HU211207B - Method for producing recombinant dna molecules containing yeart ph05 gene upstream activating sequences - Google Patents

Method for producing recombinant dna molecules containing yeart ph05 gene upstream activating sequences Download PDF

Info

Publication number
HU211207B
HU211207B HU863720A HU372086A HU211207B HU 211207 B HU211207 B HU 211207B HU 863720 A HU863720 A HU 863720A HU 372086 A HU372086 A HU 372086A HU 211207 B HU211207 B HU 211207B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
yeast
dna
gene
promoter
fragment
Prior art date
Application number
HU863720A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
HUT42525A (en
Inventor
Bernd Meyhack
Albert Hinnen
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HUT42525A publication Critical patent/HUT42525A/hu
Publication of HU211207B publication Critical patent/HU211207B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Gyroscopes (AREA)
  • Led Devices (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Graft Or Block Polymers (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)

Description

A leírás terjedelme: 36 oldal (ezen belül 10 lap ábra)
HU 211 207 B
HU 211 207 Β peptidek előállítására élesztő gazdaszervezetekben, rekombináns-DNS technikai alkalmazásával. Közelebbről, a találmány új, „upstream” aktivációs szekvenciák, az ezeket tartalmazó hibrid élesztő promoterek, élesztősejtek transzformálására használható új hibrid vektorok, az ezekkel transzformált élesztősejtek és az élesztő számára idegen polipeptidek előállítására vonatkozik.
Az utóbbi években nagy fejlődés volt a géntechnológiában, és jelenleg működik néhány olyan rendszer, amely genetikailag átalakított mikroorganizmusokat, különösképpen az Escherichia coli enterobaktérium törzseit és a sütőélesztő (Saccharomyces cerevisiae) törzseit használja fel. Igény van azonban további és jobb rendszerekre, különösen eukarióta rendszerekre, úgymint élesztőkre, amelyek alkalmasak proteinek gazdaságos és ipari méretű előállítására. Jelenleg különböző élesztővektorok állnak rendelkezésre génklónozásra. Ahhoz, hogy az idegen gének hatékonyan expresszálódhassanak az élesztőben, a strukturális kódoló szekvenciát olyan erős élesztő promoterekkel kell kombinálni, amelyek előnyösen szabályozó tulajdonságokkal rendelkeznek, ami lehetővé teszi a génexpresszálódás külső irányítását. Mivel úgy hiszik, hogy az expresszálódás (termékképződés) hatékonysága az alkalmazott promoter erősségének függvénye és azzal arányos, a géntechnológia területén dolgozók különleges figyelmet szentelnek erőteljes promoter rendszerek kiépítésének.
A fehérjéket kódoló klónozott élesztőgének in vitro mutagenezise és visszaépítésük az élesztősejtbe funkcionális analízis céljából lehetővé tette számos különböző alapvető cisz-hatású promoter alkotórész azonosítását [összefoglaló irodalmi hivatkozás: Guarente, L.: Cell, 36, 799, (1984)]. Ezek közé az alkotórészek közé tartoznak - a felsorolást azokkal az alkotórészekkel kezdve, amelyek közvetlenül közrefogják a fehérjekódoló régiót a gén 5’-végénél - a következők:
- egy 5’-átírt vezetőrégió, amely A-T-ben meglehetősen gazdag, néha tartalmaz egy CAACAACAA, vagy ezzel rokon szekvenciát is,
- átírási kezdőpontok, amely a ATG transzlációs indítókodontól körülbelül 40-60 bázispámyira néha távolabb - helyezkednek el, és általában több különböző erősségű mRNS indítóhelyet jelölnek,
- egy (néha több) TATA-box, amely az átírási kezdőponttól körülbelül 40-80 bázispámyira helyezkedik el, és feltehetően alapvető RNS-polimeráz-Π felismerőhelyként működik,
- „upstream” aktivációs hely(ek) (rövidítése a továbbiakban UAS), amelyek a szabályozó fehérjék feltételezett célhelyei, és körülbelül 100-300 bázispárral a TATA-box „előtt” helyezkednek el.
Az „upstream” aktivációs hely más módon működik, mint a prokariótákban talált szabályozóhelyek, és inkább az emlős szervezetek gyorsítóhelyeire emlékeztet. Részletesebb adatok találhatók a GÁL 1, GÁL 7, GÁL 10 élesztőcsoportról, amelyeknél a pozitiven működő szabályozófehérje (GÁL 4 géntermék) közvetlen kölcsönhatásba lép a GÁL 1 - GÁL 10 UAS-ével [Giniger és munkatársai: Cell, 40, 767, (1985)].
Az élesztő CYC 1 gén TATA-box-a előtt elhelyezkedő, a GÁL 1 - GÁL 10 UAS-ét kódoló promoter szegmensek összeépítésével egy olyan hibrid promotert hoztak létre, amelynek átírása a GÁL 1 - GÁL 10 UAS-ének szabályozása alatt áll, azaz GÁL 4gén-függő [Guarente, L. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7410, (1984)]. Hasonló szerkezetű promotert hoztak létre a CYC 1 és LEU 2 promoter alkotórészeinek összeépítésével [Guarente, L. és munkatársai: Cell, 36, 503, (1984)]. Mindkét rendszer élesztőből származó promoter alkotórészeket és protein kódoló szekvenciákat tartalmaz, és nincs bizonyíték arra, hogy olyan génekkel is működnek, amelyek az élesztő számára idegenek.
Egy nemrégiben közrebocsátott szabadalmi bejelentés (PCT 84/4757) az élesztő PGK-gén egy UAS alkotórészét írja le. Kimutatják egy alapvető promoter alkotórész jelentését, amely az ATG-től számítva a -324. és -455. bázisok között helyezkedik el. Feltételezik, hogy ennek az alkotórésznek a bevitele más promoterek elé felfokozná bármilyen más élesztő promoter erejét. Nem adnak azonban semmilyen, ezt a feltételezést alátámasztó példát; az érvelés teljesen negatív adatokon alapul (egy promoter elroncsolása). Könnyen lehetséges, hogy ez az alkotórész a PGK-promoter egy alapvető része, de kétséges, hogy egy ilyen alkotórész működne-e egy hibrid promoter részeként. A PGK UAS-e továbbá nem kapcsolódik egy szabályozó szignálhoz, azaz nem teszi lehetővé a „downstream” kódoló szekvencia expressziójának (átíródásának) irányítását egy specifikus fiziológiai szignál segítségével.
A glikolitikus gének promotereinek egy része glükózjelenlétében indukálódik. Ezek működhetnek hibásan is, ha a sejteket glükózmentes közegben tenyésztik. Ez azt jelenti, hogy az élesztő gazdasejteket egy olyan közegben kellene transzformálni és regenerálni, amelyben a glükózt más szénfonással (acetát, glicerin, laktát, stb.) helyettesítették, hogy meg lehessen védeni a sejteket egy olyan, esetleg káros vagy pusztító génterméktől, amely a sejten belül gyűlik fel. Mivel a protoplaszt [Hinnen, A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) vagy a sóval kezelt teljes sejtek [Ito és munkatársai: J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] regenerálását általában gazdag tápközegben végzik, hogy lehetővé tegyék a sejtek gyors regenerálódását és telepek képződését, mindegyik jelenleg használt transzformációs előirat glükózt alkalmaz szénforrásként. Várható, hogy a regenerálódás és az újraképződés glükózmentes közegben igen rosszul vagy egyáltalán nem megy végbe.
Az irodalomban általánosan ismeretes, hogy az expresszálódás időzítését szabályozni kell annak biztosítására, hogy a fehérje csak akkor képződjön nagy mennyiségben, amikor a sejt legjobban bírja az idegen fehérje nagy mennyiségének jelenlétét, azaz a növekedési szakaszon kívül. Az is kívánatos, hogy az expresszió szabályozása ne függjön a mikrobiális növekedéshez legfontosabb szénforrás, azaz a glükóz jelenlé2
HU 211 207 Β létől vagy hiányától. Az irodalomból alig ismeretesek olyan szabályozható és erős promoter rendszerek, amelyek megfelelnek ezeknek a kívánalmaknak és idegen gének élesztőkkel végzett könnyű és technikailag alkalmazható expresszálására alkalmazhatók. Szükség van ezért ilyen promoter rendszerek kifejlesztésére.
Meglepő módon azt találtuk, hogy ha kombináljuk a glikolitikus anyagcserében részt vevő enzimek expresszálódását szabályozó promoterek - amelyeket jelenleg általánosan a legerősebb promoterekhez tartozóknak tartanak - TATA-box régióját egy olyan szabályozható promoter „upstream” promoter alkotórészeivel, amelynek represszálódása vagy derepresszálódása nem függ egy alapvető alkotórész - például egy eszszenciális szén- vagy nitrogénforrás - jelenlététől vagy hiányától a tápközegben, akkor olyan erős hibrid promotereket kapunk, amelyek kielégítik a technikailag alkalmazható promoter rendszerekkel szemben támasztott követelményeket
A találmány szerinti eljárással olyan hibrid promotereket, különösen olyan glikolitikus gének promotereit állítottuk elő, amelyeket a savas foszfatáz PH05-gén UAS-ének szabályozása alá helyeztünk, és amelyeket idegen gének élesztőkben való hatékony expresszálására alkalmaztunk.
A találmány tárgyát képezik tehát az élesztő PH05gén újonnan elkülönített UAS-szignáljai, a PH05 UASszignálokat tartalmazó hibrid promoterek, az ilyen hibrid promotereket tartalmazó hibrid vektorok és az ilyen hibrid vektorokkal transzformált élesztő gazdaszervezetek előállítása, valamint a transzformált élesztő gazdaszervezetek felhasználása élesztő idegen polipeptidek előállítási eljárása.
Részletesebben a találmány szerinti eljárás során
- UAS1 (PH05) és/vagy UAS2 (PH05) szekvenciákat tartalmazó DNS-fragmentumokat és szubfragmentumokat úgy állítottunk elő, hogy egy PH05-gént tartalmazó DNS-t, vagy a PH05-gént vagy annak 5’-terminális részét megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasítunk és adott esetben a fragmentumokat egy exonukleázzal rövidítjük, majd az így kapott fragmentumok közül kiválogatjuk azokat, amelyeknek UAS-funkciója megmaradt, és a fragmentumokat vagy szubfragmentumokat elkülönítjük, vagy a fenti DNSfragmentumokat vagy szubfragmentumokat kémiai DNS-szintézissel állítjuk elő;
- élesztő hibrid promótereket úgy állítunk elő, hogy egy, az élesztő PH05 gén upstream aktivációs szekvenciáját/szekvenciáit tartalmazó, 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promóter egységet, egy PH05-tő! különböző élesztő gén 3’ irányban elhelyezkedő, működőképes TATA-boxot tartalmazó, és a transzlációs start-kódon közelében végződő downstream promóter egységéhez kapcsolunk;
- élesztő hibrid-vektorokat úgy állítunk elő, hogy egy hibrid-promótert - amely az élesztő PH05 gén UAS szekvenciáját/szekvenciáit magában foglaló, 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promóter egységből, valamint egy PH05-től különböző élesztő gén 3’ irányban elhelyezkedő, transzkripciós iniciációs helyekkel rendelkező működőképes TATA-boxot is tartalmazó downstream promóter egységből áll - upstream irányban egy élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS fragmentum elé kapcsolunk és az ilymódon előállított NDS molekulák közül egyet, vagy többet élesztő vektor DNS-be inszertálunk;
- transzformált élesztősejtek előállításánál a fenti hibrid-vektorokat alkalmazzuk; és
- élesztő-idegen polipeptidet úgy állítunk elő, hogy egy élesztő törzset - melyet olyan hibridvektorral transzformálunk, amely egy vagy több DNS inszertet tartalmaz, mely inszertek mindegyike tartalmaz egy hibrid-promóter transzkripciós szabályozása alatt álló, élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS részletet, mely promóter az élesztő PH05 gén UAS szekvenciáját/szekvenciáit magában foglaló, 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promóter egységből, valamint egy PH05-től különböző élesztő gén 3’ irányban elhelyezkedő, transzkripciós iniciációs helyekkel rendelkező, működőképes TATA-boxot is tartalmazó downstream promóter egységéből áll - tenyésztjük és az expresszált polipeptidet izoláljuk.
Először ismertetjük az élesztő savas foszfatáz (PH05) gén „upstream” aktivációs szekvenciáját és ennek felhasználását hibrid promoter előállítására.
Ezelőtt nem volt ismert az irodalomban, hogy egy vagy több „upstream” aktivációs hely (vagy „upstream” aktivációs szekvencia, rövidítése UAS) létezik-e, amely az élesztő PH05-gén átírását befolyásolja. A PH05-gén egy represszibilis élesztő savas foszfatázt kódol. Ez szervetlen foszfátok nagy koncentrációjánál represszálódik és szervetlen foszfátok hiányában derepresszálódik [Meyhack, B. és munkatársai: EMBOJ„ 1,675, (1982)].
A PH05-gén 5’-régiójának elemzése olyan cisz-hatású alkotórészek azonosításához vezetett, amelyek befolyásolják a PH05-gén átírását. A PH05-gén 5’-régiójának egy 623 bázispárnyi BamHI-Sall fragmentumát, amelyet az Μ13mp9 fág-vektorba (rekombináns vektor M13mp9/PH05 Bam-Sal, vö. 143 081. számú európai szabadalmi bejelentés) klónoztak, az egyik kísérletben a Bam-helytől, a másik kísérletben az Sal-helytől kiindulva emésztettek Bal31 exonukleázzal. így egy sorozat megrövidített PH05 promoter fragmentumot állítottak elő, amelyeket szekvenciaanalízisnek vetettek alá és a megrövidített végeken szintetikus EcoRI-kapcsolókkal láttak el. Az Sal-helyen megrövidített fragmentumok („balkar promoter fragmentumok”) és a Bamhelyen megrövidített fragmentumok (.jobbkar promoter fragmentumok”) kombinálásával a PH05 promoter régió deléciós mutánsainak egy sorozatát állították elő, amelyeknek a PH05 strukturgén expresszálódását befolyásoló képességét megvizsgálták. Megállapították, hogy a -225. és -263. nukleotidok közötti rész deléció3
HU 211 207 Β ja a savas foszfatáz aktivitás ötszörös csökkenéséhez, és a -361. és -392., vagy a -346. és -369. nukleotidok közötti rész deléciója a savas foszfatáz aktivitás tízszeres csökkenéséhez vezet (a nukleotidok számozása az 1. ábrán látható). Ezek a hatások az „upstream” aktivációs helyeknek (UAS) tulajdoníthatók, amelyek alapvető fontosságúak a PH05 expresszióhoz. Azt az UASt, amely a -365. nukleotid szomszédságában helyezkedik el egy 268 bázispámyi BamHI-Clal fragmentumban (-274. —541. nukleotidok a PH05-gén 5’-régiójában, UASl(PH05)-nek nevezik, míg a -245. nukleotid szomszédságában elhelyezkedő UAS régiót, amely a 100 bázispámyi Clal-BstEII fragmentumban (-174. -273. nukleotid) helyezkedik el a PH05-gén 5’-régiójában, UAS2(PH05)-nek nevezik.
Találmányunk különösképpen a PH05-gén BamHIBstEII fragmentumában a -174. és -541. nukleotidok között elhelyezkedő UAS1 (PH05) és UAS2 (PH05) „upstream” aktivációs szekvenciák előállítására vonatkozik.
Találmányunk kiterjed továbbá a PH5-gén BamHIClal fragmentumában a -274. és -541. nukleotidok között található UAS1 (PH05) „upstream” aktivációs szekvencia és a PH05-gén Clal-BstEII fragmentumában a -174. és -273. nukleotidok között található UAS2 (PH05) „upstream” aktivációs szekvencia előállítására.
Különösen előnyös az UAS1 (PH05) „upstream” aktivációs szekvencia. Az UAS1 szabályozó szignál pontos helye a BamHI-Clal fragmentumon belül meghatározható; egy 31 bázispámyi DNS-fragmentumban (a PH05 promoter régió -381. és -351. pozíciója közötti rész) helyezkedik el. A fragmentum előnyösen bármelyik végén megfelelő restrikciós helyekkel ellátott tompa végű kapcsolókat tartalmaz, vagy egy restrikciós endonukleázra, úgymint EcoRI-re specifikus tapadós végeket tartalmaz. A 31 bázispámyi fragmentum szekvenciája a következő:
GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
Az UAS1 (PH05) és/vagy UAS2 (PH05) szekvenciákat tartalmazó DNS-fragmentumok előállítási eljárásának lényege az, hogy a PH05-gént tartalmazó DNS PH05-génjét vagy annak 5’-vég részét megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasítjuk és a kívánt fragmentumokat elkülönítjük. így például a PH05 promotert és a PH05 kódoló régió egy részét tartalmazó PH05 (ismertetése fent) 623 bázispámyi BamHI-Sall fragmentumát a BamHl és BstEII restrikciós endonukleázokkal emésztjük és elkülönítjük a 368 bázispámyi szubfragmentumot, amely tartalmazza mindkét „upstream” aktivációs helyet. Analóg módon a fenti BamHI-Sall fragmentumot BamHI-gyel és Clal-gyel vagy Clal-gyel és BstEII-gyel hasítva egy 268 bázispámyi, UASl(PH05)-Öt tartalmazó BamHI-Clal szubfragmentumot, illetve egy 100 bázispámyi, UAS2(PH05)-öt tartalmazó Clal-BstEII szubfragmentumot kapunk. A fragmentumok és szubfragmentumok elkülönítését és tisztítását szokásos módszerekkel, például agaróz gél elektroforézissel vagy poliakril-amid gél elektroforézissel végezzük.
A találmány szerinti eljárás során „upstream” aktivációs helyeket tartalmazó DNS-fragmentumokat önmagában ismert módon, például egy exonukleázzal, úgymint Bal 31-gyei végzett részleges emésztéssel rövidíthetjük úgy, hogy a megrövidített fragmentum AUS funkciója megmaradjon. A rövidítést végezhetjük a fragmentumok 5’- vagy 3’-végén, vagy mindkét végén. Azokat a szubfragmentumokat, amelyek megtartották az UAS funkciót, a fent leírt módon választjuk ki, azaz az eredeti, az UAS(eke)-t tartalmazó szekvenciákat a megrövidített fragmentumokkal helyettesítjük és megvizsgáljuk a kapott PH05 promoter deléciós mutánst, hogy mennyire tudja befolyásolni a PH05 strukturgén expresszálódását. A találmány szerinti fragmentumok és azok megrövidített származékai, amelyek a PH05gén egyik vagy mindkét „upstream” aktivációs helyét tartalmazzák, elláthatók mesterséges kapcsoló szekvenciákkal, amelyek bármelyik véghez kapcsolhatók, hogy a hibrid promoterek előállítását, illetve egy vektorhoz való kapcsolódást megkönnyítsék.
A DNS-fragmentumokat, valamint a PH05 „upstream” aktivációs helyét/helyeit tartalmazó rövidített származékaikat kémiai DNS-szintézissel is előállíthatjuk, az irodalomból jól ismert szokásos módszerek alkalmazásával. Megfelelő technikát dolgozott ki S.A. Narang [Tetrahedron, 39, 3 (1983)]. Különösen a 146 785. számú európai szabadalmi bejelentésben leírt módszerek használhatók.
A találmány egy további részét képezi a PH05 „upstream” aktivációs helyeinek felhasználása hibrid promoterek előállítására, és a PH05-gén „upstream” aktivációs helyeit tartalmazó hibrid promoterek előállítására.
A találmány különösképpen élesztő hibrid promoterek előállításárára irányul, amelyek magukba foglalnak egy 5’ „upstream” promoter alkotórészt, amely tartalmazza az élesztő PH05-gén „upstream” aktivációs helyét/helyeit és egy olyan élesztőgén 3’ „downstream” promoter alkotórészét, amely a PH05-géntől eltérő, és amely olyan átírási kezdőpontokat tartalmaz, amelyek magukban foglalnak egy funkcionális TATA-box-ot és a transzlációs start kodonhoz közel fejeződnek be; különleges esetben a hibrid promoter csak ezekből a részekből áll. Az 5’ „upstream” promoter alkotórész speciálisan a fent meghatározott DNS-fragmentumok valamelyike, elsősorban a 368 bázispámyi BamHI-BstEII fragmentum, amely UASl(PH05)-öt és UAS2(PH05)öt tartalmaz, vagy a 268 bázispámyi BamHI-Clal fragmentum, amely UASl(PH05)-öt tartalmaz, vagy ennek rövidített származékai, amelyek megtartották az UAS funkciót, így a 31 bázispámyi fragmentum, amely tartalmazza az UASl(PH05)-öt, vagy ennek még kisebb szubfragmentumai.
