KR940011534B1 - 억제성 효모 프로모터의 제조방법 - Google Patents

억제성 효모 프로모터의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

억제성 효모 프로모터의 제조방법
제1도는 PH05 프로모터 영역 BamHⅠ-SalⅠ 단편의 DNA 서열을 나타낸다.
제2도는 GAPDH의 프로모터 영역의 DNA 서열[참조:Clone 491, G.A.Bitter et al., Gene 32, 263(1984)]을 나타낸다.
제3도는 플라스미드 pGAPDH-EL의 작제늘 도식화한 것이다.
제4도는 본 발명에 사용한 GAPDH 유전자의 3' 프로모터 요소를 나타낸다.
제5도는 플라스미드 pJDB207R/PH05-EGL의 작제도이다.
제6도는 플라스미드 pJDB207/PAPEL-EGL(UAS 1)의 작제도이다.
제7도는 성숙한 데설파토히루딘을 암호화하는 DNA 단편의 분리를 나타내는 도식적 도면이다.
제8도는 플라스미드 pJDB207/PH05-HIR의 작제도이다.
제9도는 플라스미드 pJDB207/PH05(Eco)-HIR의 작제도이다.
제10도는 플라스미드 pJDB207/PAPFL-TPA(UAS 1+UAS 2)의 작제도이다.
본 발명은 재조합 DNA 기술을 사용한 효모 숙주에서의 외래 폴리펩타이드 제조에 관한 것이다. 특히 본 발명은 신규한 상부(upstream) 활성 서열, 그런 상부 활성 서열을 포함하는 하이브리드 효모 프로모터, 효모 세포의 형질전환시 유용한 신규의 하이브리드 벡터, 이와 같은 형질전환된 효모 세포 및 효모에 대해 외래인 폴리펩타이드 제조를 위한 형질전환된 효모 세포의 용도에 관한 것이다.
지난 수년 동안 유전공학 분야에는 커다란 진보가 있었고, 유전적으로 조작된 미생물, 특히 장내 세균 에쉐리시아 콜라이(Escherichia coli) 및 제빵용 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 균주를 사용한 몇몇 시스템이 현재 이용되고 있다. 그러나 산업상 단백질의 경제적이고도 대규모 생산에 적합한 또 다른 증진된 시스템, 특히 효모같은 진핵 시스템에 대한 필요성이 상존한다. 현재 유전자 클로닝을 위한 여러가지 효모 벡터가 입수 가능하다. 효모에서 외래 유전자의 효율적인 발현을 위해, 구조적 암호화 서열이 유리하게는 유전자 발현의 외인적 제어를 허용하는 조절 특성이 있는 강력한 효모 프로모터와 결합되어야 한다. 발현의 효율성(생성물 형성)은 사용한 프로모터의 함수로서 그의 강도에 비례하는 것으로 여겨지기 때문에, 유전공학 분야의 종사자들은 강력한 프로모터 시스템의 개발에 특별한 관심을 가졌다.
단백질을 암호화하는 클론된 효모 유전자의 시험관내 변이유발 및 기능 분석을 위한 효모 세포로의 재유도는 여러가지 필수적인 시스-작용성(cis-acting) 프로모터 요소의 동정을 가능케 하였다[참조:L.Guarente, Cell 36, 799(1984)]. 유전자의 5'말단에 단백질 암호화 영역이 바로 측면으로 위치하는 요소로 시작해서 이들 요소는 다음을 포함한다.
-A-T가 풍부한, 가끔 CAACAACAA(또는 관련서열) 주요 서열을 포함하는 5' 전사된 리더 영역(leader region).
-해독 개시 코돈 ATG로부터 약 40 내지 60bp(때로는 그 이상)에 위치하고, 통상 상이한 강도의 mRNA 출발 부위의 다수를 지시하는 전사 개시점.
-전사 개시점으로부터 약 40 내지 80bp에 위치하고, 아마도 필수적인 RNA 폴리머라제 Ⅱ인지 부위로서 작용하는 TATA 박스(때로는 하나 이상).
-TATA 박스로부터 상부 약 100 내지 300bp에 위치하는 조절 단백질의 추정적 표적 부위인 상부 활성부위(들)(UAS)
UAS는 원핵생물에서 발견되는 조절 부위와 다른 방식으로 작용하고 포유류 시스템의 인헨서(enhancer)부위에 더 유사하다. 상세한 자료는 양성적 작용 조절 단백질(GAL 4 유전자 생성물)이 직접 GAL 1-GAL 10의 UAS와 상호 작용하는 효모 GAL 1, GAL 7, GAL 10 집락으로부터 수득할 수 있다[Giniger et al., Cell 40, 767(1985)].
효모 CYC 1 유전자의 TATA 박스 앞의 GAL 1-GAL 10의 UAS를 암호화하는 프로모터 절편을 융합하므로써, 전사가 GAL 1-GAL 10의 UAS 조절하에 있게 된, 즉 GAL 4 유전자 의존성인 하이브리드 프로모터가 생성된다[L. Guarente et al., Proc Natl, Acad. Sci. USA 79, 7410(1984)]. CYC 1 및 LEU 2의 프로모터 요소를 융합한 유사한 작제가 이루어졌다[L. Guarente et al., Cell 36, 503(1984)]. 이들 두 실례는 효모로부터의 프로모터 요소와 단백질 암호화 서열을 함유하며, 이들 시스템이 효모 외래 유전자에 대해서도 또한 작용하는지는 확증되지 않았다.
최근 공고된 특허원(PCT 84/4757)은 효모 PGK 유전자의 UAS 요소를 기술하고 있다. 위치 -324와 -455(ATG로부터) 사이에 위치한 필수적인 프로모터 요소의 존재가 나타나 있다.
다른 프로모터 앞에 이 요소의 첨가는 다른 특정 효모 프로모터의 강도를 강화하는 것으로 주장된다. 그러나 이 주장을 실질화하는 실례가 없으며 이 논쟁은 전적으로 음성적 자료(프로모터의 파괴)에 의존하고 있다. 이 요소가 PGK 프로모터의 필수적인 부분일 수는 있으나, 그와같은 요소가 하이브리드 프로모터의 일부로서 작용할지는 의문이다. 게다가 PGK의 UAS는 조절 시그날과 결부되어 있지 않으며, 즉 특이한 생리학적 시그날에 의해 하부 암호화 서열의 발현(전사)을 조절할 수 없다.
당분해 유전자의 몇몇 프로모터는 글루코스의 존재하에 유도된다. 세포를 글루코스가 없는 배지에서 생장시킬 경우 그들을 강력하게 작동 중지(turn off)시킬 수 있다. 이것은 효모 숙주 세포를 형질전환하고, 세포에 아주 해롭거나 치사적인 생성물의 세포내로의 축적을 막기 위해 글루코스를 다른 탄소원(아세테이트, 글리세롤, 락테이트 등)으로 대치한 배지에서 재생하여야 하는 것을 의미한다. 원형질체[A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75, 1929(1978)] 또는 염처리한 전체 세포[Ito et al., J. Bacteriol, 153, 163(1983)]의 재생은 통상 세포의 신속한 재생 및 콜로니의 형성을 가능하게 하기 위해 증강(rich) 배지에서 수행하므로, 일반적으로 모든 형질전환 프로토콜(protocol)은 글루코스를 탄소원으로 사용한다. 글루코스가 없는 배지에서의 재생 및 회수는 매우 미약(비록 한다해도)한 것으로 예상된다.
세포가 다량의 외래 단백질에 가장 잘 견딜 수 있는 경우, 즉 성장 기간이 끝난 후 단백질을 고도로 생산하도록 발현시간을 조절해야 한다는 것이 당 분야의 일반적인 인식이다. 또한 발현 조절은 미생물의 생장에 가장 중요한 탄소원, 즉 글루코스의 존재 또는 부재에 의존하지 않는 것이 바람직하다. 효모에 의한 외래 유전자의 편리하고도 기술적으로 적용 가능한 발현시 이들 요구에 부합하는 조절적이고 강력한 프로모터 시스템은 당 분야에 거의 알려지지 않고 있다. 따라서 그와 같은 프로모터 시스템의 개발이 요구된다.
놀랍게도 억제 또는 탈억제가 필수 탄소원 또는 질소원과 같은 성장 배지 필수성분 존재 또는 부재에 의존하지 않는 조절성 프로모터의 상부 프로모터 요소와, 당분해 회로에 포함되고 현재 공지된 가장 강력한 프로모터에 속하는 것으로 통상 간주되는 효소 발현 조절용 프로모터의 TATA 박스 영역의 조합은 기술적으로 적용될 수 있는 프로모터 시스템상에 부여된 주요 요구에 부합하는 강력한 하이브리드 프로모터를 유도함이 발견되었다.
효모에서 외래 유전자의 효율적인 발현을 위해, 산 포스파타제 PH05 유전자의 UAS 조절하에 놓이게 되는 하이브리드 프로모터, 특히 당분해 유전자의 프로모터 사용이 본 발명의 목적이다.
효모 PH05 유전자의 새로 분리한 UAS 시그날, PH05 UAS 시그날을 포함하는 하이브리드 프로모터, 이러한 하이브리드 프로모터를 함유하는 하이브리드 벡터 및 이러한 하이브리드 벡터로 형질전환된 효모 숙주가 또한 본 발명의 목적이다.
또한 본 발명의 목적은 폴리펩타이드 제조를 위한 상기 UAS 시그날, 상기 하이브리드 프로모터, 상기 하이브리드 벡터 및 상기 형질전환된 효모 숙주의 제조방법, 및 상기 형질전환된 효모 숙주의 용도이다.
1. 효모 산 포스파타제(PH05) 유전자의 상부 활성 서열 및 하이브리드 프로모터
본 발명은 효모 PH05 유전자로부터 유도한 상부 활성 서열 및 하이브리드 프로모터 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명 이전에 효모 PH05 유전자의 전사를 변조(modulate)하는 상부 활성 부위(또는 서열, "UAS")하나 이상이 존재하는지의 여부는 알려져 있지 않았다. PH05 유전자는 억제성 효모 산 포스파타제를 암호화 한다. 고농도의 무기 인산염 존재시 억제되고 무기 인산염의 고갈시에는 탈억제 된다[B. Meyhack et al., EMBO-J. 1. 675(1982)].
PH05 유전자의 5' 영역 분석은 현재 PH05 유전자의 전사를 변조하는 시스-작용성 요소의 동정을 가능케한다. 파지 벡터 M13mp 9에 클론된 PH05 유전자 5' 영역의 623bp BamHⅠ-SalⅠ 단편(재조합 벡터 M13mp 0/PH05 Bam-Sal, 참조:유럽 특허원 제143,081호)을 Bam 부위로부터, 및 다른 실험에서는 Sal 부위로부터 시작해서 엑소뉴클레아제 Bal31로 분해한다.
따라서 일련의 단축된 PH05 프로모터 단편을 생성시키고 서열 분석을 하며, 단축된 말단에 합성 EcoRⅠ 링커를 제공한다. Sal 부위에서 단축된 단편["좌지(left arm) 프로모터 단편"]을 Bam 부위에서 단축된 단편["우지(right arm) 프로모터 단편"]과 조합해서, PH05 프로모터 영역의 결실 변이체 세트를 제조하고, PH05 구조 유전자의 발현 수행능력을 시험한다. 뉴클레오타이드 -225과 -263 사이의 결실은 산 인산염 활성을 5배 감소시키고, 뉴클레오타이드 -361과 -392 사이 또는 뉴클레오타이드 -346과 -369 사이의 결실은 산 포스파테이트 활성을 10배 감소시킨다(뉴클레오타이드의 번호는 첨부한 도면 제1도를 참조하라). 이러한 효과는 PH05 발현에 필수적인 상부 활성 부위(UAS)에 기인한다. 뉴클레오타이드 약 -365 근처의 UAS는 PH05 유전자 5' 영역의 268bp BamHⅠ-ClaⅠ단편(뉴클레오타이드 -274 내지 -541)에 함유되며 UAS 1(PH05)로 지정되고 반면에 뉴클레오타이드 약 -245 근처의 UAS 부위는 PH05 유전자 5' 영역의 100bp ClaⅠ-Bst EⅡ 단편(뉴클레오타이드 -174 내지 -273)에 함유되며 UAS 2(PH05)로 지정된다.
본 발명은 특히 PH05 유전자의 뉴클레오타이드 -174 및 -541 사이의 BamHⅠ-Bst EⅡ 단편에 함유된 상부 활성 서열 UAS 1(PH05) 및 UAS 2(PH05)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PH05 유전자의 뉴클레오타이드-274와 -541 사이 BamH1-ClaⅠ 단편에 함유된 상부 활성 서열 UAS 1(PH05) 및 PH05 유전자의 뉴클레오타이드 -174와 -273사이 ClaⅠ-Bst EⅡ단편에 함유된 상부 활성 서열 UAS 2(PH05)에 관한 것이다.
상부 활성 서열 UAS 1(PH05)이 특히 바람직하다. BamHⅠ-ClaⅠ 단편내 UAS 1 조절 시그날의 정확한 위치를 측정할 수 있다. 따라서 UAS 1 조절 시그날은 31bp DNA 단편(PH05 프로모터 영역의 위치-381 내지 -351)에 함유된다. 바람직하게는 단편의 양쪽에 적합한 제한 부위를 함유하는 평활 말단 링커 또는 EcoRⅠ과 같은 제한 엔도뉴클레아제에 특이한 점성 말단을 제공한다. 31bp 단편은 하기 서열을 갖는다.
GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
UAS 1(PH05) 및/또는 UAS 2(PH05) 서열을 함유하는 DNA 단편의 제조방법은 PH05 유전자를 함유하는 DNA, PH05 유전자 또는 그의 5' 종결부를 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 목적하는 단편을 분리함을 포함한다. 예를 들면 PH05 프로모터 및 PH05 암호화 영역 일부를 포함하는 PH05의 623bp BamHⅠ-SalⅠ 단편(상기)을 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 Bst EII2로 분해하고, 생성된 두 상부 활성 부위를 함유하는 368bp 아단편(subfragment)을 분리한다. 유사한 방식으로 상기 BamHⅠ-SalⅠ 단편을 BamHⅠ 및 ClaⅠ 또는 Cla Ⅰ 및 Bst EⅡ로 절단하여 각각 UAS 1(PH05)을 함유하는 268bp BamHⅠ-ClaⅠ 아단편 및 UAS 2(PH05)를 함유하는 100bp Cla Ⅰ-Bst EⅡ 아단편을 산출한다. 단편 및 아단편의 분리와 정제는 통상적인 방법, 즉 아가로스 겔 전기영동 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동에 의해 수행한다.
본 발명에 따른 상부 활성 부위를 함유하는 DNA 단편은 그 자체가 공지된 방법, 즉 Bal 31과 같은 엑소뉴클레아제로 부분적 분해하여 단축할 수 있으며, 이런 방식으로 단축된 단편에서의 UAS 기능은 보유된다. 단축은 단편의 5' 말단 또는 3' 말단에서 또는 양쪽에서 수행할 수 있다. 보유된 UAS 기능을 갖는 이들 아단편의 선별은 상기와 같이, UAS(들)를 함유하는 본래의 서열을 단축된 단편으로 대치하고, 생성된 PH05 프로모터 결실 변이체를 PH05 구조 유전자를 발현시킬 수 있는 능력에 대해 시험하므로써 수행한다. 본 발명에 따라 PH05 유전자의 하나 또는 두 상부 활성 부위를 함유하는 단편 및 단축된 그의 유도체는 양쪽 말단에 합성 링커 서열을 부착하여 하이브리드 프로모터의 작제 및 벡터로의 부착을 용이하게 할 수 있다.
PH05의 상부 활성 부위(들)를 함유하는 DNA 단편 뿐만 아니라 그의 단축된 유도체는 또한 당 분야에 숙지된 통상적인 기술을 사용한 화학적 DNA 합성에 의해 제조할 수 있다. 적절한 기술이 문헌[S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3(1983)]에 기재되어 있다. 특히 유럽 특허원 제146,785호에 기술된 방법을 사용할 수 있으며 여기에서 참조로 수록하였다.
본 발명의 다른 면은 하이브리드 프로모터 및 PH05 유전자의 상부 활성 부위를 함유하는 하이브리드 프로모터 제조를 위한 PH05 유전자 상부 활성 부위의 용도이다.
본 발명은 특히 효모 PH05 유전자의 상부 활성 부위(들)를 포함하는 5' 상부 프로모터 요소 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하고 해독 개시 코돈 가까이서 종결하는 효모 PH05 유전자 이외에 효모 유전자의 3'하부 프로모터 요소로 이루어진 효모 하이브리드 프로모터에 관한 것이다.
