JPS61271988A - プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はポリヌクレオチドに存する。詳しくは、酵母の
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに存す
る。

（発明の構成） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を・−え、
また、食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常
生活と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝
子工学に於ける宿主としての開発が期待されている。

しかし、酵母の細胞表層は、細胞膜の外側に強固な細胞
壁を有するため、遺伝子組換え技術によって生産された
有用物質（異種蛋白質）の精製が困難な場合が多く、精
製を簡略化するために、生産物を菌体外に分泌させる系
の開発が望まれている。また、分泌生産は連続培養が可
能となり、大幅な生産量の増加が期待され、更に菌体内
プロテアーゼによる生産物の分解が防止される等そのメ
リットは大きい。

本発明者等は、酵母を宿主とする遺伝子組換え技術にお
いて、菌体内で生産された有用物質を効率よく分泌させ
ることのできるシグナルペプチドを探索した結果本発明
を達成したもので、その要旨は、次のアミノ酸配列から
なるペプチドをコードするポリヌクレオチド Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ｌｌｅ　Ｐ
ｈｅ　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　ＶａｌＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　　Ａｌ
ａ　ＡｌａＰｒｏ　Ｖａｌ に、存する。

本発明の詳細な説明するに、本発明のポリヌクレオチド
（以下ＯＮ＾と記す）は、第１図に示される２２個のア
ミノ酸をコードする６６塩基対＜　ｂｐ）の塩基配列で
表わされるＤＮＡからなる。

本発明０ＯＮ＾は、合成によりｌｌ製することができる
し、また、例えば、酵母の染色体ＯＮ＾のα因子遺伝子
から単離することができる。

本発明のＤＮＡを、適当なプラスミド・ベクター上の、
プロモーター配列と所望の蛋白質をコードする外来遺伝
子の間に挿入して宿主中で発現させた場合、目的とする
蛋白質を効率よく分泌させることができる。

以下に、ヒトのβ−エンドルフィンの遺伝子（βＥ　Ｄ
ＮＡ）をマーカーとして使用し、本発明のＤＮＡを含ん
だ分泌ベクターの有用性について詳細に説明する。

［分泌ベクターの構Ｉ［］ （＋）酵母のα因子ＤＮＡを含むプラスミド　ｐＬｓＯ
ｌ　（。

４．４　ｋｂ）の調製 詳細は後記実施例に記載するが、酵母の染色体ｔ）ＨＡ
をＥｃｏＲ１で切断し２　ｋｂ前後のＤＮＡ断片をプラ
スミドｐυＣ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社カタログ、Ｐ
−Ｌ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、　２７頁、２７−４９７３記載
）のＥｃｏＲＩ　Ｂ　泣に挿入して、大腸菌を形質転換
し、挿入ＯＮ＾を含む白色のコロニーを集め、上記ＷＩ
Ｉ母のα因子ＤＮＡＦＦα１及びＭＦα２と相同な下記
の１６塩基のヌクレオチド ５　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３（α因子の
Ｃ末端側の−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
に相当する） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを
行ない、陽性のコロニーを選択する０次いでプラスミド
ＤＮＡを分離し、酵母のα因子ＤＮＡを含むプラスミド
ｐＬｓＯ１（４，４ｋｂ）を選択採取する。

（２）プラスミドｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）の調
製プラスミド［ＹＲｐ？　５．７ｋｂ、酵母のＴＲＰＩ
を含むＤＮＡ断片と　ｐＢＲ３２２を結合したプラスミ
ド、Ｈａ　−ｔｕｒｅ、　２８２巻、３９〜４３頁（１
９７９）記載］をＥｃｏＲ１で部分切断し粘着末端を充
填した後、連結してＹＲρ７の一方のＥｃｏＲＩサイト
が除去された　９１１１Ｅ１０３２　（５，８ｋｂ）を
調製する。

