FI91280B - Repressoituvat hiivapromoottorit - Google Patents
Repressoituvat hiivapromoottorit Download PDFInfo
- Publication number
- FI91280B FI91280B FI863430A FI863430A FI91280B FI 91280 B FI91280 B FI 91280B FI 863430 A FI863430 A FI 863430A FI 863430 A FI863430 A FI 863430A FI 91280 B FI91280 B FI 91280B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- yeast
- dna
- sequence
- promoter
- gene
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 194
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 73
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 123
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 49
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N desirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 23
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 22
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 20
- 108010073652 desirudin Proteins 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 16
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 14
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 14
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 14
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 108010031145 eglin proteinase inhibitors Proteins 0.000 claims description 8
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 33
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 143
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 132
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 91
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 27
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 18
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 15
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 11
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 5
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 5
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 5
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 5
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 5
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 4
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 108091026908 Downstream promoter element Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 101100062121 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- -1 vaccines Proteins 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzenesulfonyl chloride Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 102220567469 BICD family-like cargo adapter 2_A26Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100011368 Caenorhabditis elegans egl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100026178 Caenorhabditis elegans egl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011376 Caenorhabditis elegans egl-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246536 Caenorhabditis elegans pyc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102400000113 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101000658546 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoEI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100483843 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) UPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N beta-endorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 101150057929 egl-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 101150007166 ensa gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 230000035929 gnawing Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108010008429 immunoglobulin-binding factors Proteins 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003017 in situ immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L sodium sulphate Substances [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Gyroscopes (AREA)
- Led Devices (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Description
91280
Repressoituvat hiivapromoottorit
Keksintö koskee vieraiden polypeptidien tuottamista hiivaisännissä yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttämällä. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee uusia ylävirrassa olevia aktivointisekvenssejä, hiivojen yhdistelmäpromoottoreita, jotka sisältävät tällaisia ylävirrassa olevia aktivointi-sekvenssejä, uusia vhdistelmävektoreita, joita voidaan käyttää hiivasolujen transformoinnissa, tällaisia transformoituneita hiivasoluja ja tällaisten transformoituneiden hiivasolujen käyttöä hiivalle vieraiden polypeptidien tuotannossa .
Viime vuosien kuluessa on saavutettu suurta edistystä geenitekniikan alalla ja eräät systeemit, joissa käytetään geneettisesti muunnettuja mikro-organismeja, erityisesti suolistobakteeria Escherichia coli ja leivontahiivaa (Saccharomyces cerevisiae), ovat nyt toiminnassa. On kuitenkin olemassa tarve saada käyttöön muita, entistä parempia systeemejä, erityisesti eukaryoottisia systeemejä, kuten hiivoissa toimivia, jotka soveltuvat proteiinien taloudelliseen ja laajamittaiseen teolliseen tuotantoon.
Tällä hetkellä on tarjolla erilaisia hiivavektoreita geneettistä kloonausta varten. Jotta vieraat geenit ilmentyisivät tehokkaasti hiivoissa, pitää rakennegeenit liittää voimakkaisiin hiivan promoottoreihin, joihin mielellään liittyy säätelyä niin, että geenin ilmentymistä voidaan ohjata eksogeenisesti. Koska ilmentymisen tehokkuuden (tuot-teenmuodostuksen) uskotaan olevan riippuvainen ja suhteessa käytetyn promoottorin tehoon, alan ihmiset kiinnittävät erityistä huomiota voimakkaiden promoottorisysteemien kehittämiseen.
Proteiineja koodittavien kloonattujen hiivageenien in vitro-mutatointi ja niiden palauttaminen takaisin hii-vasoluihin toiminnallista analyysiä varten on mahdollistanut eräiden ohella toimivien promoottorielementtien tunnistamisen (katsaus julkaisussa L. Guarente, Cell 799 2 (1984)). Näitä elementtejä ovat seuraavassa luetellut, kun luettelossa lähdetään liikkeelle välittömästi proteiinia koodittavan geenin 5'-päästä: 5'-transkriboiduksi tuleva johtosekvenssi, joka sisältää melko paljon A-T:tä ja joskus sekvenssin CAACAACAA (tai tälle sukua olevan sekvenssin), transkriptionaloituskohdat, jotka sijaitsevat noin 40 -60 e:n päässä (joskus kauempana) luennanaloituskodonista ATG, mikä tavallisesti merkitsee useita vahvuudeltaan erilaisia mRNA:n aloituskohtia, TATA-alue (joskus useampia kuin yksi), joka sijaitsee noin 40 - 80 e:n päässä transkriptionaloituskohdista, ja joka oletettavasti toimii oleellisena RNA polymeraasi I:n tunnistuskohtana, ylävirrassa oleva(t) aktivointikohta(dat) (upstream activation site(s), UAS), joihin oletettavasti säätely-proteiinien toiminta kohdistuu, ja jotka sijaitsevat noin 100 - 300 e:n päässä TATA-alueesta ylävirrassa.
UAS toimii eri tavalla kuin prokaryooteista löydetyt säätelykohdat ja muistuttaa enemmänkin nisäkässysteemien tehostajakohtia (enhancer sites). Melko yksityiskohtaisia tietoja on olemassa hiivan GAL1, GAL7, GAL 10-rykelmästä, jossa positiivisesti toimiva säätelyproteiini (GAL 4-gee-nituote) vuorovaikuttaa suoraa GAL 1 - GAL 10:n UAS:n kanssa (Giniger et ai., Cell ^0, 767 (1985)).
Kun liitettiin GAL 1 - GAL 10:n UAS:ää koodittavat promoottorisekvenssit hiivan CYC 1-geenin TATA-alueen eteen, saatiin aikaan yhdistelmäpromoottori, jonka transkriptio on GAL 1 - GAL 10:n UAS:n ohjauksessa eli se on riippuvainen GAL 4-geenituotteesta (L. Guarente et. ai., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 7_9' 7410 (1 984)). Vastaavanlainen rakentaminen tehtiin liittämällä yhteen CYC 1:n ja LEU 2:n promoottorielementit (L. Guarente et ai. Cell 36, 503 (1984)). Nämä molemmat systeemit sisältävät promoot-torielementtejä ja proteiininkooditussekvenssejä hiivasta, mutta tarjolla ei ole mitään todisteita siitä, että nämä systeemit toimivat myös hiivalle vieraiden geenien yhteydessä .
3 91280
Eräässä äskettäin julkaistussa patenttihakemuksessa (PCT 84/4757) selostetaan hiivan PGK-geenin UAS-elementtiä. Osoitetaan välttämättömän promoottorielementin läsnäolo asemien -324 ja -455 välillä (ATG:stä lukien). Väitetään, että tämän elementin lisääminen muiden promoottorien eteen voimistaisi minkä tahansa muun hiivapromoottorin tehoa. Kuitenkaan tämän väitteen tueksi ei esitetä mitään esimerkkiä, vaan argumentit perustuvat kokonaisuudessaan negatiivisiin tuloksiin (promoottorin tuhoaminen). On hyvinkin mahdollista, että elementti on PGK-promoottorin oleellinen osa, mutta on epävarmaa, toimiiko tällainen elementti yh-distelmäpromoottorin osana. Lisäksi PGK:n UASrään ei liity säätelysignaalia eli se ei tee mahdolliseksi alavirrassa olevan koodittavan sekvenssin ilmentymisen (transkription) ohjaamista tietyn fysiologisen signaalin avulla.
Eräät glykolyyttisten geenien promoottorit indusoituvat glukoosin läsnäollessa. Ne on mahdollista kytkeä pois päältä kasvattamalla soluja glukoosittomassa väliaineessa.
Tämä merkitsee sitä, että hiivaisäntäsolut pitäisi transformoida ja regeneroida sellaisessa väliaineessa, jonka glukoosi on korvattu muilla hiililähteillä (asetaatilla, glyserolilla, laktaatilla jne.), jotta solut saadaan suojatuiksi mahdollisesti haitalliselta tai letaaliselta geenituotteelta, joka kertyy soluihin. Koska protoplastien (A. Hinnen et ai. Proc. Natl. Acad. Sei, USA 75, 1929 (1978)) ja suolalla käsiteltyjen kokonaisten solujen (Ito et ai. J. Bacteriol. 153, 163 (1983)) regenerointi suoritetaan tavallisesti rikkaassa alustassa, jotta saavutetaan solujen nopea regeneroituminen ja pesäkkeidenmuo-dostus, käytetään kaikissa tämänhetkisissä transformointi-menetelmissä glukoosia hiililähteenä. On oletettavissa, että regenerointi ja talteenotto toimivat huonosti (jos lainkaan) glukoosittomassa alustassa.
Alalla tunnustetaan yleisesti, että ilmentymisen ajoitusta pitää säätää, jotta voitaisiin taata tuotettavan proteiinin valmistuminen suurina määrinä vain silloin, kun solu pystyy parhaiten sietämään suuria määriä vieraita proteiineja, eli kasvuvaiheen jälkeen. On myös toivottavaa, ettei ilmentymisen säätely riipu mikrobin kas- 4 vulle tärkeimmän hiililähteen eli glukoosin läsnäolosta tai poissaolosta. Säädeltävissä olevia voimakkaita pro-moottorisysteemejä, jotka täyttävät nämä vaatimukset vieraiden geenien edulliseksi ja teknisesti käyttökelpoiseksi ilmentämiseksi hiivoissa, tuskin tunnetaan alalla. Näin ollen on olemassa tarve tällaisten promoottorisystee-mien kehittämiselle.
Nyt on yllättäen havaittu, että yhdistelmä, jossa glykolyyttisen ketjun entsyymien ilmentymistä ohjaavan promoottorin, joiden yleisesti uskotaan kuuluvan tällä hetkellä tunnetuista promoottoreista voimakkaimpiin, TATA-alue on liitetty sellaisen säädeltävän promoottorin ylävirran promoottorielementteihin, jonka pois päältä kytkeytyminen ja takaisin päälle kytkeytyminen ei ole riippuvainen kasvualustan sisältämän välttämättömän aineosan, kuten välttämättömän hiilen tai typen, läsnäolosta tai poissaolosta, johtaa voimakkaisiin yhdistelmäpromoottoreihin, jotka täyttävät teknisesti käyttökelpoisille promoottori-systeemeille asetettavat päävaatimukset.
Tässä keksinnössä käytetään yhdistelmäpromoottoreita, joissa erityisesti glykolyyttisten qeenien promoottorit on saatettu happofosfataasi-PH05-geenin UAS:n ohjaukseen, vieraiden geenien tehokkaaseen ilmentämiseen hiivoissa.
Keksintö koskee lisäksi vastaeristettvjä hiivan PH05-geenin UAS-signaaleja, yhdistelmäpromoottoreita, jotka sisältävät PH05 UAS-signaaleja, yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät tällaisia yhdistelmäpromoottoreita sekä hiivaisäntiä, jotka ovat transformoituneet tällaisilla yhdistelmävektoreilla.
Edelleen keksintö koskee menetelmiä mainittujen UAS-signaalien, mainittujen yhdistelmäpromoottorien, mainittujen yhdistelmävektorien ja mainittujen transformoituneiden hiivaisäntien valmistamiseksi ja mainittujen transformoitujen hiivaisäntien käyttöä polypeptidien tuottamiseen.
1. Hiivan happofosfataasigeenin (PH05) ylävirran akti-vointisekvenssit (UAS) ja yhdistelmäpromoottorit 5 91280
Keksintö koskee hiivan PH05-geenistä johdettuja ylävirran aktivointisekvenssejä (UAS) ja niiden käyttöä yhdis-telmäpromoottorien valmistukseen.
Ennen tätä keksintöä ei alalla ollut tiedossa, onko olemassa yksi tai useampia ylävirran aktivointikohtia (tai sekvenssejä, "UAS"), jotka säätelevät hiivan PH05-geenin ilmentymistä. PH05-geeni koodittaa pois päältä kytkettävissä olevaa hiivan happofosfataasia. Geeni kytkeytyy pois päältä suuressa epäorgaanisen fosfaatin pitoisuudessa ja kytkeytyy takaisin päälle silloin, kun epäorgaanista fosfaattia on läsnä liian vähän (B. Meyhack et ai., EMBO-J. 2' 675 (1982)).
PH05-geenin 5'-alueen analyysi on nyt johtanut sellaisten ohella toimivien elementtien tunnistamiseen, jotka säätelevät PH05-geenin transkriptiota. PH05-geenin 5'-alueen BamHI-Sall-jakso (623 e), joka on kloonattu faagivektoriin M13mp9 (yhdistelmävektori Ml3mp/PH05 Bam-Sal, ks. eurooppalainen patenttihakemus no. 143 081), pilkotaan eksonukleaasilla Bal31 lähtien Bam-kohdasta ja toisessa kokeessa lähtien Sal-kohdasta. Näin saadaan aikaan joukko lyhennettyjä PH05-promoottorijaksoja, joille suoritetaan sekvenssianalyysi, ja joiden lyhennetty pää varustetaan synteettisellä EcoRI-kytkijällä. Kun Sal-kohdasta lyhennetyt jaksot ("vasemman käsivarren promoottorijaksot") liitetään Bam-kohdasta lyhennettyihin jaksoihin ("oikean käsivarren promoottorijaksot"), saadaan aikaan joukko PH05-promoottorialueen deleetiomutantteja, joiden kyky saada aikaan PH05-rakennegeenin ilmentyminen tutkitaan.
Näin voitiin havaita, että nukleotidien -225 - -263 välinen deleetio johtaa happofosfataasiaktiivisuuden vähenemiseen viidesosaan alkuperäisestä ja nukleotidien -361 - -392 tai -346 - -369 välinen deleetio johtaa happo-fosfataasiaktiivisuuden vähenemiseen kymmenesosaan (nukleotidien numerointi selviää liitteenä olevasta piirroksesta 1). Nämä vaikutukset lasketaan ylävirran akti-vointikohtien (UAS) lukuun, jotka ovat oleellisia PH05:n ilmentymiselle. Nukleotidin -365 läheisyydessä 6 oleva UAS sisältyy PH05-geenin 5'-alueen 268 e:n BamHI-Clal-jaksoon (nukleotidit -274 - -541) ja sille on annettu nimeksi UAS1(PH05), kun taas nukleotidin -245 läheisyydessä oleva UAS sisältyy PH05-geenin 5'-alueen 100 e:n Clal-BstEII-jaksoon (nukleotidit -174 - -273) ja sille on annettu nimeksi UAS2(PH05).
Esillä oleva keksintö koskee erityisesti ylävirran aktivointisekvenssejä UAS1(PH05) ja UAS2(PH05), jotka sijaitsevat PH05-geenin BamHI-BstEII-jaksossa nukleotidien -174 ja -541 välissä.
Keksintö koskee lisäksi ylävirran aktivointisekvens-siä UAS1(PH05), joka on BamHI-Clal-jaksossa PH05-geenin nukleotidien -274 ja -541 välissä, ja ylävirran aktivoin-tisekvenssiä UAS2(PH05), joka on Clal-BstEII-jaksossa PH05-geenin nukleotidien -174 ja -273 välissä.
Ylävirran aktivointisekvenssi UAS1(PH05) on erittäin edullinen. UAS1-säätösignaalin tarkka sijainti BamHI-Clal-jakson sisällä voitiin määrittää. Niinpä UAS1-säätösignaali sijaitsee 31 e:n jaksossa (PH05-promoottorialueen välillä -381 - -351) . Jakson molemmat päät on edullista varustaa tasapäisillä kytkijöillä, jotka sisältävät sopivat kat-kaisukohdat, tai restriktioendonukleaasille, kuten EcoRI, spesifisillä lomittuvilla pälliä. 31 e:n jakson emäsjärjestys on seuraava:
GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
Menetelmässä UAS1(PH05)- ja/tai UAS2(PH05)-sekvenssin sisältävien DNA-jaksojen valmistamiseksi katkaistaan PH05-geenin sisältävä DNA, PH05-geeni tai sen 5'-pään osa sopivilla restriktioendonukleaaseilla ja eristetään halutut jaksot. Esimerkiksi PH05:n 623 e:n BamHI-Sall-jakso (supra), joka sisältää PH05-promoottorin ja osan PH05:ttä koodattavaa aluetta, pilkotaan restriktioendonukleaaseilla BamHI ja BstEII ja näin saatu 368 e:n alajakso, joka sisältää molemmat ylävirran aktivointialueet, eristetään. Vastaavasti, kun edelläoleva BamHI-Sall-jakso katkaistaan BamHI:llä ja Clal:llä tai Claltllä ja BstEII:llä, saadaan 268 e:n BamHI-Clal-alajakso, joka sisältää UAS1(PH05):n, 7 91280 ja 100 e:n Clal-BstEII-alajakso, joka sisältää UAS2(PH05):n, vastaavasti. Jaksot ja alajaksot voidaan eristää ja puhdistaa tavalliseen tapaan, esimerkiksi agaroosigeelielektro-foreesilla tai polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
DNA-jaksot, jotka sisältävät keksinnönmukaiset ylävirrassa olevat aktivointikohdat, voidaan lyhentää sinänsä tunnetulla tavalla, kuten suorittamalla osittainen hajotus eksonukleaasilla, esimerkiksi Bal31:llä, siten, että lyhentyneeseen jaksoon jää jäljelle UAS-funktio. Lyhentäminen voidaan suorittaa jakson 5'-päästä tai 3'-päästä tai molemmista päistä. Niiden alafragmenttien valinta, joissa UAS-funktio on säilynyt, suoritetaan samoin kuin edellä, kuten korvaamalla alkuperäiset, UAS(:t) sisältävät sekvenssit lyhennetyillä sekvensseillä ja tutkimalla kykenevätkö näin aikaansaadut PH05-promoottorin deleetio-mutantit saamaan aikaan PH05-rakennegeenin ilmentymisen. Keksinnönmukaiset jaksot ja niiden lyhennetyt johdannaiset, jotka sisältävät yhden tai molemmat ylävirrassa olevat PH05-geenin aktivointikohdat, voidaan varustaa päihin liitetyillä synteettisillä kytkijäsekvenssei1 -lä, jotta yhdistelmäpromoottorien rakentaminen tai vektoreihin liittäminen tulee helpommaksi.
PH05:n ylävirrassa olevan(at) aktivointikohdan(at) sisältävät DNA-jaksot sekä niiden lyhennetyt johdannaiset voidaan myös valmistaa kemiallisella DNA-synteesillä käyttämällä tavanomaisia, alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Sopivista menetelmistä on esitetty yhteenveto julkaisussa S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983). Erityisesti voidaan käyttää eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 146 785 kuvattuja menetelmiä, joka julkaisu liitetään tähän hakemukseen viitteeksi.
Esillä oleva keksintö koskee myös PH05-geenin ylävirrassa olevien aktivointikohtien käyttöä yhdistelmäpromoottorien valmistamiseen sekä yhdistelmäpromoottoreita, jotka sisältävät PH05-geenin ylävirran akti-vointikohtia.
Keksintö koskee erityisesti hiivan yhdistelmäpromoottoreita, jotka sisältävät tai varsinkin koostuvat 5'—yläpään promoottorielementistä, joka sisältää hiivan 8 PH05-geenin ylävirrassa olevan(at) aktivointikohdan(at), 3' -alapään promoottorielementistä, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä, ja joka sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna ja loppuu lähelle luennanaloituskohtaa.
