JPH01124384A - 分泌シグナルペプチドをコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
に間する。

（従来の技術と問題点） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を備え、ま
た、食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生
活と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子
工学に於ける宿主としての開発が期待されている。

しかし、酵母の細胞表層は細胞膜の外側に強固な細胞壁
を有するため、遺伝子組換え技術によって生産された有
用物質（異種蛋白質）の精製が困難な場合が多く、精製
を簡略化するために生産物を菌体外に分泌させる系の開
発が望まれている。

また、分泌生産は連続培養が可能となるので、大幅な生
産量の増加が期待され、更に菌体内プロテアーゼによる
生産物の分解が防止される等そのメリットは大きい。

（問題点を解決するための手段） クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓｌａｃｔｉｓ）由来の線状プラスミドｐＧＫＬ１
をもつ酵母は、それが生産し分泌するキラー毒素蛋白質
によって、ｐＧＫＬｌをもたないある種の酵母を殺す、
このキラー毒素蛋白質は、９７　ｋｄ、　３１ｋｄ及び
２８　ｋｄの３つのサブユニットからなり、キラー毒素
前駆体のＮ末端のシグナルペプチドによって培地中に放
出されると考えられている。またｐ６にＬｌ上にはキラ
ー遺伝子とともにキラー耐性遺伝子が存在し、それ自身
の生産するキラー毒素に対して抵抗性を示す、ｐＧＫＬ
ｌの全塩基配列が決定された結果、このプラスミドは５
個のオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、
このうち０ＲＦ３は９？　ｋｄと３１ｋｄの遺伝子であ
り、０ＲＦ４は２８　ｋｄの遺伝子であり、また、０Ｒ
Ｆ５はキラー耐性遺伝子であることが明らかにされてい
る［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈｓ
　１２巻、７５８１〜７５９７頁（１９８４年）、同１
５巻、１０３１〜１０４６頁（１９８７年）及び特開昭
６０−１２９８３号参１］。

本発明者等はさきに、上記９７　ｋｄと３１　ｋｄのサ
ブユニットの領域から、酵母面体内で生産された蛋白質
を効率よく分泌させることのできるシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ（以下ＤＮＡと記す）配列を見出した
く特願昭６１−２８０７４７号）。

本発明者等は、上記知見に基づいて、さらに検討の結果
、前記０ＲＦａ中の２８　ｋｄのサブユニット領域から
も、酵母面体内で生産された蛋白質を効率よく分泌させ
ることのできるシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列を見出し本発明を達成したものである。

本発明を以下に詳細に説明する。

本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
は、下記の１９個のア°ミノ酸をコードする５７塩基対
（ｂｐ）からなる。

ＭＥＴ　　ＬＹＳ　　ＩＬＥ　　ＴＹＲＨＩＳ　　ＩＬ
ＥＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＡ　　ＴＡＴ　　ＣＡＴ　
　ＡＴＡＰＨＥ　　ＳＥＲＶＡＬ　　ＣＹＳ　　ＴＹＲ
ＬＥＵＴＴＴ　　ＡＧＴ　　ＧＴＴ　　ＴＧＴ　　ＴＡ
Ｔ　　ＣＴＡＩＬＥ　　Ｔ）ＩＲＬＥＵ　　ＣＹＳ　　
ＡＬＡ　　ＡＬＡＡＴＡ　　ＡＣＡ　　ＴＴＡ　　ＴＧ
Ｔ　　ＧＣＴ　　ＧＣＴＬＡ ＣＡ 本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
は、前記のｐＧにＬｌにおけるキラー毒素蛋白質のうち
、２８　ｋｄのシグナルペプチドをコードする領域から
単離することができる。その他、化学合成により調製す
ることもできる。

本発明のｔ）ＨＡ配列を、適当なプラスミド・ベクター
上の、プロモーター配列と所望の蛋白質をコードする外
来遺伝子との間に挿入して酵母宿主中で発現させた場合
、目的とする蛋白質を効率よく分泌させることができる
。