5' 상부 프로모터 요소는 특히 상술한 특성의 DNA 단편중 하나, 특별하게는 UAS 1(PH05) 및 UAS 2(PH05)를 함유하는 368bp BamHⅠ-Bst EⅡ 단편, 또는 UAS 1(PH05)을 함유하는 268bp BamHⅠ-ClaⅠ단편, 또는 UAS 1(PH05)을 함유하는 31bp 단편 또는 더 작은 그의 아단편과 같이 UAS 작용이 보유된 그의 단축된 유도체이다.
3' 하부 프로모터 요소는 바람직하게는 고도로 발현되는 효모 유전자의 프로모터, 특히 당분해 효소를 암호화하는 효모 유전자의 프로모터, 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 3-포스포글리세레이트키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제(PyK), 트리오스-포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코스 아이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터로부터 유도된다. 3' 프로모터 요소는 정확한 전자 개시 및 정확한 전사 출발점(주요 mRNA 출발점)을 위해 효소 RNA 폴리머라제 Ⅱ를 위치시키는 것과 관련된 TATA 박스를 포함한다. TATA 박스의 하부에서 3' 프로모터 요소는 주요 mRNA 개시 및 해독 개시 코돈(ATG) 사이의 영역까지, 바람직하게는 해독 개시 코돈 부근까지 뻗어있다. TATA 박스의 상부에서 3' 프로모터 요소는 약 50 내지 150개 본래의 염기쌍을 포함한다. 이 상부 DNA 서열의 정확한 길이는 UAS들 및 TATA 박스 사이의 공간이 다소 융통적이기 때문에 결정적이지 못하다.
본 발명의 바람직한 3' 프로모터 요소는 당 분야에 가장 강력한 효소 프로모터 중의 하나로 알려져 있는 GAPDH 프로모터로부터 유도한다. 효소 GAPDH는 에스. 세레비지에 건조중량의 약 5%에 이른다[참조:E. G. Krebs, J. Biol, Chem. 200, 471(1953)]. 바람직하게는 3' GAPDH 프로모터 요소가 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -300 내지 -180에서 개시하고 뉴클레오타이드 -1에서 종결한다. 본 발명의 바람직한 태양에서 3' 프로모터 요소는 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -199 내지 -1을 포함한다. 본 발명의 또 다른 태양에서 3' 프로모터 요소는 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -263 내지 -1을 포함한다.
본 발명의 하이브리드 프로모터는 UAS 1'(PH05)와 같이 동일형의 단일 UAS(PH05) 또는 다수 UAS(PH05)를, 바람직하게는 헤드 투 테일(head to tail) 배향으로 배열해서 함유한다. 3' 프로모터 요소에 관해서는 UAS(들)가 순수한 PH05 프로모터의 배향과 비교해서 동일 또는 역배향을 갖는다.
본 발명에 따른 하이브리드 프로모터의 성분, 즉 PH05의 UAS(들)를 함유하는 프로모터 요소 및 TATA 박스를 함유하는 프로모터 요소는 합성 링커를 통한 평활 말단 결합으로, 경우에 따라 천연적으로 발생하는 친화성 제한부위를 통해 연결한다. 본 발명에 따른 하이브리드 프로모터의 5' 및 3' 말단은 벡터 DNA에의 연결 및 3' 말단에 이종 단백질 암호화 영역을 부착시킬 수 있는 합성 링커를 적당하게 제공한다.
본 발명에 따른 하이브리드 프로모터는 생물공학에 유용한 프로모터 상에 부여된 모든 요구에 부합한다. 그들은 강력하고, 성장 배지의 필수 탄소원 또는 질소원과는 상이한 물질에 의해 유도될 수 있으며, 실험실 및 산업 규모로 손쉽게 조작된다.
본 발명은 또한 효모 PH05 유전자의 상부 활성 부위(들)를 포함하는 5' 상부 프로모터 요소를 작용성 TATA 박스를 포함하고 전자 개시 코돈에 근접하여 종결되는 PH05 유전자 이외의 효모유전자 3' 하부 프로모터 요소에 연결시킴을 특징으로 하여, 효모 PH05 유전자의 상부 활성 부위(들)을 포함하는 5' 상부 프로모터 요소 및 작용성 TATA 박스를 포함하고 전자 개시 코돈에 근접하여 종결되는 전사 개시 부위를 포함하는 효모 PH05 유전자 이외의 효모 유전자 3' 하부 프로모터 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양에서 프로모터 요소의 연결은 합성 링커를 통하여 수행한다.
PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 상기 하부 프로모터 요소는 주요 mRNA 개시 및 해독 개시 코돈 사이에 있는 영역까지 뻗은 강력한 효모 프로모터의 5' 말단을 예를 들면 엑소뉴클레아제, 즉 Bal 31로 부분분해하고, 생성된 5' 평활 말단을 합성 링커 DNA에 연결하고 제조한다. 전사 개시 부위(들) 및 서열 5'의 약 50 내지 150 염기쌍을 함유하는 TATA 박스를 보유하는 프로모터 요소를 선별한다. 예를 들면 생성된 프로모터 요소를, 프로모터 요소의 5' 말단에서 합성 링커 서열을 인지하는 제한 엔도뉴클레아제 및 3' 말단에서 합성 링커를 인지하는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 생성된 DNA 단편의 길이를 아가로스 겔 전기영동에 의해 측정하므로써 선별한다. 3' 프로모터 요소는 또한 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적 합성으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 하이브리드 프로모터는 효모에서 포유동물 유전자의 강화되고 조절된 발현을 위해 사용할 수 있다.
2. 하이브리드 프로모터의 조절하의 이종 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 함유한 하이브리드 벡터
본 발명은 또한 PH05 유전자의 UAS(들)가 있는 5'상부 프로모터 요소 및 작용성 TATA 박스를 포함한 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 효모 하이브리드 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 하이브리드 플라스미드 및 선형 DNA 벡터로 구성되는 그룹으로부터 선택한다.
효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편은 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하여 광범위한 폴리펩타이드, 특히 영양물질 생산 및 화학의 효소 반응 수행시 사용할 수 있는 효소, 또는 사람 및 동물질환 치료시 또는 예방시 유용하고 가치있는 비-효소성 폴리펩타이드, 예를 들면 호르몬, 면역조절성 폴리펩타이드, 항-바이러스 및 항-종양 특성 물질, 항체, 바이러스 항원, 백신, 응혈인자, 식품 및 유사물질과 같은 고등 진핵생물, 특히 포유동물, 예를 들면 동물 또는 사람 기원의 폴리펩타이드이다.
그런 폴리펩타이드의 실례는 인슐린, 성장인자, 예를 들면, 표피성 인슐린형, 마스트 세포(mast cell), 신경 또는 전환 성장인자, 성장 호르몬, 예를 들면 사람 또는 소의 성장 호르몬 인터루킨, 예를 들면 인터루킨-1 또는 -2 사람 대식세포 이동 억제 인자(MIF), 인터페론, 예를 들면 인터페론-αA,αB,αD 또는 αF와 같은 사람 α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 예를 들면 αA-αD- 또는 αB-αD-하이브리드 인터페론, 간염 바이러스 항원, 예를 들면 B형 간염 바이러스 표면 또는 핵 항원 또는 A형 간염 바이러스 항원, 플라스미노겐 활성자, 예를 들면 조직 플라스미노겐 활성자 또는 우로키나제, 종양 괴사 인자, 소마토스타틴, 레닌, β-엔도르핀, 면역 글로블린, 예를 들면 면역 글로블린 D,E 또는 G의 경쇄 및/또는 중쇄, 면역 글로블린 결합인자, 예를 들면 면역 글로블린 E 결합인자, 칼시토닌, 사람 칼시토닌-관련 펩타이드, 혈액 응혈인자, 예를 들면 인자 Ⅸ 또는 Ⅷc, 에글린, 예를 들면 에글린 C, 데설파토히루딘(desulphatohirudin), 예를 들면 데설파토히루딘 변이체 HV 1, HV 2 또는 PA 또는 사람의 수퍼옥사이드 디스뮤타제 등이다. 바람직한 유전자는 사람 α-인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 사람 조직 플라스미노겐 활성자(t-PA), B형 간염 바이러스 표면 항원(HBVsAg), 인슐린형 성장인자 I, 에글린 C 및 데설파토히루딘 변이체 HV 1 등이다.
하이브리드 프로모터가 상기 명시된 것중 하나이다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 특히, 하이브리드 프로모터 및 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편으로 이루어진 하나 또는 다수 DNA 삽입물을 함유할 수 있다. 하이브리드 벡터가 다수 DNA 삽입물 바람직하게는 2 내지 4개 DNA 삽입물을 함유하는 경우, 이들은 직렬배열로 또는 하이브리드 벡터의 상이한 위치에 존재할 수 있다. 바람직한 하이브리드 벡터는 직렬로 하나의 DNA 삽입물 또는 DNA 삽입물들을 함유한다.
본 발명의 하이브리드 벡터에서, 효모 하이브리드 프로모터는 폴리펩타이드 암호화 영역에 작동적으로 연결되어 폴리펩타이드가 효율적으로 발현되도록 한다. 본 발명의 바람직한 태양중 하나는, 효모 하이브리드 프로모터를 접합부에 삽입된 전사 개시 시그날(ATG)가 함께 완전 폴리펩타이드의 암호화 영역에 직접 연결시킨다. 효모 하이브리드 프로모터를 폴리펩타이드 암호화 영역에 결합시키기에 바람직한 영역은 내인성 ATG에 바로 인접한 영역이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서, 시그날 서열은 작제물에 포함되어 있다. 적합한 시그날 서열은 예를 들면 PH05 시그날 서열, 효모 인버타제 유전자의 시그날 서열, 또는 α-인자 프리-프로 서열, 및 발현시킬 폴리펩타이드 암호화 영역에 천연적으로 연결된 시그날 서열이다. 또한 융합된 시그날 서열을 작제할 수 있다. 시그날 서열과 완전 폴리펩타이드 서열 사이에 정확한 절단을 허용하는 그런 조합이 바람직하다. 특이한 프로세싱(processing) 시그날을 운반하거나 또는 운반할 수 없는 전(pro-) 또는 공간(spacer-) 서열과 같은 추가의 서열이 또한 작제물에 포함되어 전구물질 분자의 정확한 프로세싱을 용이하게 할 수 있다. 또한 생체내 또는 시험관내에서 적합한 성숙을 허용하는 내부 프로세싱 시그날을 함유하는 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 바람직하게는 프로세싱 시그날은 Lys-Arg 잔기를 함유하고, 이는 분비경로에 위치한 효모 엔도펩티다제에 의해 인지된다.
유전자의 발현시, 유전자 생성물은 분비 경로에 들어가며, 외질 공간으로 이동한다. 세포벽을 통한 배양배지로의 배출이 달성될 경우, 수율면에서 상당한 증가가 가능하다. 역시 회수 공정도 세포의 파괴없이 단순화할 수 있다. 게다가 성숙한 암호화 서열 앞에 해독 개시 시그날로서 ATG가 필요없기 때문에, N-말단에 부가적인 메티오닌 없이 폴리펩타이드를 회수할 수 있다. 글리코실화는 분비 경로와 결부되어 있으므로, 생성된 폴리펩타이드는 글리코실화된 것으로 예상된다(단, 글리코실화 부위가 존재한다는 전제하에), 글리코실화 폴리펩타이드는 비글리코실화 폴리펩타이드 보다 유리한 몇가지 특성이 있다:글리코실화 폴리펩타이드 비글리코실화된 폴리펩타이드보다 포유동물 세포로부터의 순수한 폴리펩타이드에 더 유사하다. 더불어 그런 단백질의 3차 구조는 아마도 글리코실 잔기의 존재에 어느 정도 의존하고 있다. 이들 분자에 존재하는 탄수화물 잔기는 화학적 안정성 및 약리학적 활성에 양호한 영향을 주는 것으로 예상된다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 바람직하게는 전사 종결 및 폴리아데닐화를 위한 적절한 시그날을 함유하는 효모 유전자의 3' 측면 서열을 포함한다. 바람직한 3' 측면 서열은 효모 PH05 유전자의 것이다.
본 발명은 특히 효모 PH05 유전자의 UAS(들)가 있는 5' 상부 프로모터 요소 및 작용성 TATA 박스를 포함한 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 이외의 효모 유전자의 3'하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터로 필수적으로 이루어진 선형 DNA 분자에 관한 것으로, DNA 절편은 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 하이브리드 프로모터에 의해 조절되며, 적절히 자리잡은 효모 PH05 유전자의 전사 종결 시그날을 함유한다.
동종 3' 및 5' 측면 서열을 통해서, 폴리펩타이드 암호화 영역을 포함하는 전체 선형 DNA 벡터를 효모 염색체의 PH05 좌위에 안정하게 통합시킨다.
본 발명은 특히 하이브리드 프로모터와 달리, 폴리펩타이드 암호화 영역 및 3' 측면 서열이 프로모터의 작용상, 즉 폴리펩타이드 암호화 영역의 발현시 불필요하거나 덜 중요한, 그러나 예를 들면 상기 하이브리드 벡터로 형질전환한 효모 세포의 증식시 중요한 작용을 하는 부가적인 DNA 서열(들)을 함유하는 환상 하이브리드 플라스미드에 관한 것이다. 부가적인 DNA 서열(들)은 원핵 및/또는 진핵 세포로부터 유도하며, 염색체 및/또는 염색체외(extra-chromosomal) DNA서열이다. 예를 들면 부가적인 DNA 서열은 세균 또는 진핵 플라스미드 DNA와 같은 플라스미드 DNA, 세균, 효모 또는 고등진핵 염색체 DNA와 같은 바이러스 DNA 및/또는 염색체 DNA로부터(또는 이것으로 구성된) 유도한다. 바람직한 하이브리드 플라스미드는 세균 플라스미드, 특히 에쉐리시아 클라이 플라스미드 pBR 322 또는 관련된 플라스미드, 박테리오파지 λ, 효모 2μ 플라스미드, 및/또는 효모 염색체 DNA로부터 유도한 부가적 DNA 서열을 함유한다.
특히 부가적인 DNA 서열은 효모 복제원 및 효모에 대한 선별적 유전자 마커(marker)를 함유한다. 효모 복제원을 함유하는 하이브리드 플라스미드, 예를 들면 염색체성 자가 복제 절편(ars)은 형질전환 후 효모 세포내에 염색체 외적으로 유지되고, 유사분열에 따라 자가 복제된다. 효모 2μ 플라스미드 DNA에 동종인 서열을 함유하는 하이브리드 플라스미드를 또한 사용할 수 있다. 이들 하이브리드 플라스미드는 세포내에 이미 존재하는 2μ 플라스미드에 재조합에 의해 통합되거나 또는 자가 복제된다. 2μ 서열은 특히 고빈도의 형질전환 플라스미드에 적합하며 높은 복제수(copy numbers)를 나타낸다.
효모에 대한 선별적 유전자 마커로서, 마커의 표현형 발현으로 인해 형질전환체의 선별을 용이하게 하는 마커 유전자를 사용할 수 있다. 효모에 적합한 마커는 특히 항생물질 내성을 발현하는 것들, 또는 영양 요구성 효모 변이체의 경우 숙주 결손을 보충시키는 유전자이다. 상응하는 유전자는 예를 들면 항생물질 사이 클로헥시마이드에 내성을 부여하거나 또는 영양 요구성 변이체, 예를 들면, URA3, LEU 2, HIS 3 또는 TRP1 유전자에서 프로토트로피(prototrophy)를 제공한다. 형질전환할 숙주가 마커에 의해 발현되는 생성물에 대해 영양 요구성인 경우, 자가 복제 절편과 결합된 구조 유전자를 마커로 사용하는 것이 또한 가능하다.
유리하게는 본 발명에 따라 하이브리드 플라스미드에 존재하는 부가적인 DNA 서열이 복제원 및 세균숙주, 특히 에쉐리시아 콜라이에 대해 선택적인 유전자 마커를 포함한다. 효모 하이브리드 벡터에 이.콜라이 복제원 및 이.콜라이 마커가 존재함에 따른 유용한 특성은 다음과 같다:첫번째, 다량의 하이브리드 벡터 DNA를 이.콜라이에서의 성장 및 증폭에 의해 수득할 수 있고, 두번째, 이.콜라이에 기본한 전체 콜로닝기술의 목록을 사용하여 이.콜라이에서 하이브리드 벡터의 작제를 편리하게 수행한다. pBR 322등과 같은 이. 콜라이 플라스미드는 이.콜라이 복제원 및 테트라사이클린 및 암피실린과 같은 항생물질에 대한 내성을 부여하는 이.콜라이 유전자 마커를 함유하고, 효모 하이브리드 벡터의 일부로서 유리하게 사용된다.
예를 들면 효모 및 세균 숙주(상기 참조)의 복제원 및 유전자 마커를 함유하는 부가적인 DNA 서열은 이후 효모 프로모터 및 폴리펩타이드 암호화 영역과 함께 본 발명에 따라 하이브리드 플라스미드를 형성하는 "벡터 DNA"로 지칭된다.