（３）プラスミド　ｐＵｃ訃βＥ　（２，９ｋｂ　）の
調製プラスミド　ρＹＴ３・２４り特開昭５８−９２６
９６号公報、２頁記載）をＨａｅ［ＩＩで切断して、ヒ
トのβ−エンドルフィン遺伝子（９３ｂｐ　、以下βε
ＤＮＡという）を含む１６０１）ｐのＨａｅｍ　〜Ｈａ
ｅ［Ｉ［断片を採取する。

一方、）７一ジＭＩ３ｓｐ？　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ　−５ｅａｒｃｈ　９１．３０９〜３２１
頁記載）のＲＦ　Ｉ　　ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を旧ｎ
ｃＩＩで切断し、エタノールに溶解するＨｉｎｃＩＩ　
〜Ｈｉｎｃｌｌ断片５’ＧＡＣＣ丁ＧＣＡＧＧＴＣ３を
除いた旧ｎｃ■部位に、上記βＥ　ＤＮＡを含む１６０
　ｈｐのＤＮＡ断片を連結し大ＨＭを形質転潰した。形
質転攪株カラＢＲＦＩ　　ＯＮＡヲ＊ｉ＆シ、これをＢ
ａｍＨＩで切断して得られた　１７２　ｂｐのＢａｍＨ
Ｉ　−Ｂａｍ）ｌ　Ｉ断片を、プラスミドｐＵＣ８［８
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ　−ｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、発行のＢＲＬカタログ（Ａｕ
ｇｕｓｔ　Ｉ。

１９８３　）、Ｃａｔ　／　Ｎｏ、５３５９５Ａ記載］
のＢａｍＨＩサイトに挿入してｐＵｃ８−βＥ　（２，
９ｋｂ　）を得る。

（４）プラスミド　ｐＲＥＩ０４６　（７，４ｋｂ　）
の！ｌｌ製ρＬＳＯＩ　（４，４ｋｂ　）の、プロモー
ター配列及びリーダー配列（第１図に示す本発明の塩基
配列を含む）を含むＥｃｏＲＩ　〜Ｈｉｎｄｍ断片（１
，４ｋｂ）とｐＵｃ８−βＥ　（２，９ｋｂ）のＨｉｎ
ｄｍ　〜ＥｃｏＲＩ断片（０，２ｋｂ、βＥ　ＤＮＡを
含む）とを、ｐＲＥＩＱ３２　（５，８ｋｂ）のＥｃｏ
ＲＩ切断部位に、連結してｐＲＥ＋０４８　（７，４ｋ
ｂ　）を得る。（第２図参照） （５）プラスミドｐＲＥ１０５２　（５，２ｋｂ）の調
製ｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）のＴＲＰＩを含むＥ
ｃｏＲＩ　〜Ｐｓｔ　１断片（０，８ｋｂ　）と、２μ
■プラスミドの複製開始点を含むＰｓＬ■〜εｃｏＲＩ
断片（２ｋｂ　）と、ｐＢＲ３２２のＰｖｕ　Ｉｆ　〜
ＥｃｏＲＩ断片（２，３ｋｂ　’）とを、連結してｐＲ
Ｅ１０５１　（５，１ｋｂ）を作製した後ＥｃｏＲ１で
部分切断し、粘着末端を充填後連結して、ｐＲＥＩ０５
１の一方のＥｃｏＲＩ切断部位を欠いたｐＲＥＩ０５２
　（も、２　ｋｂ　”）を得た。（第３図参照）（６）
プラスミドｐＲＥＩ０５９　（６，８ｋｂ　）の調製前
記（４）で得たρＲＥ１０４６のプロモーター配列、リ
ーダー配列及びβＥ　ＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ〜Ｓ
ａｇａ　Ｉ断片（１，６ｋｂ）と、ｐＬｓＯＩ　（４，
４ｋｂ）の、ターミネータ−配列を含む１ｌｉｎｃ■〜
ＥｃｏＲＩ断片（０．３ｋｂ）とを採取する。