A 3’ „downstream” promoter előnyösen egy erősen expresszálódotl élesztőgénből származik, különösképpen egy olyan élesztőgén promoteréből, amely egy glikolitikus enzimet kódol, úgymint az enoláz, a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), a 3foszfoglicerát-kináz (PGK), a hexokináz, a piruvát-dekarboxiláz, a foszfofruktokináz, a glükóz-6-foszfát4
HU 211 207 Β izomeráz, a 3-foszfoglicerát-mutáz, a piruvát-kináz (PyK), a triózfoszfát-izomeráz, a foszfoglükóz-izomeráz vagy a glükokináz gének promotereiből. A 3’ promoter alkotórészek magukba foglalják a TATA-box-ot, amely részt vesz az RNS-polimeráz-II enzin elhelyezésében a helyes átírás elkezdéséhez és az átírás megfelelő kezdőpontjaihoz (fő mRNS kezdőpontok). ATATA-box-tól „lefelé” a 3’ promoter alkotórész a fő mRNS kezdőpont és a transzlációs indítókodon (ATG) közötti régióig terjed, előnyösen a transzlációs indítókodon közelében. A TATA-box „előtti” oldalon a 3’ promoter alkotórészek körülbelül 50-150 eredeti bázispárt tartalmaznak. Ennek az „elöl” levő DNS-szekvenciának a pontos hossza nem kritikus tényező, mivel úgy látszik, hogy van bizonyos rugalmasság az UASek és a TATA-box térbeli elhelyezkedésében.
A találmány szerinti eljárás előnyös 3’ promoter alkotórésze a GAPDH promoterből származik, amelyet az irodalomban ismertetett egyik legerősebb élesztő promoterként ismernek [a GAPDH enzim mennyisége körülbelül 5%-a lehet a S. cerevisiae szárazsúlyának, [vö. E. G. Krebs: J. Bioi. Chem., 200, 471, (1953)]. A 3’ GAPDH promoter alkotórész előnyösen a -300. és a -180. nukleotid között kezdődik és a GAPDH-gén -1. nukleotidjénél végződik. A találmány egyik előnyös kiviteli alakjánál a 3’ promoter alkotórész a GAPDHgén -199. és -1. közötti nukleotidjeit tartalmazza. Egy másik előnyös kiviteli alak esetében a 3’ promoter alkotórész a GAPDH-gén -263. és -1. közötti nukleotidjeit tartalmazza.
A találmány szerinti eljárással előállított hibrid promoterek tartalmazhatnak egyetlen UAS(PH05)-öt vagy több, azonos típusú UAS(PH05)-öt, úgymint UASl(PH05)-öt, előnyösen „fejtől farokig” orientációban. Ami a 3’ promoter alkotórészt illeti, az UAS(ek) orientációja az eredeti PH05 promoter orientációjához képest azonos vagy fordított lehet.
A találmány szerinti eljárással előállított hibrid promoterek alkotórészei, azaz a PH05 UAS-ét/UASeit tartalmazó promoter alkotórész és a TATA-box-ot tartalmazó promoter alkotórész mesterséges kapcsolókkal, tompa véghez való ligálással vagy - ha lehetséges - természetben előforduló kompatíbilis hasítóhelyekkel vannak összekapcsolva. A találmány szerinti hibrid promoterek 5’- és 3’-végei megfelelően el vannak látva olyan mesterséges kapcsolókkal, amelyek lehetővé teszik a vektor-DNS-hez való ligálást, és a 3’-végen egy heterológ protein kódoló régióhoz való kapcsolódást.
A találmány szerinti eljárással előállított hibrid promoterek megfelelnek minden, a biotechnológiában felhasználható promoterekkel szemben támasztott kívánalomnak; erősek, a táptalaj esszenciális szén- vagy nitrogénforrásaitól eltérő vegyületekkel indukálhatók, és kényelmesen kezelhetők laboratóriumi vagy ipari méretben.
A találmány kiterjed olyan hibrid promoterek előállítási eljárására is, amelyek egy az élesztő PH05-gén „upstream” aktivációs helyét/helyeit tartalmazó 5’ „upstream” promoter alkotórészből, és egy a PH05 élesztőgéntől eltérő élesztőgén 3’ „downstream” promoter alkotórészéből állnak, mely utóbbi kezdőpontokat tartalmaz, amelyek egy funkcionális TATA-box-ot foglalnak magukba és a transzlációs indítókodonhoz közel fejeződnek be; az eljárás értelmében egy 5’ „upstream” promoter alkotórészt, amely az élesztő PH05-gén „upstream” aktivációs helyét/helyeit tartalmazza, hozzáképcsoljuk egy PH05-géntől eltérő élesztőgén 3’ „downstream” promoter alkotórészéhez, amely egy funkcionális TATA-box-ot tartalmaz és a transzlációs indítókodonhoz közel fejeződik be.
A találmány egyik előnyös kiviteli alakjánál a promoter alkotórész ligálását mesterséges kapcsolókkal hajtjuk végre.
A PH05-géntől eltérő élesztőgén fenti „downstream” promoter alkotórészét úgy állítjuk elő, hogy részlegesen emésztjük egy erős élesztőpromoter 5’-végét; ilyen promoter például a fent felsoroltak valamelyike, amely a fő mRNS kezdőpont és a transzlációs indítókodon közötti régióig terjed. Az emésztést egy exonukleázzal, például Bal31-gyel végezzük és a kpott 5’ tompa végeket egy mesterséges kapcsoló DNS-hez kapcsoljuk. Olyan promoter alkotórészeket választunk, amelyek megtartják az átírási kezdőpontot/kezdőpontokat, és a TATA-box-ot, beleértve 50150 bázispárnyit az 5’ szekvenciából a TATA-box-ig. A kiválasztást például úgy hajtjuk végre, hogy a kapott promoter alkotórészeket hasítjuk egy olyan restrikciós endonukleázzal, amely felismeri a mesterséges kapcsoló szekvenciát az 5’-végen, és egy olyan restrikciós endonukleázzal, amely felismeri a mesterséges kapcsoló szekvenciát a promoter alkotórész 3’-végén, és a kapott DNS-fragmentum hosszúságát agaróz gél elektroforézissel határozzuk meg. A 3’ promoter alkotórészeket kémiai úton, az irodalomból ismert módszerekkel is előállíthatjuk.
A találmány szerinti hibrid promotereket emlősgének élesztőkben való expresszálódásának javítására és szabályozására használhatjuk.
A találmány körébe tartoznak olyan hibrid vektorok is, amelyek egy heterológ polipeptidet kódoló gént tartalmaznak; a gén hibrid promoterek szabályozása alatt áll. A találmány szerinti élesztő hibrid vektorok egy vagy több olyan beékelt DNS-szakaszt tartalmaznak, amelyek mindegyike egy az élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS-szegmenst tartalmaz; ez a szegmens egy olyan hibrid promoter átírási szabályozása alatt áll, amely egy az élesztő PH05-gén UASét/UAS-eit tartalmazó 5’ upstream promoter alkotórészből és egy olyan 3’ downstream promoter alkotórészből áll, amely egy a PH05-géntől eltérő élesztőgénből származik és átírási kezdési helyeket tartalmaz, amelyek egy funkcionális TATA-box-ot is magukba foglalnak.
A találmány szerinti hibrid vektorokat egy hibrid plazmidból és egy lineáris DNS-vektorból választjuk ki.
Egy DNS-szegmens, amely egy az élesztő számára heterológ polipeptidet kódol, egy olyan DNS (gén), amely számos különböző polipeptidet - beleértve a glikozilezett polipeptideket is - kódolhat, különösen a
HU 211 207 Β magasabbrendű eukarióták, elsősorban az emlősök, úgymint az állatok és különösképpen az emberek plipeptidjeit, úgymint enzimeket, amelyek például tápanyagok előállítására és enzimatikus kémiai reakciók végrehajtására használhatók, vagy nem enzimjellegű polipeptideket, amelyek igen hasznosak és értékesek emberi és állati megbetegedések kezelésére vagy megelőzésére, így hormonokat, immunmodulátor, vírusellenes vagy tumorellenes hatású polipeptideket, antitesteket, vírus antigéneket, véralvadási faktorokat, élelmiszereket és más hasonlókat.
Ilyen polipeptidek például az inzulin növekedési faktorok, úgymint az epidermális inzulinszerű, emlősejti, idegi vagy transzformációs növekedési faktor, a növekedési hormonok, úgymint az emberi vagy borjú növekedési hormonok, az interleukinok, úgymint az interleukin-1 vagy -2, az emberi makrofág migrációját gátló faktor (MIF), az interferonok, úgymint az emberi α-interferon, például az interferon-ctA, -txB, -aD vagy -aF, a β-interferon, a γ-interferon vagy egy hibrid interferon, például egy αΑ-aD- vagy egy aB-aD-hibrid interferon, hepatitis vírus antigének, úgymint hepatitis B vírus felszíni vagy magi antigénje vagy hepatiüs A vírus antigén, plazminogén aktivátorok, úgymint szöveti plazminogén aktivátor vagy urokináz, tumor nekrózis faktor, szomatosztatin, renin, β-endorfin, immunglobulinok, úgymint az immunglobulin D, E vagy G könnyű és/vagy nehéz láncai, immunglobulin kötő faktorok, úgymint immunglobulinE kötő faktor, kalcitonin, emberi kalcitonin-szerű peptid, véralvadási faktorok, úgymint a IX faktor vagy a VIIIc faktor, egy eglin, úgymint eglin C, egy deszulfátohirudin HV1, HV2, vagy PA változat, vagy emberi szuperoxid dizmutáz. Az előnyös gének azok, amelyek egy humán interferont vagy hibrid interferont, emberi szövet plazminogén aktivátort (t-PA), hepatitis-B vírus felszíni antigént (HBVsAg), inzulinszerű növekedési faktor Iet, eglin C-t vagy deszulfátohirudin HV1 variánsát kódolják.
A hibrid promoter különösképpen a fent leírtak valamelyike.
A találmány szerinti hibrid vektorok egy vagy több beékelt DNS-szakaszt tartalmazhatnak, amelyek mindegyike tartalmazza egyebek között a hibrid promotert és egy olyan DNS-szegmenst, amely egy az élesztő számára heterológ polipeptidet kódol. Ha a hibrid vektor több, előnyösen 2-4 beékelt DNS-szakaszt tartalmaz, ezek tandem elrendezésben vagy a hibrid vektor különböző helyein lehetnek jelen. Az előnyös hibrid vektorok vagy egy beékelt DNS-szakaszt tartalmaznak, vagy több beékelt NDS-szakaszt, tandem elrendezésben.
A találmány szerinti hibrid vektorokban az élesztő hibrid promoter működőképesen a polipeptid kódoló régióhoz van kötve úgy, hogy biztosítsa a polipeptid hatékony expresszálódását. A találmány egyik előnyös kiviteli alakjánál az élesztő hibrid promoter közvetlenül a kész polipeptidet kódoló régióhoz van kötve egy transzlációs indító szignállal (ATG), amelyet az összekapcsolási helyhez ékelünk be. Az élesztő hibrid promoternek a polipeptid kódoló régióhoz kapcsolására az egyik előnyös régió az, amely közvetlenül az endogén
ATG szomszédságában helyezkedik el.
A találmány egy másik előnyös kiviteli alakja szerint egy jelző (szignál) szekvencia is jelen van. Megfelelő jelző szekvenciák például a PH05 jelző szekvencia, az élesztő invertáz gén jelző szekvenciája, vagy az α-faktor pre-pro szekvenciája, és az expresszálandó polipeptid kódoló régióhoz természetesen kapcsolódó jelző szekvenciák. Egy másik megoldás szerint összeépített jelző szekvenciákat lehet létrehozni. Azokat a kombinációkat részesítjük előnyben, amelyek pontos hasítást tesznek lehetővé a jelző szekvencia és a kész polipeptid szekvenciája között. További szekvenciák, úgymint pro- vagy spacer-szekvenciák, amelyek vagy tartalmaznak specifikus átalakító szignálokat vagy nem, szintén jelen lehetnek, hogy megkönnyítsék a prekurzor molekulák pontos átalakítását. Egy másik megoldás szerint létre lehet hozni olyan összeépített proteineket, amelyek belső átalakító szignálokat tartalmaznak, ami lehetővé teszi az in vivő és in vitro megfelelő maturációt. Az átalakító szignálok előnyösen tartalmaznak egy Lys-Arg maradékot, amelyet a kiválasztási folyamatban részt vevő élesztő endopeptidáz felismer.
A gén expresszálódásakor a gén termék belép a kiválasztási folyamatba és a periplazmatikus térbe kerül tovább. Ha el lehet érni a további kiválasztást a sejtfalon keresztül a tápközegbe, a kitermelést jelentősen lehet növelni. A kinyerési folyamatot tehát egyszerűsíteni lehet anélkül, hogy a sejteket el kellene roncsolni. A polipeptidet továbbá az N-végen egy további metionin jelenléte nélkül lehet kinyerni, mivel nincs szükség egy ATG-re transzlációs indító szignálként a kódoló szekvencia előtt. Mivel a glikozilezés kapcsolódik a kiválasztási folyamathoz, várható, hogy a termelt polipeptid glikozilezett lesz (amennyiben glikozilezési helyek jelen vannak). Több olyan jellemző van, amely a glikozilezett polipeptideket előnyösebbé teszi a nem glikozilezett polipeptideknél: A glikozilezett polipeptid jobban hasonlít az emlőssejtek eredeti polipeptidjére, mint a nem glikozilezett polipeptid. Az ilyen proteinek harmadlagos szerkezete továbbá valószínűleg bizonyos fokig függ a glikozilgyökök jelenlététől. Várható, hogy az ezekben a molekulákban jelenlevő szénhidrátgyökök kedvezően befolyásolják a kémiai stabilitást és a farmakológiai aktivitást.
A találmány szerinti hibrid vektorok előnyösen egy élesztőgén 3’ határoló szekvenciáját is magukba foglalják, amely tartalmazza a megfelelő szignálokat az átírás befejezésére és a poliadenilezésre. Az előnyös 3’ határoló szekvencia a PH05-génből származik.
A találmány különösképpen egy olyan lineáris DNS-molekula előállítására vonatkozik, amely lényegében egy hibrid promoterből (amely egy az élesztő PH05-gén UAS-ét/UAS-eit tartalmazó 5’ upstream promoter alkotórészből és egy a PH05-géntől eltérő élesztőgén 3’ downstream promoter alkotórészéből épül fel; a 3’ downstream promoter alkotórész átírási kezdési helyeket tartalmaz, amelyek egy funkcionális
HU 211 207 Β
TATA-box-ot is magukba foglalnak), egy az ez által a hibrid promoter által szabályozott DNS-szegmensből, amely az élesztő számára heterológ polipeptidet kódol, és olyan DNS-szegmensből áll, amely az élesztő PH05-gén megfelelően elhelyezkedő átírási befejezési szignáljait tartalmazza.
A homológ 3’ és 5’ határoló szekvenciák révén a polipeptid kódoló régiót tartalmazó teljes lineáris DNS-vektor stabilan beépül az élesztőlaromoszóma PH05 helyére.
A találmány tárgya közelebbről eljárás olyan gyűrűs hibrid plazmidok előállítására, amelyek a hibrid promoteren, a polipeptid kódoló régión és a 3’ határoló szekvenciákon kívül olyan további DNS-szekvenciá(ka)t is tartalmaz, amelyek a promoter funkciója szempontjából - azaz a polipeptid kódoló régió expresszálódásához - lényegtelenek vagy kevésbé fontosak, de lényeges funkciókat tölthetnek be például az említett hibrid vektorokkal transzformált élesztősejtek szaporításában. A további DNS-szekvencia/szekvenciák prokarióta és/vagy eukarióta sejtekből származhatnak és tartalmazhatnak kromoszomális és/vagy extrakromoszomális DNS-szekvenciákat. A további DNSszekvenciák származhatnak (vagy állhatnak) például plazmid DNS-ből, úgymint bakteriális vagy eurakióta plazmid DNS-ből Vírus DNS-ből és/vagy kromoszomális DNS-ből, úgymint bakteriális, élesztő vagy magasabbrendű eukarióták kromoszomális DNS-éből. Az előnyös hibrid plazmidok olyan további DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek bakteriális plazmidokból, különösen az Escherichia coli plazmid pBR322-ből vagy ezzel rokon plazmidokból, bakteriofágokból élesztő 2 μ plazmidból és/vagy élesztő kromoszomális DNS-ből származnak.
A további DNS-szekvenciák elsősorban egy élesztő replikációs origót és egy élesztőre szelektív genetikai markert tartalmaznak. Az élesztő replikációs origót, például egy kromoszomális autonóm replikációs szegmenst (ars) tartalmazó hibrid plazmidok extrakromoszomálisan maradnak fenn az élesztősejten belül a transzformáció után és autonóm módon mitózis során replikálódnak. Olyan hibrid plazmidok is használhatunk, amelyek az élesztő 2 μ plazmid DNS-sel homológ szekvenciákat tartalmaznak. Ezek a hibrid plazmidok rekombinációval beépülnek a sejtben már jelenlevő 2 μ plazmidokba vagy autonóm módon replikálódnak. A 2 μ szekvenciák különösen alkalmasak a nagyfrekvenciás transzformációs plazmidokhoz és lehetővé teszik a nagy másolatszámot.
Élesztő szelektív génmarkerként bármelyik marker gén használható, amely fenotípusos expresszálódása révén megkönnyíti a transzformánsok kiválasztását. Megfelelő élesztőmarkerek különösen azok, amelyek antibiotikus rezisztenciát expresszálnak, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében az olyan gének, amelyek a gazdaszervezet sérülését kiküszöbölik. A megfelelő gének például rezisztenciát hordoznak a cikloheximid antibiotikummal szemben, vagy egy auxotróf élesztőmutánsban prototrófíát biztosítanak; ilyen például az URA3, LEU2, HIS3 vagy TRP1 gén. Markerként olyan strukturgének is alkalmazhatók, amelyek egy autonóm replikálódó szegmenshez kapcsolódnak, ezáltal biztosítva, hogy a transzformálandó gazdaszervezet auxotróf legyen a marker által expresszált termékre.
A találmány szerinti hibrid plazmidokban jelenlevő további DNS szekvenciák előnyösen egy replikációs origót és egy szelektív genetikus markert is tartalmaznak baktérium gazdaszervezetekre, különösen Escherichia coli-ra. Egy E. coli replikációs origó és egy E. coli marker egy élesztő hibrid vektorban való jelenlétének előnyei például a következők: először is nagy mennyiségű hibrid vektor DNS-t lehet előállítani E. coli tenyésztésével és szaporításával, másodszor a hibrid vektorok létrehozása kényelmesen végrehajtható az E. coli-ban és az E. coli-ra alapozott klónozó technológia valamennyi módszerének felhasználásával. Az E. coli plazmidok, úgymint a pBR322 és más hasonlók tartalmazzák mind az E. coli replikációs origót, mind az antibiotikumokkal, például tetraciklinnel és ampicillinnel szembeni rezisztenciát hordozó E. coli genetikus markereket, és előnyösen az élesztő hibrid vektorok részeiként kerülnek alkalmazásra.
A további DNS-szekvenciát, amely tartalmazza például a replikációs origót és a genetikus markereket az élesztőkre és egy baktérium gazdaszervezetre (amint ezt fent leírtuk), ezentúl „vektor-DNS”-nek nevezzük, amely az élesztő promoterrel és a polipeptid kódoló régióval együtt egy találmány szerinti hibrid plazmidot képez.
A találmány egyik előnyös kiviteli alakja olyan hibrid plazmidok előállítására vonatkozik, amelyek replikálődni tudnak, és fenotípusos kiválasztásukra egy élesztő gazdaszervezet törzsben, amely egy élesztő hibrid promotert és egy heterológ polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz; ez a DNS-szekvencia az átírási kezdési és befejezési szignálokkal együtt, valamint a transzlációs kezdési és befejezési szignálokkal együtt a hibrid plazmádban az említett hibrid promoter irányítása alatt áll, így egy transzformált élesztőtörzsben ez expresszálódik az említett polipeptid előállítására.