以下に、マウスのαアミラーゼの遺伝子をマーカーとし
て使用した、本発明のＤＮＡ配列を含有する分泌ベクタ
ーの構成法と有用性について詳細に説明する。

［分泌ベクターの構築］ （１）プラスミドｐＫＥＮ５１６（１１，１ｋｂ）の作
成ｐＧＫＬＩ　ＤＮＡの全領域をを環状プラスミドへ挿
入する。

ｐｃにＬＩ　ＤＮＡの（８，９ｋｂ）の５′末端には蛋
白質が共有結合しているので、先ずｐ　Ｇ、Ｘ　Ｌ　１
を０．ＩＮ　Ｎａ０）１と３０℃で３０分間処理して結
合蛋白質を分解する１次いて中和した後、フェノール抽
出し、セファアクリルＳ−１０００（ファルマシア社ｌ
りを用いて精製する。

このＤＮＡをＲａｍ）Ｉ　Ｉで切断し、得られた左右２
つの断片を、Ｅ、ｃｏｌｉとＢ、５ｕｂｔｉ　ｌ　ｉｓ
のクローニングベクターであるプラスミドｐＬｓ３５４
［ＥＭＢｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ、３巻、７６１〜７６６頁
（１９８４年）］をＳｅａ　Ｉ及びＢａＩＩＨＩで切断
した断片にクローニングして、右断片を含む１１ＧにＦ
２Ｏ３（９，８ｋｂ）と左断片を含むｐＧＫＦ１０７（
９，８ｋｂ）とを作成する。

次いでｐＧＫＦ＋０６をＢａｗｌ　Ｉ及びＥｃｏＲＥで
切断した断片（４，４ｋｂ）と、ｐｃにＦ２Ｏ３をＢａ
ｍＨＩ及びＰｖｕ　Ｉで切断した断片（５，５ｋｂ）を
作成し、これ等２つの断片を、プラスミドｐＫＥＮ４０
５［：ｐＢＲ３２２をＰｖｕ　ＩＩで切断し、ＥｃｏＲ
Ｉリンカ−（ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結合し、次いでＥ
ｃｏＲＩで切断した後、連結して得られる、ρＢＲ３２
２のテトラサイクリン遺伝子を含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｖ
ｕ　ＩＩ断片（２，１ｋｂ）を欠いたブラスミドコのＥ
ｃｏＲＩ　−Ｐｖｕ！断片（ｏｒｉを含む１．２　ｋｂ
）と連結し、ｐＧＫＬｌの全領域を含むプラスミドｐＫ
Ｅ８５１６（１１，１ｋｂ）を得る（第１図）。

（２）プラスミドｐＮ％１００２（３，８ｋｂ）の作成
プラスミドｐにＥＮ５１６をＸｍｎ　Ｉ及びＥＣＯＲＩ
で切断し、得られるｐＧＫ、Ｌｌ上の２８　ｋｄのキラ
ー毒素遺伝子を含む１．２　ｋｂの断片を、プラスミド
ｐＵｃ１３（ファルマシア社カタログＰ−Ｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ、　１９８６年版、６０頁、２７−４
９５４−０１記載）のＥｃｏＲＩ　、　Ｓｅａ　１部位
に挿入してプラスミドｐＮＷＯＯ２（３，８ｋｂ）を作
成する（第１図）。

（３）プラスミドｐ）ｌ讐０４３（２，８ｋｂ）の作成
ｐＮν００２上の２８　ｋｄのキラー毒素遺伝子の翻訳
開始コドンの５９　ｂｐＪ：流からシグナルペプチドを
コードする１１３　ｂｐ領領域、プラスミドｐｕｃ１２
（ファルマシア社カタログＰ−Ｌ　ｆｌｉｏｃｈｅ＋ｗ
ｉｃａｌｓ、　１９８８年版、６０頁、２７−４９５２
−０１）に挿入してプラスミドｐＮＷＯ４３（２，８ｋ
ｂ）を作成する。

