JP2511251B2 - 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 - Google Patents
成熟インスリンの生産のための遺伝子系Info
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ハイブリドＤＮＡ技法は、遺伝子
の転写及び翻訳による所望のポリペプチド生成物の製造
を可能にする。ほとんどの場合、注目するポリペプチド
生成物は哺乳動物遺伝子に関連するが、宿主細胞の選択
はまず原核生物及び下等真核生物、例えば菌類、特に酵
母に向けられてきた。これは増殖及び遺伝的操作が簡単
なためである。所望のポリペプチドの効果的な産生を供
するＤＮＡ構成を形成するための方法の開発において
は、要求される通りにＤＮＡ断片を挿入しそして切り出
すことが可能な方法を開発しなければならない。
の転写及び翻訳による所望のポリペプチド生成物の製造
を可能にする。ほとんどの場合、注目するポリペプチド
生成物は哺乳動物遺伝子に関連するが、宿主細胞の選択
はまず原核生物及び下等真核生物、例えば菌類、特に酵
母に向けられてきた。これは増殖及び遺伝的操作が簡単
なためである。所望のポリペプチドの効果的な産生を供
するＤＮＡ構成を形成するための方法の開発において
は、要求される通りにＤＮＡ断片を挿入しそして切り出
すことが可能な方法を開発しなければならない。
【０００２】しばしば、種種の制御シグナル、複製系、
マーカー、及び注目する１又は複数の構造遺伝子が異る
分離源に由来する。従って、該当する配列中でエンドヌ
クレアーゼ切断、挿入及び切出しを可能にし、複数のＤ
ＮＡ断片を正しい方向に且つ適切な空間的関係において
配列せしめる方法を開発しなければならない。さらに、
目的とする構造遺伝子の効果的な転写、翻訳又は増加を
妨害するか又は妨害する可能性がある配列の存在を回避
しなければならず、又はこれらの配列が不利益な効果を
有しない場合にのみその存在が許される。
マーカー、及び注目する１又は複数の構造遺伝子が異る
分離源に由来する。従って、該当する配列中でエンドヌ
クレアーゼ切断、挿入及び切出しを可能にし、複数のＤ
ＮＡ断片を正しい方向に且つ適切な空間的関係において
配列せしめる方法を開発しなければならない。さらに、
目的とする構造遺伝子の効果的な転写、翻訳又は増加を
妨害するか又は妨害する可能性がある配列の存在を回避
しなければならず、又はこれらの配列が不利益な効果を
有しない場合にのみその存在が許される。
【０００３】ＤＮＡ構成の調製に関する方法のほかに、
制御シグナル及び発現生成物についてコードする配列の
選択、これらの個々の相互作用、宿主に対するこれらの
影響、宿主のエネルギーが目的ポリペプチドの産生に用
いられる効率、及びポリペプチド生成物の分離の容易さ
も考慮に入れられる。従って、特定のポリペプチドの製
造のための方法の個々の開発は、実験計画、手順の組織
化及び研究における知的な実践となる。
制御シグナル及び発現生成物についてコードする配列の
選択、これらの個々の相互作用、宿主に対するこれらの
影響、宿主のエネルギーが目的ポリペプチドの産生に用
いられる効率、及びポリペプチド生成物の分離の容易さ
も考慮に入れられる。従って、特定のポリペプチドの製
造のための方法の個々の開発は、実験計画、手順の組織
化及び研究における知的な実践となる。
【０００４】
【従来の技術】ヒト−インスリンのヒト−ＤＮＡ配列
は、Ｂｅｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２：５
２５−５２７に見出される。ラットの「プレ」−プロイ
ンスリンポリペプチド断片の細菌中での産生が米国特許
第４，３３８，３９７号に記載されている。Ｋｕｒｊａ
ｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ（１９８２）３
０：９３３−９４３は、成熟α−ファクターの４個のタ
ンデムコピーを含有するα−ファクター前駆体を予想
し、配列を記載しそしてプロセシング機構を仮定してい
る。
は、Ｂｅｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２：５
２５−５２７に見出される。ラットの「プレ」−プロイ
ンスリンポリペプチド断片の細菌中での産生が米国特許
第４，３３８，３９７号に記載されている。Ｋｕｒｊａ
ｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ（１９８２）３
０：９３３−９４３は、成熟α−ファクターの４個のタ
ンデムコピーを含有するα−ファクター前駆体を予想
し、配列を記載しそしてプロセシング機構を仮定してい
る。
【０００５】Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，
１９８１年におけるＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔの「Ａ Ｐｕｔ
ａｔｉｖｅ Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｅｃｕｒ
ｓｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕｒ Ｔａｎｄｅ
ｍ Ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ Ａｌｐｈａ
−Ｆａｃｔｏｒ」と題する要約紙は、α−ファクターに
ついてコードする配列、及びこれらの２個の配列の間の
スペーサーを記載している。米国特許第４，３３８，３
９７号の第３及び第４欄は有用な定義を与えており、こ
の定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
１９８１年におけるＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔの「Ａ Ｐｕｔ
ａｔｉｖｅ Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｅｃｕｒ
ｓｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕｒ Ｔａｎｄｅ
ｍ Ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ Ａｌｐｈａ
−Ｆａｃｔｏｒ」と題する要約紙は、α−ファクターに
ついてコードする配列、及びこれらの２個の配列の間の
スペーサーを記載している。米国特許第４，３３８，３
９７号の第３及び第４欄は有用な定義を与えており、こ
の定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
【０００６】
【発明の要約】酵母宿主中で「プレ」−プロインスリン
を産生せしめ、そしてプロセシングされた「プレ」−プ
ロインスリンを培地中に分泌せしめるための方法及び構
成が提供される。このＤＮＡ構成は種々の分離源に由来
するＤＮＡ配列を連結することによって形成され、この
構成は酵母宿主中で安定に複製されそしてプロセシング
された「プレ」−プロインスリンの栄養培地中への効率
的な高レベル産生をもたらす。他方、この生成物は高収
率で分離され得る。
を産生せしめ、そしてプロセシングされた「プレ」−プ
ロインスリンを培地中に分泌せしめるための方法及び構
成が提供される。このＤＮＡ構成は種々の分離源に由来
するＤＮＡ配列を連結することによって形成され、この
構成は酵母宿主中で安定に複製されそしてプロセシング
された「プレ」−プロインスリンの栄養培地中への効率
的な高レベル産生をもたらす。他方、この生成物は高収
率で分離され得る。
【０００７】
【具体的な説明】酵母宿主中で哺乳動物の「プレ」−プ
ロインスリンを効果的に産成し、そして「プレ」−プロ
インスリンをプロセシングする新規なＤＮＡ構成が提供
される。この構成は、哺乳動物「プレ」−プロインスリ
ンの転写及び翻訳、並びにこのポリペプチド生成物のプ
ロセシング及び培地への分泌をもたらす。
ロインスリンを効果的に産成し、そして「プレ」−プロ
インスリンをプロセシングする新規なＤＮＡ構成が提供
される。この構成は、哺乳動物「プレ」−プロインスリ
ンの転写及び翻訳、並びにこのポリペプチド生成物のプ
ロセシング及び培地への分泌をもたらす。
【０００８】従ってこの構成は、酵母宿主中で安定な保
持を可能にする複製系；効果的なプロモーター；プロイ
ンスリンについてのコード領域に連結されたリーダー及
びプロセシングシグナルを含有する構造遺伝子（このプ
ロインスリンについてのコード領域は分泌リーダー及び
プロセシングコード配列とリーディングフレームが一致
している）；及びこの構造遺伝子から下流に位置するタ
ーミネーター配列を含む。場合によっては、転写制御、
遺伝子の増幅、転写の外的制御等のための他の配列を有
することができる。
持を可能にする複製系；効果的なプロモーター；プロイ
ンスリンについてのコード領域に連結されたリーダー及
びプロセシングシグナルを含有する構造遺伝子（このプ
ロインスリンについてのコード領域は分泌リーダー及び