A hibrid vektorokat például úgy állítjuk elő, hogy összekapcsolunk egy hibrid promotert (amely egy az élesztő PH05-gén UAS-ét /UAS-eit tartalmazó ’5 upstream promoter alkotórészből, és egy 3’ downstream promoter alkotórészből áll, mely utóbbi egy a PH05géntől eltérő élesztőgénből származik és olyan átírási kezdőpontokat tartalmaz, amelyek egy funkcionális TATA-box-ot is magukba foglalnak), egy az élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS-szegmenst, és egy élesztőgén 3’ határoló szekvenciáit úgy, hogy a DNS-szegmens az említett hibrid promoter átírási szabályozása alatt álljon, és a vektor DNS-be adott esetben egy vagy több lineáris DNS-t is beviszszük. Célszerűen feltérképezett lineáris vagy - előnyösen - gyűrűs vektor DNS-t, például bakteriális plazmid DNS-t vagy ehhez hasonló DNS-t (vö. a fenti leírással) alkalmazunk, amelynek legalább egy, előnyösen két vagy több hasítóhelye van. A vektor DNS előnyösen már tartalmaz replikációs origókat és génmarkereket élesztőkhöz és/vagy egy baktérium gazdaszervezethez. A vektor DNS-t egy megfelelő restrikciós endonukleáz
HU 211 207 Β alkalmazásával hasítjuk. A hasított DNS-t ligáljuk egy olyan lineáris DNS fragmentumhoz, amely egyebek között tartalmazza az élesztő hibrid promotert, és a polipeptidet kódoló DNS-szegmenshez. A hibrid promoterhez és a polipeptid kódoló régióhoz való kapcsolás előtt vagy után (vagy egyidejűleg is) bevihetünk replikációs origókat és/vagy markereket is élesztőkhöz vagy egy bakteriális gazdaszervezethez. A hasítási és melegítési körülményeket minden esetben úgy kell megválasztani, hogy a vektor DNS alapvető funkciói ne ütközzenek a hibrid promotereivel. A hibrid vektort felépíthetjük szekvenciálisán vagy két olyan DNSszegmens ligálásával, amelyek mindegyik fontos szekvenciát tartalmazzák.
Különböző technikák használhatók a DNS-szegmensek in vitro összekapcsolásához. Bizonyos restrikciós endonukleázok által létrehozott tompa végek (teljesen bázispárosított DNS-duplexek) közvetlenül ligálhatók T4 DNS-ligázzal. Szokásosabban úgy járunk el, hogy a DNS-szegmenseket egyfonalas kohézív végükön keresztül kapcsoljuk össze és kovalens módon zárjuk egy DNSligázzal, például T4 DNS-ligázzal. Az ilyen egyfonalas „kohézív végek”-et úgy hozhatjuk létre, hogy DNS-t egy másik endonukleáz csoporttal hasítunk, amely eltolt végeket hoz létre (a DNS kettős spirál két szálát különböző pontokon, néhány nukleotidnyi távolságra hasítjuk). Az egyfonalas formát úgy is létrehozhatjuk, hogy a nukleotidokat a tompa végekhez vagy az eltolt végekhez építjük terminális transzferázok alkalmazásával (homopolimer farkazás) vagy egy tompavégű DNS-szegmenst egy megfelelő exonukleázzal, úgymint λ-exonukleázzal egyszerűen visszahasítva.
Eltolt végek előnyösen úgy is létrehozhatók, hogy a tompavégű DNS-szegmenshez egy kémiailag előállított kapcsoló DNS-t ligálunk, amely tartalmaz egy olyan felismerő helyet, amely felismeri az eltolt végeket képző endonukleázt, és a kapott DNS-t a megfelelő endonukleázzal emésztjük.
A hatékony expresszálódáshoz a génnek megfelelően kell elhelyezkednie az átírási (élesztő hibrid promoter) és a transzlációs funkciókat tartalmazó szekvenciákhoz képest. Először is a polipeptid kódoló régiót és a hibrid promotert magába foglaló DNS-szegmens ligálását a megfelelő orientációban kell végrehajtani. Ha két orientáció lehetséges, a helyeset szokásos hasítási elemzéssel kell meghatározni. A helytelenül orientált beékelt polipeptid gént tartalmazó hibrid vektorokat re-orientáljuk a beékelt gén kihasításával egy megfelelő restrikciós endonukleázzal és a gén újraligálásával a hibrid vektor fragmentumba. A helytelen orientációt minden esetben elkerülhetjük úgy, hogy 2 olyan DNSszegmenst ligálunk, amelyek végén különböző hasítóhelyek vannak. A hibrid vektort továbbá úgy kell felépíteni, hogy lehetséges legyen az átírás helyes elkezdése és befejezése. Ami az utóbbit illeti, az átírt származék előnyös, ha az élesztő kromoszomális DNS-ből vagy élesztő 2 μ plazmidból származó DNS-szekvencia az átírási egységre végződik. Előnyösen az átírt származék egy olyan DNS-szekvenciával végződik, amely tartalmazza egy élesztőgén, például a PH05 vagy a TRP1 átírási befejező szignálját. Másodszor létre kell hozni egy megfelelő leolvasási keretet. A promoter régió és a polipeptid kódoló régió nukleotidszekvenciája általában ismert ligálás előtt, vagy könynyen meghatározható úgyhogy nincs nehézség a helyes leolvasási keret létrehozásával.
Ha az érett polipeptid közvetlenül expressziőját óhajtjuk, akkor el kell távolítani az adott esetben a hibrid promoter régiót követő és/vagy adott esetben az érett polipeptidet kódoló régiót megelőző jelzőszekvenciákat vagy azok részeit; az eltávolítás végrehajtható például egy exonukleázzal, úgymint Bal31-gyel végzett emésztéssel. Az élesztő promotemek a közvetlen hozzákapcsolására a polipeptid kódoló szekvenciához előnyös régió a fő mRNS indítókodon és az ATG transzlációs indítókodon közötti. Az ebben a régióban való összekapcsoláshoz a polipeptid kódoló szekvenciának saját ATG-je kell legyen a transzláció indításához, vagy ellenkező esetben el kell látni egy további szintetikus oligonukleotiddal. Az élesztő hibrid promotert a polipeptid kódoló szekvenciához egy szintetikus oligodezoxinukleotid mint összekötő molekula segítségével is hozzákapcsolhatjuk. így a hibrid promoter régiót, ha az lehetséges, szabályozni lehet 3’-vége közelében úgy, hogy abból hiányozzon egy előre meghatározott számú bázispár. Analóg módon a polipeptid kódoló szekvenciát szabályozni lehet 5’-vége közelében. Ezután egy szintetikus oligodezoxinukleotidot lehet felépíteni olyan módon, hogy amikor az élesztő hibrid promotert és a polipeptid kódoló szekvenciát összekapcsoljuk az összekötő oligodezoxinukleotidon keresztül, a hiányzó bázispárokat pótoljuk beleértve egy ATG transzlációs kezdési szignált is, és a polipeptid kódoló szekvencia a promoterhez képest a megfelelő leolvasási keretben legyen.
A kívánt hibrid vektort tartalmazó lígáló keveréket közvetlenül felhasználjuk a transzformációs lépésben vagy először feldúsítjuk a hibrid vektorra nézve, például gélelektroforézissel, és ezután használjuk transzformálásra.
A közti termékeket, például az olyan vektorokat, amelyeknek egy vagy több alapvető funkciója még hiányzik, valamint a végső, találmány szerinti hibrid vektorokat adott esetben transzformáljuk egy bakteriális gazdaszervezetbe, különösen E. coli-ba, a fenti okok miatt (például nagy mennyiségű intermedier termék vagy hibrid plazmid előállítására). E miatt a bakteriális vektorok, úgymint az E. coli pBR322 plazmid és ezek bakteriális replikációs origót és génmarker(ek)-et tartalmazó fragmensei a legelőnyösebb vektorok. Amikor ilyen bakteriális vektort alkalmazunk, a végső lépések az élesztő hibrid vektorok előállítására előnyösen magukba foglalják az élesztőhöz való genetikus marker és egy replikációs origó bevitelét is.
A találmány egy másik része élesztők átalakítása polipeptid kódoló szekvenciát tartalmazó hibrid vektorokkal; ez tulajdonképpen egy olyan transzformált élesztősejtek előállítására irányuló eljárás, amelyek az élesztő számára heterológ polipeptidet tudnak termelni. Az eljárás élesztősejtek transzformálásából áll egy hibrid vek tónál, amely egy vagy több DNS-inszertet tar8
HU 211 207 Β talmaz; ezek mindegyikében van egy az élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS-szegmens, amely egy hibrid promoter átírási szabályozása alatt áll. Ez a hibrid promoter egy az élesztő PH05-gén AUS-ét/AUS-eit tartalmazó 5’ upstream promoter alkotórészből és egy 3’ downstream alkotórészből áll; ez utóbbi egy a PH05-géntől eltérő élesztőgénből származik és átírási kezdőpontokat tartalmaz, amelyek egy funkcionális TATA-box-ot is magukba foglalnak.
Az alkalmazható élesztők közé tartoznak a Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Torulopsis vagy rokon nemzetségek fajai [vö. J. Lodder: „The Yeasts”, Amsterdam, (1971)], különösenb a Saccharomyces cerevisiae törzsei.
Az élesztők transzformálása hibrid vektorokkal az irodalomból ismert módszerekkel hajtható végre, például a Hinnen és munkatársai által leírt módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929, (1978)]. Ez a módszer három lépésre osztható:
(1) az élesztősejtfalnak vagy részeinek eltávolítása, (2) a csupasz élesztősejtek (szferoplasztok) kezelése a transzformáló DNS-sel polietilénglíkol (PEG) és Ca2+-ionok jelenlétében, (3) a sejtfal regenerálása és a transzformált sejtek kiválasztása egy szilárd agarrétegen.
Az előnyös módszerek (1) esetében: az élesztő sejtfalat enzimesen távolítjuk el különböző glükozidáz készítményekkel, úgymint csiga bélnedvekkel (például Glusulase® és Helicase® néven forgalmazott termékek) vagy mikroorganizmusokból nyert enzimkeverékkel (például a Zymolyase® néven forgalmazott tennék) ozmotikusán stabilizált oldatokban (például 1 M szorbitol);
(2) esetében: az élesztő szferoplasztok polietilénglíkol jelenlétében aggregálódnak és a citoplazmatikus membránok helyi összeolvadása indukálódik. Az összeolvadáshoz megfelelő körülmények megteremtése kritikus tényező és számos transzformált élesztősejt válik diploiddá vagy akár triploiddá a transzformálási eljárás alatt. Az összeolvadt szferoplasztok kiválasztását lehetővé tevő eljárások használhatók a transzformánsok dúsítására, azaz a transzformált sejteket könnyen ki lehet szűrni az előzőleg kiválasztott összeolvadási termékekből;
(3) esetében: mivel a sejtfal nélküli élesztősejtek nem osztódnak, a sejtfalat regenerálni kell. Ezt a regenerálást célszerűen úgy hajtjuk végre, hogy a szferoplasztokat agarba ágyazzuk be. így például olvasztott agart (körülbelül 50 ’C-on) keverünk össze a szferoplasztokkal. Az oldatot az élesztők növekedési hőmérsékletére (30 ’C körül) hűtve egy szilárd réteget kapunk. Ez az agarréteg arra szolgál, hogy megelőzze az esszenciális makromolekulák gyors diffúzióját és eltávozását a szferoplasztokból és ezáltal megkönnyíti a sejtfal regenerálódását. A sejtfal regenerálódást azonban úgy is el lehet érni (bár ez kevésbé hatékony), hogy a szferoplasztokat az előre megformált agarrétegek felületére telepítjük.
A regeneráló agart előnyösen úgy készítjük, hogy lehetséges legyen a transzformált sejtek egyidejű regenerálása és kiválasztása. Mivel az aminosav bioszintézis utak enzimjeit kódoló élesztőgéneket általában mint szelektív markereket használjuk (vö. a fentiekkel), a regenerálást előnyösen élesztő minimum agar tápközegen végezzük. Ha nagyon hatékony regenerálásra van szükség, akkor előnyösen egy kétlépéses eljárást kell követni: (1) a sejtfal regenerálása egy gazdag komplex tápközegben, és (2) a transzformált sejtek kiválasztása a sejtréteg átmásolásával szelektív agar lemezekre.
Ha a hibrid vektor nem tartalmaz semmilyen marker gént, a transzformáit sejteket más módszerekkel is azonosítani lehet. Ilyen módszer például az in situ hibridizálás egy címkézett DNS-fragmentummal, amely homológ a hibrid vektor szekvenciáira például Hinnen és munkatársai fent említett módszerével, vagy in situ immunoassay-kkel, amennyiben a bevitt gén termékére rendelkezésre áll egy antitest, vagy más szűrési módszerekkel, amelyek a transzformáló plazmid(ok) által kódolt géntermékeket határozzák meg.
Egy másik megoldás szerint az élesztőt ko-transzformálhatjuk egy találmány szerinti hibrid vektorral és egy olyan másik vektorral, amely egy élesztő genetikus markert tartalmaz. Ha a két különböző vektornak vannak közös DNS-szekvenciái (ezek a vektorokban jelenlevő bakteriális szekvenciák lehetnek), akkor a végbemenő rekombináció egy összeolvadt, kiválasztható hibrid molekulához vezet.
Az élesztőt ko-transzformálhatjuk úgy is, hogy egy lineáris DNS-vektort - amely az élesztő hibrid promoterből, az ezáltal szabályozott heterológ polipeptid kódoló régióból és az élesztő PH05-gén átírási befejezési szignáljából áll - és egy élesztőre szelektív markert tartalmazó vektort alkalmazunk. A ko-transzformálás lehetővé teszi azoknak az élesztősejteknek a feldúsítását, amelyek olyan DNS-t vettek fel, amelyre közvetlenül nem lehet szelektálni. Mivel a megfelelő sejtek bármilyen típusú DNS-t felvesznek, egy szelektív vektorral transzformált sejtek nagy százaléka szintén felvesz bármilyen további DNS-t (úgymint a fenti lineáris DNS-t). Megfelelően hosszú homológ szekvenciák (például 20-100 dezoxinukleotid) segítségével a polipeptid gént stabilan be lehet építeni a gazdakromoszómába. A találmány szerinti különleges felépítés a heterológ gén stabil beépítését eredményezi a PH05-gén kromoszómájába, azaz a II-élesztő kromoszómába.
A találmány szerinti hibrid plazmidokat tartalmazó élesztőtörzsek heterológ polipeptid termelő képességét javíthatjuk mutációval és kiválasztással, az irodalomból ismert módszereket alkalmazva. A mutációt kiválthatjuk például UV-sugárzással vagy egy megfelelő kémiai reagenssel.
Azt találtuk, hogy a találmány szerinti hibrid vektorokkal végzett transzformálás és a sejtfal regenerálása szénforrásként glükózt tartalmazó gazdag tápközegben könnyen végrehajtható, és lényegesen egyszerűbb, mint azok a megfelelő lépések, amelyeket hagyományos, glükózzal indukálható promotereket tartalmazó hibrid vektorokkal hajtanak végre, amely esetben glükózmentes közegben kell dolgozni, hogy meg lehessen
HU 211 207 Β akadályozni a pusztító géntermékek esetleges felhalmozódását a sejteken belül.
A találmány tehát kiterjed élesztő gazdaszervezeteknek olyan hibrid vektorokkal történő transzformálására is, amelyek egy vagy több beékelt DNS-szakaszt tartalmaznak; ezeknek a DNS-szakaszoknak mindegyike tartalmaz egy olyan DNS-szegmenst, amely az élesztő számára heterológ polipeptidet kódol, és egy olyan hibrid promoter szabályozása alatt áll, amely az élesztő PH05-gén UAS-ét/UAS-eit tartalmazó 5’ upstream promoter alkotórészből és egy olyan 3’ downstream promoter alkotórészből áll, amely a PH05-géntől eltérő élesztőgénből származik és olyan átírási kezdési helyeket tartalmaz, amelyek egy funkcionális TATA-box-ot is magukba foglalnak; és az ilyen törzsek mutánsaira.
A transzformált élesztősejtek tenyésztése és az expresszálódott polipeptid elkülönítése is a találmány körébe tartozik; az élesztő számára heterológ polipeptid előállítását úgy végezzük, hogy egy olyan élesztőtörzset vagy annak mutánsát tenyésztjük, amelyet egy vagy több beékelt DNS-szakaszt tartalmazó hibrid vektorral transzformáltunk; valamennyi beékelt DNS-szakasz tartalmaz egy az élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS-szegmenst, amely egy olyan hibrid promoter szabályozása alatt áll, amely egy az élesztő PH05-gén UAS-ét/UAS-eit tartalmazó 5’ upstream promoter alkotórészből és egy olyan 3’ upstream promoter alkotórészből tevődik össze, amely egy a PH05géntől eltérő élesztőgénből származik, és átírási kezdési helyeket tartalmaz, amelyek egy funkcionális TATAbox-ot is magukba foglalnak; és az expresszálódott polipeptidet elkülönítjük.
A találmány szerinti eljárással transzformált élesztősejteket az irodalomból ismert módszerekkel tenyésztjük egy olyan folyékony közegben, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat és szervetlen só forrásokat tartalmaz, és amennyiben szükséges, növekedést serkesztő anyagok jelenlétében.
Különböző szénforrásokat alkalmazhatunk. Előnyösen alkalmazható szénforrások például az asszimilálható szénhidrátok, úgymint glükóz, maltóz, mannitol vagy laktóz, vagy egy acetát, úgymint nátrium-acetát, amelyet akár egymagában, akár megfelelő keverékben alkalmazhatunk. Az alkalmazható nitrogénforrás például egy aminosav, kazaminosav, peptidek, fehérjék és bomlástermékeik, például tripton, pepton vagy húsextraktumok, továbbá élesztőextraktumok, malátaextraxt, kukoricalekvár, valamint ammóniumsók, úgymint ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyeket akár egymagukban, akár megfelelő keverékben alkalmazhatunk. Az alkalmazható szervetlen sók közé tartoznak például a nátrium, kálium, magnézium és kalcium szulfátjai, kloridjai, foszfátjai és karbonátjai. Ezenkívül a tápközeg növekedést serkentő anyagokat is tartalmazhat. A növekedést gyorsító anyagok lehetnek például növekedésserkentők, nyomelemek, úgymint vas, cink, mangán és más hasonló elemek, vagy különálló aminosavak.
Mivel a találmány szerinti hibrid promoterek szabályozottak, a tápközeg összetételét a növekedési fázisokhoz kell igazítani. A növekedési szakasz alatt, nagy foszfátkoncentrációknál a találmány szerinti hibrid promoterek lényegében nem működnek. így például a találmány szerinti legelőnyösebb hibrid promoter, amely tartalmazza a PH05 5’ egy upstream promoter alkotórészét a PH05 UAS-eivel és a GAPDH egy 3’ downstream promoter alkotórészét a TATA-box-szal, ilyen körülmények között ötvened részére csökkenti működését. Ezért az esetleges toxikus géntermékek csak igen kis mennyiségben termelődnek és a lehető legkisebbre csökken a sejt metabolizmusára kifejtett károsító hatás. Amikor a megfelelő sejtsűrűséget elértük, a tápközegben előnyösen csökkentjük a szervetlen foszfátok szintjét (alacsony Pj közeg). Ennek hatására a találmány szerinti hibrid promoterek működni kezdenek (depresszálódnak) és a lehető legnagyobb számú átírt mRNS-t kapjuk.
A tenyésztést szokásos technikák alkalmazásával végezzük. A tenyésztési körülményeket, így a hőmérsékletet, a közeg pH-ját és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy a kívánt polipeptid legnagyobb mennyisége keletkezzen. A tenyésztést általában aerob körülmények között, süllyesztett tenyészetben végezzük rázatással vagy keveréssel, körülbelül 25-35 *C hőmérsékleten, pH=4-8, például pH= körülbelül 7 értéken, körülbelül 4-20 órát, előnyösen addig, amíg a kívánt protein legnagyobb mennyiségét elérjük.
Az expresszálódott polipeptid elkülönítését és tisztítását kívánt esetben az irodalomból ismert módszerekkel végezzük.
