FI91280C - Repressoituvat hiivapromoottorit - Google Patents
Repressoituvat hiivapromoottorit Download PDFInfo
- Publication number
- FI91280C FI91280C FI863430A FI863430A FI91280C FI 91280 C FI91280 C FI 91280C FI 863430 A FI863430 A FI 863430A FI 863430 A FI863430 A FI 863430A FI 91280 C FI91280 C FI 91280C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- yeast
- dna
- promoter
- gene
- sequence
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 192
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 73
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 46
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 152
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 118
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 31
- XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N desirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 21
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 20
- 108010073652 desirudin Proteins 0.000 claims description 20
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 16
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 14
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 14
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 108010031145 eglin proteinase inhibitors Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 108091026908 Downstream promoter element Proteins 0.000 claims description 8
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 7
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims 2
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 30
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 144
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 131
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 94
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 27
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 26
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 18
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 17
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 11
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 6
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 5
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- -1 glyceraldehyde-purine Chemical compound 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 4
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 3
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 3
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 3
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 101100062121 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- JWDYCNIAQWPBHD-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methylphenyl)glycerol Chemical compound CC1=CC=CC=C1OCC(O)CO JWDYCNIAQWPBHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100011368 Caenorhabditis elegans egl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100026178 Caenorhabditis elegans egl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011376 Caenorhabditis elegans egl-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246536 Caenorhabditis elegans pyc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 244000304337 Cuminum cyminum Species 0.000 description 1
- 235000007129 Cuminum cyminum Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101000658546 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoEI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 101000741445 Homo sapiens Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000860415 Homo sapiens Galanin peptides Proteins 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100483843 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) UPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N beta-endorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 101150057929 egl-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000035929 gnawing Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940045644 human calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010008429 immunoglobulin-binding factors Proteins 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003017 in situ immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L sodium sulphate Substances [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Led Devices (AREA)
- Gyroscopes (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
91280
Repressoituvat hiivapromoottorit
Keksinto koskee vieraiden polypeptidien tuottamista hiivaisånnisså yhdistelmå-DNA-menetelmiå kayttamalla. Tar-kemmin sanottuna keksinto koskee uusia ylavirrassa olevia aktivointisekvensseja, hiivojen yhdistelmåpromoottoreita, jotka sisaltavåt tallaisia ylavirrassa olevia aktivointi-sekvenssejå, uusia yhdistelmavektoreita, joita voidaan kåyt-taa hiivasolujen transformoinnissa, tallaisia transformoi-tuneita hiivasoluja ja tallaisten transformoituneiden hiivasolujen kayttoa hiivalle vieraiden polypeptidien tuotan-nossa.
Viime vuosien kuluessa on saavutettu suurta edistystå geenitekniikan alalla ja eraat systeemit, joissa kaytetaån geneettisesti muunnettuja mikro-organismeja, erityisesti suolistobakteeria Escherichia coli ja leivontahiivaa (Saccharomyces cerevisiae), ovat nyt toiminnassa. On kui-tenkin olemassa tarve saada kSyttoon muita, entista parem-pia systeemeja, erityisesti eukaryoottisia systeemeja, kuten hiivoissa toimivia, jotka soveltuvat proteiinien ta-loudelliseen ja laajamittaiseen teolliseen tuotantoon.
Tallå hetkellå on tarjolla erilaisia hiivavektoreita ge-neettistå kloonausta vårten. Jotta vieraat geenit ilmen-tyisivåt tehokkaasti hiivoissa, pitåå rakennegeenit liit-taå voimakkaisiin hiivan promoottoreihin, joihin mielellåån liittyy sååtelyå niin, ettå geenin ilmentymistå voidaan oh-jata eksogeenisesti. Koska ilmentymisen tehokkuuden (tuot-teenmuodostuksen) uskotaan olevan riippuvainen ja suhtees-sa kåytetyn promoottorin tehoon, alan ihmiset kiinnittå-våt erityistå huomiota voimakkaiden promoottorisysteemien kehittåmiseen.
Proteiineja koodittavien kloonattujen hiivageenien in vitro-mutatointi ja niiden palauttaminen takaisin hii-vasoluihin toiminnallista analyysiå vårten on mahdollista-nut eraiden ohella toimivien promoottorielementtien tun-nistamisen (katsaus julkaisussa L. Guarente, Cell 799 2 (1984)). Nåitå elementtejå ovat seuraavassa luetellut, kun luettelossa låhdetaan liikkeelle valittomasti pro-teiinia koodittavan geenin 5'-paasta: 5'-transkriboiduksi tuleva johtosekvenssi, joka si-saltaa melko paljon A-T:ta ja joskus sekvenssin CAACAACAA (tai tålle sukua olevan sekvenssin), transkriptionaloituskohdat, jotka sijaitsevat noin 40 -60 e:n pååsså (joskus kauerapana) luennanaloituskodonista ATG, mikå tavallisesti merkitsee useita vahvuudeltaan eri-laisia mRNA:n aloituskohtia, TATA-alue (joskus useampia kuin yksi), joka sijaitsee noin 40 - 80 e:n pååsså transkriptionaloituskohdista, ja joka oletettavasti toimii oleellisena RNA polymeraasi I:n tunnistuskohtana, ylåvirrassa oleva(t) aktivointikohta(dat) (upstream activation site(s), UAS), joihin oletettavasti sååtely-proteiinien toiminta kohdistuu, ja jotka sijaitsevat noin 100 - 300 e:n pååsså TATA-alueesta ylåvirrassa.
UAS toimii eri tavalla kuin prokaryooteista 15ydetyt sååtelykohdat ja muistuttaa enemmånkin nisåkåssysteemien tehostajakohtia (enhancer sites). Melko yksityiskohtaisia tietoja on olemassa hiivan GAL1, GAL7, GAL 1Ο-rykelmåstå, jossa positiivisesti toimiva sååtelyproteiini (GAL 4-gee-nituote) vuorovaikuttaa suoraa GAL 1 - GAL 10:n UAS:n kanssa (Giniger et al., Cell 40, 767 (1985)).
Kun liitettiin GAL 1 - GAL 10:n UAS:åå koodittavat promoottorisekvenssit hiivan CYC 1-geenin TATA-alueen eteen, saatiin aikaan yhdistelmapromoottori, jonka trans-kriptio on GAL 1 - GAL 10:n UAS:n ohjauksessa eli se on riippuvainen GAL 4-geenituotteesta (L. Guarente et. al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 7_9' 7410 (1 984)). Vastaavan-lainen rakentaminen tehtiin liittåmållå yhteen CYC 1:n ja LEU 2:n promoottorielementit (L. Guarente et al. Cell 36, 503 (1984)). Nåmå molemmat systeemit sisåltåvåt promoot-torielementtejå ja proteiininkooditussekvenssejå hiivasta, mutta tarjolla ei ole mitåån todisteita siitå, ettå nåmå systeemit toimivat myos hiivalle vieraiden geenien yhtey-desså.
3 91280
Eraåsså åskettåin julkaistussa patenttihakemuksessa (PCT 84/4757) selostetaan hiivan PGK-geenin UAS-elementtia. Osoitetaan valttamattomån promoottorielementin lasnaolo asemien -324 ja -455 valilla (ATG:sta lukien). Vaitetaan, ettå taman elementin lisååminen muiden promoottorien eteen voimistaisi minka tahansa muun hiivapromoottorin tehoa. Kuitenkaan taman vaitteen tueksi ei esitetå mitåån esimerk-kiå, vaan argumentit perustuvat kokonaisuudessaan negatii-visiin tuloksiin (promoottorin tuhoaminen). On hyvinkin mahdollista, etta elementti on PGK-promoottorin oleellinen osa, mutta on epåvarmaa, toimiiko tallainen elementti yh-distelmapromoottorin osana. Lisaksi PGK:n UASraan ei lii-ty saåtelysignaalia eli se ei tee mahdolliseksi alavirrassa olevan koodittavan sekvenssin ilmentymisen (transkription) ohjaamista tietyn fysiologisen signaalin avulla.
Eråat glykolyyttisten geenien promoottorit indusoitu-vat glukoosin låsnåollessa. Ne on mahdollista kytkea pois paalta kasvattamalla soluja glukoosittomassa valiaineessa.
Tama merkitsee sita, etta hiivaisantasolut pitaisi trans-formoida ja regeneroida sellaisessa valiaineessa, jonka glukoosi on korvattu muilla hiililahteilla (asetaatilla, glyserolilla, laktaatilla jne.), jotta solut saadaan suo-jatuiksi mahdollisesti haitalliselta tai letaaliselta geenituotteelta, joka kertyy soluihin. Koska protoplastien (A. Hinnen et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA TS, 1929 (1978)) ja suolalla kasiteltyjen kokonaisten solujen (Ito et al. J. Bacteriol. 153, 163 (1983)) regenerointi suoritetaan tavallisesti rikkaassa alustassa, jotta saa-vutetaan solujen nopea regeneroituminen ja pesakkeidenmuo-dostus, kaytetåån kaikissa tamanhetkisissa transformointi-menetelmissa glukoosia hiililahteena. On oletettavissa, etta regenerointi ja talteenotto toimivat huonosti (jos lainkaan) glukoosittomassa alustassa.
Alalla tunnustetaan yleisesti, etta ilmentymisen ajoi-tusta pitaa saataa, jotta voitaisiin taata tuotettavan proteiinin valmistuminen suurina maarina vain silloin, kun solu pystyy parhaiten sietamaan suuria måaria vierai-ta proteiineja, eli kasvuvaiheen jalkeen. On myos toi-vottavaa, ettei ilmentymisen saately riipu mikrobin kas- 4 vulle tarkeimman hiililahteen eli glukoosin lasnaolosta tai poissaolosta. Såadeltavissa olevia voimakkaita pro-moottorisysteemeja, jotka tayttavat nåmå vaatimukset vieraiden geenien edulliseksi ja teknisesti kåyttokel-poiseksi ilmentåmiseksi hiivoissa, tuskin tunnetaan alalla. Nain olien on olemassa tarve tallaisten promoottorisystee-mien kehittåmiselle.
Nyt on yllåttaen havaittu, etta yhdistelmå, jossa glykolyyttisen ketjun entsyymien ilmentymistå ohjaavan promoottorin, joiden yleisesti uskotaan kuuluvan talla hetkella tunnetuista promoottoreista voimakkaimpiin, TATA-alue on liitetty sellaisen saadeltavan promoottorin ylå-virran promoottorielementteihin, jonka pois paaltå kytkey-tyminen ja takaisin paalle kytkeytyminen ei ole riippuvai-nen kasvualustan sisaltaman valttamattoman aineosan, kuten valttamattoman hiilen tai typen, lasnaolosta tai poissaolosta, johtaa voimakkaisiin yhdistelmapromoottoreihin, jotka tayttavat teknisesti kayttokelpoisille promoottori-systeemeille asetettavat paavaatimukset.
Tassa keksinnossa kaytetaån yhdistelmåpromoottoreita, joissa erityisesti glykolyyttisten qeenien oromoottorit on saatettu happofosfataasi-PH05-geenin UAS:n ohjaukseen, vieraiden geenien tehokkaaseen ilmentamiseen hiivoissa.
Keksinto koskee lisaksi vastaeristettvja hiivan PH05-geenin UAS-signaaleja, yhdistelmåpromoottoreita, jotka sisaltåvat PH05 UAS-signaaleja, yhdistelmavektoreita, jotka sisaltavat tallaisia yhdistelmåpromoottoreita seka hiivaisantia, jotka ovat transformoituneet tallaisilla yhdistelmavektoreilla.
Edelleen keksinto koskee menetelmia mainittujen UAS-signaalien, mainittujen yhdistelmapromoottorien, mainittujen yhdistelmavektorien ja mainittujen transformoitunei-den hiivaisantien valmistamiseksi ja mainittujen trans-formoitujen hiivaisantien kayttoa polypeptidien tuotta-miseen.
1. Hiivan happofosfataasigeenin (PH05) ylavirran akti-vointisekvenssit (UAS) ja yhdistelmapromoottorit 5 91280
Keksinto koskee hiivan PH05-geenista johdettuja yla-virran aktivointisekvensseja (UAS) ja niiden kayttoa yhdis-telmåpromoottorien valmistukseen.
Ennen tata keksintoa ei alalla ollut tiedossa, onko olemassa yksi tai useampia ylavirran aktivointikohtia (tai sekvensseja, "UAS"), jotka sååtelevåt hiivan PH05-geenin ilmentymista. PH05-geeni koodittaa pois paalta kytketta-vissa olevaa hiivan happofosfataasia. Geeni kytkeytyy pois paalta suuressa epåorgaanisen fosfaatin pitoisuudessa ja kytkeytyy takaisin paalle silloin, kun epaorgaanista fosfaat-tia on lasna liian vahan (B. Meyhack et al., EMBO-J.
675 (1982)).
PH05-geenin 5'-alueen analyysi on nyt johtanut sellaisten ohella toimivien elementtien tunnistamiseen, jotka saatelevat PH05-geenin transkriptiota. PH05-geenin 5'-alueen BamHI-Sall-jakso (623 e), joka on kloonattu faagivektoriin M13mp9 (yhdistelmåvektori Ml3mp/PH05 Barn-Sal, ks. eurooppalainen patenttihakemus no. 143 081), pilkotaan eksonukleaasilla Bal31 lahtien Bam-kohdasta ja toisessa kokeessa lahtien Sal-kohdasta. Nain saadaan aikaan joukko lyhennettyja PH05-promoottorijaksoja, joille suoritetaan sekvenssianalyysi, ja joiden lyhennetty påa varustetaan synteettisella EcoRI-kytkijalla. Kun Sal-kohdasta ly-hennetyt jaksot ("vasemman kasivarren promoottorijaksot") liitetaån Bam-kohdasta lyhennettyihin jaksoihin ("oikean kasivarren promoottorijaksot"), saadaan aikaan joukko PH05-promoottorialueen deleetiomutantteja, joiden kyky saada aikaan PH05-rakennegeenin ilmentyminen tutkitaan. Nainvoitiin havaita, etta nukleotidien -225 - -263 vali-nen deleetio johtaa happofosfataasiaktiivisuuden vahe-nemiseen viidesosaan alkuperaisesta ja nukleotidien -361 - -392 tai -346 - -369 valinen deleetio johtaa happo-fosfataasiaktiivisuuden vahenemiseen kymmenesosaan (nukleotidien numerointi selviaa liitteenå olevasta piir-rokseeta 1). NMma vaikutukset lasketaan ylavirran akti-vointikohtien (UAS) lukuun, jotka ovat oleellisia PH05:n ilmentymiselle. Nukleotidin -365 laheisyydessa 6 oleva UAS sisaltyy PH05-geenin 5'-alueen 268 e:n BamHI-Clal-jaksoon (nukleotidit -274 - -541) ja siile on annettu nimeksi UAS1(PH05), kun taas nukleotidin -245 laheisyy-dessa oleva UAS sisaltyy PH05-geenin 5'-alueen 100 e:n Clal-BstEII-jaksoon (nukleotidit -174 - -273) ja siile on annettu nimeksi UAS2(PH05).
Esilla oleva keksinto koskee erityisesti ylavirran aktivointisekvensseja UAS1(PH05) ja UAS2(PH05), jotka sijaitsevat PH05-geenin BamHI-BstEII-jaksossa nukleoti-dien -174 ja -541 valissa.
Keksintd koskee lisaksi ylavirran aktivointisekvens-sia UAS1 (PH05) , joka on BamHI-Clal-jaksossa PH05-geenin nukleotidien -274 ja -541 valissa, ja ylavirran aktivoin-tisekvenssia UAS2(PH05), joka on Clal-BstEII-jaksossa PH05-geenin nukleotidien -174 ja -273 valissa.
Ylavirran aktivointisekvenssi UAS1(PH05) on erittain edullinen. UAS 1-saatosignaalin tarkka sijainti BamHI-Clal-jakson sisalla voitiin maårittåå. Niinpa UAS1-såatosignaali sijaitsee 31 e:n jaksossa (PH05-promoottorialueen valilla -381 - -351) . Jakson molemmat paat on edullista varustaa tasapaisilla kytkijoilla, jotka sisaltavåt sopivat kat-kaisukohdat, tai restriktioendonukleaasille, kuten EcoRI, spesifisilla lomittuvilla pailla. 31 e:n jakson emasjar-jestys on seuraava:
GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
Menetelmassa UAS1(PH05)- ja/tai UAS2(PH05)-sekvenssin sisaltavien DNA-jaksojen valmistamiseksi katkaistaan PH05-geenin sisaltava DNA, PH05-geeni tai sen 5'-paan osa sopi-villa restriktioendonukleaaseilla ja eristetaan halutut jak-sot. Esimerkiksi PH05:n 623 e:n BamHI-Sall-jakso (supra), joka sisaltaa PH05-promoottorin ja osan PH05:tta koodit-tavaa aluetta, pilkotaan restriktioendonukleaaseilla BamHI ja BstEII ja nain saatu 368 e:n alajakso, joka sisaltaa molemmat ylavirran aktivointialueet, eristetaan. Vastaa-vasti, kun edellaoleva BamHI-Sall-jakso katkaistaan BamHI:11a ja Clal:lla tai Claltlla ja BstEII:11a, saadaan 268 e:n BamHI-Clal-alajakso, joka sisaltaa UAS1(PH05):n, 7 91280 ja 100 e:n Clal-BstEII-alajakso, joka sisaltaa UAS2(PH05):n, vastaavasti. Jaksot ja alajaksot voidaan eristaå ja puh-distaa tavalliseen tapaan, esimerkiksi agaroosigeelielektro-foreesilla tai polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
DNA-jaksot, jotka sisaltavat keksinnonmukaiset yla-virrassa olevat aktivointikohdat, voidaan lyhentåH sinan-sa tunnetulla tavalla, kuten suorittamalla osittainen ha-jotus eksonukleaasilla, esimerkiksi Bal31:lla, siten, etta lyhentyneeseen jaksoon jaa jaljelle UAS-funktio. Lyhentaminen voidaan suorittaa jakson 5'-paasta tai 3'-paastå tai molemmista paista. Niiden alafragmenttien va-linta, joissa UAS-funktio on sailynyt, suoritetaan samoin kuin edella, kuten korvaamalla alkuperaiset, UAS(:t) sisaltavat sekvenssit lyhennetyilla sekvensseilla ja tutkimalla kykenevatko nain aikaansaadut PH05-promoottorin deleetio-mutantit saamaan aikaan PH05-rakennegeenin ilmentymisen. Keksinnonmukaiset jaksot ja niiden lyhennetyt johdannaiset, jotka sisaltavat yhden tai molemmat ylavirrassa olevat PH05-geenin aktivointikohdat, voidaan varustaa paihin liitetyillå synteettisilla kytkijasekvenssei1 -la, jotta yhdistelmapromoottorien rakentaminen tai vektoreihin liittåminen tulee helpommaksi.
PH05:n ylavirrassa olevan(at) aktivointikohdan(at) sisaltavat DNA-jaksot seka niiden lyhennetyt johdannaiset voidaan myos valmistaa kemiallisella DNA-synteesilla kayttamallS tavanomaisia, alalla hyvin tunnettuja mene-telmia. Sopivista menetelmista on esitetty yhteenveto julkaisussa S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983). Erityi-sesti voidaan kayttaa eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 146 785 kuvattuja menetelmia, joka julkaisu liitetaan tahan hakemukseen viitteeksi.
Esilla oleva keksinto koskee myos PH05-geenin ylavirrassa olevien aktivointikohtien kayttoa yhdistelmapromoottorien valmistamiseen seka yhdistelmapromoottoreita, jotka sisaltavat PH05-geenin ylavirran akti-vointikohtia.
Keksinto koskee erityisesti hiivan yhdistelmapromoottoreita, jotka sisaltavat tai varsinkin koostuvat 5'—ylapåan promoottorielementista, joka sisaltaa hiivan 8 PH05-geenin ylavirrassa olevan(at) aktivointikohdan(at), 3' -alapåån promoottorielementista, joka on peråisin muusta hiivageenista kuin PH05-geenistå, ja joka sisaltaa transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaan-luettuna ja loppuu lahelle luennanaloituskohtaa.