一方、ｐＲＥ１０５２　（５，２ｋｂ）をＥｃｏＲ［で
切断し、次いでバクチリアルアルカリンフォスファター
ゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ、ＢＡＰ）を加えて末端のリン酸基を外
した後、これを、上記二つのＤＮＡ断片と連結してプラ
スミドｐＲＥＩ０５９　（６，８ｋｂ　）を得る。（第
４図参照） （７）プラスミドｐＲＥ１０６６　（６，６ｋｂ　）の
調製ｐＲＥＩ０５９をＨｉｎｃＩＩ、Ｂａｎ　ＩＩ及び
ＥｃｏＲＩで切断して、Ｂａｎ■−Ｈ１ｎｃ■断片（＋
、５　ｋｂ）　、ＨｉｎｃＵ〜ＥｃｏＲＩ断片（０，５
ｋｂ）及びＢａ５ＩＩ　〜ＥｃｏＲＩ断片（４，６ｋｂ
）　ヲｖ４製し、；−ｔＬ　ラ’ｔ　連結Ｌ／　１”　
ＴＩＲＥ　１０５９　（７）旧ｎｃｌｌ〜Ｈｉｎｃ１１
部位が欠失しているプラスミドｐＲＥ１０６６　（６，
６ｋｂ　）を得る。（第５図参照）（発明の効果） プラスミドｐＲＥ１０６６は、βＥ　ＤＮＡ配列の上流
に第１図に示す、本発明の僅か６６塩基からなる短いシ
グナル配列を有するのみであるが、このプラスミドを、
例えば、酵母サツカロマイセス・セレビシｇ　ＹＮＮ２
７株に導入し、形質転換株を培養すると、後記実施例に
示すように、高い効率でβ−エンドルフィンを培養液中
に分泌させることができる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次の■〜■の方法によった。

■［制限酵素によるＤＮＡの切断と回収］制限酵素によ
る切断用緩衝液は、下記４種類を用い（＋）　〜（３）
の使い分けは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅ−ｒｉ
ａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（＋９８１）（Ｃｏｌｄ　ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に従った
。また切断条件は、２単位／μｇＤＮＡの制限酵素を用
い、３７℃または６５℃、３０分間処理する。

次いで、ＴＥ緩衝液（ＩＱ　ｍＭ　　のトリス塩酸ｐＨ
８，０及び　ｌ　ｍＭのＥＤＴＡからなる）で飽和した
フェノールで１回抽出し、エーテルでフェノールを除き
、２倍容のエタノールを加えて一２０℃で３０分間放置
した後、遠心分離してＤＮＡを回収する。

（＋）低塩濃度緩衝液 ＩＱ　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４）　、　１０　ｍ
Ｍの硫酸マグネシウム及びｌ　ｍＭのジチオスレイトー
ルからなる。

（２）中塊濃度緩衝液 ５０　ｓ＋ＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，４）＋Ｈｏ■阿の硫酸マグネシウム及び１　ｍＭの
ジチオスレ（トールからなる。

（３）高塩濃度緩衝液 １００　ｓＭのＮａＣｌ　、５０　ａ＋Ｍのトリス塩酸
（ｐＨ７，４）及びｔｏ　ｍＭの硫酸マグネシウムから
なる。

（４）制限酵素Ｓａｇａ　Ｉ用緩衝液 ２０　ｍＭのにＣ１，１０■Ｈのトリス塩酸（ｐＨ８，
０）、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及びＩ　ｍＭのジチ
オスレイトールからなる。

