末端で放射能標識を行ない、放射
能標識されたｐＢｒ３２２ ＨａｅIII 切断ＤＮＡをマ
ーカーとして用いて、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリル
アミドゲル上で分析する。総ての２０個のコロニーから
得られるＤＮＡについて、正確な大きさのバンドが観察
される。１個のクローンを１００μｇ／mlのアンピシリ
ンを含む１００mlのＬＢ培地で増殖させる。プラスミド
ＤＮＡを単離して、ｐ３１ＲＩＴ−１２と称する。
【０３４７】（Ｃ）ＧＡＰＦＬプロモータ要素のインベ
ルターゼシグナル配列への連結 ５μｇのプラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２を、ＳａｌＩお
よびＥｃｏＲＩを用いて完全に消化する。大きな３．３
ｋｂ Ｓａｌｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、０．６％
アガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液（pH８．２）中で
単離する。ＤＮＡをゲルから電気溶出し、フェノール抽
出し、そしてエタノールで沈澱させる。１０μｇのプラ
スミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ（実施例２
５参照）をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化す
る。
【０３４８】４７７ｂｐ ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグ
メントを、０．８％アガロースゲル上トリス−ホウ酸−
ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で単離する。ＤＮＡを電
気溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱
させる。これらの単離されたＤＮＡフラグメントを連結
する。連結混合物の一部を用いて、適当なＥ．コリＨＢ
１０１細胞を形質転換する。ａｍｐR コロニーを増殖せ
しめ、プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII ＳａｌＩ二重
消化によって分析する。正確なインサートを有するプラ
スミドを、ｐ３１／ＧＡＰＦＬ−ＩＴと命名する。
【０３４９】（Ｄ）プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰ
ＦＬ−Ｉ−ＨＩＲの造成（図１５参照） ２５μｇのプラスミドｐ３１／ＧＡＰＦＬ−ＩＴを、Ｐ
ｓｔＩおよびＳａｌＩを用いて完全に消化する。生成す
る６７６ｂｐフラグメントを、１０％調製用アガロース
ゲル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ衝液（pH８．３）中で
単離する。ＤＮＡをゲルから電気溶出し、ＤＥ５２イオ
ン交換クロマトグラフィによって精製し、エタノールで
沈澱させ、そしてＨｇａＩ酵素に好適な緩衝液に再分散
して０．１μｇ／μｌの濃度にする。
【０３５０】ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメント
を、０．５単位／μｇ ＤＮＡの存在でＨｇａＩを用い
て３７℃で６０分間部分的に消化する。ＥＤＴＡを添加
して最終濃度を１０mMにすることによって、反応を停止
させる。５３４ｂｐ ＳａｌＩ−ＨｇａＩフラグメント
を１％調製用アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡをゲ
ルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフィによって
精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分散させて、
約０．１ｐモル／μｌの濃度にする。
【０３５１】１０μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−ＨＩＲ（実施例１６参照）を、ＢａｌＩおよび
ＨｉｎｄIII を用いて消化する。生成する５８７ｂｐ
ＢａｌＩ−ＨｉｎｄIIフラグメントを、調製用１％アガ
ロースゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出し、エタノ
ール沈澱し、更にＨｉｎｆＩで消化する。下記のオリゴ
デオキシヌクレオチド
【０３５２】
【化１７】
【０３５３】のそれぞれ１．３μｇ（１６０ｐＭ）を実
施例２４ｄIII に記載のようにしてキナーゼ処理し、そ
してアニーリングする。０．６μｇ（１．６ｐモル）の
ＨｉｎｆＩで消化したＢａｌＩ−ＨｉｎｄIII フラグメ
ント（上記参照）および１６０ｐモルのキナーゼ処理さ
れアニーリングしたリンカーを、８３μｌの１０mMトリ
ス−ＨＣｌ（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mM
ＤＴＴ，３．５mM ＡＴＰおよび４００単位のＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼ中で、１５℃で１６時間連結させる。
【０３５４】８５℃にて１０分間の後、ＤＮＡをイソプ
ロパノールで沈澱させることによって過剰のリンカーを
除去する（実施例２４ｄIII 参照）。５８４ｂｐ Ｈｇ
ａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを、１％調製用アガロ
ースゲル上で単離する。電気溶出し、精製し、そしてエ