即ち、ｐＮＷＯＯ２（３，８ｋｂ）をＲｓａ　Ｉ及びＰ
ｓｔ　Ｉで切断して、本発明の分泌シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列を含むＲｓａ　ｒ　−Ｐｓｔ　Ｉ
断片を採取し、これをｐＵｃＩ２の旧ｎｃＩＩ　−Ｐｓ
ｔ　１部位に挿入してプラスミドｐＮ１１１０４３（２
，８ｋｂ）を作成する（第２１！Ｉ）。

（４）プラスミドρＮ讐０４８（２，８ｋｂ）の作成ｐ
ＮＷＯ４３をＢａｍ＋ＨＩで切断し、その切断部位から
ヌクレアーゼＢＡＬ３１で［ｌＮＡを処理した後、バク
チリアル　アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）処理を
行い、これにＢｇｌ■リンカ−（ｐＣＡ、ＧＡＴＣＴＧ
）を結合させてｐＧＫＬｌのシグナル配列を含むプラス
ミドｐＮ％１０４８（２，８ｋｂ）を作成する（第２図
）。

（５）プラスミドルＮ誓０５１（４，３ｋｂ）の作成ｐ
６にＬｌのシグナル配列と酵母ホスフォグリセレートキ
ナーゼ遺伝子（ＰｉＫ）のプロモーター配列を含むプラ
スミドｐＮＷＯ５１（４，３ｋｂ）を作成する。

ｐｃにし１のプロモーターは環状ベクター中では働かな
いとされているので、酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）のホスフォグリセレートキナーゼ遺伝子（山）のプロ
モータ配列を含むプラスミドｐＭＡ９１（９，５ｋｂ）
［Ｇｅｎｅ、　２４巻、１−１４頁（１９８３）記載］
を使用し、山のプロモーター配列を含む領域を上記プラ
スミドｐＮＷ０４８のシグナル配列の上流（５′側）に
結合させ、この配列を含有するプラスミドｐＮＷＯ５１
（４，３ｋｂ）を作成する。

即ち、ｐＭＡ９１（９，５ｋｂ）をＥｃｏＲＩ及びＢｇ
ｌＩ［で切断して得た山のプロモーター配列を含むＥｃ
ａＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　（１，４ｋｂ）断片と、前記
ｐＮＷＯ４８をＰｓｔ　Ｉ及びＢｇｌＩ［で切断して得
たｐＧＫＬｌのシグナル配列を含む断片とを、プラスミ
ドｌ］Ｕｃ１２のＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ部位に挿入
してプラスミドｐＮν０５１（４，３ｋｂ）を作成する
（第２図）。

（６）プラスミドｐＮＷＯ５０Ｃ４，１ｋｂ）の作成マ
ウス唾液腺由来のアミラーゼ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＭｓａ１０４［ｃｅｌｌ、１７９巻、２１頁（１９
８０年）］をＰｓｔ　Ｉで切断し、得られたアミラーゼ
遺伝子を含むＰｓｔ　Ｉ〜Ｐｓｔ　Ｉ断片を、ρＵＣｌ
３のＰｓｔ　１部位に挿入することによって作成された
プラスミドｐＲＥ１０７５（４，３ｋｂ）（特開昭６２
−９６０８６）を、Ａｐａ　Ｉで切断し、Ａｐａ　Ｉ切
断部位をＳｔヌクレアーゼで処理して平滑末端とした後
Ｄｒａ　Ｉで切断して、アミラーゼ前駆体の最初の１５
個のアミノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白質をコードするＡ
ｐａ　１〜口ｒａＩ断片を採取する（この遺伝子はアミ
ラーゼの分泌シグナルを欠失している）。これにＢａ５
ａｌ　Ｉリンカ−（例えば１２ｍｅｒ）を結合し、Ｂａ
ｗｌ　Ｉで切断して両端にＢａｍＨＩ部位を持つＩ）Ｎ
Ａ断片を得る。この断片を平滑末端にしたのち、プラス
ミドｐＬＩｃ９［Ｇｅｎｅ％１９巻、２５９〜２６８頁
（１９８２年）］の旧ｎｃｌ［部位に挿入してプラスミ
ドｐＮν ０５０を作成する。