바람직한 태양에서, 본 발명은 효모 하이브리드 프로모터 및 이종 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진 효모 숙주 균주에서 복제 및 표현형적 선별을 할 수 있는 하이브리드 플라스미드에 관한 것으로, 상기 DNA 서열은 상기 하이브리드 프로모터의 조절하에 상기 하이브리드 플라스미드에서 전사 개시 및 종결 시그날 및 해독 개시 및 정지 신호와 함께 위치하여 형질전환된 효모 균주에서 상기 폴리펩타이드를 생산 발현시킨다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들면 효모 PH05 유전자의 UAS(들)가 있는 5' 상부 프로모터 요소 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 이외의 효모 유전자의3' 하부 프로모터로 이루어진 하이브리드 프로모터를 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편 및 효모 유전자의 3' 측면 서열에 연결하여 상기 DNA 절편이 상기 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있게 하고, 제조한 하나 또는 그 이상의 선형 DNA를 임의로 벡터 DNA에 결합시킴으로써 제조한다.
용이하게 지도화한 선형 또는, 바람직하게는 환상 벡터 DNA, 예를 들면 제한 부위 하나 이상, 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 제한 부위를 갖는 세균성 플라스미드 DNA 또는 유사물(상기 참조)을 사용한다. 유리하게는 벡터 DNA가 이미 효모 및/또는 세균 숙주의 복제원 및 유전자 마커를 함유한다. 벡터 DNA는 적당한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단한다. 제한된 DNA를 효모 하이브리드 프로모터를 함유하는 선형 DNA 단편 및 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편에 연결시킨다. 하이브리드 프로모터 및 폴리펩타이드 암호화 영역의 연결 전 또는 후에(또는 동시에), 효모 또는 세균 숙주에 대한 복제원 및/또는 마커를 도입하는 것도 가능하다. 결국 제한 및 어닐링(annealing) 조건은 벡터 DNA 및 하이브리드 프로모터의 필수적인 작용에 방해가 없는 방식으로 선택해야 한다. 하이브리드 벡터는 연속적으로 또는 모든 해당 서열을 함유하는 두 DNA 절편을 연결시킴으로써 구성한다.
시험관내 DNA 절편 결합시 여러가지 기술을 사용할 수 있다. 특정 제한엔도뉴클레아제에 의해 생성된 평활 말단(완전하게 염기쌍을 이룬 DNA 이본쇄)은 T4DNA 리가제에 의해 직접 연결된다. 더 통상적으로는 DNA 절편을 그들의 일본쇄 점성말단을 통해 연결하고 DNA 리가제, 예를 들면 T4DNA 리가제로 공유적으로 결합한다. 이러한 일본쇄 "점성 말단"은 서로 엇갈리는(staggered)말단을 생성하는 다른 부류의 엔도뉴클레아제로 DNA를 절단하여 형성한다(DNA 이본체의 두 본쇄는 약간의 뉴클레오타이드가 떨어진 상이한 위치에서 절단된다). 단일 본쇄는 또한 평활말단 또는 점성 말단에 말단 트랜스퍼라제["호모폴리머릭 테일링(homopolymeric tailing)"]를 사용하여 뉴클레오타이드를 첨가하거나, 또는 단순히 평활말단 DNA 절편의 한 본쇄를 λ-엑소뉴클레아제와 같이 적합한 엑소뉴클레아제로 분해시킴으로써 형성할 수 있다. 점성말단을 제조하는 바람직한 접근방법은 점성말단 형성 엔도뉴클레아제의 인지부위를 함유하는 화학적 합성 링커 DNA를 평활말단 DNA 절편에 연결시키고, 생성된 DNA를 해당 엔도뉴클레아제로 분해하는 것이다.
효율적으로 발현시키기 위해 유전자는 전사(효모 하이브리드 프로모터) 및 해독 기능을 갖는 서열에 대해 적절하게 위치시켜야 한다. 첫번째 하이브리드 프로모터를 함유하는 DNA 절편의 폴리펩타이드 암호화 영역과의 결합은 적합한 배향으로 수행한다. 두배향이 가능할 경우 통상적인 제한 분석으로 옳은 것을 판정한다. 부정확하게 배향된 폴리펩타이드 유전자 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터는 유전자 삽입물을 적합한 제한효소로 절단하고 유전자를 하이브리드 벡터 단편과 재결합시켜 재배향한다. 어느 경우라도 부적절한 배향은 두 DNA 절편을 그들의 말단에 각각 다른 제한 부위를 연결시킴으로써 회피한다. 또한 하이브리드 벡터의 작제는 올바른 전사 개시 및 종결을 가능하케하는 방식으로 수행해야 한다. 후자의 지적에서와 같이, 전사물은 바람직하게는 효모 염색체 DNA 또는 효모 2μ 플라스미드로부터 유도된 DNA 서열에서 끝나야 한다. 유리하게는 전사가 효모 유전자, 예를들면 PH05 또는 TRP 1의 전사 종결 시그날을 함유하는 DNA 서열에서 종결한다. 두번째로 적절한 판독 프레임(reading frame)을 확립하여야 한다. 보통 프로모터 부위 및 폴리펩타이드 암호화 영역의 뉴클레오타이드 서열은 연결전에 알고 있거나 쉽게 확인할 수 있어 올바른 판독 프레임을 확립하는데 문제가 없다.
성숙한 폴리펩타이드의 직접 발현이 바람직한 경우, 하이브리드 프로모터 영역에 임의로 뒤따르고/거나 완전 폴리펩타이드 암호화 영역에 임의로 선행하는 시그날 서열 또는 그의 일부를, 예를 들면 Bal 31과 같은 엑소뉴클레아제로 분해하여 제거한다. 효모 프로모터를 폴리펩타이드 암호화 서열에 직접 연결시키기 위해 바람직한 영역은 주요 mRNA 개시 및 ATG 해독 개시 코돈사이이다. 이 영역에의 접합시 폴리펩타이드 암호화 서열은 전사 개시를 위한 그 자신의 ATG를 가져야 하거나, 또는 부가적인 합성 올리고뉴클레오타이드가 제공되어야 한다. 효모 하이브리드 프로모터는 연결분자로서 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 폴리펩타이드 암호화 서열에 연결될 수도 있다. 따라서 경우에 따라 하이브리드 프로모터 영역은 그의 3'-말단가까이 제한되어 예정한 염기쌍 수가 결핍될 수 있다. 마찬가지로 폴리펩타이드 암호화 서열은 그의 5'-말단가까이에서 제한될 수 있다. 합성 올리고데옥시 뉴클레오타이드는 그런 식으로 작제되고, 연결 올리고 뉴클레오타이드를 통해 효모 하이브리드 프로모터 및 폴리펩타이드 암호화 서열을 결합하는 경우, 결손 염기쌍은 ATG 전사 개시 시그날을 포함하여 재저장되며, 폴리펩타이드 암호화 서열은 프로모터에 대하여 적절한 판독 프레임내에 있게 된다.
목적 하이브리드 벡터를 함유하는 연결혼합물은 직접 형질전환 단계에서 사용하거나, 우선 하이브리드 벡터를 예를들면 겔 전기영동으로 증강시킨 다음 형질전환시 사용한다.
하나 또는 그 이상 필수적기능이 결핍된 벡터와 같은 중간 생성물, 및 본 발명에 따른 최종 하이브리드 벡터는 상기 이유로 인해(예를들면 각각 중간 생성물 및 하이브리드 플라스미드 대량 생산) 세균 숙주, 특히 이.콜라이에 임의로 형질전환시킨다. 세균성 복제원 및 유전자 마커(들)를 함유하는 이.콜라이 플라스미드 pBR 322와 같은 세균 벡터 및 그의 단편이 이런 목적을 위해 가장 바람직한 벡터이다. 그런 세균 벡터를 사용하는 경우 효모 하이브리드 벡터 제조의 최종 단계를 바람직하게는 효모용 유전자 마커 및 복제원의 도입을 포함한다.
3. 폴리펩타이드 암호화 서열을 함유하는 하이브리드 벡터에 의해 효모의 형질전환
본 발명의 다른 면은 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5'상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위로 이루어진, PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3'하부 프로모터 요소로 각각 구성된 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터로 효모 세포를 형질전환시킴을 특징으로 하여, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 형질전환된 효모 세포의 제조방법을 포함한다.
유용한 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 토룰롭시스(Torulopsis)속 및 관련속(참조:J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971)의 종, 특히 사카로마이세스 세레비지에의 균주이다.
효모를 하이브리드 벡터로 형질전환하는 것은 당 분야에 공지된 방법, 예를들면 힌넨 등이 기술한 방법에 따라 수행한다[Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]. 이 방법은 3단계로 나눌 수 있다:
(1) 효모 세포벽 또는 그의 일부를 제거.
(2) "벗겨진(naked)" 효모 세포(스페로플라스트)를 PEG(폴리에틸렌글리콜) 및 Ca2+이온의 존재하에 형질전환 DNA로 처리.
(3) 세포벽의 재생 및 한천의 고체층에서 형질전환된 세포의 선별.
바람직한 방법:
(1)에 따라:삼투압적으로 안정화된 용액(예:1M 소르비톨)중의 달팽이 소화관 쥬스[예:글루술라제
Figure kpo00001
(Glusulase
Figure kpo00002
) 또는 헬라카제
Figure kpo00003
(Helicase
Figure kpo00004
)와 같은 여러가지 글루코시다제의 제제, 또는 미생물로부터 수득한 효소 혼합물(예:자이몰라제(Zymolase
Figure kpo00005
))을 사용하여 효모 세포벽을 효소학적으로 제거한다.
(2)에 따라:PEG의 존재하에 효모 스페로플라스트 응집 및 세포막의 부분적 융합을 유도한다. "융합형" 조건의 생성이 결정적이며, 형질전환된 많은 효모 세포가 형질전환 공정도중 이배체 또는 심지어는 삼배체가 된다. 융합된 스페로플라스트를 선별할 수 있는 방법을 사용하여 형질 전환체를 증강시킬 수 있는데, 즉 형질전환된 세포는 예비 선택적 융합 생성물로 용이하게 선별할 수 있다.
(3)에 따라:세포벽이 없는 효모 세포는 분열하지 않기 때문에 세포벽을 재새하여야 한다. 이 재생은 스페로플라스트를 한천에 넣어 용이하게 수행한다. 예를들면 용융 한천(약 50℃)을 스페로플라스트와 혼합한다. 용액을 효모 성장 온도(약 30℃)로 냉각함에 따라 고체층이 수득된다. 이 한천은 신속한 확산 및 스페로플라스트로부터 필수 대형분자의 상실을 방지하고, 그에 의해 세포벽의 재생을 용이하게 한다. 그러나 세포벽의 재생은(비록 낮은 효율이지만) 수행된 한천의 표면상에 스페로플라스트를 위치시켜 수득할 수도 있다.
바람직하게는 재생 한천은 형질전환딘 세포의 재생 및 선별을 동시에 가능케하는 방식으로 제조한다. 아미노산 생합성 경로의 효소를 암호화하는 효모-유전자를 통상 선별마커로 사용하기 때문에 (상기), 재생은 바람직하게는 효모 최소 배지 한천에서 수행한다. 재생의 고효율이 요구되는 경우 다음의 두 단계 방법이 유리하다:(1) 증강 복합 배지에서 세포벽의 재생, 및(2) 선별 한천 평판상에 레플리카도말함으로써 형질전환된 세포의 선별.
하이브리드 벡터가 어떠한 마커 유전자도 함유하지 않는 경우, 형질전환된 세포 또한 다른 방법으로 동정할 수 있다. 그런 방법은 예를들면 하이브리드 벡터의 서열에 동종인 표지된 DNA 단편과의 동일계 하이브리드화[예:상기의 Hinnen 등에 따라], 도입된 유전자의 생성물에 대한 항체가 유용한 경우 동일계 면역검정법, 또는 형질전환 플라스미드(들)에 의해 암호화된 유전자 생성물을 측정하는 기타 선별법등을 포함한다.
또한 효모를 본 발명에 따른 하이브리드 벡터 및 효모의 유전적 마커를 함유하는 2차 마커로 공동-형질전환(Co-tranform)시킬 수 있다. 두개의 상이한 벡터가 공동의 DNA 서열을 갖는 경우 (이들은 벡터에 존재하는 세균성 서열일 수 있다), 재조합은 융합된 선별성 하이브리드 분자를 유도하며 발생한다.
효모는 또한 효모 하이브리드 프로모터, 상기 하이브리드 프로모터에 의해 조절되는 이종 폴리펩타이드 암호화 영역 및 효모 PH05 유전자의 전사 종결 시그날로 이루어진 선형 DNA 벡터 및 효모에 대한 선별성, 마커를 함유하는 벡터로 공동 형질전환시킬 수 있다. 공동 형질전환은 직접 선별할 수 없는 DNA를 취한 효모 세포를 증강시킬 수 있다. 캄피턴트(competent)세포는 특정 형태의 DNA를 취하고 있기 때문에 선별성 벡터로 형질전환시킨 높은 %의 세포가 특정의 부가적 DNA(상기의 선형 DNA와 같은)를 또한 축적할 것이다. 충분히 긴 동종 서열(예:길이 약 20 내지 100데옥시뉴클레오타이드)로 인해 폴립펩타이드 유전자는 숙주 염색체에 안정하게 통합된다. 본 발명의 특수한 작제물은 PH05 유전자의 염색체 부위, 즉 효모 염색체 Ⅱ에 이종 유전자의 안정한 통합을 유도한다.
본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드를 함유하는 수득된 효모 균주는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 돌연변이 및 선별에 의해 이종 폴리펩타이드의 생산을 증진시킬 수 있다. 예를들면 U.V. 조사 및 적합한 화학 시약에 의한 돌연변이를 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터로의 형질전환 및 탄소원으로서 글루코스를 함유하는 증강 배지에서의 세포벽 재생은 용이하게 수행할 수 있으며, 강력하게 치사적인 유전자 생성물이 세포내에 축적되는 것을 방지하기 위해 글루코스가 없는 배지에서 수행해야 하는, 글루코스에 의해 유도되는 종래의 프로모터를 함유하는 하이브리드 벡터로 수행되는 상응하는 단계보다 상당히 용이함이 발견되었다.
본 발명은 또한 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사개시 부위로 이루어진, PH05 유전자 이외의 효모 유전자 3' 하부 프로모터로 구성된 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편으로 각각 이루어진 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 효모 숙주 및 그의 변이체에 관한 것이다.
4. 형질전환된 효모 세포의 배양 및 발현된 폴리펩타이드의 분리
본 발명은 또한 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자 3' 하부 프로모터로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편으로 각각 이루어진 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 효모 숙주, 또는 그의 변이체를 배양하고 발현된 폴리펩타이드를 분리시킴을 특징으로 하는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 형질전환된 효모 세포는 탄소, 질소, 무기염, 및 경우에 따라 성장 촉진 물질의 동화원을 함유하는 액체 배지에서 당 분야에 공지된 방법으로 배양한다.
여러가지 탄소원이 유용하다. 바람직한 탄소원의 실례는 글루코스, 말토스, 만니톨 또는 락토스와 같은 동화성 탄소화물, 나트륨 아세테이트와 같은 아세테이트이며 단독 또는 적합한 혼합물로 사용할 수 있다. 적합한 질소원은 예를 들면 카사미노산과 같은 아미노산, 펩타이드 및 단백질과 트립톤, 펩톤, 또는 고기 추출물과 같은 그들의 분해산물, 또한 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 염화암모늄, 황산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 암모늄염이며, 단독 또는 적합한 혼합물로 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 무기염은 예를들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 염산염, 인산염 및 탄산염 등을 포함한다. 게다가 영양배지는 또한 성장 촉진 물질을 함유할 수도 있다. 성장 촉진 물질은 예를들면 성장 촉진제, 철, 아염, 망간 등의 미량 원소, 또는 개개의 아미노산이다.
본 발명에 따른 하이브리드 프로모터는 조절되기 때문에, 영양 배지의 조성은 성장 단계에 따라 적응되어야 한다. 성장 기간도중 고 인산염 농도하에서 본 발명에 따른 하이브리드 프로모터는 실질적으로 작동하지 않는다. 예를들면 PH05의 UAS가 있는 PH05의 5' 상부 프로모터 요소 및 TATA 박스가 있는 3' 하부 프로모터 요소를 함유하는 본 발명의 가장 바람직한 하이브리드 프로모터는 이런 조건하에 약 5배나 내려간다. 그러므로 아주 독성적인 유전자 생성물은 매우 낮은 비율로 합성하여 세포 대사에 대한 해로운 효과를 최소로 한다. 충분한 세포 밀도에 달했을때 영양 배지상의 무기 인산염 수준을 바람직하게는 감소시킨다(낮은 Pi 배지). 그에 따라 본 발명의 하이브리드 프로모터는 작동을 개시하고(탈억제) mRNA 전사물의 최대수준이 수득된다.