■［大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　）１８１０１からのプラ
スミドＤＮＡの調製］ （１）ミニ調製法（ｍ１ｎｉ　ｐｒｅｐ法）　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７巻、１５１３〜１５２３
頁（＋９７９）］大大腸菌１８１０１を宿主とし、０．
５１のし一ブロス（１０ｇのペプトン、５ｇのイースト
・エキス、１８のグルコース、５８のＮａＣｌ／　Ｉか
らなるｐｉｔ　？、２）を用いて一夜間培養し、遠心分
離して集菌した面体を、１００μＩの溶液Ａ（５０ａ＋
Ｍのグルコース、１０＋ｇＭのＥＤＴＡ、　　２５ｍＭ
のトリス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２腸８／■
１からなる）に懸濁し室温で３０分間放置する。

次いで氷水中で２００μｍの溶液８［ＩＸの５ＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む０．２　ＮのＮａＯＨ］
を加えて振盪してし、同時にＤＮＡの変性を行う。

１５０μｍの３Ｍ酢酸ソーダ溶液を加え水冷後、遠心分
離し、上清に冷エタノールを加え、−２０℃に冷却して
遠心分離し、沈澱を集める。

沈澱を、溶液Ｃ（５０ｍＭのトリス塩酸及び０．１Ｈの
酢酸ソーダからなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エ
タノールを加え、沈澱するＤＮＡを洗浄し、減圧上乾燥
し一２０℃で保存する。

（２）大量調製法 ２００１のし一ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬
剤を含む）に大腸菌ＨＢＩＯｆを植菌し、−夜間培養し
、集菌後、１５　ｍｌの５ＴＥＳ緩衝液［ＴＥＳ緩衝液
（１０ｍＭのトリス塩＃（９１１７，４）　、１１Ｈの
ＥＤＴＡ及び５０　ｍＨのＮａＣＩからなる）に２５ｘ
のサッカロースを添加したものコに懸濁し、ＥＤＴＡ、
リゾチーム及びリボヌクレアーゼＡ（シグマ社！１）を
夫々　３０　ｍＭ、　６００μ８／１及び５０μ８／−
１加え、更に氷水中でプロナーゼＥを５００μ５ｌ−１
添加する０次いで、ＳＤＳを　１ｘとなるように加え、
３７℃で振盪し、氷水中に戻し、ＮａＣＩを終濃度ＩＭ
となるように添加した後、遠心分離し、上清に、２倍容
の冷エタノールを加え、−２０℃に保持し遠心分離して
ＤＮＡを沈澱として回収し、減圧下乾燥し、−２０℃で
保存する。

１１１［Ｔ４［ＩＮＡリガーゼによる連結］連結する２
個のＤＮＡ断片は、　１μ８／ｌＯμｍに４るように、
連結用緩衝１１１［６６ａ＋Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７，
５）　、６．６　ｍＭの塩化マグネシウム、１０−Ｍの
ジチオスレイトールからなる］に溶解し６５℃で１０分
間処理した後、４℃で６６μバのＡＴＰ　（アデノシン
トリフオスフェート）を加え、更にＴ４リガーゼを粘着
末端の場合はＯ０ｌ単位／μｇ　ＤＮＡ　。

また平滑末端の場合はｌ単位／μｇ°ＤＮＡになるよう
に加えて４℃で　１８８時間応させた後、６５℃で１０
分間処理する。

■［大腸菌の形質転換（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｌ　Ｇｅ　−ｎｅｔｉｃｓ（１９８＋）　（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｖｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）
］５■１のし一ブロスに、大ｌＩ薗ＨＢＩＯＩを植菌し
、−夜間培養する。この０．２　ｍｌを２０−１のし一
ブロスに植え、３７℃でクレットユニットが６０に達す
るまで振盪培養する。菌体を集め水冷した５０１Ｍの塩
化カルシウムとＩＯ＋Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８，０）と
からなる緩衝液１０　ｍｌに懸濁し、３０分間水冷する
。

遠心分離した菌体を１−１の塩化カルシウム溶液に懸濁
し、この０．１１を　１０μｍのＤＮＡ溶液と飛合し０
℃で３０分ｍ１４２℃で２分間インキュベートした後、
１．５１のし一ブロスを加え３７℃で３０分間培養し、
この０．１１を寒天培地に植える。