5'- yläpäässä oleva promoottorielementti on erityisesti joku edellämainituista, varsinkin 368 e:n BamHI-BstEII jakso, joka sisältää UAS1(PH05):n ja UAS2(PH05):n, tai 268 e:n BamHI-Clal-jakso, joka sisältää UAS1(PH05):n, tai joku näiden lyhennetty johdannainen, jossa UAS-funktio on jäljellä, kuten UAS1(PH05):n sisältävä 31 e:n jakso tai jopa sen pienempi alajakso.
3'- alapään promoottorielementti on mielellään johdettu voimakkaasti ilmentyvän hiivageenin promoottorista, erityisesti glykolyyttistä entsyymiä koodittavan hiiva-geenin promoottorista, kuten enolaasi-, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi- (GADPH), 3-fosfoglyseraattiki-naasi- (PGK), heksokinaasi-, puryvaattidekarboksylaa -, fosfofruktokinaasi-, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimutaasi-, pyruvaattikinaasi- (PyK), trioosifosfaatti-isomeraasi-, fosfoglukoosi-isomeraasi-tai glukokinaasigeenin promoottorista. 3'-promoottori-elementit sisältävät TATA-alueen, jonka tehtäviin kuuluu RNA-polymeraasi II:n sijoittaminen oikeaan trans-kriptionaloitusasemaan, sekä «oikeat transkriptionaloitus-kohdat (suuren mRNA:n aloituskohdat). TATA-alueen alapuolella 3'-promoottorielementti ulottuu suuren mRNA:n alun ja luennanaloituskodonin (ATG) väliselle alueelle, mielellään lähelle luennanaloituskodonia. TATA-alueen ylävirrassa sisältävät 3'-promoottorielementit noin 50 -150 alkuperäistä emäsparia. Ylävirran DNA-sekvenssin tarkka pituus ei ole oleellisen tärkeä, koska UAS:ien ja TATA-alueen välisellä etäisyydellä näyttää olevan joustovaraa.
Tämän keksinnön mukaisesti on etusijalle asetettava 3'-promoottorielementti GAPDH-promoottorista johdettu, jonka tiedetään olevan yksi voimakkaimmista alalla tunnetuista hiivapromoottoreista (GAPDH-entsyymiä voi olla 9 91280 jopa noin 5 % S. cerevisiaen kuivapainosta, ks. E.G.
Krebs, J. Biol. Chem. 200, 471 (1953)). 3'-GAPDH-pro- moottorielementti alkaa GAPDH-geenin nukleotidista -300 --180 ja päättyy nukleotidiin -1. Eräässä tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa 3'-promoottorielementti kattaa GAPDH-geenin nukleotidit -199 - -1. Toisessa keksinnön edullisessa toteutustavassa 3'-promoottorielementti kattaa GAPDH-geenin nukleotidit -263 - -1.
Tämän keksinnön mukaiset yhdistelmäpromoottorit voivat sisältää yhden ainoan UAS(PH05):n tai useita samaa tyyppiä edustavia UAS(PH05):iä, esimerkiksi UAS1(PH05), mielellään pää-häntäsuuntaan ryhmiteltyinä. 3'-promoot-torielementtiin nähden voi(vat) UAS(t) olla samassa tai vastakkaisessa suunnassa verrattuna aidon PH05- promoottorin suuntaan.
Keksinnönmukaisten yhdistelmäpromoottorien osat eli PH05:n UAS:n(:t) sisältävä promoottorielementti ja TATA-alueen sisältävä promoottorielementti liitetään yhteen synteettisillä kytkijöillä,tasaisten päiden yhteenliittä-misellä tai, mikäli mahdollista, luontaisten yhteensopivien restriktiokohtien kautta. Keksinnönmukaisten yhdistelmäpromoottorien 5'- ja 3'-pää on edullista varustaa synteettisellä kytkijällä, joka mahdollistaa liittämisen vektori-DNA:hän ja 3'-päässä liittämisen heterolo-gista proteiinia koodittavaan alueeseen.
Keksinnönmukaiset yhdistelmäpromoottorit täyttävät kaikki biotekniikassa käyttökelpoisiksi katsottavien promoottorien vaatimukset. Ne ovat voimakkaita, indusoitavissa muilla kuin kasvualustan välttämättömillä hiili- ja typpilähteillä ja helposti käsiteltävissä laboratorio-ja teollisessa mittakaavassa.
Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää sellaisten yhdistelmäpromoottorien tuottamiseksi, jotka sisältävät 5'-yläpään promoottorielementin, joka sisältää hiivan PH05-geenin ylävirrassa olevan(at) aktivointikohdan(at), ja 3'-alapään promoottorielementin, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä ja sisältää transkription- aloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna ia päättyy lä- 10 helle luennanaloituskodonia, ia menetelmässä liitetään 5'-yläpään promoottorielementti, joka sisältää hiivan PH05-geenin ylävirran aktivointikohdan(at), 3'-alapään promoottori-elementtiin, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä sisältäen funktionaalisen TATA-alueen ja loppuen lähelle luennanaloituskodonia.
Tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa pro-moottorielementtien yhteenliittäminen suoritetaan synteettisten kytkijöiden välityksellä.
Edellämainittu alaosassa oleva muun hiivageenin kuin PH05-geenin promoottorielementti valmistetaan pilkkomalla osittain vahva hiivapromoottori, esimerkiksi joku edellämainituista, joka ulottuu suuren mRNA:n alun ja luennanaloituskodonin välille, 5'-päästään eksonukle-aasilla, esimerkiksi Bal31:llä, ja liittämällä syntyneeseen tasaiseen 5'-päähän synteettinen kytkijä-DNA.
Valitaan sellaiset promoottorielementit, joissa on säilynyt transkriptionaloituskohta(dat) ja TATA-alue mukaanlukien 50 - 150 emäsparin pituiset sekvenssin TATA-alueen 5'-päässä. Valinta suoritetaan esimerkiksi katkaisemalla saadut promoottorielementit sellaisella rest-riktioendonukleaasilla, joka tunnistaa promoottoriele-mentin 5'-pään synteettisen kytkijäsekvenssin, ja sellaisella restriktioendonukleaasilla, joka tunnistaa promoottorielementin 3'-pään synteettisen kytkijäsekvenssin ja määrittämällä syntyneen DNA-jakson pituus agaroosigeelielektroforeesilla. 3'-promoottorielementit voidaan valmistaa myös alalla'tunnetuilla kemiallisilla synteesimenetelmillä.
Keksinnönmukaisia yhdistelmäpromoottoreita voidaan käyttää nisäkäsgeenien tehostettuun ja säädeltyyn ilmentämiseen hiivoissa.
2. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät heterologista po-lypeptidiä koodittavan geenin yhdistelmäpromoottorin ohjauksessa
Keksintö koskee myös hiivan yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joista kukin sisältää hiivaan verrattuna heterologista 11 91280 polypeptidiä koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistel-mäpromoottorin ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään pro-moottorielementistä, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja 3'-alapään promoottorielementistä, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä ja sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna.
Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit voivat olla yhdistelmäplasmideja tai lineaarisia DNA-vektoreita.
Hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodattava DNA-segmentti voi olla mikä tahansa erilaisia polypeptidejä edustavista DNA-jaksoista (geeneistä), glykosyloituneet polypeptidit mukaanluettuina, erityisesti korkeammista eukaryooteista ja varsinkin nisäkkäistä, kuten eläimistä tai erityisesti ihmisestä peräisin olevaa polypeptidiä koodittava. Esimerkkeinä mainittakoon entsyymit, joita voidaan käyttää esimerkiksi ravintoaineiden tuotantoon tai entsymaattisten reaktioiden suorittamiseen kemiassa, tai ei-entsymaattiset polypeptidit, jotka ovat hyödyllisiä ja käyttökelpoisia ihmisten tai eläinten sairauksien hoidossa tai ehkäisyssä, kuten hormonit, immunomodulatorisia, virusten-vastaisia tai kasvaintenvastaisia ominaisuuksia omaavat polypeptidit, vasta-aineet, virusantigeenit, rokotteet, hyytymistekijät, ruoka-aineet tms.
Esimerkkejä tällaisista polypeptideistä ovat insuliini, kasvutekijät, kuten orvaskeden, insuliininkaltai-nen, syöttösolun, hermojen tai transformoiva kasvutekijä, kasvuhormonit, kuten ihmisen tai naudan kasvuhormoni, interleukiini, kuten interleukiini-1 tai -2, ihmisen makro-faagien vaeltamista estävä tekijä (migration inhibitory factor, MIF), interferonit, kuten ihmisen a-interferoni, esimerkiksi interferoni· αΑ, aB, ao tai aF, S-interferoni, γ-interferoni tai yhdistelmäinterferonit, esimerkiksi aA-aD- tai αβ-aD-yhdistelmäinterferoni, hepatiittivirus-antigeenit, kuten hepatiitti B-viruksen pinta- tai ydin-antigeeni tai hepatiitti A-viruksen antigeeni, plasmino-geenin aktivaattorit, kuten kudosplasminogeenin aktivaat-tori tai urokinaasi, kasvainnekroositekijä, somatosta- 12 tiini, reniini, β-endorfiini, immunoglobuliinit, kuten immunoglobuliini D:n, E:n tai G:n kevyt ja/tai raskas ketju, inmmnoglobuliinia sitovat tekijät, kuten immunoglo-buliini E:tä sitova tekijä, kalsitoniini, ihmisen kalsi-toniinille sukua oleva peptidi, veren hyytymistekijät, kuten tekijä IX tai Ville, egliinit, kuten egliini C, desulfatodirudiinit, kuten desulfatohirudiinivariantti HV1, HV2 tai PA, tai ihmisen superoksididismutaasi. Etusijalle asetetaan ihmisen α-interferonia tai yhdistelmä-interferonia, ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria (t-PA), hepatiitti B-viruksen pinta-antigeeniä (HBVsAg), insuliininkaltaista kasvutekijää I, egliini C:tä ja desulfatohirudiinivarianttia HV1 koodittavat geenit.
Yhdistelmäpromoottori on varsinkin joku edellämää-ritellyistä.
Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit voivat sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joissa kussakin on mm. yhdistelmäpromoottori ja hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodittava DNA-segmentti. Jos yhdistelmä-vektori sisältää useita DNA-liitännäisiä, mielellään 2-4 DNA-liitännäistä, ne voivat olla tandem-ryhmityksessä tai eri kohdissa yhdistelmävektorissa. Etusijalle asetettavat yhdistelmävektorit sisältävät yhden DNA-liitännäisen tai tandem-ryhmityksessä olevia useampia DNA-liitännäisiä.
Tämän keksinnön mukaisissa yhdistelmävektoreissa on hiivan yhdistelmäpromoottori toimivasti liitetty polypeptidiä koodittavaan alueeseen, jotta voidaan taata polypep-tidin tehokas ilmentyminen. Eräässä tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa on hiivan yhdistelmäpromoottori liitetty suoraan kypsää polypeptidiä koodittavaan alueeseen niin, että luennanaloitussignaali (ATG) sijaitsee liitoskohdassa. Edullinen alue hiivan yhdistelmäpro-moottorin liittämiseksi polypeptidiä koodittavaan alueeseen on endogeenistä ATG:tä välittömästi edeltävä alue.
Toisessa tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa rakenteeseen sisällytetään signaalisekvenssi. Sopivia signaalisekvenssejä ovat esimerkiksi PH05-signaalisek-venssi, hiivan invertaasigeenin signaalisekvenssi tai a-tekijän pre-prosekvenssi sekä ilmennettävää polypepti- 13 91280 diä koodattavaan alueeseen luontaisesti liittyvät signaali-sekvenssit. Vaihtoehtoisesti voidaan rakentaa fuusioituja signaalisekvenssejä. Sellaiset kombinaatiot asetetaan etusijalle, jotka mahdollistavat tarkan katkeamisen sig-naalisekvenssin ja kypsän polvpeptidin sekvenssin välistä. Rakenteisiin voidaan sisällyttää myös muita sekvenssejä, kuten pro- tai välikesekvenssejä, jotka haluttaessa voivat sisältää spesifisiä prosessointisignaaleja, jotta pre-kursorimolekyylien tarkka prosessointi tulee mahdolliseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa yhdistelmäproteiineja, jotka sisältävät sisäisiä prosessointisignaaleja, jotka mahdollistavat asianmukaisen kypsymisen in vivo tai in vitro. Prosessointisignaalit sisältävät mielellään Lys-Arg-tähteen, jonka erittymistiessä sijaitseva hiivan endo-peptidaasi tunnistaa.
Geenin ilmentymisen jälkeen geenituote joutuu erit-tymisprosessiin ja kuljetetaan periplasmiseen tilaan. Jos voidaan saavuttaa vielä erittyminen solunseinän läpi kasvualustaan, ovat saavutettavissa olevat saannot todennäköisesti paljon suurempia. Myös talteenottoproses-si on yksinkertaisempi, jos soluja ei rikota. Lisäksi polypeptidi voidaan saada talteen ilman N-pään lisäme-tioniinia, koska kypsää polypeptidiä koodittavan sekvenssin edessä ei tarvita ATG-luennanaloitussignaalia. Koska glykosyloituminen liittyy erittymistiehen, tuotetun poly-peptidin ajatellaan olevan glykosyloitunut (edellyttäen, että glykosylointikohdat ovat läsnä). On olemassa useita seikkoja, jotka tekevät glykosyloituneista polypeptideistä edullisia glykosyloitumattomiin verrattuina. Glykosyloitunut polypeptidi muistuttaa läheisemmin aitoa nisäkäs-solun polypeptidiä kuin glykosyloitumaton. Lisäksi tällaisten proteiinien tertiäärirakenne luultavasti riippuu tietyssä määrin glykosyylitähteiden läsnäolosta. Oletettavasti hiilihydraattitähteiden läsnäolo näissä molekyyleissä vaikuttaa edullisella tavalla kemialliseen stabiilisuuteen ja farmakologiseen aktiivisuuteen.
Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit sisältävät mielellään myös hiivageenin 3'-oheissekvenssin, jossa on asianmukaiset signaalit transkription lopettamiselle ja 14 polyadenyloinnille. Etusijalle asetettava 3'-oheissekvens-si on hiivan PH05-geenille kuuluva.
Keksintö koskee erityisesti lineaarista DNA-molekyy-liä, joka oleellisesti ottaen koostuu yhdistelmäpromoot-torista, jossa on 5'-yläpäässä hiivan PH05-geenin promoot-torielementti, joka sisältää UAS:n(:t), ja 3'-alapäässä muun hiivageenin kuin PH05-geenin promoottorielementti, joka sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, hiivaan verrattuna heterolo-gista polypeptidiä koodittavan DNA-segmentin, joka on mainitun promoottorin ohjauksessa, sekä DNA-segmentin, joka sisältää hiivan PH05-geenin oikealla tavalla sijaitsevat transkriptionlopetussignaalit.
Johtuen homologisista 3'- ja 5'-oheissekvensseistä intergoituu polypeptidiä koodittavan alueen sisältävä DNA-vektori kokonaisuudessaan stabiilisti hiivan kromosomin PH05-lokukseen.
Keksintö koskee erityisesti rengasmaisia yhdistel-mäplasmideja, jotka yhdistelmäpromoottorin, polypeptidiä koodittavan alueen ja 3'-oheissekvenssien lisäksi sisältävät lisä-DNA-sekvenssin(ejä), jotka eivät ole välttämättömiä tai ovat vähemmän tärkeitä promoottorin toiminnalle eli polypeptidiä koodittavan alueen ilmentymiselle, mutta jotka suorittavat tärkeitä toimintoja, esimerkiksi mainituilla yhdistelmävektoreilla transformoituneiden hiivasolujen lisääntymisessä. Lisä-DNA-sekvenssit voivat olla prokaryoottisista ja eukaryoottisista soluista johdettuja ja saattavat sisältää kromosomaalisia ja/tai ekstrakromosomaalisia sekvenssejä. Lisä-DNA-sekvenssit voivat olla peräisin (tai koostua) plasmidi-DNA:sta, kuten bakteeri- tai eukaryoottiplasmidi-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromosomaalisesta DNA:sta, kuten bakteerien, hiivojen tai korkeampien eukaryoottien kromosomaalisesta DNA:sta. Etusijalle asetettavat yhdistelmäplas-midit sisältävät sellaisia lisä-DNA-sekvenssejä, jotka on johdettu bakteeriplasmideista, erityisesti Escherichia colin plasmidista pBR322 tai sille sukua olevista plas-mideista, bakteriofaagi λ:sta, hiivan 2y-plasmidista ja/tai hiivan kromosomaalisesta DNA:sta.
15 91280
Erityisesti sisältävät lisä-DNA-sekvenssit hiivan replikonin ja geneettisen valintamerkin hiivaa varten. Yhdistelmäplasmidit, jotka sisältävät hiivan replikonin, esimerkiksi kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), pysyvät yllä hiivasolussa kromosomin ulkopuolella transformoitumisen jälkeen ja replikoituvat autonomisesti mitoosissa. Yhtä hyvin voidaan käyttää yhdis-telmäplasmideja, jotka sisältävät hiivan 2p-plasmidi-DNA:lie homologisia sekvenssejä. Nämä yhdistelmäplasmidit integroituvat rekombinaatiolla jo ennestään solussa läsnäoleviin 2y-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. 2u-sek-venssit soveltuvat erityisen hyvin suurella frekvenssillä transformoiviin plasmideihin ja tuottavat suuria kopiomää-riä.
Hiivan geneettiseksi valintamerkiksi soveltuu mikä tahansa merkkigeeni, joka mahdollistaa transformanttien valinnan merkin fenotyyppisen ilmentymisen perusteella.
Sopivia hiivoissa käytettäviä merkkejä ovat erityisesti sellaiset, jotka antavat vastustuskyvyn antibiootin suhteen, tai auksotrofisten hiivamutanttien kohdalla geenit, jotka täydentävät kyseisiä puutteellisuuksia. Tällaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn sykloheksimidianti-biootille tai antavat prototrofian auksotrofiselle hiiva-mutantille, kuten esimerkiksi URA3-, LEU2-, HIS3- tai TRP1-geenin. Merkkeinä on myös mahdollista käyttää rakennegeenejä, jotka liittyvät autonomisesti replikoitavaan segmenttiin edellyttäen, että transformoitava isäntä on auksotrofinen merkin ilmentämälle tuotteelle.
On edullista, jos keksinnönmukaisissa yhdistelmä-plasmideissa läsnäolevat lisä-DNA-sekvenssit sisältävät myös replikonin ja geneettisen valintamerkin bakteeri-isännälle, erityisesti Escherichia colille. On olemassa seikkoja, jotka tekevät E. colin replikonin ja E. colin merkin läsnäolon edulliseksi hiivan yhdistelmävektorissa. Ensinnäkin voidaan saada aikaan suuria määriä yhdistelmävekto-ri-DNA:ta kasvattamalla ja lisäämällä sitä E. colissa, ja toiseksi yhdistelmävektorien rakentaminen on edullista suorittaa E. colissa, jolloin voidaan käyttää hyväksi laajaa E. coliin perustuvaa kloonausteknologiaa. E. colin plas- 16 midit, kuten pBR322 tms., sisältävät sekä E. colin repliko-nin että E. colin geneettiset merkit, jotka antavat vastustuskyvyn antibioottien suhteen, kuten esimerkiksi tetrasyklikin ja ampisilliinin suhteen, ja joita voidaan edullisesti käyttää osina hiivan yhdistelmävektoreissa.