배양은 종래의 기술을 사용하여 수행한다. 온도, 배지의 pH 및 발효시간과 같은 배양조건을 목적하는 폴리펩타이드의 최대량이 수득되는 방식으로 선택한다. 일반적으로 약 25°내지 35℃의 온도, 4 내지 8의 pH값, 예를들면 약 pH7에서 약 4 내지 20시간 동안, 바람직하게는 목적 단백질이 최대 수율에 달할 때까지 진탕 또는 교반하면서 심부 배양으로 호기성 조건하에 성장시킨다.
경우에 따라 발현된 폴리펩타이드의 분리 및 정제가 당분야에 공지된 방법에 따라 수행된다.
형질 전환된 세포가 만족스러운 세포 밀도로 성장한 후, 발현된 단백질 회수의 첫단계는 세포내부로부터 단백질의 방출이다. 대부분의 방법에서는 세포벽을 효소적 분해, 예를들면 글루코시다제로 우선 제거한다. 다음에 생성된 스페로플라스트를 트리톤과 같은 세정제로 처리한다. 또한 전단응력[예를 들면 X-압착기, 후렌치(French)-압착기]과 같은 기계적인 힘 또는 유리 비드와의 진탕이 세포 파괴를 위해 적합하다. 생성된 혼합물은 폴리에틸렌아민으로 처리하여 대부분의 비단백질성 물질 제거, 황산암모늄 또는 트리클로로 아세트산으로 용액을 포화시켜 단백질을 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 예를들면 이온 교환 크로마토그래피, 크기 세척 크로마토그래피, HPLC 또는 역상 HPLC, 적합한 세파덱스 컬럼상에서 분자 크기 분류 등과 같은 종래의 방법에 의해 목적하는 폴리펩타이드를 증가시킨다. 예비-정제 생성물의 최종 정제는 예를들면 항체 친화성 크로마토그래피의 수단에 의해 달성한다.
목적하는 폴리펩타이드가 효모 세포에 의해 외질 공간으로 분비되는 경우, 단단한 원안을 사용할 수 있다:세포벽을 효소학적으로 제거하거나, 또는 세포벽에 손상을 줘 폴리펩타이드를 압출시키게 하는 티올 시약 또는 EDTA와 같은 화학약품으로 처리하여 세포 용해없이 폴리펩타이드를 회수한다. 폴리펩타이드를 배양 브로쓰(broth)로 분비하는 경우, 그로부터 직접 회수할 수 있다.
수득한 글리코실화 및 비글리코실화 단백질의 혼합물을 예를들면 콘카발린-A 세파로스
Figure kpo00006
컬럼 상에 크로마토그래피하여 분리한다. 비글리코실화 생성물은 컬럼을 통해 통과하고, 반면에 비글리코실화 생성물은 선택적으로 흡착하여 통상적인 방법, 예를들면 KSCN과 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)와 배합한 α-에틸만노사이드를 용출시킬 수 있다.
예를 들면 엔도글리코시다제 H 또는 F의 작용에 의해 효소적으로 글리코실 잔기를 제거하는 것이 가능하다. 이 방법은 상당히 순수한 형태로 비글리코실화된 생성물의 생산을 허용한다.
본 발명은 나아가 본 발명의 방법에 따라 제조된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 특히 PH05의 상부 활성 서열, 하이브리드 프로모터, 하이브리드 벡터, 형질전환된 효모 세포 및 그의 제조방법, 및 실시예에 기술한 바와같이 효모에 이종인 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
하기 실험 단계에서 본 발명의 다양한 태양은 첨부한 도면을 참고로해서 기술되고 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하는데 일조하며 그의 제한으로 해석될 수 없다.
실험단계
[실시예 1]
PH05 프로모터 결실부의 작제
a) Bal 31 분해
제1도에 인용한 PH05의 BamHⅠ-Sal Ⅰ 단편을 함유하는 재조합 파지 M13mp9/PH05 Bam-Sal을 PH05 프로모터를 위한 공급원으로 사용한다(참조:유럽 특허원 제143,081호). 파지 DNA(RF:복제형) 20μg을 제한 엔노뉴클레아제 SalⅠ으로 분해하여 약 9kb의 선형 DNA를 수득한다. 페놀/클로로포름으로 추출한 후, DNA에 에탄올로 침전시킨다. DNA를 0.5μg/ml 농도로 10mM 트리스 pH 8.0에서 재현탁한다. SalⅠ절단된 DNA 16μg을 20mM 트리스 pH 8.0, 199mM NaCl, 12mM MgCl2, 12mM CaCl2및 1mM EDTA의 100μl중에 엑소뉴클레아제 Bal 31(BRL) 2U로 분해한다. 각각 2μg DNA 분취량을 30℃ 배양 1,2,3,4,5 및 6분 후 회수하고, 페놀 50μl 및 TNE 60μl와 즉시 혼합한다. 페놀/클로로포름으로의 추출 및 에탄올 침전후, DNA를 10mM 트리스 pH 8.0중에 100μg/ml 농도로 재현탁한다. Bal 31에 의한 엑소뉴클레아제 분해 정도를 분석하기 위해 매 시점으로부터 0.5μg의 DNA를 엔도뉴클레아제 BamHⅠ으로 분해하고, 트리스-보레이트 완충액 pH 8.3(90mM 트리스·HCl pH 8.3, 90mM 붕산, 2.5mM EDTA)중에서 1.5% 아가로스 겔 상에 분석한다. Bal 31분해의 1분당 평균 100bp가 매 단편의 말단으로부터 제거된다.
b) Bal 31 처리한 DNA에 EcoRⅠ 링커의 첨가
EcoRⅠ 링커(5'-GGAATTCC-3', BRL)의 A260단위 두개를 10mM 트리스 pH 8, 1mM EDTA의 250μl중에 현탁한다. EcoRⅠ 링커 2μg을 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 15mM DDT, 10μM ATP 및 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer) 33U의 75μl 중에서 키나제 처리한다. 37℃에서 1시간 후 혼합물을 실온으로 냉각하고 이어서 -20℃로 보관한다.
어닐링된(annealed), 이본쇄 EcoRⅠ 링커의 평활말단을 Bal 31 처리한 DNA 단편에 연결한다. Bal 31 처리한 DNA(실시예 1a 참조) 0.5μg을 키나제 처리한 EcoRⅠ 링커의 50배 과량과 함께 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 4mM ATP 및 T4DNA 리가제(Biolabs) 600U의 20μl중에서 실온으로 16시간 동안 항온 처리한다. T4DNA 리가제를 불활성화한 후(65℃에서 10분) 과량의 EcoRⅠ링커를 50U EcoRⅠ(Boehringer) 50μL 용적으로 절단한다. DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 다음 10mM 트리스, 1mM EDTA(=TE)중에 재현탁한다. 이어서 DNA를 BamHⅠ(Biolabs) 5단위로 절단하고, 혼합물을 트리스-보레이트 완충액(상기 참조)중에서 1.5% 저융해 아가로스 겔(Sigma)에적용한다. 밴드를 에티듐 브로마이드로 염색하고 366nm의 장파 UV 광하에 가시화하다. 약 100bp 내지 600bp의 광범위한 확산 밴드 형태를 겔로부터 절단해 내고, DNA를 하기와 같이 추출한다: 아가로스의 조각을 65℃에서 액화시키고, 500mM NaCl로 조정하며, 20분 동안 65℃로 항온 처리한다. 페놀(10mM 트리스·HCl pH 7.5, 1mM EDTA, 500mM NaCl로 평형화) 1용적을 가한다. 수성상을 페놀로 2회 및 클로로포름으로 1회 재추출한다. DNA 냉 무수 에탄올 2.5용적으로 침전시키고 원심분리하여 수거한다. DNA 펠릿(pellet)을 냉 80% 에탄올로 세척하고 진공중에 건조한다. DNA를 10μl TE에 재현탁한다.
c) M13mp9에 결합
M13mp9의 RF 3μg을 50μl 용적의 EcoRⅠ(Biolabs) 15단위 및 BamHⅠ(Boehringer) 15단위로 분해한다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후 DNA를 50μl TE에 재현탁한다. 절단 벡터 DNA 5μl(약 200ng)를 상기 샘플(실시예 1b에 기술한 바와같이 다양한 Bal 31분해에 의해 수득한 DNA단편) 10μl와 혼합하고, 60mM 트리스/HCl pH7.5, 6mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP 및 T4DNA 리가제 200U의 존재하에 총용적 20μl중에서 15시간 동안 연결시킨다. 균주 이.콜라이 JM 101의 캄피턴트 세포에의 형질도입은 뉴우잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)가 출판한 문헌["M 13 cloning and sequencing system"]에 따라 수행한다. 많은 백색 플라크(plaques)로부터 파지를 성장시켜, 제한효소 EcoRⅠ및 BamHⅠ으로 절단하여 그들의 DNA 삽입물의 크기에 대해 분석한다.
d) 생거 서열화에 의한 Bal 31 결실 말단점의 측정(SalⅠ부위로부터 결실)
상술한 문헌에 기술된 바와 같이 생거 등[Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463(1977)]의 디데옥시 DNA 서열화 시스템을 사용하여 서열화한다. 결실 말단점은 하기와 같다:
Figure kpo00007
e) 생거 서열화에 의한 Bal 31 결실 말단점의 측정(Bam HⅠ 부위로부터 결실)
유사한 Bal 31 결실을 M 13mp9 PH05 Bam-Sal을 BamHⅠ으로 절단하는 것외에, a-c에서 기술한 바와같이 수행한다. Bal 31 분해한 분자를 EcoRⅠ및 SalⅠ으로 절단하고, 생성된 단편을 EcoRⅠ 및 SalⅠ으로 분해한 M13mp9 내로 클론화한다. 결실 말단점은 하기와 같다:
Figure kpo00008
f) 내부 PH05 프로모터 결실물의 작제
d)에서 기술한 Bal 31 결실부 세트는 EcoRⅠ 부위로 끝나는 "좌지(left arm)" PH05 프로모터 단편을 제공하고, e)에서 기술한 Bal 31 결실 세트는 EcoRⅠ 부위로 끝나는 "우지(right arm)" PH05 프로모터 단편을 제공한다. 여러위치의 "좌지" 및 "우지"를 조합하여 결실된 DNA의 부위에 EcoR1링커 절편을 함유하는 내부 결실물을 제조한다. 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ 및 BamHⅠ(좌지) 또는 EcoRⅠ 및 SalⅠ(우지)에 의해 M 13mp9 유도체로부터 "좌지" 및 "우지"를 절단하고, b)에서 기술한 연성 아가로스 겔 전기영동을 통해 상응하는 단편을 분리함으로써 각각의 내부 결실물을 작제한다. "좌지", "우지"의 동몰량 및 BamHⅠ과 SalⅠ 분해한 M 13mp9벡터 DNA 200ng을 c)에서 기술한 바와 같이 연결한다. 이.콜라이 JM 101로 형질도입한 후, 백색 플라크를 취하여 RF를 생성시키고 제한효소 분석(BamHⅠ, SalⅠ, EcoRⅠ)에 의해 분석한다. 하기 암(arms)을 합하여 특수한 내부 결실물을 제조한다(뉴클레오타이드 번호에 대해서는 제1도를 참조하라).
Figure kpo00009
[실시예 2]
PH05 프로모터의 내부 결실물의 생체내 분석
실시예 1f)에 기술한 여러가지 결실물을 야생형 PH05 Bam-Sal 단편을 결실된 부분으로 대치하므로써 플라스미드 pJDB207/PH05[R. Haguenauer-Tsapis and A. Hinnen, Molocular and Cellular Biology, 4, 2668-2675(1984)]로 클론화한다. 효모 균주 에스. 세레비지에 AH216(참조:유럽 특허원 제143,081호)의 형질전환 후, 산 포스파타제 활성을 문헌[Toh-e et al. J.Bacteriol, 113, 727(1973)]에 기술된 바와 같이 측정한다. 결실 △11 및 △12는 PH05 활성의 약 10배 감소를 나타내며, PH05 발현시 필수적인 상부영역("상부 활성 부위", UAS)을 규정하고 있다. 유사한 다운(down) 효과가 결실△17(약 5배 감소) 및 TATA 박스 결실 △23-△26(약 30배 감소)에 대해 관찰된다. 모든 그 밖의 결실이 거의 야생형 수준의 활성을 보인다. 이 결과는 PH05 발현시 필수적인 정보의 세 영역이 하기 위치에 있음을 시사한다.
1. 위치 -349 및 -383 사이(UAS1)
2. 위치 -225 및 -263 사이(UAS2)
3. 위치 -87 및 -125사이(TATA박스)
PH05의 UAS1 또는 UAS2 또는 UAS1과 UAS2를 함유하는 DNA 단편은 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 재조합 파지 M13 mp9/PH05 Bam-Sal(실시예 1)로부터 제조할 수 있다. UAS1은 하기 서열의 268bp BamHⅠ-ClaⅠ단편중에 포함한다.
Figure kpo00010
UA2는 하기 서열의 100bp ClaⅠ-BstEⅡ 단편중에 포함된다.
Figure kpo00011
UAS1 및 UAS2는 하기 서열의 368bp BamHⅠ-BstEⅡ 단편에 존재한다.
Figure kpo00012
[실시예 3]
융합된 PH05-GAPDH 하이브리드 프로모터의 작제
실시예 1 및 실시예 2는 조절 기능을 갖는 UAS일 수 있는 PH05의 -365 주위의 영역[UAS1(PH05)] 및 -180 주위의 영역[UAS2(PH05)]를 제공한다. UAS1(PH05) 268bp BamHⅠ-ClaⅠ단편중에 함유되는 반면 UAS1(PH05) 및 UAS2(PH05) 모두는 308bp BamHⅠ-BstEⅡ 단편중에 함유된다. 이들 두가지 단편은 각각 TATA 박스와 GAPDH의 전사 개시 부위를 포함하는 두개의 서로 다른 GAPDH 하부의 프로모터 요소에 융합된다.
a) 효모 유전자 라이브러리의 작제
야생형 사카로마이세스 세리비지에 균주 S288C로 부터의 총 고분자량 효모 DNA[M.V.Olsen et al. J. Mol.Biol. 132, 387(1979)] 30μg을 공급자로부터 추천받은 250μl의 EcoRⅠ메틸화 완충액 중에서 37℃에서 30분간 2단위의 EcoRⅠ 메틸라제(New England Biolabs)와 함께 배양시킨다. 에탄올로 DNA를 침전시키고, 500μl의 25mM 트리스·HCl, pH 8.5, 2mM MgCl2(EcoRⅠ*완충액)[H.Meyer, FEBS Lett, 90, 341(1979)]에 재현탁시키고, DNA 단편의 크기 분포가 최대 30 내지 50kb 범위(λDNA의 XhoⅠ 분해로 약 33kb 및 17kb 마커를 제공하다)일때까지 EcoRⅠ(Boehringer)로 분해시킨다. EcoRⅠ*조건하에 분해된 효모 DNA는 수크로스 구배(10mM 트리스·HCl pH 7.5, 1mM EDTA중 5 내지 20% 수크로즈)로 38,000rpm의 SW40 회전기에서 6시간동안 크기 분별시킨다. 구배의 상단에서부터 각 0.4ml씩 30개의 분획을 수집한다. 16번 분획은 30 내지 40kb 크기의 DNA 단편을 함유한다. 상기 분획의 DNA(3μg)를 에탄올로 침전시키고 총 부피 15μl중 15℃에서 16시간 동안, EcoRⅠ에 의해 선형화된 1μg의 코스미드 벡터 pYc1에 연결시킨다[B.Hohn et al. in "Genetic Engineering", Vol.2, p169, New York 1980]. 연결은 공급자에 의해 설명된 완충 시스템을 사용하여 300U T4DNA 리가제(New England Biolabs)로 수행한다. DNA를 시험관내에서 박테리오파지 λ에 패키징하고[B.Hohn in "Methods in Enzymology", Vol.68, p.299, New York 1979], 어셈블링된 파지를 이.콜라이 균주 HB101로 도입시키는데 사용한다(r
Figure kpo00013
k,m
Figure kpo00014
k,leu
Figure kpo00015
,pro
Figure kpo00016
,recA). 형질 도입 효율은 pYc1 벡터 1μg당 약 5000 암피실린-내성 콜로니이다. 3000ampR콜로니를 취해, 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지[10g 박터-트립톤(Difco], 5g 박토 효모 추출물(Difco), 10g NaCl]중 미세역가 접시의 벽에서 각각 성장시킨다.