プロセシングコード配列とリーディングフレームが一致
している）；及びこの構造遺伝子から下流に位置するタ
ーミネーター配列を含む。場合によっては、転写制御、
遺伝子の増幅、転写の外的制御等のための他の配列を有
することができる。
【０００９】「プレ」−プロインスリン遺伝子とは、ヒ
ト−プロインスリンについてコードし、酵母宿主により
効率的に認識されるリーダ配列及びプロセシングシグナ
ルとリーディングフレームが一致している遺伝子を意味
する。すなわち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌
及びプロセシングシグナルを意味し、プロインスリン遺
伝子と共に天然に存在し天然のプレプロペプチドをプロ
インスリンにプロセシングするためのヒトの配列と区別
される。
ト−プロインスリンについてコードし、酵母宿主により
効率的に認識されるリーダ配列及びプロセシングシグナ
ルとリーディングフレームが一致している遺伝子を意味
する。すなわち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌
及びプロセシングシグナルを意味し、プロインスリン遺
伝子と共に天然に存在し天然のプレプロペプチドをプロ
インスリンにプロセシングするためのヒトの配列と区別
される。
【００１０】この構成の調製においては、個々の配列を
あらかじめ定められた順序で一緒にすることにより、存
在する複数の配列が各段階において妨害されそれらの機
能が不都合な影響を受けることがないこと、及び導入さ
れる各配列が他の配列との関係において適切に位置し、
これらの個々の機能が満たされ得ることを保証すること
が必要である。さらに、構成を有利に調製するためにア
ダプター分子を使用することができる。
あらかじめ定められた順序で一緒にすることにより、存
在する複数の配列が各段階において妨害されそれらの機
能が不都合な影響を受けることがないこと、及び導入さ
れる各配列が他の配列との関係において適切に位置し、
これらの個々の機能が満たされ得ることを保証すること
が必要である。さらに、構成を有利に調製するためにア
ダプター分子を使用することができる。
【００１１】使用されるプロインスリン遺伝子は染色体
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらを組合わせ
たものであってよい。プロインスリン遺伝子は哺乳動物
遺伝子であり、そして制御シグナル、リーダー及びプロ
セシングシグナル、並びに転写ターミネーターシグナル
は宿主に由来しそして宿主によって認識される配列であ
るであろうから、幾つかの配列をコネクター配列又はア
ダプター配列により連結するのが有用であろう。
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらを組合わせ
たものであってよい。プロインスリン遺伝子は哺乳動物
遺伝子であり、そして制御シグナル、リーダー及びプロ
セシングシグナル、並びに転写ターミネーターシグナル
は宿主に由来しそして宿主によって認識される配列であ
るであろうから、幾つかの配列をコネクター配列又はア
ダプター配列により連結するのが有用であろう。
【００１２】すなわち、制御部位を適切に選択すること
により、コード鎖の内側であり５′−末端近くの制限酵
素部位において切断し幾つかの塩基対が欠失したプロイ
ンスリン遺伝子を得ることができる。同様にして、リー
ダー及びプロセシングシグナル配列を、コード鎖の内側
であって３′−末端の近くの制限酵素部位で切断して多
数の塩基対を欠失せしめることができる。（特にことわ
らないかぎり、５′−及び３′−の標示はコード鎖につ
いて用いる。）アダプターがプロインスリン遺伝子の適
切なリーディングフレームをもたらすように制御部位が
選択される。
により、コード鎖の内側であり５′−末端近くの制限酵
素部位において切断し幾つかの塩基対が欠失したプロイ
ンスリン遺伝子を得ることができる。同様にして、リー
ダー及びプロセシングシグナル配列を、コード鎖の内側
であって３′−末端の近くの制限酵素部位で切断して多
数の塩基対を欠失せしめることができる。（特にことわ
らないかぎり、５′−及び３′−の標示はコード鎖につ
いて用いる。）アダプターがプロインスリン遺伝子の適
切なリーディングフレームをもたらすように制御部位が
選択される。
【００１３】アダプターは合成的に調製することができ
るので、アダプターのコドンは、天然に存在する哺乳動
物のコドンではなく、酵母宿主により選択的に用いられ
るコドン、例えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコド
ンであることが好ましい。アダプターはコード配列中に
約２０〜４０、さらに一般的には約２５〜３５の塩基を
有し、そして接着末端又は平滑末端、好ましくは接着末
端を有する。好ましくは、アダプターの末端は異なる接
着末端を有し、該アダプターの正しい方向付けを保証す
る。従って、連結されるべき２つの末端も又異なる末端
を有するであろう。
るので、アダプターのコドンは、天然に存在する哺乳動
物のコドンではなく、酵母宿主により選択的に用いられ
るコドン、例えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコド
ンであることが好ましい。アダプターはコード配列中に
約２０〜４０、さらに一般的には約２５〜３５の塩基を
有し、そして接着末端又は平滑末端、好ましくは接着末
端を有する。好ましくは、アダプターの末端は異なる接
着末端を有し、該アダプターの正しい方向付けを保証す
る。従って、連結されるべき２つの末端も又異なる末端
を有するであろう。
【００１４】リーダー及びプロセシングシグナルのため
に、酵母由来の天然のＤＮＡ配列を使用することができ
る。酵母により分泌されるポリペプチドにはα−ファク
ター、ａ−ファクター等が含まれる。この発明を、酵母
α−ファクターの制御シグナル、リーダー及びプロセシ
ングシグナル、並びに転写ターミネーターと共に、プロ
インスリンのｃＤＮＡを用いて説明する。
に、酵母由来の天然のＤＮＡ配列を使用することができ
る。酵母により分泌されるポリペプチドにはα−ファク
ター、ａ−ファクター等が含まれる。この発明を、酵母
α−ファクターの制御シグナル、リーダー及びプロセシ
ングシグナル、並びに転写ターミネーターと共に、プロ
インスリンのｃＤＮＡを用いて説明する。
【００１５】酵母α−ファクターはＨｉｎｄIII 及びＳ
ａｌＩにより切り出すことができる。ＨｉｎｄIII は、
α−ファクターのプロセシングシグナル中ｇｌｕコドン
のコード鎖の第２塩基において切断し、他方認識配列は
ｇｌｕコドンを満たしそしてａｌａをコードする。Ｓａ
ｌＩ部位はα−ファクター転写ターミネーターに先行す
る。
ａｌＩにより切り出すことができる。ＨｉｎｄIII は、
α−ファクターのプロセシングシグナル中ｇｌｕコドン
のコード鎖の第２塩基において切断し、他方認識配列は
ｇｌｕコドンを満たしそしてａｌａをコードする。Ｓａ
ｌＩ部位はα−ファクター転写ターミネーターに先行す
る。
【００１６】ヒト−プロインスリンｃＤＮＡは、Ｅｃｏ
ＲＩにより切り出されて、プロインスリンの完全コード
配列及びフランク配列を有する断片（ＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ）をもたらす。ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＥ
ｃｏＲIIにより部分消化してコード配列の内部を切断す
ることにより、５′−末端においてコード配列の一部分
が欠落した不完全断片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ）が得られる。
ＲＩにより切り出されて、プロインスリンの完全コード
配列及びフランク配列を有する断片（ＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ）をもたらす。ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＥ
ｃｏＲIIにより部分消化してコード配列の内部を切断す
ることにより、５′−末端においてコード配列の一部分
が欠落した不完全断片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ）が得られる。
【００１７】この塩基対はアダプターにより与えられ、
このアダプターはＥｃｏＲII−ＥｃｏＲＩ断片とリーデ
ィングフレームが適切に一致するようにリーダー及びプ
ロセシングシグナル断片（ＨｉｎｄIII 部位）に結合す
る。アダプターは単一断片として調製することができ、
又は２以上の単一鎖を連結することによって調製するこ
とができる。アダプターが、プロセシングシグナル及び
発現されるべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。
このアダプターはＥｃｏＲII−ＥｃｏＲＩ断片とリーデ
ィングフレームが適切に一致するようにリーダー及びプ
ロセシングシグナル断片（ＨｉｎｄIII 部位）に結合す