5'- ylapaassa oleva promoottorielementti on eri-tyisesti joku edellåmainituista, varsinkin 368 e:n BamHI-BstEII jakso, joka sisaltaa UAS1(PH05):n ja UAS2(PH05):n, tai 268 e:n BamHI-Clal-jakso, joka sisaltaå UAS1(PH05):n, tai joku naiden lyhennetty johdannainen, jossa UAS-funktio on jaljellå, kuten UAS1(PH05):n sisaltava 31 e:n jakso tai jopa sen pienempi alajakso.
3'-alapaan promoottorielementti on mielellaan joh-dettu voimakkaasti ilmentyvån hiivageenin promoottorista, erityisesti glykolyyttista entsyymia koodittavan hiivageenin promoottorista, kuten enolaasi-, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi- (GADPH), 3-fosfoglyseraattiki-naasi- (PGK), heksokinaasi-, puryvaattidekarboksylaa fosfofruktokinaasi-, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimutaasi-, pyruvaattikinaasi- (PyK), trioosifosfaatti-isomeraasi-, fosfoglukoosi-isomeraasi-tai glukokinaasigeenin promoottorista. 3'-promoottori-elementit sisaltåvåt TATA-alueen, jonka tehtaviin kuu-luu RNA-polymeraasi II:n sijoittaminen oikeaan trans-kriptionaloitusasemaan, seka oikeet transkriptionaloituskohdat (suuren mRNA:n aloituskohdat). TATA-alueen ala-puolella 3'-promoottorielementti ulottuu suuren mRNA:n alun ja luennanaloituskodonin (ATG) valiselle alueelle, mielellaan lahelle luennanaloituskodonia. TATA-alueen ylavirrassa sisåltavat 3'-promoottorielementit noin 50 -150 alkuperaista emåsparia. Ylavirran DNA-sekvenssin tarkka pituus ei ole oleellisen tårkea, koska UAS:ien ja TATA-alueen valisella etåisyydellå nayttåa olevan joustovaraa.
Taman keksinnon mukaisesti on etusijalle asetettava 3'-promoottorielementti GAPDH-promoottorista johdettu, jonka tiedetaan olevan yksi voimakkaimmista alalla tun-netuista hiivapromoottoreista (GAPDH-entsyymia voi olla 9 91280 jopa noin 5 % S. cerevisiaen kuivapainosta, ks. E.G.
Krebs, J. Biol. Chem. 200, 471 (1953)). 3'-GAPDH-pro- moottorielementti alkaa GAPDH-geenin nukleotidista -300 --180 ja paattyy nukleotidiin -1. Eraasså taman keksinnon edullisessa toteutustavassa 3'-promoottorielementti kat-taa GAPDH-geenin nukleotidit -199 - -1. Toisessa keksinnon edullisessa toteutustavassa 3'-promoottorielementti kattaa GAPDH-geenin nukleotidit -263 - -1.
Taman keksinnon mukaiset yhdistelmapromoottorit voi-vat sisaltaå yhden ainoan UAS(PH05):n tai useita samaa tyyppia edustavia UAS(PH05):ia, esimerkiksi UAS1(PH05), mielellaan paa-hantasuuntaan ryhmiteltyina. 3'-promoot-torielementtiin nåhden voi(vat) UAS(t) olla samassa tai vastakkaisessa suunnassa verrattuna aidon PH05- promoottorin suuntaan.
Keksinnbnmukaisten yhdistelmapromoottorien osat eli PH05:n UAS:n(:t) sisaltavå promoottorielementti ja TATA-alueen sisaltavå promoottorielementti liitetåån yhteen synteettisillå kytkijoillå,tasaisten påiden yhteenliittå-misellå tai, mikåli mahdollista, luontaisten yhteenso-pivien restriktiokohtien kautta. KeksinnSnmukaisten yhdistelmapromoottorien 5'- ja 3'-paa on edullista varus-taa synteettisellå kytkijållå, joka mahdollistaa liittå-misen vektori-DNA:han ja 3'-pååsså liittåmisen heterolo-gista proteiinia koodittavaan alueeseen.
Keksinnonmukaiset yhdistelmapromoottorit tåyttåvåt kaikki biotekniikassa kåyttokelpoisiksi katsottavien promoottorien vaatimukset. Ne ovat voimakkaita, indusoita-vissa muilla kuin kasvualustan vålttåmåttomillå hiili- ja typpilåhteillå ja helposti kåsiteltåvisså laboratorio-ja teollisessa mittakaavassa.
Esilla oleva keksinto koskee myos menetelmåå sellais-ten yhdistelmapromoottorien tuottamiseksi, jotka sisåltå-våt 5'-ylåpåån promoottorielementin , joka sisaltaå hiivan PH05-geenin ylåvirrassa olevan(at) aktivointikohdan(at), ja 3'-alapåån promoottorielementin, joka on peråisin muusta hiivageenistå kuin PH05-geenistå ja sisåltåå transkription- aloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna ia paattyy lå- 10 helle luennanaloituskodonia, ja menetelmasså liitetaan 5'-yla-paån promoottorielementti, joka sisaltaa hiivan PH05-geenin ylavirran aktivointikohdan(at), 3'-alapåan promoottori-elementtiin, joka on peraisin muusta hiivageenista kuin PH05-geenista sisaltåen funktionaalisen TATA-alueen ja loppuen lahelle luennanaloituskodonia.
Taman keksinnon edullisessa toteutustavassa pro-moottorielementtien yhteenliittaminen suoritetaan syn-teettisten kytkijoiden valityksella.
Edellåmainittu alaosassa oleva muun hiivageenin kuin PH05-geenin promoottorielementti valmistetaan pilk-komalla osittain vahva hiivapromoottori, esimerkiksi joku edellåmainituista, joka ulottuu suuren mRNA:n alun ja luennanaloituskodonin vålille, 5'-paaståan eksonukle-aasilla, esimerkiksi Bal31:l'la, ja liittamalla syntynee-seen tasaiseen 5'-paahan synteettinen kytkija-DNA.
Valitaan sellaiset promoottorielementit, joissa on sai-lynyt transkriptionaloituskohta(dat) ja TATA-alue mu-kaanlukien 50 - 150 emasparin pituiset sekvenssin TATA-alueen 5'-paassa. Valinta suoritetaan esimerkiksi kat-kaisemalla saadut promoottorielementit sellaisella rest-riktioendonukleaasilla, joka tunnistaa promoottoriele-mentin 5'-paSn synteettisen kytkijasekvenssin, ja sellaisella restriktioendonukleaasilla, joka tunnistaa promoottorielementin 3'-paan synteettisen kytkijasekvenssin ja maarittåmalla syntyneen DNA-jakson pituus agaroosigeelielektroforeesilla. 3'-promoottorielementit voidaan valmistaa myos alalla'tunnetuilla keniallisil-la synteesimenetelmilla.
Keksinnonmukaisia yhdistelmapromoottoreita voidaan kayttaa nisakasgeenien tehostettuun ja saadeltyyn ilmentamiseen hiivoissa.
2. Yhdistelmavektorit, jotka sisaltavat heterologista po-lypeptidia koodittavan geenin yhdistelmapromoottorin oh-jauksessa
Keksinto koskee myos hiivan yhdistelmavektoreita, jotka sisaltavat yhden tai useampia DNA-liitannaisia, joista kukin sisaltaa hiivaan verrattuna heterologista 11 91280 polypeptidiå koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistel-måpromoottorin ohjauksessa, joka koostuu 5'-ylapaån pro-moottorielementistå, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja 3'-alapåån promoottorielementistå, joka on peraisin muusta hiivageenista kuin PH05-geenista ja sisaltaa transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna.
Keksinnonmukaiset yhdistelmåvektorit voivat olla yhdistelmaplasmideja tai lineaarisia DNA-vektoreita.
Hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiå koo-dittava DNA-segmentti voi olla rtiika tahansa erilaisia polypeptideja edustavista DNA-jaksoista (geeneista), glykosyloituneet polypeptidit mukaanluettuina, erityi-sesti korkeammista eukaryooteista ja varsinkin nisak-kaista, kuten elåimistå tai erityisesti ihmisestå peraisin olevaa polypeptidiå koodittava. Esimerkkeina mainittakoon entsyymit, joita voidaan kayttåa esimerkik-si ravintoaineiden tuotantoon tai entsymaattisten reak-tioiden suorittamiseen kemiassa, tai ei-entsymaattiset polypeptidit, jotka ovat hyodyllisia ja kayttdkelpoisia ihmisten tai elainten sairauksien hoidossa tai ehkai-sysså, kuten hormonit, immunomodulatorisia, virusten-vastaisia tai kasvaintenvastaisia ominaisuuksia omaavat polypeptidit, vasta-aineet, virusantigeenit, rokotteet, hyytymistekijat, ruoka-aineet tms.
Esimerkkeja tallaisista polypeptideista ovat insu-liini, kasvutekijat, kuten orvaskeden, insuliininkaltai-nen, syottosolun, hermojen tai transformoiva kasvutekija, kasvuhormonit, kuten ihmisen tai naudan kasvuhormoni, interleukiini, kuten interleukiini-1 tai -2, ihmisen makro-faagien vaeltamista estava tekija (migration inhibitory factor, MIF), interferonit, kuten ihmisen a-interferoni, esimerkiksi interferoni·αΑ, aB, ao tai aF, β-interferoni, γ-interferoni tai yhdistelmainterferonit, esimerkiksi aA-aD- tai αΒ-aD-yhdistelmainterferoni, hepatiittivirus-antigeenit, kuten hepatiitti B-viruksen pinta- tai ydin-antigeeni tai hepatiitti A-viruksen antigeeni, plasmino-geenin aktivaattorit, kuten kudosplasminogeenin aktivaat-tori tai urokinaasi, kasvainnekroositekija, somatosta- 12 tiini, reniini, β-endorfiini, immunoglobuliinit, kuten immunoglobuliini D:n, E:n tai G:n kevyt ja/tai raskas ketju, inmmnoglobuliinia sitovat tekijat, kuten immunoglo-buliini E:tå sitova tekija, kalsitoniini, ihmisen kalsi-toniinille sukua oleva peptidi, veren hyytymistekijat, kuten tekija IX tai Ville, egliinit, kuten egliini C, desulfatodirudiinit, kuten desulfatohirudiinivariantti HV1, HV2 tai PA, tai ihmisen superoksididismutaasi. Etu-sijalle asetetaan ihmisen α-interferonia tai yhdistelmå-interferonia, ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria (t-PA), hepatiitti B-viruksen pinta-antigeeniå (HBVsAg), insuliininkaltaista kasvutekijåå I, egliini C:ta ja desulfatohirudiinivarianttia HV1 koodittavat geenit.
Yhdistelmapromoottori on varsinkin joku edellamaå-ritellyistå.
Keksinnonmukaiset yhdistelmavektorit voivat sisaltaa yhden tai useampia DNA-liitånnåisiå, joissa kussakin on mm. yhdistelmapromoottori ja hiivaan verrattuna heterologista polypeptidia koodittava DNA-segmentti. Jos yhdistelma-vektori sisaltaa useita DNA-liitannaisia, mielellaan 2-4 DNA-liitannaista, ne voivat olla tandem-ryhmityksessa tai eri kohdissa yhdistelmavektorissa. Etusijalle asetetta-vat yhdistelmavektorit sisaltavat yhden DNA-liitannaisen tai tandem-ryhmityksessa olevia useampia DNA-liitannaisia.
Taman keksinnon mukaisissa yhdistelmavektoreissa on hiivan yhdistelmapromoottori toimivasti liitetty polypeptidia koodittavaan alueeseen, jotta voidaan taata polypep-tidin tehokas ilmentyminen. Eraassa taman keksinnon edullisessa tnteutustavassa on hiivan yhdistelmapromoottori liitetty suoraan kypsåa polypeptidia koodittavaan alueeseen niin, etta luennanaloitussignaali (ATG) sijait-see liitoskohdassa. Edullinen alue hiivan yhdistelmapro-moottorin liittamiseksi polypeptidia koodittavaan alueeseen on endogeenista ATG:ta valittomasti edeltava alue.
Toisessa taman keksinnon edullisessa toteutustavas-sa rakenteeseen sisallytetaan signaalisekvenssi. Sopi-via signaalisekvensseja ovat esimerkiksi PH05-signaalisek-venssi, hiivan invertaasigeenin signaalisekvenssi tai a-tekijan pre-prosekvenssi seka ilmennettavaa polypepti- 13 91280 dia koodittavaan alueeseen luontaisesti liittyvat signaali-sekvenssit. Vaihtoehtoisesti voidaan rakentaa fuusioitu-ja signaalisekvensseja. Sellaiset kombinaatiot asetetaan etusijaile, jotka mahdollistavat tarkan katkeamisen sig-naalisekvenssin ja kypsan polvpeptidin sekvenssin valista. Rakenteisiin voidaan sisållyttåå myos muita sekvenssejå, kuten pro- tai vålikesekvensseja, jotka haluttaessa voi-vat sisåltåå spesifisia prosessointisignaaleja, jotta pre-kursorimolekyylien tarkka prosessointi tulee mahdolliseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa yhdistelmaproteiineja, jotka sisaltavat sisaisia prosessointisignaaleja, jotka mahdollistavat asianmukaisen kypsymisen in vivo tai in vitro. Prosessointisignaalit sisaltavat mielellaan Lys-Arg-tåhteen, jonka erittymistiesså sijaitseva hiivan endo-peptidaasi tunnistaa.
Geenin ilmentymisen jalkeen geenituote joutuu erit-tymisprosessiin ja kuljetetaan periplasmiseen tilaan. Jos voidaan saavuttaa viela erittyminen solunseinan lapi kasvualustaan, ovat saavutettavissa olevat saannot to-dennakoisesti paljon suurempia. Myos talteenottoproses-si on yksinkertaisempi, jos soluja ei rikota. Lisaksi polypeptidi voidaan saada talteen ilman N-paan lisame-tioniinia, koska kypsåa polypeptidia koodittavan sekvenssin edessa ei tarvita ATG-luennanaloitussignaalia. Koska glykosyloituminen liittyy erittymistiehen, tuotetun poly-peptidin ajatellaan olevan glykosyloitunut (edellyttaen, etta glykosylointikohdat ovat lasna). On olemassa useita seikkoja, jotka tekevat glykosyloituneista polypeptideista edullisia glykosyloitumattomiin verrattuina. Glykosyloitunut polypeptidi muistuttaa laheisemmin aitoa nisakas-solun polypeptidia kuin glykosyloitumaton. Lisaksi tallaisten proteiinien tertiaarirakenne luultavasti riip-puu tietyssa maarin glykosyylitahteiden lasnaolosta. Oletettavasti hiilihydraattitahteiden låsnaolo naissa molekyyleissa vaikuttaa edullisella tavalla kemialliseen stabiilisuuteen ja farmakologiseen aktiivisuuteen.
Keksinnonmukaiset yhdistelmavektorit sisaltavat mielellaan myos hiivageenin 3'-oheissekvenssin, jossa on asianmukaiset signaalit transkription lopettamiselle ja 14 polyadenyloinnille. Etusijalle asetettava 3'-oheissekvens-si on hiivan PH05-geenille kuuluva.
Keksinto koskee erityisesti lineaarista DNA-molekyy-liS, joka oleellisesti ottaen koostuu yhdistelmapromoot-torista, jossa on 5'-ylåpaåsså hiivan PH05-geenin promoot-torielementti, joka sisaltaa UAS:n(:t), ja 3'-alapåMssa muun hiivageenin kuin PH05-geenin promoottorielementti, joka sisaltaa transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, hiivaan verrattuna heterolo-gista polypeptidia koodittavan DNA-segmentin, joka on mainitun promoottorin ohjauksessa, seka DNA-segmentin, joka sisaltaa hiivan PH05-geenin oikealla tavalla sijait-sevat transkriptionlopetussignaalit.
Johtuen homologisista 3'- ja 5'-oheissekvensseista intergoituu polypeptidia koodittavan alueen sisaltavå DNA-vektori kokonaisuudessaan stabiilisti hiivan kromo-somin PH05-lokukseen.
Keksinto koskee erityisesti rengasmaisia yhdistel-maplasmideja, jotka yhdistelmåpromoottorin, polypeptidia koodittavan alueen ja 3'-oheissekvenssien lisåksi sisal-tavat lisa-DNA-sekvenssin(eja), jotka eivat ole valtta-mattdmia tai ovat vahemman tarkeita promoottorin toimin-nalle eli polypeptidia koodittavan alueen ilmentymiselle, mutta jotka suorittavat tarkeita toimintoja, esimerkiksi mainituilla yhdistelmavektoreilla transformoituneiden hii-vasolujen lisaantymisessa. Liså-DNA-sekvenssit voivat olla prokaryoottisista ja eukaryoottisista soluista joh-dettuja ja saattavat sisaltaa kromosomaalisia ja/tai ekstrakromosomaalisia sekvensseja. Lisa-DNA-sekvenssit voivat olla peraisin (tai koostua) plasmidi-DNA:sta, kuten bakteeri- tai eukaryoottiplasmidi-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromosomaalisesta DNArsta, kuten baktee-rien, hiivojen tai korkeampien eukaryoottien kromosomaalisesta DNA:sta. Etusijalle asetettavat yhdistelmåplas-midit sisaltavat sellaisia lisa-DNA-sekvensseja, jotka on johdettu bakteeriplasmideista, erityisesti Escherichia colin plasmidista pBR322 tai siile sukua olevista plas-mideista, bakteriofaagi λ:sta, hiivan 2y-plasmidista ja/tai hiivan kromosomaalisesta DNA:sta.
15 91280
Erityisesti sisaltavat liså-DNA-sekvenssit hii-van replikonin ja geneettisen valintamerkin hiivaa vårten. Yhdistelmaplasmidit, jotka sisaltavat hiivan replikonin, esimerkiksi kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), pysyvat ylla hiivasolussa kromosomin ulko-puolella transformoitumisen jalkeen ja replikoituvat autonomisesti mitoosissa. Yhta hyvin voidaan kayttaa yhdis-telmåplasmideja, jotka sisaltavat hiivan 2y-plasmidi-DNA:lie homologisia sekvensseja. NSma yhdistelmaplasmidit integ-roituvat rekombinaatiolla jo ennestaan solussa låsnaoleviin 2y-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. 2u-sek-venssit soveltuvat erityisen hyvin suurella frekvenssilla transformoiviin plasmideihin ja tuottavat suuria kopiomaa-riå.
Hiivan geneettiseksi valintamerkiksi soveltuu mika tahansa merkkigeeni, joka mahdollistaa transformanttien valinnan merkin fenotyyppisen ilmentymisen perusteella.
Sopivia hiivoissa kaytettaviå merkkeja ovat erityisesti sel-laiset, jotka antavat vastustuskyvyn antibiootin suhteen, tai auksotrofisten hiivamutanttien kohdalla geenit, jotka taydentavat kyseisia puutteellisuuksia. Tallaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn sykloheksimidianti-biootille tai antavat prototrofian auksotrofiselle hiiva-mutantille, kuten esimerkiksi URA3-, LEU2-, HIS3- tai TRP1-geenin. Merkkeina on myos mahdollista kayttaa rakennegeeneja, jotka liittyvat autonomisesti replikoi-tuvaan segmenttiin edellyttåen, ettM transformoitava isanta on auksotrofinen merkin ilmentamalle tuotteelle.
On edullista, jos keksinndnmukaisissa yhdistelma-plasmideissa lasnaolevat lisa-DNA-sekvenssit sisaltavat myos replikonin ja geneettisen valintamerkin bakteeri-isannalle, erityisesti Escherichia colille. On olemassa seikkoja, jotka tekevat E. colin replikonin ja E. colin merkin låsnaolon edulliseksi hiivan yhdistelmavektorissa. En-sinnåkin voidaan saada aikaan suuria maaria yhdistelmavekto-ri-DNA:ta kasvattamalla ja lisaamalla sita E. colissa, ja toiseksi yhdistelmavektorien rakentaminen on edullista suo-rittaa E. colissa, jolloin voidaan kayttaa hyvaksi laa-jaa E. coliin perustuvaa kloonausteknologiaa. E. colin plas- 16 midit, kuten pBR322 tms., sisaltavat sekå E. colin repliko-nin etta E. colin geneettiset merkit, jotka antavat vas-tustuskyvyn antibioottien suhteen, kuten esimerkiksi tetra-sykliinin ja ampisilliinin suhteen, ja joita voidaan edul-lisesti kayttaå osina hiivan yhdistelmåvektoreissa.