Miután a transzformált sejteket megfelelő sejtsűrűségig tenyésztettük, az expresszálódott protein kinyerésének első lépése a protein kiszabadítása a sejt belsejéből. A legtöbb eljárásban először eltávolítják a sejtfalat enzimes emésztéssel, például glükozidázokkal. Ezt követően a kapott szferoplasztokat felületaktív anyagokkal, például Triton-nal kezeljük. Egy másik megoldás szerint a sejtek elroncsolására mechanikai erőket, úgymint nyíróerőt (például X-prés, franciaprés) vagy üveggyöngyökkel végzett rázatást alkalmaznak. A kapott elegyet a kívánt polipeptidre nézve a szokásos módszerekkel dúsítjuk, például a nem fehérjejellegű anyag nagy részének eltávolításával polietilén-imines kezeléssel, a proteinek kicsapásával az oldat ammónium-szulfáttal vagy triklór-ecetsavval végzett telítésével, gélelektroforézissel, dialízissel, kromatográfiásan, például ioncserés kromatográfiával, méret szerint szétválasztó kromatográfiás módszerrel, HPLC-vel vagy reverz fázisú HPLC-vel, molekuláris méret szerinti elkülönítéssel egy megfelelő Sephadex® oszlopon, vagy más hasonló módszerrel. Az előtisztított tennék végső tisztítását például antitest affinitásos kromatográfiával végezzük.
Ha az élesztő a kívánt polipeptidet a plazmaközi térbe választja ki, egyszerűbben is eljárhatunk; a polipeptidet kinyerhetjük a sejt oldása nélkül, azaz a sejtfal enzimes eltávolításával, vagy vegyszerekkel, például tiolreagensekkel vagy EDTA-val végzett kezeléssel, amelyek lehetővé teszik a sejtfal roncsolódását és ezál10
HU 211 207 Β tál a polipeptid kiszabadulását. Ha a polipeptid a tápközegbe választódik ki, akkor onnan közvetlenül kinyerhető.
A kapott, glikozilezett és glikozilezetlen proteineket tartalmazó elegyet szétválaszthatjuk például egy concavalin-A Sepharose® oszlopon végzett kromatográfálással. A glikozilezetlen termékek átmennek az oszlopon, miközben a glikozilezett termékek szelektíven adszorbeálódnak és szokásos módszerekkel eluálhatók, például α-metil-mannozid és egy kaotropikus szer, például KSCN kombinációjával.
A glikozilgyökök el is távolíthatók enzimesen, például endoglikozidáz-H-val vagy -F-fel. Ez a módszer lehetővé teszi glikoziletlen termékek lényegében tiszta formában való előállítását.
A találmány tárgya tehát eljárás PH05 upstream aktivációs szekvenciák, a hibrid promoterek, a hibrid vektorok, transzformált élesztősejtek, valamint az élesztő számára heterológ polipeptidek előállítására, amint azt a példákban ismertetjük.
Az 1. ábra a PH05 promoter régió BamHI-Sall fragmentumának DNS-szekvenciáját mutatja.
A 2. ábra a GAPDH promoter régiójának DNS-szekvenciáját szemlélteti [491-es klón, (vö. Bittér, G. A. és munkatársai: Gene, 32, 263, (1984)].
A 3. ábra sematikusan szemlélteti a pGAPDH-EL plazmid előállítását.
A 4. ábra a találmányban használt GAPDH-gén 3’ promoter alkotórészeit mutatja.
Az 5. ábra a pJDB207R/PH05-EGL plazmid előállítását szemléltető diagram.
A 6. ábra a hibrid PH05/GAPDH promotert tartalmazó pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1) plazmid létrehozását mutatja be.
A 7. ábra egy olyan sematikus diagram, amely a kész deszulfátohirudint kódoló DNS-fragmentum elkülönítését mutatja.
A 8. ábra a pJDB207/PH05-HIR plazmid előállítását szemlélteti sematikusan.
A 9. ábra a pJDB207/PH05 (Eco)-HIR plazmid létrehozását bemutató diagram.
A 10. ábra a pJDB207/PAPFL-TPA (UAS1+UAS2) plazmid létrehozását bemutató sematikus diagram.
A találmány szerinti megoldást a következő nem korlátozó példákkal szemléltetjük.
Kísérleti rész
1. példa
PH05 promoter deléciók létrehozása
a) Bal 31 emésztés
PH05-promoter forrásként a PH05 BamHI-Sall 1. ábrán szemléltetett fragmentumát tartalmazó M13mp9/PH05 Bam-Sal rekombináns fágot használjuk [vö. 143 081. számú európai szabadalmi bejelentés], A fág-DNS 20 pg-ját (RF jelentése replikatív alak) Sáli restrikciós endonukleázzal emésztjük, így egy körülbelül 9 kilobázisnyi lineáris DNS-t kapunk. Fenol és kloroform keverékével végzett extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk, majd újra szuszpendáljuk 10 mM pH=8,0 trisz-ben, 0,5 pg/ml koncentrációban. 16 pg Sall-gyel hasított DNS-t 2 egység Bal31 exonukleázzal (BRL) emésztünk 100 pl-nyi 20 mM-os 8,0 pH-jú íriszben, 199 mM nátrium-klorid, 12 mM magnéziumklorid, 12 mM kalcium-klorid és 1 mM EDTA jelenlétében. 1, 2, 3, 4 és 5 percnyi 30 ’C-on végzett inkubálás után 2 pg-os alikvot DNS-mintákat veszünk és ezeket azonnal összekeverjük 50 pl fenollal, 60 pl TNE-vel. Fenol és kloroform keverékével végzett extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-ből 10 mM 8,0-as pH-jú trisz-szel 100 pg/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk. A Bal31 exonukleotikus hasításának mértékét úgy határozzuk meg, hogy az egyes időpontokban vett minták DNS-ének 0,5 pg-ját BamHI endonukleázzal emésztjük és 1,5%-os agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát pufferrel (90 mM trisz x HCI pH=8,3, 90 mM bórsav, 2,5 mM EDTA) vizsgáljuk. A Bal 31-gyei végzett emésztéssel percenként átlagosan a fragmentum mindkét végéről 100 bázispárt távolítunk el.
b) EcoRI kapcsolók adagolása a Bal31-gyei kezelt
DNS-hez
EcoRI kapcsolók (5’-GGAATTCC-3’) két A260 egységét újraszuszpendáljuk 250 pl 10 mM trisz (pH=8) és 1 mM EDTA elegyében. 2 pg EcoRI kapcsolót kinázzal kezelünk 75 pl 60 mM trisz (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM DDT, 10 pM ATP és 33 egység T4 polinukleotid kináz (gyártja a Boehringer) elegyében. Az elegyet 37 ’C-on tartjuk 1 órát, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és ezután -20 ’C-on tároljuk.
A hőkezelt kétfonalas EcoRI kapcsolókat tompa végükkel a Bal31-gyel kezelt DNS-fragmentumokhoz ligáljuk. Bal 31-gyei kezelt DNS [vö. 1. a) példa] fél mikrogrammját 16 órát inkubáljuk szobahőmérsékleten EcoRI kapcsolók ötvenszeres feleslegével, 20 pl trisz (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 4 mM ATP és 600 egység T4 DNS-ligáz (Biolabs gyártmány) jelenlétében. A T4 DNS-ligáz inaktiválása után (10 perc 65 ’C-on) az EcoRI kapcsolók feleslegét 50 egység EcoRI-vel (Boehringer gyártmány) hasítjuk 50 pl térfogatban. A DNS-t fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk és újra szuszpendáljuk 10 mM triszben és 1 mM EDTA-ban (TE). Ezután a DNS-t 5 egység BamHI-gyel (Biolabs gyártmány) hasítjuk és az elegyet 1,5%-os kis olvadáspontú agarózgélre (Sigma termék) visszük trisz-borát pufferben (vö. a fent ismertetettel). A sávokat etidium-bromiddal színezzük és hosszúhullámú ultraibolya sugárzással, 366 nm-nél láthatóvá tesszük. A széles diffúz sávokat körülbelül 100 és 500 bázispár között kivágjuk a gélből és a DNS-t a következőképpen extraháljuk: az agaróz egy darabját 65 ’C-on elfolyósítjuk, nátriumkloriddal 500 mM-osra állítjuk be és 65 ’C-on inkubáljuk 20 percig. Egy térfogatrész fenolt (10 mM triszhidrokloriddal (pH=7,5), 1 mM EDTA-val és 500 mM nátrium-kloriddal ekvilibrálva) adunk hozzá, a vizes
HU 211 207 Β fázist kétszer újra extraháljuk fenollal és egyszer kloroformmal. A DNS-t 2,5 térfogatrész hideg abszolút etanollal kicsapjuk és centrifugálással összegyűjtjük. A DNS pelletet hideg 80%-os etanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A DNS-t újra szuszpendáljuk 10 μΐ TE-ben.
c) Ligálás M13mp9-hez
M13mp9 RF-jének 3 (Xg-ját 15 egység EcoRI-vei (Biolabs gyártmány) és 15 egység BamHI-gyel (Boehringer) emésztjük 50 μΐ térfogatban. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t újra szuszpendáljuk 50 μΐ TE-ben. A hasított vektor DNS 5 μΐ-jét körülbelül 200 ng) összekeverjük a fenti minták 10 μΐ-jével [a DNS fragmentumok a különböző Bal 31-es emésztésekből származnak, amint azt az 1. b) példában leírtuk] és 20 μΐ teljes térfogatban ligáljuk 60 mM trisz/hidrogén-klorid (pH=7,5), 6 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 1 mM ATPés 200 egység T4 DNS-ligáz jelenlétében 15 órát. Az E. coli JM101 törzs megfelelő sejtjeinek transzdukcióját az „Ml3 cloning and sequencing system” kézikönyv szerint végezzük (kiadja a New England Biolabs). Számos fehér tarfoltból (plakkból) származó fágokat tenyésztünk és elemzünk beékelt DNS-szakaszaik méretének meghatározására, az EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel végzett hasítással.
d) A Bal31 deléciós végpontjainak meghatározása
Sanger-féle szekvenálással (az Sáli-helytől való deléciók)
A szekvenálást Sanger és munkatársai didezoxiDNS szekvenciálási rendszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, (1977)], a fent említett kézikönyvben leírt módon végezzük. A deléciós végpontokat az alábbiakban adjuk meg:
klón a PH05-szekvencia utolsó nukleotidjának helyzete (vö. 1. ábra)
A -502
B -471
C -422
D -400
E -392
F -369
G -350
H -328
I -300
K -283
L -255
M -226
N -211
O -187
P -111
Q -88
R -57
S -33
e) A Bal31 deléciós végpontjainak meghatározása
Sanger-féle szekvenálással (a BamHI-hely felőli deléciók)
A fenti a) - c) lépésekben leírthoz hasonló Bal31 deléciók sorozatát hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy az Μ13mp9 PH05 Bam-Sal-et BamHI-vei hasítjuk. A Bal 31 -gyei emésztett molekulákat EcoRI-vel és Sall-vel hasítjuk és a létrehozott fragmentumokat EcoRl-vel és Sall-vel emésztett Μ13mp9-be klónozzuk. A deléciós végpontokat az alábbiakban adjuk meg:
klón a PH05-szekvencia utolsó nukleotidjának helyzete (vö. l.ábra)
A’ -24
B’ -35
C’ -41
D’ —48
E’ -74
F’ -89
G’ -93
H’ -97
I’ -124
K -162
L’ -174
M’ -262
Ν' -277
θ' -306
P' -332
Q’ -346
R -361
S' -382
Τ' -393
f) Belső PH05 promoter deléciók létrehozása
A d) lépésben leírt Bal31 deléciós sorozat egy olyan „balkar” PH05 promoter fragmentumot hoz létre, amely egy EcoRI helyben végződik, és a fenti e) lépésben leírt Bal 31 deléciós sorozat egy olyan Jobbkar” PH05 promoter fragmentumot hoz létre, amely egy EcoRI hellyel végződik. A különböző helyzetű „balkar”-okat és ,jobbkar”-okat kombinálva belső deléciókat hozunk létre, amelyek egy EcoRI kapcsoló szegmenst tartalmaznak a kivágott DNS helyén.
Az egyéni belső deléciókat úgy hozzuk létre, hogy az M13mp9-származékokból a „balkar”-okat és a ”jobbkar”-okat EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal (”balkar”-ok) vagy EcoRI és Sáli endonukleázokkal (”jobbkar”-ok) hasítjuk és a megfelelő fragmentumokat lágy agaróz gél elektroforézissel különítjük el a b) lépésben leírt módon. A „balkar”-ok, a „jobbkar”-ok ekvimoláris mennyiségét és 200 ng BamΗΙ-gyel és Sall-gyel emésztett M13mp9 vektor DNS-t ligálunk a c) lépésben leírt módon. Az E. coli JM10112
HU 211 207 Β be való transzdukció után a fehér tarfoltokat kiemeljük, RF-et állítunk elő és restrikciós vizsgálattal elemezzük (BamHI, Sáli, EcoRI). A következő karokat kombináljuk specifikus belső deléciók létrehozására (a nukleotidok számozásához vö. 1. ábra):
„balkar” .jobbkar” deléció mettől meddig kivágott nukleoti- dok
A T Δ7 -501 —394 108
B T Δ8 -470 —394 77
C T Δ9 -421 —394 28
D S’ Δ10 -399--383 17
E R’ Δ11 -391 —362 30
F Q’ Δ12 -368 —347 22
G P’ Δ13 -349—333 17
H O’ Δ14 -327--307 21
I N’ Δ15 -329--278 22
K M’ Δ16 -282--263 20
L L’ Δ17 -254—175 80
M L’ Δ18 -225--175 51
N L’ Δ19 -210—175 36
O L’ Δ20 -186--175 12
O K’ Δ21 -186—163 24
0 I’ Δ22 -186—125 62
0 H’ Δ23 -186—98 89
P H’ Δ24 -110—98 13
P G’ Δ25 -110--94 17
P F’ Δ26 -110--90 21
Q E’ Δ27 -87 - -75 13
R D’ Δ28 -56—49 8
R C’ Δ29 -56 —42 15
„balkar” ,jobbkar” deléció mettől meddig kivágott nukleoti- dok
R B’ Δ30 -56—36 21
S A’ Δ31 -32--25 8
2. példa
A PH05 pmmoter belső delécióinak in vivő elemzése
Az 1. f) példában ismertetett különböző deléciókat a pJDB207/PH05 plazmidba klónozzuk [Haguenauer-Tsapis, R., Hinnen, A.: Molecular and Cellular Biology, 4, 2668-2675, (1984)] úgy, hogy a vad típusú PH05 BamSal fragmentumot a kivágottal helyettesítjük. Az S. cere15 visiae AH216 élesztőtörzs transzformálása után (vö. 143 081. számú európai szabadalmi bejelentés) a savas foszfatáz aktivitást meghatározzuk Tohe és munkatársai módszerével [J. Bacteriol., 113, 727, (1973)]. Αδίΐ és 812 deléciók a PH05 aktivitás körülbelül tízszeres csök20 kenését mutatják és egy upstream régiót határoznak meg („upstream aktivációs hely”, UAS), amely alapvető a PH05 expresszióhoz. Hasonló csökkentő hatást figyeltünk meg a 57 deléciónál (körülbelül ötszörös csökkenés) és a 523-526 TATA-box delécióknál (körülbelül har25 mincszoros csökkenés). Valamennyi más deléció esetében az aktivitás körülbelül megfelel a vad típus szintjének. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a PH05 expresszió három alapvető információs területe a következőképpen helyezkedik el:
1. a -349. és -383. helyzet között (UAS1),
2. a -225. és -263. helyzet között (UAS2),
3. a -87. és -125. helyzet között (TATA-box).
A PH05 UAS 1-ét vagy UAS2-jét, vagy UAS 1-ét és UAS2-jét tartalmazó DNS-fragmentumokat az
M13mp9/PH05 Bam-Sal rekombináns fágból állíthatjuk elő (vö. 1. példa), a megfelelő restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással. Az UAS1 egy 268 bázispámyi BamHI-Clal fragmentumban helyezkedik el, amelynek képlete
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTG
CGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTT
CATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACG
CAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT, az UAS2 egy 100 bázispámyi Clal-BstEII fragmentumban helyezkedik el, amelynek képlete
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT
CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG és mind az UAS1, mind pedig az UAS2 jelen van egy 368 bázispámyi BamHI-BstEÜ fragmentumban, amelynek képlete
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTGC
GCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTTCA
TAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCAA
CTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT
CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG
HU 211 207 B
3. példa
Összeolvasztott PH05-GAPDH hibridpromoterek létrehozása
Az 1. és a 2. példa egy a -365. helyzet UASl(PH05) körüli, és egy másik, a-180. helyzet UAS2(PH05) körüli régiót hoz létre a PH05-génben, és ezek megfelelő jelöltek a szabályozó funkcióval rendelkező UAS-hez. Az UASl(PH05) egy 268 bázispámyi BamHI-Clal fragmentumban helyezkedik el, míg az UASl(PH05) és az UAS2(PH05) egyaránt benne vannak egy 368 bázispárnyi BamHI-BstEH fragmentumban.
A két fragmentum mindegyikét két különböző GAPDH downstream promoter alkotórésszel olvasztjuk össze, amelyek tartalmazzák a GAPDH TATA-boxát és átírási kezdési helyeit.
a) Egy élesztő géntár előállítása
Saccharomyces cerevisiae S288C törzs vad típusából származó teljes nagy molekulasúlyú DNS 30 pg-ját [01sen, Μ. V. és munkatársai: J. Mól. Bioi., 132, 387, (1979)] 30 percig inkubáljuk 37 ’C-on 2 egység EcoRImetilázzal (New England Biolabs gyártmány) 250 μΐ EcoRI metilező pufferben, a szállító által javasolt módon. A DNS-t etanollal kicsapjuk, újra szuszpendáljuk 500 μΐ 25 mM trisz.HCl-ban (pH=8,5) és 2 mM magnéziumkloridban (EcoRI+ puffer) [Meyer, H.: FEBS Lett., 90, 341, (1979)], és EcoRI-vei (Boehringer gyártmány) emésztjük, amíg a DNS-fragmentumok méret szerinti eloszlása legfeljebb 30-50 kilobázis tartományban mozog (a λ DNS Xhol-el végzett emésztése megfelelő 33 kilobázisos és 17 kilobázisos markereket eredményez). Az EcoRI+ körülmények között emésztett élesztő DNS-t méret szerint frakcionáljuk egy szukróz gradiensen [5-20% szukróz 10 mM trisz x HCl-ban (pH=7,5), és 1 mMEDTA-ban] 6 órát 38 ezer/perc fordulatszámon egy SW 40 rotorban. A gradiens tetejéről 30, egyenként 0,4 ml-es frakciót szedünk. A 16. frakció 30-40 kilobázis méretű DNS-fragmentumokat tartalmaz. Ennek a fragciónak a DNS-ét (3 μg) etanollal kicsapjuk és 16 órát ligáljuk 15 ’C-on 15 μΐ teljes térfogatban, egy pYcl kozmid vektor 1 μg-jához [Hohn, B. és munkatársai: Genetic Engineering, 2. kötet, 169. oldal, New York, (1980)], amelyet EcoRI-vei linearizáltunk. A ligálást 300 egység T4 DNSligázzal (New England Biolabs gyártmány) végezzük, a szállító által ismertetett pufferrendszert alkalmazva. A DNS-t in vitro becsomagoljuk λ-bakteriofágba [Hohn, B.: Methods in Enzimology, 68. kötet, 299. oldal, New York, (1979)] és az így létrehozott kapcsolt fágokat az E. coli HB101 törzs transzdukálására használjuk (rj[ mMA%-40-|, leu-, pro, recA). A transzdukció hatékonysága körülbelül 5000 ampicillinrezisztens telep a pYcl vektor 1 μg-jára számítva.