Lisä-DNA-sekvenssiä, joka sisältää esimerkiksi rep-likoitumisen aloituskohdan ja geneettiset merkit hiivalle ja bakteeri-isännälle (ks. edellä), kutsutaan jäljempänä "vektori-DNA":ksi, joka yhdessä hiivan promoottorin ja po-lypeptidiä koodittavan alueen kanssa muodostavat keksinnön-mukaisen yhdistelmäplasmidin.
Tämän keksinnön edullinen toteutustapa koskee yhdis-telmäplasmide ja, jotka kykenevät replikoituinaan, ja jotka voidaan valita fenotyypin perusteella hiivakannoissa, ja jotka sisältävät hiivan yhdistelmäpromoottorin ja hetero-logista polypeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin, ja mainittu DNA-sekvenssi on sijoitettu yhdessä transkription-aloitus- ja lopetussignaalien kanssa mainittuun yhdistel-mäplasmidiin mainitun yhdistelmäpromoottorin ohjaukseen siten, että se ilmentyy mainitussa hiivakannassa tuottaen mainittua polypeptidiä.
Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit valmistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi liittämällä yhdistelmäpromoottori, jossa on 5'-yläpäässä hiivan PH05-geenin promoottorielementti, jossa on UAS(:t), ja 3'-alapään promoottorielementti, joka on peräisin muun hii-vageenin kuin PH05-geenin promoottorista, ja joka sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, DNA-segmentti, joka koodittaa hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä, ja hiivageenin 3'-oheis-sekvenssit yhteen siten, että mainittu DNA-segmentti on mainitun yhdistelmäpromottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja haluttaessa liitetään mukaan yksi tai useampia lineaarisia DNA-jaksoja, jotka muodostavat DNA-vektorin.
On edullista käyttää kartoitettua lineaarista tai mieluummin rengasmaista vektori-DNA:ta, esimerkiksi baktee-riplasmidi-DNA:ta tai vastaavaa (ks. edellä), jossa on vähintään yksi restriktiokohta, mieluummin kaksi tai 17 91280 useampia restriktiokohtia. On edullista, jos vektori-DNA:ssa on valmiina replikoitumisen alituskohdat ja geneettiset merkit hiivalle ja/tai bakteeri-isännälle. Tämä vektori-DNA katkaistaan käyttämällä sopivaa restriktioendonukleaasia. Katkaistuun DNA:han liitetään lineaarinen DNA-jakso, joka sisältää mm. hiivan yhdistelmäpromoottorin ja polypeptidiä koodattavan DNA-segmentin. Ennen yhdistelmäpromoottorin ja polypeptidiä koodattavan alueen liittämistä tai sen jälkeen (tai samanaikaisesta) on myös mahdollista liittää mukaan repli-koitumisenaloituskohdat ja/tai merkit hiiva- tai bakteeri-isäntää varten. Kaikissa tapauksissa katkaisu- ja liittä-misolosuhteet on valittava niin, ettei vektori-DNA:n eikä yhdistelmäpromoottorin oleellisiin toimintoihin vaikuteta. Yhdistelmävektori voidaan rakentaa peräkkäisesti tai liittämällä yhteen kaksi DNA-segmenttiä, jotka sisältävät kaikki tarvittavat sekvenssit.
Eri tekniikoita voidaan käyttää DNA-segmenttien yh-teenliittämiseen in vitro. Tylpät päät (joissa on täydellisesti emäspariutuneet DNA-kahdenteet', joita eräät rest-riktioendonukleaasit tuottavat, voidaan liittää suoraan yhteen T4 DNA-ligaasin avulla. Tavallisimmin DNA-segmentit liitetään yhteen yksisäikeisten kohesiivisten päidensä kautta ja päät suljetaan DNA-ligaasilla, esim. T4 DNA-ligaasilla. Tällaiset yksisäikeiset "kohesiiviset päät" voidaan muodostaa katkaisemalla DNA toista luokkaa edustavilla endonukleaaseilla, jotka tuottavat porrastettuja päitä (kaksi DNA-kahdenteen säiettä katkeaa eri kohdista niin, että katkeamiskohdat ovat muutaman nukleotidin päässä toisistaan) . Yksinkertaisia säikeitä voidaan myös muodostaa lisäämällä nukleotideja tylppiin päihin tai porrastettuihin päihin käyttämällä terminaalista transferaasia ("homo-polymeerihännitys") tai yksinkertaisesti vain nakertamalla tylppäpäisen DNA-segmentin toista säiettä sopivalla eksonuk-leaasilla, kuten λ-eksonukleaasilla. Vielä eräs edullinen tapa tuottaa porrastettuja päitä on liittää tylppäpäisiin DNA-segmentteihin kemiallisesti syntetisoitu kytkijä-DNA, joka sisältää porrastettuja päitä tuottavan endonukleaasin tunnistuskohdan, ja katkaista saatu DNA kyseisellä endo- 18 nukleaasilla.
Jotta geeni ilmentyisi tehokkaasti, sen pitää sijaita oikealla tavalla suhteessa niihin sekvensseihin, jotka sisältävät transkriptionaaliset (hiivan yhdistelmäpromoottori) ja luennalliset funktiot. Ensinnäkin yhdistelmäpromoottorin sisältävän DNA-segmentin liittyminen polypeptidiä kooditta-vaan alueeseen pitää saada tapahtumaan oikeassa suunnassa.
Jos kaksi suuntaa on mahdollista, pitää oikea määrittää tavanomaisella restriktioanalyysillä. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät väärässä suunnassa olevan polypeptidigeeni-liitännäisen, saatetaan oikein suunnatuiksi leikkaamalla geeniliitännäinen irti sopivalla restriktioendonukleaasilla ja liittämällä geeni uudestaan yhdistelmävektorijaksoon. Joka tapauksessa väärä suunta voidaan välttää liittämällä kyseiset kaksi DNA-segmenttiä yhteen niin, että kummassakin päässä on eri restriktiokohta. Lisäksi yhdistelmävektorin rakentaminen pitäisi suorittaa siten, että se mahdollistaa oikean transkription aloituksen ja lopetuksen. Mitä viimeksimainittuun näkökohtaan tulee, pitäisi transkription kohteena olevan alueen mieluummin päättyä hiivan kromosomaalisesta DNA: sta tai hiivan 2y-plasmidista johdettuun DNA-sekvenssiin.
On edullista, jos transkription kohteena oleva DNA-sekvenssi päättyy sellaiseen DNA-sekvenssiin, joka sisältää hiiva-geenin, esim. PH05 tai TRP1, transkriptionlopetussignaalit. Toiseksi pitää saada syntymään oikea lukuvaiheistus. Tavallisesti promoottorialueen ja polypeptidiä koodittavan alueen nukleotidisekvenssi tunnetaan ennen yhteenliittämistä tai ne voidaan määrittää helposti, joten oikean lukuvai-heistuksen aikaansaamisessa ei ole mitään vaikeutta.
Jos halutaan saada aikaan kypsän polypeptidin ilmentyminen suoraan, yhdistelmäpromoottorialuetta mahdollisesti seuraavat ja/tai kypsää polypeptidiä koodattavaa aluetta mahdollisesti edeltävät signaalisekvenssit tai sen osat pitää poistaa esimerkiksi pilkkomalla eksonukleaa-silla, esim. Bal31:llä. Edullinen alue hiivan promoottorin liittämiseksi polypeptidiä koodittavaan sekvenssiin, on suuren mRNA:n alun ja luennanaloituskodonin ATG välissä.
Kun liittäminen suoritetaan tällä alueella, pitäisi poly- 91280 1 9 peptidiä koodittavalla alueella olla oma ATG-kodoni luennan aloitusta varten tai muussa tapauksessa se pitää tuoda lisäämällä synteettinen oligonukleotidi. Hiivan yhdistel-mäpromoottori voidaan myös liittää polypeptidiä kooditta-vaan sekvenssiin käyttämällä synteettistä oligodeoksinuk-leotidiä liitosmolekyylinä. Niinpä yhdistelmäpromoottori-alue voidaan, mikäli mahdollista, katkaista restriktio-entsyymillä läheltä 3'-päätä niin, että puuttumaan jää tietty määrä emäspareja. Vastaavasti voidaan polypeptidiä koodittava alue katkaista läheltä 5'-päätään. Sen jälkeen voidaan rakentaa synteettinen oligodeoksinukleotidi siten, että liitettäessä hiivan yhdistelmäpromoottori polypeptidiä koodittavaan sekvenssiin kytkijäoligodeoksinukleo-tidisekvenssin avulla saadaan puuttuvat emäsparit ATG-luen-nanaloitussignaali mukaanlukien sekä polypeptidiä koodittava sekvenssi palautetuiksi oikeaan lukuvaiheistukseen suhteessa promoottoriin.
Halutun yhdistelmävektorin sisältävää yhteenliit-tämisseosta käytetään sellaisenaan transformoinnissa tai se rikastetaan ensin yhdistelmävektorin suhteen esim. geeli-elektroforeesilla, ja sen jälkeen suoritetaan transfor-mointi.
Välituotteilla, kuten vektoreilla, joista puuttuu vielä yksi tai useampia oleellisia funktioita, tai kek-sinnönmukaisilla lopullisilla yhdistelmävektoreilla voidaan haluttaessa transformoida bakteeri-isäntä, erityisesti E. coli, edellämainituista syistä (esim. haluttaessa tuottaa suuria määriä välituotteita tai yhdistelmäplas-midejä vastaavasti). Tähän tarkoitukseen voidaan edullisimmin käyttää bakteerivektoreita, kuten E. colin plas-midia pBR322 ja sen osia, jotka sisältävät bakteerin rep-likoitumisen aloituskohdan ja geneettisen merkin tai geneettisiä merkkejä. Tällaista bakteerivektoria käytettäessä sisältävät lopulliset hiivan yhdistelmävektorien valmistusvaiheet mielellään myös hiivan geneettisen merkin ja replikoitumisen aloituskohdan liittämisen.
20 3. Hiivan transformointi polypeptidiä koodittavan sekvenssin sisältävillä yhdistelmävektoreilla
Vielä eräs tämän keksinnön kohde koskee menetelmää sellaisten transformoituneiden hiivasolujen tuottamiseksi, jotka kykynevät saamaan aikaan hiivalle heterologista polypeptidiä, siten, että transformoidaan hiivasolut yhdistel-mävektorilla, joka sisältää yhden tai useampia DNA-liitän-näisiä, joista kukin sisältää hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistelmäpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään promoottorielementistä, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja 3alapään promoottori-elementistä, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä ja sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna.
Saccharomyces-, Kluyveromyces-, Candida-, Rhodotorula-ja Torulopsis-sukuun sekä näille läheistä sulua olevat lajit ovat käyttökelpoisia (ks. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971), erityisesti Saccharomyces cerevisiae-kannat.
Hiivojen transformointi yhdistelmävektoreilla voidaan suorittaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi Hin-nen et al:n kuvaamalla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei.
USA TS_, 1929 (1978)). Tämä menetelmä jakautuu kolmeen vaiheeseen: (1) Hiivan solunseinän tai sen osien poisto.
(2) "Alastomien" hiivasolujen (sferoplastien) käsittely transformoivalla DNA:11a PEG:n (polyetyleeniglykoli) ja Ca^+-ionien läsnäollessa.
(3) Solunseinän regenerointi ja transformoituneiden solujen valinta kiinteässä agarkerroksessa.
Seuraavat menetelmät ovat edullisia: (1) : Hiivan solunseinä poistetaan entsymaattisesti käyttämällä erilaisia glukosidaasivalmisteita, kuten etanan mahanesteitä (esim. GlusulasJ^ tai Helicase^) , mikro-organismeista saatuja entsyymiseoksia (esim. Zymolyase*^ , osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esim. 1 M sorbitoli).
(2) : Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n läs näollessa ja näin indusoituu solukalvojen paikallisia fuu- 21 91280 sioita. "Fuusionkaltaisten" olosuhteiden syntyminen on välttämätöntä ja monista transformoituneista hiivasoluista tulee diploidisia tai triploidisia transformoinnin kuluessa. Menetelmiä, jotka mahdollistavat fuusioitujen sfero-plastien valinnan, voidaan käyttää transformanttien rikastamiseen eli transformoituneet solut voidaan helposti seuloa ennalta valittujen fuusiotuotteiden joukosta.
(3): Koska soluseinättömät hiivasolut eivät jakau du, pitää soluseinä regeneroida. Tämä regenerointi on edullista suorittaa peittämällä sferoplastit agariin. Esimerkiksi voidaan sulaa agaria (noin 50°C) sekoittaa sferoplas-teihin. Kun seos jäähdytetään hiivan kasvulämpötilaan (noin 30°C), saadaan kiinteä kerros. Tämän agarkerroksen tarkoituksena on estää nopea diffuusio ja oleellisten makromolekyylien poistuminen sferoplasteista, jolloin soluseinän regeneroituminen helpottuu. Soluseinän regeneroituminen voidaan myös saada aikaan (vaikkakin pienemmällä teholla) kasvattamalla sferoplasteja valmiiden agarkerrosten pinnassa .
Regenerointiagarin koostumus on edullista valita niin, että transformoituneet solut voidaan regeneroida ja valita samanaikaisesti. Koska valintamerkkeinä käytetään tavallisesti hiivageenejä, jotka koodittavat aminohappobiosyn-teesin entsyymejä, on regenerointi edullista suorittaa hiivan minimikasvualustaa sisältävässä agarissa. Jos vaaditaan erittäin korkeita regenerointitehoja, on seuraava kaksivaiheinen menetelmä edullinen: (1) Soluseinä regene roidaan ravintorikkaassa alustassa ja (2) transformoituneet solut valitaan kasvattamalla solukerroksesta kopio selektiivisellä agarlevyllä.
Jos yhdistelmävektori ei sisällä mitään merkkigeeniä, voidaan transformoituneet solut tunnistaa vaihtoehtoisilla menetelmillä. Tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi in situ-hybridisaatio leimatulla DNA-fragmentilla, joka sisältää yhdistelmävektorin kanssa homologisia sekvenssejä (esim. Hinnen et al:n mukaan, supra), in situ-immunomääri-tyksillä edellyttäen, että liitetyn geenin aikaansaaman tuotteen vasta-aine on saatavissa, tai muilla seulontame- 22 netelmillä, jotka mittaavat transformoinnissa käytetyn plasmidin koodittamia geenituotteita.
Vaihtoehtoisesti voidaan hiiva yhteistransformoida keksinnönmukaisella yhdistelmävektorilla sekä toisella vektorilla, joka sisältää hiivan geneettisen valintamerkin.
Jos kyseisillä kahdella eri vektorilla on yhteisiä DNA-sekvenssejä (nämä voivat olla vektoreissa läsnäolevia bak-teerisekvenssejä), tapahtuu rekombinaatio, josta on seurauksena fuusioitunut, valinnan mahdollistava yhdistelmä-molekyyli .
Hiiva voidaan myös yhteistransformoida lineaarisella DNA-vektorilla, joka sisältää hiivan yhdistelmäpromoot-torin, mainitun promoottorin ohjauksessa olevan heterolo-gista polypeptidiä koodittavan alueen ja hiivan PH05-geenin transkriptionlopetussignaalit, ja hiivan valinta-merkin sisältävällä vektorilla. Yhteistransformointi mahdollistaa sellaisten hiivasolujen rikastamisen, jotka ovat ottaneet DNA:ta, jota ei voi suoraan valita merkin perusteella. Koska transformointikelpoiset solut ottavat vastaan mitä tahansa DNA-tyyppiä, on suuri osa soluista transformoitunut valinta-DNA:n lisäksi myös toisella DNArlla (kuten edellämainitulla lineaarisella DNA:11a).Koska polypeptidigeeni sisältää riittävän pitkiä homologisia sekvenssejä (esim. noin 20 - 100 deoksinukleotidia pitkiä), polypeptidigeeni integroituu isäntäkromosomiin stabiilisti. Tämän keksinnön mukainen spesifinen rakenne johtaa hetero-logisen geenin stabiiliin integroitumiseen PH05-geenin kohtaan kromosomissa eli hiivan kromosomiin II.
Näin saatuja, keksinnönmukaisia yhdistelmäplasmi-deja sisältäviä hiivakantoja voidaan parantaa heterologis-ten polypeptidien tuotannon suhteen aikaansaamalla mutaatioita ja suorittamalla valintaa alalla tunnetuilla menetelmillä. Mutaatiot voidaan saada aikaan esimerkiksi UV-säteilytyksellä tai sopivilla kemiallisilla reagensseil-lä.
On havaittu, että transformointi keksinnönmukaisilla yhdistelmävektoreilla ja solunseinien regenerointi rikkaassa kasvualustassa, joka sisältää glukoosia hiililähteenä, voidaan suorittaa edullisesti ja on oleellisesti helpompaa 23 91280 kuin saman suorittaminen sellaisilla yhdistelmävektoreilla, jotka sisältävät tavanomaisia, glukoosilla indusoituvia promoottoreita, jolloin toimenpiteet pitää suorittaa glukoosittomassa alustassa, jotta voidaan välttää mahdollisesti letaalisen geenituotteen kertyminen solujen sisään.
Keksintö koskee myös hiivaisäntiä, jotka ovat transformoituneet sellaisilla yhdistelmävektoreilla, jotka sisältävät yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joista kukin sisältää hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistelmäpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään promoottorielementistä, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja 3'-alapään promoottorielementistä, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä ja sisältää transkription-aloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna sekä näiden mutantteja.
4. Transformoituneiden hiivasolujen viljely ja ilmentyneen polypeptidin eristäminen
Keksintö koskee myös menetelmää hiivaan verrattuna heterologisen polypeptidin tuottamiseksi siten, että hiiva-kantaa, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, joka sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joista kukin sisältää hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistelmäpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään promoottorielementistä, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t)ja 3'-alapään promoottorielementistä, joka on peräisin muusta hiivageenistä kuin PH05-geenistä ja sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, tai tämän mutanttia viljellään ja ilmentynyt polypeptidi eristetään.
Keksinnönmukaisia transfromoituneita hiivasoluja viljellään alalla tunnetuilla menetelmillä nestemäisessä kasvualustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja ja tarvittaessa kasvua edistäviä aineita.
Voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Edullisia 24 hiililähteitä ovat esimerkiksi assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli ja laktoosi, tai asetaatit, kuten natriumasetaatti, yksin tai sopivina seoksina käytettyinä. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit sekä niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni ja lihauutteet, ja edelleen hiivauute, mallasuute, maissin-liotusvesi ja ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää yksin tai seoksina. Sopivia epäorgaanisia suoloja ovat mm. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatti, kloridi, fosfaatti ja karbonaatti. Kasvualusta voi lisäksi sisältää kasvua edistäviä aineita. Kasvua edistäviä aineita ovat mm. kasvunedistysaineet, hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms., ja yksittäiset aminohapot.