る。アダプターは単一断片として調製することができ、
又は２以上の単一鎖を連結することによって調製するこ
とができる。アダプターが、プロセシングシグナル及び
発現されるべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。
【００１８】プロインスリンのｃＤＮＡ遺伝子を含有す
る断片の他端にはＥｃｏＲＩ認識部位が存在する。α−
ファクター遺伝子はｆ−ｍｅｔコドンの第１塩基から５
３３番目の塩基にＳａｌＩ制限部位を有する。小型のＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩアダプターがこの３′−非コード領
域において２個の末端を連結するために機能し、そして
それ由に構成にα−ファクター転写ターミネーターを復
元するために機能する。
る断片の他端にはＥｃｏＲＩ認識部位が存在する。α−
ファクター遺伝子はｆ−ｍｅｔコドンの第１塩基から５
３３番目の塩基にＳａｌＩ制限部位を有する。小型のＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩアダプターがこの３′−非コード領
域において２個の末端を連結するために機能し、そして
それ由に構成にα−ファクター転写ターミネーターを復
元するために機能する。
【００１９】便利には、プロモーターとして、リーダー
配列と関連するプロモーターを使用することができる。
この場合、プロモーター及びリーダー配列の両者を効果
的な転写のために適切である空間的関係において含有す
る５′−ポータブル要素を得ることができる。さらに、
転写ターミネーターを含めることにより、プロモーター
／リーダー／外来性遺伝子／ターミネーターから成る
「カセット」を形成することもできる。このことは、酵
母由来の無傷の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下
流の転写制御配列を含有するＤＮＡ断片（この遺伝子は
酵母宿主によって分泌されるポリペプチドを発現する）
を分離することによって達成される。このことは、α−
ファクターを用いてすでに例示した。
配列と関連するプロモーターを使用することができる。
この場合、プロモーター及びリーダー配列の両者を効果
的な転写のために適切である空間的関係において含有す
る５′−ポータブル要素を得ることができる。さらに、
転写ターミネーターを含めることにより、プロモーター
／リーダー／外来性遺伝子／ターミネーターから成る
「カセット」を形成することもできる。このことは、酵
母由来の無傷の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下
流の転写制御配列を含有するＤＮＡ断片（この遺伝子は
酵母宿主によって分泌されるポリペプチドを発現する）
を分離することによって達成される。このことは、α−
ファクターを用いてすでに例示した。
【００２０】プロインスリンｃＤＮＡはそれ自体の終結
コドンを有し、ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末
端と同一であることを保証するであろう。上記の方法に
代えて、天然のプロモーターの代りに転写制御を可能に
する他のプロモーターを使用することができる。このた
めには、異なるプロモーターを導入するためにリーダー
配列から上流の領域の配列を決定しそして／又は制限地
図を作成することが必要であろう。ある場合には、天然
のプロモーターを残留せしめ、この天然のプロモーター
の上流又は下流のいずれかに第２のプロモーターを与え
ることが望ましいであろう。
コドンを有し、ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末
端と同一であることを保証するであろう。上記の方法に
代えて、天然のプロモーターの代りに転写制御を可能に
する他のプロモーターを使用することができる。このた
めには、異なるプロモーターを導入するためにリーダー
配列から上流の領域の配列を決定しそして／又は制限地
図を作成することが必要であろう。ある場合には、天然
のプロモーターを残留せしめ、この天然のプロモーター
の上流又は下流のいずれかに第２のプロモーターを与え
ることが望ましいであろう。
【００２１】広範囲の種類のプロモーターを使用するこ
とができ、又は酵母遺伝子から得ることができる。特に
好ましいプロモーターには、解糖経路における酵素と関
連するプロモーター例えばアルコールデヒドロゲナー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェート
イソメラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラ
クトキナーゼ等のためのプロモーターが含まれる。
とができ、又は酵母遺伝子から得ることができる。特に
好ましいプロモーターには、解糖経路における酵素と関
連するプロモーター例えばアルコールデヒドロゲナー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェート
イソメラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラ
クトキナーゼ等のためのプロモーターが含まれる。
【００２２】これらのプロモーターを制御配列、例えば
オペレーター、レプレッサー及びデレプレッサーと共に
使用することにより、そして無傷の制御系を有する宿主
を使用することにより、プロセシングされた「プレ」−
プロインスリンの発現を制御することができる。すなわ
ち、目的ポリペプチドの産生の制御のために種々の小有
機分子、例えばグルコースを用いることができる。
オペレーター、レプレッサー及びデレプレッサーと共に
使用することにより、そして無傷の制御系を有する宿主
を使用することにより、プロセシングされた「プレ」−
プロインスリンの発現を制御することができる。すなわ
ち、目的ポリペプチドの産生の制御のために種々の小有
機分子、例えばグルコースを用いることができる。
【００２３】また、温度を変えることによって転写を調
節することを可能にする温度感受性変異株を使用するこ
ともできる。すなわち、非許容的温度（ｎｏｎｅｐｅｒ
ｍｉｓｓｉｖｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）において細
胞を増殖せしめることにより細胞を高濃度に増殖せし
め、この後温度を変えることによりプロセシングされた
「プレ」−プロインスリンを発現せしめる。
節することを可能にする温度感受性変異株を使用するこ
ともできる。すなわち、非許容的温度（ｎｏｎｅｐｅｒ
ｍｉｓｓｉｖｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）において細
胞を増殖せしめることにより細胞を高濃度に増殖せし
め、この後温度を変えることによりプロセシングされた
「プレ」−プロインスリンを発現せしめる。
【００２４】その他の能力を構成中に導入することもで
きる。例えば、宿主に対するストレスの際に、増幅され
たストレスに対して遺伝子のみならずフランク領域も応
答する場合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝
子を、プロモーター及び「プレ」−プロインスリンの転
写制御をもたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そ
して酵母宿主をストレスすることにより、「プレ」−プ
ロインスリン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の
反復配列を有するプラスミドが得られる。
きる。例えば、宿主に対するストレスの際に、増幅され
たストレスに対して遺伝子のみならずフランク領域も応
答する場合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝
子を、プロモーター及び「プレ」−プロインスリンの転
写制御をもたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そ
して酵母宿主をストレスすることにより、「プレ」−プ
ロインスリン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の
反復配列を有するプラスミドが得られる。
【００２５】代表的な遺伝子にはメタロチオネイン遺伝
子及びジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子が含まれ
る。構成はリーダー配列断片のほかに宿主染色体に相同
の他のＤＮＡを含有することができる。プロインスリン
遺伝子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、プ
ロインスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体ＤＮ
Ａと相同の配列を用いて組込みを強化することができ
る。