b) 효모 GAPDH 유전자의 분리
상기에 기술된 유전자 라이브러리를 서열 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'의 합성 올리고뉴클레오타이드[포스포트리 에스테르 방법으로 제조:K.Itakura et. al., J.Am.Chem. Soc.97, 7327(1975); J.F.M.de Rooij et al., Recl. Trav. Chim Pays-Bas 98, 537(1979)]로 선별한다. 10μg의 올리고뉴클레오타이드를 마니아티스등(Maniatis et al.)에 의해 기재된 같이["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, page 125] 50μl의 총 용적중, T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer)와 함께 10μl γ-32p-ATP(300Ci/mmol, 10μCi/μl Amersham)을 사용하여 키나제 처리한다. 클로니 하이브리드화는 상기와 동일한 저자에 의해 기재된 바와 같이 수행한다(page 312). 양성 클론은 코닥 X-5 X-선 필름을 사용하여 자기방사법에 의해 검출한다. 플라스미드 DNA를 분리하여(참조, 유럽 특허원 제100,561호)GAPDH를 암호화하는 2100bp HindⅢ단편을 함유하는 하이브리드 클론을 생성시킨다[J.P.Holland et al., J.Biol. Chem. 254, 9839(1979)]. 클론화된 DNA의 근거는 이본쇄 DNA에 대한 지.에프.홍(G.F.Hong)의 기술[Bioscience Reports 1, 243(1981)]과 같은 디데옥시 서열화 원인과 함께, 상기 언급된 올리고뉴클레타이드를 사용한 DNA 서열화 실험으로 증명된다. 클론화된 GAPDH 유전자는 홀랜드(Holland) 등에 의해 발표된[J. Biol. Chem.255, 2596(1980)] pgap 491과 같은 서열을 갖는다.
c) GAPDH 하부 프로모터 요소의 제조(제2도 및 제3도 참조)
GAPDH 유전자의 ATG로부터 -27에서 -675 위치를 포함하는 649bp TaqⅠ단편(제2도 참조)을 TaqⅠ(New England Biolabs)로 상기 언급한 하이브리드 플라스미드를 분해하고, 1.2%의 연성 아가로스겔상에 DNA 단편을 분리하고, 고온 페놀로 DNA를 추출하여(실시예 1참조) 분리시킨다. TaqⅠ단편의 클로닝은 pBR 322의 ClaⅠ 부위에 행해지는데; 1μg의 pBR 322를 공급자의 설명에 따라 3단위의 ClaⅠ(New England Biolabs)로 절단한다. 300ng의 페놀화되고 절단된 벡터를 총 20μl 용적의 200U의 T4DNA 리가제를 사용하여 약 300ng의 삽입 DNA(649bp Taq 단편)에 연결시킨다(실시예 1b 참조). 형질전환은 암피실린 내성을 위해 이.콜라이 HB101내로 수행하며, 플라스미드 DNA를 제조하고, 제한 분석[TaqⅠ, DraⅠ]에 의해 분석한다. TagⅠ단편의 배향은 플라스미드의 BamHⅠ부위와 함께 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ을 사용하여 수행하고, pBR 322의 HindⅢ에 근접한 -675 위치의 TaqⅠ 부위를 갖는 플라스미드를 선별한다. pBR 322/GAPDH로 나타낸 상기 플라스미드는 BamHⅠ(New England Biolabs)를 사용하여 선형화시키고, Bal31을 사용하는 분해는 BalⅡ 링커(5'-GAGATCTG-3', New England Biolabs)가 사용되는 것을 제외하고 실시예 1의 방법대로 수행하며, 분해된 플라스미드는 총 20μl의 용적중 5μg/ml의 농도에서 직접 환상화한다. Bal31로 단축된 TaqⅠ 단편의 크기는 제한 분석으로 측정한다(BalⅡ 및 HindⅢ 사용), GAPDH 프로모터에 ATG 상부로 부터 약 200bp 내지 265bp 연장된 DNA 단편을 함유하는 두개의 클론을 선별한다. 두 단편은 모두 약 -140bp에 추정적 TATA 박스를 함유한다. 이 클론은 또한 DNA의 pBR 322에서 유도된 부분에 복제원을 함유하는데, 각각 pGAPDH-F 및 pGAPDH-E로 명명한다.
d) PH05의 UAS1(PH05)를 갖는 하부 GAPDH 요소와 에글린 C의 단백질 암호화 영역의 결합
(Ⅰ) GAPDH 요소(제3도 참조)
GAPHD 유전자의 ATG에 바로 인접한 위치에 -27 위치까지 TaqⅠ부위로부터 GAPDH 프로모터 요소를 연장시키기 위해 다음 서열의 2개의 합성 상보성 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.
5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3'
3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'
상기의 올리고뉴클레오타이드는 -26 내지 -5 부위의 순수한 GAPDH 프로모터 서열에 말단의 EcoRⅠ부위를 제공한다. 각 2μg의 플라스미드 pGAPDH-E 및 -F를 50μl중 6단위의 TaqⅠ로 분해시키고, 생성되는 혼합물을 페놀화시키고, 에탄올 침전시킨 다음 10μl의 물에 재현탁시킨다. 합성 올리고뉴클레오타이드를, 10mM 트리스·HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 50mM NaCl을 함유하는 용액 100μl중에서 각 일본쇄 2μl를 혼합시키고 3분간 90℃로 가열한 다음 이 용액을 실온까지 서서히 냉각시킴으로써(약 3시간 이내) 어닐링시킨다. TaqⅠ 분해된 플라스미드 각 1μg을 800U 및 T4DNA 리가제를 사용하여 약 18시간 동안 20μl 용적중 약 20배몰 과량의 어닐링된 올리고뉴클레오타이드와 혼합한다. 총 혼합물을 3단위의 BglⅡ(New England Biolabs)로 분해시킨다. DNA 단편을 1.5% 연성 아가로스겔 상에서 분리한다. 각각 약 200bp 및 265bp의 BalⅡ 및 EcoRⅠ 단펴을 겔로부터 절단하여 추출하고 에탄올 침전시킨다.
플라스미드 pGAPDH-E를 BalⅡ 및 EcoRⅠ로 분해하고 큰 단편(약 3.5kb)을 분리한다. 이 단편을 벡터로서 사용하여, 전술한 연결, 형질전환 및 플라스미드 분리 조건을 사용하여 265bp 및 200bp BglⅡ-EcoRⅠ 단편을 클론화시킨다. 생성된 플라스미드를 pGAPDH-EL 및 pGAPDH-FL로 명명한다. pGAPDH-EL 및 pGAPDH-FL에서 클론화된 BalⅡ-EcoRⅠ 단편의 DNA 서열은 제4도에 나타내었다. 단편의 정확한 크기는 각각 266bp 및 201bp이다.
(Ⅱ) UAS1(PH05)조절 요소
3μg의 플라스미드 p31/Y(유럽 특허원 제100,561호 참조)를 6단위의 ClaⅠ(New England Biolabs)로 분해한다. 3'-오목한(recessed) 말단을 마니아티스에 따른 이, 콜라이 DNA 폴리머라제 I(Bethesda Research Laboratories)의 클레나우 단편과 함께 반응시켜 충전한다. BalⅡ 링커(5'-CAGATCTG-3')를 실시예 1에서와 같이 가한다. DNA를 SalⅠ 및 BalⅡ(New England Biolabs)로 분해하고 1% 연성 아가로스겔 상에서 진행시킨다. 전술한 바와 같이, 548bp 단편을 겔로부터 절단하고 페놀화시킨 후 에탄올 침전시킨다.
(Ⅲ) 플라스미드 pJDB207R/PH05-EGL의 작제(제5도 참조)
이 플라스미드는 이글린 C 암호화 영역 및 PH05 전사 터미네이터로 구성되는 DNA 단편의 공급원이다.
(A) pJDB207 벡터 단편의 분리
6μg의 플라스미드 pJDB207R/1F(α-3)(유럽 특허원 제100,561호)을 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ으로 완전히 분해시킨다. 생성되는 6.85kb 및 1.15kb 크기의 DNA 단편을 에탄올로 침전시키고, 400μl의 50mM 트리스-HCl pH8.0에 재현탁시킨 다음 4.5 단위의 송아지 장내 알칼리성 포스파타제(Boehringer, Mannheim)를 가한다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 이 용액을 150mM NaCl로 조절한다. DNA 용액을 150mM NaCl 및 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-HCl pH 7.5로 평형화시킨 DE52(Whatman) 음이온 교환기 베드 100μl에 적용한다. 동일한 완충액으로 세척한 후, DNA를 400μl의 1.5M NaCl, 10mM 트리스-HCl pH7.5, 1mM EDTA로 용출시킨 다음 에탄올 침전시킨다. 큰 6.85kb BamHⅠ 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중 0.6% 저용융 아가로스겔 상에서 작은 단편과 분리시킨다.
(B) 534bp PH05 프로모터 단편의 분리
10μg의 플라스미드 p31/R(유럽 특허원 제100,561호)를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ 및 BamHⅠ으로 분해한다. 생성되는 세개의 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중 0.6% 저용융 아가로스겔 상에서 분리한다. m-RNA 출발 부위를 포함하는 PH05 프로모터를 함유하는 534bp BamHⅠ-EcoRⅠ 단편을 분리한다.
(C) 에글린의 암호화 서열을 함유하는 221bp DNA 단편의 분리
8μl의 플라스미드 pML 147(유럽 특허원 제146,785호)를 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 EcoRⅠ으로 분해한다. 생성되는 두개의 DNA 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중 0.6% 저용융 아가로스겔 상에서 분리한다. 221bp 단편이 분리된다.
(D) DNA 단편의 연결
접착 말단을 갖는 전술한(실시예 3d Ⅲ A-C) 세가지 DNA 단편을 한 반응으로 연결시킨다: pML 147중의 0.1pmole(0.45μg)의 6.85kb BamHⅠ 벡터 단편, 0.2pmole(70ng)의 534bp BamHⅠ-EcoRⅠ PH05 프로모터 단편 및 0.2pmole(29ng)의 221bp EcoRⅠ-BamHⅠ 단편을 연결시킨다. 세가지 DNA 단편 모두는 저용융 아가로스겔의 작은 겔 블럭에 함유된다. 아가로스겔 세조각을 모으고 65℃에서 액화시키고 2배로 희석시킨다. 연결은 총 부피 270μl의 60mM 트리스-HCl pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP중에서 16단위의 T4DNA 리가제(Boehringer, Mannheim)를 사용하여 15℃에서 16시간 동안 수행한다. 10μl의 연결 혼합물 100μl의 칼슘 처리된 형질전환된 캄피턴트 이, 콜라이 HB101 세포에 가한다.
24개의 형질전환된 ampR콜로니를 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 각각 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 홀름(Holmes)등의 방법에 따라 제조하고[Anal. Biochem. 114, 193(1981)], HindⅢ/EcoRⅠ 이중분해로 분석한다. 600bp EcoRⅠ-HindⅢ 단편의 출현은 특정 클론이 정배향의 발현 벡터에 삽입된 PH05 프로모터-에글린 C-DNA 단편을 갖는 것으로 지적된다. 기대되는 바와 같이, 약 50%의 클론이 우측 배향으로 삽입물을 갖는다. 이들 클론중 하나를 분리하여 pJDB207R/PH05-EGL이라 칭한다.
6μg의 플라스미드 pJDB207R/PH05-EGL을 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ 및 SalⅠ으로 완전히 분해한다. 큰 6.1kb(벡터부) 단편을 연성 아가로스겔 전기영동으로 분리시키고 페놀 추출하여 에탄올 침전시킨다. 벡터 DNA를 20μl의 물에 재현탁시킨다. pJDB207R/PH05-EGL를 HindⅢ 및 EoRⅠ으로 분해하여 에글린 단편을 생성시킨다. 생성되는 600bp 단편을 연성 아가로스겔 전기영동으로 분리하고, 페놀 추출한 다음 에탄올 침전시킨다. 에글린 단편을 20μl H2O에 재현탁시킨다.
(Ⅳ) UAS1(PH05) 요소를 사용한 단편의 연결(제6도 참조)
다음의 4가지 성분을 사용하여 연결시킨다:0.5μg의 6.1kb HindⅢ-SalⅠ 벡터 단편, 100ng의 600bp EcoRⅠ-HindⅢ 에글린 C 단편, 200ng의 pGAPDH-EL의 266bp BglⅡ-EcoRⅠ 단편, 및 UAS1(PH05)를 함유하는 548bp SalⅠ-BalⅡ 단편 100ng. 상기와 같이 연결한다. 암피실린 내성인 이. 콜라이 HB101의 형질전환, 플라스미드 분리 및 양성 클론의 제한분석은 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ, EcoRⅠ, BglⅡ 및 SalⅠ를 사용하여 전술한 바와 같이 수행한다. 하나의 양성 클론을 선별하여 pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1)이라 칭한다.
유사한 작제를 pGAPDH-FL의 201bp BalⅡ-EcoRⅠ 단편으로 수행한다. 생성된 플라스미드를 pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1)로 칭한다.
(Ⅴ) UAS1(PH05) 및 UAS2(PH05) 요소를 갖는 하이브리드의 작제
3μg의 상기 플라스미드(Ⅳ 참조)를 BalⅡ로 분해한다. 페놀 추출하고 에탄올 침전시킨 후 DNA를 물에 재현탁시킨다. 3'-오목한 말단을(Ⅱ)에서 기술한 바와 같이 클레나우 DNA 폴리머라제로 충전시킨다. 이 플라스미드를 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨다. SalⅠ(Biolabs)를 분해한 후, 큰 단편(약 7.2kb)을 연성 아가로스겔 전기영동 및 페놀추출하여 분리하고 에탄올 침전된 DNA를 물에 재현탁시킨다.
유사한 방법으로, 플라스미드 p31/Y를 BstEⅡ으로 분해하고 DNA 폴리머라제(클라나우단편)로 처리한 다음 SalⅠ으로 절단한다. 651bp 단편을 상기와 같이 분리한다. 651bp 단편을 사용하여 200ng의 상기 벡터 DNA를 연결시켜 다음의 플라스미드를 수득한다.
pJDB207/PAPEL-EGL(UAS1-UAS2)
(pGAPDH-EL로부터의 266bp BglⅡ-EcoRⅠ 단편을 포함)
pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1-UAS2)
(pGAPDH-FL로부터의 201bp BalⅡ-EcoRⅠ 단편을 포함)
[실시예 4]
(a) 사카로마이세스 세레비지에 GRF18의 형질전환
실시예 3d Ⅳ 및 3d Ⅴ에 네가지 플라스미드를 한넨(Hinnen)등[Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]의 형질전환 원안을 사용하여 사카로마이세스 세레비지에 균주 GRF 18(α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR)에 각각 도입시킨다. 형질전환된 효모 세포를 로이신 결핍 효모 최소 배지 평판상에 선별한다. 단일 형질전환 효모 콜로니를 분리하여 사카로마이세스 세레비지에 GRF 18/pJDB207/PAPEL-EGL(UAS1), /PAPFL-EGL(UAS1), /PAPEL-EGL(UAS1+UAS2) 및 /PAPFL-EGL(UAS1+UAS2)로 칭한다.
(b) 형질 전환체의 발효
네가지 에스, 세레비지에 GRF18 형질전환체 세포를 각각 50ml 삼각 플라스크내에서 진탕시키며 30℃에서 24시간 동안 10ml의 효모 최소 배지(2% 글루코스 및 20mg/ℓ L-히스티딘을 가한, 아미노산이 없는 Difco Yeast Nitrogen Base) 3×107세포/ml 농도까지 성장시킨다. 세포를 0.9% NaCl로 세척하고, 이를 사용하여 (NH4)2SO4, 2% 글루코스 및 1g/ℓ L-히드티딘 대신 0.03g/ℓ KH2PO4, 1g/ℓ KC1, 10g/ℓ L-아스파라긴을 함유하는 디프코 효모 질소 염기 배지(아미노산 부재)를 사용하여 제조한 고 Pi 배지(상기와 같음) 및 저 Pi 최소 배지를 배양한다. 이 배지를 0.03의 출발 OD600으로 접종한다. 세포를 500ml 플라스크내에서 30℃에서 24시간 동안 성장시킨다(저 Pi 배지에서 OD600nm=1.8 고 Pi 배지에서 OD600nm=3.0).
(c) 에글린 C 역가의 측정
세포가 전술한 세포밀도(OD)에 도달하였을때, 세포를 거두어 원심분리하고 유리 비드로 분쇄한다. 유. 시물러(U. Seemueller) 등의 방법[Hoppe-Seyler's Z.Physiol. Chem. 358, 1105(1977)]에 따라 사람 백혈구 엘라스타제 억제를 측정함으로서 혼합물의 에글린 활성을 평가한다. 하기의 활성을 수득한다.