Lisa-DNA-sekvenssiå, joka sisaltaa esimerkiksi rep-likoitumisen aloituskohdan ja geneettiset merkit hiivalle ja bakteeri-isannalle (ks. edella), kutsutaan jåljempana "vektori-DNA":ksi, joka yhdessa hiivan promoottorin ja po-lypeptidia koodittavan alueen kanssa muodostavat keksinnon-mukaisen yhdistelmaplasmidin.
Tamån keksinnon edullinen toteutustapa koskee yhdis-telmåplasmideja, jotka kykenevat replikoitumaan, ja jotka voidaan valita fenotyypin perusteella hiivakannoissa, ja jotka sisaltavat hiivan yhdistelmapromoottorin ja hetero-logista polypeptidia koodittavan DNA-sekvenssin, ja mai-nittu DNA-sekvenssi on sijoitettu yhdessa transkription-aloitus- ja lopetussignaalien kanssa mainittuun yhdistel-maplasmidiin mainitun yhdistelmapromoottorin ohjaukseen siten, etta se ilmentyy mainitussa hiivakannassa tuottaen mainittua polypeptidia.
Keksinnonmukaiset yhdistelmavektorit valmistetaan sinansa tunnetuilla menetelmilla, esimerkiksi liittåmålla yhdistelmapromoottori, jossa on 5'-ylapaassa hiivan PH05-geenin promoottorielementti, jossa on UAS(:t), ja 3'-alapaan promoottorielementti, joka on peraisin muun hii-vageenin kuin PH05-geenin promoottorista, ja joka sisaltaa transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mu-kaanluettuna, DNA-segmentti, joka koodittaa hiivaan verrattuna heterologista polypeptidia, ja hiivageenin 3'-oheis-sekvenssit yhteen siten, etta mainittu DNA-segmentti on mainitun yhdistelmapromottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja haluttaessa liitetaan mukaan yksi tai useampia lineaarisia DNA-jaksoja, jotka muodostavat DNA-vektorin.
On edullista kayttaa kartoitettua lineaarista tai mieluummin rengasmaista vektori-DNA:ta, esimerkiksi baktee-riplasmidi-DNA:ta tai vastaavaa (ks. edella), jossa on våhintaan yksi restriktiokohta, mieluummin kaksi tai 17 91280 useampia restriktiokohtia. On edullista, jos vektori-DNA:ssa on valmiina replikoitumisen alituskohdat ja geneettiset mer-kit hiivalle ja/tai bakteeri-isånnålle. Tama vektori-DNA katkaistaan kayttamalla sopivaa restriktioendonukleaasia. Katkaistuun DNA:han liitetaan lineaarinen DNA-jakso, joka sisaltaa mm. hiivan yhdistelmapromoottorin ja polypeptidiå kooditta-van DNA-segmentin. Ennen yhdistelmåpromoottorin ja poly-peptidia koodittavan alueen liittåmistå tai sen jalkeen (tai samanaikaisesti) on myos mahdollista liittaa mukaan repli-koitumisenaloituskohdat ja/tai merkit hiiva- tai bakteeri-isantaa vårten. Kaikissa tapauksissa katkaisu- ja liitta-misolosuhteet on valittava niin, ettei vektori-DNA:n eika yhdistelmapromoottorin oleellisiin toimintoihin vaikuteta. Yhdistelmavektori voidaan rakentaa perakkaisesti tai liitta-malla yhteen kaksi DNA-segmenttiå, jotka sisaltavat kaikki tarvittavat sekvenssit.
Eri tekniikoita voidaan kayttaa DNA-segmenttien yh-teenliittamiseen in vitro. Tylpat paat (joissa on taydel-lisesti emaspariutuneet DNA-kahdenteet', joita eraat rest-riktioendonukleaasit tuottavat, voidaan liittaa suoraan yhteen T4 DNA-ligaasin avulla. Tavallisimmin DMA-segmentit liitetaan yhteen yksisåikeisten kohesiivisten paidensa kautta ja paat suljetaan DNA-ligaasilla, esim. T4 DNA-ligaasilla. Tallaiset yksisaikeiset "kohesiiviset paat" voidaan muodostaa katkaisemalla DNA toista luokkaa edusta-villa endonukleaaseilla, jotka tuottavat porrastettuja pai-ta (kaksi DNA-kahdenteen saietta katkeaa eri kohdista niin, etta katkeamiskohdat ovat muutaman nukleotidin paassa toi-sistaan). Yksinkertaisia saikeita voidaan myos muodostaa lisaamalla nukleotideja tylppiin paihin tai porrastettui-hin paihin kayttamalla terminaalista transferaasia ("homo-polymeerihannitys") tai yksinkertaisesti vain nakertamalla tylppapaisen DNA-segmentin toista saietta sopivalla eksonuk-leaasilla, kuten λ-eksonukleaasilla. Viela eras edullinen tapa tuottaa porrastettuja paita on liittaa tylppapaisiin DNA-segmentteihin kemiallisesti syntetisoitu kytkija-DNA, joka sisaltaa porrastettuja paita tuottavan endonukleaasin tunnistuskohdan, ja katkaista saatu DNA kyseisella endo- 18 nukleaasilla.
Jotta geeni ilmentyisi tehokkaasti, sen pitaa sijai-ta oikealla tavalla suhteessa niihin sekvensseihin, jotka si-såltavåt transkriptionaaliset (hiivan yhdistelmåproraoottori) ja luennalliset funktiot. Ensinnakin yhdistelmåpromoottorin sisaltSvan DNA-segmentin liittyminen polypeptidiå kooditta-vaan alueeseen pitaa saada tapahtumaan oikeassa suunnassa.
Jos kaksi suuntaa on mahdollista, pitaS oikea maarittaa ta-vanomaisella restriktioanalyysillå. Yhdistelmåvektorit, jotka sisaltavat vaårassa suunnassa olevan polypeptidigeeni-liitånnaisen, saatetaan oikein suunnatuiksi leikkaamalla geeniliitannainen irti sopivalla restriktioendonukleaasilla ja liittåmålla geeni uudestaan yhdistelmavektorijaksoon. Joka tapauksessa våarå suunta voidaan valttaa liittamalla kyseiset kaksi DNA-segmenttia yhteen niin, etta kummassakin paassa on eri restriktiokohta. Lisaksi yhdistelmavektorin rakentaminen pitaisi suorittaa siten, etta se mahdollistaa oikean trans-kription aloituksen ja lopetuksen. Mita viimeksimainittuun nakokohtaan tulee, pitaisi transkription kohteena olevan alueen mieluummin paattya hiivan kromosomaalisesta DNA: sta tai hiivan 2y-plasmidista johdettuun DNA-sekvenssiin.
On edullista, jos transkription kohteena oleva DNA-sekvenssi paåttyy sellaiseen DNA-sekvenssiin, joka sisaltåa hiiva-geenin, esim. PH05 tai TRP1, transkriptionlopetussignaalit. Toiseksi pitaa saada syntymaan oikea lukuvaiheistus. Taval-lisesti promoottorialueen ja polypeptidiå koodittavan alueen nukleotidisekvenssi tunnetaan ennen yhteenliittamista tai ne voidaan maarittaa helposti, joten oikean lukuvai-heistuksen aikaansaamisessa ei ole mitaan vaikeutta.
Jos halutaan saada aikaan kypsan polypeptidin il-mentyminen suoraan, yhdistelmapromoottorialuetta mahdolli-sesti seuraavat ja/tai kypsaa polypeptidiå koodittavaa alu-etta mahdollisesti edeltavat signaalisekvenssit tai sen osat pitaa poistaa esimerkiksi pilkkomalla eksonukleaa-silla, esim. Bal31:lla. Edullinen alue hiivan promoottorin liittamiseksi polypeptidiå koodittavaan sekvenssiin, on suuren mRNA:n alun ja luennanaloituskodonin ATG valissa.
Kun liittaminen suoritetaan talla alueella, pitSisi poly- 91280 1 9 peptidia koodittavalla alueella olla oma ATG-kodoni luennan aloitusta vårten tai muussa tapauksessa se pitaa tuoda lisååmållå synteettinen oligonukleotidi. Hiivan yhdistel-måpromoottori voidaan myos liittåa polypeptidiå kooditta-vaan sekvenssiin kåyttåmållå synteettistå oligodeoksinuk-leotidiå liitosmolekyylinå. Niinpa yhdistelmapromoottori-alue voidaan, mikali mahdollista, katkaista restriktio-entsyymilla laheltå 3'-pååtå niin, ettå puuttumaan jaa tietty maara emaspareja. Vastaavasti voidaan polypeptidiå koodittava alue katkaista lahelta 5'-paåtaan. Sen jålkeen voidaan rakentaa synteettinen oligodeoksinukleotidi siten, etta liitettaessa hiivan yhdistelmåpromoottori poly-peptidia koodittavaan sekvenssiin kytkijåoligodeoksinukleo-tidisekvenssin avulla saadaan puuttuvat emasparit ATG-luen-nanaloitussignaali mukaanlukien seka polypeptidiå koodittava sekvenssi palautetuiksi oikeaan lukuvaiheistukseen suhteessa promoottoriin.
Halutun yhdistelmavektorin sisaltavaa yhteenliit-tamisseosta kaytetaan sellaisenaan transformoinnissa tai se rikastetaan ensin yhdistelmavektorin suhteen esim. geeli-elektroforeesilla, ja sen jålkeen suoritetaan transfor-mointi.
Vålituotteilla, kuten vektoreilla, joista puuttuu vielå yksi tai useampia oleellisia funktioita, tai kek-sinndnmukaisilla lopullisilla yhdistelmåvektoreilla voidaan haluttaessa transformoida bakteeri-isåntå, erityi-sesti E. coli, edellåmainituista syistå (esim. haluttaessa tuottaa suuria måariå vålituotteita tai yhdistelmåplas-midejå vastaavasti). Tåhån tarkoitukseen voidaan edulli-simmin kåyttåå bakteerivektoreita, kuten E. colin plas-midia pBR322 ja sen osia, jotka sisåltåvåt bakteerin rep-likoitumisen aloituskohdan ja geneettisen merkin tai geneettisiå merkkejå. Tållaista bakteerivektoria kåytet-tåesså sisåltåvåt lopulliset hiivan yhdistelmåvektorien valmistusvaiheet mielellåån myos hiivan geneettisen merkin ja replikoitumisen aloituskohdan liittåmisen.
20 3. Hiivan transformointi polypeptidia koodittavan sekvens-sin sisaltavilla yhdistelmavektoreilla
Viela eras taman keksinnon kohde koskee menetelmåa sellaisten transformoituneiden hiivasolujen tuottamiseksi, jotka kykynevåt saamaan aikaan hiivalle heterologista polypeptidia, siten, etta transformoidaan hiivasolut yhdistel-mavektorilla, joka sisaltaa yhden tai useampia DNA-liitan-naisia, joista kukin sisaltaa hiivaan verrattuna heterologista polypeptidia koodittavan DNA-segmentin sellai-sen yhdistelmapromoottorin transkriptionaalisessa ohjauk-sessa, joka koostuu 5'-ylapaan promoottorielementista, jos-sa on hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja 3 ' - alapaan pramoottori-elementistå, joka on peraisin muusta hiivageenista kuin PH05-geenista ja sisaltaa transkriptionaloituskohdat funktio-naalinen TATA-alue mukaanluettuna.
Saccharomyces-, Kluyveromyces-, Candida-, Rhodotorula-ja Torulopsis-sukuun seka naille laheista sulua olevat lajit ovat kayttokelpoisia (ks. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971), erityisesti Saccharomyces cerevisiae-kannat.
Hiivojen transformointi yhdistelmavektoreilla voidaan suorittaa alalla tunnetuilla menetelmilla, esimerkiksi Hin-nen et al:n kuvaamalla menetelmalla (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA TS_, 1929 (1978)). Tåmå menetelma jakautuu kolmeen vaiheeseen: (1) Hiivan solunseinån tai sen osien poisto.
(2) "Alastomien" hiivasolujen (sferoplastien) kasittely transformoivalla DNArlla PEG:n (polyetyleeniglykoli) ja Ca^+-ionien låsnaollessa.
(3) Solunaeinan regenerointi ja transformoituneiden solu-jen valinta kiinteassa agarkerroksessa.
Seuraavat menetelmat ovat edullisia: (1) : Hiivan solunseina poistetaan entsymaattisesti kayttamalla erilaisia glukosidaasivalmisteita, kuten eta-nan mahanesteita (esim. Glusulas^; tai Helicase^) , mikro-organismeista saatuja entsyymiseoksia (esim. Zymolyase*^ , osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esim. 1 M sorbitoli).
(2) : Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n las- naollessa ja nain indusoituu solukalvojen paikallisia fuu- 21 91280 sioita. "Fuusionkaltaisten" olosuhteiden syntyminen on valttamatonta ja monista transformoituneista hiivasoluista tulee diploidisia tai triploidisia transformoinnin kulu-essa. Menetelmia, jotka mahdollistavat fuusioitujen sfero-plastien valinnan, voidaan kayttaa transformanttien ri-kastamiseen eli transformoituneet solut voidaan helposti seuloa ennalta valittujen fuusiotuotteiden joukosta.
(3): Koska soluseinåttomåt hiivasolut eivat jakau- du, pitaa soluseina regeneroida. Tåmå regenerointi on edul-lista suorittaa peittåmalla sferoplastit agariin. Esimer-kiksi voidaan sulaa agaria (noin 50°C) sekoittaa sferoplas-teihin. Kun seos jaahdytetaan hiivan kasvulampotilaan (noin 30°C), saadaan kiintea kerros. Taman agarkerroksen tarkoi-tuksena on eståa nopea diffuusio ja oleellisten makromo-lekyylien poistuminen sferoplasteista, jolloin soluseinan regeneroituminen helpottuu. Soluseinan regeneroituminen voidaan myos saada aikaan (vaikkakin pienenunållå teholla) kasvattamalla sferoplasteja valmiiden agarkerrosten pin-nassa.
Regenerointiagarin koostumus on edullista valita niin, etta transformoituneet solut voidaan regeneroida ja valita samanaikaisesti. Koska valintamerkkeina kaytetaan tavalli-sesti hiivageeneja, jotka koodittavat aminohappobiosyn-teesin entsyymeja, on regenerointi edullista suorittaa hiivan minimikasvualustaa sisåltavassa agarissa. Jos vaa-ditaan erittåin korkeita regenerointitehoja, on seuraava kaksivaiheinen menetelma edullinen: (1) Soluseina regene- roidaan ravintorikkaassa alustassa ja (2) transformoituneet solut valitaan kasvattamalla solukerroksesta kopio selektiivisella agarlevyllå.
Jos yhdistelmavektori ei sisalla mitaån merkkigeenia, voidaan transformoituneet solut tunnistaa vaihtoehtoisilla menetelmilla. Tallaisia menetelmia ovat esimerkiksi in situ-hybridisaatio leimatulla DNA-fragmentilla, joka si-saltaa yhdistelmavektorin kanssa homologisia sekvensseja (esim. Hinnen et al:n mukaan, supra), in situ-immunomaåri-tyksilla edellyttaen, etta liitetyn geenin aikaansaaman tuotteen vasta-aine on saatavissa, tai muilla seulontame- 22 netelmillå, jotka mittaavat transformoinnissa kaytetyn plasmidin koodittamia geenituotteita.
Vaihtoehtoisesti voidaan hiiva yhteistransformoida keksinnonmukaisella yhdistelmavektorilla seka toisella vek-torilla, joka sisaltaa hiivan geneettisen valintamerkin.
Jos kyseisilla kahdella eri vektorilla on yhteisia DNA-sekvensseja (nama voivat olla vektoreissa låsnåolevia bak-teerisekvenssejå), tapahtuu rekombinaatio, josta on seu-rauksena fuusioitunut, valinnan mahdollistava yhdistelma-molekyyli.
Hiiva voidaan myos yhteistransformoida lineaarisel-la DNA-vektorilla, joka sisaltaa hiivan yhdistelmapromoot-torin, mainitun promoottorin ohjauksessa olevan heterolo-gista polypeptidia koodittavan alueen ja hiivan PH05-geenin transkriptionlopetussignaalit, ja hiivan valintamerkin sisaltavalla vektorilla. Yhteistransformointi mah-dollistaa sellaisten hiivasolujen rikastamisen, jotka ovat ottaneet DNA:ta, jota ei voi suoraan valita merkin perus-teella. Koska transformointikelpoiset solut ottavat vastaan mita tahansa DNA-tyyppia, on suuri osa soluista transformoitunut valinta-DNA:n lisaksi myos toisella DNArlla (kuten edellamainitulla lineaarisella DNA:11a).Koska polypeptidigeeni sisaltaa riittavan pitkia homologisia sekvensseja (esim. noin 20 - 100 deoksinukleotidia pitkia), polypeptidigeeni integroituu isåntakromosomiin stabiilisti. Taman keksinnon mukainen spesifinen rakenne johtaa heterologisen geenin stabiiliin integroitumiseen PH05-geenin koh-taan kromosomissa eli hiivan kromosomiin II.
Nain saatuja, keksinnonmukaisia yhdistelmaplasmi-deja sisaltavia hiivakantoja voidaan parantaa heterologis-ten polypeptidien tuotannon suhteen aikaansaamalla mu-taatioita ja suorittamalla valintaa alalia tunnetuilla menetelmilla. Mutaatiot voidaan saada aikaan esimerkiksi UV-sateilytyksella tai sopivilla kemiallisilla reagensseil-la .
On havaittu, etta transformointi keksinnonmukaisilla yhdistelmavektoreilla ja solunseinien regenerointi rikkaas-sa kasvualustassa, joka sisaltaa glukoosia hiililahteena, voidaan suorittaa edullisesti ja on oleellisesti helpompaa 23 91280 kuin saman suorittaminen sellaisilla yhdistelmavektoreilla, jotka sisaltavat tavanomaisia, glukoosilla indusoituvia promoottoreita, jolloin toimenpiteet pitaa suorittaa glukoosittomassa alustassa, jotta voidaan valttaa mah-dollisesti letaalisen geenituotteen kertyminen solujen sisaan.
Keksinto koskee myos hiivaisantiå, jotka ovat trans-formoituneet sellaisilla yhdistelmavektoreilla, jotka sisaltavat yhden tai useampia DNA-liitannaisia, joista kukin sisaltaa hiivaan verrattuna heterologista polypeptidia koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistelmapromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-ylapaan promoottorielementista, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja 3'-alapaan promoottorielementista, joka on peraisin muusta hiivageenista kuin PH05-geenista ja sisaltaa transkription-aloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna seka naiden mutantteja.
4. Transformoituneiden hiivasolujen viljely ja ilmenty-neen polypeptidin eristaminen
Keksinto koskee myos menetelmaa hiivaan verrattuna heterologisen polypeptidin tuottamiseksi siten, etta hiiva-kantaa, joka on transformoitunut yhdistelmavektorilla, joka sisaltaa yhden tai useampia DNA-liitannåisiå, joista kukin sisaltaa hiivaan verrattuna heterologista polypeptidia koodittavan DNA-segmentin sellaisen yhdistelmapromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-yla-paan promoottorielementista, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(:t)ja 3'-alapaan promoottorielementista, joka on peraisin muusta hiivageenista kuin PH05-geenista ja sisaltaa transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, tai taman mutanttia viljellaan ja ilmentynyt polypeptidi eristetaan.
Keksinnonmukaisia transfromoituneita hiivasoluja viljellaan alalia tunnetuilla menetelmilla nestemaisessa kasvualustassa, joka sisaltaa assimiloituvia hiili- ja typpilahteita, epaorgaanisia suoloja ja tarvittaessa kasvua ediståvia aineita.