Koska keksinnönmukaiset yhdistelmäpromoottorit ovat säätelyn alaisia, pitää kasvualustan koostumus sovittaa kasvuvaiheen mukaan. Kasvuvaiheen aikana, jolloin fosfaat-tipitoisuus on korkea, ovat keksinnönmukaiset yhdistelmäpromoottorit käytännöllisesti katsoen pois päältä kytkettyinä. Esimerkiksi kaikkein edullisin tämän keksinnön mukainen yhdistelmäpromoottori, joka sisältää 5'-yläpäässä PH05:n promoottorielementin, jossa on PH05:n UAS:t, ja 3'- alapäässä GAPDH:n promoottorielementin, jossa on TATA-alue, on kytketty pois päältä niin, että sen teho on pudonnut viidenteenkymmenenteen osaan. Näin ollen mahdollisesti toksisia geenituotteita syntetisoituu hyvin pieninä määrinä ja solujen aineenvaihduntaan kohdistuvat haitalliset vaikutukset jäävät mahdollisimman vähäisiksi.
Kun on saavutettu riittävä solutiheys, ravintoalustan sisältämä epäorgaanisen fosfaatin pitoisuus mielellään lasketaan matalaksi (matala-P^-alusta). Tällöin keksinnönmukaiset yhdistelmäpromoottorit kytkeytyvät päälle ja saadaan mahdollisimman suuri määrä mRNA-transkripteja.
Kasvatus suoritetaan tavallisilla menetelmillä. Kasvuolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH ja fermentoin-tiaika valitaan siten, että haluttua polypeptidiä valmistuu mahdollisimman paljon. Yleensä kasvatus suoritetaan aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistele- 25 91280 maila tai sekoittamalla noin 25 - 35°C lämpötilassa välillä 4-8 olevassa pH:ssa, esimerkiksi noin pH:ssa 7, noin 4 -20 tunnin kuluessa, mielellään siksi, kunnes haluttua proteiinia on saatu maksimaalinen määrä.
Ilmentyneen polypeptidin eristäminen ja puhdistaminen suoritetaan haluttaessa alalla tunnetuilla menetelmillä.
Kun transformoituneet solut ovat kasvaneet tyydyttävään solutiheyteen, vapautetaan ilmentyneen proteiinin talteenoton ensimmäisessä vaiheessa proteiini solun sisältä. Useimmissa menetelmissä soluseinä poistetaan ensin entsymaattisella hajotuksella, esim. käyttämällä glykosi-daaseja. Näin saadut sferoplastit käsitellään pinta-aktii-visilla aineilla, kuten Tritonilla. Vaihtoehtoisesti voidaan solujen rikkomiseen käyttää mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimia (esimerkiksi X-puristin, ranskalainen puristin) tai ravistelua lasihelmien kanssa. Näin saatu seos rikastetaan halutun polypeptidin suhteen käyttämällä tavanomaisia menetelmiä. Voidaan esimerkiksi poistaa suurin osa ei-proteiinimateriaalista polyetyleeniamiinikäsitte-lyllä ja saostaa proteiinit kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai trikloorietikkahapolla ja suorittamalla geelielektroforeesi, dialyysi, kromatografinen käsittely, esim. ioninvaihtokromatografointi, ekskluusiokromatogra-fointi, HPLC tai käänteisfaasi-HPLC, tai erottelu mole-
dD
kyylikoon mukaan sopivassa Sephadex^-pylväässä tms. Esi-puhdistettu tuote voidaan puhdistaa lopulliseen puhtauteensa esimerkiksi vasta-aineaffiniteettikromatografiaa käyttämällä.
Siinä tapauksessa, että hiivasolu erittää halutun polypeptidin periplasmiseen tilaan, voidaan käyttää yksinkertaisempaa menetelmää. Polypeptidi voidaan ottaa talteen solua hajottamatta, sillä riittää vain solun seinän poisto entsymaattisesti tai käsittely kemiallisilla aineilla, kuten tiolireagensseilla tai EDTA:lla, jotka vaurioittavat solunseiniä mahdollistaen polypeptidin vapautumisen. Jos polypeptidi erittyy suoraan kasvualustaan, se voidaan ottaa talteen sieltä.
Jos saadaan glykosyloituneiden ja glykosyloitumat- 26 tornien proteiinien seos, voidaan seoksen aineosat erottaa toisistaan esimerkiksi suorittamalla kromatografia konkana-valiini-A-Sepharose'*^-py lväässä. Glykosyloitumattomat tuotteet kulkevat pylvään läpi, kun taas glykosyloituneet tuotteet adsorboituvat selektiivisesti ja ne voidaan eluoida tavallisilla menetelmillä, esimerkiksi käyttämällä α-metyylimannosidia yhdessä l·aotrooppisen aineen, kuten KSCN:n kanssa.
On myös mahdollista poistaa glykosyylitähteet entsymaattisesti, esimerkiksi käyttämällä endoglykosidaasia H tai F. Näin saadaan aikaan glykosyloitumattomia tuotteita oleellisesti ottaen puhtaassa muodossa.
Tämä keksintö koskeekin myös kaikkia sellaisia poly-peptidejä, jotka on valmistettu keksinnönmukaisilla menetelmillä .
Keksintö koskee erityisesti PH05:n ylävirran akti-vointisekvenssejä, yhdistelmäpromoottoreita, yhdistelmä-vektoreita, transformoituneita hiivasoluja ja menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä hiivalle heterologisten poly-peptidien valmistusmenetelmää, kuten esimerkeissä on selostettu .
Seuraavassa kokeellisessa osassa tämän keksinnön erilaisia toteutustapoja selostetaan viittaamalla liitteenä oleviin kuviin.
Kuva 1 esittää PH05-promoottorialueen BamHI-Sall-jakson DNA-sekvenssiä.
Kuva 2 esittää GAPDH:n promoottorialueen DNA-sekvenssiä (klooni 491, ks. G.A. Bitter et ai., Gene J2, 263 (1984)).
Kuva 3 on kaaviokuva plasmidin pGAPDH-EL valmistamisesta.
Kuva 4 esittää tässä keksinnössä käytettyjä GAPDH-geenin 3'-promoottorielementtejä.
Kuva 5 esittää plasmidin pJDB207R/PHO5-EGL valmistusta .
Kuva 6 esittää plasmidin pJDB207/PAPEL-EGL(UAS1) valmistusta .
Kuva 7 on kaavioesitys kypsää desulfatohirudiinia koodittavan DNA-jakson eristämisestä.
91280 27
Kuva 8 esittää plasmidin pJDB207/PHO5-HIR valmistusta .
Kuva 9 esittää plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR valmistusta.
Kuva 10 esittää plasmidin pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1+ UAS2) valmistusta.
Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraa-villa esimerkeillä.
Esimerkki 1: PH05-promoottorin deleetioiden aikaansaa minen a) Pilkkominen Bal31:llä PH05-promoottorin lähteenä käytetään yhdistelmätaa-gia M13mp9/PH05 Bam-Sal, joka sisältää kuvassa 1 esitetyn PH05:n BamHI-Sall-jakson (ks. eurooppalainen patenttihakemus no. 143 081). 20 yg faagi-DNA:ta (RF: replikoituva muoto) katkaistaan restriktioendonukleaasilla Sali, jolloin saadaan lineaarinen DNA, jonka pituus on noin 9 ke. Feno-li/kloroformiuuton jälkeen DNA saostetaan etanolilla. DNA audelleensuspendoidaan pitoisuuteen 0,5 yg/ml liuokseen, jossa on 10 mH Tris pH 8,0. 16 yg Sällillä pilkottua DNA: ta hajotetaan 2 yksiköllä eksonukleaasia Bal31 (BRL) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaC^ ja 1 mM EDTA. Otetaan 2 yg:n näyte DNA:ta, kun on inkuboitu 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 minuuttia 30°C:ssa, ja näytteisiin sekoitetaan välittömästi 50 yl fenolia ja 60 yl TNE:tä. Fenoli/kloroformiuuton ja etanoli- saostuksen jälkeen DNA uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 100 yg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris pH 8,0. Jotta saataisiin selville, kuinka pitkälle Bal31:n eksonukleo-lyyttinen vaikutus on edennyt, 0,5 yg kussakin vaiheessa saatua DNA:ta katkaistaan endonukleaasilla BamHI ja analysoidaan 1,5 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraattipuskuriin pH 8,3 (90 mM Tris.HCl pH 8,3, 90 mM boorihappo, 2,5 mM EDTA). Keskimäärin 100 emäsparia poistuu jakson kummastakin päästä Bal31-hajotusminuuttia kohti.
28 b) EcoRI-kytkijän liittäminen Bal31:llä käsiteltyyn DNA:hän
Kaksi A26Q-yksikköä EcoRI-kytkijää (5'-GGAATTCC-3', BRL) uudelleensuspendoidaan 250 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris pH 8 ja 1 mM EDTA. 2 yg EcoRI-kytkijää kina-soidaan 75 y1:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2» 15 mM DDT, 10 hM ATP ja 33 yksikköä T4-polynukleo-tidikinaasia (Boehringer). Kun seosta on pidetty 1 tunti 37°C:ssa, sen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan ja sen jälkeen varastoidaan -20°C:ssa.
Emäspariutetut, kaksisäikeiset EcoRI-kytkijät liitetään tylpistä päistään DNA-jaksoihin, jotka on käsitelty Bal31:llä. 0,5 yg Bal31:llä käsiteltyä DNA:ta (ks. esimerkki 1a) inkuboidaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa 50-kertaisen ylimäärän kanssa kinasoitua EcoRI-kytkijää 20 ylrssa reak-tioseosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs).
Kun T4 DNA-ligaasi on inaktivoitu (10 minuuttia 65°C:ssa), ylimääräinen EcoRI-kytkijä katkaistaan 50 yksiköllä EcoRIrtä 50 yl:n tilavuudessa. DNA uutetaan fenoli/kloroformilla, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris ja 1 mM EDTA (=TE).Sitten DNA katkaistaan 5 yksiköllä BamHIrtä (Biolabs) ja seos viedään 1,5 %: seen matalalla sulavaan agaroosigeeliin (Sigma), joka on tehty Tris-boraattipuskuriin (ks. edellä). Vyöhykkeet värjätään etidiumbromidilla ja tehdään näkyviksi pitkäaaltoi-sella UV-valolla 366 nm:ssä. Leveä, diffuusi vyöhykkeistö, joka on 100 ja 600 emäsparin välissä, leikataan irti geelistä ja DNA uutetaan seuraavalla tavalla: Agaroosipala nesteytetään 65°C:ssa, NaCl-pitoisuudeksi säädetään 500 mM ja sen jälkeen inkuboidaan 20 minuuttia 65°C:ssa. Lisätään yksi tilavuus fenolia (tasapainotettu pitoisuuteen 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl). Vesifaasi uutetaan uudestaan kahdesti fenolilla ja kerran kloroformilla.
DNA saostetaan 2,5 tilavuudella kylmää absoluuttista etanolia ja otetaan talteen sentrifugoimalla. DNA-pelletti pestään kylmällä 80 %:sella etanolilla ja kuivataan vakuu-missa. DNA uudelleensuspendoidaan 10 yl:aan TE:tä.
91280 29 c) Liittäminen plasmidiin M13mp9 3 yg M13mp9:n replikoituvaa muotoa (RF) katkaistaan 15 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) ja 15 yksiköllä BamHI: tä (Boehringer) 50 yl:n tilavuudessa. Fenoliuuton ja eta-nolisaostuksen jälkeen DNA uudelleensuspendoidaan 50 ui:aan TE:tä. 5 ui leikattua vektori-DNA:ta (noin 200 ng) sekoi tetaan 10 ul:aan edellä saatua näytettä (DNA-jaksot, jotka saatiin esimerkissä 1b eri Bal31-pilkkomistuot-teista ja suoritettiin yhteenliittäminen 20 ul:n tilavuudessa 15 tunnissa käyttämällä 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 200 yksikköä T4 DNA-li-gaasia. Käsiteltyjen E. coli JM101-solujen transduktio suoritetaan New England Biolabsin käsikirjan "M13 cloning and sequencing system". Useista valkoisista täplistä saatuja faageja kasvatetaan ja niiden DNA-liitännäisen koko analysoidaan suorittamalla katkaisu entsyymeillä EcoRI ja BamHI.
d) Bal31-deleetioiden päättymiskohtien määrittäminen Sangerin sekvenssinmääritysmenetelmällä (deleetiot Sali-kohdasta lukien)
Sekvenssinmääritys suoritetaan käyttämällä Sanger et alin dideoksi-DNArnmääritysmenetelmää (Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 74, 5463 (1977)), joka on selostettu edellämainitussa käsikirjassa. Deleetioiden päättymiskohdat on esitetty seuraavassa:
Klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin asema (ks. kuva 1) A -502 B -471 C -422 D -400 E -392 F -369 30 G -350 H -328 I -300 K -283 L -255 M -226 N -211 O -187 P -111 Q -88 R -57 S -33 e) Bal31-deleetioiden päättymiskohtien määrittäminen Sangerin sekvenssinmääritysmenetelmällä (deleetiot BamHI-kohdasta lukien)
Suoritetaan samanlaiset Bal31-deleetiot kuin kohdissa a - c, mutta M13mp9 PH05 Bam-Sal katkaistaan BamHIillä. Bal31:llä pilkotut molekyylit katkaistaan EcoRIillä ja Sällillä ja syntyneet jaksot kloonataan EcoRIillä ja Sällillä katkaistuun M13mp9iään. Deleetioiden päättymiskohdat on esitetty seuraavassa.
Klooni PH05in sekvenssin viimeisen nukleotidin asema (ks. kuva 1) A’ -24 B' -35 C' -41 D' -48 E’ -74 F' -89 G’ -93 H' -97 1' -124 K' -162 L’ -174 M’ -262 31 91280 Ν' -277 0’ -306 Ρ· -332 Q’ -346 R’ -361 S' -382 Τ’ -393 f) Sisäisten deleetioiden aikaansaaminen PH05-promoot-toriin
Kohdassa d) selostettu Bal31-deleetiotoimenpide tuottaa "vasemman käsivarren" PH05-promoottorifragmentin, joka päättyy EcoRI-kohtaan, ja kohdassa e) kuvattu Bal31-deleetiotoimenpide tuottaa "oikean käden" PH05-promoottorifrag-mentin, joka päättyy EcoRI-kohtaan. Kun "vasemmat käsivarret" ja "oikeat käsivarret" liitetään yhteen, on saatu aikaan eripituisia sisäisiä deleetioita, jotka sisältävät EcoRI-kytkijäjakson poistuman kohdalla. Yksittäiset sisäisen deleetion omaavat jaksot saadaan leikkaamalla "va-seamnat käsivarret" ja "oikeat käsivarret" plasmidin M13mp9 johdannaisista restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI (vasemmat käsivarret) tai restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Sali (oikeat käsivarret) ja eristämällä vastaavat fragmentit pehmeäagaroosigeelielektroforeesilla kohdassa b) kuvatulla tavalla. Ekvimolaariset määrät "oikeaa käsivartta", "vasenta käsivartta" ja 200 ng BamHI:llä ja Sall:llä katkaistua M13mp9-vektori-DNA:ta liitetään yhteen kohdassa c) kuvatulla tavalla. Suoritetaan E. coli JM101:n transduktio ja poimitaan valkoiset plakit, tuotetaan RF ja suoritetaan restriktioanalyysi (BamHI, Sali, EcoEI).
Seuraavat käsivarret yhdistetään spesifisten sisäisten deleetioiden aikaansaamiseksi (nukleotidien numerointi käy ilmi kuvasta 1): "vasen käsi- "oikea kä- nukleoti- poistunut nukleo- varsi" sivarsi" deleetio diväli tidimäärä A Τ’ Δ 7 -501 394 108 B Τ' Δ 8 -470 394 77 C Τ' Δ 9 -421 - -394 28 D S' Δ10 -399 383 17 £ R’ Δ11 -391 362 30 F Q' Δ12 -368 347 22 32 G P' Δ13 -349 - -333 17 H 0' Δ14 -327 - -307 21 I Ν' Δ15 -299 - -278 22 K M' Δ16 -282 - -263 20 L L' Δ17 -254 “ -175 80 H L’ Δ18 -225 - -175 51 N L' Δ19 -210 - -175 36 O L' Δ20 -186 - -175 12 O K' Δ21 -186 - -163 24 O 1' Δ22 -186 - -125 62 O H' Δ23 -186 - - 98 89 P H’ Δ24 -110 - - 98 13 P G’ Δ25 -110 ^ - 94 17 P F' Δ26 -110 - - 90 21 Q E’ Δ27 - 87 -- 75 13 R D’ Δ28 -56--49 8 R C Δ29 - 56 -- 42 15 R B' Δ30 - 56 - - 36 21 S A' Δ31 - 32 - - 25 8
Esimerkki 2: PH05-promoottorin sisäisten deleetioiden ana lyysi in vivo
Erilaiset esimerkissä 1f) kuvatut deleetiot kloonataan plasmidiin pJDB207/PHO5 (R. Haguenauer-Tsapis and A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4_, 2668 - 2675 (1984)) korvaamalla villityyppinen PH05 Bam-Sal-jakso deleetion sisältävällä versiolla. Hiivakannan S. cere-visiae AH216 (ks. eurooppalainen patenttihakemus no.
143 081) transformoinnin jälkeen happofosfataasiaktii-visuus määritetään Toh-e et al:n menetelmällä (J. Bacteriol. 1 13, 727 (1973)). Deleetiot Δ11 ja Δ12 osoittavat PH05-aktiivisuuden vähenemistä noin kymmenenteen osaan ja määrittelevät ylävirran alueen ("upstream activation site", UAS), joka on oleellinen PH05:n ilmentymiselle. Samanlai- 33 91280 nen vähentävä vaikutus havaitaan deleetiolla Λ17 (väheneminen noin viidenteen osaan) ja TATA-alueen deleetioilla Λ23 -A26 (väheneminen noin kolmanteenkymmenenteen osaan) .
Kaikki muut deleetiot osoittavat suunnilleen villityyrapisen tasoisia aktiivisuuksia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PH05:n ilmentymisen kannalta on kolme oleellista aluetta, jotka sijaitsevat seuraavissa kohdissa: 1. kohtien -349 ja -383 välissä (UAS1) 2. kohtien -225 ja -263 välissä (UAS2) 3. kohtien -87 ja -125 välissä (TATA-alue) DNA-jaksot, jotka sisältävät PH05:n UAS1:n tai UAS2:n tai sekä UAS1:n että UAS2:n, voidaan tuottaa yhdistelmä-faagista Ml3mp9/PH05 Bam-Sal (ks. esimerkki 1) suorittamalla katkaisut tarvittavilla restriktioendonukleaaseilla.