Figure kpo00017
[실시예 5]
PH05-GAPDH 하이브리드 프로모터의 조절하에 데설파토히루딘의 발현
Ⅰ. 데설파토히루딘 HV1 유전자의 5' 말단에 뉴클레오타이드 서열의 조성
데설파토히루딘을 암호화하는 뉴클레노타이드 서열(참조, 유럽 특허원 제168,342호)은 최종 유전자 생성물의 NH2-말단 발린을 나타내는 GTT로부터 출발한다. 이. 콜라이에 편리하게 서브클로닝 및 발현시키기 위해 암호화 서열은 EcoRⅠ 제한부위 및 ATG 개시코돈을 포함하는 8개의 뉴클레오타이드에 의해 5'-말단에 연장된다. PH05 시그날 펩타이드를 암호화하는 서열에 하루딘 암호화 서열을 정확하게 프레임 융합시키기 위해 상기의 부가적인 뉴클레오타이드는 제거해야 한다. 이는 EcoRⅠ 제한 부위를 평활 말단 부위로 전환시키고, HgaⅠ을 사용한 연속 절단이 GTT 코돈의 바로 상부에서 일어나는 상기 부위에 HgaⅠ 인지 부위를 함유하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 가하여 수행한다.
데설파토히루딘 유전자의 앞부분에 HgaⅠ제한부위의 도입(제7도 참조)
8μg의 플라스미드 pML 310(EP 168,342 참조)를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ으로 완전히 분해한다. DNA(pML 310/EcoRⅠ)를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 5'위에 붙은 말단을 뉴클레아제 S1으로 제거한다. 4μg의 pML310/EcoRⅠ DNA를 100μl의 250mM NaCl, 1mM ZnSO4, 30mM 이세트산 나트륨 pH 4.6중에서 20U/ml의 뉴믈레아제 S1(Sigma)를 사용하여 37℃에서 45분동안 분해시킨다.
DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하여 에탄올로 침전시킨다. DNA(pML 310/EcoRⅠ/S1)을 100μl의 50mM 트리스·HCl pH8.0에 재현탁시키고, 37℃에서 1시간동안 2단위의 송아지 장내 알칼리성 포스파타제(CIAP, Boehringer)와 배양한다. 효소를 65℃에서 1.5시간 동안 불활성화시킨다.
배양 혼합물중의 NaCl 농도를 150mM로 조절한다. 탈인산화 DNA(pML 310/EcoRⅠ/S1/CIAP)를 저염 완충액(150mM NaCl, 10mM 트리스·HCl pH 8.0, 1mM EDTA)중 DE 52(Whatman) 이온 교환 컬럼에 흡착시킨 다음 고 염 완충액(1.5M NaCl, 10mM 트리스·HCl pH 8.0, 1mM EDTA)로 용출시켜 정제한다. DNA를 에탄올로 침전시키고 0.8mg/ml의농도로 H2O에 재현탁시킨다.
서열 5'-AGCGTCGACGCT-3'의 올리고뉴클레오타이드는 포스포트리에스테르법[Itakura, et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706(1981)]에 의해 합성된다. 올리고뉴클레오타이드의 서열은 제한 엔도뉴클레아제 HgaⅠ에 대한 인지 부위 -GACGC-를 함유하는 자가-상보적 서열이다. 두개의 일본쇄의 어닐링으로 12bp의 이본쇄 DNA 링커가 형성된다. 1.2μg의 합성 일본쇄 올리고 데옥시뉴클레오타이드를 10μl의 60mM 트리스·HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 30μCi의 [γ-32P] ATP(3000Ci, mmol-1, Amersham) 및 6 단위의 T4폴리뉴클레오타이드 카나제(Boehringer)중에서 30분간 37℃에서 인산화시킨 다음, 0.5mM의 ATP 존재하에 37℃에서 15분간 둔다. 그다음 혼합물을 75℃에서 10분간 배양시켜 효소를 불활성화시키고, 어닐링시키기 위해 실온까지 냉각시킨다.
0.6μg(170pmoles)의32P-표지된 링커 DNA를 2.4μg(1.75pmole 말단)의 pML 310/EcoRⅠ/S1/CIAP와 혼합시키고, 15℃에서 20시간 동안 20μl의 60mM 트리스·HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 3.5mM ATP, 800단위의 T4DNA 리가제(Biolabs)중에서 연결시킨다. 리가제를 85℃에서 10분간 불활성화하고, 10mM EDTA pH 7.4, 300mM 아세트산 나트륨 pH 6.0 및 0.54 용적의 이소프로판올 존재하에 DNA를 침전시켜 과량이 링커 분자를 제거한다. 실온에서 30분후, DNA를 펠릿화하고 45μl의 연결 혼합물(상기에 자세히 설명함)중에 재현탁시킨 다음 15℃에서 6시간 동안 연결시켜 환상 DNA를 형성시킨다.
1μl 및 3μl의 연결 혼합물을 100μl의 칼슘-처리된 형질전환 컴피턴트 이. 콜라이 HB101 세포[D.Hanahan의 방법에 따라 제조함. J. Biol. Chem. 166, 557(1983)]에 가한다. 세포를 얼음 위에 30분간 정착시킨 다음 42℃에서 3분간 배양하고 얼음상에서 2분간 냉각한 후 400μl의 SOC 배지에서 37℃에서 시간 배양한다. 세포를 각 100μl 중에 농축시키고 50μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 평판상에 도말한다.
12개의 형질전환된 ampR콜로니를 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지중에서 각각 성장시킨다. 플라스미드 DNA는 디. 에스. 홀름(D.S.Holmes)등의 방법[Anal. Biochem. 114, 193(1981)]에 따라 제조한다. 합성올리고뉴클레오타이드 링커의 존재하는 히루딘의 암호화 분쇄에 하이브리드화된 프라이머로서 일본쇄 DNA 단편을 사용하는 DNA 서열화에 의해 확인된다. 히루딘 유전자의 앞쪽의 정위치에 링커 DNA를 함유하는 하나의 클론을 pML310L로 명명한다.
Ⅱ. PH05 시그날 서열과 데설파토히루딘 구조 유전자의 융합
(a) 0.2kb 데설파토히루딘 단편의 분리(제7도 참조)
12μg의 플라스미드 pML 310L을 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 PvuⅠ으로 완전히 분해한다. 페놀/클로로포름으로 DNA 추출하고 에탄올 침전시킨 후 두개의 제한 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중의 1.2% 아가로스겔 상에서 분리한다. 에티듐브로마이드로 착색한 0.84kb PvuⅠ-BamHⅠ 단편을 겔 조각으로 분리시킨다. DNA를 3ml의 0.2×TBE완충액으로 채운 투석 백에서 전기용출시킨다. 밀폐된 백을 TBE 완충액 pH 8.3(90mM 트리스-염기, 90mM 붕산, 2.4mM EDTA)에 담근다. 100mA에서 30분후 전류편극이 45초 역전되어 투석막으로부터 DNA를 제거한다. 투석 백내의 겔 조각 주위의 완충액을 회수하여 150mM NaCl로 조절하고, DE52(Whatman) 이온 교환 컬럼을 통과시킨다. DNA를 고염 완충액(1.5M NaCl, 10mM 트리스·HCl pH 8.0, 1mM EDTA)으로 용출시키고 에탄올로 침전시킨 다음 H2O에 0.1mg/ml 농도로 재용해시킨다.
pML 310L의 0.84kb PvuⅠ-BamHⅠ 단편을 엔도뉴클레아제 HgaⅠ으로 더 분해시킨다. 이러한 분해로 성숭한 데설파토히루딘에 대한 완전한 암호화 서열을 함유하는 198bp HgaⅠ-BamHⅠ 단편이 생성된다. 추가의 AluⅠ 분해는 198bp HgaⅠ-BamHⅠ 단편에 영향을 미치지 않으나 유사한 크기의 다른 HgaⅠ 단편이 제거된다.
0.2kb HgaⅠ-BamHⅠ 단편을 TBE 완충액중 1.5% 아가로스겔 상에서 다른 단편과 분리시키고, 전기용출로 분리한다(전술한 바와 같다). DNA를 DE 52 이온 교환 크로마토그래피로 정제하고 에탄올 침전시킨다. DNA를 30μg/ml(0.2pmole/ μl)의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
(b) 일부의 PH05 시그날 서열을 사용한 PH05 프로모터 영역의 분리
플라스미드 p31/PH05-TPA 18(유럽 특허원 제143,081호)는 PH05 프로모터를 가지며 PH05 시그날 서열은 이종 구조 유전자(t-PA)에 융합된다. 584bp BamHⅠ-BalⅠ단편은 PH05 프로모터와 모든 PH05 시그날 서열을 함유하나, 3' 말단에 8개의 뉴클레오타이드는 함유하지 않는다.
8μg의 p31/PH05-TPA 18 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 BalⅠ으로 분해한다(16시간 동안 37℃에서). DNA를 페놀/클로로포름 추출하고 에탄올 침전시켜 정제한다. DNA를 0.7mg/ml의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
PH05 시그날 서열 및 데설파토히루딘에 대한 암호화 영역 사이의 정확한 연결부는 다음 서열의 합성 링커에 의해 제공된다.
(1) 5'-CCAATGCA-3'
(2) 3'-GGTTACGTCAACA-5'
링커(5'-CCAATGCA)의 5'-말단에 있는 8개의 뉴클레오타이드는 BalⅠ 부위로부터 프로세싱 부위까지 PH05 시그날 서열의 일부를 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드(2)의 5'에 달려 있는 5개 뉴클레오타이드 데설파토히루딘 암호화 서열의 5'-말단에서 HalⅠ절단 부위에 맞추어진다.
개개의 일본쇄 올리고뉴클레오타이드(1) 및 (2)를 포스포트리에스테르 방법(Itakura et al., 상기)에 의해 합성한다. 각각 1.1μg 및 1.8μg의 올리고뉴클레오타이드(1) 및 (2)는 이의 5'-말단에서 개별적으로 인산화하고 동몰량으로 혼합한 다음 실시예 51에 기재된 대로 어닐링시킨다.
1.3μg(200pmoles)의 인산화된 이본쇄 링커 DNA를 15℃에서 16기간동안 40μl의 60mM 트리스 HCl pH7.5, 10mM MgCl2, 3.5mM ATP, 5mM DTT 및 1400 단위의 T4DNA 리가제(Biolabs)중에서 7μl(1.8pmoles)의 BalⅠ로 절단한 p31-PH05-TPA18에 연결시킨다. 85℃에서 10분간 리가제를 불활성화시킨다. 과량의 링커를 10mM EDTA 300mM 아세트산 나트륨 pH 6.0 및 0.54 용적의 이소프로판올 존재하에 DNA 침전에 의해 제거한다. DNA를 재현탁시키고, 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ로 더 분해시킨다. 페놀/클로로포름으로 DNA를 추출하고, 에탄올 침전시킨 후 두가지 제한단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중에서 1.2% 아가로스겔 상에서 분리한다. 0.6kB 단편을 겔로부터 분리한다. DNA를 전기 용출시키고 DE 52 이온 교환 크로마토그래피 및 에탄올 침전으로 더 정제한다. 0.6kb BamHⅠ-HgaⅠ 단편을 40μg/ml의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
(c) pJDB207 효모 벡터 단편의 분리(제8도 참조)
9μg의 플라스미드 pJDB207R/PH05-TPA(12-12) DNA(유럽 특허원 제143,081호 참조)를 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ으로 분해시킨다. 완전히 분해한 후, DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시킨다. DNA를 50mM 트리스·HCl pH8.0에 0.1mg/ml의 농도로 재현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 7단위의 송아지 장내 알카리성 포스파타제로 분해시킨다. 포스파타제를 65℃에서 1.5시간 동안 불활성화시키고 DNA를 DE 52 이온 교환 크로마토그래피(실시예 5Ⅰ 참조) 및 에탄올 침전으로 정제한다. 6.8kb의 큰 BamHⅠ 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH8.3에서 1.2% 아가로스겔 상에서 분리한다.
DNA를 전기용출시키고 DE 52 이온 교환 크로마토그래피 및 메탄올 침전시켜 정제한다. DNA를 0.4mg/ml(0.1pmoles/ μl)의 농도로 H2O에 용해시킨다.
(d) pJDB207 효모 벡터 단편에 PH05 프로모터 단편 및 데설파토하루딘 구조 유전자의 연결(제8도 참조)
pJDB207 효모 벡터, 즉 PH05 시그날 서열 및 데설파토히루딘 구조 유전자를 함유하는 PH05 프로모터 단편을 발현 플라스미드를 형성시키기 위해 연결시킨 DNA 단편(실시예 5Ⅱa-c)으로서 분리한다.
0.3pmoles의 p31/PH05-TPA 18의 0.6kb BamHⅠ-HgaⅠ 단편 및 0.3pmoles의 pML 301L의 0.2kb HgaⅠ-BamHⅠ 단편을 10μl의 60mM 트리스 HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM ATP 및 400단위의 T4 DNA 리가제중 15℃에서 20시간 동안 pJDB207R/PH05-TPA(12-2)의 0.1pmoles의 6.8kb BamHⅠ 단편에 연결시킨다.
1μl의 연결 혼합물을 하나한(Hanahan)에 따라 제조한 100μl의 형질전환 캄피턴트 이. 콜라이 HB101세포에 가한다. 형질전환 원안은 상기 기재한 문헌의 것을 채택한다. 세포를 50μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 평판상에 도말한다.
24ampK콜로니를 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB배지에서 개별적으로 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 PatⅠ으로 절단시킴으로써 삽입물의 크기 및 배향을 분석한다. 정배향의 삽입물을 함유하는 단일 클론을 pJDB207/PH05-HIR로 명명한다.
(Ⅲ) 플라스미드 pJDB207/PH05(Eco)-HIR의 제조(제9도 참조)
PH05 시그날 서열(플라스미드 pJDB207/PH05-HIR내의)를 포함하는 데설파토히루딘의 암호화 영역에 UAS(PH05)-GAPDH 하이브리드 프로모터 요소를 편리하게 결합시키기 위해, EcoRⅠ 제한 부위를 mRNA 출발부위와 암호화 영역의 ATG 사이의 5' 비해독 영역에 도입시킨다.
15μg의 플라스미드 pJDB207/PH05-HIR을 제한 엔도뉴클레아제 DraⅠ(Boehringer)로 분해시킨다. 생성된 4개 단편을 트리스-보레이트 EDTA 완충액 pH 8.3중에 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 4.2kb DNA 단편을 겔로부터 회수하고 전기용출후 에탄올로 침전시킨다. DNA를 0.6mg/ml의 농도로 H2O중 재현탁시킨다.
다음 구조식의 합성 올리고뉴클레오타이드(각각 2.3μg 및 2.9μg)을 각각 20μl의 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM ATP 및 20U의 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer)중에서 키나제화시킨다.
5'-AATTCGATTACCAATGTTT-3'
3'- GCTAATGGTTACAAA-5'
37℃에서 45분 후, 두 반응 혼합물을 합하고 75℃로 10분간 가열한 다음 실온까지 냉각시킨다. 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 링커를 -20℃에서 보관한다.
6.5μl(2.3pmoles)의 4.2kb DraⅠ DNA 단편을, 50μl의 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 800U의 T4DNA 리가제(Biolabs)중에 70배 과량의 활성화되고 어닐링된 올리고 뉴클레오타이드 링커와 함께 15℃에서 16시간 동안 배양한다. 85℃에서 10분 동안 T4 DNA 리가제를 불활성화한 후, 10mM EDTA, 300mM 나트륨-아세테이트 pH 6.0 및 0.54 용적의 이소프로판올의 존재하에 DNA를 침전시켜 과량의 링커를 제거한다. DNA를 EcoRⅠ및 HindⅢ로 분해한다. 생성되는 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중의 1% 아가로스겔 상에서 분리한다. 643bp 단편을 전기용출 및 에탄올 침전에 의해 겔로부터 회수한다. DNA를 0.1pmoles/ μl의 농도로 재현탁시킨다. EcoRⅠ-HindⅢ 단편은 PH05 시그날 서열; 데설파토히루딘의 암호화 서열 및 PH05 전사 터미네이터를 함유한다.
543bp PH05 프로모터 단편을 플라스미드 p31/R로부터 분리한다(유럽 특허원 제100,561호).
10μg의 p31/R을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRⅠ 및 BamHⅠ으로 분해시킨다. 생성되는 3단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중 0.6% 저 용융 아가로스겔 상에서 분리한다. mRNA 출발 부위를 포함하는 PH05 프로모터를 함유하는 543bp BamHⅠ-EcoRⅠ단편을 분리한다.
벡터 단편을 플라스미드 pJDB207/PH05-HIR로 부터 분리한다. 6μg의 상기 플라스미드를 BamHⅠ 및 HindⅢ로 분해한다. 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중 0.6% 저용융 아가로스겔 상에서, 큰 6.5kb BamHⅠ-HindⅢ 단편을 소단편들과 분리한다.