Voidaan kayttåa erilaisia hiililåhteita. Edullisia 24 hiililahteita ovat esimerkiksi assimiloituvat hiilihydraa-tit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli ja laktoosi, tai asetaatit, kuten natriumasetaatti, vksin tai sopivina seok-sina kaytettyina. Sopivia typpilahteita ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit seka niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni ja lihauutteet, ja edelleen hiivauute, mallasuute, maissin-liotusvesi ja ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -sul-faatti tai -nitraatti, joita voidaan kayttåa yksin tai seoksina. Sopivia epaorgaanisia suoloja ovat mm. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatti, kloridi, fosfaatti ja karbonaatti. Kasvualusta voi lisaksi sisaltaa kasvua ediståvia aineita. Kasvua edistavia aineita ovat mm. kasvunedistysaineet, hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms., ja yksittSiset aminohapot.
Koska keksinnonmukaiset yhdistelmapromoottorit ovat saatelyn alaisia, pitaå kasvualustan koostumus sovittaa kasvuvaiheen mukaan. Kasvuvaiheen aikana, jolloin fosfaat-tipitoisuus on korkea, ovat keksinnonmukaiset yhdistelmapromoottorit kaytannollisesti katsoen pois paalta kytket-tyina. Esimerkiksi kaikkein edullisin taman keksinnon mu-kainen yhdistelmapromoottori, joka sisaltaa 5'-ylåpaassa PH05:n promoottorielementin, jossa on PH05:n UAS:t, ja 3'- alapåassa GAPDH:n promoottorielementin, jossa on TATA-alue, on kytketty pois paalta niin, etta sen teho on pudonnut viidenteenkymmenenteen osaan. Nain olien mah-dollisesti toksisia geenituotteita syntetisoituu hvvin pienina maarina ja solujen aineenvaihduntaan kohdistuvat haitalliset vaikutukset jaavat mahdollisimman vahåisiksi.
Kun on saavutettu riittava solutiheys, ravintoalustan sisal-tama epaorgaanisen fosfaatin pitoisuus mielellåan laske-taan matalaksi (matala-P^-alusta). Talloin keksinndnmu-kaiset yhdistelmapromoottorit kytkeytyvat paalle ja saadaan mahdollisimman suuri maara mRNA-transkripteja.
Kasvatus suoritetaan tavallisilla menetelmilla. Kasvuolosuhteet, kuten lampotila, alustan pH ja fermentoin-tiaika valitaan siten, etta haluttua polypeptidia valmis-tuu mahdollisimman paljon. Yleensa kasvatus suoritetaan aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmana ravistele- 25 91280 malla tai sekoittamalla noin 25 - 35°C låmpotilassa valilla 4-8 olevassa pH:ssa, esimerkiksi noin pH:ssa 7, noin 4 -20 tunnin kuluessa, mielellaan siksi, kunnes haluttua pro-teiinia on saatu maksimaalinen maårå.
Ilmentyneen polypeptidin eriståminen ja puhdista-minen suoritetaan haluttaessa alalla tunnetuilla menetelmillå.
Kun transformoituneet solut ovat kasvaneet tyydyttå- vaan solutiheyteen, vapautetaan ilmentyneen proteiinin talteenoton ensimmåisesså vaiheessa proteiini solun sisål- ta. Useimmissa menetelmissa soluseina poistetaan ensin entsymaattisella hajotuksella, esim. kåyttåmållå glykosi- daaseja. Nain saadut sferoplastit kasitellaan pinta-aktii- visilla aineilla, kuten Tritonilla. Vaihtoehtoisesti voi- daan solujen rikkomiseen kayttaa mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimia (esimerkiksi X-puristin, ranskalainen puris- tin) tai ravistelua lasihelmien kanssa. Nain saatu seos rikastetaan halutun polypeptidin suhteen kayttåmalla ta- vanomaisia menetelmia. Voidaan esimerkiksi poistaa suurin osa ei-proteiinimateriaalista polyetyleeniamiinikasitte- lylla ja saostaa proteiinit kyllastamalla liuos ammonium- sulfaatilla tai trikloorietikkahapolla ja suorittamalla geelielektroforeesi, dialyysi, kromatografinen kasittely, esim. ioninvaihtokromatografointi, ekskluusiokromatogra- fointi, HPLC tai kaanteisfaasi-HPLC, tai erottelu mole- (g, kyylikoon mukaan sopivassa Sephadex^-pylvaassa tms. Esi-puhdistettu tuote voidaan puhdistaa lopulliseen puh-tauteensa esimerkiksi vasta-aineaffiniteettikromatografiaa kayttamalla.
Siina tapauksessa, etta hiivasolu erittåa halutun polypeptidin periplasmiseen tilaan, voidaan kayttaa yksin-kertaisempaa menetelmaa. Polypeptidi voidaan ottaa talteen solua hajottamatta, silla riittaa vain solun seinan poisto entsymaattisesti tai kasittely kemiallisilla aineilla, kuten tiolireagensseilla tai EDTA:lla, jotka vaurioittavat solunseinia mahdollistaen polypeptidin vapautumisen. Jos polypeptidi erittyy suoraan kasvualustaan, se voidaan ottaa talteen sielta.
Jos saadaan glykosyloituneiden ja glykosyloitumat- 26 tomien proteiinien seos, voidaan seoksen aineosat erottaa toisistaan esimerkiksi suorittamalla kromatografia konkana-valiini-A-Sepharose'*^-py lvååsså. Glykosyloitumattomat tuotteet kulkevat pylvaan lapi, kun taas glykosyloituneet tuotteet adsorboituvat selektiivisesti ja ne voidaan eluoida tavallisilla menetelmilla, esimerkiksi kayttamalla a-metyylimannosidia yhdesså l·aotrooppisen aineen, kuten KSCN:n kanssa.
On myos mahdollista poistaa glykosyylitåhteet entsv-maattisesti, esimerkiksi kayttamalla endoglykosidaasia H tai F. Nåin saadaan aikaan glykosyloitumattomia tuottei-ta oleellisesti ottaen puhtaassa muodossa.
Tama keksinto koskeekin myos kaikkia sellaisia poly-peptideja, jotka on valmistettu keksinnonmukaisilla menetelmilla .
Keksinto koskee erityisesti PH05:n ylavirran akti-vointisekvensseja, yhdistelmapromoottoreita, yhdistelma-vektoreita, transformoituneita hiivasoluja ja menetelmia niiden valmistamiseksi seka hiivalle heterologisten poly-peptidien valmistusmenetelmaa, kuten esimerkeisså on se-lostettu.
Seuraavassa kokeellisessa osassa taman keksinnon erilaisia toteutustapoja selostetaan viittaamalla liittee-na oleviin kuviin.
Kuva 1 esittaa PH05-promoottorialueen BamHI-Sall-jakson DNA-sekvenssiå.
Kuva 2 esittaa GAPDH:n promoottorialueen DNA-sekvens-sia (klooni 491, ks. G.A. Bitter et al., Gene J2, 263 (1984)).
Kuva 3 on kaaviokuva plasmidin pGAPDH-EL valmista-misesta.
Kuva 4 esittaa tassa keksinnossa kaytettyja GAPDH-geenin 3'-promoottorielementteja.
Kuva 5 esittaa plasmidin pJDB207R/PHO5-EGL valmis- tusta.
Kuva 6 esittaa plasmidin pJDB207/PAPEL-EGL(UAS1) val-mistusta.
Kuva 7 on kaavioesitys kypsaa desulfatohirudiinia koodittavan DNA-jakson eristamisesta.
91280 27
Kuva 8 esittaå plasmidin pJDB207/PHO5-HIR valmis- tusta.
Kuva 9 esittaå plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR valmistusta.
Kuva 10 esittaå plasmidin pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1+ UAS2) valmistusta.
Keksintoå valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraa-villa esimerkeillå.
Esimerkki 1: PH05-promoottorin deleetioiden aikaansaa- minen a) Pilkkominen Bal31:llå PH05-promoottorin låhteenå kåytetåån yhdistelmåfaa-gia M13mp9/PH05 Barn-Sal, joka sisåltåå kuvassa 1 esitetyn PH05:n BamHI-Sall-jakson (ks. eurooppalainen patenttihake-mus no. 143 081). 20 ug faagi-DNA:ta (RF: replikoituva muoto) katkaistaan restriktioendonukleaasilla Sall, jolloin saadaan lineaarinen DNA, jonka pituus on noin 9 ke. Feno-li/kloroformiuuton jålkeen DNA saostetaan etanolilla. DNA audelleensuspendoidaan pitoisuuteen 0,5 yg/ml liuokseen, jossa on 10 mH Tris pH 8,0. 16 ug Sall:llå pilkottua DNA: ta hajotetaan 2 yksikollå eksonukleaasia Bal31 (BRL) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaC^ ja 1 mM EDTA. Otetaan 2 yg:n nåyte DNA:ta, kun on inkuboitu 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 minuut-tia 30°C:ssa, ja nåytteisiin sekoitetaan vålittomåsti 50 yl fenolia ja 60 yl TNE:tå. Fenoli/kloroformiuuton ja etanoli-saostuksen jålkeen DNA uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 100 ug/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris pH 8,0. Jotta saataisiin selville, kuinka pitkålle Bal31:n eksonukleo-lyyttinen vaikutus on edennyt, 0,5 ug kussakin vaiheessa saatua DNA:ta katkaistaan endonukleaasilla BamHI ja analy-soidaan 1,5 %:sessa agaroosigeelisså, joka on tehty Tris-boraattipuskuriin pH 8,3 (90 mM Tris.HCl pH 8,3, 90 mM boorihappo, 2,5 mM EDTA). Keskimåårin 100 emåsparia pois-tuu jakson kummastakin pååstå Bal31-hajotusminuuttia kohti.
28 b) EcoRI-kytkijan liittåminen Bal31:lla kåsiteltyyn DNA:han
Kaksi A260-yksikkoa EcoRI-kytkijåa (5'-GGAATTCC-3', BRL) uudelleensuspendoidaan 250 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris pH 8 ja 1 mM EDTA. 2 yg EcoRI-kytkijaa kina-soidaan 75 y1:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2» 15 mM DDT, 10 hM ATP ja 33 yksikkoa T4-polynukleo-tidikinaasia (Boehringer). Kun seosta on pidetty 1 tunti 37°C:ssa, sen annetaan jåahtyå huoneenlampotilaan ja sen jalkeen varastoidaan -20°C:ssa.
Emaspariutetut, kaksisaikeiset EcoRI-kytkijat lii-tetaan tylpistå paistaan DNA-jaksoihin, jotka on kasitelty Bal31:lla. 0,5 yg Bal31:lla kasiteltyS DHA:ta (ks. esimerkki 1a) inkuboidaan 16 tuntia huoneenlåmpdtilassa 50-kertaisen ylimaSran kanssa kinasoitua EcoRI-kytkijaa 20 ylrssa reak-tioseosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 600 yksikkoa T4 DNA-ligaasia (Biolabs).
Kun T4 DNA-ligaasi on inaktivoitu (10 minuuttia 65°C:ssa), ylimaarainen EcoRI-kytkija katkaistaan 50 yksikolla EcoRIrta 50 yl:n tilavuudessa. DNA uutetaan fenoli/kloroformilla, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris ja 1 mM EDTA (=TE).Sitten DNA katkaistaan 5 yksikdlla BamHIrta (Biolabs) ja seos viedaan 1,5 %: seen matalalla sulavaan agaroosigeeliin (Sigma), joka on tehty Tris-boraattipuskuriin (ks. edella). Vyohykkeet var-jataan etidiumbromidilla ja tehdaan nakyviksi pitkaaaltoi-sella UV-valolla 366 nm:ssa. Levea, diffuusi vyohykkeisto, joka on 100 ja 600 emasparin valissa, leikataan irti gee-lista ja DNA uutetaan seuraavalla tavalla: Agaroosipala nesteytetaån 65°C:ssa, NaCl-pitoisuudeksi saSdetaan 500 mM ja sen jalkeen inkuboidaan 20 minuuttia 65°C:ssa. Lisataan yksi tilavuus fenolia (tasapainotettu pitoisuuteen 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl). Vesifaasi uutetaan uudestaan kahdesti fenolilla ja kerran kloroformilla.
DNA saostetaan 2,5 tilavuudella kylmaa absoluuttista eta-nolia ja otetaan talteen sentrifugoimalla. DNA-pelletti pestaan kylmalla 80 %:sella etanolilla ja kuivataan vakuu-missa. DNA uudelleensuspendoidaan 10 yl:aan TE:ta.
91280 29 c) Liittåminen plasmidiin M13mp9 3 Og M13mp9:n replikoituvaa muotoa (RF) katkais-taan 15 yksikolla EcoRIrta (Biolabs) ja 15 yksikolla BamHI: ta (Boehringer) 50 yl:n tilavuudessa. Fenoliuuton ja eta-nolisaostuksen jålkeen DNA uudelleensuspendoidaan 50 ylraan TE:ta. 5 ul leikattua vektori-DNA:ta (noin 200 ng) sekoi- tetaan 10 ylraan edella saatua naytetta (DNA-jaksot, jot- ka saatiin esimerkisså 1b eri Bal31-pilkkomistuot-teista ja- suoritettiin yhteenliittaminen 20 yl:n tilavuudessa 15 tunnissa kayttamalla 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 200 yksikkoa T4 DNA-li-gaasia. Kasiteltyjen E. coli JM101-solujen transduktio suoritetaan New England Biolabsin kasikirjan "M13 cloning and sequencing system". Useista valkoisista taplista saatuja faageja kasvatetaan ja niiden DNA-liitannåisen koko analysoidaan suorittamalla katkaisu entsyymeilla EcoRI ja BamHI.
d) Bal31-deleetioiden paattymiskohtien maarittaminen Sangerin sekvenssinmaaritysmenetelmållå (deleetiot Sall-kohdasta lukien)
Sekvenssinmaåritys suoritetaan kayttamalla Sanger et al:n dideoksi-DNA:nmååritysmenetelmaa (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 7jl, 5463 (1977)), joka on selostettu edella-mainitussa kasikirjassa. Deleetioiden paattymiskohdat on esitetty seuraavassa:
Klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin asema (ks. kuva 1) A -502 B -471 C -422 D -400 E -392 F -369 30 G -350 Η -328 I -300 K -283 L -255 Μ -226 N -211 O -187 P -111 Q -88 R -57 S -33 e) Bal31-deleetioiden påattymiskohtien måårittåminen Sangerin sekvenssinmaaritysmenetelmålla (deleetiot BamHI-kohdasta lukien)
Suoritetaan samanlaiset Bal31-deleetiot kuin kohdis-sa a - c, mutta M13mp9 PH05 Barn-Sal katkaistaan BamHIrlla. Bal31:lla pilkotut molekyylit katkaistaan EcoRI:llå ja Sall :11a ja syntyneet jaksot kloonataan EcoRl:llå ja Sall:llå katkaistuun M13mp9:åån. Deleetioiden paåttymiskohdat on esitetty seuraavassa.
Klooni PH05:n sekvenssin viimeisen nukleotidin asema (ks. kuva 1) A’ -24 B' -35 C' -41 D' -48 E’ -74 F' -89 G’ -93 H' -97 1' -124 K' -162 L’ -174 M’ -262 31 91280 Ν' -277 0’ -306 Ρ· -332 Q’ -346 R’ -361 S' -382 Τ’ -393 f) Sisaisten deleetioiden aikaansaaminen PH05-promoot-toriin
Kohdassa d) selostettu Bal31-deleetiotoimenpide tuot-taa "vasemman kåsivarren" PH05-proraoottorifragmentin, joka paattyy EcoRI-kohtaan, ja kohdassa e) kuvattu Bal31-deleetiotoimenpide tuottaa "oikean kaden" PH05-promoottorifrag-mentin, joka paattyy EcoRI-kohtaan. Kun "vasenunat kasi-varret" ja "oikeat kasivarret" liitetaan yhteen, on saatu aikaan eripituisia sisåisiå deleetioita, jotka sisaltavat EcoRI-kytkijajakson poistuman kohdalla. Yksittaiset si-såisen deleetion omaavat jaksot saadaan leikkaamalla "va-seanmat kasivarret" ja "oikeat kasivarret" plasmidin M13mp9 johdannaisista restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI (vasemmat kasivarret) tai restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Sall (oikeat kåsivarret) ja eriståmallå vastaa-vat fragmentit pehmeaagaroosigeelielektroforeesilla kohdassa b) kuvatulla tavalla. Ekvimolaariset maarat "oikeaa kasivartta", "vasenta kSsivartta" ja 200 ng BamHI:11¾ ja Sall :11a katkaistua M13mp9-vektori-DNA:ta liitetaan yhteen kohdassa c) kuvatulla tavalla. Suoritetaan E. coli JM101:n transduktio ja poimitaan valkoiset plakit, tuotetaan RF ja suoritetaan restriktioanalyysi (BamHI, Sall, EcoEI).
Seuraavat kasivarret yhdistetaan spesifisten sisaisten deleetioiden aikaansaamiseksi (nukleotidien numerointi kay ilmi kuvasta 1): "vasen kasi- "oikea ka- nukleoti- poistunut nukleo- varsi" sivarsi" deleetio divali tidimaara A Τ’ Δ 7 -501 394 108 B Τ' Δ 8 -470 394 77 C Τ' Δ 9 -421 - -394 28 D S' Δ10 -399 383 17 Ε R' Δ11 -391 362 30 F Q' Δ12 -368 347 22 32 G P' Δ13 -349 - -333 17 H 0' Δ14 -327 - -307 21 I Ν' Δ15 -299 - -278 22 K Μ' Δ16 -282 - -263 20 L L' Δ17 -254 “ -175 80 M L’ Δ18 -225 - -175 51 N L' Δ19 -210 - -175 36 O L' Δ20 -186 - -175 12 O K' Δ21 -186 - -163 24 O 1' Δ22 -186 - -125 62 O Η' Δ23 -186 - - 98 89 P Η’ Δ24 -110 - - 98 13 P G’ Δ25 -110 ^ - 94 17 P F' Δ26 -110 - - 90 21 Q E’ Δ27 - 87 -- 75 13 R D’ Δ28 -56--49 8 R C Δ29 - 56 -- 42 15 R B' Δ30 - 56 - - 36 21 S A' Δ31 - 32 - - 25 8
Esimerkki 2: PH05-promoottorin sisaisten deleetioiden ana- lyysi in vivo
Erilaiset esimerkissa 1f) kuvatut deleetiot kloona-taan plasmidiin pJDB207/PHO5 (R. Haguenauer-Tsapis and A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4_, 2668 - 2675 (1984)) korvaamalla villityyppinen PH05 Bam-Sal-jakso deleetion sisaltavalla versiolla. Hiivakannan S. cere-visiae AH216 (ks. eurooppalainen patenttihakemus no.
143 081) transformoinnin jalkeen happofosfataasiaktii-visuus maaritetaan Toh-e et al:n menetelmalla (J. Bacteriol. 1 13, 727 (1973)). Deleetiot Δ11 ja Δ12 osoittavat PH05-aktiivisuuden vahenemistå noin kymmenenteen osaan ja maa-rittelevat ylåvirran alueen ("upstream activation site", UAS), joka on oleellinen PH05:n ilmentymiselle. Samanlai- 33 91280 nen vahentavå vaikutus havaitaan deleetiolla Λ17 (vahene-minen noin viidenteen osaan) ja TATA-alueen deleetioilla Λ23 -Å26 (vaheneminen noin kolmanteenkymmenenteen osaan).
Kaikki muut deleetiot osoittavat suunnilleen villityyppisen tasoisia aktiivisuuksia. Name tulokset viittaavat siihen, etta PH05:n ilmentymisen kannalta on kolme oleellista aluetta, jotka sijaitsevat seuraavissa kohdissa: 1. kohtien -349 ja -383 valissa (UAS1) 2. kohtien -225 ja -263 valissa (UAS2) 3. kohtien -87 ja -125 valissa (TATA-alue) DNA-jaksot, jotka sisaltavat PH05:n UAS1:n tai UAS2:n tai seka UAS1:n etta UAS2:n, voidaan tuottaa yhdistelma-faagista Ml3mp9/PH05 Bam-Sal (ks. esimerkki 1) suoritta-malla katkaisut tarvittavilla restriktioendonukleaaseilla.