（７）プラスミドｐＭ７５７（５，２ｋｂ）の作成第３
１！ｌに示すルートにより、プラスミドＹＲｐ７Ｎａｔ
ｕｒｅ、、　２８２巻、３９〜４３頁（１９７９）記載
］の■ム及びＡＲ５Ｉを含むプラスミドｐＲＥ１０３２
（特開昭６ｌ−２７１９８８）と、２μ園プラスミドと
プラスミドｐＢＲ３２２とから、■ム、Ａｐｒ及びｐＢ
Ｒ３２２と２μ爾プラスミドの双方の複製開始点を含む
酵母と大腸菌のシャトルベクターｐＲＥＩ０５２（特開
昭６１−２７１９８８参照）を作成し、次いでｐＲＥ＋
０５２をＡａｔＩＩで切断した後、Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ
ヌクレアーゼ処理して平滑末端にした。この末端にＢｇ
ｌＩＩリンカ−を結合し、ｓｇ＋ｎで切断した後、結合
することによりプラスミドｐＭ７５７を作成する。

（８）マウスアミラーゼの分泌ベクターｐＮν０５２（
８，１ｋｂ）の作成 ｐＮＷＯ５１をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉで切断して、
ＰＧＫのプロモーター配列及びｐＧＫＬｌのシグナル配
列を含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を採取し、一方
、ｐＮＷＯ５０をＰｓｔ■及びＢａｍＨＩで切断してマ
ウスアミラーゼ遺伝子を含むＰｓｔｌ−Ｂａ−）ＩＩ断
片を採取し、これ等２つのＤＮＡ断片を、ｐＭＴ５７の
ＥｃｏＲＩ　−Ｂ８１１１部位に挿入して、マウスアミ
ラーゼの分泌ベクターｐＮＷＯ５２（８，１ｋｂ）を作
成する（第２図）。

このようにして作成された、本発明の分泌シグナル配列
を有するｐＮＷＯ５２を導入したサツカロマイセス・セ
レビシェは、効率よくマウスアミラーゼを培養液性に分
泌させることができる。

また、ｐＮＷＯ５２の分泌シグナル配列の下流（３′側
）にはＰｓｔ　Ｉ切断部位を有し、ここに、マウスアミ
ラーゼ遺伝子の代りに、任意の構造遺伝子を挿入するこ
とにより夫々相当する所望の蛋白質を発現分泌させるこ
とができる。また、Ｐｓｔ　Ｉ切断部位に複数の制限酵
素切断部位を挿入し、マルチクローニングサイトを導入
することができる。

（実施例） 以下に実施例をあげて、本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次のＩ−ＸＩの方法によった。

■［制限酵素によるＤＮＡの切断と回収］制限酵素によ
る切断用緩衝液は、下記３種類を用い（１）　〜（３）
の使い分けは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８１）（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に従った。また
切断条件は、２単位／μｇ　ＤＮＡの制限酵素を用い、
３７℃または６５℃、３０分間処理する。

次いで、ＴＥＩＩ衝液（１０曙阿のトリス塩酸ｐｕ　８
．０及びＩ　＋ｇＭのＥ［ｌＴＡからなる）で飽和した
フェノールで１回抽出し、エーテルでフェノールを除き
２倍容のエタノールを加えて一２０℃で３０分間放置し
た後、遠心分離してＤＮＡを回収する。

（１）低塩濃度緩衝液 １０　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭの
硫酸マグネシウム及び１　ｍＭのジチオスレイトールか
らなる。

（２）中塊濃度緩衝液 ５０　ｍＭのＮａＣｌ、　　１０　ｍＭのトリス塩＊（
ｐＨ７，４）、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及び１　ｍ
Ｍのジチオスレイトールからなる。

（３）高塩濃度緩衝液 ｔｏｏ　ｆｆ１ＭのＮａＣｌ、５０　ｍＭのトリス塩酸
（ｐＨ７，４）及び１０　ｍＭの硫酸マグネシウムから
なる。

■［大腸菌からのプラスミドＤＮＡの調！１］（１）ミ
ニ調製法（ｍｉｎｉ’　ｐｒｅｐ法）Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７巻、１５１３〜１５２３頁（１９７９）プラスミドＤ
ＮＡを含む大腸菌を、５００μｍのＬ−プロス（１０ｇ
のペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのグルコース、５
８のＮａＣｌ／　Ｉからなる　ｐＨ７，２）を用いて一
夜間培養し、遠心分離して集菌した菌体を１００μｍの
溶液Ａ［５０冒門のグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡ、
２５慣門のトリス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２
Ｉ１ｇ／ｌからなる］に懸濁し氷水中で３０分間放置す
る。