3000 ampR telepet kiválasztunk és egyénileg tenyésztünk mikrotitráló edények üregeiben LB közegen [10 g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto élesztőextraktum (Difco), 10 g nátrium-klorid], amely 100 μg/ml ampicillint tartalmaz.
b) Az élesztő GAPDH-gén elkülönítése
A fent leírt géntárat egy szintetikus oligonukleotiddal [előállítása a foszfátriészter módszer alkalmazásával; Itakura, K. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 97, 7327, (1975); de Rooij, J.F.M. és munkatársai: Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 98, 537, (1979)] screen-eljük, amelynek szerkezete a következő; 5’GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3’. Az oligonukleotid 10 pg-ját kinázzal kezeljük 10 μΐ γ32 P-ATP-t (3000 Ci/mmól, 10 pCI/μΙ, Amersham gyártmány) alkalmazva, T4 polinukleotid-kináz (Boehringer gyártmány) felhasználásával, 50 μΐ teljes térfogatban, Maniatis és munkatársai módszerével [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratórium, 125. oldal, (1982)]. A telephibridizálást ugyanennek a szerzőnek a módszerével végezzük (312. oldal). A pozitív kiónokat autoradiográfiásan mutatjuk ki, Kodak X-5 röntgenfilmet alkalmazva. A plazmid DNS elkülönítése (vö. 100 561. számú európai szabadalmi bejelentés) egy olyan hibrid kiónt eredményez, amely egy 2100 bázispámyi, GAPDH-t kódoló Hindül-fragmentumot [Holland, J.P. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 254, 9839. oldal, (1979)] tartalmaz. A klónozott DNS azonosságának végső bizonyítékát a DNS-szekvenálási kísérlet szolgáltatja a fent említett oligonukleotidot, a didezoxiszekvenálási eljárással együtt alkalmazva, G. F. Hong kétfonalas DNS-re vonatkozó leírása szerint [Bioscience Reports, 1, 243, (1981)]. A klónozott GAPDH-gén szekvenciája azonos a pgap491-ével, amit Holland és munkatársai ismertetnek [J. Bioi. Chem., 255, 2596, (1980)].
c) GAPDH downstream promoter alkotórészek előállítása (2. és 3. ábra)
A GAPDH-gén ATG-jének -27.--675. pozíciót magába foglaló 649 bázispámyi Taql fragmentumot (lásd 2. ábra) úgy különítjük el, hogy a fent említett hibrid plazmidot Taql-el (New England Biolabs gyártmány) emésztjük, a DNS-fragmentumokat 1,2%-os lágy agaróz gélen elkülönítjük és a DNS-t forró fenollal extraháljuk (vö. 1. példa). A Taql-fragmentum klónozását a pBR322 Clal-helyére végezzük; 1 μg pBR322-t 3 egység Clal-vel (New England Biolabs gyártmány) hasítunk, a szállító által leírt módon. A fenollal kezelt és hasított vektor 300 ng-ját körülbelül 300 ng beékelt DNS-hez (649 bázispámyi Taql fragmentum) ligáljuk, 200 egység T4 DNS-ligázt alkalmazva, 20 μΐ teljes térfogatban [vö. 1. b) példa]. A transzformálást E. coli HBlOl-be végezzük, hogy ampicillinrezisztencia jöjjön létre, a plazmid DNS-t kinyerjük és restrikciós analízissel elemezzük (Taql, Dral). A Taql-fragmentum orientációját a Dral restrikciós endonukieáz alkalmazásával határozzuk meg, kombinációban a plazmidok BamHI-helyével, és kiválasztunk egy olyan plazmidot, amelynek a -675. pozíciójú Taq-helye a pBR322 HindHI-helyéhez közel van. Ezt a plazmidot pBR322/GAPDH-nak nevezzük és BamHI (New England Biolabs gyártmánya) alkalmazásával linearizáljuk, és a Bal31gyel végzett emésztést az 1. példában leírt módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy BglIH-kapcsolókat (5’-CAGATCTG14
HU 211 207 Β
3’, a New England Biolabs gyártmánya) alkalmazunk és az emésztett plazmidot közvetlenül gyűrűssé alakítjuk 5 pg/ml koncentrációban, 20 pl teljes térfogatban. A Bal31-gyel rövidített Taql-fragmentum méretét restrikciós elemzéssel (BglII-t és Hindlü-t használva) határozzuk meg. Kiválasztunk két kiónt, amelyek olyan DNS-fragmentumokat tartalmaznak, amelyek az ATGtől körülbelül 200 és 265 bázispámyira benyúlnak „felfelé” a GAPDH-promoterbe. Mindkét fragmentum tartalmazza a vélelmezett TATA-box-ot körülbelül a -140. bázispámál. Ezek a kiónok még mindig tartalmazzák a replikációs origót a DNS pBR322-ből származó részében, és pGAPDH-F-nek, illetve pGAPDHE-nek nevezzük őket.
d) A downstream GAPDH alkotórész kombinálása a PH05 UASl(PH05)-jével és az eglin C protein kódoló régiójával
I) GAPDH alkotórészek (3. ábra)
Annak érdekében, hogy a GAPDH promoter alkotórészeket kivigyük a -27. pozíciónál levő Taql-helytől a GAPDH-gén ATG-je mellett közvetlenül elhelyezkedő pozícióba, két szintetikus komplementer oligonukleotidot hozunk létre, amelyek szerkezete a következő: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3'
3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'
Ezek az oligonukleotidok biztosítják az eredeti GAPDH promoter szekvenciát a -26. pozíciótól a -5. pozícióig, egy terminális EcoRI-hely létrehozásával. A pGAPDH-E és -F plazmidok 2-2 pg-ját 6 egység Taqlvel emésztjük 50 pl térfogatban, és a kapott elegyeket fenollal kezeljük, etanollal kicsapjuk és 10 pl vízben újra szuszpendáljuk. A szintetikus oligonukleotidokat hőkezeljük mindegyik szimpla fenol 2 pl-ét belekeverve 100 pl olyan oldatba, amely 10 mM trisz x HCl-ot (pH=7,5), 10 mM magnézium-kloridot és 50 mM nátrium-kloridot tartalmaz, az oldatot 3 percre 90 ’C-ra melegítve majd lassan szobahőmérsékletre hűtve (körülbelül 3 óra alatt). A Taql-el emésztett plazmidok mindegyikének 1 pg-ját összekeverjük a hőkezelt oligonukleotidok hússzoros moláris feleslegével 20 pl térfogatban, körülbelül 18 órát, 800 egység T4 DNS-ligáz alkalmazásával. A teljes elegyet emésztjük 3 egység Bglü-vel (New England Biolabs gyártmány). A DNS-fragmentumokat 1,5%-os lágy agaróz gélen elválasztjuk. A körülbelül 200 bázispámyi, illetve 265 bázispámyi Bglü-EcoRI fragmentumokat kivágjuk a gélből, extraháljuk és etanollal kicsapjuk.
A pGAPDH-E plazmidot BglII-vel és EcoRI-vel emésztjük és a nagy (körülbelül 3,5 kilobázisnyi) fragmentumot elkülönítjük. Ezt a fragmentumot vektorként használjuk a 265 bázispámyi és 200 bázispámyi BglüEcoRI-fragmentumok klónozására, olyan ligálási, transzformálási és plazmid elkülönítési körülményeket alkalmazva, amelyeket fent ismertettünk. Az előállított plazmidokat pGAPDH-EL-nek és pGAPDH-FL-nek nevezzük. A 4. ábrán láthatók a Bglü-EcoRI fragmentumok DNS-szekvenciái pGAPDH-EL-be és pGAPDH-FL-be klónozva. A fragmentumok pontos mérete 266 illetve 201 bázispár.
II) Az UASl(PHOS) szabályozó alkotórész
A p31/Y plazmid (vö. 100 561. számú európai szabadalmi bejelentés) 3 pg-ját 6 egység Clal-gyel (New England Biolabs gyártmány) emésztjük. A 3’ recesszált végeket az E. coli DNS-polimeráz-I Klenow-fragmentumával (Bethesda Research Laboratories) végzett reakcióval töltjük ki, Maniatis fent említett eljárásával. BglII-kapcsolókat (5’-CAGATCTG-3’) adagolunk, amint azt az 1. példában leírtuk. A DNS-t Sall-gyel és BglII-vel (New England Biolabs gyártmány) emésztjük és 1%-os lágy agaróz gélen futtatjuk. Az 548 bázispárnyi fragmentumot kivágjuk a gélből, fenollal kezeljük és etanollal kicsapjuk a fent leírt módon.
Ili) A pJDB207R/PH05-EGL plazmid létrehozása (5. ábra)
Ez a plazmid a forrása egy olyan DNS-fragmentumnak, amely az eglin C kódoló régiójából és a PH05 átírási terminátorból áll.
A) A pJDB2O7 vektor fragmentum elkülönítése
A pJDB207R/IF (a-3) plazmid (100 561. számú európai szabadalmi bejelentés) 6 pg-ját BamHI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztjük. A kapott 6,85 kilobázis és 1,15 kilobázis méretű DNS-fragmentumokat etanollal kicsapjuk és újra szuszpendáljuk 400 pl 50 mM trisz-HCl-ban (pH=8,0). Hozzáadunk 4,5 egység borjú bél alkálikus foszfatázt (Boehringer, Mannheim gyártmány), és az elegyet 37 ’C-on inkubáljuk 1 órát. Ezt követően a foszfatázt inaktiváljuk 65 ‘C-on végzett 1 órás inkubálással. Az oldatot 150 mM nátrium-klorid koncentrációra állítjuk be. A DNS-oldatot felvisszük egy DE 52 (Whatman gyártmány) anioncserélőt tartalmazó 100 pl-es ágyra; az anioncserélőt 150 mM nátrium-kloridot és 1 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM trisz-HCl-dal (pH=7,5) ekvilibráltuk. Ugyanezzel a pufferrel végzett mosás után a DNS-t eluáljuk 400 pl 1,5 M nátrium-klorid, 10 mM trisz-HCl (pH=7,5) és 1 mM EDTA alkalmazásával, és etanollal kicsapjuk. A nagy, 6,85 kilobázis méretű BamHI-fragmentumot a kis fragmentumoktól 0,6%-os, kis olvadáspontú agaróz gélen választjuk el, 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben.
B) Egy 534 bázispámyi PH05 promoter fragmentum elkülönítése
A p31/R plazmid (100 561. számú európai szabadalmi bejelentés) 10 pg-ját EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztjük. A kapott 3 fragmentumot 0,6%-os, kis olvadáspontú agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát pufferben szétválasztjuk; elkülönítünk egy 534 bázispámyi BamHI-EcoRI-fragmentumot, amely tartalmazza az mRNS indítási helyeket magába foglaló PH05 promotert.
C) Egy 221 bázispámyi, az eglint kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-fragmentum elkülönítése
A pML147 plazmid (146 785. számú európai szabadalmi bejelentés) 8 pg-ját BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott 2 DNS-frag15
HU 211 207 B meritumot 0,6%-os, kis olvadáspontú agaróz gélen,
8,3 pH-jú trisz-borát pufferben választjuk szét. A 221 bázispárnyi fragmentumot elkülönítjük.
D) DNS-fragmentumok ligálása fent leírt [3. d) ΙΠ.Α-C példák], megfelelő ragadós végekkel rendelkező DNS-fragmentumot egy reakcióban ligálun: a ligáláshoz 0,1 pmól (0,45 pg) 6,85 kilobázisnyi BamHI vektor fragmentumot, 0,2 pmól (70 ng) 534 bázispámyi BamHI-EcoRI PH05 promoter fragmentumot és pML147 221 bázispárnyi EcoRI-BamHI-fragmentumának 0,2 pmól-ját (29 ng) használjuk.
Mindhárom DNS-ffagmentum alacsony olvadáspontú agaróz kis gélblokkjaiban helyezkedik el. A 3 agaróz gél darabkát összekeverjük, 65 C-on elfolyósítjuk és kétszer hígítjuk. A ligálást 270 pl 60 mM triszHC1 (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT és 1 mM ATP teljes térfogatában végezzük 16 egység T4 DNS-ligázzal (Boehringer, Mannheim) 15 °C-on 16 órát. A ligálási elegy 10 pl-es alikvot részét hozzáadjuk 100 pl-nyi, kalciummal kezelt, transzformálásra alkalmas E. coli HB101 sejthez.
különálló transzformált, ampR telepet tenyésztünk 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegen. Plazmid DNS-t állítunk elő Holmes és munkatársai módszere szerint [Anal. Biochem. 114, 193, (1981)] és HindlII/EcoRI kettős emésztéssel elemezzük. A 600 bázispárnyi EcoRI-HindlII fragmentum megjelenése azt mutatja, hogy a szóbanforgó klón a megfelelő orientációban tartalmazza a PH05 promoter - eglin C DNS-fragmentum részt az expressziós vektorba beékelve. Amint azt vártuk, a kiónok körülbelül 50%-a tartalmazza a beékelt részt ahelyes orientációban. E kiónok egyikét elkülönítjük és pJDB207R/PH05-EGLnek nevezzük el.
A pJDB207R/PH05-EGL plazmid 6 pg-ját Hindül és Sáli restrikciós endonukleázokkal teljesen emésztjük. A nagy, 6,1 kilobázisnyi (vektorrész) fragmentumot elkülönítjük lágy agaróz gél elektroforézissel, fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással. A vektor DNS-t 20 pl vízben újra szuszpendáljuk. Az eglin fragmentumot úgy hozzuk létre, hogy pJDB207R/PH05EGL-t HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztjük. A kapott 600 bázispárnyi fragmentumot lágy agaróz gél elektroforézissel választjuk el, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Az eglin fragmentumot újra szuszpendáljuk 20 pl vízben.
ÍV A fragmentumok ligálása UAS1(PHO5) alkotórészek alkalmazásával (6. ábra)
A ligálást a következő 4 komponens felhasználásával végezzük: 0,5 g 6,1 kilobázisnyi Hindül-Sall vektor fragmentum, 100 ng 600 bázispárnyi EcoRI-HindlII eglin C fragmentum, 200 ng 266 bázispárnyi BglIIEcoRI fragmentum (pGAPDH-EL-ből) és 100 ng UASl(PH05)-öt magába foglaló 548 bázispárnyi SallBglII fragmentum. A ligálást a fent leírt módon hajtjuk végre. Az E. coli HB101 transzformálását ampicillin rezisztenciára, a plazmid elkülönítést és a pozitív kiónok restrikciós elemzését a korábban leírt módon hajtjuk végre, Hindin, EcoRI, BglH és Sáli restrikciós endonukleázokat alkalmazva. Egy pozitív kiónt kiválasztunk és pJDB207/PAPEL-EGL (UASl)-nek nevezzük el.
Analóg módon járunk el a pGAPDH-FL 201 bázispárnyi BglII-EcoRI fragmentumával. A kapott plazmidot pJDB207/PAPFL-EGL (UASl)-nek nevezzük.
V Hibridek létrehozása UAS1(PHO5) és
UAS2(PH05) alkotórészekkel
A IV. részben előállított plazmidok 3 pg-ját BglHvel emésztjük. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t vízben újra szuszpendáljuk. A 3’ receszszált végeket Klenow DNS-polimerázzal töltjük ki, amint azt a II. részben ismertettük. A plazmidokat 70 C-ra melegítjük 10 percig az enzim inaktiválására. Sall-gyel (Biolabs gyártmány) végzett emésztés után a nagy fragmentumokat (körülbelül 7,2 kilobázis) lágy agaróz gél elektroforézissel és fenolos extrakcióval különítjük el, és az etanollal kicsapott DNS-t vízben újra szuszpendáljuk.
A p31/Y plazmidot hasonló módon emésztjük BstEHvel, DNS-polimerázzal (Klenow-fragmentum) kezeljük és Sall-gyel hasítjuk. A 651 bázispárnyi fragmentumot a fent leírt módon elkülönítjük. A fenti vektor DNS-ek 200 ng-jának ligálása a 651 bázispárnyi fragmentumhoz a következő plazmidokat eredményezi:
pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1+UAS2) (magába foglalja a pGAPDH-EL 266 bázispárnyi BglII-EcoRI fragmentumát), pJDB207/PAPFL-EGL (UAS1+UAS2) (magába foglalja a pGAPDH-FL 201 bázispárnyi BglII-EcoRI fragmentumát).
4. példa
a) Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformálása
A 3. d/IV. és 3.d/V. példák 4 plazmidjának mindegyikét bevisszük Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzsbe (a, his3—11, his3-15, leu2-3, leu2-l 12, canR), a Hinnen és munkatársai által leírt transzformációs előiratot [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, (1978)] követve. A transzformált élesztősejteket leucinhiányos élesztő minimum tápközeg lemezein választjuk szét. A különálló transzformált élesztőtelepeket elkülönítjük és Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1), /PAPEL-EGL (UAS1+UAS2) és PAPFL-EGL (UAS1+UAS2) elnevezéssel hivatkozunk rájuk.
b) A transzformánsok fermentálása
A 4 S. cerevisiae GRF18 transzformáns mindegyikének sejtjeit 10 ml élesztő minimum tápközegben (Difco Yeast Nitrogén Base, aminosavak nélkül, 2% glükóz és 20 mg/1 L-hisztidin hozzáadásával) tenyésztjük 50 ml-es Erlenmeyer lombikban rázatás közben 30 C-on 24 óra hosszat, 3 x 107 sejt/ml sűrűségig. A sejteket 0,9%-os nátrium-klorid oldattal mossuk és egy magas Pj közeg (mint fent) és egy alacsony P, minimum tápközeg 50-50 ml-ének inokulálására használjuk; ez utóbbit a Difco Yeast Nitrogén Base tápközeg receptje alapján készítjük (aminosavak nélkül), 0,03 g/1
HU 211 207 Β kálium-dihidrogén-foszfáttal, 1 g/1 kálium-kloriddal, 10 g/1 L-aszparaginnal ammónium-szulfát helyett, 2% glükózzal és 1 g/1 L-hisztidinnel. A közeget 0,03-as kezdeti optikai sűrűségre (600 nm-en mérve) inokuláljuk. A sejteket 500 ml-es lombikban tenyésztjük 30 ‘C-on 24 órát (optikai sűrűség 600 nm=l,8 az alacsony Pi tápközegre, optikai sűrűség 600 nm=3,0 a magas P, tápközegre).
C) Az eglin C literek meghatározása
Amikor a sejtek elérték a fent megadott sejtsűrűséget (optikai sűrűséget), azokat kinyerjük, centrifugáljuk és üveggyöngyökkel elroncsoljuk. Az elegyek eglin aktivitását meghatározzuk az emberi leukocita elasztáz gátlásának mérésével U. Seemüller és munkatársai módszerével [Hoppe-Seyler’s Z. Physiol, Chem., 358, 1105, (1977)]. A következő aktivitásértékeket kaptuk:
S. cerevisiae extraktum eglin C aktivitás (mg/l/a tenyészet optikai sűrűsége)
indukált (alacsony Pj) nem indukált (magas R)
pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1) 14 0,7
pJDB207/PAPFL-EGL (UAS1) 17 0,7
pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1 +UAS2) 14 1
pJDB207/PAPFL-EGL (UAS1 + UAS2) 11 07
5. példa
Deszulfátohirudin expressziója a PH05-GAPDH hibrid promoter szabályozása alatt
I. A nukleotidszekvencia módosítása a deszulfátohirudin HV1 gén 5 ’-végén
A deszulfátohirudint kódoló nukleotidszekvencia (vö. 168 342. számú európai szabadalmi bejelentés) GTT-vel kezdődik, ami a végső géntermék NH2-terminális valin aminosavának felel meg. Az E. coli-ban való egyszerű szubklónozáshoz és expresszióhoz a kódoló szekvenciát 5’-végén meghosszabbítjuk 8 nukleotiddal, amelyben egy EcoRl restrikciós hely és egy ATG indftókodon is van. Ezeket a hozzáépített nukleotidokat el kell távolítani a hirudin kódoló szekvenciának a PH05 jelzőpeptidet kódoló szekvenciához való pontos kereten belüli fúziójához. Ezt úgy érjük el, hogy az EcoRl restrikciós helyet egy síkban levő véghellyé alakítjuk át, egy szintetikus oligonukleotid hozzáadásával, amely olyan pozícióban tartalmazza a Hgal felismerőhelyet, hogy az ezt követően Hgal-gyel végzett hasítás közvetlenül a GTT-kodontól „felfelé” megy végbe.
Egy Hgal restrikciós hely bevitele a deszulfátohirudin gén elé (7. ábra) pg pML310 plazmidot (168 342. számú európai szabadalmi bejelentés) EcoRl restrikciós endonukleázzal teljesen emésztünk. A DNS-t (pML310/EcoRI) fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Az 5’ túlnyúló végeket Sl-nukleázzal eltávolítjuk. 4 pg pML310/EcoRI DNS-t 100 pl 250 mM nátrium-klorid, 1 mM cink-szulfát, 30 mM nátriumacetát (pH=4,6) jelenlétében emésztünk 20 egység/ml Sl-nukleázzal (Sigma gyártmány) 45 percig 37 ‘C-on.
A DNS-t fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t (pML130/EcoRI/Sl) újra szuszpendáljuk 10 pl 50 mM trisz-Hcl-ban (pH=8,0) és 2 egység borjú bél alkálikus foszfatázzal (CIAP, Boehringer gyártmány) inkubáljuk 1 óra hoszszat 37 ‘C-on. Az enzimet 65 ’C-on, 1,5 óra hosszat inaktiváljuk.