UAS1 sisaltaå 268 emasparin BamHI-Clal-jaksoon, jonka kaava on seuraava GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTG CGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTT CATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACG CAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAAT GAAT, UAS2 sisaltyy 100 emasparin Clal-BstEII-jaksoon, jonka kaava on seuraava
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT
CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG
ja seka UAS1 etta UAS2 ovat lasna 368 emasparin BamHI-BstEII-jaksossa, jonka kaava on seuraava GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTTATGTGC GCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGGTAAAAGGTTCA TAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCAA CTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTT CGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG .
34
Esiraerkki 3: Fuusioitujen PH05-GAPDH-yhdistelmapromoot- torien rakentaminen
Esimerkit 1 ja 2 tekevat PH05-geenin aseman -365 ympårilla olevasta alueesta (UAS1 (PH05)) ja aseman -180 ymparilla olevasta alueesta (UAS2(PH05)) mahdollisia kandidaatteja sellaiselle UAS-alueelle, jolla on saate-lyominaisuuksia. UAS1(PH05) sisaltyy 268 emåsparin BamHI-Clal-jaksoon, kun taas sekå UAS1(PH05) etta UAS2(PH05) si-saltyvat BamHI-BstEII-jaksoon. Nåmå kaksi jaksoa fuu-sioidaan erikseen kahteen eri GAPDHm alavirran promoot-torielementtiin, jotka sisaltavat TATA-alueen ja GAPDHrn transkriptionaloituskohdat.
a) Hiivan geenikirjaston rakentaminen 30 yg suurimolekyylipainoista hiivan kokonais-DNA: ta (M.V. Olsen et al., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)), joka on saatu Saccharomyces cerevisiae-kannasta S288C, inkuboi-daan 30 minuuttia 37°C:ssa kayttamalla 2 yksikkoa EcoRI-metylaasia (New England Biolabs) 250 ylrssa EcoRI-metyloin-tipuskuria valmistajan ohjeiden mukaan. DNA saostetaan etanolilla, uudelleensuspendoidaan 500 ylraan puskuria, jossa on 25 mM Tris.HCl pH 8,5 ja 2 mM MgCl2 (EcoRI*-puskuri) (H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979)), ja pilko- taan EcoRIrlla (Boehringer), kunnes DNA-jaksojen kokoja-kautuman maksimi on 30 - 50 kern alueella (XDNArn Xhol-ha-jotustuote antaa sopivat 33 kern ja 17 kern merkit). EcoRI*-olosuhteissa pilkottu hiivan DNA fraktioidaan koon mukaan sakkaroosigradientissa (5 - 20 % sakkaroosia liuoksessa, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA) kasittele-malla 6 tuntia nopeudella 38 000 1/min SW 40-roottorissa. Gradientin ylapaasta kerataan 30 jaetta, joiden kunkin ti-lavuus on 0,4 ml. Jae 16 sisaltaa ne DNA-jaksot, joiden koko on 30 - 40 ke. Taman jakeen DNA (3 yg) saostetaan etanolilla ja sita liitetaan 16 tuntia 15°Crssa 15 ylm kokonaistilavuudessa 1 ygraan kosmidivektoria pYd (B.
Hohn et al., "Genetic Engineering",Vol. 2, s. 169, New York 1980)), joka on linearisoitu EcoRIrlla. Yhteenliit-taminen suoritetaan kayttamalla 300 yksikkoa T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) ja valmistajan kuvaamaa 35 91280 puskurisysteemiå. DNA pakataan in vitro bakteriofaagi-λ: aan (B. Hohn, "Methods in Enzymology", Vol. 68, s. 299,
New York 1979) ja yhteenkootuilla faageilla suoritetaan E. coli-kannan HB101 (r^, m^, leu , pro , recA) transduk- tio. Transduktion tehokkuus on noin 5000 ampisilliinille vastustuskykyista pesaketta per yg pYc1-vektoria.
R
3000 amp -pesaketta poimitaan ja niita kasvatetaan erikseen mikrotitrauslevyjen koloissa LB-alustassa (10 g Bacto-tryptonia (Difco), 5 g Bacto-hiivauutetta (Difco) ja 10 g NaCl), joka sisaltaå 100 yg/ml ampisilliinia.
b) Hiivan GAPDH-geenin eristaminen
Edellakuvattu geenikirjasto seulotaan synteettisel- la oligonukleotidilla (valmistettu kåyttcimållå fosfotri- esterimenetelmaa: K. Itakura et al., J.Am. Chem. Soc.
97, 7327 (1975); J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav.
Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)), jonka rakenne on seuraa- va: 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10 yg oligonukleotidia 32 kinasoidaan kåyttamalla 10yl γ- P-ATP:tå (3000 Ci/mmol, 10 yCi/yl Amersham) T4 polynukleotidikinaasilla (Boehringer) 50 yl:n kokonaistilavuudessa Maniatis et al:n mukaan ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, s. 125). Pesakehybridisaatio suoritetaan saman tekijan kuvaamalla menetelroalla (s. 312). Positiiviset pesåkkeet havaitaan autoradiografialla kayttamalla Kodak X-5-rontgenfilmiå. Plasmidi-DNA:n eristaminen (ks. eurooppalainen patenttiha-kemus no. 100 561) tuottaa yhdistelmakloonin, joka sisal-taa 2100 emasparin Hindlll-jakson, joka koodittaa GAPDH: ta (J.P. Holland et al., J. Biol. Chem. 254^, 9839 (1979)). Lopullinen naytto kloonatun DNA:n autenttisuudelle tulee DNA:n sekvenssinmaarityksesta kayttamalla edellamainittua oligonukleotidia yhdessa dideoksisekventointimenetelman kanssa G.F. Hongin mukaan (Bioscience Reports _1_, 243 (1981)) koskien kaksisåikeista DNA:ta. Kloonatulla GAPDH-geenilla on sama sekvenssi kuin pgap491:lla, jonka Holland et al. ovat julkaisseet (J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)).
36 c) GAPDH:n alavirrart promoottorielementtien valmistus (ks. kuvat 2 ja 3) 649 emåsparin TaqI-jakso, joka sisaltaa nukleo-tidit -27 - -675 GAPDH-geenin ATGrsta lukien (kuva 2), eristetaan pilkkomalla edellamainittu yhdistelmaplasmidi Taql:lla (New England Biolabs), eriståmållå DNA-jaksot 1,2 % sessa pehmeaagarocsigeelissa ja uuttamalla DNA kuumalla fenolilla (ks. esimerkki 1). TaqI-jakso kloonataan plasmidin pBR322 Clal-kohtaan: 1 yg plasmidia pBR322 katkaistaan kolmella yksikolla Clal:ta (New England Biolabs) valmistajan ohjei-den mukaan. 300 ng fenolilla kasiteltya ja leikattua vektoria liitetaan noin 300 ng:aan liitettavaa DNAtta (649 emåsparin Taq-jakso) kayttamalla 200 yksikkoa T4 DNA-ligaasia 20 yl:n kokonaistilavuudessa (ks. esimerkki 1b). Transformointi suoritetaan E. coliin HB101 saattamalla se vastustuskykyiseksi ampisilliinille, plasmidi-DNA valmis-tetaan ja analysoidaan restriktioanalyysilla (TaqI, Dral). TaqI-jakson suunta mSaritetaan kayttamalla restriktioendo-nukleaasikohtia Dral ja BamHI ja se plasmidi valitaan, jos-sa on TaqI-kohta asemassa -675 lahellå pBR322:n Hindlll-kohtaa. Tama plasmidi, jolle on annettu nimi pBR322/GAPDH, linearisoidaan kayttamalla BamHI:ta (New England Biolabs) ja pilkkominen Bal31:lla suoritetaan esimerkissa 1 kuva-tulla tavalla paitsi, etta kaytetåån Bglll-kytkijoita (5'-CAGATCTG-3', New England Biolabs) ja pilkottu plasmidi saatetaan valittomasti renkaan muotoon pitoisuudessa 5 yg/ml 20 yl:n kokonaistilavuudessa. Bal31:lla lyhenne-tyn TaqI~gakson koko maaritetåan restriktioanalyysilla (kayttamalla Bglllrta ja HindIII:a). Valitaan kaksi kloo-nia, jotka sisaltavat DNA-jaksot, jotka ulottuvat noin 200 emasparin ja 265 emasparin paahan ATG:sta ylospain GAPDH-promoottorin suuntaan. Molemmat jaksot sisaltavat oletetusti TATA-alueen noin emasparin -140 kohdal-la. Nåmå kloonit sisåltåvåt edelleen replikoitumisen aloituskohdan DNA:n plasmidista pBR322 johdetussa kohdas-sa ja niille annetaan vastaavasti nimet pGAPDH-F ja pGAPDH-F.
37 91280 d) Alapaan GAPDH-elementin yhdiståminen PH05:n UAS1(PH05)-elementtiin ja egliini C-proteiinia koodittavaan aluee-seen I) GAPDH-elementit (ks. kuva 3)
Jotta GAPDH-promoottorielementti saataisiin ulo-tetuksi asemassa -27 olevasta Taq-kohdasta vålittomåsti GAPDH-geenin vieressa olevaan ATG-kodoniin, syntetisoidaan kaksi komplementaarista oligonukleotidia, joilla on seuraavat rakenteet: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' 3’ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'
Nåmå oligonukleotidit antavat aidon GAPDH-promoot-torisekvenssin asemasta -26 asemaan -5 synnyttaen samalla terminaalisen EcoRI-kohdan. 2 yg kutakin plasmidia pGAPDH-E
ja -F pilkotaan 6 yksikolla Taql:tå 50 ylrssa ja reaktio-seokset kåsitellåån fenolilla, saostetaan etanolilla ja sakka uudelleensuspendoidaan 10 yl:aan vettå. Synteet-tiset oligonukleotidit emaspariutetaan sekoittamalla 2 yl kumpaakin yksittåistå såiettå 100 yl:ssa liuosta, joka sisåltåå 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ ja 50 mM NaCl, kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:ssa ja liuos jååh-dytetaån hitaasti huoneenlåmpotilaan (noin 3 tunnin kulu-essa). 1 yg kutakin Taqlrllå katkaistua plasmidia sekoi- tetaan noin 20-kertaiseen ylimaåråån emåspariutettuja oligonukleotideja ja inkuboidaan 20 yl:n tilavuudessa noin 18 tuntia kåyttåmållå 800 yksikkoå T4 DNA-ligaasia.
Koko seos pilkotaan 3 yksikolla Bglllrta (New England Biolabs). DNA-jaksot erotetaan 1,5 %:sessa pehmeåaga-•iroosigeelisså. Bglll-EcoRI-jakeet, joiden koot ovat vastaavasti 200 emåsparia ja 265 emåsparia, leikataan irti geelistå, uutetaan ja saostetaan etanolilla.
Plasmidi pGAPDH-E katkaistaan BglII:lla ja EcoRIrllå ja suuri (noin 3,5 ke) jakso eristetåån. Tåtå jaksoa kaytetåån vektorina 265 emåsparin ja 200 emåsparin Bglll-EcoRI-jaksojen kloonauksessa kåyttåmållå edellåkuvat-tuja yhteenliittåmis-, transformointi- ja plasmidineristys-olosuhteista. Nåin saaduille plasmideille annetaan ni-
miksi pGAPDH-EL ja pGAPDH-FL. Plasmideihin pGAPDH-EL
38 ja pGAPDH-FL kloonattujen Bglll-EcoRI-jaksojen DNA-sek-venssit on esitetty kuvassa 4. Jaksojen tarkat koot ovat 266 emasparia ja 201 emasparia vastaavasti.
II) UAS1(PH05)-saatelyelementti 3 yg plasmidia p31/Y (ks. eurooppalainen patentti-hakemus no. 100 561) katkaistaan 6 yksikolla Clalrta (New England Biolabs). Sisåånvetåytyneet 3'-påat tayte-taan suorittamalla reaktio E. colin DNA polymeraasi I:n Klenow-jakson kanssa (Bethesda Research Laboratories) nou-dattamalla Maniatisin menetelmåå (supra). Bglll-kytkijat (5'-CAGATCTG-3') lisåtaån esimerkisså 1 kuvatulla tavalla. DNA katkaistaan Sall :11a ja BglII:lla (New England Biolabs) ja ajetaan 1 %:sella pehmeaagaroosigeelilla. 548 emaspa- rin jakso leikataan irti geelista, kåsitellaan fenolilla ja s aastetaan etanolilla edellakuvatulla tavalla.
III) Plasmidin pJDB207R/PHO5-EGL rakentaminen (ks. kuva 5) Tåma plasraidi on sellaisen DNA-jakson låhde, joka koostuu egliini C:ta koodittavasta alueesta ja PH05:n transkription lopettajasta.
A) pJDB207-vektorijakson eriståminen 6 yg plasmidia pJDB207R/IF (ot — 3) (eurooppalainen pa-tenttihakemus no. 100 561) katkaistaan taysin restriktio-endonukleaasilla BamHI. Nain syntyneet jaksot, joiden koot ovat 6,85 ke ja 1,15 ke, saostetaan etanolilla ja uu-delleensuspendoidaan 400 ylraan 50 mM Tris.HCl pH 8,0. Li-såtaan 4,5 yksikkoa vasikan sisaelinten emasfosfataasia (Boehringer, Mannheim). Saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Sitten fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 1 tunti 65°C:ssa. Liuoksen pitoisuudeksi saadetåan 150 mM NaCl. DNA-liuos sijoitetaan 100 Vl:n kerrokseen DE 52 (Whatman) anioninvaihdinta, joka on tasapainotettu liuok-sella, jossa on 10 mM Tris-HCl pH 7,5, joka sisåltaa 150 mM NaCl ja 1 mM EDTA. Kun on pesty samalla puskurilla, DNA eluoidaan 400 Pl:lla liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 ke:n BamHI-jakso erotetaan pienesta 39 91280 jaksosta 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelisså, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
B) 534 emasparin PH05-promoottorijakson eristaminen 10 \jg plasmidia p31/R (eurooppalainen patenttiha-kemus no. 100 561) katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la EcoRI ja BamHI. Saadut 3 jaksoa erotetaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 534 emasparin BamHI-EcoRI- jakso, joka sisaltaa PH05-promoottorin mRNA:n aloituskoh-dat mukaanlukien, eristetåan.
C) 221 emasparin DNA-jakson eristaminen, joka sisaltaa egliinia koodittavan sekvenssin 8 yg plasmidia pML147 (eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 146 785) katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la BamHI ja EcoRI. Syntyneet kaksi DNA-jaksoa erotetaan toisistaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
221 emasparin fragmentti eristetåan.
D) DNA-jaksojen yhteenliittåminen
Edellåkuvatut kolme DNA-jaksoa (esimerkit 3dIIIA-C), joissa on tarvittavat tarttuvat påat, liitetåån yhteen yh-desså reaktiossa: 0,1 pmol (0,45 yg) 6,85 ke:n BamHI- vektorijaksoa, 0,2 pmol (70 ng) 534 emasparin BamHI-EcoRI PH05-promoottorijaksoa ja 0,2 pmol (29 ng) 221 emasparin EcoRI-BamHI-jaksoa, joka on saatu plasmidista pML147, lii-tetåån yhteen. Kaikki kolme DNA-jaksoa ovat pienissa matalalla sulavan agaroosin palasissa. Nåmå kolme agaroosi-geelipalaa yhdistetåån, nesteytetåån 65°C:ssa ja laimen-netaan puoleen. Yhteenliittåminen suoritetaan 270 yl:n kokonaistilavuudessa, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^/ 10 mM DTT ja 1 mM ATP, kåyttåmållå 16 yksikkoå T4 DNA-ligaasia (Boehringer, Mannheim) 16 tuntia 15°C:ssa.
10 yl:n erå yhteenliittåmisseosta lisåtåån 100 yl:aan kalsiumilla kåsiteltyjå, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
40 24 transformoitunutta amp -peeåkettS kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisaitaa 100 yg/ml ampisil-liinia. Plasmidi-DNA valmistetaan Holmes et al:n mene-telmSlia (Anal. Blochem. 114, 193 (1981)) ja analysoldaan Hindlll/EcoRI-kaksoiskatkaisulla. Jos havaltaan 600 emasparin EcoRI-Hindlll-jakso, on tama merkkl siita, etta kyselsessM kloonissa on PH05-promootttori-egliini C-DNA-jakso liittyneenM ilmentamisvektoriin olkeassa suunnassa. Odotetusti noin 50 %:ssa klooneista on liltMnnainen oi-keassa suunnassa. Yksl nHistS klooneista erlstetMMn ja sille annetaan nimeksi pJDB207R/PHO5-EGL.
6 yg plasmidia pJDB207R/PHO5-EGL katkalstaan taysin restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja Sall. Suuri 6,1 ke:n (vektoriosa) eristetaan pehmeaagaroosigeelilelektro-foreesilla, fenoliuutolla ja etanolisaostuksella. Vektori-DNA uudelleensuspendoidaan 20 yl:aan vettM. Egliinijakso tuotetaan katkaisemalla pJDB207R/PHO5-EGL Hindlll:11a ja EcoRI:lia. Saatu 600 emasparin jakso eristetaMn pehmeM-agaroosigeelielektroforeesilla, uutetaan fenolilla ja saos-tetaan etanolilla. Egliinijakso uudelleensuspendoidaan 20 yl:aan vetta.
IV) Jaksojen yhteenliittaminen UAS1(PH05)-elementteja kayttamana (ks. kuva 6)
Yhteenliittaminen suoritetaan kayttamaiia seuraa-via neljaa komponenttiS^ 0,5 yg 6,2 kern Hindlll-Sall-vektorijaksoa, 100 ng 600 emasparin EcoRI-Hindlll-egliini C-jaksoa, 200 ng 266 emasparin Bglll-EcoRI-jaksoa, joka on saatu plasmidista pGAPDH-EL, ja 100 ng 548 emasparin Sall-Bglll-jaksoa, joka sisaltaa UAS1(PH05):n. Yhteenliittaminen suoritetaan edeliakuvatulla tavalla. E. coli HB101 transformoidaan ampisilliinille vastustuskykyiseksi, plas-midi eristetaan ja positiivisille klooneille suoritetaan restriktioanalyysi edeliakuvatulla tavalla kayttamaiia restriktioendonukleaaseja Hindlll, EcoRI, Bglll ja Sall. Valitaan yksi positiivinen klooni ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PAPEL-EGL(UAS1).
Sama rakentaminen suoritetaan kayttamaiia 201 emMs- 41 91280 parin Bglll-EcoRI-jaksoa, joka on saatu plasmidista pGAPDH-FL. Nåin saadulle plasmidille annetaan nimeksi pJDB207/ PAPFL-EGL(UAS 1) .
V) UAS1(PH05)-elementin ja UAS2(PH05)-elementin sisåltå-vien yhdistelmien rakentaminen 3 yg edellåmainittuja plasmideja (ks. IV) katkais-taan BglII:lla. Uutetaan fenolilla ja DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan veteen. Vetåyty-neet 3'-paåt taytetaan Klenow DNA-polymeraasilla kohdas-sa II) kuvatulla tavalla. Plasmideja kuumennetaan 10 minuuttia 70°C:ssa. Katkaistaan Salltllå (Biolabs) ja suuret jaksot (noin 7,2 ke) eristetaan pehmeaagaroosigee-lielektroforeesilla, suoritetaan fenoliuutto ja DNA saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen.
Samalla tavoin plasmidi p31/Y katkaistaan BstEII: 11a, kasitellaan DNA-polymeraasilla (Klenow-jakso) ja katkaistaan Sall:11a. 651 emasparin jakso eristetaan edel- låkuvatulla tavalla. Kun 200 ng kutakin edellamainittua vektori-DNA:ta liitetaan kulloinkin yhteen 651 emasparin jaksoon, saadaan seuraavat plasmidit: pJDB207/PAPEL-EGL (UAS 1 + UAS2) (sisaltaa pGAPDH-EL:stå saa-dun 266 emåsparin Bglll-EcoRI-jakson) pJDB207/PAPEL-EGL (UAS1 + UAS2) (sisaltaa pGAPDH-FL:sta saa-dun 201 emasparin Bglll-EcoRI-jakson)
Esimerkki 4 a) Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformointi
Esimerkeissa 3dIV ja 3dV saadut nelja plasmidia tuodaan Saccharomyces cerevisiae GRF18 (a, his3-11, his3-15, £ leu2-3, leu2-112, can )-kantaan erillisesti kayttamalla Hinnen et al:n menetelmaa <Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimikasvualustalevyilla, joista puuttuu leusiini. Yk-sittaiset transformoituneet hiivapesakkeet valitaan ja niista kaytetaan nimityksia Saccharomyces cerevisiae GRF18/PJDB207/PAPEL-EGL(UAS1) , /PAPFL-EGL(UAS 1) , /PAPEL-EGL (UAS 1 + UAS2) ja /PAPFL-EGL(UAS1 + UAS2).