ｖｃｓｔヌクレアーゼによる［ｌＮＡ粘着末端の除去］
粘着末端を持つＤＮＡを、２００μｍの高塩濃度緩衝液
［３０ｍＭの酢酸ソーダ（ｐＨ４，２５）　、０．３　
Ｍのｓｈｃ＋及び４ａ＋Ｈの硫酸亜鉛からなる］に溶解
し、Ｓｌヌクレアーゼを２０単位／μｓ　ＤＮＡ加え、
２２℃で４０分間処理し、ＴＥ緩衝渣で飽和したフェノ
ールで抽出処理した後、エーテルでフェノールを除き、
冷エタノールを加え、−２０℃に冷却し、遠心分離゛に
より、沈澱した　ＤＮＡを回収する。

＊［ＢａｍＨＩリンカ−のリン酸化］ ＢａｍＨＩリンカ−＜　Ｂ、Ｒ，Ｌ社製）５　ＣＣＧＧ
ＡＴＣＣＧＧ　３’ ＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ は、末端にリン酸基が付いていないので、Ｔ４キナーゼ
でリン酸化を行なった。

３　ｎ　ｓｏｌのＢａａ＋ＨＩリンカ−を、４１μｍの
８０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）及び１２　ｍＭの塩
化マグネシウムに溶解し、６０℃で１０分間インキュベ
ートした後、３７℃で１０　ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールと、２０　ｍＭのＡＴＰを加え、更に　１０単位
のＴ４キナーゼを添加して３７℃で３０分間処理した後
、−２０℃で保存する。

■［Ｂａ■Ｈｌリンカ−の平滑末端への連結］平滑末端
のＤＮＡ断片（１，２ρ閤０１末端）と上記■でリン酸
化した　８ａａ＋ＨＩリンカ−（１００ｐ　ａ＋ｏｌ末
端）を連結用緩衝液［６６ｓＭのトリス塩酸（ｐＨ７，
５）　、　６．６　ａ＋Ｈの塩化マグネシウム、１０　
ｓＭのジチオスレイトールからなる］に溶解し、１単位
のＴ４リガーゼを加え４℃で１８時間反応後、［ｌａｍ
＋ＨＩで処理して余分のＢａｍＨＩリンカ−を除き、Ｔ
Ｅ緩衝液で飽和したフェノールでＤＮＡを抽出し、エー
テルでフェノールを除去後エタノール沈殿でＤＮＡをＢ
Ｖする。

■［プラスミド　ＤＮＡのバクチリアルアルカリンフォ
スファターゼ（ＲＡＰ　）処理］ プラスミド　ＤＮＡの自己連結を阻止するため、プラス
ミド　ＤＮＡの制限酵素部位とＤＮＡ断片との連結に先
だって、プラスミド　ＤＮＡを予めＢＡＰで処理する。

制限酵素で切断したプラスミド　ＤＮＡ（１０ｐ　ｍｏ
１５′末端）を２００μｍのＢＡＰ緩衝液［１０５Ｍの
トリス塩酸（ｐ）Ｉ　８．０）及び０．１　ｍＭのＥＤ
ＴＡからなる］に溶解し、１００単位のＢＡＰを加え、
６５℃で１時間反応後、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノー
ルで抽比処理し、エーテルでフェノールを除去し、エタ
ノール沈澱によりプラスミド　ＤＮＡを回収する。

実施例 （１）　フラスミＦ　ｐＬｓＯＩ（４，４ｋｂ）（Ｄ調
製酵母サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ
　−５ｉａｅ　）ＩＦＯｌｌ３６ｃ７）染色体［ＩＮ４
５００ｕｇをｓｏｏμ＋の緩衝液［１００ｍＭ（Ｄ　）
リス塩酸（ｐＨ７，５）、５０　ｗ＋ＭのＮａＣｌ　、
１０　ｓ＋Ｈの塩化マグネシウム及びＩ　ｍＭのジチオ
スレイトールからなる］中で　１５単位のＥｃｏＲＩで
３７℃、１夜間処理して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、２　ｋｂ前後のＤＮＡ断痔を集めた。こ
れをプラスミド　ｐｕｃｓ３をＥｃｏＲＩを盾いて切断
した断片１μｓとＴ４リガーゼ２単位堰用いて連結し、
得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ８３株を形質転換し、
アンピシリン（Ａｐｙ）耐性株を選択した。