UAS1 sisältää 268 emäsparin BamHI-Clal-jaksoon, jonka kaava on seuraava
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTG
CGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTT
CATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACG
CAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAAT
GAAT, UAS2 sisältyy 100 emäsparin Clal-BstEII-jaksoon, jonka kaava on seuraava
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT
CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG
ja sekä UAS1 että UAS2 ovat läsnä 368 emäsparin BamHI-BstEII-jaksossa, jonka kaava on seuraava GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTGC GCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTTCA TAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCAA CTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG .
34
Esimerkki 3: Fuusioitujen PH05-GAPDH-yhdistelmäpromoot- torien rakentaminen
Esimerkit 1 ja 2 tekevät PH05-geenin aseman -365 ympärillä olevasta alueesta (UAS1 (PH05)) ja aseman -180 ympärillä olevasta alueesta (UAS2(PH05)) mahdollisia kandidaatteja sellaiselle UAS-alueelle, jolla on sääte-lyominaisuuksia. UAS1(PH05) sisältyy 268 emäsparin BamHI-Clal-jaksoon, kun taas sekä UAS1(PH05) että UAS2(PH05) sisältyvät BamHI-BstEII-jaksoon. Nämä kaksi jaksoa fuusioidaan erikseen kahteen eri GAPDHm alavirran promoot-torielementtiin, jotka sisältävät TATA-alueen ja GAPDHrn transkriptionaloituskohdat.
a) Hiivan geenikirjaston rakentaminen 30 yg suurimolekyylipainoista hiivan kokonais-DNA: ta (M.V. Olsen et ai., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)), joka on saatu Saccharomyces cerevisiae-kannasta S288C, inkuboi-daan 30 minuuttia 37°C:ssa käyttämällä 2 yksikköä EcoRI-metylaasia (New England Biolabs) 250 ylrssa EcoRI-metyloin-tipuskuria valmistajan ohjeiden mukaan. DNA saostetaan etanolilla, uudelleensuspendoidaan 500 ylraan puskuria, jossa on 25 mM Tris.HCl pH 8,5 ja 2 mM MgC^ (EcoRI*-puskuri) (H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979)), ja pilko taan EcoRIrllä (Boehringer), kunnes DNA-jaksojen kokoja-kautuman maksimi on 30 - 50 ke:n alueella (XDNArn Xhol-ha-jotustuote antaa sopivat 33 ke:n ja 17 kern merkit). EcoRI*-olosuhteissa pilkottu hiivan DNA fraktioidaan koon mukaan sakkaroosigradientissa (5 - 20 % sakkaroosia liuoksessa, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA) käsittelemällä 6 tuntia nopeudella 38 000 1/min SW 40-roottorissa. Gradientin yläpäästä kerätään 30 jaetta, joiden kunkin tilavuus on 0,4 ml. Jae 16 sisältää ne DNA-jaksot, joiden koko on 30 - 40 ke. Tämän jakeen DNA (3 yg) saostetaan etanolilla ja sitä liitetään 16 tuntia 15°C:ssa 15 ylin kokonaistilavuudessa 1 ygraan kosmidivektoria pYd (B.
Hohn et ai., "Genetic Engineering",Voi. 2, s. 169, New York 1980)), joka on linearisoitu EcoRIrllä. Yhteenliittäminen suoritetaan käyttämällä 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) ja valmistajan kuvaamaa 35 91280 puskurisysteemiä. DNA pakataan in vitro bakteriofaagi-λ: aan (B. Hohn, "Methods in Enzymology", Voi. 68, s. 299,
New York 1979) ja yhteenkootuilla faageilla suoritetaan E. coli-kannan HB101 (r^, m^, leu , pro , recA) transduk- tio. Transduktion tehokkuus on noin 5000 ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä per yg pYc1-vektoria.
R
3000 amp -pesäkettä poimitaan ja niitä kasvatetaan erikseen mikrotitrauslevyjen koloissa LB-alustassa (10 g Bacto-tryptonia (Difco), 5 g Bacto-hiivauutetta (Difco) ja 10 g NaCl), joka sisältää 100 yg/ml ampisilliiniä.
b) Hiivan GAPDH-geenin eristäminen
Edelläkuvattu geenikirjasto seulotaan synteettisellä oligonukleotidilla (valmistettu käyttämällä fosfotri-esterimenetelmää: K. Itakura et ai., J.Am. Chem. Soc.
97, 7327 (1 975); J.F.M. de Rooij et ai., Red. Trav.
Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)), jonka rakenne on seuraa- va: 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10 yg oligonukleotidia 32 kinasoidaan käyttämällä 10yl γ- P-ATP:tä (3000 Ci/mmol, 10 yCi/yl Amersham) T4 polynukleotidikinaasilla (Boehringer) 50 yl:n kokonaistilavuudessa Maniatis et ai:n mukaan ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, s. 125). Pesäkehybridisaatio suoritetaan saman tekijän kuvaamalla menetelmällä (s. 312). Positiiviset pesäkkeet havaitaan autoradiografiällä käyttämällä Kodak X-5-röntgenfilmiä. Plasmidi-DNA:n eristäminen (ks. eurooppalainen patenttihakemus no. 100 561) tuottaa yhdistelmäkloonin, joka sisältää 2100 emäsparin Hindlll-jakson, joka koodittaa GAPDH: ta (J.P. Holland et ai., J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979)). Lopullinen näyttö kloonatun DNA:n autenttisuudelle tulee DNA:n sekvenssinmäärityksestä käyttämällä edellämainittua oligonukleotidia yhdessä dideoksisekventointimenetelmän kanssa G.F. Hongin mukaan (Bioscience Reports _1_, 243 (1981)) koskien kaksisäikeistä DNA:ta. Kloonatulla GAPDH-geenillä on sama sekvenssi kuin pgap491:llä, jonka Holland et ai. ovat julkaisseet (J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)).
36 c) GAPDH:n alavirran promoottorielementtien valmistus (ks. kuvat 2 ja 3) 649 emäsparin TaqI-jakso, joka sisältää nukleotidit -27 - -675 GAPDH-geenin ATGrstä lukien (kuva 2), eristetään pilkkomalla edellämainittu yhdistelmäplasmidi Taql:llä (New England Biolabs), eristämällä DNA-jaksot 1,2 % sessa pehmeäagarocsigeelissä ja uuttamalla DNA kuumalla fenolilla (ks. esimerkki 1). TaqI-jakso kloonataan plasmidin pBR322 Clal-kohtaan: 1 yg plasmidia pBR322 katkaistaan kolmella yksiköllä Clal:tä (New England Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. 300 ng fenolilla käsiteltyä ja leikattua vektoria liitetään noin 300 ng:aan liitettävää DNAtta (649 emäsparin Taq-jakso) käyttämällä 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia 20 yl:n kokonaistilavuudessa (ks. esimerkki 1b). Transformointi suoritetaan E. coliin HB101 saattamalla se vastustuskykyiseksi ampisilliinille, plasmidi-DNA valmistetaan ja analysoidaan restriktioanalyysillä (Taql, Dral). TaqI-jakson suunta määritetään käyttämällä restriktioendo-nukleaasikohtia Dral ja BamHI ja se plasmidi valitaan, jossa on TaqI-kohta asemassa -675 lähellä pBR322:n Hindlll-kohtaa. Tämä plasmidi, jolle on annettu nimi pBR322/GAPDH, linearisoidaan käyttämällä BamHI:tä (New England Biolabs) ja pilkkominen Bal31:llä suoritetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla paitsi, että käytetään Bglll-kytkijöitä (5'-CAGATCTG-3', New England Biolabs) ja pilkottu plasmidi saatetaan välittömästi renkaan muotoon pitoisuudessa 5 yg/ml 20 yl:n kokonaistilavuudessa. Bal31:llä lyhennetyn TaqI-gakson koko määritetään restriktioanalyysillä (käyttämällä Bglllrta ja HindIII:a). Valitaan kaksi kloonia, jotka sisältävät DNA-jaksot, jotka ulottuvat noin 200 emäsparin ja 265 emäsparin päähän ATG:stä ylöspäin GAPDH-promoottorin suuntaan. Molemmat jaksot sisältävät oletetusti TATA-alueen noin emäsparin -140 kohdalla. Nämä kloonit sisältävät edelleen replikoitumisen aloituskohdan DNA:n plasmidista pBR322 johdetussa kohdassa ja niille annetaan vastaavasti nimet pGAPDH-F ja pGAPDH-F.
37 91280 d) Alapään GAPDH-elementin yhdistäminen PH05:n UAS1(PH05)-elementtiin ja egliini C-proteiinia koodittavaan alueeseen I) GAPDH-elementit (ks. kuva 3)
Jotta GAPDH-promoottorielementti saataisiin ulotetuksi asemassa -27 olevasta Taq-kohdasta välittömästi GAPDH-geenin vieressä olevaan ATG-kodoniin, syntetisoidaan kaksi komplementaarista oligonukleotidia, joilla on seuraavat rakenteet: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' 3’ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'
Nämä oligonukleotidit antavat aidon GAPDH-promoot-torisekvenssin asemasta -26 asemaan -5 synnyttäen samalla terminaalisen EcoRI-kohdan. 2 yg kutakin plasmidia pGAPDH-E
ja -F pilkotaan 6 yksiköllä Taql:tä 50 yl:ssa ja reaktio-seokset käsitellään fenolilla, saostetaan etanolilla ja sakka uudelleensuspendoidaan 10 yl:aan vettä. Synteettiset oligonukleotidit emäspariutetaan sekoittamalla 2 yl kumpaakin yksittäistä säiettä 100 yl:ssa liuosta, joka sisältää 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ ja 50 mM NaCl, kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:ssa ja liuos jäähdytetään hitaasti huoneenlämpötilaan (noin 3 tunnin kuluessa) . 1 yg kutakin Taqlrllä katkaistua plasmidia sekoi tetaan noin 20-kertaiseen ylimäärään emäspariutettuja oligonukleotideja ja inkuboidaan 20 yl:n tilavuudessa noin 18 tuntia käyttämällä 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia.
Koko seos pilkotaan 3 yksiköllä Bglllrta (New England Biolabs). DNA-jaksot erotetaan 1,5 %:sessa pehmeäaga-•iroosigeelissä. Bglll-EcoRI-jakeet, joiden koot ovat vastaavasti 200 emäsparia ja 265 emäsparia, leikataan irti geelistä, uutetaan ja saostetaan etanolilla.
Plasmidi pGAPDH-E katkaistaan BglII:lla ja EcoRIrllä ja suuri (noin 3,5 ke) jakso eristetään. Tätä jaksoa käytetään vektorina 265 emäsparin ja 200 emäsparin Bglll-EcoRI-jaksojen kloonauksessa käyttämällä edelläkuvattuja yhteenliittämis-, transformointi- ja plasmidineristys-olosuhteista. Näin saaduille plasmideille annetaan ni
miksi pGAPDH-EL ja pGAPDH-FL. Plasmideihin pGAPDH-EL
38 ja pGAPDH-FL kloonattujen Bglll-EcoRI-jaksojen DNA-sek-venssit on esitetty kuvassa 4. Jaksojen tarkat koot ovat 266 emäsparia ja 201 emäsparia vastaavasti.
II) UAS1(PH05)-säätelyelementti 3 yg plasmidia p31/Y (ks. eurooppalainen patenttihakemus no. 100 561) katkaistaan 6 yksiköllä Clalrtä (New England Biolabs). Sisäänvetäytyneet 3'-päät täytetään suorittamalla reaktio E. colin DNA polymeraasi I:n Klenow-jakson kanssa (Bethesda Research Laboratories) noudattamalla Maniatisin menetelmää (supra). Bglll-kytkijät (5'-CAGATCTG-3') lisätään esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. DNA katkaistaan Sällillä ja Bglllrlla (New England Biolabs) ja ajetaan 1 %:sella pehmeäagaroosigeelillä. 548 emäspa- rin jakso leikataan irti geelistä, käsitellään fenolilla ja säestetään etanolilla edelläkuvatulla tavalla.
III) Plasmidin pJDB207R/PHO5-EGL rakentaminen (ks. kuva 5) Tämä plasmidi on sellaisen DNA-jakson lähde, joka koostuu egliini C:tä koodattavasta alueesta ja PH05:n transkription lopettajasta.
A) pJDB207-vektorijakson eristäminen 6 yg plasmidia pJDB207R/IF (ot — 3) (eurooppalainen patenttihakemus no. 100 561) katkaistaan täysin restriktio-endonukleaasilla BamHI. Näin syntyneet jaksot, joiden koot ovat 6,85 ke ja 1,15 ke, saostetaan etanolilla ja uu-delleensuspendoidaan 400 yIraan 50 mM Tris.HCl pH 8,0. Lisätään 4,5 yksikköä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (Boehringer, Mannheim). Saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Sitten fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 1 tunti 65°C:ssa. Liuoksen pitoisuudeksi säädetään 150 mM NaCl. DNA-liuos sijoitetaan 100 Ulin kerrokseen DE 52 (Whatman) anioninvaihdinta, joka on tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM Tris-HCl pH 7,5, joka sisältää 150 mM NaCl ja 1 mM EDTA. Kun on pesty samalla puskurilla, DNA eluoidaan 400 Pirilä liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 kein BamHI-jakso erotetaan pienestä 39 91280 jaksosta 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
B) 534 emäsparin PH05-promoottorijakson eristäminen 10 yg plasmidia p31/R (eurooppalainen patenttihakemus no. 100 561) katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la EcoRI ja BamHI. Saadut 3 jaksoa erotetaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 534 emäsparin BamHI-EcoRI- jakso, joka sisältää PH05-promoottorin mRNA:n aloituskohdat mukaanlukien, eristetään.
C) 221 emäsparin DNA-jakson eristäminen, joka sisältää egliiniä koodattavan sekvenssin 8 yg plasmidia pML147 (eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 146 785) katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la BamHI ja EcoRI. Syntyneet kaksi DNA-jaksoa erotetaan toisistaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
221 emäsparin fragmentti eristetään.
D) DNA-jaksojen yhteenliittäminen
Edelläkuvatut kolme DNA-jaksoa (esimerkit 3dIIIA-C), joissa on tarvittavat tarttuvat päät, liitetään yhteen yhdessä reaktiossa: 0,1 pmol (0,45 yg) 6,85 ke:n BamHI- vektorijaksoa, 0,2 pmol (70 ng) 534 emäsparin BamHI-EcoRI PH05-promoottorijaksoa ja 0,2 pmol (29 ng) 221 emäsparin EcoRI-BamHI-jaksoa, joka on saatu plasmidista pML147, liitetään yhteen. Kaikki kolme DNA-jaksoa ovat pienissä matalalla sulavan agaroosin palasissa. Nämä kolme agaroosi-geelipalaa yhdistetään, nesteytetään 65°C:ssa ja laimennetaan puoleen. Yhteenliittäminen suoritetaan 270 yl:n kokonaistilavuudessa, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^/ 10 mM DTT ja 1 mM ATP, käyttämällä 16 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Boehringer, Mannheim) 16 tuntia 15°C:ssa.
10 yl:n erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
40 24 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisil-liiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan Holmes et ai:n menetelmällä (Anal. Biochem. 114, 193 (1981)) ja analysoidaan Hindlll/EcoRI-kaksoiskatkaisulla. Jos havaitaan 600 emäsparin EcoRI-Hindlll-jakso, on tämä merkki siitä, että kyseisessä kloonissa on PH05-promootttori-egliini C-DNA-jakso liittyneenä ilmentämisvektoriin oikeassa suunnassa. Odotetusti noin 50 %:ssa klooneista on liitännäinen oikeassa suunnassa. Yksi näistä klooneista eristetään ja sille annetaan nimeksi pJDB207R/PHO5-EGL.
6 yg plasmidia pJDB207R/PHO5-EGL katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja Sali. Suuri 6,1 kein (vektoriosa) eristetään pehmeäagaroosigeelilelektro-foreesilla, fenoliuutolla ja etanolisaostuksella. Vektori-DNA uudelleensuspendoidaan 20 yliaan vettä. Egliinijakso tuotetaan katkaisemalla pJDB207R/PHO5-EGL Hindlllilla ja EcoRIillä. Saatu 600 emäsparin jakso eristetään pehmeä-agaroosigeelielektroforeesilla, uutetaan fenolilla ja saos-tetaan etanolilla. Egliinijakso uudelleensuspendoidaan 20 yliaan vettä.
IV) Jaksojen yhteenliittäminen UAS1(PH05)-elementtejä käyttämällä (ks. kuva 6)
Yhteenliittäminen suoritetaan käyttämällä seuraa-via neljää komponentti^ 0,5 yg 6,2 kein Hindlll-Sall-vektorijaksoa, 100 ng 600 emäsparin EcoRI-Hindlll-egliini C-jaksoa, 200 ng 266 emäsparin Bglll-EcoRI-jaksoa, joka on saatu plasmidista pGAPDH-EL, ja 100 ng 548 emäsparin Sall-Bglll-jaksoa, joka sisältää UAS1(PH05):n. Yhteenliittäminen suoritetaan edelläkuvatulla tavalla. E. coli HB101 transformoidaan ampisilliinille vastustuskykyiseksi, plas-midi eristetään ja positiivisille klooneille suoritetaan restriktioanalyysi edelläkuvatulla tavalla käyttämällä restriktioendonukleaaseja Hindlll, EcoRI, Bglll ja Sali. Valitaan yksi positiivinen klooni ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PAPEL-EGL(UAS1).
Sama rakentaminen suoritetaan käyttämällä 201 emäs- 41 91280 parin Bglll-EcoRI-jaksoa, joka on saatu plasmidista pGAPDH-FL. Näin saadulle plasmidille annetaan niineksi pJDB207/ PAPFL-EGL(UAS1).
V) UAS1(PH05)-elementin ja UAS2(PH05)-elementin sisältävien yhdistelmien rakentaminen 3 yg edellämainittuja plasmideja (ks. IV) katkaistaan Bglllilla. Uutetaan fenolilla ja DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan veteen. Vetäytyneet 3'-päät täytetään Klenow DNA-polymeraasilla kohdassa II) kuvatulla tavalla. Plasmideja kuumennetaan 10 minuuttia 70°C:ssa. Katkaistaan Sällillä (Biolabs) ja suuret jaksot (noin 7,2 ke) eristetään pehmeäagaroosigee-lielektroforeesilla, suoritetaan fenoliuutto ja DNA saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen.
Samalla tavoin plasmidi p31/Y katkaistaan BstEII: 11a, käsitellään DNA-polymeraasilla (Klenow-jakso) ja katkaistaan Sällillä. 651 emäsparin jakso eristetään edelläkuvatulla tavalla. Kun 200 ng kutakin edellämainittua vektori-DNA:ta liitetään kulloinkin yhteen 651 emäsparin jaksoon, saadaan seuraavat plasmiditi pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1 + UAS2) (sisältää pGAPDH-ELi stä saadun 266 emäsparin Bglll-EcoRI-jakson) pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1 + UAS2) (sisältää pGAPDH-FListä saadun 201 emäsparin Bglll-EcoRI-jakson)
Esimerkki 4 a) Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformointi
Esimerkeissä 3dIV ja 3dV saadut neljä plasmidia tuodaan Saccharomyces cerevisiae GRF18 (a, his3-11, his3-15, £ leu2-3, leu2~112, can )-kantaan erillisesti käyttämällä Hinnen et alin menetelmää <Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimikasvualustalevyillä, joista puuttuu leusiini. Yksittäiset transformoituneet hiivapesäkkeet valitaan ja niistä käytetään nimityksiä Saccharomyces cerevisiae GRF18/PJDB207/PAPEL-EGL(UAS1), /PAPFL-EGL(UAS1), /PAPEL-EGL (UAS 1 + UAS2) ja /PAPFL-EGL(UAS1 + UAS2).