점성 말단을 갖는 상기의 세가지 DNA 단편을 다음의 반응으로 연결시킨다. 0.2pmoles(70ng)의 543bp BamHⅠ-EcoRⅠ PH05 프로모터 단편, 0.2pmoles(85ng)의 643bp EcoRⅠ-HindⅢ 단편(히루딘 암호화 서열) 및 0.1pmole(0.4μg)의 6.5bp BamHⅠ-HindⅢ 벡터 단편을 15℃에서 6시간동안 10μl의 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM, DTT, 1mM ATP 및 400U의 T4리가제 중에서 연결시킨다. 1μl의 연결 혼합물을 100μl의 칼슘 처리된 형질전환 캄피턴트 이. 콜라이 HB 101 세포에 가한다.
12개의 형질전환된 ampR콜로니를 각각 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 홀름등의 방법[Anal, Biochem. 114(1981) 193]에 따라 제조하고 EcoRⅠ 및 BamHⅠ 제한 분해에 의해 분석한다. 기대하는 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 분리하여 pJDB207/PH05(Eco)-HIR로 명명한다.
(Ⅳ) 데설파토히루딘의 단백질 암호화 영역에 UASI (PH05)-GAPDH 하이브리드 프로모터의 연결
15μg의 플라스미드 pJDB207/PH05(Eco)-HIR을 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 분해한다. DNA 단편을 트리스-보레이트 EDTA 완충액 pH 8.3중 1% 아가로스겔 상에서 분리한다. 643bp 단편을 겔로부터 분리하고 전기용출하여 에탄올로 침전시킨다. DNA를 0.1pmoles/ μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
6μg의 플라스미드 pJDB207/PH05-HIR을 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ 및 SalⅠ으로 완전히 분해한다. 큰 6.3kb 단편(벡터부위)를 연성 아가로스겔 전기영동, 페놀추출 및 에탄올 침전으로 분리한다. 벡터 DNA 단편을 0.05pmoles/ μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
10μg의 플라스미드 pGAPDH-EL(실시예 3dⅠ 참조)를 BalⅡ 및 EcoRⅠ으로 분해한다. 266bp BalⅡ-EcoRⅠ 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중 1.2% 아가로스겔 상에서 분리하고 겔로부터 전기용출시키고 에탄올로 침전시킨다. DNA를 0.3pmoles/ μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
0.3pmoles의 UAS1(PH05)를 함유하는 548bp SalⅠ-BalⅡ 단편, 0.3pmoles의 pGAPDH-EL의 643bp EcoRⅠ-HindⅢ 단편, 0.3pmoles의 pJDB207/PH05(Eco)-HIR의 643bp EcoRⅠ-HindⅢ 단편 및 0.12pmoles의 6.3kb SalⅠ-HindⅢ 벡터 단편을 20μl의 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM ATP 및 400U의 T4DNA 리가제(Biolabs)중에서 15℃에서 6시간 동안 연결시킨다. 연결 혼합물 1μl 및 3μl를 칼슘 처리된, 이. 콜라이 HB101 세포 100μl에 가한다. ampR콜로니로부터 플라스미드의 분리 및 SalⅠ, BalⅡ, EcoRⅠ 및 HindⅢ를 사용하는 제한분석은 전술한 바와 같이 수행한다(실시예 3dⅢ 참조). 하나의 양성 클론을 선별하여 pJDB207/PALPEL-HIR(UAS1)으로 명명한다. pGAPDH-FL로부터 분리된 201bp BglⅡ-EcoRⅠ 단편으로 유사한 작제를 수행한다. 하나의 선별된 플라스미드를 pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1)으로 명명한다.
(Ⅴ) 데설파토히루딘의 단백질 암호화 영역에 UAS1(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH 하이브리드 프로모터의 연결
각각 3μg의 플라스미드 pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) 및 pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1)을 BglⅡ으로 분해시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후, DNA의 3'-오목한 말단을 마니아티스의 방법에 따라 이. 콜라이 DNA 폴리머라제(클레나우 단편: Bethesda Research Laboratories)와 반응시켜 충진한다. 70℃에서 10분간 효소를 불활성화시킨다. SalⅠ으로 DNA를 더 분해하고 연성 아가로스겔 전기영동, 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 큰 7.2kb 단편을 분리한다. 각 단편을 0.05pmoles/ μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다. 이 단편은 히루딘 암호화 영역, 대부분의 벡터 서열 및 pGAPDH-EL 또는 pGAPDH-FL로부터 분리된 두가지 서로 다른 GAPDH 프로모터 요소중 하나를 함유한다.
플라스미드 p31/Y(유럽 특허원 제100,561호)를 BstEⅡ으로 분해시키고 전술한 바와 같이 이. 콜라이 DNA 폴리머라제(클레나우 단편)과 함께 배양한 다음 SalⅠ으로 절단한다. 649bp 단편을 연성 아가로스겔상에서 분리시키고, 페놀추출 및 에탄올 침전으로 회수한다.
UAS1-UAS2(PH05) 프로모터 요소를 함유하는 649bp 단편 0.3pmoles과 7.2kb 단편중 하나 0.15pmoles를 연결시키고 전술한 바와 같이 이. 콜라이 HB101에 형질 전환시킨다. 플라스미드는 ampR콜로니로부터 제조하며 제한 분해에 의해 분석한다. 단일 클론을 선택하고 이의 플라스미드 DNA를 pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS2) 및 pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)로 명명한다.
[실시예 6]
31bp DNA 서열은 포스페이트 조절 요소로서 작용하기에 충분하다.
두측면 결실 △10 및 △13으로 정의된(실시예 1f 참조) PH05 프로모터의 상부영역으로부터의 31bp 서열은(-381에서 -351위치) 조절서열을 함유할 수도 있다. 이는 다음 구조를 갖는 두가지 상보적 올리고뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하여 시험할 수 있다.
5'-AATTCGAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCAG-3'
3'- GCTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGTCTTAA-5'
상기 서열은 EcoRⅠ 제한 부위가 측면에 위치한 31bp 서열을 함유한다. EcpRⅠ 부위는 상기 서열을 쉽게 중합화시켜 멀티머가 형성되도록 한다.
(a) 벡터 LT 98내로 31bp 요소의 클로닝
50pmoles의 두 합성 올리고뉴클레오타이드를 20ml의 60mM 트리스 pH7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM ATP 및 20U의 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer) 중에 각각 키나제화시킨다. 37℃에서 45분 후, 두 반응 혼합물을 혼합하고 75℃에서 10분간 가열한 다음 실온까지 냉각시킨다. 어닐링된 올리고뉴클레오타이드를 -20℃에서 보관한다. 7.5pmoles의 키나제화되고 어닐링된 올리고뉴클레오타이드를 전술한 바와 같이 30분 동안 총용적 15μl 중에서 연결시킨다(실시예 5Ⅲ). 그 다음, 5μl의 EcoRⅠ 절단된 LT 98 벡터 DNA[Dixon et al. Gene 25, 189(1983)]을 가하고 (0.075pmole) 총 6시간 동안 배양한다. 이. 콜라이 HB 101로 형질 전환시킨 후 플라스미드를 분리하고 BamHⅠ으로 분해하여 분석한다. 이 분석결과 삽입물의 총 길이의 자료를 제공하며, 클론화된 EcoRⅠ 단편의 수를 측정할 수 있다. 1, 2, 3, 4 또는 5개의 EcoRⅠ 단편을 함유하는 개개의 플라스미드를 선택하였으며, DNA 서열화(생거 방법)로 다중 31bp 요소가 헤드 투 테일 배향으로 클론화됨이 지적되었다.
(b) pJDB207로의 클로닝
31bp 올리고머를 이의 상부에 GAPDH 프로모터를 삽입시킴으로써 이의 프로모터 조절작용에 대해 시험한다. 플라스미드 pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1)을 단축시켜 UAS1 요소가 제거된 플라스미드를 생성시킨다: 이 플라스미드를 SalⅠ 및 BalⅡ로 분해하고, 겔 정제한 후, 큰 벡터 단편을 분리한다. 별도의 반응 혼합물에서 상기 플라스미드를 BamHⅠ으로 분해시킨다. 오목한 3' 말단을 모든 네가지 dNTP를 사용하여 클레나오 DNA 폴리머라제로 충전한다. 평활말단 부위를 인산화된 BalⅡ 링커(CAGATCTG, Biolabs)로 연장시키고, SalⅠ 및 BglⅡ로 분해시킨후, 약 400bp의 DNA 단편을 겔 정제로 분리시킨다. 큰 벡터 단편을 T4DNA 리가제를 사용하여 약 400bp의 SalⅠ-BglⅡ 단편과 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101을 형질전환시킨 후, 분리한 플라스미드는 PH05 UAS 부재하에 수득된다. 이 플라스미드를 pJDB207/GAPFL-EGL로 명명한다. 이 플라스미드를 BalⅡ로 분해하고 31bp 올리고머를 클로닝하기 위한 벡터로서 제공한다. 1, 2, 3, 4 또는 5개의 올리고뉴클레오타이드 삽입물을 함유하는 LT 98은 BamHⅠ으로 분해한다. 여러가지 크기의 단편을 겔정제로 분리하고 BglⅡ로 절단한 pJDB207/GAPFL-EGL에 연결시킨다. 연결 혼합물을 BglⅡ로 분해하여 DNA 삽입물이 함유되지 않은 불필요한 재연결된 벡터를 제거한 다음 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키는데 사용한다. 수득한 플라스미드를 SalⅠ 및 Dral(GAPDH 프로모터 부분내의 부위)로 제한 분석하여 분석한다. 효모 균주 GRF 18을 형질전환시킨 후, 에글린 C 역가를 실시예 4C에 기재된 방법에 따라 측정한다. 다음의 특정 활성은 발효 46시간 후에 측정한다.
Figure kpo00018
* → PH05 프로모터에서와 같은 배향
← PH05 프로모터의 역배향
[실시예 7]
PAPFL 프로모터로부터 인슐린형 성장인자 1(IGF-1)의 발현
유럽 특허원 제123,228호에 기재된 플라스미드 pAB113-IGF-1을 PstⅠ으로 분해한다. 다음 서열의 각각 두개의 합성 올리고뉴클레오타이드(50pmol)을 전술한 바와 같이 키나제화하고 어닐링시킨다.
Figure kpo00019
어닐링된 이본쇄 어뎁터를 Pst1으로 절단된 플라스미드에 연결시키고 EcoRⅠ 및 BamHⅠ으로 분해시킨 다음 겔 정제하여 약 800bp EcoRⅠ-BamHⅠ 단편을 분리한다. 플라스미드 pJDB207/PAPFL-EGL(UAS1)을 SalⅠ 및 EcoRⅠ으로 분해하고 겔 정제하여 약 700bp단편을 분리한다. 3중 연결에 있어, 0.5μg의 플라스미드 pCl/1(유럽 특허원 제123,228호; BamHⅠ및 SalⅠ으로 분해; 벡터 겔정제)를 각각 100ng의 두개의 작은 유전자 및 프로모터 부분과 연결시킨다. 이. 콜라이드를 형질전환시킨 후, 플라스미드를 EcoRⅠ, BamHⅠ 및 SalⅠ 분해에 의해 분석한다. 효모 균주 AB 103[ATCC 제 20,673호로 기탁되었음; 복합 배지에서 밤새 효모 세포를 성장시키고 개개의 콜로니에 대해 문헌의 기재대로 콜로니 하이브리드화에 의해 IGF-1 플라스미드의 존재여부를 시험하여 pYIGF-1-10/1을 성장정지시킴; Hinnen et al. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]를 형질전환시켜, 방시 표지된 IGF-1를 사용하는 통상의 경쟁적 방사면역 분석으로 측정된 바와 같이 유발된(저 Pi) 조건(1mg/ℓ)하에 단지 IGF-1를 생성시키는 형질 전환체를 수득한다[Anderson et al., in; Somatomedins/Insulin-Like Growth Factor, Spencer, E. M., ed., Walter de Gruyter, Berlin]. 이 클론을 pCl/1/PAPFL IGF-1(UAS1)으로 명명한다.
[실시예 8]
PH05-GAPDH 하이브리드 프로모터 조절하에 조직 플라스미노겐 활성자(t-PA)의 발현
12μg의 플라스미드 pJDB207/PH05-TPA 18(유럽 특허원 제143,081호)를 제한 엔도뉴클레아제 SalⅠ 및 HindⅢ으로 완전히 분해한다. 생성되는 두개의 DNA 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3에 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 작은 2.6kb SalⅠ-HindⅢ 단편을 전기용출시키고 페놀 추출한 다음 에탄올 침전시켜 분리한다. DNA를 BalⅠ으로 더 분해한다. PH05 시그날 서열 일부, t-PA의 암호화 서열 및 PH05 터미네이터요소를 함유하는 1.8kb 단편을 분리하고, 상기와 같이 정제한 다음 0.1pmoles/ μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
하이브리드 프로모터 단편을 플라스미드 pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)에서 분리한다(실시예 5V 참조). 12μg의 플라스미드 DNA를 SalⅠ 및 HindⅢ로 분해한다. 생성되는 1.5kb 단편을 BalⅠ으로 더 분해한다. 하이브리드 프로모터와 PH05 시그날 서열 일부를 포함하는 920bp 단편을 1.5% 이가로스겔상에서 분리한다. DNA를 전기용출시키고 페놀 추출한 다음 에탄올로 침전시키고 0.1pmoles/ μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
0.2pmoles의 920bp SalⅠ-BalⅠ 단편, 0.2pmoles와 1.8kb BalⅠ-HindⅢ 단편 및 0.1pmoles의 SalⅠ, Hind 절단된 벡터 pJDB207을 총 부피 10μl중 15℃에서 16시간 동안 연결시킨다. 1μl의 연결 혼합물을 100μl의 칼슘 처리된 형질전환 캄피턴트 이, 콜라이 HB101 세포에 가한다.
형질전환된 ampR콜로니 12개를 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 각각 성장시킨다. 홀름등의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 제조한다[Anal-Biochem. 114, 193(1981)], PstⅠ 및 BamHⅠ/EcoRⅠ 제한분해하여 분석한다. 기대하는 제한단편을 갖는 하나의 클론을 분리하여 pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1+PAS2)로 명명한다.
UAS1(PH05) 요소에 대해서 유사한 작제를 수행한다. pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1)의 820bp SalⅠ-BalⅠ 단편(실시예 5Ⅳ)을 분리하고, 1.8kb BalⅠ-HindⅢ 단편 및 SalⅠ, HindⅢ 절단된 벡터에 연결시킨다. 생성되는 플라스미드를 pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1)으로 명명한다.
pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) 또는 pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)로부터 분리한 상응하는 단편으로 유사한 작제가 이루어진다(실시예 5). 생성되는 플라스미드를 pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1) 및 pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1+UAS2)로 명명한다.
[실시예 9]
PH05-GAPDH 하이브리드 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드의 발현
(a) 사카로마이세스 세레비지에 GRF 18의 형질전환
사카로마이세스 세레비지에 균주 GRF 18(α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112)를 한넨 등에 의해 기술된 형질전환 원안을 사용하여 다음의 플라스미드로 형질전환시킨다[Proc. Natl. Acal. Sci. USA 75 1929(1978)]
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1)
pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1)
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS2)
pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)
pJDB207/PAPFLⅠ(+)-EGL
pJDB207/PAPFLⅠ(-)-EGL
pJDB207/PAPFLⅡ(+)-EGL
pJDB207/PAPFLⅢ(-)-EGL
pJDB207/PAPFLⅣ(+)-EGL
pJDB207/PAPFLⅤ(-)-EGL
pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1)
pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1)
pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1+UAS2)
pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1+UAS2)
pCl/l/PAPFL-IGF-1(UAS1)
형질전환된 효모세포를 로이신이 결핍된 효모 최소 배지에서 선택한다. 단일 형질 전환된 효모 콜로니를 분리하여 다음과 같이 명명한다.
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS2)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPEL(+)-EGL
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFLⅠ(-)-EGL
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFLⅡ(+)-EGL
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFLⅢ(-)-EGL
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFLⅣ(+)-EGL
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFLⅤ(-)-EGL
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPEL-TPA(UAS1+UAS2)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFL-TPA(UAS1+UAS2)
사카로마이세스 세레비지에 GRF18/pJDB207/PAPFL-IGF-1(UAS1)
(b) 형질전환체의 발효
에스 세레비지에 GRF 18 형질전환체의 세포를 30℃에서 24시간 동안 진탕시키며, 50ml 삼각 플라스크 중에서 3×107세포/ml의 밀도가 될때까지 10ml의 효모 최소 배지(2% 글루코스 20mg/ℓ L-히스티딘을 가하고 아미노산이 없는 Difco 효모 질소배지)에서 성장시킨다. 세포를 0.9% NaCl로 세척하고, (NH4)2SO2, 2% 글루코스 및 1g/ℓ L-히스티딘 대신 0.03g/ℓ KH2PO4. 1g/ℓ KCl 및 10g/ℓ L-아스파라긴을 함유하는 디프코 효모 질소 염기 배지(아미노산 부재)의 방법에 따라 제조된 50ml의 저 Pi 최소 배지에 접종시킨다. 배양액은 4×106세포/ml의 세포밀도가 될때까지 접종시키고, 30℃에서 42시간 이내에 200회/분으로 진탕시킨다.