Az inkubált elegy nátrium-klorid koncentrációját 150 mM-ra állítjuk be. A defoszforilezett DNS-t (pML310/EcoRI/Sl/CIAP) adszorpcióval tisztítjuk DE52 (Whatman gyártmány) ioncserélő oszlopon, kis sótartalmú pufferben [150 mM nátrium-klorid, 10 mM trisz-HCl (pH=8,0) ImM ADTA], majd egy nagy sótartalmú pufferoldattal [1,5 M nátrium-klorid, 10 mM trisz-HCl (pH=8,0), 1 mM EDTA] eluáljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és vízben újra szuszpendáljuk 0,8 g/ml koncentrációban.
Egy 5’-AGCGTCGACGCT-3’ képletű oligonukleotidot állítunk elő a foszfotriészter módszerrel [Italaira és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 103, 706, (1981)]. Az oligonukleotid szekvenciája önkiegészítő és tartalmazza a -GACGC-felismerőhelyet a Hgal restrikciós endonukleázhoz. A két szimpla fonal melegítése egy 12 bázispárnyi kétfonalas DNS-kapcsolót eredményez.
A szintetikus egyfonalas oligodezoxi-nukleotid 1,2 pg-ját foszforilezzük 10 pl 60 mM trisz-HCl-ben (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid 5 mM DTT, 30 pCi [y32P] ATP (3000 Ci xmmól1), (Amersham gyártmány jelenlétében 6 egység T4 polinukleotid-kinázzal (Boerringer gyártmány) 30 percig 37 ‘C-on, majd 15 percig 37 ‘C-on 0,5 mM ATP jelenlétében. Az elegyet tovább inkubáljuk 10 percig 75 ’C-on az enzim inaktiválására, majd a hőkezelésre hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. 0,6 pg (170 pmól) 32P-jelzett kapcsoló DNS-t összekeverünk 2,4 pg (1,75 pmól végek) pML310/EcoRI/Sl/CIAP-vei és 20 pl 60 mM triszHCl-ben (pH=7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT és 3,5 mM ATP jelenlétében ligáljuk 800 egység T4 DNS-ligázzal (Biolabs gyártmány) 20 órát 15 ’Con. A ligázt 85 ’C-on 10 percig inaktiváljuk és a kapcsolómolekulák feleslegét eltávolítjuk a DNS kicsapásával 10 mM EDTA (pH=7,5), 300 mM nátrium-acetát (pH=6,0) és 0,54 térfogatrész izopropanol jelenlétében. 30 percnyi szobahőmérsékleten tartás után a DNS-t pelletezzük, újra szuszpendáljuk 45 pl ligáló elegyben (fent ismertettük) és 6 órát ligáljuk 15 'C-on gyűrűs DNS kialakítására.
A ligáló elegy 1 pl-es és 3 pl-es alikvot részeit hozzáadjuk 100 pl-nyi kalciummal kezelt, transzformálható E. coli HB101 sejthez [előállítása D. Hanahan módszerével, J. Bioi. Chem., 166, 557, (1983)]. A sejteket 30 percig jégen hagyjuk, majd 3 percig 42 ‘C-on inkubáljuk, jégen hűtjük 2 percig, majd 1 órát inkubál17
HU 211 207 B juk 37 °C-on 400 μΐ SOC közegben. A sejtmintákat egyenként 100 pl-re töményítjük be és LB agarlemezekre helyezzük, amelyek 50 μg/ml ampicillint tartalmaznak.
transzformált, ampR telepet tenyésztünk különkülön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben. Plazmid DNS-t állítunk elő D.S. Holmes és munkatársai módszere szerint [Anal. Biochem., 114, 193, (1981)]. A szintetikus oligonukleotid kapcsoló jelenlétét DNS-szekvenálással erősítjük meg, printerként egy olyan egyfonalas DNS-fragmentumot alkalmazva, amely a hirudin kódoló fonalára hibridizálódik. Egy a kapcsoló DNS-t helyes pozícióban, a hirudin gén előtt tartalmazó kiónt pML310L-nek nevezünk.
II. A PH05 jelzőszekvencia és a deszulfátohirudin struktúrgén összeolvasztása
a) A 0,2 kilobázisnyi deszulfátohirudin fragmentum (7. ábra) elkülönítése pg pML310L plazmidot teljesen emésztünk BamHl és Pvul restrikciós endonukleázokkal. A DNS fenol és kloroform elegyével végzett extrakciója és etanolos kicsapása után a két restrikciós fragmentumot elválasztjuk 1,2%-os agaróz gélen 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTApufferben. Az etidium-bromiddal megfestett 0,84 kilobázisnyi Pvul-BamHI fragmentumot egy gélszeleten különítjük el. A DNS-t elektromos úton eluáljuk egy dializáló zacskóban, amely 3 ml 0,2 x TBE pufferrel van megtöltve. A zárt zacskót 8,3 pH-jú TBE pufferbe (90 mM trisz bázis, 90 mM bórsav, 2,5 mM ADTA) merítjük. 30 percig 100 mA áramot vezetünk át, majd az áram polaritását 45 másodpercre megfordítjuk, hogy a DNS-t eltávolítsuk a dializáló membránból. Kinyerjük a puffért, amely körülveszi a gélszeletet a dializáló edényben, nátrium-klorid koncentrációját 150 mM-ra állítjuk be és átengedjük egy DE52 (Whatman gyártmány) ioncserélő oszlopon. A DNS-t nagy sótartalmú pufferrel [1,5 M nátrium-klorid, 10 mM trisz-HCl (pH=8,0), 1 mM EDTA)] eluáljuk, etanollal kicsapjuk és újra feloldjuk vízben, 0,1 mg/ml koncentrációban.
A pML310L 0,84 kilobázisnyi Pvul-BamHI fragmentumát tovább emésztjük Hgal restrikciós endonukleázzal. Ez az emésztés egy 198 bázispárnyi HgalBamHI fragmentumot eredményez, amely tartalmazza a kész deszulfátohirudin teljes kódoló szekvenciáját. Az Alul-gyel végzett további emésztés nem változtatja meg a 198 bázispárnyi Hgal-BamHI fragmentumot, de eltávolítja a többi hasonló méretű Hgal fragmentumot.
A 0,2 kilobázisnyi Hgal-BamHI fragmentumot a többi fragmentumtól 1,5%-os agaróz gélen TBE pufferben választjuk el és elektromos úton végrehajtott eluálással (amint fent leírtuk) különítjük el. A DNS-t DE52 ioncserés kromatográfiával és etanolos kicsapással tisztítjuk. A DNS-t újra szuszpendáljuk vízben 30 pg/ml koncentrációban (0,2 pmól/ pl),
b) A PH05 promoter régió elkülönítése a PH05 jelzőszekvencia egy részével együtt (8. ábra)
A p31/PHO5-TPA18 plazmid (vö. 143 081. számú európai szabadalmi bejelentés) egy idegen struktúrgén (t-PA) keretében olvasztva tartalmazza a PH05 promotert és a PH05 jelzőszekvenciát. Egy 584 bázispárnyi BamHI-Ball fragmentum tartalmazza a PH05 promotert és a teljes PH05 jelzőszekvenciát, kivéve 8 nukleotidot a 3’-végen.
pg p31/PHO5-TPA18 DNS-t emésztünk Ball restrikciós endonukleázzal (16 óra 37 °C-on). A DNS-t fenol és kloroform elegyével extrahálva és etanollal kicsapva tisztítjuk. A DNS-t vízben újra szuszpendáljuk 0,7 mg/ml koncentrációban.
A megfelelő összekapcsolást a PH05 jelzőszekvencia és a deszulfátohirudint kódoló régió között egy (1) 5’-CCAATGCA-3’ (2) 3’-GGTTACGTCAACA-5’ képletű szintetikus kapcsoló biztosítja.
A kapcsoló 5’-végén 8 nukleotid (5’-CCAATGCA) a PH05 jelzőszekvencia részét képezi a Ball-helytől az átalakítási helyig. A (2) oligonukleotid 5’-végen túlnyúló 5 nukleotidja beleillik a Hgal hasítóhelybe a deszulfátohirudint kódoló szekvencia végén.
Az (1) és (2) egyfonalas egyedi nukleotidokat a foszfotriészter módszenei [Itakura és munkatársai fent hivatkozott módszere] állítjuk elő. 1,1 pg (1) nukleotidot és 1,8 pg (2) nukleotidot külön-külön foszforilezünk 5’-végükön, ekvimoláris arányban összekeverjük és az 5.1. példában leírt módon hőkezeljük őket.
A foszforilezett, kétfonalas kapcsoló DNS 1,3 pgját (200 pmól) 7 pg (1,8 pmól) Ball-gyel hasított p31/PH05-TPA18-hoz ligáljuk 40 pl 60 mM trisz-HCl (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT és 1400 egység T4 DNS-ligáz (Biolabs gyártmány) jelenlétében 15 °C-on 16 óra hosszat. A ligázt 10 percig inaktiváljuk 85 °C-on. A kapcsolók feleslegét a DNS-kicsapásával távolítjuk el 10 mM EDTA, 300 mM nátrium-acetát (pH=6,0) és 0,54 térfogatrész izopropanol jelenlétében. A DNS-t újra szuszpendáljuk és tovább emésztjük BamHl restrikciós endonukleázzal. A DNS fenol és kloroform elegyével végzett extrahálása és etanolos kicsapása után a két restrikciós fragmentumot 1,2%-os agaróz gélen,
8,3 pH-jú Trisz-borát-EDTA pufferben szétválasztjuk. A 0,6 kilobázisnyi fragmentumot elkülönítjük a gélből. A DNS-t elektromos úton eluáljuk és tovább tisztítjuk DE52 ioncserés kromatográfiával és etanolos kicsapással. A 0,6 kilobázisnyi BamHI-Hgal DNS-fragmentumot vízben újra szuszpendáljuk 40 pg/ml koncentrációban.
c) Egy’ pJDB207 élesztő vektor fragmentum elkülönítése (8. ábra)
A pJDB207R/PH05-TPA (12-2) plazmid (143 081. számú európai szabadalmi bejelentés) DNS-ének 9 pgját BamHl restrikciós endonukleázzal emésztjük. A teljes emésztés után a DNS-t extraháljuk fenol és kloroform elegyével és etanollal kicsapjuk. A DNS-t újra szuszpendáljuk 50 mM trisz-HCl-ban (pH=8,0), 0,1 mg/ml koncentrációban, és 7 egység borjú bél alkálikus foszfatázzal emésztjük 1 óra hosszat 37 'C-on. A foszfatázt inaktiváljuk 1,5 óra hosszat 65 *C-on és a DNS-t DE52 ioncserés kromatográfiával és etanolos
HU 211 207 Β kicsapással (vö. 5.1. példa) tisztítjuk. A 6,8 kilobázis nagyságú BamHI fragmentumot elválasztjuk 1,2%-os agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben. A DNS-t elektromosan eluáljuk és DE52 ioncserés kromatográfiával és etanolos kicsapással tisztítjuk. A DNS-t vízben oldjuk 0,4 mg/ml koncentrációban (0,1 pmól/ pl).
d) A PH05 promoter fragmentum és a deszulfátohirudin strukturgén ligálása a pDJB207 élesztő vektorfragmentumhoz (8. ábra)
A pDJB207 élesztő vektort, a PH05 promoter fragmentumot a PH05 jelzőszekvenciával és a deszulfátohirudin strukturgént egyaránt DNS-ffagmentumok formájában [vö. 5.II. a)-c) példa] különítjük el, amelyeket egy expressziós plazmid képzésére ligálunk.
A p31/PH05-TPA18 0,6 kilobázisnyi BamHI-Hgal fragmentumának 0,3 pmól-ját és a pML310L 0,2 kilobázisnyi Hgal-BamHI-fragmentumának 0,3 pmól-ját a pJDB207/PH05-TPA (12-2) 6,8 kilobázisnyi BamHI fragmentumának 0,1 pmól-jához ligáljuk 10 pl 60 mM trisz-HCl (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 1 mM ATP és 400 egység T4 DNS-ligáz jelenlétében 20 óra hosszat 15 ”C-on.
A ligálási elegy 1 μΐ-nyi alikvot részét hozzáadjuk 100 μΐ transzformálásra alkalmas E. coli BH101 sejthez, amelyeket Hanahan fent említett módszere szerint állítottunk elő. A transzformálási előiratot is ebből a közleményből vettük át. A sejteket 500 μg/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezekre telepítjük.
ampR telepet tenyésztünk külön-külön LB tápközegen, 100 pg/ml ampicillinnel. A plazmid DNS méretét és a beékelt rész helyzetét Pstl restrikciós endonukleázzal végzett hasítással határozzuk meg. Azt a kiónt, amelyik a beékelt részt helyes orientációban tartalmazza, pJDB207/PH05-HIR-nek nevezzük.
III. A pJDB207/PH05(Eco)-H/R plazmid előállítása (9. ábra)
Az UAS(PH05)-GAPDH hibrid promoter alkotórészek megfelelő csatlakoztatására a deszulfátohirudin PH05 jelzőszekvenciát is tartalmazó kódoló régiójához (mint a pJDB207)PH05-HIR plazmidban) egy EcoRI hasítóhelyet viszünk be az 5’ le nem fordított régióba az mRNS indítóhelyek és a kódoló régió ATG-je közé.
pg pJDB207/PHO-HIR plazmidot Dral restrikciós endonukleázzal (Boehringer gyártmány) emésztünk. A kapott 4 fragmentumot 0,8%-os agaróz gélen különítjük el 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben. A 4,2 kilobázisnyi DNS-fragmentumot kinyerjük a gélből, elektromosan eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t újra szuszpendáljuk vízben 0,6 mg/ml koncentrációban.
Az 5’-AATTGCATTACCAATGTTT-3’ szintetikus oligonukleotid 2,3 pg-ját illetve a 3’-<jCTAATGGTTACAAA-5’ képletű szintetikus oligonukleotid 2,9 pg-ját kinázzal kezeljük 20 pl 60 mM íriszben (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP és 20 egység T4 polinukleotid-kináz (Boeh ringer gyártmány) jelenlétében. 45 perc múlva 'C-on a két reakcióelegyet egyesítjük, 10 percre
75’C-ra melegítjük és hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. A hőkezelt oligonukleotid kapcsolót -20 ’C-on tároljuk.
A 4,2 kilobázisnyi Dral DNS-fragmentum 6,5 pgját (2,3 pmól) 16 órát inkubáljuk 15 ’C-on a kinázzal és hővel kezelt oligonukleotid kapcsoló hetvenszeres feleslegének jelenlétében, 50 pl 60 mM trisz-szel (pH=7,5), 10 mM magnézium-kloriddal, 5 mM DTTvel, 3,5 mM ATP-vei és 800 egység T4 DNS-ligázzal (Biolabs gyártmány). A T4 DNS-ligázt 10 percig inaktiváljuk 85 ’C-on, majd a kapcsolók feleslegét a DNS kicsapásával távolítjuk el 10 mM EDTA, 300 mM nátrium-acetát (pH=6,0) és 0,54 térfogatrész izopropanol jelenlétében. A DNS-t EcoRI-gyel és Hindül-mal emésztjük. A kapott fragmentumokat 1 %-os agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben választjuk szét. A 643 bázispámyi fragmentumot a gélből elektromos eluálással és etanolos kicsapással távolítjuk el. A DNS-t újra szuszpendáljuk 0,1 pmól/ pl koncentrációban. Az EcoRI-HindüI fragmentum tartalamzza a PH05 jelzőszekvenciáját, a deszulfátohirudint kódoló szekvenciát és a PH05 átírási terminátort.
Az 534 bázispámyi PH05 promoter fragmentumot a p31/R plazmidból különítjük el (100 561. számú európai szabadalmi bejelentés).
pg p31/R-et EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal hasítunk. A kapott 3 fragmentumot 0,6%os, kis olvadáspontú agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben választjuk szét. Elkülönítünk egy 534 bázispámyi BamHI-EcoRI fragmentumot, amely tartalmazza PH05 promotert, beleértve az mRNS indítóhelyeket is.
A vektor fragmentumot a pJDB207/PH05-HIR plazmidból különítjük el. Ennek a plazmidnak 6 pg-ját BamHI-gyel és HindlII-mal emésztjük. A nagy, 6,5 kilobázisnyi BamHI-Hindlü fragmentumot a kis fragmentumtól 0,6%-os, kis olvadáspontú agaróz gélen,
8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferrel választjuk el.
Három fent leírt, megfelelő ragadós végekkel rendelkező DNS-fragmentumot ligálunk a következő reakcióban: a PH05 promoter 534 bázispámyi BamHIEcoRI fragmentumának 0,2 pmól-ját (70 ng), a 643 bázispámyi EcoRI-Hindlü fragmentum (hirudin kódoló szekvencia) 0,2 pmól-ját (85 ng) és a 6,5 kilobázisnyi BamHI-HindlII vektor fragmentum 0,1 pmól-ját (0,4 pg) ligáljuk 10 pl 60 mM trisz-ben (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 1 mM ATP és 400 egység T4 DNS-ligáz jelenlétében 6 órát 15 ’C-on. A ligálási elegy 1 pl-nyi alikvot részét hozzáadjuk 100 pl-nyi, kalciummal kezelt, transzformálásra alkalmas E. coli HB101 sejtekhez.
transzformált, ampR telepet tenyésztünk különkülön, 100 pg/ml amplicillint tartalmazó LB közegen. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai módszerével állítjuk elő [Anal. Biochem., 114, 193, (1981)], és az EcoRI és BamHI restrikciós emésztési termékek elemzése alapján vizsgáljuk. Egy a várt restrikciós fragmentumokat eredményező gént elkülönítünk és pJDB207/PH05(Eco)-HIR-nek nevezünk el.
HU 211 207 Β
IV. Az UAS1(PHO5)-GAPDH hibrid promoterek ligálása a deszulfátohirudin protein kódoló régiójához gg pJDB207/PH05(Eco)-HIR plazmidot EcoRIgyel és HindlII-mal emésztünk. A DNS-fragmentumokat 1%-os agaróz gélen választjuk szét 8,3 pH-jú triszborát-EDTA pufferben.
A 643 bázispámyi fragmentumot elkülönítjük a gélből, elektromosan eluáljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t újra szuszpendáljuk vízben 0,1 pmól/μΙ koncentrációban.
μg pJDB207/PH05-HIR plazmidot teljesen emésztünk Hindin és Sáli restrikciós endonukleázzal. A nagy, 6,3 kilobázisnyi fragmentumot (vektorrész) lágy gél elektroforézissel, fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással különítjük el. A vektor DNS-fragmentumot vízben újra szuszpendáljuk 0,05 pmól/μΙ koncentrációban.
μg pGAPDH-EL plazmidot (vö. 3. d/I. példa) Bglll-vel és EcoRI-gyel emésztünk. A 266 bázispárnyi BglII-EcoRI fragmentumot 1,2%-os agaróz gélen,
8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben választjuk el, elektromosan eluáljuk a gélből és etanollal kicsapjuk. A DNS-t újra szuszpendáljuk vízben 0,3 pmól/μΙ koncentrációban.
Az UASl(PH05)-öt tartalmazó 548 bázispárnyi Sall-BglII fragmentum (3. d/11. példa) 0,3 pmól-ját, a pGAPDH-EL 266 bázispárnyi BglII-EcoRI fragmentumának 0,3 pmól-ját, a pJDB207/PH05(Eco)-HIR 643 bázispárnyi EcoRI-HindlII fragmentumának 0,3 pmól-ját és a 6,3 kilobázisnyi Sall-HindlII vektor fragmentum 0,12 pmól-ját ligáljuk 20 μΐ 60 mM trisz-ben (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 1 mM ATP és 400 egység T4 DNS-ligáz (Biolabs gyártmány) jelenlétében 6 órát 15 °C-on. A ligálási elegy 1 μΐ-nyi és 3 μΐ-nyi alikvot részeit 100 μΐ-nyi kalciummal kezelt, E. coli HB101 sejtekhez adjuk. Az ampR telepekből a plazmid elkülönítését és a restrikciós elemzést Sáli, BglII, EcoRI és Hindin alkalmazásával a fent leírt módon hajtjuk végre (3. d/III. példa). Egy pozitív kiónt kiválasztunk és pJDB207/PAPEL-HIR(UASl)-nek nevezzük el. Analóg módon járunk el a pGAPDH-FL-ből elkülönített 201 bázispárnyi BglII-EcoRI-fragmentummal. Egy kiválasztott plazmidot pJDB207/PAPFLHIR(UASl)-nek nevezünk el.