子及びジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子が含まれ
る。構成はリーダー配列断片のほかに宿主染色体に相同
の他のＤＮＡを含有することができる。プロインスリン
遺伝子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、プ
ロインスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体ＤＮ
Ａと相同の配列を用いて組込みを強化することができ
る。
【００２６】酵母宿主により認識される複製系を用い
る。従って、複製系が酵母宿主にとって本来的なもので
あることが好ましい。多数の酵母ベクターがＢｏｔｓｔ
ｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ（１９７９）８：１７−２４により
報告されている。２μｍプラスミド複製系を含有するＹ
Ｅｐプラスミドが特に好ましい。これらのプラスミドは
多コピー数において容易に保持される。以上の方法に代
えて、又はこれに加えて、ＡＲＳ１及びＣＥＮ４の組合
わせを用いて安定な保持を得ることができる。
る。従って、複製系が酵母宿主にとって本来的なもので
あることが好ましい。多数の酵母ベクターがＢｏｔｓｔ
ｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ（１９７９）８：１７−２４により
報告されている。２μｍプラスミド複製系を含有するＹ
Ｅｐプラスミドが特に好ましい。これらのプラスミドは
多コピー数において容易に保持される。以上の方法に代
えて、又はこれに加えて、ＡＲＳ１及びＣＥＮ４の組合
わせを用いて安定な保持を得ることができる。
【００２７】各操作の後、適当であれば構成をクローニ
ングして、目的とする構成を純粋な形でそしてさらに操
作するのに十分な量において得る。好ましくは、原核生
物、特にＥ・コリ中でクローニングができるように、シ
ャトルベクター（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を
含有するベクター）を用いる。
ングして、目的とする構成を純粋な形でそしてさらに操
作するのに十分な量において得る。好ましくは、原核生
物、特にＥ・コリ中でクローニングができるように、シ
ャトルベクター（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を
含有するベクター）を用いる。
【００２８】プラスミドは、酵母細胞又はスフェロプラ
ストを用いそして形質転換のためのカルシウム沈殿ＤＮ
Ａを用いる任意の便利な手段により、又はその他の常用
技法により、酵母に導入することができる。変性された
宿主は、発現プラスミドを構成するためのベクターに通
常備なえられている遺伝的マーカーに従って選択するこ
とができる。栄養要求宿主を用い、プラスミドはこの宿
主を補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）しそして原栄養性を
付与する遺伝子を有する。この方法に代えて、適当な殺
生物剤、例えば抗生物質、重金属、毒素又はこれらに類
するものに対する耐性を、マーカーとしてプラスミドに
導入することができる。
ストを用いそして形質転換のためのカルシウム沈殿ＤＮ
Ａを用いる任意の便利な手段により、又はその他の常用
技法により、酵母に導入することができる。変性された
宿主は、発現プラスミドを構成するためのベクターに通
常備なえられている遺伝的マーカーに従って選択するこ
とができる。栄養要求宿主を用い、プラスミドはこの宿
主を補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）しそして原栄養性を
付与する遺伝子を有する。この方法に代えて、適当な殺
生物剤、例えば抗生物質、重金属、毒素又はこれらに類
するものに対する耐性を、マーカーとしてプラスミドに
導入することができる。
【００２９】次に、親細胞をストレスしプラスミドを含
有する細胞を選択する栄養培地を用いることにより選択
を行う。次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中に
増殖せしめ、そして分泌された目的ポリペプチドを常法
に従って分離する。このポリペプチドをクロマトグラフ
ィー、抽出等により精製する。ポリペプチドは培地中に
成熟型として存在するであろうから、目的ポリペプチド
を連続的に取り出しながら栄養培地を循環することがで
きる。次に、この発明を具体的に説明するために例を記
載するがこれによりこの発明の範囲を限定するものでは
ない。
有する細胞を選択する栄養培地を用いることにより選択
を行う。次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中に
増殖せしめ、そして分泌された目的ポリペプチドを常法
に従って分離する。このポリペプチドをクロマトグラフ
ィー、抽出等により精製する。ポリペプチドは培地中に
成熟型として存在するであろうから、目的ポリペプチド
を連続的に取り出しながら栄養培地を循環することがで
きる。次に、この発明を具体的に説明するために例を記
載するがこれによりこの発明の範囲を限定するものでは
ない。
【００３０】実験 １．ｐｈｉｎｓ１−１９のＥｃｏＲＩ消化 約７００μｇのｐｈｉｎｓ１−１９（ｐＢＲ３２８のＥ
ｃｏＲＩ部位においてクローニングされた、完全なヒト
−プロインスリン遺伝子を含有する５１７bpのｃＤＮ
Ａ）を、約１６００ユニットのＥｃｏＲＩ（ニューイン
グランドビオラブス）と共に、１ml中で、３７℃にて約
４．５時間（完了まで）製造者により指定された緩衝条
件下でインキュベートした。（ｐｈｉｎｓ１−１９は、
Ｂｅｌｌ等、前記、により記載されたプラスミドから、
ＰｓｔＩ開裂、Ｂａｌ３１切断、ＥｃｏＲＩリンカーの
付加、及びｐＢＲ３２８への挿入により誘導される。）
ｃｏＲＩ部位においてクローニングされた、完全なヒト
−プロインスリン遺伝子を含有する５１７bpのｃＤＮ
Ａ）を、約１６００ユニットのＥｃｏＲＩ（ニューイン
グランドビオラブス）と共に、１ml中で、３７℃にて約
４．５時間（完了まで）製造者により指定された緩衝条
件下でインキュベートした。（ｐｈｉｎｓ１−１９は、
Ｂｅｌｌ等、前記、により記載されたプラスミドから、
ＰｓｔＩ開裂、Ｂａｌ３１切断、ＥｃｏＲＩリンカーの
付加、及びｐＢＲ３２８への挿入により誘導される。）
【００３１】ヒト−プロインスリン遺伝子を含有するｐ
ｈｉｎｓ１−１９のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の分離 Ｅｃｏ ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を５％非変性条件下のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ゲルを１
μｇ／mlのエチジゥムブロミド溶液中で約１０分間染色
し、そして長波長ＵＶ光のもとで可視化した。５１７bp
断片に対応するバンドを切り取り、そして電気溶出〔Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．（１９８
０）６５：３７１−３８０〕によりゲルから分離した。
ＤＮＡを濃縮し、そしてこれを指定された条件下でエル
チップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）に通すことにより精
製した。
ｈｉｎｓ１−１９のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の分離 Ｅｃｏ ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を５％非変性条件下のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ゲルを１
μｇ／mlのエチジゥムブロミド溶液中で約１０分間染色
し、そして長波長ＵＶ光のもとで可視化した。５１７bp
断片に対応するバンドを切り取り、そして電気溶出〔Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．（１９８
０）６５：３７１−３８０〕によりゲルから分離した。
ＤＮＡを濃縮し、そしてこれを指定された条件下でエル
チップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）に通すことにより精
製した。
【００３２】２．ＥｃｏＲIIを用いるＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ片の部分消化 Ｅｃｏ ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１７μｇ）を、約３ユ
ニットのＥｃｏＲII（ベセスダリザーチラブス）と共
に、１７０μｌの容積において、３７℃にて指定された
緩衝条件下で、インキュベートした。同量のアリコート
を１８，２１、及び２５分間目に採取した。