次いで氷水中で２００μｌの溶液Ｂ［１＄の５Ｏ５（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む０．２ＮのＮａＯＨ］を
加え振盪して同時にＤＮＡの変性を行う。

１５０μｍ０３Ｍ酢酸ソーダ溶渣（ｐＨ４，８）を加え
水冷後遠心分離し、上清に２倍容の冷エタノールを加え
、−７０℃にｌθ分間冷却し、その後遠心分離し沈澱を
集める。沈澱を４００μｍの溶液Ｃ［５０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨ８，０）及び０．１　Ｍの酢酸ソーダからな
る］に溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを加え、
沈澱するＤＮＡを洗浄し、減圧上乾燥し一２０℃で保存
する。

（２）大量調製法 プラスミドＤＮＡを含む大腸菌を、１００　ｍｌのし一
ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬剤を含む）を用
いて培養し、集菌、洗浄後、３１の溶液Ａ（５０ＩＩＭ
のグルコース、１０５ＭのＥＤＴＡ、　２５ｍＭのトリ
ス塩酸（ｐＨ８，０）及びリゾチーム２ｍｇ／ｍｌから
なる）に懸濁し、氷水中で３０分間放置する。

次いで、氷水中で４１の溶液Ｂ［Ｉ　Ｘの５Ｏ５（ドデ
シル硫酸ナトリウム）を含む０．２８　Ｎａｐ）１１を
加え振盪して同時にＤＮＡの変性を行う。

３１０３Ｍ酢酸ソーダ溶液（ｐＨ４，８）を加え水冷後
、遠心分離し、上清に０．６容のイソプロパツールを加
え一２０℃で２０分間放置する。

遠心分離して沈澱を集め、エタノールで洗浄後２１のＴ
Ｅ（ｐ）Ｉ　７．５）緩衝液に懸濁する。次いで、１０
８ｍのＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ａ＋Ｉ）を加え、３７
℃で３０分間放置後フェノール抽出を行う。水層に０．
２容の５ＭＮａＣｌと１７３容の３０ｚポリエチレング
リコール６０００を加えて一２０℃で４０分間、次いで
４℃で４０分間放置する。遠心分離して沈澱を集め、４
００１の水に溶解し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
洗浄後１００μ＋（７）ＴＥ１ｉ１？＃′ＷＣ″ｍ５ｔ
ｉ・　　　　　　−一、　６．６　ｍＭの塩化マグネシ
ウム、１０　ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶
解し６５℃で１０分間処理した後、４℃で６６μ門のＡ
ＴＰ（アデノシントリフオスフェート）を加え、更にＴ
４リガーゼを粘着末端の場合は０．１単位／μｇ　ＤＮ
Ａ、また平滑末端の場合は１単位／μｇ　ＤＮＡになる
ように加えて４℃で１８時間反応させた後６５℃で１０
分間処理する。

■［大腸菌の形質転換］［Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ　Ｇｅ−ｎｅｔｉｃｓ（＋９８１）（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｖｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）］
５１のし一ブロスに大腸菌を植菌し、−夜間環。

養する。この０．２１を２０１のし一ブロスに植え３７
℃でクレットユニットが６０に達するまで振盪培養する
０Ｍ体を集め氷冷した５０　ｍＭの塩化カルシウムと１
０＋ｇＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）とからなる緩衝液
１０　ｍｌに懸濁し、３０分間氷冷する。遠心分離した
菌体を１１の塩化カルシウム溶液に懸濁し、この０．１
１を１０μｍのＤＮＡ溶液と混合し０℃で３０分間、４
２℃で２分間インキュベートした後、１．５１のし一ブ
ロスを加え３７℃で３０分間培養し、この０．１　ｍｌ
を寒天培地に植える。