タノール沈澱させたＤＮＡを水に再分散して、０．１ｐ
モル／μｌの濃度にする。５μｇのｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−ＨＩＲをＨｉｎｄIII およびＳａｌＩで消化
し、そして大きな６．２ｋｂフラグメントを単離する。
【０３５５】０．２ｐモルの５３４ｂｐ ＳａｌＩ−Ｈ
ｇａＩフラグメント、０．２ｐモルの５８４ｂｐ Ｈｇ
ａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント、および０．１ｐモル
の６．２ｋｂ ＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII ベクターフラグ
メントを、１０μｌの１０mMトリス・ＨＣｌ（pH７．
５），１０mM ＭｇＣｌ2 ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴ
Ｐおよび４００単位のＴ4 リガーゼ中で１５℃で５時間
連結させる。連結混合物の１μｌを用いて、コンピテン
トＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換させる。
【０３５６】２４個の形質転換されたアンピシリン耐性
のコロニーを、１００μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ
培地で別々に増殖させる。プラスミドＤＮＡを調製し
て、ＨｉｎｄIII およびＳａｌＩ二重消化によって分析
する。正確な制限パターンを有する単一クローンを単離
し、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−Ｉ−ＨＩＲと表す。
インベルターゼシグナル配列の同一性およびヒルジンコ
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
【０３５７】実施例２９． （ａ）サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８の形質
転換 サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８株（α，ｈｉ
ｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２
−１１２，ｃａｎR ）を、Ｈｉｎｎｅｎらの報告による
形質転換法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕を用い
て、次のようなプラスミドを用いて形質転換する。
【０３５８】ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（Ｕ
ＡＳ１），ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ＵＡ
Ｓ１），ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ
１＋ＵＡＳ２），ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ
（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２），ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ
−ＨＩＲ，ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ，ｐＪ
ＤＢ２０７／〔ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲ〕Ｄ，ｐＪＤＢ２０
７／〔ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｄ，ｐＪＤＢ２０７／〔Ｐ
ＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）Ｄ，ｐＪＤ
Ｂ２０７／〔ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｔ，ｐＪＤＢ２０７
／ＧＡＰＦＬ−Ｉ−ＨＩＲ
【０３５９】形質転換した酵母細胞を、ロイシンを欠く
酵母最少培地平板上で選択する。単一の形質転換した酵
母コロニーを単離して、次のように命名する。サッカロ
ミセス・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／
ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１），サッカロミセス・セ
レビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ
−ＨＩＲ（ＵＡＳ１），サッカロミセス・セレビシエー
ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ
（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２），
【０３６０】サッカロミセス・セレビシエー ＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１＋
ＵＡＳ２），サッカロミセス・セレビシエー ＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲ，サッカロミ
セス・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／Ｇ
ＡＰＦＬ−ＨＩＲ，サッカロミセス・セレビシエー Ｇ
ＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／〔ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲ〕
Ｄ，
【０３６１】サッカロミセス・セレビシエー ＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７／〔ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｄ，サッ
カロミセス・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０
７／〔ＰＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）〕
Ｄ，サッカロミセス・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪ
ＤＢ２０７／〔ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ〕Ｔ，サッカロミセ
ス・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡ
ＰＦＬ−Ｉ−ＨＩＲ．
【０３６２】（ｂ）形質転換体の醗酵 Ｓ．セレビシエーＧＲＦ１８形質転換体の細胞をそれぞ
れ、５０ml三角フラスコ中で、１０mlの酵母最少培地
（２％グルコースおよび２０mg／ｌのＬ−ヒスチジンを
加えた、アミノ酸を含有しないＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）中で、３０℃で２４時
間振盪しながら培養して、３×１０7 個／mlの細胞密度
とする。ハイブリッドＰＨ０５−ＧＡＰＤＨプロモータ
ーを有するプラスミドを含む酵母形質転換体は、デスル
ファトヒルジンの発現にはプロモーターの抑制解除を必
要とする。
【０３６３】細胞を０．９％ＮａＣｌで洗浄し、これを
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２％グルコースおよび１ｇ／ｌの
Ｌ−ヒスチジンの代わりに０．０３ｇ／ｌのＫＨ2 ＰＯ
4 ，１０ｇ／ｌのＬ−アスパラギンを含むほか、Ｄｉｆ
ｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ培地
（アミノ酸なし）の処方にしたがって調製した５０mlの
低Ｐi 最少培地に接種する。培養物は、４×１０６個／
ml以下の細胞密度で接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２
４時間攪拌する。最終的密度は、１×１０8 個／mlとな
る。
【０３６４】ＧＡＰＤＨプロモーターを有するプラスミ
ドを含有する酵母形質転換体は、構成的にデスルファト
ヒルジンを発現する。細胞をペプトン（５ｇ／ｌ）、酵
母エキス（１０ｇ／ｌ）、グルコース（２０ｇ／ｌ）、
シュークロース（４０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（３
ｇ／ｌ）、ＫＨ2 ＳＯ4 （２ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ
4 （０．５ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（０．１ｇ／ｌ）、Ｃａ
Ｃｌ2 （０．１ｇ／ｌ）、ビオチン（１０μｇ／ｌ）か
ら成る複合培地（ｇ／ｌ）中で培養する。３０℃，２０
０ｒｐｍで４８時間培養した後に、約１×１０9 個／ml
の細胞が得られる。幾つかの代表的な形質転換した酵母
株によって分泌されるデスルファトヒルジンの量（トロ
ンビン阻害法によって測定）を、以下の表にまとめてあ
る。
【０３６５】
【表１６】
【０３６６】また、酵母形質転換体によって発現された
デスルファトヒルジン化合物の少なくとも９０％は培養
液中に分泌されることも決定される。回収の時間の関数
としての培養液中および細胞内におけるデスルファトヒ
ルジンの分布を決定するため、３リットルのＭＢＲバイ
オリアクター（ＭＢＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ＡＧ，
Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、スイス）中で醗酵を行う。
【０３６７】サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ株を３リットル
の複合培地（上記参照）に接種して、３０℃で、攪拌速
度５００ｒｐｍおよび通気量２００リットル／時間で培
養する。最終密度５×１０９個／mlが達成される。試料
をそれぞれ、１８，２４および４２時間目に採取し培溶
液中および細胞内（崩壊後、実施例２２参照）のデスル
ファトヒルジンの含量をトロンビン阻害法およびＨＰＬ
Ｃによって測定する。
【０３６８】
【表１７】
【０３６９】実施例３０ ．３００リットル規模での形質転換体の培養 サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ株の細胞を含む深冷凍結アン
プルから多数の寒天斜面に接種を行う。１個以上の寒天
斜面を２８〜３０℃で３〜５日間培養する。１つの寒天
斜面の内容物を、邪魔板がなく、前培養培地１００mlを
収容する単一の５００ml三角フラスコに無菌的に接種す
る。フラスコを、振幅が５０mmで２５０ｒｐｍのロータ
リー・シェイカーで、培養温度２８℃で振盪する。
【０３７０】４８時間後に、これらのフラスコの内容物
（一次前培養物）２％（ｖ／ｖ）を、６００mlの前培養
培地を収容する２リットルの三角フラスコに無菌的に接