合成オリゴヌクレオチド ５’　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３’をプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ない、
陽性のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを分離し、
制限酵素による解析と塩基配列の決定により、Ｃｅ１ｌ
、３０巻、９３７頁（＋９８２　）の記載と一致する塩
基配列を有する酵母のα因子ＤＮＡを含むプラスミド　
ｐＬｓＯｌ（４，４ｋｂ）を選択株数した。

（２）プラスミドｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）の調
製プラスミド’ＩＲｐ７　（５，７ｋｂ　）をＥｃｏＲ
Ｉで部分切断し、粘着末端を充填した後、Ｔ４リガーゼ
で連結してＹＲｐ７の一方のＥｃｏＲＩサイトが除去さ
れたｐＲＥ　１０３２　（５，８ｋｂ）を調製した。

（３）プラスミド　ｐＵｃ訃βＥ（２゜９　ｋｂ　）の
調製プラスミド　ｐＹＴ３−２４をＨａｅｍで切断して
、βＥＤＮＡ　（９３ｂｐ　）を含む１６０　ｂｐのＨ
ａｅｍ　〜ｌｌａｅｍ断片を採取した。

一方、ファージ旧３−ｐ７のＲＦＩＤＮＡをＨｉｎｃ■
で切断し、エタノールを添加してエタノールに溶解する
断片５’　ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣ３’　（Ｎ１ｎｅ
■〜Ｈｉｎｃ■）を・除去した後、Ｈｉ　ｎｃ　ＩＩ部
位に、上記βＥ　ＤＮＡを含Ｃ１６０ｂｐのＨａｅＩＩ
Ｉ　〜Ｈａｅｍ断片をＴ４リガーゼで連結した。これを
大腸菌ＨＢＩ旧株に導入した。得られた形質転換株から
　Ｄ）ＪＡを！１ｌｉ１シこれを８ａａｌｌｌで切断し
、得られたＢａｗｌ（Ｉ　−８ａｍ＋　Ｉ（Ｅ断片を、
プラスミド　ｐｕｃｓのＢａａ＋ｌＩＩサイトに４大し
てρＵＣ８−βＥ　（２，９ｋｂ　）を得た。

（４）　フラスミＦ　ｐＲＥ１０４６　（７，４ｋｂ　
）（７）Ｉｌｌ！（イ）　　ｐＬｓＯＩ　（４，４ｋｂ
　）をＥｃｏＲＩ及びｌｌｉｎｄｍで切断してプロモー
ター配列及びリーダー配列を含むＥｃｏＲＩ　−）１ｉ
ｎｄｌＩ［断片（＋、４　ｋｂ）を得た。

（［：Ｉ）ｐ（ＪＣ８−βＥ（２，９ｋｂ）を　Ｉ（ｉ
ｎｄ［及びＥｃｏＲＩで切断して）ｌｉｎｄｍ　〜Ｅｃ
ｏＲＩ断片（０，２ｋｂ　）を得た。

（ハ）　ｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）をＥｃｏＲＩ
で切断し、これを上記（イ）及び（ロ）で得た　［）Ｎ
Ａ断片とＴ４リガーゼを用いて連結してｐＲＥ１０４６
　（７，４ｋｂ　）を得た。

（５）プラスミドρＲε１０５２　（５，２ｋｂ　）の
ＷＲａ（イ）　ｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）をＥｃ
ｏＲＩ及びＰｓｔｌで切断してＴＲＰＩを含むＥｃｏＲ
Ｉ　〜Ｐｓｔ　Ｉ断片（ｏ、８ｋｂ　）を得た。