Ｖ　［Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎヌクレアーゼによるＤＮＡ粘
着末端の除去］ 粘着末端を持つＤＮＡを、３０　ｍＭの酢酸ナトリウム
（ｐＨ４，６）、５０−ＭのＮａＣｌ及び１１のＺｎＣ
ｌ２からなる緩衝液１００μ＋に溶解し、これにｌμＩ
（２ｕｎｉｔｓ／　μＩ）のＭｕｎｇ　ｂｅａｎヌクレ
アーゼを加えて３７℃で１０分間処理した後、２μｍの
２５％ＳＯＳ溶液、１０μｍの０．５　Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐ）１９．５）及び１０μｍの８　Ｍ　ＬｉＣｌ
を添加する。

次いでこれに１５０μ！のフェノール及びクロロホルム
混合液（１：Ｉ）を加えて抽出処理し、水層を採取して
１０μｍの３Ｍ酢酸ナトリウムと２００μｍのエタノー
ルを加え、−２０℃に冷却し、遠心分離して沈澱したＤ
ＮＡを回収する。

Ｖｌ　［ＢＡＬ３１処理］ Ｄ）ＩＡの両端から２本鎖とも消化するため、ＢＡＬ３
１処理を行う、即ち、エタノール沈澱した１５μｇのＤ
ＮＡを２０μｍの５Ｘ　ＢＡＬ３１緩衝液［３Ｍの塩化
ナトリウム、６０　ｍＭの塩化カルシウム、６０　ｍＭ
の塩化マグネシウム、５　＋ａＭのＥＤＴＡＩに溶解し
、水７９μｌと１μｍ（２単位）のＢＡＬ３１酵素を加
え、２０℃で３０分間冷温する。反応後フェノールで３
回、エーテルで３回抽出した後エタノール沈澱を行う。

■［粘着末端の充填］ ｌμｇのＤＮＡを、３０μｍの５０ｎ＋Ｍ）リス塩酸（
ｐＨ７，２）、ｌＯＩＩＭの硫酸マグネシウム、０．１
　ｍＭのジチオスレイトール、５０μｇ　／ｗ＋Ｉの牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．２　ｎ＋ＭのｄＮＴ
Ｐに溶かし、１．２５単位のｋｌｅｎｏｗ断片（大腸菌
のＤＮＡポリメラーゼ■をトリプシンで処理して得るら
れる大きな断片）を加え室温で３０分間反応させる。次
いで１μｍのＯ，’５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を加
えて反応を停止させ、フェノール及びエーテルで逐次抽
出しフェノールを除去し、ＤＮＡをエタノール沈澱によ
り回収する。

■［ＢｇＩｎ及びＥｃｏＲＩリンカ−のリン酸化１８ｇ
Ｉｎリンカ−（５’ＣＡＧＡＴＣＴＧ　３’）及びＥｃ
ｏＲＩリンカ−（５’ＧＧＡＡＴＴＣＣ３’） （二重鎖のうち一本鎖のみを示した） は、末端にリン酸基が付いていないので、Ｔ４キナーゼ
でリン酸化を行なった。

３　ｒ＋ｓ＋ｏｌのリンカ−ＤＮＡを、４１μｍの８０
１ＩＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）及び１２　ｍＭの塩化
マグネシウムに溶解し、６０℃で１０分間インキュベー
トした後３７℃で１０　ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルと、２０　ｍＭのＡＴＰを加え、更にｌＯ単位のＴ４
キナーゼを添加して３７℃で３０分間処理した後、−２
０℃で保存する。

ＩＸ　［ＢｇｌＩ［リンカ−及びＥｃｏＲＩの平滑末端
への連結］ 平滑末端のＤＮＡ断片（１，２ｐｓ＋ｏｌ末端）と上記
■でリン酸化したリンカ−ＤＮＡ（＋００　ｐｍｏｌ末
端）を連結用緩衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，
５）、６．６　ｍＭの塩化マグネシウム、１０　ｍＭの
ジチオスレイト−ルからなる］に溶解し、！単位のＴ４
リガーゼを加え４℃で１８８時間応後、Ｂａｇ）Ｉ　Ｉ
又は８３１■で処理して余分のリンカ−を除き、ＴＥＩ
ｔ衝液で飽和したフェノールでＤＮＡを抽出し、エーテ
ルでフェノールを除去後エタノール沈殿でＤＮＡを回収
する。