42 b) Transformanttien fermentointi
Kyseisiå neljåå S. cerevisiae GRF18-transformantti-laatua kasvatetaan kutakin erikseen 10 ml:ssa hiivan mi-nimikasvualustaa (Difco Yeast Nitrogen Base, ilman amino-happoja, mutta lisåttynå 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histi-diinia) 50 ml:n Erlenmeyer-kolveissa ravistelemalla 30°C: ssa 24 tuntia tiheyteen 3x10^ solua/ml. Solut pestaan 0,9 %:sella natriumkloridiliuoksella ja sen jalkeen niilla ympåtåån 50 ml korkea-P^-alustaa (kuten edella) ja matala-P^-minimialustaa, joka on valmistettu Difcon Yeast Nitrogen Base-alustan mukaan (ilman aminohappoja) sisaltaen 0,03 g/1 Κϊ^ΡΟ^, 1 g/1 KCl, 10 g/1 L-asparagiinia (NH^^SO^n tilalla, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniå. Alusta ympatåan niin, ettå lahto-OD6Q0 on 0,03. Soluja kasvatetaan 500 ml:n kolvissa 30°C:ssa 24 tuntia (OD^_rt = 600 nm 1,8 matala-P^-alustalla, OD^qq nm = 3,0 korkea-P^-alustalla).
c) Egliini C-tiitterien måarittaminen
Kun edellamainittu solutiheys (OD) on saavutettu, solut otetaan talteen, sentrifugoidaan ja rikotaan lasihel- milla. Seosten egliiniaktiivisuus analysoidaan mittaamalla ihmisen leukosyyttielastaasin inhiboituminen menetelmalla U. Seemueller et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 358, 1105 (1977)). Nain saadaan seuraavat aktiivisuudet: S. cerevisiae- egliini-C-aktiivisuus (mg/l/vil uute_ jelman OD-yksikko) indusoitu (ma- indusoimaton tala P^) (korkea Pi) pJDB207/PAPEL-EGL (UASl) 14 °'7 pJDB207/PAPFL-EGL (UASl) 17 °;7 pJDB207/PAPEL-EGL (UASl + UAS2) 14 1 pJDB207/PAPFL-EGL (UASl + UAS2) 11 0/7 43 91280
Esimerkki 5: Desulfatohirudiinin ilmentaminen PH05-GAPDH- yhdistelmåpromoottorin ohjauksessa I. Desulfatohirudiini-HVl-geenin 5'-paan nukleotidisekvens-sin saataminen
Desulfatohirudiini (ks. eurooppalainen patentti-hakemusjulkaisu no. 168 342) alkaa GTT-kodonilla, joka edustaa NH2~paan valiinia lopullisessa tuotteessa. Jotta alakloonaus ja E. colissa ilmentaminen olisi helpompaa, on koodittavaa sekvenssiå jatkettu 5'-paasta kahdeksalla nukleotidilla, jotka sisaltåvat EcoRI-restriktiokohdan ja ATG-aloituskodonin. Jotta hirudiinia koodittava sek-venssi saataisiin liitetyksi tarkkaan vaiheistukseen PH05-signaalipeptidia koodittavan sekvenssin kanssa, pi-taa nåmå lisanukleotidit poistaa. Tama saavuteaan muun-tamalla EcoRI-katkaisukohta tasapaiseksi kohdaksi ja lisaa-malla synteettinen oligonukleotidi, joka sisåltaå Hgal:n tunnistuskohdan sellaisessa asemassa, etta seuraava Hgal-katkaisu tapahtuu heti GTT-kodonin ylapuolelta.
Hgal-restriktiokohdan tuominen desulfatohirudiinigeenin eteen (ks. kuva 7) 8 yg plasmidia pML310 (ks. EP 168 342) katkaistaan taysin restriktioendonukleaasillå EcoRI. DMA (pML310/
EcoRI) uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan eta-nolilla. Yli roikkuvat 5'-paat poistetaan -nukleaasil-la. 4 yg pML310/EcoRI DNA:ta katkaistaan 100 ylrssa reak-tioseosta, joka sisaltaa 250 mM NaCl, 1 mM ZnS04 ja 30 mM natriumasetaattia pH 4,6, kayttamalla 20 yksikkoa/ml -nukleaasia (Sigma) 45 minuuttia 37°C:ssa.
DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan eta-nolilla. DNA (pML310/EcoRI/S^) uudelleensuspendoidaan 100 ylraan 50 mM Tris.HCl pH 8,0 ja inkuboidaan 2 yksikdn kanssa vasikan sisaelinten emasfosfataasia (CIAP, Boehringer) 1 tunti 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan inku-boimalla 1,5 tuntia 65°C:ssa.
Inkubointiseoksen NaCl-pitoisuudeksi saadetaan 150 mM. Defosforyloitu DNA (pML310/EcoRI/S1/CIAP) puh-distetaan adsorboimalla DE52-ioninvaihtopylvaaseen 44 (Whatman) vahan suolaa sisåltåvåsså puskurissa (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) ja sen jalkeen eluoidaan paljon suolaa sisåltåvåsså puskurissa (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,8 mg/ml.
Oligonukleotidi, jonka kaava on 5'-AGCGTCGACGCT-3' syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmalla (Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)). Oligonukleotidisek-venssi on itsekomplementaarinen ja sisaltaa Hgal-rest-riktioendonukleaasin tunnistuskohdan -GACGC-. Run nåmå kaksi yksittåista saietta emaspariutetaan, saadaan 12 emasparia sisåltåvå kaksisaikeinen DNA-kytkija.
1,2 pg synteettista yksisaikeista oligodeoksinukleo- tidia fosforyloidaan 10 pl:ssa liuosta, joka sisaltaa 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl„, 5 mM DTT, 30 PCi /γ-32Ρ/ -1 *· ATP:ta (3000 Ci.mmol , Amersham) ja 6 yksikkoa T^-poly-nukleotidikinaasia (Boehringer), 30 minuuttia 37°C:ssa, ja sen jalkeen inkuboidaan 15 minuuttia 37°C:ssa niin, ettå lasnå on 0,5 mM ATP:tå. Taman jalkeen seosta inkuboidaan vielå 10 minuuttia 75°C:ssa entsyymin inaktivoimiseksi ja sen jålkeen annetaan jååhtyå huoneenlåmpotilaan emås-pariutumista vårten.
0,6 pg (170 pmol) 32P:llå leimattua kytkijå-DNA: ta sekoitetaan 2,4 pg:aan (1,75 pmol påitå) pML310/EcoRI/ S^/CIAP:tå ja liitetåån yhteen 20 pl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikkdå T^ DNA-ligaasia (Biolabs), 20 tuntia 15°C:ssa. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa ja ylimååråiset kytkijåmolekyylit poistetaan saostamalla DNA siten, ettå låsnå on 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta iso-propanolia. Run seosta on pidetty 30 minuuttia huoneen-låmpbtilassa, DNA pelletoidaan ja uudelleensuspendoidaan 45 pl:aan liittåmisseosta (koostumus selostettu edellå) ja liitetåån yhteen 6 tuntia 15°C:ssa niin, ettå syntyy rengasmainen DNA.
45 91280 1 μ1:η ja 3 μ1:η eråt yhteenliittåmisseosta li-såtåån 100 μ1:33η kalsiumilla kasiteltyja, transformointi-kelpoisia E. coli HB101-soluja (valmistettu menetelmalla D. Hanan, J. Biol. Chem. 166, 557 (1983)). Solut jatetaan ^aålle 30 minuutiksi ja sen jalkeen inkuboidaan 3 minuut-tia 42°C:ssa, jaahdytetaan jaalla 2 minuuttia ja sen jalkeen inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 400 μΐ:ΞΞ3 SOC-alustaa.
Kukin solunayte konsentroidaan 100 μΐ:ksi ja sen jalkeen kasvatetaan LB-agarlevyillå, jotka sisaltavat 50 μ9/πι1 ampisilliinia.
12 transformoitunutta amp -pesåketta kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisaltåa 100 ug/ml ampisil-liinia. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmalla D.S.
Holmes et al. (Anal. Biochem. 114, 193 (1981)). Synteet-tisen oligonukleotidikytkijan låsnaolo todetaan DNA-sek-ventoinnilla kayttamalla alukkeena yksisaikeista DNA-jaksoa, joka hybridisoituu hirudiinia koodittavan sai-keen kanssa. Yhdelle kloonille, joka sisaltaa kytkijå-DNA:n oikeassa asemassa hirudiinigeenin edessa, annetaan nimeksi pML310L.
II. PH05-signaalisekvenssin liittaminen ja desulfatohiru-diinin rakennegeeni a) 0,2 ke:n desulfatohirudiinijakson eristaminen (ks. ku-va 7) 12 μg plasmidia pilL310L pilkotaan taysin restriktio-endonukleaaseilla BamHI ja Pvul. DNA uutetaan fenoli/klo-roformilla ja saostetaan etanolilla ja sen jalkeen erotetaan kyseiset kaksi restriktiojaksoa 1,2 %:sessa agaroosigeelis-sa, joka on tehty tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Etidiumbromidilla varjatty 0,84 ke:n Pvul-BamHI-jakso eristetaan geelipalasta. DNA elektroeluoidaan dialyysi-pussissa, joka on taytetty 3 ml:11a 0,2xTBE-puskuria. Sul-jettu pussi upotetaan TBE-puskuriin pH 8,3 (90 mM Tris-emasta, 90 mM boorihappoa, 2,5 mM EDTA). Kun on pidetty 30 minuuttia 100 mA:ssa, virran polaarisuus kaannetaan 45 sekunniksi, jotta DNA saadaan tyonnetyksi pois dialyysi- 46 kalvosta. Geelipalaa ymparoiva, dialyysipussissa oleva puskuri otetaan talteen, pitoisuudeksi såådetåån 150 mM NaCl ja lasketaan DE52 (Whatman) ioninvaihtopylvaan lapi.
DNA eluoidaan paljon suolaa sisaltavalla puskurilla (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), saoste-taan etanolilla ja uudelleenliuotetaan veteen pitoisuuteen 0,1 mg/ml.
0,84 ke:n Pvu-BamHI-jakso, joka on saatu plasmi-dista pML3101, katkaistaan viela restriktioendonukleaa-silla Hgal. Tåma katkaisu saa aikaan 198 emåsparin Hgal-BamHI-jakson, joka sisåltaa kypsåå desulfatohirudiinia koodittavan sekvenssin tåydellisenå. Kun viela suorite-taan katkaisu Alul:lla, ei tama vaikuta 198 emåsparin Hgal-BamHI-jaksoon, mutta eliminoi toisen, samankokoisen Hgal-j akson.
0,2 ke:n Hgal-BamHI-jakso erotetaan muista jaksois-ta 1,5 %:sessa agaroosigeelissa, joka on tehty TBE-pusku-riin, ja eristetaan elektroeluutiolla (kuten edella on selostettu). DNA puhdistetaan ED52-ioninvaihtokromatogra-fisesti ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoi-daan veteen pitoisuuteen 30 yg/ml (0,2 pmol/ ul) .
b) PH05-promoottorialueen eristaminen, jossa on osa PH05:n signaalisekvenssia (ks. kuva 8)
Plasmidissa p31/PH05-TPA18 (ks. eurooppalainen patent-tihakemusjulkaisu no. 143 081) on PH05-promoottori ja PH05-signaalisekvenssi lukuvaiheistuksessa fuusioituneina vie-raaseen rakennegeeniin (t-PA). 584 emåsparin BamHI-Ball- jakso sisåltaa PH05-promoottorin ja PH05-signaalisekvenssin kokonaan, lukuunottamatta 3'-påån kahdeksaa nukleotidia.
8 yg p31/PH05-YPA18 DNArta katkaistaan restriktio-endonukleaasilla Ball (16 tuntia 37°C:ssa). DNA puhdistetaan fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisaostuksella. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,7 mg/ml.
PH05-signaalisekvenssin ja desulfatohirudiinia koodittavan alueen vålille saadaan oikea liitos synteettisel-lå kytkijållå, jonka kaava on 47 91280 (1) 5'-CCAATGCA-3' (2) 3'-GGTTACGTCAACA-51
Kahdeksan nukleotidia kytkijan 5’-paassa (5'-CCAATGCA) edus-tavat osaa PH05-signaalisekvenssista Ball-kohdasta proses-sointikohtaan. Yli menevat 5’-påan viisi nukleotidia, jot-ka ovat oligonukleotidissa (2), sopivat desulfatohirudii-nia koodittavan sekvenssin Hgal-katkaisukohdan 5'-paåharr.
Erilliset yksisaikeiset oligonukleotidit (1) ja (2) syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmalla (Itakura et al., supra). 1,1 yg ja 1,8 ug oligonukleotideja (1) ja (2) fosforyloidaan vastaavasti S'-paastaån, sekoitetaan ek-vimolaariset måarat ja emåspariutetaan esimerkissa 51 ku-vatulla tavalla.
1,3 yg (200 pmol) fosforyloitua, kaksisaikeista kytkija-DNA:ta liitetaån 7 ygraan (1,8 pmol) Ball:11a katkaistua plasmidia p31/PH05-TPA18 40 ylrssa puskuria, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT ja 1400 yksikkoa DNA-ligaasia (Biolabs), 15°C: ssa 16 tuntia. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 mi-nuuttia 85°C:ssa. KytkijaylimMara poistetaan saostamalla DNA niin, etta lasna on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaat-tia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA uudel-leensuspendoidaan ja katkaistaan viela restriktioendonuk-leaasilla BamHI. Sitten DNA uutetaan fenoli/kloroformilla, saostetaan etanolilla ja kyseiset kaksi restriktiojaksoa erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissa, joka sisaltaa tris-boraatti-EDTA-puskuria pH 8,3. 0,6 kern jakso eristetaan geelista. DNA elektroeluoidaan ja jatkopuhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografisesti ja etanolisaostuksella. 0,6 kern BamHI-Hgal-DNA-jakso uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 40 yg/ml.
c) pJDB207-hiivavektorijakson eristaminen (ks. kuva 8)
9 ug plasmidin pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) DNA:ta (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan restriktioendonukleaasilla BamHI. Tåydel-lisen katkaisun jalkeen DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan 50 mM
48
Tris.HCl-puskuriin pH 8,0 pitoisuuteen 0,1 mg/ml ja hajo-tetaan 7 yksikollå vasikan sisaelinten emasfosfataasia 1 tunti 37°C:ssa. Fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 1,5 tuntia 65°C:ssa ja DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihto-kromatografisesti (ks. esimerkki 51) ja saostetaan etanolil-la. 6,8 kern suuri BamHI-jakso erotetaæ 1 , 2 %:sessa agaroosi-geelisså, joka on tehty tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. DNA elektroeluoidaan ja puhdistetaan DE52-ioninvaihtokro-matografisesti ja saostetaan etanolilla. DNA liuotetaan veteen pitoisuuteen 0,4 mg/ml (0,1 pmol/ u1).
d) PH05-promoottorijakson ja desulfatohirudiinirakennegee-nin liittaminen pJDB207-hiivavektorijaksoon (ks. kuva 8)
Plasmidi pJDB207-hiivavektori, PH05-promoottori-jakso, joka sisaltåå PH05-signaalisekvenssin, ja desulfato-hirudiinirakennegeeni ovat kaikki eristettyja DNA-jak-soja (ks. esimerkki 511 a-c), jotka liitetaan yhteen ilmentamisplasmidiksi.
0,3 pmol plasmidin p31/PH05-TPA18 0,6 kern BamHI-Hgal-jaksoa ja 0,3 pmol plasmidin pML310L 0,2 kern Hgal-BamHI-jaksoa liitetaan 0,1 pmolriin plasmidin pJDB207R/PHO5-TPA (12-2) 6,8 kern BamHI-jaksoa TO Plrssa puskuria, jossa on 60 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikkoa T^ DNA-ligaasia, 20 tuntia 15°Crssa.
1 ylrn era yhteenliittamisseosta-lisatåan 100 yl.'aan transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja, jotka on valmistettu Hanahan menetelmålla (supra). Transformointi-menetelma on myos mukautettu tasta julkaisusta. Soluja kasvatetaan LB-agar-levyilla, jotka sisaltavat 50 ug/ml ampisilliinia.
24 amp -pesåketta kasvatetaan yksittaisesti LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA analysoidaan liitannaisen koon ja suunnan suhteen katkaisemalla restriktioendonukleaasilla PstI. Yhdelle kloonille, jossa on liitånnåinen oikeassa suunnassa, an-netaan nimeksi pJDB207/PHO5-HIR.
III) Plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR rakentaminen (ks.
49 91280 kuva 9)
Jotta UAS(PH05)-GAPDH-yhdistelmåpromoottorielemen-tit voitaisiin edullisesti liittaa PH05-signaalisekvenssin sisaltavåan desulfatohirudiinia koodittavaan alueeseen (kuten plasmidissa pJDB207/PHO5-HIR), tuodaan EcoRI-kat-kaisukohta luetuksi tulemattomaan 5'-alueeseen mRNA:n aloituskohtien ja koodittavan alueen ATG-kodonin våliin.
15 ug plasmidia pJDB207/PHO-HIR katkaistaan rest-riktioendonukleaasilla Dral (Boehringer). Syntyneet 4 jaksoa erotetaan 0,8 %:sessa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 4,2 ke:n jak so otetaan talteen geelista, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuu-teen 0,6 mg/ml.
Kukin kahdesta synteettisesta oligonukleotidista, joiden kaavat ovat 5'-AATTCGATTACCAATGTTT-3' 3'- GCTAATGGTTACAAA-5' (2,3 ug ja 2,9 ug vastaavasti) kinasoidaan 20 ul:ssa pusku-ria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 20 yksikkoa T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer).
Kun on inkuboitu 45 minuuttia 37°C:ssa, mo-lemmat reaktioseokset yhdistetaån, kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja annetaan jååhtyå huoneenlåmpotilaan. Emås-pariutettua oligonukleotidikytkijaa varastoidaan -20°C:ssa.
6,5 ug (2,3 pmol) 4,2 ke:n Dral-DNA-jaksoa inkuboi-daan 16 tuntia 15°C:ssa kinasoidun ja emåspariutetun oligo-nukleotidin 70-kertaisen ylimaårån kanssa 50 ul^ssa pusku-ria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikkoa T4 DNA-kinaasia (Biolabs). T4 DNA-ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa ja kytkijaylimaara poistetaan saostamalla DNA siten, etta lasnå on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA katkaistaan EcoRIrlla ja HindIII:lla. Syntyneet jaksot erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 643 emåsparin jakso otetaan talteen geelista 50 elektroeluutiolla ja etanolisaostuksella. DNA uudelleen-suspendoidaan pitoisuuteen 0,1 pmol/ ul. EcoRI-Hindlll-jakso sisaltaa PH05-signaalisekvenssin, desulfatohirudii-nia koodittavan sekvenssin ja PH05:n transkription lopet-tuskohdan.
534 emåsparin PH05-promoottorijakso eristetaan plasmidista p31/R (eurooppalainen patenttihakemusjulkai-su no. 100 561).
10 ug plasmidia p31/R katkaistaan restriktio-endonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Saadut 3 jaksoa erote-taan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 534 emas- parin BamHI-EcoRI-jakso eristetaan ja se sisaltaa PH05-promoottorin seka mRNA:n aloituskohdan.
Vektorijakso eristetMan plasmidista pJDB207/PHO5-HIR.