ｏＲＩ片の部分消化 Ｅｃｏ ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１７μｇ）を、約３ユ
ニットのＥｃｏＲII（ベセスダリザーチラブス）と共
に、１７０μｌの容積において、３７℃にて指定された
緩衝条件下で、インキュベートした。同量のアリコート
を１８，２１、及び２５分間目に採取した。
【００３３】ＥｃｏＲII−ＥｃｏＲＩ（長断片）の分離 ３９２bpのＥｃｏＲII−ＥｃｏＲＩ断片を、前記のごと
く、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出、及び
エルチップ−ｄクロマトグラフィーにより分離した。
く、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出、及び
エルチップ−ｄクロマトグラフィーにより分離した。
【００３４】３．ＥｃｏＲII−ＥｃｏＲＩ断片と合成断
片との連結 インスリンコード領域のほとんどを含有するＥｃｏＲII
−ＥｃｏＲＩ部分消化断片を、シリコン加工した１．５
mlのエッペンドルフ管中で水を蒸発せしめることにより
乾燥した（８０μｇ，０．３５ピコモル）。このペレッ
トに、１０ピコモルの５′−燐酸化合成断片３及び４、
並びに２５ピコモルの断片２及び５を加え、容積を１４
μｌとした。断片２〜５は次のＤＮＡ配列（５′→３′
で示す）を有する。
片との連結 インスリンコード領域のほとんどを含有するＥｃｏＲII
−ＥｃｏＲＩ部分消化断片を、シリコン加工した１．５
mlのエッペンドルフ管中で水を蒸発せしめることにより
乾燥した（８０μｇ，０．３５ピコモル）。このペレッ
トに、１０ピコモルの５′−燐酸化合成断片３及び４、
並びに２５ピコモルの断片２及び５を加え、容積を１４
μｌとした。断片２〜５は次のＤＮＡ配列（５′→３′
で示す）を有する。
【００３５】２． ACAAAAGCTTC ３． TTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACA ４． CCAGGTGTGAGCCGCACAGGTGTTGGTTC ５． AATTTGATAAG
【００３６】これに、５μｇのポリ−Ａ（５μｌ）、２
５０mMのＥＤＴＡ（１μｌ）、２Ｍ酢酸ナトリウム（２
０μｌ）を加えた。この溶液を６０℃に５分間加熱する
ことにより残存キナーゼを失活せしめ、そして次に２５
ピコモルの５′−ヒドロキシン合成断片１及び６を加え
た。断片１及び６は次のＤＮＡ配列を有する。 １． AGCTGAAGCTT ６． TCGACTTATCA
５０mMのＥＤＴＡ（１μｌ）、２Ｍ酢酸ナトリウム（２
０μｌ）を加えた。この溶液を６０℃に５分間加熱する
ことにより残存キナーゼを失活せしめ、そして次に２５
ピコモルの５′−ヒドロキシン合成断片１及び６を加え
た。断片１及び６は次のＤＮＡ配列を有する。 １． AGCTGAAGCTT ６． TCGACTTATCA
【００３７】この方法によりコンカテマー（ｃｏｎｃａ
ｔｅｍｅｒ）の形成が回避される。これらの断片は、酵
母α−ファクタープロセシングシグナルからプロインス
リン遺伝子中のＥｃｏＲII制限部位までのコドンを、ｈ
ｉｓ及びｌｅｕのコドンにおいて架橋し、そしてさらに
プロインスリン遺伝子を含有する断片のＥｃｏＲＩ制限
部位と酵母α−ファクターを含有する断片のｓａｌＩ制
限部位（ＥｃｏＲＩ部位及びｓａｌＩ部位はいずれもこ
れらそれぞれのコード領域より下流にある）とを架橋す
るアダプターとなる。
ｔｅｍｅｒ）の形成が回避される。これらの断片は、酵
母α−ファクタープロセシングシグナルからプロインス
リン遺伝子中のＥｃｏＲII制限部位までのコドンを、ｈ
ｉｓ及びｌｅｕのコドンにおいて架橋し、そしてさらに
プロインスリン遺伝子を含有する断片のＥｃｏＲＩ制限
部位と酵母α−ファクターを含有する断片のｓａｌＩ制
限部位（ＥｃｏＲＩ部位及びｓａｌＩ部位はいずれもこ
れらそれぞれのコード領域より下流にある）とを架橋す
るアダプターとなる。
【００３８】この混合物を攪拌し、２００μｌの９５％
エタノールを加え、そしてチューブを−８０℃にて２０
分間保持することによりＤＮＡを沈澱せしめる。１２，
８００Ｇにて１０分間遠心分離した後、溶液をデカント
し、冷エタノールで洗浄し、そして蒸発乾燥した。断片
のアニーリングを、１８μｌの水を加え、渦流攪拌し、
９０℃に加熱しそして１時間かけて１４℃に冷却するこ
とにより達成した。全容積２７μｌに５０mMのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．８）、１０mMのＭｇＣｌ2 、１mg／ml
のスパーミジン、１０mMジチオスレイトール、１mMのＡ
ＴＰ（リゼーション緩衝液）を含有するように溶液を調
整した。
エタノールを加え、そしてチューブを−８０℃にて２０
分間保持することによりＤＮＡを沈澱せしめる。１２，
８００Ｇにて１０分間遠心分離した後、溶液をデカント
し、冷エタノールで洗浄し、そして蒸発乾燥した。断片
のアニーリングを、１８μｌの水を加え、渦流攪拌し、
９０℃に加熱しそして１時間かけて１４℃に冷却するこ
とにより達成した。全容積２７μｌに５０mMのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．８）、１０mMのＭｇＣｌ2 、１mg／ml
のスパーミジン、１０mMジチオスレイトール、１mMのＡ
ＴＰ（リゼーション緩衝液）を含有するように溶液を調
整した。
【００３９】６ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（３μｌ）を加えることにより連結反応
（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を開始した。１４℃にて２時間置
いた後、予想される４４３bpのＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ
断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。エチジウムブロミド（０．５μ
ｇ／ml）で染色することによりバンドを可視化し、切り
取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を取り出
し、５μｇのポリ−Ａを加え、ＤＮＡをエタノール沈澱
し、そして乾燥した。断片をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（３ユニット）を用い、３７℃にて１時間合計２０
μｌのリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化した。
ＮＡリガーゼ（３μｌ）を加えることにより連結反応
（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を開始した。１４℃にて２時間置
いた後、予想される４４３bpのＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ
断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。エチジウムブロミド（０．５μ
ｇ／ml）で染色することによりバンドを可視化し、切り
取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を取り出
し、５μｇのポリ−Ａを加え、ＤＮＡをエタノール沈澱
し、そして乾燥した。断片をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（３ユニット）を用い、３７℃にて１時間合計２０
μｌのリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化した。
【００４０】４．ＨｉｎｄIII −ＳａｌＩα−ファクタ
ー−プロインスリン融合断片のｐＡＢ１１３への連結 ｐＡＢ１１３は、ＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ部位が除去
されているｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位においてクロ
ーニングされた酵母α−ファクター遺伝子を含有する
１．８kbＥｃｏＲＩ断片を含んで成るプラスミドであ
る。ｐＡＢ１１３はプラスミドｐＡＢ１０１から誘導さ
れ、このものは、プラスミドＹＥｐ２４のＢａｍＨＩ部
位においてクローニングされた部分Ｓａｕ３Ａ断片とし
てα−ファクター遺伝子を含有する。
ー−プロインスリン融合断片のｐＡＢ１１３への連結 ｐＡＢ１１３は、ＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ部位が除去
されているｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位においてクロ
ーニングされた酵母α−ファクター遺伝子を含有する
１．８kbＥｃｏＲＩ断片を含んで成るプラスミドであ
る。ｐＡＢ１１３はプラスミドｐＡＢ１０１から誘導さ
れ、このものは、プラスミドＹＥｐ２４のＢａｍＨＩ部