V. UASl(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH hibrid promoterek ligálása a deszulfátohirudin protein kódoló frakciójához
A pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) és a pJDB207/PAPFL-HIR(UAS 1) plazmidok 3-3 μg-ját Bglll-vel emésztjük. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS 3’ recesszált végeit E. coli DNSpolimerázával (Klenow-fragmentum; Bethesda Research Laboratories) végzett reakcióval töltjük ki Maniatis és munkatársai fent hivatkozott módszerével. Az enzimet 70 ’C-on Ínaktiváljuk 10 percig. A DNS-eket Sall-gyel tovább emésztjük és a nagy, 7,2 kilobázisnyi fragmentumot lágy agaróz gél elektroforézissal, fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással különítjük el. Mindegyik fragmentumot újra szuszpendáljuk vízben 0,05 pmól/ μΐ koncentrációban. A fragmentumok tartalmazzák a hirudint kódoló régiót, a legtöbb vektor szekvenciát és a pGAPDH-EL-ből vagy pGAPDH-FL-ből elkülönített 2 promoter alkotórész bármelyikét.
A p31/Y plazmidot (100 561. számi európai szabadalmi bejelentés) BstEII-vel emésztjük, E. coli DNS-plimerázzal (Klenow-fragmentum) inkubáljuk a fent leírt módon és Sall-gyel hasítjuk. A 649 bázispárnyi fragmentumot lágy agaróz gélen elválasztjuk és fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással kinyerjük.
A p31/Y 649 bázispárnyi fragmentumának - amely tartalmazza az UASl-UAS2(PH05) promoter alkotórészt - 0,3 pmól-ját és a 7,2 kilobázisnyi fragmentumok bármelyikét ligáljuk és E. coli HBlOl-be transzformáljuk a fent leírt módon. Az ampR telepekből plazmidokat állítunk elő és a restrikciós emésztéssel nyert termékek alapján vizsgáljuk őket. Egyes kiónokat kiválasztunk és plazmid DNS-üket pJDB207/PAPELHIR(UASl+UAS2)-nek és pJDB207/PAPFLHIR(UASl+UAS2)-nek nevezzük el.
6. példa
Egy 31 bázispámyi DNS-szekvencia hatékony mint foszfatáz szabályozó alkotórész A PH05 promoter upstream régiójának egy 31 bázispárnyi szekvenciája (a -381. - -351.), amelyet a közrefogó Δ10 és Δ13 deléciók határoznak meg (vö. 1. f/ példa) tartalmazhat egy szabályozó szignált. Ezt meg lehet vizsgálni úgy, hogy a következő két komplementer oligonukleotidot állítjuk elő kémai úton:
5'-AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG-3'
3'-GCTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGTCTTAA-5'
Ez a szekvencia tartalmazza az EcoRI hasítóhelyek által körülvett 31 bázispámyi szekvenciát. Az EcoRIhelyek megkönnyítik a szekvencia polimerizálását multimerek képzésére.
a) A 31 bázispámyi alkotórész klónozása az LT98 vektorba
A két szintetikus oligonukleotid 50-50 pmól-ját kinázzal kezeljük 20 ml triszben (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP és 20 egység T4 polinukleotid-kináz (Boehringer gyártmány) jelenlétében. 37 ’C-on végzett 45 perces reakció után a két reakcióelegyet egyesítjük, 10 percig 75 ’C-ra melegítjük és hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. A hőkezelt oligonukleotidokat -20 C-on tároljuk. A kinázzal és hővel kezelt oligonukleotidok 7,5 pmól-ját 30 percig ligáljuk a fent leírt módon (5. III. példa) 15 μΐ teljes térfogatban. Ezután hozzáadunk 5 μΐ (0,075 pmól) EcoRI-gyel hasított LT98 vektor DNS-t [Dixon és munkatársai: Gene, 25, 198, (1983)] és az inkubálást folytatjuk, összesen 6 óráig. Az E. coli HBlOl-be való transzformálás után a plazmidokat elkülönítjük és
HU 211 207 Β
BamHI-gyel végzett emésztéssel elemezzük. Az elemzés adatokat szolgáltat a beékelt rész teljes hosszáról és lehetővé teszi a klónozott EcoRI fragmentumo származnak megbecsülését. 1, 2, 3, 4 vagy 5 EcoRI fragmentumot tartalmazó egyedi plazmidokat választunk ki és DNS-szekvenálásuk (Sanger-módszer) azt mutatja, hogy a 31 bázispámyi alkotórészek „fejtől farokig” orientációban klónozódnak.
b) Klónozás pJDB207-be
A 31 bázispámyi oligomerek promoter szabályozó funkcióját úgy vizsgáljuk meg, hogy beékeljük őket a GAPDH promoter F alkotórészétől „felfelé”. A pJDB2O7/PAPFL-EGL(UASl) plazmidot rövidítjük egy olyan plazmid előállítására, amelyből az UAS1 alkotórész hiányzik; a plazmidot Sáli és BglII alkalmazásával emésztjük, gélen tisztítjuk és elkülönítjük a nagy vektor fragmentumot. Egy független reakcióelegyben ugyanezt a plazmidot BamHI alkalmazásával emésztjük. A 3’ recesszált végeket Klenow DNSpolimerázzal töltjük ki, mind a négy dNTP-t használva. A tompavégű helyeket foszforilezett BglII-kapcsolókkal (CAGATCTG, Biolabs gyártmány) megtoldjuk és Sáli és BglII alkalmazásával végzett emésztés után egy körülbelül 400 bázispámyi DNSfragmentumot különítünk el gélen tisztítva. A nagy vektor fragmentumot a körülbelül 400 bázispámyi Sall-BglII fragmentumhoz ligáljuk T4 DNS-ligáz alkalmazásával. Az E. coli HBlOl-be végrehajtott transzformáció és plazmid elkülönítés után egy olyan plazmidot kapunk, amelyben nincs PH05 UAS. Ezt a plazmidot pDJB207/GAPFL-EGL-nek nevezzük. A plazmidot BglII-vel emésztjük és vektorként szolgál a 31 bázispámyi oligomerek klónozásához. Az 1, 2, 3, 4 vagy 5 beékelt oligonukleotid részt tartalmazó LT98-at BamHI-gyel emésztjük. A különböző méretű fragmentumokat gélen végzett tisztítással különítjük el és egymástól függetlenül ligáljuk a BglII-vel hasított pJDB207/GAPFL-EGL-hez. A ligálási elegyet BglII-vel emésztjük a nem kívánt újraligált vektor eltávolítására, amelyben nincs beékelt DNS, majd E. coli HB101 transzformálására használjuk. A kapott plazmidokat restrikciós elemzéssel vizsgáljuk Sáli és Dral (egy a GAPDH promoter részen belüli hely) alkalmazásával. A GRF18 emésztőtörzs transzformálása után ez eglin C titereket a 4. c) példában leírt módon határozzuk meg. 46 óra fermentálás után a következő specifikus aktivitásokat mértük;
pJDB207/klón a 31 bázispámyi beékelt részek orientá- ci? eglin C titer (mg/1 optikai sűrűség)
alacsony Pi magas Pi
PAPFLI (+)EGL 1 —> 9,2 5,2
PAPFLI (->EGL 1 <- 10,2 2,1
PAPFL11 (+> EGL 2 -> 10,2 3,5
pJDB207/klón a 31 bázispárnyi beékelt részek orientá- cióz‘ eglin C titer (mg/1 optikai sűrűség)
alacsony Pi magas Pi
PAPFL111 (-)EGL 3 11,2 1,4
PAPFLIV (+> EGL 4 —> 10,7 1,5
PAPFLV (-)EGL 5 4— 12,6 1,4
jelentése ugyanaz az orientáció, mint a PH05 promoterben <— jelentése ellentétes orientáció, mint a PH05 promoterben
7. példa
Inzulinszerű növekedési faktor (1GF-1) expressziója egy PAPFL promoterből A 123 228. számú európai szabadalmi bejelentésben leírt pABl 13-IGF-l plazmidot PstI alkalmazásával emésztjük. Két szintetikus oligonukleotidot (50 pmól) készítünk, amelyek képlete a következő:
AATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA
GTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG és mindkettőt kinázzal és hővel kezeljük a fent leírt módon. A hőkezelt kétfonalas adaptert a Pstlgyel hasított plazmidhoz ligáljuk, EcoRI és BamHI alkalmazásával emésztjük és a körülbelül 800 bázispárnyi EcoRI-BamHI fragmentumot gélen végzett tisztítással ekülönítjük. A pJDB207/PAPFLEGL(UAS 1) plazmidot Sáli és EcoRI alkalmazásával emésztjük és a körülbelül 700 bázispárnyi fragmentumot gélen végzett tisztítással elkülönítjük. Egy hármas ligálásban a pCl/1 plazmid (123 228. számú európai szabadalmi bejelentés; BamHI-gyel és Sallgyel emésztve, a vektor gélen tisztítva) 0,5 gg-ját a két kisebb gén és promoter rész 100-100 ng-jához ligáljuk. E. coli-ba végzett transzformálás után a plazmidokat EcoRI, BamHI és Sáli felhasználásával emésztéssel elemezzük. Az AB 103 élesztőtörzs transzformálása [az ATCC-ben 20 673-as számon deponálva; a pYIGF-1-10/1 rosszabb változata, élesztősejteknek komplex közegben egy éjszakán át végzett tenyésztésével, az egyes telepek megvizsgálásával az IGF-1 plazmid jelenlétére, a Hinne és munkatársai által leírt telephibridizálással (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] olyan transzformánsokat eredményez, amelyek csak indukált (alacsony PJ körülmények között (1 mg/I) termelnek IGF-l-et; ennek meghatározását szokásos kompetitív radioimmunoassay-vel végezzük, radioaktív izotóppal jelzett IGF-1et [Anderson és munkatársai: Somatomedins/InsulinLike Growth Factors, Spencer, Ε. M. kiadó Walter de Gruyter, Berlin] használva. A kiónokat pCl/l/PAPFLIGF-l(UASl)-nek nevezzük.
HU 211 207 Β
8. példa
Szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) expressziója egy PH05-GAPDH hibrid promoter szabályozása alatt (10. ábra) gg pJDB207/PH05-TPA18 plazmidot (143 081. számú európai szabadalmi bejelentés) teljesen emésztünk Sáli és Hindin restrikciós endonukleázokkal. a kapott 2 DNS-fragmentumot 0,8%-os agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát-EDTA pufferben választjuk szét. A kis, 2,6 kilobázisnyi Sall-Hindül fragmentumot elektromos eluálással, fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással különítjük el. A DNS-t Ball-gyel tovább emésztjük. Az 1,8 kilobázisnyi fragmentumot a PH05 jelzőszekvencia egy részével, a t-PA kódoló szekvenciájával és a PH05 terminátorral a fent leírt módon elkülönítjük és tisztítjuk, és vízben újra szuszpendáljuk 0,1 pmól/ μΐ koncentrációban.
A hibrid promoter fragmentumot elkülönítjük a pJDB207/PAPFL-HIR UAS1+UAS2 plazmidból (vö. 5. V. példa). A plazmid DNS 12 gg-ját Sáli és HindlH alkalmazásával emésztjük. A kapott 1, kilobázisnyi fragmentumokat Ball-gyel tovább emésztjük. Egy 920 bázispárnyi, a hibrid promotert és a PH05 jelzőszekvencia egy részét tartalmazó fragmentumot 1,5%-os agaróz gélen különítünk el. A DNS-t elektromosan eluáljuk, fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és vízben újra szuszpendáljuk 0,1 pmól/gl koncentrációban.
A 920 bázispámyi Sall-Ball fragmentum 0,2 pmólját, az 1,8 kilobázisnyi Ball-HindlII fragmentum 0,2 pmól-ját és az Sall-gyel Hindlü-mal hasított pJDB207 vektor 0,1 pmól-ját 16 órát ligáljuk 15 ”C-on, 10 gl teljes térfogatban. A ligálási elegy egy 1 gl-es alikvot részét hozzáadjuk 100 gl-nyi, kalciummal kezelt, transzformálásra alkalmas E. coli HB101 sejtekhez.
transzformált, ampR telepet tenyésztünk külön-külön 100 gg/ml ampicillint tartalmazó LB közegen. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai módszerével [Anal. Biochem., 114, 193, (1981)] állítjuk elő és a Pstlgyel és BamHI/EcoRI-gyel kapott restrikciós emésztési termékeken keresztül elemezzük. Izolálunk egy kiónt, amely tartalmazza a várt restrikciós fragmentumokat, és pJDB207/PAPFL-TPA(UASl+UAS2)-nek nevezzük el.
Analóg módon járunk el az UASl(PH05) alkotórész vonatkozásában; a pJDB207/PAPFLHIR(UASl) (5. IV. példa) egy 820 bázispárnyi SallBall fragmentumát elkülönítjük és az 1,8 bázispárnyi Ball-HindlII fragmentumhoz és az Sall-gyel és Hindlll-mal hasított vektorhoz ligáljuk. A kapott plazmidot pJDB207/PAPFL-TPA(UASl)-nek nevezzük.
Analóg módon járunk el a megfelelő, pJDB207/PAPEL-HIR(UAS 1 )-ből vagy pJDB207/PAPELHIR(UASl+UAS2)-bőI (5. példa) származó fragmentumokkal is. A kapott plazmidokat pJDB207/PAPELTPA(UAS 1 )-nek, illetve pJDB207/PAPELTPA(UASl+UAS2)-nek nevezzük.
9. példa
Polipeptidek expressziója PH05-GAPDH hibrid promoterek szabályozása alatt
a) Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformálása
Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzset (alfa, his3—11, his3—15, lue2-3, lue2-112, canR) transzformálunk a következő plazmidokkal:
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS 1) pJDB207/PAPFL-HIR(UAS 1) pJDB207/PAPEL-HIR(UAS 1+UAS2) pJDB207/PAPFL-HIR(UAS 1+UAS2) pJDB207/PAPFLI (+)-EGL pJDB207/PAPFLI (-)-EGL pJDB207/PAPFLII(+)-EGL pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL pJDB207/PAPFLY(-)-EGL pJDB207/PAPEL-TPA(UAS 1) pJDB207/PAPFL-TPA(UAS 1) PJDB207/PAPEL-TPA(UAS 1+UAS2) pJDB207/PAPFL-TPA(UAS 1+UAS2) PC1/1/PAPFL-IGF-1(UAS 1) a Hinnen és munkatársai által leírt előiratot [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, (1978)] alkalmazva. A transzformált élesztősejteket leucinhiányos élesztő minimum tápközeg lemezeken választjuk szét. Egyes transzformált élesztőtelepeket kiválasztunk és a következőképpen nevezzük el azokat:
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPELHIR(UASl)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLHIR(UASl)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPELHIR(UAS1+UAS2)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLEHIR(UAS1+UAS2)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(+)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(-)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLII(+)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLII(+)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIV(-)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLV (-)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPELTPA(UASl)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB206/PAPFLTPA(UASl)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPELTPA(UAS 1+UAS2)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLTPA(UAS 1+UAS2)
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pCl/l/PAPFL-IGF1(UAS1)
b) A transzformánsok fermentálása
S. cerevisiae GRF18 transzformánsok sejtjeit különkülön 10 ml élesztő minimum tápközegben (Difco Yeast Minimum Base - aminosavak nélkül -, amelyhez 2%
HU 211 207 Β glükózt és 20 mg/1 L-hisztidint adtunk) tenyésztjük 50 ml-es Erlemeyer-lombikban rázatás közben 30 ’C-on 24 órát 3xl07 sejt/ml sűrűségig. A sejteket 0,9%-os nátrium-klorid oldattal mossuk és egy olyan alacsony Pj minimum tápközeg 50 ml-ének inokulálására használjuk, amelyet a Difco Yeast Nitrogén Base tápközeg receptje szerint készítettünk (aminosavak nélkül), de 0,03 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot, 1 g/1 kálium-kloridot és ammónium-szulfát helyett 10 g/1 L-aszparagint tartalmaz, továbbá 2% glükózt és 1 g/1 L-hisztidint. A tenyészeteket 4X106 sejt/ml sejtsűrűségig inokuláljuk és 30 ’C-on keverjük 200 fordulat/perc sebességgel 42 órát.
c) Az expresszált géntermék titere
Az élesztő a deszulfátohirudin vegyületeket a tápközegbe választja ki. 22 óra fermentálás után 10 ml-es mintát veszünk a tápközegből és proteinben dúsítjuk kisózással és Bond Elüt C-l 8 oszlopon (1 ml, Analytichem International gyártmány) végzett tömény ftéssel. Az oszlopot kétszer mossuk víz és acetonitril 9:1 arányú elegyének 1,5 ml-ével, amely 0,1% trifluor-ecetsavat is tartalmaz. A deszulfátohirudin vegyületeket az oszlopról víz és acetonitril 6:4 térfogatarányú, 0,1% trifluor-ecetsavat is tartalmazó elegyével eluáljuk. 2 ml eluátumot Speed Vác koncentrátorban (Savant gyártmány) 400 μΐ végső térfogatra sűrítünk. Adeszulfátohirudint HPLC elemzéssel azonosítjuk, hiteles deszulfátohirudinnal összehasonlítva és trombin inhibiciós vizsgálat [vö. Bergmeyer, M.U. szerkesztése: Methods in Enzymatic Analysis, II. kötet, 314-316, Verlag Chemie, Weinheim, Német Szövetségi Köztársaság, (1983)] alkalmazásával.
Az eredmények az 1. táblázatban láthatók.
1. táblázat
Különböző plazmátokkal transzformált S. cerevisiae GRF18 törzs deszulfátohirudin kiválasztása a tápközegbe
plazmid deszulfátohirudin (mg/1 tápközeg/600 nm-en mért optikai sűrűség)
pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1) 2,0
pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1) 2,2
pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1 +UAS2) 3,0
pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1 +UAS2) 2,8
A szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) felhalmozódik az élesztősejtekben. Sejtextraktumokat készítünk és meghatározzuk a t-PA aktivitást a következőképpen: 35 ml alacsony Pj tápközeg [Meyhack, B. és munkatársai: EMBO-J., /, 675, (1982)] sejtjeit (sejtsűrűség 12xl07 ml) Sorval SS34 rotorban 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig végzett centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket a tápközeg sókomponenseit tartalmazó pufferben (azaz aminosavak, glükóz, vitaminok, nyomelemek nélkül) mossuk. A sejteket szobahőmérsékleten centrifugáljuk 5 percig, 3000 fordulat/perc sebességgel. A kiülepedett sejteket újra szuszpendáljuk 4 ml hideg 66 mM nátrium-foszfát puffer (pH=-7,4) és 0,1 térfogat% Triton X-100 teljes térfogatában. A sejtszuszpenziót átvisszük egy 30 ml-es Corex csőbe, hozzáadunk 8 g 0,4 mm átmérőjű üveggyöngyöt és Vortex Mixer-en (Scientific Instruments Inc., USA, gyártmány) rázatjuk teljes sebességgel 4 percig, majd jeges fürdőben lehűtjük. Ezzel az eljárással a sejtek több mint 90%-át elroncsoljuk. A sejttörmelékeket és az üveggyöngyöket Sorvall HB-4 rotorban 10 percig 8000 fordulat/perc sebességgel 4 ‘C-on végzett centrifugálással kiülepítjük. A felülúszót Eppendorf-csövekbe tesszük át, folyékony nitrogénben megfagyasztjuk és -60 ’C-on tároljuk. A t-PA aktivitást Ranby kicsit módosított módszere szerint [Biochim. Biophys. Acta, 704, 461, (1982)] határozzuk meg. Szubsztrátként DVal-Leu-Lys-pNA-t (Kabi S-2251) használunk. A 405 nm-en mért abszorpciót korrigáljuk a nem specifikus hasítás miatt és egy urokináz standard-hoz viszonyítjuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.