6 ug tata plasmidia katkaistaan BamHI:11a ja HindIII:lla. Suuri 6,5 ke:n BamHI-Hindlll-jakso erotetaan pienesta jak-sosta 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
Edella kuvatut kolme DNA-jaksoa, joissa on tarvit-tavat tarttuvat paat, liitetaan yhteen seuraavassa reak-tiossa: 0,2 pmol (70 ng) 534 emasparin BamHI-EcoRI-PH05- promoottorijaksoa, 0,2 pmol (85 ng) 643 emasparin EcoRI-Hindlll-jaksoa (hirudiinia koodittava sekvenssi) ja 0,1 pmol (0,4 ug) 6,5 ke:n BamHI-Hindlll-vektorijaksoa liitetaan yhteen 10 ul:ssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^» 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikkoa T4 DNA-li-gaasia, 6 tuntia 15°C:ssa. 1 ul:n era yhteenliittamis- seosta lisataan 100 ul:aan kalsiumilla kasiteltyja, trans-formointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
12 transformoitunutta amp -pesåkettå kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 ug/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmalla Holmes et al.
(Anal. Biochem. 114 (1981) 193) ja analysoidaan katkai-semalla EcoRI:11a ja BamHI:11a. Yksi klooni, jossa on halutut restriktiojaksot, eristetaan ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5(Eco)-HIR.
51 91280 IV) UAS1(PH05)-GAPDH-yhdistelmåpromoottorien liittåmi-nen desulfatohirudiiniproteiinia koodittavaan alueeseen 15 yg plasmidia pJDB207/PHO5(Eco)-HIR katkaistaan EcoRIrlla ja Hindlllrlla. DNA-jaksot erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelisså, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-pusku-riin pH 8,3. 643 emåsparin jakso irroitetaan geelista, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleen-suspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
6 yg plasmidia pJDB207/PHO5-HIR katkaistaan tåy-sin restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja Sall. Suu-ri 6,3 kern jakso (vektoriosa) erotetaan agaroosigeeli-elektroforeesilla, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Vektori-DNA-jakso uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,05 pmol/yl.
10 yg plasmidia pGAPDH-EL (ks. esimerkki 3dl) katkaistaan Bgllrllå ja EcoRIrlla. 266 emåsparin Bgll-EcoRI-jakso erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3, elektroeluoidaan geelista ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,3 pmol/yl.
0,3 pmol 548 emåsparin Sall-Bglll-jaksoa, joka si-saltaa UAS1(PH05):n (esimerkki 3dII), 0,3 pmol plasmidin pGAPDH-EL 266 emasparin Bglll-EcoRI-jaksoa, 0,3 pmol plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR 643 emåsparin EcoRI-Hindlll-jaksoa ja 0,12 pmol 6,3 kern Sall-Hindlll-vektori-jaksoa liitetåån yhteen 20 ylrssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 1 0 mM MgC^, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikkoå T4 DNA-ligaasia (Biolabs), 6 tuntia 15°Crssa. Yhteenliittåmisseoksesta lisåtåån 1 ylrn ha 3 ylrn erå 100 ylraan kalsiumilla kåsiteltyjå E. coli HB101-soluja. Plasmidi-DNA eristetåan amp -pesåkkeistå ja suoritetaan restriktioanalyysi Sallrlla, Bglllrlla, EcoRIrlla ja Hindlllrlla edellå kuvatulla tavalla (ks. esimerkki 3dIII). Valitaan yksi positiivinen klooni ja siile annetaan ni-meksi pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1). Sama rakentaminen suoritetaan plasmidista pGAPDH-FL saadulle 201 emaaparin Bglll-EcoRI-jaksolle. Yhdelle valituista plasmideista annetaan nimi pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1).
52 V) UAS1(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH-yhdistelmapromoottorien liittåminen desulfatohirudiinia koodittavaan alueeseen 3 yg kutakin plasmidia pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) ja pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) katkaistaan BglII:lla. Fenoli-uuton ja etanolisaostuksen jålkeen DNA:n sisåanvetåyty-neet 3'-pååt tåytetåån reaktiolla E. colin DNA-polyme-raasin kanssa (Klenow-jakso; Bethesda Research Laboratories) menetelmalla Maniatis et al. (supra). Entsyymi in-aktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 70°C:ssa. DNA:t katkaistaan viela Sall :11a ja suuret 7,2 ke:n jaksot eristetaan pehmealiivateagaroosigeelielektroforeesilla, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Kukin jakso uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,05 pmol/yl. Jaksot sisaltavat hirudiinia koodittavan alueen, suurim-man osan vektorisekvensseista ja jomman kuminan plasmideis-ta pGAPDH-EL tai pGAPDH-FL eristetyistå kahdesta eri GAPDH-promoottorista.
Plasmidi p31/Y (eurooppalainen patenttihakemusjul-kaisu no. 100 561) katkaistaan BstEIIrlla, inkuboidaan E. coli DNA-polymeraasin (Klenow-jakso) kanssa kuten edel-la on selostettu ja katkaistaan Sall :11a. 649 emasparin jakso erotetaan pehmeåagaroosigeelissa ja otetaan talteen fenoliuutolla ja etanolisaostuksella.
0,3 pmol plasmidin p31/Y 649 emasparin jaksoa, joka sisaltaa UAS1-UAS2(PH05)-promoottorielementin ja 0,15 pmol jompaa kumpaa 7,2 ke:n jaksoa liitetåan yhteen ja suoritetaan E. coli HBl01:n transformointi edellåkuvatul- p la tavalla. Plasmidi-DNA:t valmistetaan amp -pesakkeista ja analysoidaan restriktiokatkaisuilla. Valitaan yksi klooni kummastakin ja niille annetaan nimet pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) ja pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2).
Esimerkki 6: 31 emasparin sekvenssi riittaa toimimaan fosfaattisaatoelementtina PH05-promoottorin ylapaan alueen 31 emasparin sekvenssi (asemasta -381 aseaman -351), joka on kahden viereisen deleetion 410 ja Δ\ 3 maarittelema (ks. esimerkki 1f), voisi mahdollisesti sisaltaa saatosignaalin. Tama voidaan tutkia syntetisoimalla kemiallisesti kaksi 53 91280 komplementaarista oligonukleotidia, joilla on seuraava rakenne: 5’-AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG-3' 3'- GCTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGTCTTAA-5'
Tama sekvenssi sisåltaå 31 emasparin sekvenssin, jonka vieressa on EcoRI-restriktiokohdat. EcoRI-kohdat mahdol-listavat sekvenssin helpon polymeroinnin multimee-reiksi.
a) 31 emasparin sekvenssin kloonaaminen vektoriin LT98 50 pmol kutakin synteettista oligonukleotidia kina-soidaan erikseen 20 ml:ssa puskuria, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 20 yksikkoa T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kun on inkuboitu 45 minuuttia 37°C:ssa, molemmat reaktioseokset yhdistetåån, kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja annetaan jaahtya huoneenlampotilaan. Emaspariutettuja oligonukleotideja varastoidaan -20°C:ssa. 7,5 pmol kinasoituja ja emås- pariutettuja oligonukleotideja liitetåan yhteen 30 minuuttia edellakuvatulla tavalla (esimerkki 5III) 15 yl:n kokonaistilavuudessa. Sitten lisataån 5 yl EcoRIrlla katkaistua LT98 vektori-DNA:ta (Dixon et al., Gene 25, 189 (1983)) (0,075 pmol) ja inkubointia jatketaan kaikki- aan 6 tuntia. Suoritetaan E. colin HB101:n transformointi ja plasmidit eristetåan ja analysoidaan suorittamalla kat-kaisu BamHI:lla. Tamå analyysi antaa tietoja liitån-nåisen kokonaispituudesta ja mahdollistaa kloonattujen EcoRI-jaksojen lukumaaran arvioinnin. Valitaan yksit-taiset plasmidit, joissa on 1, 2, 3, 4 tai 5 EcoRI-jaksoa ja niiden DNA-sekvenssin maaritys (Sangerin menetelma) osoittaa, etta 31 emasparin elementit ovat liittyneet yhteen paå-hantasuunnassa.
b) Kloonaus plasmidiin pJDB207 31 emasparin oligomeerit testataan promoottorinsaato-funktionsa suhteen liittåmalla ne GAPDH-promoottorin F-elementin ylavirtaan. Plasmidi pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1) 54 lyhennetåån niin, etta saadaan plasmidi, josta on pois-tettu UAS1-elementti. Plasmidi katkaistaan Sall :11a ja Bgllrllå, geeli puhdistetaan ja suuri vektorijakso eristetaan. Samasta plasmidista tehty erillinen reaktioseos katkaistaan BamHI:lla. Sisaanvetåytyneet 3'-paat tåyte-taån Klenow-DNA-polymeraasilla kåyttåmalla kaikkia neljaa dNTP-laatua. Tasapaiset kohdat jatketaan fosforyloiduilla Bglll-kytkijoilla (CAGATCTG, Biolabs) ja, kun on suori-tettu katkaisu Sall :11a ja BglII:lla, eristetaan geeli-puhdistuksella DNA-jakso, jonka pituus on noin 400 emås-paria. Suuri vektorijakso liitetaan yhteen noin 400 emas-parin pituisen Sall-Bgll-jakson kanssa kayttåmållå T4 DNA-ligaasia. Transformoidaan E. coli HB101 ja eristetaan plasmidi, jolloin saadaan plasmidi, joka ei sisalla PH05 UAS-aluetta. Tasta plasmidista kaytetaån nimea pJDB207/GAPFL-EGL. Tama plasmidi katkaistaan BglII:lla ja se toimii vektorina 31 emåsparin oligomeerien kloonauksessa. LT98, joka sisåltaa 1, 2, 3, 4 tai 5 oligonukleotidiliitånnaista, katkaistaan BamHI:lla. Erikokoiset jaksot eristetaan geeli-puhdistuksella ja liitetaan itsenaisesti plasmidiin pJDB207/GAPFL-EGL, joka on sita ennen katkaistu BglII:lla. Yhteenliittamisseos pilkotaan BglII:lla, jotta saadaan poistetuksi uudelleen yhteenliittynyt vektori-DNA, joka ei sisalla DNA-liitannåista, ja sen jalkeen transformoidaan E. coli HB101. Saadut plasmidit analysoidaan suorittamalla restriktioanalyysi Sall :11a ja Dral:lla (GAPDH-promoottorin sisalla oleva kohta). Transformoidaan hiivakanta GRF18 ja sen jalkeen maaritetaan egliini C-tiitterit esimerkissa 4c kuvatulla tavalla. Seuraavat ominaisaktiivisuudet saadaan 46 tunnin fermentoinnin jalkeen: 55 91280 klooni 31 emasparin egliini-C-tiitteri pJDB207/ pituisen lii- (mg/l/OD-yksikko) tånnaisen lu- suunta* matala P. korkea kumååra PAPFLI( + )-EGL 1 —- 9.2 5.2 PAPFLI(-)-EGL 1 — 10.2 2.1 PAPFLIK+ )-EGL 2 — 10.2 3.5 PAPFLI11 (-) -EGL 3 — 11.2 1.4 PAPFLIV( + )-EGL 4 — 10.7 1.5 PAPFLV(-)-EGL 5 — 12.6 1.4 * -^ sama suunta kuin PH05-promoottorilla < eri suunta kuin PH05-promoottorilla
Esimerkki 7: Insuliininkaltaisen kasvutekijan 1 (IGF-1) il- mentaminen PAPFL-promoottorin avulla
Plasmidi pAB113-IGF-1, jota on selostettu eurooppa-laisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 123 228, katkais-taan Pstl:lla. Kukin kahdesta synteettisestå oligonukleo-tidista (50 pmol), joiden kaavat ovat
AATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA
GTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG
kinasoidaan ja emaspariutetaan edellåkuvatulla tavalla. Emåspariutettu kaksisåikeinen adapteri liitetåån Pstl:lla katkaistuun plasmidiin, katkaistaan EcoRI:lla ja BamHI:llå ja noin 800 emasparin EcoRI-BamHI-jakso eristetaan geeli-puhdistuksella. Plasmidi pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1) katkaistaan Sall :11a ja EcoRI:lla ja noin 700 emasparin jakso eristetaan geelipuhdistuksella. Kolmoisliittamisesså liite-taan 0,5 y :j plasmidia pC1/1 (eurooppalainen patenttihake-musjulkaisu no. 123 228; katkaistu BamHI:lla ja Sallillå, vektori geelipuhdistettu) 100 ngraan kutakin kahdesta pienemmasta geeni- ja promoottoriosasta vastaavasti. Trans-formoidaan E. coli ja plasmidit analysoidaan EcoRI:lla,
BamHI:lla ja Sall:11a katkaisemalla. Kun suoritetaan hii-vakannan AB103 (talletettu ATCC-kokoelmiin numerolla 20 673; pYIGF-1-10/1:n poisto kasvattamalla hiivasoluja 56 yon yli kompleksialustassa ja tutkimalla yksittåisistå pesakkeista IGF-1-plasmidin olemassaolo suorittamalla pesakehybridisaatio Hinnen et al:n kuvaamalla tavalla (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_5, 1 929 ( 1 978)) transfor-mointi, saadaan transformantteja, jotka tuottavat IGF-1:ta vain indusoiduissa olosuhteissa (matala P^) (1 mg/ml), kun maaritys suoritetaan tavanomaisella kompetitiivisella radioimmunologisella måårityksellå kayttamalla radioaktii-visesti leimattua IGF-1:ta (Anderson et al. teoksessa Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., ed., Walter de Gruyter, Berlin). Klooneille annetaan nimeksi pC1/1/PAPFL-IGF-1(UAS1).
Esimerkki 8: Kudosplasminogeenjn aktivaattorin (t-PA) ilmentaminen PH05-GAPDH-yhdistelmapromoottorin ohjauk-sessa (ks. kuva 10) 12 yg plasmidia pJDB207/PHO5-TPA18 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan taysin restriktioendonukleaaseilla Sail ja Hindlll. Syntyneet kaksi DNA-jaksoa eristetaan 0,8 %:sessa agaroosigeelissa, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Pieni 2,6 ke:n Sall-Hindlll-jakso eristetaan elektroeluutio11a, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. DNA katkaistaan vielå Ballrlla. 1,8 ke:n jakso, joka sisåltaa osan PH05-signaalisekvenssista, t-PA:ta koodittavan sekvenssin ja PH05-terminaattorin, eristetaan ja puhdistetaan edella-kuvatulla tavalla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoi-suuteen 0,1 pmol/yl.
Yhdistelmapromoottorijakso eristetaan plasmidista pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2) (ks. esimerkki 5V). 12 yg plasmidi-DNA:ta katkaistaan Sall:lla ja HindIII:lla. Saa-tu 1,5 ke:n jakso katkaistaan viela Ball:lla. 920 ke:n jakso, joka sisåltaa yhdistelmåpromoottorin ja osan PH05-signaalisekvenssistå eristetaan 1,5 %:sessa agaroosigeelissa. DNA elektroeluoidaan, uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
0,2 pmol 920 emasparin Sail-Ball-jaksoa, 0,2 pmol 1,8 ke:n Ball-Hindlll-jaksoa ja 0,1 pmol Sall:lla ja 57 91280
HindIII:lla katkaistua vektoria pJDB207 liitetaan yhteen 16 tuntia 15°C:ssa 10 μ1:η kokonaistilavuudessa. 1 μ1:η era yhteenliittåmisseosta lisataan 100 plraan kalsiu-milla kåsiteltyjå, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
p 12 transformoitunutta amp -pesaketta kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisaltaa 100 yg/ml ampisil-liinia. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmållå Holmes et al. (Anal. Biochem. 114, 193 (1981)) ja analysoidaan katkaisemalla PstI:llå ja BamHI/EcoRI:11a. Yksi klooni, jossa on halutut restriktiojaksot, eristetaan ja siile annetaan nimeksi pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2).
Vastaava rakentaminen tehdaan UAS1(PH05)-elementil-le: Plasmidin pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) 820 emåsparin Sall-
Ball-jakso (esimerkki 5IV) eristetaan ja liitetaan 1,8 ke:n Bal1-HindIII-jaksoon ja Sall,HindIII-katkaistuun vekto-riin. Nain saadusta plasmidista kaytetaan nimea pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1).
Vastaavat rakentamiset tehdaan vastaavilla jaksoil-la, jotka on saatu plasmidista pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) tai pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) (esimerkki 5). Saaduista plasmideista kaytetaan nimia pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1) ja pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1 + UAS2).
Esimerkki 9: Polypeptidien ilmentaminen PH05-GAPDH-yhdis- telmapromoottorien ohjauksessa a) Saccharomyces cerevisiae GRF18:n transformointi:
Saccharomyces cerevisiae GRF18 (a,his 3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can ) transformoidaan plasmideilla
pJDB20 7/PAPEL-HIR(UAS1) pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) pJDB20 7/PAPFLI(+)-EGL pJDB207/PAPFLI(-)-EGL pJDB20 7/PAPFLII(+)-EGL pJDB2 0 7/PAPFLI11(-)-EGL pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL
58 pJDB207/PAPFLV(-)-EGL pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) pJDB20 7/PAPFL-TPA(UAS1) pJDB20 7/PAPEL-TPA(UAS1 + UAS2) pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2) pCl/1/PAPFL-IGF-1(UAS1) kayttamalla Hinnen et al:n kuvaamaa transformointimene-telmaa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_5 , 1 929 ( 1 978)). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimialusta-levyilla, joista puuttuu leusiini. Yksittaiset transformoituneet hiivapesakkeet eristetaan ja niille annetaan nimet
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLI(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFLII(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIII(-)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLIV(+)-EGL Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFLV(-)-EGL
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-TPA(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-TPA(UASl + UAS2) Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pCl/l/PAPFL-IGF-1(UAS1) b) Transformanttien fermentointi
Kunkin S. cerevisiae GRF18-transformantin soluja kasvatetaan 10 ml:ssa hiivan minimikasvualustaa (Difco Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja, johon on lisatty 59 91280 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiinia) 50 ml:n Erlenmeyer-kolveissa ravistelemalla 30°C:ssa 24 tuntia niin, etta solutiheydeksi tulee 3 x 10 solua/ml. Solut pestaan 0,9 %:sessa natriumkloridissa ja niilla ympataan 50 ml matala-P^alustaa, joka on valmistettu noudattamalla Difcon Yeast Nitrogen Base-alustan koostumusta (ilman aminohappoja), mutta kayttamallå 0,03 g/1 KF^PO^, 1 g/1 KCl ja 10 g/1 L-asparagiinia (NH^^SO^in tilalla, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiinia. Viljelmat ympataan solutiheyteen korkeintaan 4 x 10° solua/ml ja sekoitetaan 30°C:ssa korkeintaan 42 tuntia nopeudella 200 1/min.
c) Ilmentyneiden geenituotteiden tiitterit
Hiiva erittaa desulfatohirudiiniyhdisteitå kasvu-alustaan. Kun on fermentoitu 22 tuntia otetaan kasvu-alustasta 10 ml:n nayte ja se rikastetaan proteiinien suhteen poistamalla suolat ja konsentroimalla Bond Elut C-18-pylvaassa (1 ml, Analytichem International). Pyl-vås pestaan kahdesti 1/5 ml:11a vesi-asetonitriiliseos-ta (9:1), jossa on 0,1 % trifluorietikkahappoa. Desul-fatohirudiiniyhdisteet eluoidaan pylvaasta vesi-aseto-nitriili-0,1 % trifluorietikkahapposeoksella (6:4 tila-vuusosina). 2 ml eluaattia vakevoidaan Speed Vac-vå- kevdintilaitteessa (Savant) niin, etta lopulliseksi ti-lavuudeksi tulee 400 pi. Desulfatohirudiini identifioi-daan HPLC-analyysilla, vertaamalla autenttiseen desulfato-hirudiiniin ja trombiini - inhibitiomaarityksella (ks. M.U. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II, s. 341 - 316, Verlag Chemie, Weinheim (Lansi-Saksa) 1983).
Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1.