位においてクローニングされた部分Ｓａｕ３Ａ断片とし
てα−ファクター遺伝子を含有する。
【００４１】ｐＡＢ１０１は、ＹＥｐ２４中にクローニ
ングされた酵母遺伝子ライブラリーを、公表されている
α−ファクターコード領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓ
ｋｏｗｉｔｚ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １９８１ Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏ
ｎ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ
Ｙｅａｓｔｓ，２４２頁）と相同の合成オリゴヌクレ
オチドプローブを用いてスクリーニングすることにより
得られる。ｐＡＢ１１３をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
III 及びＳａｌＩにより完全消化した。
ングされた酵母遺伝子ライブラリーを、公表されている
α−ファクターコード領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓ
ｋｏｗｉｔｚ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １９８１ Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏ
ｎ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ
Ｙｅａｓｔｓ，２４２頁）と相同の合成オリゴヌクレ
オチドプローブを用いてスクリーニングすることにより
得られる。ｐＡＢ１１３をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
III 及びＳａｌＩにより完全消化した。
【００４２】前記のようにして調製した連結生成物を含
有するサンプルを６０℃に加熱し、そして１００ngの消
化されたｐＡＢ１１３を加えた。この溶液を、１５分間
かけて１４℃に冷却し、２ワイスユニットのＴ４リガー
ゼを加え、そして１４℃にて２時間連結を行った。
有するサンプルを６０℃に加熱し、そして１００ngの消
化されたｐＡＢ１１３を加えた。この溶液を、１５分間
かけて１４℃に冷却し、２ワイスユニットのＴ４リガー
ゼを加え、そして１４℃にて２時間連結を行った。
【００４３】挿入部を含有するｐＡＢ１１３によるＥ・
コリＨＢ１０１の形質転換、及び形質転換体の試験 エタノール沈澱の後、ペレットを７５mMのＣａＣｌ2 に
入れ、そしてこれを用いてコンピテントＥ・コリＨＢ１
０１細胞を形質転換した。８個の形質転換体を得、これ
らの各々からプラスミドＤＮＡを抽出した〔Ｂｉｒｂｏ
ｉｍ及びＤｏｌｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
（１９７９）７：１５１３〕。
コリＨＢ１０１の形質転換、及び形質転換体の試験 エタノール沈澱の後、ペレットを７５mMのＣａＣｌ2 に
入れ、そしてこれを用いてコンピテントＥ・コリＨＢ１
０１細胞を形質転換した。８個の形質転換体を得、これ
らの各々からプラスミドＤＮＡを抽出した〔Ｂｉｒｂｏ
ｉｍ及びＤｏｌｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
（１９７９）７：１５１３〕。
【００４４】組換プラスミドをＰｓｔＩ及びＳａｌＩに
より消化し、そしてα−ファクター−プロインスリン挿
入部に特異的な３１９，２０７，７９，４８，３１、及
び２７bpの予想される断片の収得を電気泳動的に試験し
た。８個の形質転換体の内、ｐｙｉｎｓ−１，−２，−
３，−４，−５と標示する５個の形質転換体がα−ファ
クター−プロインスリン挿入部を含有していた。陽性形
質転換体の各々について１ｌの培養物からプラスミドＤ
ＮＡを調製した。
より消化し、そしてα−ファクター−プロインスリン挿
入部に特異的な３１９，２０７，７９，４８，３１、及
び２７bpの予想される断片の収得を電気泳動的に試験し
た。８個の形質転換体の内、ｐｙｉｎｓ−１，−２，−
３，−４，−５と標示する５個の形質転換体がα−ファ
クター−プロインスリン挿入部を含有していた。陽性形
質転換体の各々について１ｌの培養物からプラスミドＤ
ＮＡを調製した。
【００４５】５．ｐｙｉｎｓ−１，−２，−３，−４，
−５のＥｃｏＲＩ消化 各形質転換体からのプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）
を、２４０ユニットのＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）と共に４時
間２００μｌの容積において指定された緩衝条件のもと
でインキュベートした。
−５のＥｃｏＲＩ消化 各形質転換体からのプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）
を、２４０ユニットのＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）と共に４時
間２００μｌの容積において指定された緩衝条件のもと
でインキュベートした。
【００４６】ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の分離 ２０５６bpＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を５％ポリアク
リルアミド電気泳動により分離した（この方法に代えて
アガロースを使用することもできる）。ゲルをエチジゥ
ムブロミドで染色し、そして予想されるＵＶ−可視化バ
ンドを切り出した。ＤＮＡを、前記のごとく、電気溶出
により分離し、そしてクロマトグラフィーにより精製し
た。
リルアミド電気泳動により分離した（この方法に代えて
アガロースを使用することもできる）。ゲルをエチジゥ
ムブロミドで染色し、そして予想されるＵＶ−可視化バ
ンドを切り出した。ＤＮＡを、前記のごとく、電気溶出
により分離し、そしてクロマトグラフィーにより精製し
た。
【００４７】６．ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片へのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプターの連結 各「ｐｙｉｎ」クローン（約４μｇ）を、次のＤＮＡ配
列を有する５′−燐酸化ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプ
ター１．０μｇと共に、２０００ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（ニューイングランドビオラブス）の存在下で
インキュベートした。 ５′−GATCCCTCTAGG−３′ ；及び、 ５′−AATTCCTAGAGG−３′
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプターの連結 各「ｐｙｉｎ」クローン（約４μｇ）を、次のＤＮＡ配
列を有する５′−燐酸化ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩアダプ
ター１．０μｇと共に、２０００ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（ニューイングランドビオラブス）の存在下で
インキュベートした。 ５′−GATCCCTCTAGG−３′ ；及び、 ５′−AATTCCTAGAGG−３′
【００４８】反応は、９００μｌの指定された緩衝液中
で１８℃にて２．５時間行った。サンプルを６５℃に１
０分間加熱し、フェノール抽出し、そして２５０μｌの
指定された緩衝液中で３７℃にて４時間、１００ユニッ
トのＢａｍＨＩ（ＢＲＬ）を用いて消化した。ＢａｍＨ
Ｉ−ＢａｍＨＩα−ファクター−プロインスリン断片
を、上記のようにして、１％アガロースゲル電気泳動、
電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーによ
り精製した。
で１８℃にて２．５時間行った。サンプルを６５℃に１
０分間加熱し、フェノール抽出し、そして２５０μｌの
指定された緩衝液中で３７℃にて４時間、１００ユニッ
トのＢａｍＨＩ（ＢＲＬ）を用いて消化した。ＢａｍＨ
Ｉ−ＢａｍＨＩα−ファクター−プロインスリン断片
を、上記のようにして、１％アガロースゲル電気泳動、
電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーによ
り精製した。
【００４９】７．ｐＣｌ／１のＢａｍＨＩ部位へのＢａ
ｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の連結 ｐｙｉｎｓ−１のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の０．７
μｇ及び他のｐｙｉｎｓからの同様の断片０．４μｇ