(c) 발현된 유전자 생성물의 역가
효모 배양 브로쓰내로 데설파토히루딘 화합물을 분비한다. 22시간 동안 발효시킨 후, 배양 배지로부터 10m의 표본을 채취하고, Bond Elut C-18 칼럼(1ml, Analytichem International)상에서 탈염 및 농축시켜 단백질을 강화시킨다. 컬럼을 1.5ml 물-아세토니트릴(9:1)-0.1% 트리플루오로아세트산으로 2회 세척한다. 데설파토히루딘 화합물을 물-아세토니트릴 -0.1% 트리플루오로아세트산(6:4 v/v)으로 컬럼으로부터 용출시킨다. 2ml의 용출물을 스피드 백 농축기(Speed Vac concentrator, savant)에서 최종 용적 400μl까지 농축시킨다. 이 데설파토히루틴을 HPLC 분석으로 실제 데설파토히루딘과 비교하고 트롬빈 억제 검정으로 확인한다[참조: M.U. Bergmeyer(ed), Method in Enzymatic Analysis, vol, Ⅱ, p314-316, Verlag Chemie, Weinheim(FRG) 1983].
결과는 표 1에 나타내었다.
[표 1]
서로 다른 플라스미드로 형질전환된 에스 세레비지에 균주 GRF 18에 의해 배양 브로쓰내로의 데설파토히루딘의 분비
Figure kpo00020
조직 플라스미노겐 활성자(t-PA)를 효모 세포내에 축적시킨다. 세포 추출물을 제조하고, t-PA 활성을 다음과 같이 측정한다. 세포밀도 1 내지 2×107/ml에서 35ml의 저 Pi 배양 배지로부터의 세포[B.Meyhack et al. EMBO-J. 1, 675(1982)]를 소르발 SS 34 회전기에서 10분간 300rpm으로 원심 분리시켜 수집한다. 세포를 배양 배지(아미노산, 글루코스, 비타민, 미량원소가 없는)의 염 성분을 함유하는 완충액에서 세척한다. 세포를 실온에서 5분간 3000rpm으로 원심 분리한다. 침적된 세포를 총 용적 4ml의 냉 66mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4 및 0.1%(v/v) 트리톤 X-100중에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 30ml의 Corex 튜브에 옮기고, 8g의 유리 비드(직경 0.4mm)를 가한 다음 현탁액을 최대 속도로 4분간 혼합기[Vortex Mixer(Scientific Instruments Inc., USA)]상에서 진탕시킨 다음 빙욕에서 냉각시킨다. 이 과정에서 90% 이상의 세포가 파괴된다. 세포 잔사 및 유리 비드를 소르발 HB-4 회전기에서 10분 동안 8000rpm으로 4℃에서 원심분리하여 침전시킨다. 상등액을 에펜도르프 튜브에 옮기고 액체 질소하에서 냉각시킨 다음 -60℃에서 보관한다:
약간 수정한 랜비(Ranby)의 방법[BioChim. Biophys. Acta 704, 461(1982)]에 따라 t-PA 활성을 측정한다. 기질로서 D-Val-Leu-Lys-pNA(Kabi -2251)을 사용한다. 405nm에서의 흡수를 비특이 절단을 위해 보정시키고 우로키나제 표준과 비교한다. 이 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
상이한 플라스미드로 형질전환시킨 에스 세레비지에 균주 GRF 18중의 t-PA 활성
Figure kpo00021
[실시예 10]
형질전환된 효모 균주로부터 IGF-I의 분리 및 특성
(a) 배양 배지로부터 IGF-1의 분리
효모 균주 pCl/ℓ/PAPFL-IGF-1(UAS1)을 60시간 동안 배양시킨다. 3ℓ의 배양액을 거두어, 실시예 9에 기재된 대로 원심분리한다. 2ml의 상등액(1:10농도)을 역상 HPLC에 의해 분석하여 1mg/ℓ IGF-1의 역가를 수득한다. 상등액을 20ml SP-세파덱스 C-25(Pharmacia)로 pH3.0에서 처리하고 60분간 동안 4℃에서 교반시킨다. 흡수된 IGF-1을 세척한 수지로부터 아세트산 나트륨 완충액 구배(50mM, pH 3.0 내지 pH9.0)으로 용출시키고 두 단계의 이온교한에 의해 더 정제한다: 1단계는 CM-52 컬럼(Whatman, 1.5cm×8.5cm, 구배, 완충액 A 20mM NH4OAc pH 4.0:완충액 B 100mM NH4OAc pH6.8)상에서 수행한다. 제2단계는 DE-53 음이온 교환 컬럼(Whatman)상에서 수행한다(조건:1.5cm×10.5cm 컬럼: 유속 1ml/분, 구배, 완충액 A 20mA NH4OAc pH9.0; 완충액 B 200mM NH4OAc pH6.5). 최종 정제는 반예비적 RP-HPLC 컬럼상에서 수행한다. 활성 분획을 보유시간 21.3분으로용출시켜 1.1mg의 95% 순수 IGF-1을 수득한다.
실험조건: Vydac 218TP 510RP-HPLC 컬럼, 10×250min:매 분리시 분취량(1:10으로 농축된 200μl):220nm에서 UAFS 0.5:유속:3ml/분, 용출제:A:0.1% 트리플루오로아세트산, B:아세토니트릴/물 8:2+0.07% 트리플루오로아세트산, 3분간 35% B로 용출시킨 다음 30분간 45% B까지 증가시킨다. 생성 분획을 물로 1:1 희석시킨 다음 동결건조한다.
(b) 균주 pCl/ℓ/PAPFL-IGF-1(UAS1)의 발효로부터 IGF-1의 특성화
RP-HPLC 분석에 따라 배양 배지로부터 분리한 IGF-1은 혈청으로부터 실제 IFG-1과 동일하다. 등전점 pI:8.6
아미노산 조성의 측정
약 2.5μg의 순수한 IGF-1을 110℃에서 6N HCl로 24시간 동안 가수분해한 창(Chang)등의 기재에 따라 분석한다[DABS-Cl법: Method in Enzymology 91, 41(1983)].
가수분해물은 다음의 조성을 갖는다.
Figure kpo00022
부분시열 분석
70μg(10nmole)의 순수한 IGF-1을 에드만(Edman)에 따른 통상의 서열분석으로 분서간다. N-말단의 PTH-아미노산을 RP-HPLC로 측정한다.
결과:
Figure kpo00023
n.d:측정하지 않았음
·:Cys(6) 및 Cys(18)을 요오드 아세트아미드로 카복시메틸화에 의해 별도로 측정하였다.
그 결과 아미노산 1 내지 50의 부분서열을 실제 IGF-1의 공개된 일차서열과 동일하였다.
C-말단의 분석
순수한 IGF-1을 카복시펩티다제 Y로 분해하고, 방출된 아미노산을 아미노산 분석기로 측정한다(비교, J.Y.Chang, R. Knedel, D. G Braun, Biochem. 199. 547)
결과:
아미노산 70
5분 분해:Ala
120분 분해: Ser-Ala
겉보기 분자량
IGF-1(30μg)을 SDS 우레아 겔 상에서 분석한다:[SUDS겔: 비교, Kyte et al., Anal Biochem. 133, 515(1983)].
겉보기 분자량 6000 내지 7000달톤에 상응하는 단일 밴드가 관찰된다.
FAB-MS에 의한 분자량 측정
IGF-1을 FAB-MS(fast atom bombardment postive ion mass spectrometry)에 적용한다. 장치:VG-Analytical Ltd. Manchester의 ZAB-HF 질량 분광분석기: 매트릭스:티오글리세롤:크세논 포격; 이온 에너지 3Kev: 외부 구경:
Cs30J29(분자량 7667.4)
실험식:C33H518N94O101S7
분자량(계산치):7648.71
분자량(실험치):7648.07

Claims (39)

  1. PH05 유전자를 함유하는 DNA, PH05 유전자 또는 그의 5' 종결부를 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 임의로 이 단편을 생성될 아단편의 UAS 기능이 보유되는 방식으로 엑소뉴클레아제로 짧게 만들며, 이러한 단편 또는 아단편을 분리하거나, 또는 화학적 DNA 합성법으로 상기 DNA 단편 또는 아단편을 제조함을 특징으로 하여, UAS1(PH05) 및/또는 UAS2(PH05) 서열을 함유하는 DNA 단편 및 UAS 기능이 보유된 그의 아단편을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, PH05 유전자를 함유하는 DNA, PH05 유전자 또는 그의 5' 종결부를 제한 엔도뉴 클레아제 BamHⅠ 및 BatEⅡ로 절단하고 단편을 분리함을 특징으로 하여, UAS1(PH05) 및 UAS2(PH05) 서열을 함유하는 효모 PH05 유전자 5' 영역의 368bp BamHⅠ-BstEⅡ 단편을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, PH05 유전자를 함유하는 PH05 유전자, PH05 유전자 또는 그의 5' 종결부를 제한 엔도뉴 클레아제 BamHⅠ 및 ClaⅠ으로 절단하고 단편을 분리함을 특징으로 하여, UAS1(PH05)를 함유하는 효모 PH05 유전자 5' 영역의 268bp BamHⅠ-ClaⅠ 단편을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하기 서열의 DNA를 화학적 DNA 합성법으로 합성하고, 이로써 생성된 DNA에 합성 링커 서열을 임의로 제공함을 특징으로 하여, 하기 서열의 DNA를 제조하는 방법.
    GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
    CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT
  5. 제1항에 있어서, PH05 유전자를 함유하는 DNA, PH05 유전자 또는 그의 5' 종결부를 제한 엔도뉴 클레아제 ClaⅠ 및 BstEⅡ로 절단하고 단편을 분리함을 특징으로 하여, UAS2(PH05)를 함유하는 효모 PH05 유전자 5' 영역의 100bp ClaⅠ-BstEⅡ 단편을 제조하는 방법.
  6. 효모 PH05 유전자의 상부 활성 부위(들)를 함유하는 5' 상부 프로모터 요소를, 작용성 TATA 박스를 포함하고 해독 개시 코돈에 근접하여 종결하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소에 연결시킴을 특징으로 하여, 효모 PH05 유전자의 상부 활성 부위(들)를 포함하는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하고 해독 개시 코돈에 근접하여 종결하는 전사 개시 부위를 포함하는 효모 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 효모 PH05 유전자의 5' 상부 프로모터 요소를 효모 GAPDH 유전자의 3' 하부 프로모터 요소에 연결시킴을 특징으로 하여, 효모 PH05 유전자의 상부 활성 부위(들)을 포함하는 5' 상부 프로모터 요소, 및 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -300 내지 -180에서 개시하고 뉴클레오타이드 -1에서 종결하는 효모 GAPDH 유전자의 3' 하부 프로모터 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 5' 상부 프로모터 요소가 효모 PH05 유전자 5' 영역의 368bp BamHⅠ-BstEⅡ 단편인 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  9. 제6항에있어서, 5' 상부 프로모터 요소가 효모 PH05 유전자의 5' 영역의 268bp BamHⅠ-ClaⅠ 단편인 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 5' 상부 프로모터 요소가 효모 PH05 유전자 5' 영역의 100bp ClaⅠ-BstEⅡ 단편인 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 5' 상부 프로모터 요소가 하기 서열의 31bp DNA인 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
    GAAATATATATTAAATTAGCACGTTTTCGCA
    CTTTATATATAATTTAATCGTGCAAAAGCGT.
  12. 제6항에 있어서, UAS1(PH05) 및 UAS2(PH05)를 함유하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  13. 제6항에 있어서, UAS1(PH05)를 함유하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  14. 제6항에 있어서, UAS1(PH05)를 함유하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  15. 제6항에 있어서, 3' 하부 프로모터 요소가 당분해 효소를 암호화하는 효모 유전자의 프로모터로부터 유도되는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  16. 제6항에 있어서, 3' 하부 프로모터 요소가 효모 GAPDH 유전자로부터 유도되는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  17. 제7항에 있어서, 3' 하부 프로모터 요소가 효모 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -199 내지 -1을 포함하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  18. 제7항에 있어서, 3' 하부 프로모터 요소가 효모 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -263 내지 -1을 포함하는 하이브리드 프로모터를 제조하는 방법.
  19. 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터를, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편에 연결하여 상기 DNA에 절편이 상기 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있게 하고, 생성된 하나 이상의 선형 DNA를 벡터 DNA에 임의로 도입시킴을 특징으로 하여, 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 효모 하이브리드 벡터를 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터를, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편에 연결하여 상기 DNA 절편이 상기 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있게 하고, 생성된 하나 이상의 선형 DNA를 벡터 DNA에 임의로 도입시킴을 특징으로 하여, 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -300 내지 -180에서 개시하고 뉴클레오타이드 -1에서 종결하는 효모 GAPDH 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 효모 하이브리드 벡터를 제조하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하이브리드 벡터가 1 내지 4개의 DNA 삽입물을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하이브리드 벡터가 1개의 DNA 삽입물을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하이브리드 벡터가 하이브리드 플라스미드 및 선형 DNA 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하이브리드 벡터가 고등 진핵 생물 기원의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 효모 하이브리드 프로모터가 접합부에 삽입된 ATG를 갖는 성숙한 폴리펩타이드의 암호화 영역에 직접 연결됨을 특징으로 하는 하이브리드 벡터의 제조방법.
  26. 제19항 또는 제20항에 있어서, 폴리펩타이드 암호화 영역이 시그날 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화 함을 특징으로 하는 하이브리드 벡터의 제조방법.
  27. 제19항 또는 제20항에 있어서, 이종 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 전사 개시 및 종결 시그날 및 해독 개시 및 정지 시그날과 함께 하기 하이브리드 벡터에서 하기 하이브리드 프로모터의 조절하에 위치시켜, 형질전환된 효모 균주에서 상기 폴리펩타이드를 발현시켜 폴리펩타이드를 생산시키도록 함을 특징으로 하여, 효모 하이브리드 프로모터 및 이종 폴리펩타이드를 암호화 하는 DNA 서열을 포함하는 효모숙주 균주에서 복제 및 표현형적 선별 가능한 하이브리드 벡터를 제조하는 방법.
  28. 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터로 효모 세포를 형질전환시킴을 특징으로 하여, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 생산할 수있는 형질전환된 효모 세포를 제조하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -300 내지 -180에서 개시하고 뉴클레오타이드 -1에서 종결하는 효모 GAPDH 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터 효모 세포를 형질전환시킴을 특징으로 하여, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 형질전환된 효모 세포를 제조하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 효모숙주로 사용함을 특징으로 하는 방법.
  31. 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 작용성 TATA 박스를 포함하여 전사 개시 부위를 포함하는 PH05 유전자 이외의 효모 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터를 형질전환시킨 효모 균주, 또는 그의 변이체를 배양하고 발현된 폴리펩타이드를 분리시킴을 특징으로 하여, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 효모 PH05 유전자의 UAS(들)를 갖는 5' 상부 프로모터 요소, 및 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드 -300 내지 -180에서 개시하고 뉴클레오타이드 -1에서 종결하는 효모 GAPDH 유전자의 3' 하부 프로모터 요소로 이루어진 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있는, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편을 각각 포함하는 하나 또는 다수의 DNA 삽입물을 함유하는 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 효모 균주, 또는 그의 변이체를 배양하고 발현된 폴리펩타이드를 분리시킴을 특징으로 하여, 효모에 이종인 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 효모 세포를 탄소, 질소, 무기염, 및 경우에 따라 필수 성장 촉진 물질의 동화원을 함유하는 액체 배지에서 배양함을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, DNA 서열이 고등 진핵 생물 기원의 폴리펩타이드를 암호화하는 방법.
  35. 제31항 또는 제32항에 있어서, DNA 서열이 사람 α-인터페론, 사람 하이브리드 인터페론, 사람 t-PA, HBVsAg, 데설파토히루딘, 에글린 C 및 인슐린형 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 방법.
  36. 제31항 또는 제32항에 있어서, 에글린 C를 생산하는 방법.
  37. 제31항 또는 제32항에 있어서, 데설파토히루딘을 생산하는 방법.
  38. 제31항 또는제32항에 있어서, 인슐린형 성장 인자를 생산하는 방법.
  39. 제31항 또는 제32항에 있어서, 효모 숙주가 사카로마이세스 세레비지에의 균주임을 특징으로 하는 방법.
KR1019860007214A 1985-08-29 1986-08-29 억제성 효모 프로모터의 제조방법 KR940011534B1 (ko)

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