60
Taulukko 1: Eri plasmideilla transformoituneiden S.
cerevisiae GRF18-kantojen kasvualustaansa erittama desulfatohirudiini desulfatohirudiini p asmi i (mg/1 kasvualustaa/OD^Qg) pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) 2.0 pJDB20 7/PAPFL-HIR(UAS1) 2.2 pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) 3.0 pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) 2.8
Kudosplasminogeenin aktivaattaiiit-PA) kertyy hiiva-soluihin. Valmistetaan solu-uutteet ja t-PA-aktiivisuus maaritetaan seuraavasti: Matala-P^kasvualustasta (35 ml) (B. Meyhack et al. EMBO-J. 1, 675 (1982)), jonka soluti- 7 teys on 1 - 2 x 10 /ml, otetaan solut talteen sentrifugoi-malla Sorvall SS34-sentrifugissa 10 minuuttia nopeudella 3000 1/min. Solut pestaan puskurissa, joka sisaltaa kas-vualustan suolakomponentit (so. ei aminohappoja, glukoosia, vitaraiineja eika hivenaineita). Solut sentrifugoidaan huo-neenlampotilassa 5 minuutissa nopeudella 3000 1/min. Las-keutuneet solut uudelleensuspendoidaan kaikkiaan 4 ml:aan kylmaå 66 mM natriumfosfaattipuskuria pH 1,4, joka sisaltaa 0,1 tilavuus-% Triton X-100. Solususpensio siirretaån 30 ml:n Corex-putkeen, lisataan 8 g lasihelmia (halkai-sija 0,4 mm) ja suspensiota ravistellaan Vortex Mixerissa (Scientific Instruments Inc., USA) taydella nopeudella 4 minuuttia ja sen jalkeen jaahdytetaan jaahauteella.Talla tavalla yli 90 % soluista sarkyy. Solujåtteet ja lasi-helmet sentrifugoidaan pohjaan 10 minuutissa 4°C:ssa nopeudella 8000 1/min Sorvall HB-4-roottorissa. Emaliuos siirretaan Eppendorf-putkiin, jaahdytetaan nestetypessa ja varastoidaan -60°C:ssa.
t-PA-aktiivisuus maaritetaan Rånbyn menetelmalla (Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982)) pienin muunnok-sin. Kaytetty substraatti on D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S- 61 91280 2251). Absorptio 405 nm:ssa korjataan epaspesifisella katkaisulla ja suhteutetaan urokinaasistandardiin. Tu-lokset on esitetty taulukossa 2.
Taulukko 2: Eri plasmideilla transformoituneiden S.
cerevisiae GRF18-kantojen t-PA-aktiivisuus plasmidi t-PA-aktiivisuus (k.y./l hiivasoluvil-jelmaS/OD600) pJDB20 7/PAPFL-TPA(UAS1) 300 pJDB20 7/PAPFL-TPA(UAS1 + UAS2) 200
Esimerkki 10: IGF-1:n eriståminen transformoituneesta hiivakannasta ja tunnistaminen a) IGF-1:n eriståminen kasvualustasta
Hiivakantaa pCl/1/PAPFL-IGF-1(UAS1) kasvatetaan 60 tuntia. 3 litraa kasvualustaa otetaan talteen ja sentri-fugoidaan esimerkisså 9 kuvatulla tavalla. Kun 2 ml ema-liuosta (vakevoity 1:10) kaanteisfaasi-HPLC:11a, saadaan tiitteriksi 1 mg/1 IGF-1:ta. Emaliuokseen lisataan 20 ml SP-Sephadex C-25 (Pharmacia) pH:ssa 3,0 ja sekoitetaan 60 minuuttia 4°C:ssa. Adsorboitunut IGF-1 eluoidaan pestysta hartsista natriumasetaattipuskurigradientissa (50 mM, pH 3,0 - pH 9,0) ja jatkopuhdistetaan kahdessa ioninvaihtovaiheessa: Ensimmåinen vaihe suoritetaan CM-52- pylvaåssa (Whatman, 1,5 cm x 8,5 cm, gradientti, puskuri A 20 mM NH^OAc pH 4,0; puskuri B 100 mM NH^OAc pH 6,8).
Toinen vaihe suoritetaan DE-53-anioninvaihtopylvaassa (Whatman) (olosuhteet: 1,5 cm x 10, 5 cm pylvas, virtaus 1 ml/min, gradientti, puskuri A 20 mM NH^OAc pH 9,0; puskuri B 200 mM NH^OAc pH 6,5). Lopullinen puhdistus suoritetaan puolipreparatiivisessa RP-HPLC-pylvåassa.
Aktiivinen jae eluoituu retentioajassa 21,3 minuuttia antaen 1,1 mg IGF-1:ta, jonka puhtausaste on 95 %.
62
Koeolosuhteet: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-pylvås, 10 x 250 mm, nåyte-eråt (200 UL vakevoity suhteessa 1:10) per erotus; AUFS 0,5 220 nm:ssa; virtausnopeus 3 ml/min. Eluentti: A: 0,1 % trifluorietikkahappo, B:asetonitriili/vesi 8:2 + 0,7 % trifluorietikkahappoa, 3 minuuttia 35 % B:ta, sitten nostetaan 30 minuutin kuluessa 45 %:ksi B:ta. Saadut jakeet laimennetaan 1:1 vedella ja lyofilisoidaan.
b) IGF-1:n karakterisointi kannan pC1/1/PAPFL-IGF-1(UAS1) fermentoinnista
Kasvuliuoksesta eristetyn IGF-1:n RP-HPLC-analyysi (ks. esimerkki 10a) osoittaa, etta tuote on identtinén seerumista saadun autenttisen lGF-1:n kanssa.
Isoelektrinen piste: pi 8,6 (isoelektrinen foku- sointi, proteiinin TCA-saostus)
Aminohappokoostumuksen maårittåminen
Noin 2,5 ug puhdasta IGF-1:ta hydrolysoidaan 24 tun-tia 6 N suolahapossa 110°C:ssa ja sen jålkeen suorite-taan analyysi Chang et al:n menetelmalla (DABS-Cl-method; Methods in Enzymology 9J_, 41 (1983)). Hydrolysaatin koostumus on seuraava: aminohappo hydrolysaatti aminohappo hydrolysaatti
Asp 5.7 (5) Ile 0.7 (1)
Thr 3.2 (3) Leu 5.9 (6)
Ser 5.2 (5) Tyr 2.8 (3)
Glu 6.5 (6) Phe 3.9 (4)
Pro 5.3 (5) His
Gly 7.2 (7) Lys 3.0 (3)
Ala 6.1 (6) Arg 6.0 (6)
Val 2.7 (3) Met 0.9 (1) kystiini 2.2 (3) y'nte’ensa (70)
Osittainen sekvenssianalyysi 70 yg:lle (10 nmol) puhdasta IGF-1:ta suoritetaan tavanomai-nen sekvenssianalyysi Edmanin menetelmalla. N-påSn 63 91280 PTH-aminohapot maaritetaan RP-HPLC-menetelmallå.
-kokset: gykll 1 5 , ί °
Amino Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys*-Gly-Ala-Glu-Leu-
Sykli 11 15 ^
Amino Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys*-Gly-Asp-
By&li 21 25 30
Amino Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lye-Pro-Thr-Gly-
Eykli 31 35 40
Amino Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-
SyKli 41 45 50
Amino Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-n.d.-n.d.-Phe-Arg- n.d.: ei maaritetty *: cys (6) ja cys(18) maaritetaan erikseen karboksimety- loimalla jodiasetamidilla.
Osittainen aminohapposekvenssi, joka ulottuu amino-haposta 1 aminohappoon 50, on nain olien identtinen au-tenttisen IGF-1:n julkaistun primaarisen sekvenssin kanssa.
C-påan analyysi
Puhdas IGF-1 pilkotaan karboksipeptidaasi Y:lla ja vapautuneet aminohapot maaritetaan aminohappoanalysaatto-rilla (ks. J.Y. Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Biochem. J.
199, 547).
Tulokset: aminohappo 70 5 minuutin hajotus -Ala 120 minuutin hajotus Ser-Ala
Naennainen molekyylipaino: IGF-1 (30 yg) analysoidaan SDS-ureageelissa (SUDS-geeli; ks. Kyte et al., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)). Havaitaan yksi vyohyke, joka vastaa 6000 - 7000 daltonin naennaista molekyylipainoa.
Molekyylipainon maaritys FAB-MS-menetelmalla
IGF-1:lle suoritetaan FAB-MS-maaritys (fast atom bombardment positive ion mass spectrometry. Laite: ZAB-HF
64 massaspektrometri, VG-Analytical Ltd., Manchester; matrii-si: tioglyseroli; Xenon-pommitus; ionienergia 3 KeV; ulkoinen kalibrointi: Cs30J29 (molekyylipaino 7667,4).
empiirinen kaava: C331H51 8*J94°1 0S7 molekyylipaino(laskettu) 7648,71 molekyylipaino (loydetty) 7648,07
Claims (12)
1. Ylåvirrassa oleva aktivointisekvenssi, tunnettu siita, etta se kMsittaa osan hiivan PH05-geenista, ja etta kyseessa on ylavirrassa oleva aktivointisekvenssi UAS1 (PH05) tai UAS2 (PH05), jotka sijaitsevat hiivan PH05-gee-nin BamHI-BstEII-jaksossa nukleotidien -174 ja -541 vMlil-la, jolloin ylS-virrassa oleva aktivointisekvenssi UAS1 (PH05) sijaitsee hiivan PH05-geenin BamHI-Clal-jaksossa nukleotidien -274 ja -541 valilla, ja tarkemmin DNA-jak-sossa jonka sekvenssi on GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT ja ylavirrassa oleva aktivointisekvenssi UAS2 (PH05) si-jatsee hiivan PH05-geenin Clal-BstEII-jaksossa nukleotidien -174 ja -273 valilla.
2. Hiivan yhdistelmapromoottori, tunnettu siita, etta se sisåltaa S'-ylapSan promoottorielementin, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin ylavirrassa oleva(t) aktivointikohta(dat), ja hiivan GAPDH-gee-nin S'-alapaan promoottorielementin, joka on hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti valilla -5 - -199 tai hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti valilla -5 - -263.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmapromoottori, tunnettu siita, etta 5'-ylapaan promoottoriele-mentti on hiivan PH05-geenin 5'-alueen 368 emasparin BamHI-BstEII-jakso, hiivan PH05-geenin 5'-alueen 268 emasparin BamHI-Clal-jakso, 31 emasparin jakso, jonka kaava on GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT tai hiivan PH05-geenin 5'-alueen 100 emasparin Clal-BstEII-jakso.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmapromoottori, tunnettu siita, etta se sisåltaa UAS1 (PH05):n ja/ tai UAS2 (PH05):n.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmapromoottori, tunnettu siita, etta 3'-alapaån promoottorielement-ti on johdettu glykolyyttistå entsyymia koodittavan hiiva-geenin promoottorista.
6. Hiivan yhdistelmavektori, tunnettu siita, etta se sisaltåa yhden tai useampia DNA-liitannaisiå, joissa kussakin on hiivaan verrattuna heterologista polypeptidia koodittava DNA-segmentti sellaisen yhdistelmåpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-ylapaan promoottorielementista, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja hiivan GAPDH-geenin 3'-alapaån promoottorielementista, joka on hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti valilla -5 - -199 tai hiivan GAPDH-promoottorin DNA-fragmentti valilla -5 - -263.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmavektori, tunnettu siita, etta se sisMltåå joko patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen 5'-ylapaån promoottorielementin ja patenttivaatimuksen 5 mukaisen 3'-alapaån promoottorielementin.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen yhdistelmavektori, tunnettu siita, etta se sisåltaa DNA-segmentin, joka koodittaa korkeampaa eukaryoottista alkuperåå olevaa polypeptidia.
9. Transformoitunut hiivaisanta, tunnettu siita, etta transformoituminen on tapahtunut yhdistelmavektoril- 91280 la, joka sisåltåå yhden tai useampia DNA-liitånnåisiå, jolssa kussakin on hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiå koodittava DNA-segmentti sellaisen yhdistelmåpro-moottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-ylåpåån promoottorielementista, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja hiivan GAPDH-geenin 3'-alapåån promoottorielementista, joka si-såltåå transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna.
10. Menetelmå hiivalle heterologisen polypeptidin tuotta-miseksi, tunnettu siitå, etta hiivakantaa, joka on transformoitunut yhdistelmSvektorilla, joka sisåltåå yhden tai useampia DNA-liitånnåisiå, joissa kussakin on hiivaan verrattuna heterologista polypeptidiå koodittava DNA-seg-mentti sellaisen yhdistelmåpromoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, joka koostuu 5'-ylåpåån promoottorielementista, jossa on patenttivaatimuksen 1 mukaiset hiivan PH05-geenin UAS(:t), ja hiivan GAPDH-geenin 3'-alapåån promoottorielementista, joka sisåltåå transkriptionaloituskohdat funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, vil-jellåån ja ilmentynyt polypeptidi otetaan talteen.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, t u η n e t-t u siitå, ettå DNA-sekvenssi koodittaa korkeampaa euka-ryoottialkuperåa olevaa polypeptidiå.
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, t u η n e t-t u siitå, ettå DNA-sekvenssin koodittama polypeptidi on ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattori (t-PA), desulfa-tohirudiini, egliini C tai insuliinin kaltainen kasvuteki-jå.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8521496 | 1985-08-29 | ||
| GB858521496A GB8521496D0 (en) | 1985-08-29 | 1985-08-29 | Repressible yeast promoters |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863430A0 FI863430A0 (fi) | 1986-08-25 |
| FI863430A FI863430A (fi) | 1987-03-01 |
| FI91280B FI91280B (fi) | 1994-02-28 |
| FI91280C true FI91280C (fi) | 1994-06-10 |
Family
ID=10584428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863430A FI91280C (fi) | 1985-08-29 | 1986-08-25 | Repressoituvat hiivapromoottorit |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436136A (fi) |
| EP (1) | EP0213593B1 (fi) |
| JP (1) | JPH07110233B2 (fi) |
| AT (1) | ATE62510T1 (fi) |
| AU (1) | AU599329B2 (fi) |
| CA (1) | CA1318616C (fi) |
| DD (2) | DD254212A5 (fi) |
| DE (1) | DE3678647D1 (fi) |
| DK (1) | DK175093B1 (fi) |
| ES (3) | ES2001618A6 (fi) |
| FI (1) | FI91280C (fi) |
| GB (1) | GB8521496D0 (fi) |
| GR (1) | GR862209B (fi) |
| HU (1) | HU211207B (fi) |
| IE (1) | IE58844B1 (fi) |
| IL (1) | IL79837A (fi) |
| NO (1) | NO175871C (fi) |
| NZ (1) | NZ217388A (fi) |
| PH (1) | PH24715A (fi) |
| PT (1) | PT83273B (fi) |
| SU (1) | SU1630616A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA866535B (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU621277B2 (en) * | 1985-11-13 | 1992-03-12 | Xoma Corporation | Shortened phosphoglycerate kinase promoter |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
| GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
| GB8907110D0 (en) * | 1988-05-04 | 1989-05-10 | Ciba Geigy Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| NO177065C (no) * | 1988-09-26 | 1995-07-12 | Labofina Sa | Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| JPH06506117A (ja) * | 1991-04-01 | 1994-07-14 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 |
| US5674728A (en) * | 1993-11-03 | 1997-10-07 | Novartis Corporation | Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease |
| JPH08173170A (ja) * | 1994-05-25 | 1996-07-09 | Kirin Brewery Co Ltd | キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現 |
| JP2001501097A (ja) * | 1996-09-24 | 2001-01-30 | ケイダス ファーマスーティカル コーポレイション | レセプターエフェクターを同定する方法及び組成物 |
| US6265186B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-07-24 | Dsm N.V. | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces |
| US6890730B1 (en) | 1999-12-10 | 2005-05-10 | The Salk Institute | Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems |
| US8008459B2 (en) * | 2001-01-25 | 2011-08-30 | Evolva Sa | Concatemers of differentially expressed multiple genes |
| EP2571991A1 (en) | 2010-05-20 | 2013-03-27 | Evolva SA | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
| AU2021260878A1 (en) | 2020-04-20 | 2022-11-17 | Vestaron Corporation | Proteolytically stable U1-agatoxin-Ta1b variant polypeptides for pest control |
| TW202205956A (zh) | 2020-05-01 | 2022-02-16 | 美商韋斯塔隆公司 | 殺蟲組合 |
| CA3215602A1 (en) | 2021-04-01 | 2022-10-06 | Vestaron Corporation | Av3 mutant polypeptides for pest control |
| WO2023122805A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Vestaron Corporation | Sorbitol driven selection pressure method |
| TW202413392A (zh) | 2022-05-18 | 2024-04-01 | 美商韋斯塔隆公司 | 殺蟲ａｃｔｘ肽變異體 |
| WO2023245100A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Vestaron Corporation | Antimicrobial ncr13 variant peptides |
| WO2024026406A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Vestaron Corporation | Next Generation ACTX Peptides |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
| US4876197A (en) * | 1983-02-22 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| EP0127839B1 (en) * | 1983-05-27 | 1992-07-15 | THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| GB8314961D0 (en) * | 1983-05-31 | 1983-07-06 | Kingsman A J | Dna sequence |
| EP0143081B1 (en) * | 1983-11-21 | 1989-08-23 | Ciba-Geigy Ag | Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast |
| EP0164556B1 (en) * | 1984-05-11 | 1994-03-02 | Chiron Corporation | Enhanced yeast transcription employing hybrid promoter region constructs |
| EP0164566A3 (de) * | 1984-05-11 | 1986-10-29 | LGA Gastechnik GmbH | Sicherheitseinrichtung für Flüssiggastanks |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
-
1985
- 1985-08-29 GB GB858521496A patent/GB8521496D0/en active Pending
-
1986
- 1986-08-25 IL IL79837A patent/IL79837A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-25 FI FI863430A patent/FI91280C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 DE DE8686111820T patent/DE3678647D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-26 EP EP86111820A patent/EP0213593B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-26 AT AT86111820T patent/ATE62510T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-27 CA CA000516879A patent/CA1318616C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-27 GR GR862209A patent/GR862209B/el unknown
- 1986-08-27 DD DD29389486A patent/DD254212A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-27 DD DD31325586A patent/DD267739A5/de unknown
- 1986-08-28 AU AU62032/86A patent/AU599329B2/en not_active Expired
- 1986-08-28 HU HU863720A patent/HU211207B/hu unknown
- 1986-08-28 ZA ZA866535A patent/ZA866535B/xx unknown
- 1986-08-28 NO NO863458A patent/NO175871C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 PH PH34192A patent/PH24715A/en unknown
- 1986-08-28 PT PT83273A patent/PT83273B/pt unknown
- 1986-08-28 DK DK198604096A patent/DK175093B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-28 SU SU864028035A patent/SU1630616A3/ru active
- 1986-08-28 NZ NZ217388A patent/NZ217388A/xx unknown
- 1986-08-28 IE IE230786A patent/IE58844B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 ES ES8601490A patent/ES2001618A6/es not_active Expired
- 1986-08-29 JP JP61201924A patent/JPH07110233B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-16 ES ES8800794A patent/ES2006382A6/es not_active Expired
- 1988-03-16 ES ES8800795A patent/ES2006383A6/es not_active Expired
-
1991
- 1991-12-20 US US07/811,898 patent/US5436136A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91280C (fi) | Repressoituvat hiivapromoottorit | |
| EP0100561B1 (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| EP0123544A2 (en) | Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor | |
| FI94773B (fi) | Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi | |
| CZ284251B6 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce | |
| GB2137208A (en) | The use of the gal1 promoter | |
| IE59774B1 (en) | Expression and secretion of heterologous proteins by yarrowia lipolytica transformants | |
| EP0127304A1 (en) | Process for producing heterologous protein in yeast, expression vehicle therefor, and yeast transformed therewith | |
| US7198919B1 (en) | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems | |
| EP1076097B1 (en) | METHOD FOR CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE | |
| US6410272B1 (en) | Production of thrombin inhibitors | |
| KR940011534B1 (ko) | 억제성 효모 프로모터의 제조방법 | |
| PH26266A (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| HU204087B (en) | Process for producing humqn alpha or beta interferon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: NOVARTIS AG |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: NOVARTIS AG |
|
| MA | Patent expired |