を、一定量のＢａｍＨＩ消化ｐＣｌ／１と連結し、この
場合のモル比を断片１０：ベクター１とした。〔プラス
ミドｐＣｌ／１はｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，１９７８，２７５：１０４）の誘導体であり、
ｐＪＢＢ２１９中の細菌プラスミドｐＭＢ９に対応する
領域はｐＣｌ／１中でｐＢＲ３２２により置換されてい
る。
ｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の連結 ｐｙｉｎｓ−１のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の０．７
μｇ及び他のｐｙｉｎｓからの同様の断片０．４μｇ
を、一定量のＢａｍＨＩ消化ｐＣｌ／１と連結し、この
場合のモル比を断片１０：ベクター１とした。〔プラス
ミドｐＣｌ／１はｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，１９７８，２７５：１０４）の誘導体であり、
ｐＪＢＢ２１９中の細菌プラスミドｐＭＢ９に対応する
領域はｐＣｌ／１中でｐＢＲ３２２により置換されてい
る。
【００５０】ｐＣｌ／１は完全な２μｍ複製因子、酵母
ＬＥＵ２遺伝子及び完全なｐＢＲ３２２を含有してい
る。〕すべての連結反応は、５μｇ／mlのＤＮＡ濃度及
び８００ユニットのＴ４リガーゼ（ニューイングランド
ビオラブス）を用いて２１℃にて２．５時間行った。エ
タノール沈澱の後、ＤＮＡを７５mMのＣａＣｌ2 １００
μｌに再懸濁し、そしてこれを用いてＥ・コリＨＢ１０
１細胞を形質転換した。
ＬＥＵ２遺伝子及び完全なｐＢＲ３２２を含有してい
る。〕すべての連結反応は、５μｇ／mlのＤＮＡ濃度及
び８００ユニットのＴ４リガーゼ（ニューイングランド
ビオラブス）を用いて２１℃にて２．５時間行った。エ
タノール沈澱の後、ＤＮＡを７５mMのＣａＣｌ2 １００
μｌに再懸濁し、そしてこれを用いてＥ・コリＨＢ１０
１細胞を形質転換した。
【００５１】α−ファクター−プロインスリン挿入部の
存在についての形質転換体の試験 各「ｐｙｉｎｓ」のクローンについて数百個ずつの形質
転換体を得た。５種類の「ｐｙｉｎｓ」クローンのそれ
ぞれに由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドＤ
ＮＡを抽出し、これをＰｓｔＩ（ニューイングランドビ
オラブス）により消化することにより試験した。このＰ
ｓｔＩは、挿入部の存在下で、２０７，４８，及び２７
bpの特異的な断片を生じさせるものと予想される。
存在についての形質転換体の試験 各「ｐｙｉｎｓ」のクローンについて数百個ずつの形質
転換体を得た。５種類の「ｐｙｉｎｓ」クローンのそれ
ぞれに由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドＤ
ＮＡを抽出し、これをＰｓｔＩ（ニューイングランドビ
オラブス）により消化することにより試験した。このＰ
ｓｔＩは、挿入部の存在下で、２０７，４８，及び２７
bpの特異的な断片を生じさせるものと予想される。
【００５２】試験した２０個の形質転換体の内の１４個
がα−ファクター−プロインスリン挿入部を含有してい
ることが見出された。これらの形質転換体はもとの「ｐ
ｙｉｎｓ」クローンの各々を代表している。もとの「ｐ
ｙｉｎｓ」クローンの各々に由来する形質転換体からプ
ラスミド標品を調製した。このプラスミドを用いて酵母
ＡＢ１０３細胞（α，ｐｅｐ ４−３，ｌｅｕ２−３，
ｌｅｕ ２−１１２，ｕｒａ ３−５２，ｈｉｓ ４−
５８０）を形質転換し、そしてＬｅｕ+ 形質転換体を選
択した。
がα−ファクター−プロインスリン挿入部を含有してい
ることが見出された。これらの形質転換体はもとの「ｐ
ｙｉｎｓ」クローンの各々を代表している。もとの「ｐ
ｙｉｎｓ」クローンの各々に由来する形質転換体からプ
ラスミド標品を調製した。このプラスミドを用いて酵母
ＡＢ１０３細胞（α，ｐｅｐ ４−３，ｌｅｕ２−３，
ｌｅｕ ２−１１２，ｕｒａ ３−５２，ｈｉｓ ４−
５８０）を形質転換し、そしてＬｅｕ+ 形質転換体を選
択した。
【００５３】細胞培地のインスリンのラジオイムノアッ
セイ 酵母形質転換体ＡＢ１０３（ｐＹｉｎｓ１又はｐＹｉｎ
ｓ５）を、ロイシンを含有しない最少プレート上に「斑
点」として増殖せしめた。殺菌したプラスチック製植菌
耳を用いて各斑の幾らかを、ロイシンを含有しない最少
培地２mlに植付けた。この培養物及びＡＢ１０３（ｐＣ
ｌ／１）の対照培養物を飽和状態まで増殖せしめた。ベ
ックマンＪ６Ｂ遠心分離機中で２，５００rpm で１０分
間遠心分離することにより細胞をペレットにした。上清
液を取り出し、アマーシャム製のキットを用いてＲＩＡ
アッセイした。１，１０、及び１００μｌの上清液を測
定した。
セイ 酵母形質転換体ＡＢ１０３（ｐＹｉｎｓ１又はｐＹｉｎ
ｓ５）を、ロイシンを含有しない最少プレート上に「斑
点」として増殖せしめた。殺菌したプラスチック製植菌
耳を用いて各斑の幾らかを、ロイシンを含有しない最少
培地２mlに植付けた。この培養物及びＡＢ１０３（ｐＣ
ｌ／１）の対照培養物を飽和状態まで増殖せしめた。ベ
ックマンＪ６Ｂ遠心分離機中で２，５００rpm で１０分
間遠心分離することにより細胞をペレットにした。上清
液を取り出し、アマーシャム製のキットを用いてＲＩＡ
アッセイした。１，１０、及び１００μｌの上清液を測
定した。
【００５４】
【表１】
【００５５】脂肪形成バイオアッセイ（ｌｉｐｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ ｂｉｏａｓｓａｙ）〔Ｍｏｏｄｙ等、Ｈｏｒ
ｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．（１９７４）６：１２−１
６〕において、１μｇのサンプルは２７％のインスリン
活性を示した。サンプルはプラスミドｐＹｉｎｓ１−４
Ａから次のようにして得た。この特徴付けのために酵母
培養物を遠心分離して細胞を除去し、そして上清液を酢
酸によりpH３に酸性化した。この材料を、ビオレックス
（Ｂｉｏｒｅｘ）−７０に吸着し、カラムを０．１Ｎ酢
酸及び５０％エタノールで洗浄し、そして８０％エタノ
ール中１０mMＨＣｌで溶出することにより精製した。溶
出物をロータリーエバポレーターにより乾燥し、そして
少量の水に入れた。上記の結果はインスリン活性ペプチ
ドの存在を示す。
ｅｓｉｓ ｂｉｏａｓｓａｙ）〔Ｍｏｏｄｙ等、Ｈｏｒ
ｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．（１９７４）６：１２−１
６〕において、１μｇのサンプルは２７％のインスリン
活性を示した。サンプルはプラスミドｐＹｉｎｓ１−４
Ａから次のようにして得た。この特徴付けのために酵母
培養物を遠心分離して細胞を除去し、そして上清液を酢
酸によりpH３に酸性化した。この材料を、ビオレックス
（Ｂｉｏｒｅｘ）−７０に吸着し、カラムを０．１Ｎ酢
酸及び５０％エタノールで洗浄し、そして８０％エタノ
ール中１０mMＨＣｌで溶出することにより精製した。溶
出物をロータリーエバポレーターにより乾燥し、そして
少量の水に入れた。上記の結果はインスリン活性ペプチ
ドの存在を示す。
【００５６】この発明に従えば、新規な構成が提供さ
れ、この構成はベクターに挿入され、「プレ」−プロイ
ンスリンの発現、プロセシング及び分泌がもたらされ
る。こうして、天然のヒト−インスリンと同一の配列を
有するポリペプチドが得られる。分泌により細胞数に対
する収量が非常に増加し、その後の調製操作及び精製が
非常に単純化される。以上、この発明を説明及び例によ
りいく分詳細に記載したが、これは理解を明確にするた
めのものであり、この発明の範囲内において幾つかの変
更及び変法を行うことができることは言うまでもない。
なお、細胞系ｐＹｉｎｓ１は、１９８３年４月６日、Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２０６７０としてＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．に寄託された。
れ、この構成はベクターに挿入され、「プレ」−プロイ
ンスリンの発現、プロセシング及び分泌がもたらされ
る。こうして、天然のヒト−インスリンと同一の配列を
有するポリペプチドが得られる。分泌により細胞数に対
する収量が非常に増加し、その後の調製操作及び精製が
非常に単純化される。以上、この発明を説明及び例によ
りいく分詳細に記載したが、これは理解を明確にするた
めのものであり、この発明の範囲内において幾つかの変
更及び変法を行うことができることは言うまでもない。
なお、細胞系ｐＹｉｎｓ１は、１９８３年４月６日、Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２０６７０としてＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．に寄託された。
【図１】図１は本発明において使用される酵母α−ファ