42 b) Transformanttien fermentointi
Kyseisiä neljää S. cerevisiae GRF18-transformantti-laatua kasvatetaan kutakin erikseen 10 ml:ssa hiivan mi-nimikasvualustaa (Difco Yeast Nitrogen Base, ilman aminohappoja, mutta lisättynä 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histi-diiniä) 50 ml:n Erlenmeyer-kolveissa ravistelemalla 30°C: ssa 24 tuntia tiheyteen 3x10^ solua/ml. Solut pestään 0,9 %:sella natriumkloridiliuoksella ja sen jälkeen niillä ympätään 50 ml korkea-P^-alustaa (kuten edellä) ja matala-P^-minimialustaa, joka on valmistettu Difcon Yeast Nitrogen Base-alustan mukaan (ilman aminohappoja) sisältäen 0,03 g/1 KI^PO^, 1 g/1 KCl, 10 g/1 L-asparagiinia (NH^^SO^n tilalla, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Alusta ympätään niin, että lähtö-OD6Q0 on 0,03. Soluja kasvatetaan 500 ml:n kolvissa 30°C:ssa 24 tuntia (OD^_rt = 6 0 0 nm 1,8 matala-P^-alustalla, OD^qq nm = 3,0 korkea-P^-alustalla).
c) Egliini C-tiitterien määrittäminen
Kun edellämainittu solutiheys (OD) on saavutettu, solut otetaan talteen, sentrifugoidaan ja rikotaan lasihel- millä. Seosten egliiniaktiivisuus analysoidaan mittaamalla ihmisen leukosyyttielastaasin inhiboituminen menetelmällä U. Seemueller et ai. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 358, 1105 (1977)). Näin saadaan seuraavat aktiivisuudet: S. cerevisiae- egliini-C-aktiivisuus (mg/l/vil uute_ jelmän OD-yksikkö) indusoitu (ma- indusoimaton tala P^) (korkea Pj.) pJDB207/PAPEL-EGL (UASl) 14 °'7 pJDB207/PAPFL-EGL (UASl) 17 °;7 pJDB207/PAPEL-EGL (UASl + UAS2) 14 1 pJDB207/PAPFL-EGL (UASl + UAS2) 11 0/7 43 91280
Esimerkki 5: Desulfatohirudiinin ilmentäminen PH05-GAPDH- yhdistelmäpromoottorin ohjauksessa I. Desulfatohirudiini-HVl-geenin 5'-pään nukleotidisekvens-sin säätäminen
Desulfatohirudiini (ks. eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 168 342) alkaa GTT-kodonilla, joka edustaa NH2~pään valiinia lopullisessa tuotteessa. Jotta alakloonaus ja E. colissa ilmentäminen olisi helpompaa, on koodittavaa sekvenssiä jatkettu 5'-päästä kahdeksalla nukleotidilla, jotka sisältävät EcoRI-restriktiokohdan ja ATG-aloituskodonin. Jotta hirudiinia koodittava sekvenssi saataisiin liitetyksi tarkkaan vaiheistukseen PH05-signaalipeptidiä koodittavan sekvenssin kanssa, pitää nämä lisänukleotidit poistaa. Tämä saavuteaan muuntamalla EcoRI-katkaisukohta tasapäiseksi kohdaksi ja lisäämällä synteettinen oligonukleotidi, joka sisältää Hgal:n tunnistuskohdan sellaisessa asemassa, että seuraava Hgal-katkaisu tapahtuu heti GTT-kodonin yläpuolelta.
Hgal-restriktiokohdan tuominen desulfatohirudiinigeenin eteen (ks. kuva 7) 8 yg plasmidia pML310 (ks. EP 168 342) katkaistaan täysin restriktioendonukleaasillä EcoRI. DNA (pML310/
EcoRI) uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. Yli roikkuvat 5'-päät poistetaan -nukleaasil-la. 4 yg pML310/EcoRI DNA:ta katkaistaan 100 ylrssa reak-tioseosta, joka sisältää 250 mM NaCl, 1 mM ZnSC>4 ja 30 mM natriumasetaattia pH 4,6, käyttämällä 20 yksikköä/ml -nukleaasia (Sigma) 45 minuuttia 37°C:ssa.
DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. DNA (pML310/EcoRI/S^) uudelleensuspendoidaan 100 ylraan 50 mM Tris.HCl pH 8,0 ja inkuboidaan 2 yksikön kanssa vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (CIAP, Boeh-ringer) 1 tunti 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan inku-boimalla 1,5 tuntia 65°C:ssa.
Inkubointiseoksen NaCl-pitoisuudeksi säädetään 150 mM. Def osforyloitu DNA (pML310/EcoRI/S., /CIAP) puhdistetaan adsorboimalla DE52-ioninvaihtopylvääseen 44 (Whatman) vähän suolaa sisältävässä puskurissa (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) ja sen jälkeen eluoidaan paljon suolaa sisältävässä puskurissa (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,8 mg/ml.
Oligonukleotidi, jonka kaava on 5'-AGCGTCGACGCT-3' syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmällä (Itakura et ai., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)). Oligonukleotidisek-venssi on itsekomplementaarinen ja sisältää Hgal-rest-riktioendonukleaasin tunnistuskohdan -GACGC-. Kun nämä kaksi yksittäistä säiettä emäspariutetaan, saadaan 12 emäsparia sisältävä kaksisäikeinen DNA-kytkijä.
1,2 pg synteettistä yksisäikeistä oligodeoksinukleo- tidia fosforyloidaan 10 piissä liuosta, joka sisältää 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl„, 5 mM DTT, 30 PCi /γ-32Ρ/ -1 *· ATP:tä (3000 Ci.mmol , Amersham) ja 6 yksikköä T^-poly-nukleotidikinaasia (Boehringer), 30 minuuttia 37°C:ssa, ja sen jälkeen inkuboidaan 15 minuuttia 37°C:ssa niin, että läsnä on 0,5 mM ATPitä. Tämän jälkeen seosta inkuboidaan vielä 10 minuuttia 75°C:ssa entsyymin inaktivoimiseksi ja sen jälkeen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan emäs-pariutumista varten.
0,6 pg (170 pmol) 32Pillä leimattua kytkijä-DNA: ta sekoitetaan 2,4 pgiaan (1,75 pmol päitä) pML310/EcoRI/ S^/CIAP:tä ja liitetään yhteen 20 piissä liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikköä T^ DNA-ligaasia (Biolabs), 20 tuntia 15°Cissa. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°Cissa ja ylimääräiset kytkijämolekyylit poistetaan saostamalla DNA siten, että läsnä on 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. Kun seosta on pidetty 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, DNA pelletoidaan ja uudelleensuspendoidaan 45 pliaan liittämisseosta (koostumus selostettu edellä) ja liitetään yhteen 6 tuntia 15°Cissa niin, että syntyy rengasmainen DNA.
45 91280 1 ulin ja 3 ulin erät yhteenliittämisseosta lisätään 100 uliaan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointi-kelpoisia E. coli HB101-soluja (valmistettu menetelmällä D. Hanan, J. Biol. Chem. 166, 557 (1983)). Solut jätetään jäälle 30 minuutiksi ja sen jälkeen inkuboidaan 3 minuuttia 42°C:ssa, jäähdytetään jäällä 2 minuuttia ja sen jälkeen inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 400 Ulissa SOC-alustaa.
Kukin solunäyte konsentroidaan 100 uliksi ja sen jälkeen kasvatetaan LB-agarlevyillä, jotka sisältävät 50 ug/ml ampisilliiniä.
12 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 ug/ml ampisil-liiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä D.S.
Holmes et ai. (Anal. Biochem. 114, 193 (1981)). Synteettisen oligonukleotidikytkijän läsnäolo todetaan DNA-sek-ventoinnilla käyttämällä alukkeena yksisäikeistä DNA-jaksoa, joka hybridisoituu hirudiinia koodattavan säikeen kanssa. Yhdelle kloonille, joka sisältää kytkijä-DNAin oikeassa asemassa hirudiinigeenin edessä, annetaan nimeksi pML310L.
II. PH05-signaalisekvenssin liittäminen ja desulfatohiru-diinin rakennegeeni a) 0,2 kein desulfatohirudiinijakson eristäminen (ks. kuva 7) 12 ug plasmidia pML310L pilkotaan täysin restriktio-endonukleaaseilla BamHI ja PvuI. DNA uutetaan fenoli/klo-roformilla ja saostetaan etanolilla ja sen jälkeen erotetaan kyseiset kaksi restriktiojaksoa 1,2 %isessa agaroosigeelis-sä, joka on tehty tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Etidiumbromidilla värjätty 0,84 kein PvuI-BamHI-jakso eristetään geelipalasta. DNA elektroeluoidaan dialyysi-pussissa, joka on täytetty 3 ml:11a 0,2xTBE-puskuria. Suljettu pussi upotetaan TBE-puskuriin pH 8,3 (90 mM Tris-emästä, 90 mM boorihappoa, 2,5 mM EDTA). Kun on pidetty 30 minuuttia 100 mAissa, virran polaarisuus käännetään 45 sekunniksi, jotta DNA saadaan työnnetyksi pois dialyysi- 46 kalvosta. Geelipalaa ympäröivä, dialyysipussissa oleva puskuri otetaan talteen, pitoisuudeksi säädetään 150 mM NaCl ja lasketaan DE52 (Whatman) ioninvaihtopylvään läpi.
DNA eluoidaan paljon suolaa sisältävällä puskurilla (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), saoste-taan etanolilla ja uudelleenliuotetaan veteen pitoisuuteen 0,1 mg/ml.
0,84 ke:n Pvu-BamHI-jakso, joka on saatu plasmi-dista pML3101, katkaistaan vielä restriktioendonukleaa-silla Hgal. Tämä katkaisu saa aikaan 198 emäsparin Hgal-BamHI-jakson, joka sisältää kypsää desulfatohirudiinia koodittavan sekvenssin täydellisenä. Kun vielä suoritetaan katkaisu Alul:llä, ei tämä vaikuta 198 emäsparin Hgal-BamHI-jaksoon, mutta eliminoi toisen, samankokoisen Hgal-j akson.
0,2 ke:n Hgal-BamHI-jakso erotetaan muista jaksoista 1,5 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty TBE-pusku-riin, ja eristetään elektroeluutiolla (kuten edellä on selostettu). DNA puhdistetaan ED52-ioninvaihtokromatogra-fisesti ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoi-daan veteen pitoisuuteen 30 yg/ml (0,2 pmol/ ui) .
b) PH05-promoottorialueen eristäminen, jossa on osa PH05:n signaalisekvenssiä (ks. kuva 8)
Plasmidissa p31/PH05-TPA18 (ks. eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 143 081) on PH05-promoottori ja PH05-signaalisekvenssi lukuvaiheistuksessa fuusioituneina vieraaseen rakennegeeniin (t-PA). 584 emäsparin BamHI-Ball- jakso sisältää PH05-promoottorin ja PH05-signaalisekvenssin kokonaan, lukuunottamatta 3'-pään kahdeksaa nukleotidia.
8 yg p31/PH05-YPA18 DNArta katkaistaan restriktio-endonukleaasilla Ball (16 tuntia 37°C:ssa). DNA puhdistetaan fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisaostuksella. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,7 mg/ml.
PH05-signaalisekvenssin ja desulfatohirudiinia koodittavan alueen välille saadaan oikea liitos synteettisellä kytkijällä, jonka kaava on 47 91280 (1) 5'-CCAATGCA-3' (2) 3'-GGTTACGTCAACA-51
Kahdeksan nukleotidia kytkijän 5’-päässä (5'-CCAATGCA) edustavat osaa PH05-signaalisekvenssistä Ball-kohdasta proses-sointikohtaan. Yli menevät 5’-pään viisi nukleotidia, jotka ovat oligonukleotidissa (2), sopivat desulfatohirudii-nia koodittavan sekvenssin Hgal-katkaisukohdan 5'-päähän .
Erilliset yksisäikeiset oligonukleotidit (1) ja (2) syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmällä (Itakura et ai., supra). 1,1 yg ja 1,8 yg oligonukleotideja (1) ja (2) fosforyioidaan vastaavasti 5'-päästään, sekoitetaan ek-vimolaariset määrät ja emäspariutetaan esimerkissä 51 kuvatulla tavalla.
1,3 yg (200 pmol) fosforyloitua, kaksisäikeistä kytkijä-DNA:ta liitetään 7 yg:aan (1,8 pmol) Ball:llä katkaistua plasmidia p31/PH05-TPA18 40 yltssa puskuria, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT ja 1400 yksikköä DNA-ligaasia (Biolabs), 15°C: ssa 16 tuntia. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Kytkijäylimäärä poistetaan saostamalla DNA niin, että läsnä on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaat-tia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA uudel-leensuspendoidaan ja katkaistaan vielä restriktioendonuk-leaasilla BamHI. Sitten DNA uutetaan fenoli/kloroformilla, saostetaan etanolilla ja kyseiset kaksi restriktiojaksoa erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissä, joka sisältää tris-boraatti-EDTA-puskuria pH 8,3. 0,6 ke:n jakso eristetään geelistä. DNA elektroeluoidaan ja jatkopuhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografisesti ja etanolisaostuksella. 0,6 ke:n BamHI-Hgal-DNA-jakso uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 40 yg/ml.
c) pJDB207-hiivavektorijakson eristäminen (ks. kuva 8)
9 yg plasmidin pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) DNA:ta (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan restriktioendonukleaasilla BamHI. Täydellisen katkaisun jälkeen DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan 50 mM
48
Tris.HCl-puskuriin pH 8,0 pitoisuuteen 0,1 mg/ml ja hajotetaan 7 yksiköllä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia 1 tunti 37°C:ssa. Fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 1,5 tuntia 65°C:ssa ja DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihto-kromatografisesti (ks. esimerkki 51) ja saostetaan etanolilla. 6,8 ke:n suuri BamHI-jakso erotetaan 1 ,2 %:sessa agaroosi-geelissä, joka on tehty tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. DNA elektroeluoidaan ja puhdistetaan DE52-ioninvaihtokro-matografisesti ja saostetaan etanolilla. DNA liuotetaan veteen pitoisuuteen 0,4 mg/ml (0,1 pmol/ ui).
d) PH05-promoottorijakson ja desulfatohirudiinirakennegee-nin liittäminen pJDB207-hiivavektorijaksoon (ks. kuva 8)
Plasmidi pJDB207-hiivavektori, PH05-promoottori-jakso, joka sisältää PH05-signaalisekvenssin, ja desulfato-hirudiinirakennegeeni ovat kaikki eristettyjä DNA-jak-soja (ks. esimerkki 511 a-c), jotka liitetään yhteen ilmentämisplasmidiksi.
0,3 pmol plasmidin p31/PH05-TPA18 0,6 ke:n BamHI-Hgal-jaksoa ja 0,3 pmol plasmidin pML310L 0,2 ke:n Hgal-BamHI-jaksoa liitetään 0,1 pmol:iin plasmidin pJDB207R/PHO5-TPA (12-2) 6,8 ke:n BamHI-jaksoa TO Ul:ssa puskuria, jossa on 60 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä DNA-ligaasia, 20 tuntia 15°C:ssa.
1 yl:n erä yhteenliittämisseosta-lisätään 100 ui:aan transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja, jotka on valmistettu Hanahan menetelmällä (supra). Transformointi-menetelmä on myös mukautettu tästä julkaisusta. Soluja kasvatetaan LB-agar-levyillä, jotka sisältävät 50 ug/ml ampisilliiniä.
24 amp -pesäkettä kasvatetaan yksittäisesti LB-alustassa, jossa on 100 ug/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA analysoidaan liitännäisen koon ja suunnan suhteen katkaisemalla restriktioendonukleaasilla PstI. Yhdelle kloonille, jossa on liitännäinen oikeassa suunnassa, annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-HIR.
III) Plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR rakentaminen (ks.
49 91280 kuva 9)
Jotta UAS(PH05)-GAPDH-yhdistelmäpromoottorielemen-tit voitaisiin edullisesti liittää PH05-signaalisekvenssin sisältävään desulfatohirudiinia koodittavaan alueeseen (kuten plasmidissa pJDB207/PHO5-HIR), tuodaan EcoRI-kat-kaisukohta luetuksi tulemattomaan 5'-alueeseen mRNA:n aloituskohtien ja koodittavan alueen ATG-kodonin väliin.
15 pg plasmidia pJDB207/PHO-HIR katkaistaan rest-riktioendonukleaasilla Dral (Boehringer). Syntyneet 4 jaksoa erotetaan 0,8 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 4,2 ke:n jak so otetaan talteen geelistä, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,6 mg/ml.
Kukin kahdesta synteettisestä oligonukleotidista, joiden kaavat ovat 5'-AATTCGATTACCAATGTTT-3' 3'- GCTAATGGTTACAAA-5' (2,3 ug ja 2,9 pg vastaavasti) kinasoidaan 20 yl:ssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 20 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer).
Kun on inkuboitu 45 minuuttia 37°C:ssa, molemmat reaktioseokset yhdistetään, kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan. Emäs-pariutettua oligonukleotidikytkijää varastoidaan -20°C:ssa.
6,5 pg (2,3 pmol) 4,2 ke:n Dral-DNA-jaksoa inkuboi-daan 16 tuntia 15°C:ssa kinasoidun ja emäspariutetun oligo-nukleotidin 70-kertaisen ylimäärän kanssa 50 plrssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikköä T4 DNA-kinaasia (Biolabs). T4 DNA-ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa ja kytkijäylimäärä poistetaan saostamalla DNA siten, että läsnä on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA katkaistaan EcoRIrllä ja HindIII:lla. Syntyneet jaksot erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 643 emäsparin jakso otetaan talteen geelistä 50 elektroeluutiolla ja etanolisaostuksella. DNA uudelleen-suspendoidaan pitoisuuteen 0,1 pmol/ ui. EcoRI-Hindlll-jakso sisältää PH05-signaalisekvenssin, desulfatohirudii-nia koodittavan sekvenssin ja PH05:n transkription lopet-tuskohdan.
534 emäsparin PH05-promoottorijakso eristetään plasmidista p31/R (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561).
10 ug plasmidia p31/R katkaistaan restriktio-endonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Saadut 3 jaksoa erotetaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 534 emäs- parin BamHI-EcoRI-jakso eristetään ja se sisältää PH05-promoottorin sekä mRNA:n aloituskohdan.
Vektorijakso eristetään plasmidista pJDB207/PHO5-HIR.