（ロ）２μｍプラスミドをＥｃｏＲ［で切断し、その粘
着末端を充填して平滑末端とした後、Ｐｓｔ　１で切断
してａ裂開始点を含むＰｓｔｌ〜εｃｏＲＩ断片（２ｋ
ｂ）を得た。

（ハ）上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片を、ｐＢ
Ｒ３２２をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ　ＩＩで切断したＰｖ
ｕ■〜ＥｃｏＲＩ断片（２，３ｋｂ　）と共にＴ４　Ｄ
Ｎ＾リガーゼにより連結してｐＲＥ１０５１　（５，１
ｋｂ　）を作製しＥｃｏＲ１で部分切断した後、粘着末
端を充填して平滑末端としてＴ４リガーゼで連結し、一
方のＥｃｏＲＩ切断部位を欠失したｐＲＥ１０５２　（
５，２ｋｂ　）を得た。

（６）プラスミド　＋）ＲＥＩ　０５９　（６，８ｋｂ
　）の調製（イ）　ｐＲＥ１０４６　（７，４ｋｂ　）
をＥｃｏＲｒ及びＳｅａ　１で切断し、得られたプロモ
ーター配列、リーダー配列及びβＥ　ＤＮＡ配列を含む
ＥｃｏＲＩ　〜５ＩＩａ　Ｉ断片（１，６ｋｂ）を採取
した。

（口’）　　ｐＬｓＯｌ　（４，４ｋｂ）を旧ｎｃＩＩ
及びＥｃｏＲ１で切断しターミネータ−配列を含むＨｉ
ｎｃＩＩ〜ＥｃｏＲ！断片（０，３ｋｂ　）を採取した
。

（ハ）　ｐＲＥ１０５２　（５，２ｋｂ　）をＥｃｏＲ
Ｉで切断し、ＲＡＰを加えて末端のリン酸基を外した後
、上記（イ）及び（ロ）で得た［ｌＮＡ断片とＴ４リガ
ーゼを用いて連結してプラスミドｐＲＥＩ０５９　（６
，８ｋｂ　）を得た。

（７）プラスミドｐＲＥ１０６６　（６，６ｋｂ　’）
の調製（イ）　ｐＲＥ１０５９　（６，８ｋｂ　）をＨ
ｉｎｃｌｌ、　ＢａｎＩＩ及びＥｃｏＲＩで夫々切断し
て、８ａｎＩ［〜Ｎ１ｎｅ■断片（１，５ｋｂ、このう
ちＨｉｎｃ１１部位から上流の６６塩基が第１図に示す
シグナルペプチドの配列である）、Ｈｉｎｃ■〜Ｅｃｏ
ＲＩ　（０，５ｋｂ）断片及びＢａｎ■〜ＥｃｏＲ１（
４，６ｋｂ）　断片ヲｒＪ４Ｉ！シ、これらをＴ４リガ
ーゼで連結してｐＲＥ１０５９のＨｉｎｃＩＬ〜Ｈｉｎ
ｃ■部位が欠失したプラスミドＰＲＥＩ０６６　（６，
６ｋｂ　）を得た。

（８）プラスミドｐＲＥ１０６６の塩基配列の確認ｐＲ
ＥＩ０６６　ＤＮＡを８ａｉ＋ＨＩで切断し、５末端の
リン酸を８ＡＰ処理により除去し、γ−Ｐ−ＡＴＰとポ
リヌクレオチドキナーゼにより　５末端を　Ｐで橡識し
た。

これをＡｖａ　Ｉで切断して得られた約３２０　ｂｐの
断片をポリアクリルアミドゲルから溶出し、マキサム−
ギルバート法により塩基配列を決定し、予期した通りの
継ぎ方であることを確認した。