クターリーダー配列をコードするＤＮＡ、プロインスリ
ンをコードするＤＮＡ及びこれらを連結するアダプター
配列、並びに制限酵素部位を示す。
クターリーダー配列をコードするＤＮＡ、プロインスリ
ンをコードするＤＮＡ及びこれらを連結するアダプター
配列、並びに制限酵素部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） ） (72)発明者 ミッキー エス．アーディア アメリカ合衆国，カリフォルニア，サン フランシスコ，サーティサード アベニ ュ 1606 (72)発明者 パブロ ディー．ティー．バレンズエラ アメリカ合衆国，カリフォルニア，サン フランシスコ，アパー テラス 455
Claims (1)
- 【請求項１】同一のリーディングフレーム内に第一ＤＮ
Ａ配列及び該第一ＤＮＡ配列の３'−末端に直接連結さ
れた第二ＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物であっ
て、該第二ＤＮＡ配列が、成熟インスリンの生産のため
にはプロセシングを必要とする成熟インスリンのための
前駆体配列をコードしており、そして前記第一ＤＮＡ配
列が、酵母α−ファクターシグナルペプチド配列をコー
ドする配列を含む、前記ＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48302383A | 1983-04-07 | 1983-04-07 | |
| US483023 | 1983-04-07 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59054554A Division JP2512416B2 (ja) | 1983-04-07 | 1984-03-23 | インスリンの発現方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767665A JPH0767665A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2511251B2 true JP2511251B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=23918330
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59054554A Expired - Lifetime JP2512416B2 (ja) | 1983-04-07 | 1984-03-23 | インスリンの発現方法 |
| JP6185950A Expired - Lifetime JP2511251B2 (ja) | 1983-04-07 | 1994-08-08 | 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59054554A Expired - Lifetime JP2512416B2 (ja) | 1983-04-07 | 1984-03-23 | インスリンの発現方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JP2512416B2 (ja) |
| AT (1) | ATE71661T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341372C (ja) |
| DE (1) | DE3485444D1 (ja) |
| DK (1) | DK172738B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| EP0170266B1 (en) * | 1984-07-30 | 1993-03-24 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor |
| JP2549504B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1996-10-30 | ア−ス製薬株式会社 | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| DE3685985T2 (de) * | 1985-04-09 | 1992-12-17 | Collaborative Res Inc | Mutanten von saccharomyces cerevisiae mit stark vermehrter sekretion. |
| JPS61271988A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Agency Of Ind Science & Technol | プラスミド |
| RU2091490C1 (ru) * | 1985-10-25 | 1997-09-27 | Зимодженетикс, Инк. | Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов |
| US5024941A (en) * | 1985-12-18 | 1991-06-18 | Biotechnica International, Inc. | Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence |
| US5037743A (en) * | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
| DE4336810A1 (de) * | 1993-10-28 | 1995-05-18 | Basf Ag | Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in Hefe |
| US6142857A (en) * | 1998-01-06 | 2000-11-07 | Speedfam-Ipec Corporation | Wafer polishing with improved backing arrangement |
| JPH11300608A (ja) * | 1998-04-20 | 1999-11-02 | Nec Corp | 化学機械研磨装置 |
| EP2277910A1 (en) | 2001-12-21 | 2011-01-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
-
1984
- 1984-02-23 DK DK198400927A patent/DK172738B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-02-29 CA CA000448492A patent/CA1341372C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-23 JP JP59054554A patent/JP2512416B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-02 AT AT84103611T patent/ATE71661T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-02 DE DE8484103611T patent/DE3485444D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-02 EP EP84103611A patent/EP0121884B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-08-08 JP JP6185950A patent/JP2511251B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3485444D1 (de) | 1992-02-27 |
| EP0121884A3 (en) | 1987-01-14 |
| ATE71661T1 (de) | 1992-02-15 |
| DK92784A (da) | 1984-10-08 |
| JPS59196093A (ja) | 1984-11-07 |
| JPH0767665A (ja) | 1995-03-14 |
| EP0121884A2 (en) | 1984-10-17 |
| JP2512416B2 (ja) | 1996-07-03 |
| EP0121884B1 (en) | 1992-01-15 |
| DK92784D0 (da) | 1984-02-23 |
| DK172738B1 (da) | 1999-06-21 |
| CA1341372C (en) | 2002-07-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960215 |
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