6 ug tätä plasmidia katkaistaan BamHI:llä ja HindIII:lla. Suuri 6,5 ke:n BamHI-Hindlll-jakso erotetaan pienestä jaksosta 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
Edellä kuvatut kolme DNA-jaksoa, joissa on tarvittavat tarttuvat päät, liitetään yhteen seuraavassa reaktiossa: 0,2 pmol (70 ng) 534 emäsparin BamHI-EcoRI-PH05- promoottorijaksoa, 0,2 pmol (85 ng) 643 emäsparin EcoRI-Hindlll-jaksoa (hirudiinia koodittava sekvenssi) ja 0,1 pmol (0,4 ug) 6,5 ke:n BamHI-Hindlll-vektorijaksoa liitetään yhteen 10 ul:ssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^» 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-li-gaasia, 6 tuntia 15°C:ssa. 1 ul:n erä yhteenliittämis- seosta lisätään 100 ui:aan kalsiumilla käsiteltyjä, trans-formointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
12 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 ug/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai.
(Anal. Biochem. 114 (1981) 193) ja analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä ja BamHI:llä. Yksi klooni, jossa on halutut restriktiojaksot, eristetään ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5(Eco)-HIR.
51 91280 IV) UAS1(PH05)-GAPDH-yhdistelmäpromoottorien liittäminen desulfatohirudiiniproteiinia koodittavaan alueeseen 15 yg plasmidia pJDB207/PHO5(Eco)-HIR katkaistaan EcoRIrllä ja Hindlllrlla. DNA-jaksot erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-pusku-riin pH 8,3. 643 emäsparin jakso irroitetaan geelistä, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleen-suspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
6 yg plasmidia pJDB207/PHO5-HIR katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja Sali. Suuri 6,3 ke:n jakso (vektoriosa) erotetaan agaroosigeeli-elektroforeesilla, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Vektori-DNA-jakso uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,05 pmol/yl.
10 yg plasmidia pGAPDH-EL (ks. esimerkki 3dl) katkaistaan Bgll:llä ja EcoRI:llä. 266 emäsparin Bgll-EcoRI-jakso erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3, elektroeluoidaan geelistä ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,3 pmol/yl.
0,3 pmol 548 emäsparin Sall-Bglll-jaksoa, joka sisältää UAS1(PH05):n (esimerkki 3dII), 0,3 pmol plasmidin pGAPDH-EL 266 emäsparin Bglll-EcoRI-jaksoa, 0,3 pmol plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR 643 emäsparin EcoRI-Hindlll-jaksoa ja 0,12 pmol 6,3 ke:n Sall-Hindlll-vektori-jaksoa liitetään yhteen 20 ylrssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 1 0 mM MgC^, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), 6 tuntia 15°C:ssa. Yhteenliittämisseoksesta lisätään 1 yl:n ha 3 yl:n erä 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja. Plasmidi-DNA eristetään amp -pesäkkeistä ja suoritetaan restriktioanalyysi Sällillä, Bglllrlla, EcoRIrllä ja Hindlllrlla edellä kuvatulla tavalla (ks. esimerkki 3dIII). Valitaan yksi positiivinen klooni ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1). Sama rakentaminen suoritetaan plasmidista pGAPDH-FL saadulle 201 emäaparin Bglll-EcoRI-jaksolle. Yhdelle valituista plasmideista annetaan nimi pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1).
52 V) UAS1(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH-yhdistelmäpromoottorien liittäminen desulfatohirudiinia koodittavaan alueeseen 3 yg kutakin plasmidia pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) ja pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) katkaistaan BglII:lla. Fenoli-uuton ja etanolisaostuksen jälkeen DNA:n sisäänvetäyty-neet 3'-päät täytetään reaktiolla E. colin DNA-polyme-raasin kanssa (Klenow-jakso; Bethesda Research Laboratories) menetelmällä Maniatis et ai. (supra). Entsyymi in-aktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 70°C:ssa. DNA:t katkaistaan vielä Sall:llä ja suuret 7,2 ke:n jaksot eristetään pehmeäliivateagaroosigeelielektroforeesilla, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Kukin jakso uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,05 pmol/yl. Jaksot sisältävät hirudiinia koodittavan alueen, suurimman osan vektorisekvensseistä ja jomman kumman plasmideis-ta pGAPDH-EL tai pGAPDH-FL eristetyistä kahdesta eri GAPDH-promoottorista.
Plasmidi p31/Y (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561) katkaistaan BstEIIrlla, inkuboidaan E. coli DNA-polymeraasin (Klenow-jakso) kanssa kuten edellä on selostettu ja katkaistaan Salirllä. 649 emäsparin jakso erotetaan pehmeäagaroosigeelissä ja otetaan talteen fenoliuutolla ja etanolisaostuksella.
0,3 pmol plasmidin p31/Y 649 emäsparin jaksoa, joka sisältää UAS1-UAS2(PH05)-promoottorielementin ja 0,15 pmol jompaa kumpaa 7,2 ke:n jaksoa liitetään yhteen ja suoritetaan E. coli HBl01:n transformointi edelläkuvatul- p la tavalla. Plasmidi-DNA:t valmistetaan amp -pesäkkeistä ja analysoidaan restriktiokatkaisuilla. Valitaan yksi klooni kummastakin ja niille annetaan nimet pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) ja pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2).
Esimerkki 6: 31 emäsparin sekvenssi riittää toimimaan fosfaattisäätöelementtinä PH05-promoottorin yläpään alueen 31 emäsparin sekvenssi (asemasta -381 aseaman -351), joka on kahden viereisen deleetion 410 ja Δ\ 3 määrittelemä (ks. esimerkki 1f), voisi mahdollisesti sisältää säätösignaalin. Tämä voidaan tutkia syntetisoimalla kemiallisesti kaksi 53 91280 komplementaarista oligonukleotidia, joilla on seuraava rakenne: 5’-AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG-3' 3'- GCTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGTCTTAA-5' Tämä sekvenssi sisältää 31 emäsparin sekvenssin, jonka vieressä on EcoRI-restriktiokohdat. EcoRI-kohdat mahdollistavat sekvenssin helpon polymeroinnin multimee-reiksi.
a) 31 emäsparin sekvenssin kloonaaminen vektoriin LT98 50 pmol kutakin synteettistä oligonukleotidia kina-soidaan erikseen 20 ml:ssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 20 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kun on inkuboitu 45 minuuttia 37°C:ssa, molemmat reaktioseokset yhdistetään, kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan. Emäspariutettuja oligonukleotideja varastoidaan -20°C:ssa. 7,5 pmol kinasoituja ja emäs- pariutettuja oligonukleotideja liitetään yhteen 30 minuuttia edelläkuvatulla tavalla (esimerkki 5III) 15 yl:n kokonaistilavuudessa. Sitten lisätään 5 yl EcoRIrllä katkaistua LT98 vektori-DNA:ta (Dixon et ai., Gene 25, 189 (1983)) (0,075 pmol) ja inkubointia jatketaan kaikki aan 6 tuntia. Suoritetaan E. colin HB101:n transformointi ja plasmidit eristetään ja analysoidaan suorittamalla katkaisu BamHI:llä. Tämä analyysi antaa tietoja liitännäisen kokonaispituudesta ja mahdollistaa kloonattujen EcoRI-jaksojen lukumäärän arvioinnin. Valitaan yksittäiset plasmidit, joissa on 1, 2, 3, 4 tai 5 EcoRI-jaksoa ja niiden DNA-sekvenssin määritys (Sangerin menetelmä) osoittaa, että 31 emäsparin elementit ovat liittyneet yhteen pää-häntäsuunnassa.
b) Kloonaus plasmidiin pJDB207 31 emäsparin oligomeerit testataan promoottorinsäätö-funktionsa suhteen liittämällä ne GAPDH-promoottorin F-elementin ylävirtaan. Plasmidi pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1) 54 lyhennetään niin, että saadaan plasmidi, josta on poistettu UAS1-elementti. Plasmidi katkaistaan Sällillä ja Bgllillä, geeli puhdistetaan ja suuri vektorijakso eristetään. Samasta plasmidista tehty erillinen reaktioseos katkaistaan BamHI:llä. Sisäänvetäytyneet 3'-päät täytetään Klenow-DNA-polymeraasilla käyttämällä kaikkia neljää dNTP-laatua. Tasapäiset kohdat jatketaan fosforyloiduilla Bglll-kytkijöillä (CAGATCTG, Biolabs) ja, kun on suoritettu katkaisu Sällillä ja Bglllilla, eristetään geeli-puhdistuksella DNA-jakso, jonka pituus on noin 400 emäs-paria. Suuri vektorijakso liitetään yhteen noin 400 emäs-parin pituisen Sall-Bgll-jakson kanssa käyttämällä T4 DNA-ligaasia. Transformoidaan E. coli HB101 ja eristetään plasmidi, jolloin saadaan plasmidi, joka ei sisällä PH05 UAS-aluetta. Tästä plasmidista käytetään nimeä pJDB207/GAPFL-EGL. Tämä plasmidi katkaistaan Bglllilla ja se toimii vektorina 31 emäsparin oligomeerien kloonauksessa. LT98, joka sisältää 1, 2, 3, 4 tai 5 oligonukleotidiliitännäistä, katkaistaan BamHIillä. Erikokoiset jaksot eristetään geeli-puhdistuksella ja liitetään itsenäisesti plasmidiin pJDB207/GAPFL-EGL, joka on sitä ennen katkaistu Bglllilla. Yhteenliittämisseos pilkotaan Bglllilla, jotta saadaan poistetuksi uudelleen yhteenliittynyt vektori-DNA, joka ei sisällä DNA-liitännäistä, ja sen jälkeen transformoidaan E. coli HB101. Saadut plasmidit analysoidaan suorittamalla restriktioanalyysi Sällillä ja Dralillä (GAPDH-promoottorin sisällä oleva kohta). Transformoidaan hiivakanta GRF18 ja sen jälkeen määritetään egliini C-tiitterit esimerkissä 4c kuvatulla tavalla. Seuraavat ominaisaktiivisuudet saadaan 46 tunnin fermentoinnin jälkeeni 55 91280 klooni 31 emäsparin egliini-C-tiitteri pJDB207/ pituisen lii- (mg/l/OD-yksikkö) tännäisen lu- suunta* matala P. korkea kumäärä PAPFLI( + )-EGL 1 —- 9.2 5.2 PAPFLI(-)-EGL 1 — 10.2 2.1 PAPFLII( + )-EGL 2 — 10.2 3.5 PAPFLI11 (-) -EGL 3 — 11.2 1.4 PAPFLIV(+)-EGL 4 — 10.7 1.5 PAPFLV(-)-EGL 5 — 12.6 1.4 * -^ sama suunta kuin PH05-promoottorilla < eri suunta kuin PH05-promoottorilla
Esimerkki 7: Insuliininkaltaisen kasvutekijän 1 (IGF-1) il mentäminen PAPFL-promoottorin avulla
Plasmidi pAB113-IGF-1, jota on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 123 228, katkaistaan Pstl:llä. Kukin kahdesta synteettisestä oligonukleo-tidista (50 pmol), joiden kaavat ovat
AATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA
GTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG
kinasoidaan ja emäspariutetaan edelläkuvatulla tavalla. Emäspariutettu kaksisäikeinen adapteri liitetään Pstl:llä katkaistuun plasmidiin, katkaistaan EcoRI:llä ja BamHI:llä ja noin 800 emäsparin EcoRI-BamHI-jakso eristetään geeli-puhdistuksella. Plasmidi pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1) katkaistaan Sällillä ja EcoRIillä ja noin 700 emäsparin jakso eristetään geelipuhdistuksella. Kolmoisliittämisessä liitetään 0,5 y:r plasmidia pC1/1 (eurooppalainen patenttihake-musjulkaisu no. 123 228; katkaistu BamHI:llä ja Sällillä, vektori geelipuhdistettu) 100 ngiaan kutakin kahdesta pienemmästä geeni- ja promoottoriosasta vastaavasti. Transformoidaan E. coli ja plasmidit analysoidaan EcoRIillä,
BamHIillä ja Sällillä katkaisemalla. Kun suoritetaan hii-vakannan AB103 (talletettu ATCC-kokoelmiin numerolla 20 673; pYIGF-1-10/1in poisto kasvattamalla hiivasoluja 56 yön yli kompleksialustassa ja tutkimalla yksittäisistä pesäkkeistä IGF-1-plasmidin olemassaolo suorittamalla pesäkehybridisaatio Hinnen et al:n kuvaamalla tavalla (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_5, 1 929 ( 1 978)) transfor-mointi, saadaan transformantteja, jotka tuottavat IGF-1:tä vain indusoiduissa olosuhteissa (matala P^) (1 mg/ml), kun määritys suoritetaan tavanomaisella kompetitiivisella radioimmunologisella määrityksellä käyttämällä radioaktii-visesti leimattua IGF-1:tä (Anderson et ai. teoksessa Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., ed., Walter de Gruyter, Berlin). Klooneille annetaan nimeksi pC1/1/PAPFL-IGF-1(UAS1).
Esimerkki 8: Kudosplasminogeenjn aktivaattorin (t-PA) ilmentäminen PH05-GAPDH-yhdistelmäpromoottorin ohjauksessa (ks. kuva 10) 12 yg plasmidia pJDB207/PHO5-TPA18 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Sali ja Hindlll. Syntyneet kaksi DNA-jaksoa eristetään 0,8 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Pieni 2,6 ke:n Sall-Hindlll-jakso eristetään elektroeluutio11a, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. DNA katkaistaan vielä Ballillä. 1,8 ke:n jakso, joka sisältää osan PH05-signaalisekvenssistä, t-PA:ta koodittavan sekvenssin ja PH05-terminaattorin, eristetään ja puhdistetaan edelläkuvatulla tavalla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
Yhdistelmäpromoottorijakso eristetään plasmidista pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2) (ks. esimerkki 5V). 12 yg plasmidi-DNA:ta katkaistaan Sällillä ja Hindlllilla. Saatu 1,5 kein jakso katkaistaan vielä Ballillä. 920 kein jakso, joka sisältää yhdistelmäpromoottorin ja osan PH05-signaalisekvenssistä eristetään 1,5 lisessa agaroosigeelissä. DNA elektroeluoidaan, uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
0,2 pmol 920 emäsparin Sall-Ball-jaksoa, 0,2 pmol 1,8 kein Ball-Hindlll-jaksoa ja 0,1 pmol Sällillä ja 57 91280
HindIII:lla katkaistua vektoria pJDB207 liitetään yhteen 16 tuntia 15°C:ssa 10 μ1:η kokonaistilavuudessa. 1 μ1:η erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 ylraan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
p 12 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisil-liiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai. (Anal. Biochem. 114, 193 (1981)) ja analysoidaan katkaisemalla PstI:llä ja BamHI/EcoRI:llä. Yksi klooni, jossa on halutut restriktiojaksot, eristetään ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2).
Vastaava rakentaminen tehdään UAS1(PH05)-elementille: Plasmidin pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) 820 emäsparin Sall-
Ball-jakso (esimerkki 5IV) eristetään ja liitetään 1,8 ke:n BalI-HindIII-jaksoon ja Sali,HindIII-katkaistuun vektoriin. Näin saadusta plasmidista käytetään nimeä pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1).
Vastaavat rakentamiset tehdään vastaavilla jaksoilla, jotka on saatu plasmidista pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) tai pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) (esimerkki 5). Saaduista plasmideista käytetään nimiä pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1) ja pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1 + UAS2).
Esimerkki 9: Polypeptidien ilmentäminen PH05-GAPDH-yhdis- telmäpromoottorien ohjauksessa a) Saccharomyces cerevisiae GRF18:n transformointi:
Saccharomyces cerevisiae GRF18 (a,his 3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can ) transformoidaan plasmideilla
pJDB20 7/PAPEL-HIR(UAS1) pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) pJDB20 7/PAPFLI(+)-EGL pJDB207/PAPFLI(-)-EGL pJDB20 7/PAPFLII(+)-EGL pJDB2 0 7/PAPFLI11(-)-EGL pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL
58 pJDB207/PAPFLV(-)-EGL pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) pJDB20 7/PAPFL-TPA(UAS1) pJDB20 7/PAPEL-TPA(UAS1 + UAS2) pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2) pCl/1/PAPFL-IGF-1(UAS1) käyttämällä Hinnen et al:n kuvaamaa transformointimene-telmää (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_5, 1 929 ( 1 978)). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimialusta-levyillä, joista puuttuu leusiini. Yksittäiset transformoituneet hiivapesäkkeet eristetään ja niille annetaan nimet
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLII(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLV(-)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pCl/l/PAPFL-IGF-1(UAS1) b) Transformanttien fermentointi
Kunkin S. cerevisiae GRF18-transformantin soluja kasvatetaan 10 ml:ssa hiivan minimikasvualustaa (Difco Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja, johon on lisätty 59 91280 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiiniä) 50 ml:n Erlenmeyer-kolveissa ravistelemalla 30°C:ssa 24 tuntia niin, että solutiheydeksi tulee 3 x 10 solua/ml. Solut pestään 0,9 %:sessa natriumkloridissa ja niillä ympätään 50 ml matala-P^alustaa, joka on valmistettu noudattamalla Difcon Yeast Nitrogen Base-alustan koostumusta (ilman aminohappoja), mutta käyttämällä 0,03 g/1 KF^PO^, 1 g/1 KCl ja 10 g/1 L-asparagiinia (NH^^SO^in tilalla, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Viljelmät ympätään solutiheyteen korkeintaan 4 x 10° solua/ml ja sekoitetaan 30°C:ssa korkeintaan 42 tuntia nopeudella 200 1/min.
c) Ilmentyneiden geenituotteiden tiitterit
Hiiva erittää desulfatohirudiiniyhdisteitä kasvualustaan. Kun on fermentoitu 22 tuntia otetaan kasvualustasta 10 ml:n näyte ja se rikastetaan proteiinien suhteen poistamalla suolat ja konsentroimalla Bond Elut C-18-pylväässä (1 ml, Analytichem International). Pylväs pestään kahdesti 1 / 5 ml:11a vesi-asetonitriiliseos-ta (9:1), jossa on 0,1 % trifluorietikkahappoa. Desul-fatohirudiiniyhdisteet eluoidaan pylväästä vesi-aseto-nitriili-0,1 % trifluorietikkahapposeoksella (6:4 tila-vuusosina). 2 ml eluaattia väkevöidään Speed Vac-vä- kevöintilaitteessa (Savant) niin, että lopulliseksi tilavuudeksi tulee 400 pl. Desulfatohirudiini identifioidaan HPLC-analyysillä, vertaamalla autenttiseen desulfato-hirudiiniin ja trombiini - inhibitiomäärityksellä (ks. M.U. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic Analysis, Voi. II, s. 341 - 316, Verlag Chemie, Weinheim (Länsi-Saksa) 1983).
Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1.