種する。これらのフラスコ（二次前培養物）を、２８℃
で、ロータリー・シェイカー上で１２０ｒｐｍで振幅を
５０mmとして４８時間振盪する。二次前培養物のフラス
コ（２％ｖ／ｖ）の内容物を、３０リットルの前培養培
地（プラント前培養物）を収容する５０リットルのステ
ンレススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。プラント
前培養液の醗酵条件は次のようである。６００ｒｐｍ
（単一の６枚羽根のタービン攪拌機、直径１１５mm）、
４枚の邪魔板、ヘッド圧：０３バール、通気量：１リッ
トルの空気／１リットルの培地／分、温度：２８℃、４
８時間。
【０３７１】寒天培地および前培養液は、寒天の有無を
除けば同じである。同じ前培養液を総ての前培養工程で
用いた。前培地の組成（ｇ／ｌ）： イーストニトロゲンベース（Ｄｉｆｃｏ） ８．４ Ｌ−アスパラギン・Ｈ2 Ｏ １１．６ Ｌ−ヒスチジン １．０ グルコース（別途に殺菌） ２．０ 寒天培地の組成：前培地に１リットル当たり２０ｇの寒
天を加えたもの。
【０３７２】（ｂ）生産醗酵（３００リットル規模） ５％（ｖ／ｖ，１５リットル）の培養したプラント前培
養液を３００リットルの無菌醗酵生産培地を収容する６
００リットルの醗酵機に無菌的に導入する。３００リッ
トル生産培地の醗酵条件は、次の通りである。４５０ｒ
ｐｍ（単一の６枚羽根攪拌機、直径２３０mm）、４枚の
邪魔板、ヘッド圧：０．３バール、通気量：０〜９時
間：０．２５リットル空気／１リットルの培地／分、９
時間〜回収時：１リットル空気／１リットルの培地／
分、温度２８℃、時間２４〜４８時間、ＯＤ600 ：１５
〜２０、収量：１５〜２５mg／ｌ（試験法：ＨＰＬＣお
よびトロンビン試験）生産培地の組成（ｇ／ｌ）
【０３７３】 ペプトン ５ 酵母エキス １０ シュークロース ４０ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ６ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ ＮａＣｌ ０．１ ＫＨ2 ＰＯ4 ２ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．０１３ 殺菌前のpH〜６．０ 消泡剤：必要な場合にはＵＣＯＮ ＬＢ６２５。
【０３７４】実施例３１．３００リットルの培養液から
のデスルファトヒルジンの単離 pH値３．３を有する培養液（実施例３０参照）を１７℃
に冷却する。細胞を、Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＳＡ−１４
スラッジ除去装置（４００〜６００リットル／時間）に
より分離する。濃いスラッジは廃棄する。僅かに濁りを
有する上澄液を、一連のＳｋａｎフィルターカートリッ
ジ（第一：孔径５μｍ；第二：孔径１μｍ：第三：孔径
０．２２μｍ）を通して濾過し、ＮａＯＨでpH７．５に
してＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに適用する。
【０３７５】カラムを酢酸ナトリウム（２０mM，pH４．
５）で洗浄し、酢酸ナトリウム（２０mM，pH３．１）で
溶出する。溶液（１５リットル）をＮａＯＨでpH７．５
に調整して、循環蒸発装置で濃縮して最終容積を１．８
リットルにする。１リットルをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
２５カラム（ベッド容積：８リットル、カラムは水で平
衡にする）に充填する。デスルファトヒルジンを含む分
画をＨＰＬＣで同定する。デスルファトヒルジン分画
（２．５リットル）を高真空のローターバップで濃縮し
て最終容積を２００mlとして、凍結乾燥する。
【０３７６】２ｇの原料を５０mlの水に溶解し、ＮａＯ
ＨでpH７．５に調整し、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ迅速硫
下カラム（ベッド容積：２００ml）に適用する。カラム
をギ酸アンモニウム（１００mM，pH３．９）で洗浄す
る。２５mlの画分を採取してＨＰＬＣによってデスルフ
ァトヒルジンを試験する。デスルファトヒルジンを含む
分画（１〜６５）をまとめて（１２５ml）高真空のロー
タバップで最終容積を１０mlまで濃縮する。濃縮した溶
液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ａｍｉｃｏ
ｎ、カラムを水で平衡にしてある）に適用し、そして脱
塩する。得られる透明な溶液（２５ml）を凍結乾燥す
る。精製する固形物は、純粋なデスルファトヒルジンか
ら成る。
【０３７７】実施例３２．プラスミドｐＪＤＢ２０７／
ＰＨ０５−ＥＧＬの造成 ヒルに由来する７０個のアミノ酸から成るポリペプチド
であるエグリンＣをコードするヌクレオチド配列は、試
験管内で合成されており、欧州特許出願第１４６，７８
５号明細書記載のようにＥ．コリでサブクローン化さ
れ、発現されている。エグリンコード配列のＰＨ０５シ
グナルペプチドをコードする配列への正確なインフレー
ム融合は、実施例１５および１６におけるヒルジンにつ
いて記載したのと全く同様に行われる。ベクター中のイ
ンサートの正確な方向を有する単一クローンを、ｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＨ０５−ＥＧＬと称する。サッカロミセス
・セレビシエーＧＲＦ１８株を、通常の方法で形質転換
する。形質転換体を、実施例２９に記載のように選択
し、そして培養する。エグリンＣは、培養液中には、検
出されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＭＬ３００の造成を示す
模式図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＭＬ３０５の造成を示す
模式図である。
【図３】図３は、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミ
ドｐＨＲｉ１４８の造成を示す図である。
【図４】図４は、発現プラスミドｐＭＬ３１０の造成を
示す図である。
【図５】図５は、成熟デスルファトヒルジンをコードす
るＤＮＡフラグメントの単離を示す模式図である。
【図６】図６は、デスルファトヒルジンを分泌する発現
プラスミドの造成を模式的に示す図である。
【図７】図７は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を
行う発現プラスミドの造成を模式的に示す図である。
【図８】図８は、ＰＨ０５プロモータ領域を含有するＰ
Ｈ０５のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ制限フラグメントのＤＮ
Ａ配列を示す。
【図９】図９は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域
のＤＮＡ配列を示す。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＥＬの
造成を示す模式図である。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＦＬお
よびｐＧＡＰＤＨ−ＥＬ中に存在するＧＡＰＤＨプロモ
ーターフラグメントの配列を示す。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ
０５（Ｅｃｏ）−ＨＩＲの造成を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＡ
ＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）の造成を示す図
である。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／〔Ｇ
ＡＰＥＬ−ＨＩＲ〕Ｄの造成を示す図である。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡ
ＰＦＬ−Ｉ−ＨＩＲの造成を示す模式図である。図面で
は、次の略号を用いる。
【符号の説明】
Ｐ…プロモーター ＳＳ…シグナル配列 ｔ…ターミネーター Ｌ…リンカー
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ベルント マイハック スイス国，4312 マークデン，ヘーエンベ ーク ９ (72)発明者 バルター メルキ スイス国，4313 メーリン，ブレーメンシ ュタールシュトラーセ 30 (72)発明者 ユッタ ハイム スイス国，4133 プラッテルン，ランクア ッカーベーク 18

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵母発現制御配列と、成熟デスルファト
    ヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流に
    ありそしてそれとリーディングフレームが合っている酵
    母ＰＨ０５又はインベルターゼシグナルペプチドをコー
    ドする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであ
    って上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、酵母
    の転写終止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞ
    れが含有する１個以上のＤＮＡインサートを有する酵母
    ハイブリッドベクター。
  2. 【請求項２】 前記第二ＤＮＡ配列が成熟デスルファト
    ヒルジン変形体ＨＶ１をコードしている請求項１に記載
    の酵母ハイブリッドベクター。
  3. 【請求項３】 酵母発現制御配列と、成熟デスルファト
    ヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流に
    ありそしてそれとリーディングフレームが合っている酵
    母ＰＨ０５又はインベルターゼシグナルペプチドをコー
    ドする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであ
    って上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、酵母
    の転写終止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞ
    れが含有する１個以上のＤＮＡインサートを有する酵母
    ハイブリッドベクターにより形質転換された酵母宿主細
    胞。
  4. 【請求項４】 前記第二ＤＮＡ配列が成熟デスルファト
    ヒルジン変形体ＨＶ１をコードしている請求項３に記載
    の酵母宿主細胞。
JP5282983A 1985-12-12 1993-11-12 デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター Expired - Lifetime JPH0787791B2 (ja)

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