Ｘ　［ＤＮＡ断片のバクチリアルアルカリンフォスファ
ターゼ（ＢＡＰ）による処理］ リガーゼ反応によるプラスミドＤＮＡの自己連結を阻止
するために、リガーゼ反応に先だって、プラスミドＤＮ
Ａの制限酵素による切断断片をＢＡＰで処理する。

制限酵素で切断したプラスミド０ＮＡ（１０ｐｍｏｌ　
５’末端）を１０μｍのＩＯＸ　ＲＡＰ緩衝液［：１０
０慣Ｈのトリス塩酸（ｐＨ８，０）、１　ｍＭのＥｌ）
ＴＡＩに溶解し、８８．５　μｍの水と１．５μ＋（０
，７５単位）のＲＡＰを加え６０℃で１時間反応後ｌＯ
μｍの０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡを加える。その後フェノ
ール−クロロホルム抽出処理を２回、フェノール抽出処
理を２回行い、次いでエーテルでフェノールを除去しエ
タノール沈澱によりプラスミドＤＮＡを回収する。

ＸＩ［酵母の形質転換（ＫＵ法） サツカロマイセス・セレビシェを１０　ｍｌのＹＥＰ［
ｌ培地中で３０℃で一夜間培養し、集菌して一回ＴＥ緩
衝液で洗浄した後、同緩衝液に懸濁し、細胞数が２Ｘ　
１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにする。

この懸濁液５００μｍに同量の０．２Ｍ酢酸リチウム（
ｐ）１７．５）を加え３０℃で１時間保持した後、１０
０μｍ宛試験管に分注し、０℃でこれにＤＮＡを添加し
０℃で３０分間混合する。１００μｍの７ｏｚポリエチ
レングリコール４０００を含むＴＥ！ｌ衝液を加え、よ
く混合した後３０℃で１時間、次いで４２℃で５分閏保
持し、遠心分離して集菌し滅菌水で洗浄する。

これを５００μｍの滅菌水に懸濁し、１００μｉ宛を選
択培地上に植菌し、３０℃で３〜４日間培養して形質転
換株を得る。

実施例 （１）ρＫＥＮ５１６（１１，１ｋｂ）の作成ｐＧＫＬ
ｌ　’　ＤＮＡの（８，９ｋｂ）を０．１Ｎ　Ｎａ０）
Ｉと３０℃で３０分間処理して結合蛋白質を分解し、次
いで中和した後、ＤＮＡをフェノールで抽出し、セファ
アクリルＳ−１０００（ファルマシア社１１）を用いて
精製した。

このＤＮＡｔｔＢａｍＨ１で切断し、得られた左右２つ
の断片を、夫々ｐＬＳ３５４をＳｍａ　Ｉ及びＢａｗｌ
　Ｉで切断して得られた断片と連結して、右断片を含む
ｐＧＫＦ＋０６（９，８ｋｂ）と左断片を含むｐｃにＦ
１０？（９，８ｋｂ）とを得た。

次いで、ｐＧにＦ２Ｏ３をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで
切断して得たＤＮＡ断片（４，４ｋｂ）と、ｐＧＫＦ１
０７をＢａｍＨＩ及びＰｖｕ　１で切断して得た［１ｌ
ＩＡ断片（５，５ｋｂ）とを、ｐＫＥＮ４０５のＥｃｏ
ＲＩ　−Ｐｖｕ　Ｉ断片（０「Ｉを含む１．２　ｋｂ）
と連結し、ｐＧにＬｌの全領域を含むプラスミドｐＫＥ
Ｎ５１６（１１，１ｋｂ）を得た（第１１！Ｉ）。