60
Taulukko 1: Eri plasmideilla transformoituneiden S.
cerevisiae GRF18-kantojen kasvualustaansa erittämä desulfatohirudiini desulfatohirudiini p asmi l (mg/1 kasvualustaa/OD^.^} pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) 2.0 pJDB20 7/PAPFL-HIR(UAS1) 2.2 pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) 3.0 pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) 2.8
Kudosplasminogeenin aktivaattca iit-PA) kertyy hiiva-soluihin. Valmistetaan solu-uutteet ja t-PA-aktiivisuus määritetään seuraavasti: Matala-P^kasvualustasta (35 ml) (B. Meyhack et ai. EMBO-J. 1, 675 (1982)), jonka soluti- 7 teys on 1 - 2 x 10 /ml, otetaan solut talteen sentrifugoi-malla Sorvali SS34-sentrifugissa 10 minuuttia nopeudella 3000 1/min. Solut pestään puskurissa, joka sisältää kasvualustan suolakomponentit (so. ei aminohappoja, glukoosia, vitamiineja eikä hivenaineita). Solut sentrifugoidaan huoneenlämpötilassa 5 minuutissa nopeudella 3000 1/min. Laskeutuneet solut uudelleensuspendoidaan kaikkiaan 4 ml:aan kylmää 66 mM natriumfosfaattipuskuria pH 1,4, joka sisältää 0,1 tilavuus-% Triton X-100. Solususpensio siirretään 30 ml:n Corex-putkeen, lisätään 8 g lasihelmiä (halkaisija 0,4 mm) ja suspensiota ravistellaan Vortex Mixerissä (Scientific Instruments Inc., USA) täydellä nopeudella 4 minuuttia ja sen jälkeen jäähdytetään jäähauteella.Tällä tavalla yli 90 % soluista särkyy. Solujätteet ja lasi-helmet sentrifugoidaan pohjaan 10 minuutissa 4°C:ssa nopeudella 8000 1/min Sorvali HB-4-roottorissa. Emäliuos siirretään Eppendorf-putkiin, jäähdytetään nestetypessä ja varastoidaan -60°C:ssa.
t-PA-aktiivisuus määritetään Ranbyn menetelmällä (Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982)) pienin muunnoksin. Käytetty substraatti on D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S- 61 91280 2251). Absorptio 405 nm:ssä korjataan epäspesifisellä katkaisulla ja suhteutetaan urokinaasistandardiin. Tulokset on esitetty taulukossa 2.
Taulukko 2: Eri plasmideilla transformoituneiden S.
cerevisiae GRF18-kantojen t-PA-aktiivisuus plasmidi t-PA-aktiivisuus (k.y./l hiivasoluvil-jelmää/OD600) pJDB20 7/PAPFL-TPA(UAS1) 300 pJDB20 7/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2) 200
Esimerkki 10: IGF-1:n eristäminen transformoituneesta hiivakannasta ja tunnistaminen a) IGF-1:n eristäminen kasvualustasta
Hiivakantaa pCl/1/PAPFL-IGF-1(UAS1) kasvatetaan 60 tuntia. 3 litraa kasvualustaa otetaan talteen ja sentri-fugoidaan esimerkissä 9 kuvatulla tavalla. Kun 2 ml emä-liuosta (väkevöity 1:10) käänteisfaasi-HPLC:llä, saadaan tiitteriksi 1 mg/1 IGF-1:tä. Emäliuokseen lisätään 20 ml SP-Sephadex C-25 (Pharmacia) pH:ssa 3,0 ja sekoitetaan 60 minuuttia 4°C:ssa. Adsorboitunut IGF-1 eluoidaan pestystä hartsista natriumasetaattipuskurigradientissa (50 mM, pH 3,0 - pH 9,0) ja jatkopuhdistetaan kahdessa ioninvaihtovaiheessa: Ensimmäinen vaihe suoritetaan CM-52- pylväässä (Whatman, 1,5 cm x 8,5 cm, gradientti, puskuri A 20 mM NH^OAc pH 4,0; puskuri B 100 mM NH^OAc pH 6,8).
Toinen vaihe suoritetaan DE-53-anioninvaihtopylväässä (Whatman) (olosuhteet: 1,5 cm x 10, 5 cm pylväs, virtaus 1 ml/min, gradientti, puskuri A 20 mM NH^OAc pH 9,0; puskuri B 200 mM NH^OAc pH 6,5). Lopullinen puhdistus suoritetaan puolipreparatiivisessa RP-HPLC-pylväässä.
Aktiivinen jae eluoituu retentioajassa 21,3 minuuttia antaen 1,1 mg IGF-1:tä, jonka puhtausaste on 95 %.
62
Koeolosuhteet: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-pylväs, 10 x 250 mm, näyte-erät (200 UL väkevöity suhteessa 1:10) per erotus; AUFS 0,5 220 nm:ssä; virtausnopeus 3 ml/min. Eluentti: A: 0,1 % trifluorietikkahappo, B:asetonitriili/vesi 8:2 + 0,7 % trifluorietikkahappoa, 3 minuuttia 35 % B:tä, sitten nostetaan 30 minuutin kuluessa 45 %:ksi B:tä. Saadut jakeet laimennetaan 1:1 vedellä ja lyofilisoidaan.
b) IGF-1:n karakterisointi kannan pC1/1/PAPFL-IGF-1(UAS1) fermentoinnista
Kasvuliuoksesta eristetyn IGF-1:n RP-HPLC-analyysi (ks. esimerkki 10a) osoittaa, että tuote on identtinen seerumista saadun autenttisen lGF-1:n kanssa.
Isoelektrinen piste: pl 8,6 (isoelektrinen foku sointi, proteiinin TCA-saostus)
Aminohappokoostumuksen määrittäminen
Noin 2,5 ug puhdasta IGF-1:tä hydrolysoidaan 24 tuntia 6 N suolahapossa 110°C:ssa ja sen jälkeen suoritetaan analyysi Chang et ai:n menetelmällä (DABS-Cl-method; Methods in Enzymology 9J_, 41 (1983)). Hydrolysaatin koostumus on seuraava: aminohappo hydrolysaatti aminohappo hydrolysaatti
Asp 5.7 (5) Ile 0.7 (1)
Thr 3.2 (3) Leu 5.9 (6)
Ser 5.2 (5) Tyr 2.8 (3)
Glu 6.5 (6) Phe 3.9 (4)
Pro 5.3 (5) His
Gly 7.2 (7) Lys 3.0 (3)
Ala 6.1 (6) Arg 6.0 (6)
Vai 2.7 (3) Met 0.9 (1) kystiini 2.2 (3) y'hfce’ensa (70)
Osittainen sekvenssianalyysi 70 yg:lle (10 nmol) puhdasta IGF-1:tä suoritetaan tavanomainen sekvenssianalyysi Edmanin menetelmällä. N-pään 63 91280 PTH-aminohapot määritetään RP-HPLC-menetelmällä.
Jaokset:
Sykli 1 5 , ί °
Amino Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys*-Gly-Ala-Glu-Leu-
Sykli 11 15 ^
Amino Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys*-Gly-Asp-
By&li 21 25 30
Amino Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lye-Pro-Thr-Gly-
Sykli 31 35 40
Amino Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-
SyKli 41 45 50
Amino Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-n.d.-n.d.-Phe-Arg- n.d.: ei määritetty *: cys (6) ja cys(18) määritetään erikseen karboksimety- loimalla jodiasetamidilla.
Osittainen aminohapposekvenssi, joka ulottuu aminohaposta 1 aminohappoon 50, on näin ollen identtinen autenttisen IGF-1:n julkaistun primäärisen sekvenssin kanssa.
C-pään analyysi
Puhdas IGF-1 pilkotaan karboksipeptidaasi Y:llä ja vapautuneet aminohapot määritetään aminohappoanalysaatto-rilla (ks. J.Y. Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Biochem. J.
199, 547).
Tulokset: aminohappo 70 5 minuutin hajotus -Ala 120 minuutin hajotus Ser-Ala Näennäinen molekyylipaino: IGF-1 (30 yg) analysoidaan SDS-ureageelissä (SUDS-geeli; ks. Kyte et ai., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)). Havaitaan yksi vyöhyke, joka vastaa 6000 - 7000 daltonin näennäistä molekyylipainoa.
Molekyylipainon määritys FAB-MS-menetelmällä
IGF-1:lle suoritetaan FAB-MS-määritys (fast atom bombardment positive ion mass spectrometry. Laite: ZAB-HF
64 massaspektrometri, VG-Analytical Ltd., Manchester; matriisi: tioglyseroli; Xenon-pommitus; ionienergia 3 KeV; ulkoinen kalibrointi: Cs30J29 (molekyylipaino 7667,4).
empiirinen kaava: C331H51 8*J94°1 0S7 molekyylipaino(laskettu) 7648,71 molekyylipaino (löydetty) 7648,07
Claims (12)
1. Ylävirrassa oleva aktivointisekvenssi, tunnettu siitä, että se käsittää osan hiivan PH05-geenistä, ja että kyseessä on ylävirrassa oleva aktivointisekvenssi UAS1 (PH05) tai UAS2 (PH05), jotka sijaitsevat hiivan PH05-gee-nin BamHI-BstEII-jaksossa nukleotidien -174 ja -541 välillä, jolloin ylä-virrassa oleva aktivointisekvenssi UAS1 (PH05) sijaitsee hiivan PH05-geenin BamHI-Clal-jaksossa nukleotidien -274 ja -541 välillä, ja tarkemmin DNA-jak-sossa jonka sekvenssi on GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT ja ylävirrassa oleva aktivointisekvenssi UAS2 (PH05) si-jatsee hiivan PH05-geenin Clal-BstEII-jaksossa nukleotidien -174 ja -273 välillä.
2. Hiivan yhdistelmäpromoottori, tunnettu siitä, että se sisältää 5'-yläpään promoottorielementin, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin ylävirrassa oleva(t) aktivointikohta(dat), ja hiivan GAPDH-gee-nin 3'-alapään promoottorielementin, joka on hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti välillä -5 - -199 tai hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti välillä -5 - -263.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäpromoottori, tunnettu siitä, että 5'-yläpään promoottoriele-mentti on hiivan PH05-geenin 5'-alueen 368 emäsparin BamHI-BstEII- jakso, hiivan PH05-geenin 5'-alueen 268 emäsparin BamHI-Clal-jakso, 31 emäsparin jakso, jonka kaava on GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT tai hiivan PH05-geenin 5'-alueen 100 emäsparin Clal-BstEII-jakso.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäpromoottori, tunnettu siitä, että se sisältää UAS1 (PH05):n ja/ tai UAS2 (PH05):n.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmäpromoottori, tunnettu siitä, että 3'-alapään promoottorielement-ti on johdettu glykolyyttistä entsyymiä koodittavan hiiva-geenin promoottorista.
6. Hiivan yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joissa kussakin on hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodittava DNA-segmentti sellaisen yhdistelmäpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään promoottorielementistä, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja hiivan GAPDH-geenin 3'-alapään promoottorielementistä, joka on hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti välillä -5 - -199 tai hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti välillä -5 - -263.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää joko patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen 5'-yläpään promoottorielementin ja patenttivaatimuksen 5 mukaisen 3'-alapään promoottorielementin.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-segmentin, joka koodittaa korkeampaa eukaryoottista alkuperää olevaa polypeptidiä.
9. Transformoitunut hiivaisäntä, tunnettu siitä, että transformoituminen on tapahtunut yhdistelmävektoril- 91280 la, joka sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joissa kussakin on hiivaan verrattuna heterologista poly-peptidiä koodittava DNA-segmentti sellaisen yhdistelmäpro-moottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään promoottorielementistä, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja hiivan GAPDH-geenin 3'-alapään promoottorielementistä, joka sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna.
10. Menetelmä hiivalle heterologisen polypeptidin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että hiivakantaa, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, joka sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joissa kussakin on hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiä koodittava DNA-seg-mentti sellaisen yhdistelmäpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yläpään promoottorielementistä, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja hiivan GAPDH-geenin 3'-alapään promoottorielementistä, joka sisältää transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, viljellään ja ilmentynyt polypeptidi otetaan talteen.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että DNA-sekvenssi koodittaa korkeampaa euka-ryoottialkuperää olevaa polypeptidiä.
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että DNA-sekvenssin koodittama polypeptidi on ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattori (t-PA), desulfa-tohirudiini, egliini C tai insuliinin kaltainen kasvutekijä.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8521496 | 1985-08-29 | ||
| GB858521496A GB8521496D0 (en) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | Repressible yeast promoters |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863430A0 FI863430A0 (fi) | 1986-08-25 |
| FI863430A FI863430A (fi) | 1987-03-01 |
| FI91280B true FI91280B (fi) | 1994-02-28 |
| FI91280C FI91280C (fi) | 1994-06-10 |
Family
ID=10584428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863430A FI91280C (fi) | 1985-08-29 | 1986-08-25 | Repressoituvat hiivapromoottorit |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436136A (fi) |
| EP (1) | EP0213593B1 (fi) |
| JP (1) | JPH07110233B2 (fi) |
| AT (1) | ATE62510T1 (fi) |
| AU (1) | AU599329B2 (fi) |
| CA (1) | CA1318616C (fi) |
| DD (2) | DD267739A5 (fi) |
| DE (1) | DE3678647D1 (fi) |
| DK (1) | DK175093B1 (fi) |
| ES (3) | ES2001618A6 (fi) |
| FI (1) | FI91280C (fi) |
| GB (1) | GB8521496D0 (fi) |
| GR (1) | GR862209B (fi) |
| HU (1) | HU211207B (fi) |
| IE (1) | IE58844B1 (fi) |
| IL (1) | IL79837A (fi) |
| NO (1) | NO175871C (fi) |
| NZ (1) | NZ217388A (fi) |
| PH (1) | PH24715A (fi) |
| PT (1) | PT83273B (fi) |
| SU (1) | SU1630616A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA866535B (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU621277B2 (en) * | 1985-11-13 | 1992-03-12 | Xoma Corporation | Shortened phosphoglycerate kinase promoter |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
| GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
| GB8907110D0 (en) * | 1988-05-04 | 1989-05-10 | Ciba Geigy Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| NO177065C (no) * | 1988-09-26 | 1995-07-12 | Labofina Sa | Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| EP0548267A4 (en) * | 1990-09-04 | 1994-11-23 | Salk Inst Biotech Ind | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| CA2105064A1 (en) * | 1991-04-01 | 1992-10-02 | Martin Anthony Gleeson | Genes which influence pichia proteolytic activity, and uses therefor |
| US5674728A (en) * | 1993-11-03 | 1997-10-07 | Novartis Corporation | Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease |
| JPH08173170A (ja) * | 1994-05-25 | 1996-07-09 | Kirin Brewery Co Ltd | キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現 |
| JP2001501097A (ja) * | 1996-09-24 | 2001-01-30 | ケイダス ファーマスーティカル コーポレイション | レセプターエフェクターを同定する方法及び組成物 |
| US6265186B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-07-24 | Dsm N.V. | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces |
| US6890730B1 (en) | 1999-12-10 | 2005-05-10 | The Salk Institute | Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems |
| US8008459B2 (en) * | 2001-01-25 | 2011-08-30 | Evolva Sa | Concatemers of differentially expressed multiple genes |
| EP2571991A1 (en) | 2010-05-20 | 2013-03-27 | Evolva SA | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
| JP2023522947A (ja) | 2020-04-20 | 2023-06-01 | ヴェスタロン・コーポレーション | タンパク質分解に対して安定な害虫制御用ｕ１－アガトキシン－ｔａ１ｂバリアントポリペプチド |
| KR20230005929A (ko) | 2020-05-01 | 2023-01-10 | 베스타론 코포레이션 | 살충 조합물 |
| WO2022212777A2 (en) | 2021-04-01 | 2022-10-06 | Vestaron Corporation | Av3 mutant polypeptides for pest control |
| WO2023122805A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Vestaron Corporation | Sorbitol driven selection pressure method |
| WO2023225555A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Vestaron Corporation | Pesticidal actx peptide variants |
| WO2023245100A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Vestaron Corporation | Antimicrobial ncr13 variant peptides |
| WO2024026406A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Vestaron Corporation | Next Generation ACTX Peptides |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
| US4876197A (en) * | 1983-02-22 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| EP0127839B1 (en) * | 1983-05-27 | 1992-07-15 | THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| GB8314961D0 (en) * | 1983-05-31 | 1983-07-06 | Kingsman A J | Dna sequence |
| PT79518B (pt) * | 1983-11-21 | 1986-12-12 | Ciba Geigy Ag | 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr |
| EP0164566A3 (de) * | 1984-05-11 | 1986-10-29 | LGA Gastechnik GmbH | Sicherheitseinrichtung für Flüssiggastanks |
| ATE102250T1 (de) * | 1984-05-11 | 1994-03-15 | Chiron Corp | Erhoehte hefetranskription unter verwendung einer hybridkonstruktion der promotorregion. |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
-
1985
- 1985-08-29 GB GB858521496A patent/GB8521496D0/en active Pending
-
1986
- 1986-08-25 IL IL79837A patent/IL79837A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-25 FI FI863430A patent/FI91280C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 AT AT86111820T patent/ATE62510T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 EP EP86111820A patent/EP0213593B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-26 DE DE8686111820T patent/DE3678647D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-27 DD DD31325586A patent/DD267739A5/de unknown
- 1986-08-27 GR GR862209A patent/GR862209B/el unknown
- 1986-08-27 DD DD29389486A patent/DD254212A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-27 CA CA000516879A patent/CA1318616C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-28 ZA ZA866535A patent/ZA866535B/xx unknown
- 1986-08-28 SU SU864028035A patent/SU1630616A3/ru active
- 1986-08-28 PT PT83273A patent/PT83273B/pt unknown
- 1986-08-28 PH PH34192A patent/PH24715A/en unknown
- 1986-08-28 NO NO863458A patent/NO175871C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 DK DK198604096A patent/DK175093B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 IE IE230786A patent/IE58844B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 NZ NZ217388A patent/NZ217388A/xx unknown
- 1986-08-28 HU HU863720A patent/HU211207B/hu unknown
- 1986-08-28 AU AU62032/86A patent/AU599329B2/en not_active Expired
- 1986-08-29 ES ES8601490A patent/ES2001618A6/es not_active Expired
- 1986-08-29 JP JP61201924A patent/JPH07110233B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-16 ES ES8800794A patent/ES2006382A6/es not_active Expired
- 1988-03-16 ES ES8800795A patent/ES2006383A6/es not_active Expired
-
1991
- 1991-12-20 US US07/811,898 patent/US5436136A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91280B (fi) | Repressoituvat hiivapromoottorit | |
| EP0100561B1 (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| EP0123544A2 (en) | Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor | |
| CA1341300C (en) | Recombinant dna means and method for producing bovine rennin and precursors | |
| US5102789A (en) | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells | |
| FI94773B (fi) | Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi | |
| IE59774B1 (en) | Expression and secretion of heterologous proteins by yarrowia lipolytica transformants | |
| EP0206783A2 (en) | Expression and secretion of polypeptides from saccharomyces cerevisiae | |
| FI105482B (fi) | Menetelmä heterologisen proteiinin valmistamiseksi eukaryoottisessa isäntäsolussa | |
| WO1992013951A1 (en) | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells | |
| FI98219C (fi) | Menetelmä urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi | |
| JPH0213377A (ja) | デスルファトヒルジン化合物の製造方法 | |
| US7198919B1 (en) | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems | |
| US6410272B1 (en) | Production of thrombin inhibitors | |
| KR940011534B1 (ko) | 억제성 효모 프로모터의 제조방법 | |
| PH26266A (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| IE881129L (en) | Process for the production of proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: NOVARTIS AG |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: NOVARTIS AG |
|
| MA | Patent expired |