（９）プラスミド　ｐＲＥＩ０６８による酵母サツカロ
マイセス・セレビシェＹＮＮ２７株の形貿転換酵母サツ
カロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ　−５ｉａ
ｅ）　ＹＮＮ２７株を、ＹＰＤ培地（ｌｚの酵母エキス
、２χのペプトン及び２ｚのグルコースからなる　）で
−夜間培養した培養液０．５１を２０麿１のＹＰＤ培地
に植え、３０℃でクレットユニット６０まで振盪培養す
る。この１０−１を遠心分離して得た菌体な１０１のＴ
Ｅ緩衝液で洗浄し、ｌ■１のＴε緩衝液に懸濁する。こ
の０．５１に０．５　ｍｌの０．２　Ｍ酢酸リチウム、
１０　ｓＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）及び１　ｍＭの
ＥＤＴＡを加え、３０℃で１時間保持した後、氷水中で
冷却する。

得られた画体懸濁液１００μｍにＤＮＡ溶液１０μｍを
加え、０℃で３０分間保持した後、２００μｍの７０　
！ポリエチレングリコール４０００溶液を加え、３０℃
で１時間、次いで４２℃で５分間保持した後、集菌し、
０．５１１の水で洗浄後０．３■１の水に懸濁し、プレ
ート　１枚に　０．１　ｍｌ植える。

（１０）β−エンドルフィンの分泌量 上記（９）で得たプラスミドｐＲＥ１０８６を含む酵母
を２日間培養した後、遠心分離し、上溝について、β−
エンドルフィン［ＲＩＡ］キットＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄＮｕｃｌｅａｒ社、カタログ番号ＮＥに−００３）を
使用し、カタログ記載の方法に従ってラジオイムノアッ
セイを行なった結果、上清中のβ−エンドルフィ・ン量
は、７３．７　ｎｇ／ｍｌであった。

なお前記のプラスミド　ｐＲＥＩ０４６及びｐＲＥＩ０
５２により、四槽にサツカロマイセス・セレビシェＹＮ
Ｎ２７株を形質転損し、培養後、遠心分離した上清につ
いて、上記と同一方法により測定したβ−エンドルフィ
ン量は、夫々＋８．３　ｎｇ／ｍｌ及び０．２　ｒ＋ｇ
／ｍｌであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のポリヌクレオチドのアミノ酸配列及び
該アミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を示し、第２
〜第６図は本発明におけるプラスミドの構成ルートを示
す模式図であって、図中、ＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉ
ｎｄｍを、Ｓは５ａｌｌを、ＰはＰｓｔｌを、ＢはＢａ
ｍＨＩを、ＰｖはＰｖｕ　ＩＩを、ＳＩＩはＳｌａ　Ｉ
を、Ｈｃは旧ｎｃＩＩを、ＯｎはＢａｎ　ＩＩを、Ｘは
Ｘｂａ　Ｉを夫々示す。 出願人　工業技術院長　　等　々　力　　達第　１　図 Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　　Ｌｌ
ｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａ１５’　ＡＴＧ　Ａ
ＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＡＣ
Ｔ　ＧＣＡ　ＧＴＴＴＡＣＴＣＴ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　Ａ
ＧＴ　ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＴＧＡ　ＣＧＴ　ＣＡＡＬｅｕ
　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ
　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　ＡｌａＴＴＡ　Ｔ
ＴＣＧＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＴＣＣＧＣＡ　ＴＴＡ　Ｇ
ＣＴ　ＧＣＴＡＡＴ　ＡＡＧ　　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＡＧ
Ｇ　ＡＧＧ　ＣＧＴ　ＡＡＴ　　ＣＧＡ　　ＣＧＡＰｒ
ｏ　　Ｖａｌ ＣＣＡ　ＧＴＣ３ ＧＧＴ　ＣＡＧ あ２凪 第３図 第　５図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする
   ポリヌクレオチド 【アミノ酸配列があります】