2. táblázat
Különbözőplazmidokkal transzformált S. cerevisiae GRF18 törzs t-PA aktivitása
plazmid t-PA aktivitás (nemzetközi egység/1 élesztősejt/600 nmen mért optikai sűrűség)
pJDB207/PAPFL-TPA UAS1 300
pJDB207/PAPFL-TPA UAS1 +UAS2 200
10. példa
IGF-1 elkülönítése és jellemzése transzformált élesztőtörzsből
a) IGF-1 elkülönítése a tápközegből pCl/l/PAPFL-IGF-1 (UAS1) élesztőtörzset 60 órát tenyésztünk. 3 1 tápközeget kiveszünk és a 9. példában leírt módon centrifugáljuk. 2 ml felülúszót (1.10 koncentráció) reverz fázisú HPLC-vel vizsgálva 1 mg/1 IGF-1 titert kapunk. A felülúszót pH=3,0-nál 20 ml SP-Sephadex C-25-tel (Pharmacia gyártmány) kezeljük és 60 percig keverjük 4 ’C-on. Az abszorbeált IGF-l-et a mosott gyantáról nátrium-acetát puffer gradienssel (50 mM, pH=3,0-6,0) eluáljuk és két lépésben végzett ioncserével tisztítjuk; az első lépést egy CM52 oszlopon hajtjuk végre (Whatman gyártmány,
1.5 cmx8,5 cm, gradiens, A puffer 20 mM-os, 4,0 pHjú ammónium-acetát, B puffer 100 mM-os, 6,8 pH-jú ammónium-acetát). A második lépést egy DE-53 anioncserélő oszlopon (Whatman gyártmány) végezzük (körülmények; 1,5 cmxl0,5 cm-es oszlop, áramlási sebesség 1 ml/perc, gradiens, A puffer 20 mM-os, 9,0 pH-jú ammónium-acetát, B puffer 200 mM-os,
6.5 pH-jú ammónium-acetát). A végső tisztítást egy szemipreparatív RP-HPLC oszlopon végezzük. Az ak23
HU 211 207 Β tív frakció 21,3 perces retenciós idővel eluálódik, és 1,1 mg 95%-os tisztaságú IGF-1 -et eredményez.
Kísérleti körülmények: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC oszlop, 10x250 mm-es; elválasztásonként aliquot részek (200 μΐ 1:10-re besűrítve); AUFS 0,5 200 nm-nél; áramlási sebesség: 3 ml/perc. Eluálószer: A - 0,1% trifluorecetsav, B - acetonitril és víz 8:2 arányú elegye + 0,07% trifluor-ecetsav; 3 percig a B részaránya 35%, majd 30 perc alatt 45%-ra növeljük. A kapott frakciókat vízzel hígítjuk 1:1 arányban és liofilizáljuk.
b) A pCI/l/PAPFL-IGF-I(UASI) törzs fermentációjából nyert IGF-] jellemzése RP-HPLC elemzés szerint a tápközegből ekülönített IGF-1 [vö. 10. a) példa] azonos a hiteles, szérumból nyert IGF-1-gyei.
Izoelektromos pont: pl=8,6 (izoelektromos fókuszálás, a protein TCA-val végzett kicsapása).
Az aminosavösszetétel meghatározása
A tiszta IGF-1 körülbelül 2,5 gg-ját 24 órát hidrolizáljuk 6 n sósavoldattal 110 ’C-on, majd a Chang és munkatársai által leírt módszerrel [DABS-C1 módszer:
Eredmények:
Methods in Enzimology, 91, 41, (1983)] elemezzük. A hidrolizátum összetétele a következő:
Amino- sav Hidrolizátum Amino- sav Hidrolizátum
Asp 5,7 (5) Ile 0,7 (1)
Thr 3,2 (3) Leu 5,9 (6)
Ser 5,2 (5) Tyr 2,8 (3)
Glu 6,5 (6) Phe 3,9 (4)
Pro 5,3 (5) His - -
Gly 7,2 (7) Lys 3,0 (3)
Alá 6,1 (6) Arg 6,0 (6)
Val 2,7 (3) Met 0,9 (1)
Cisztin 2,2 (3) összes (70)
Részletes szekvenciaelemzés A tiszta IGF-1 70 gg-ját (10 nmól) szokásos szekvenciaelemzésnek vetjük alá Edman módszere szerint. Az N-terminális PTH-aminosavakat RP-HPLC segítségével határozzuk meg.
Ciklus 15 10
Aminosav Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys*-Gly-Ala-Glu-LeuCiklus 11 15 20
Aminosav Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys*-Gly-AspCiklus 21 25 30
Aminosav Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-GlyCiklus 31 35 40
Aminosav Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Alá-Pro-GlnCiklus 41 45 50
Aminosav Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-n.d.-n.d.-Phe-Argn d. jelentése: nem határoztuk meg * jelentése: a Cys(6)-ot és Cys( 18)-at külön határozzuk meg jód-acetamiddal végzett karboximetilezéssel.
A részleges szekvencia az 1. aminosavtól az 50-ig 40 ennek alapján azonos a hiteles IGF-1 közzétett primer szekvenciájával.
C-terminális elemzés
A tiszta IGF-l-et Y-karboxipeptidázzal emésztjük 45 és a felszabadult aminosavakat aminosav analizátorral határozzk meg [vö. Chang, J.Y., Knedel, R., Braun, D.G.: Biochem. J., 199, 547],
Eredmények:
aminosav 70
5 perces emésztés: -Alá
120 perces emésztés: Ser-Ala
Molekulatömeg meghatarozasa FABAz IGFl-et gyors atom bombázásos pozitív ion tömegspektrometriának (FAB-MS) vetjük alá. Készülék: ZAB-HF tömegspektrométer a VG-Analytical Ltdtől (Manchster); mátrix: tioglicerin; bombázás xenonnal; ionenergia 3 keV; külső kalibrálás Cs3oJ29-el (molekulatömege 7667,4).
tapasztalati képlet C33iH5]gN94O]0iS7 molekulatömeg (számított) 7648,71 molekulatömeg (talált) 7648,07

Claims (38)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás UAS1 (PHO5) és/vagy UAS2 (PHO5) szekvenciákat tartalmazó DNS-fragmentumok és szubfragmentumaik előállítására, amelyekben az UAS funkció megmarad, azzal jellemezve, hogy egy PH05gént tartalmazó DNS-t, vagy a PH05-gént vagy annak 5’-terminális részét megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasítunk és adott esetben a fragmentumokat egy
    Látszólagos molekulatömeg
    30 gg IGF-l-et SDS karbamid gélen SUDS-gél;
    [vö. Kyte és munkatársai: Anal. Biochem., 133, 515, (1983)] elemzünk. Egy sávot észlelünk, amely 60007000 Dalton látszólagos molekulatömegnek felel meg.
    HU 211 207 Β exonukleázzal rövidítjük, majd az így kapott fragmentumok közül kiválogatjuk azokat, amelyeknek UASfunkciója megmaradt, és a fragmentumokat vagy szubfragmentumokat elkülönítjük, vagy a fenti DNSfragmentumokat vagy szubfragmentumokat kémiai DNS-szintézissel állítjuk elő.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás UAS1 (PH05) és UAS2 (PH05) szekvenciákat tartalmazó fragmentum előállítására, azzal jellemezve, hogy a PH05-gént tartalmazó DNS-t, a PH05-gént vagy annak 5’-terminális részét a BamHI és BstlI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, ajd a 368 bázispámyi fragmentumot elkülönítjük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás UAS1 (PH05)-öt tartalmazó fragmentum előállítására, azzal jellemezve, hogy a PH05-gént tartalmazó DNS-t, a PH05-gént vagy annak 5’-terminális részét BamHI és Clal restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd a 268 bázispámyi fragmentumot elkülönítjük.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
    GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
    CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT szekvenciájú DNS-t kémiai DNS-szintézissel állítjuk elő és adott esetben az előállított DNS-t szintetikus kapcsoló szekvenciákkal látjuk el.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás UAS2 (PH05)-t tartalmazó fragmentum előállítására, azzal jellemezve, hogy a PH05-gént tartalmazó DNS-t vagy annak 5’terminális részét Clal és BstEII restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd a 100 bázispámyi fragmentumokat elkülönítjük.
  6. 6. Eljárás élesztő hibrid-promoter előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az élesztő PH05 gén UAS1 és/vagy UAS2 szekvenciáját tartalmazó 5’ irányban elhelyezkedő upstream promoter egységet, egy PH05től különböző élesztő gén 3’ irányban elhelyezkedő, működőképes TATA-boxot tartalmazó, és a transzlációs start-kódon közelében végződő downstream-promoter egységéhez kapcsolunk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő PH05-gén UAS1 és/vagy UAS2 szekvenciáját tartalmazó, 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységet az élesztő GAPDH gén 3’ irányban elhelyezkedő a GAPDH gén -300. és -180. nukleotidja között kezdődő és a -1. nukleotidjánál végződő downstream promoter egységhez kapcsoljuk.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként az élesztő PH05 gén 5’ régiójának 368 bázispár hosszúságú BAMHI-BSTEII fragmentumát alkalmazzuk.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként az élesztő PH05 gén 5’ régiójának 268 bázispár hosszúságú BamHI-Clal fragmentumát alkalmazzuk.
  10. 10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként az élesztő PH05 gén 5’ régiójának 100 bázispár hosszúságú Clal-Bstell fragmentumát alkalmazzuk.
  11. 11. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként az alább megadott szekvenciájú, 31 bázispáros DNS-fragmentumot alkalmazzuk:
    GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
    CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
  12. 12. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként UAS1 (PH05) és UAS2 (PH05) szekvenciákat tartalmazót alkalmazunk.
  13. 13. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként UAS1 (PH05) szekvenciát tartalmazót alkalmazunk.
  14. 14. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ irányban elhelyezkedő, upstream promoter egységként az UAS2 (PH05) szekvenciát tartalmazót alkalmazzunk.
  15. 15. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3’ irányban elhelyezkedő, downstream promoter egységként valamely glikolitikus enzimet kódoló élesztő gén promoteréből származtathatót alkalmazunk.
  16. 16. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3’ irányban elhelyezkedő, downstream promoter egységként az élesztő GAPDH gén promoteréből származtathatót alkalmazunk.
  17. 17. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3’ irányban elhelyezkedő, downstream promoter egységként az élesztő GAPDH gén -199-től -1-ig terjedő nukleotidjainak szekvenciáját tartalmazót alkalmazunk.
  18. 18. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3’ irányban elhelyezkedő, downstream promoter egységként az élesztő GAPDH gén -263-tól -1 -ig terjedő nukleotidjainak szekvenciáját tartalmazót alkalmazunk.
  19. 19. Eljárás élesztő hibrid-vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 6. igénypont szerint előállított hibrid-promotert upstream irányban egy élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS fragmentum elé kapcsolunk, és az ilymódon előállított DNS molekulák közül egyet vagy többet élesztő vektor DNS-be inszertálunk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerint előállított hibridpromotert upstream irányban egy élesztő számára heterológ polipeptidet kódoló DNS-fragmentum elé kapcsolunk, és az ilymódon előállított DNS molekulák közül egyet vagy többet élesztő vektor DNS-be inszertálunk.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hibrid-promoterként a 8-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alapján előállított promotert alkalmazunk.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő vektor DNS-be 1-4 darab DNSmolekulát inszertálunk.
    HU 211 207 Β
  23. 23. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő vektorba egy DNS molekulát insze Hálunk.
  24. 24. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hibrid-plazmidot vagy pedig lineáris hibridvektort állítunk elő.
  25. 25. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magasabbrendű eukariótáből származtatható polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó hibrid-vektort állítunk elő.
  26. 26. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élszető hibrid-promotert közvetlenül az érett heterológ polipeptid kódoló régiójához kapcsoljuk, olymódon, hogy a kapcsolási helyre egy ATG kódont inszertálunk.
  27. 27. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szignál szekvenciát tartalmazó polipeptid kódoló DNS-fragmentumot alkalmazunk.
  28. 28. Eljárás transzformált élesztősejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy az élesztősejteket a 19. igénypont szerint előállított hibrid-vektorral transzformáljuk.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztősejteket a 20. igénypont szerint előállított hibrid-vektorral transzformáljuk.
  30. 30. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztősejteket a 21-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alapján előállítható hibrid-vektorral transzformáljuk.
  31. 31. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztő gazdaként valamely Saccharomyces cerevisiae törzset használunk.
  32. 32. Eljárás heterológ polipeptid előállítására élesztőben, azzal jellemezve, hogy a 28. igénypont szerint előállított élesztő sejteket tenyésztjük és az expresszált heterológ polipeptidet izoláljuk.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 29. igénypont szerint előállított élesztő sejteket tenyésztjük és az expresszált polipeptidet izoláljuk.
  34. 34. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő sejteket asszimilálható formában szén, nitrogén és szervetlen só forrásokat, valamint kívánt esetben egyéb növekedést elősegítő anyagokat is tartalmazó folyékony táptalajban tenyésztjük.
  35. 35. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 25. igénypont szerint előállított vektorral transzformált élesztő sejteket tenyésztünk.
  36. 36. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztő gazdaként valamely Saccharomyces cerevisiae törzset használunk.
  37. 37. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 21-27. igénypontok bármelyike szerint előállított hibrid-vektorral transzformált élesztő sejteket tenyésztünk.
  38. 38. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 28-31. igénypontok bármelyike szerint előállított transzformált gazdasejteket tenyésztünk.
HU863720A 1985-08-29 1986-08-28 Method for producing recombinant dna molecules containing yeart ph05 gene upstream activating sequences HU211207B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB858521496A GB8521496D0 (en) 1985-08-29 1985-08-29 Repressible yeast promoters

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT42525A HUT42525A (en) 1987-07-28
HU211207B true HU211207B (en) 1995-11-28

Family

ID=10584428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU863720A HU211207B (en) 1985-08-29 1986-08-28 Method for producing recombinant dna molecules containing yeart ph05 gene upstream activating sequences

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5436136A (hu)
EP (1) EP0213593B1 (hu)
JP (1) JPH07110233B2 (hu)
AT (1) ATE62510T1 (hu)
AU (1) AU599329B2 (hu)
CA (1) CA1318616C (hu)
DD (2) DD267739A5 (hu)
DE (1) DE3678647D1 (hu)
DK (1) DK175093B1 (hu)
ES (3) ES2001618A6 (hu)
FI (1) FI91280C (hu)
GB (1) GB8521496D0 (hu)
GR (1) GR862209B (hu)
HU (1) HU211207B (hu)
IE (1) IE58844B1 (hu)
IL (1) IL79837A (hu)
NO (1) NO175871C (hu)
NZ (1) NZ217388A (hu)
PH (1) PH24715A (hu)
PT (1) PT83273B (hu)
SU (1) SU1630616A3 (hu)
ZA (1) ZA866535B (hu)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU621277B2 (en) * 1985-11-13 1992-03-12 Xoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
MY101203A (en) * 1985-12-12 1991-08-17 Ucp Gen Pharma Ag Production of thrombin iinhibitors.
GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1986-01-22 Ciba Geigy Ag Thrombin inhibitors
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
GB8907110D0 (en) * 1988-05-04 1989-05-10 Ciba Geigy Ag Improvements in the production of polypeptides
NO177065C (no) * 1988-09-26 1995-07-12 Labofina Sa Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
EP0548267A4 (en) * 1990-09-04 1994-11-23 Salk Inst Biotech Ind Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
CA2105064A1 (en) * 1991-04-01 1992-10-02 Martin Anthony Gleeson Genes which influence pichia proteolytic activity, and uses therefor
US5674728A (en) * 1993-11-03 1997-10-07 Novartis Corporation Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease
JPH08173170A (ja) * 1994-05-25 1996-07-09 Kirin Brewery Co Ltd キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現
JP2001501097A (ja) * 1996-09-24 2001-01-30 ケイダス ファーマスーティカル コーポレイション レセプターエフェクターを同定する方法及び組成物
US6265186B1 (en) 1997-04-11 2001-07-24 Dsm N.V. Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces
US6890730B1 (en) 1999-12-10 2005-05-10 The Salk Institute Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems
US8008459B2 (en) * 2001-01-25 2011-08-30 Evolva Sa Concatemers of differentially expressed multiple genes
EP2571991A1 (en) 2010-05-20 2013-03-27 Evolva SA Method of producing isoprenoid compounds in yeast
JP2023522947A (ja) 2020-04-20 2023-06-01 ヴェスタロン・コーポレーション タンパク質分解に対して安定な害虫制御用ｕ１－アガトキシン－ｔａ１ｂバリアントポリペプチド
KR20230005929A (ko) 2020-05-01 2023-01-10 베스타론 코포레이션 살충 조합물
WO2022212777A2 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Vestaron Corporation Av3 mutant polypeptides for pest control
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method
WO2023225555A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vestaron Corporation Pesticidal actx peptide variants
WO2023245100A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Vestaron Corporation Antimicrobial ncr13 variant peptides
WO2024026406A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Vestaron Corporation Next Generation ACTX Peptides

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2125047B (en) * 1982-08-09 1986-02-19 Ciba Geigy Ag Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
US4876197A (en) * 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
NZ207926A (en) * 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
EP0127839B1 (en) * 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&amp;M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
GB8314961D0 (en) * 1983-05-31 1983-07-06 Kingsman A J Dna sequence
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO &quot;^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock&quot; de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino (&quot;PBS&quot;) pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
EP0164566A3 (de) * 1984-05-11 1986-10-29 LGA Gastechnik GmbH Sicherheitseinrichtung für Flüssiggastanks
ATE102250T1 (de) * 1984-05-11 1994-03-15 Chiron Corp Erhoehte hefetranskription unter verwendung einer hybridkonstruktion der promotorregion.
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen

Also Published As

Publication number Publication date
IL79837A (en) 1992-06-21
NO863458L (no) 1987-03-02
NO175871B (hu) 1994-09-12
DK409686A (da) 1987-03-01
NO175871C (no) 1994-12-21
US5436136A (en) 1995-07-25
PH24715A (en) 1990-10-01
NZ217388A (en) 1989-02-24
HUT42525A (en) 1987-07-28
DK409686D0 (da) 1986-08-28
JPS6251995A (ja) 1987-03-06
GB8521496D0 (en) 1985-10-02
GR862209B (en) 1986-12-31
CA1318616C (en) 1993-06-01
ES2006382A6 (es) 1989-04-16
DD254212A5 (de) 1988-02-17
IE862307L (en) 1987-02-28
EP0213593A1 (en) 1987-03-11
PT83273A (en) 1986-09-01
IE58844B1 (en) 1993-11-17
ATE62510T1 (de) 1991-04-15
ZA866535B (en) 1987-04-29
ES2001618A6 (es) 1988-06-01
FI91280B (fi) 1994-02-28
SU1630616A3 (ru) 1991-02-23
DD267739A5 (de) 1989-05-10
FI91280C (fi) 1994-06-10
AU6203286A (en) 1987-03-05
FI863430A0 (fi) 1986-08-25
DE3678647D1 (en) 1991-05-16
JPH07110233B2 (ja) 1995-11-29
NO863458D0 (no) 1986-08-28
FI863430A (fi) 1987-03-01
AU599329B2 (en) 1990-07-19
IL79837A0 (en) 1986-11-30
ES2006383A6 (es) 1989-04-16
PT83273B (pt) 1989-05-12
EP0213593B1 (en) 1991-04-10
DK175093B1 (da) 2004-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211207B (en) Method for producing recombinant dna molecules containing yeart ph05 gene upstream activating sequences
EP0100561B1 (en) Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
USRE39355E1 (en) Preparation of human IGF via recombinant DNA technology
CA1316133C (en) Method of using bar1 for secreting foreign proteins
CA1340547C (en) Novel secretory leader sequences for yeasts
EP0123544A2 (en) Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor
EP0225633A2 (en) Production of thrombin inhibitors
CA2085308C (en) Dibasic endoprotease fused to endoplasmic reticulum retention signal and use thereof
JP2970811B2 (ja) 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム
JP2777132B2 (ja) 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産
EP0127304A1 (en) Process for producing heterologous protein in yeast, expression vehicle therefor, and yeast transformed therewith
FI98219C (fi) Menetelmä urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi
Stetler et al. Secretion of Active, Full–and Half–Length Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Sacchammyces Cerevisiae
Bourbonnais et al. Heterologous expression of peptide hormone precursors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Evidence for a novel prohormone endoprotease with specificity for monobasic amino acids
KR940011534B1 (ko) 억제성 효모 프로모터의 제조방법
PT716705E (pt) Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula
PT725822E (pt) Processo para preparacao de proteinas por recombinacao em leveduras
JPH10513353A (ja) タンパク質の製造法
CA1340264C (en) Recombinant dna expression of novel diuretic/vasodilator compounds
HU204087B (en) Process for producing humqn alpha or beta interferon

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NOVARTIS AG, CH