（２）ｐＮＷＯＯ２（３，８ｋｂ）の作成ｐＫＥＮ５１
６をＸｎ＋ｎ　Ｉ及びｌ：ｃｏＲＩで切断し、得られた
ｐｃにＬｌ上の２８　ｋｄのキラー毒素遺伝子を含む１
．２　ｋｂの断片を、ρυＣ１３のＥｃｏＲＩ　−５Ｉ
Ｉａ　１部位に挿入してプラスミドルＮ讐００２（３，
８ｋｂ）を作成した。（第１図）。

（３）ｐＮν０４３（２，８ｋｂ）の作成ｐＮＷＯＯ２
をＲｓａ　Ｉ及びＰｓｔ　ｒで切断して、ｐＧＫＬＩの
分泌シグナル配ダリを含むＲｓａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断
片（１１３ｂｐ）を採取し、この断片をｐＵｃ＋２の旧
ｎｃｎ　−Ｐｓｔ　Ｉ部位に連結してプラスミドルＮ讐
０４３（２，８ｋｂ）を作成した。

（４）ｐＮＷＯ４８（２，８ｋｂ）の作成ρＮ讐０４３
をＢａｍＨＩで切断し、その切断部位からヌクレアーゼ
ＢＡＬ３１でＤＮＡを処理した後、バクチリアル　アル
カリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）処理を行い、これにＢ
ｇｌＩＩリンカ−（ρＣＡＧＡＴＣＴＧ）を結合させて
シグナル配列を含むプラスミドρＮ讐０４８（２，８ｋ
ｂ）を作成したく第２図）。

（５）ｐＮ１１０５１（４，３ｋｂ）の作成ｐＭＡ９１
（９，５ｋｂ）をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌｌｌで切断して
得られた山のプロモーター配列を含むＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ｇＩｎ　（１，４ｋｂ）断片と、前記ｐＮＷＯ４８をＰ
ｓｔＩ及びＢｇｌ■で切断して得られたｐＧＫＬＩのシ
グナル配列を含む断片とを、ｐｕｃ１２のＥｃｏＲ１−
Ｐｓｔ　１部位に挿入してプラスミドルＮ警０５１（４
，３ｋｂ）を作成した（第２図）。

（６）プラスミドＩ）ＮＷＯ５０（４，１ｋｂ）ＣＤ作
作成Ｍｓａ１０４をＰｓｔ　Ｉで切断し、得られたアミ
ラーゼ遺伝子を含むＰｓｔ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を、
ｐｔＪｃ＋３のＰｓｔ　Ｉ切断部位に挿入してｐＲＥ１
０７５（４，３ｋｂ）を得た。次いでこれをＡｐａ　Ｉ
で切断し、Ａｐａ　Ｉ切断部位を５１ヌクレアーゼで処
理して平滑末端とした後、Ｄｒａｌで切断して、アミラ
ーゼ前駆体の最初の１５個のアミノ酸を欠いたアミラー
ゼをコードするＡｐａ　Ｉ〜ＤｒａＩ断片を採取した。

これにＢａａ＋ＨＩリンカ−（１２ｍｅｒ）を結合し、
Ｒａｗ）Ｉ　Ｉで切断して両端にＢａｍ８１部位を持つ
ＤＮＡ断片を得た。この断片を平滑末端にした後、ｐｕ
ｃ９のＨｉ　ｎｃ　ＩＩ切断部位に挿入してｐＮＷＯ５
０を作成した。

（７）プラスミドｐＭＴ５７（５，２ｋｂ）の作成ｐＲ
Ｅ＋０３２をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉで切断したＥｃ
ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片（０，８ｋｂ）と、２μｍプ
ラスミドをＥｃｏＲ１で切断し、粘着末端を充填したの
ちＰｓｔ　Ｉで切断して得たＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ
断片（２ｋｂ）と、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＰｖ
ｕ　ＩＩで切断して得たＰｖｕ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断
片（２，３ｋｂ）とを連結してＰＲＥＩ０５１（５，１
ｋｂ）を作成し、これをＥｃｏＲＩで部分切断した後、
粘着末端を充填して連結し、一方のＥｃｏＲＩ切断部位
を欠失したｐＲＥＩ０５２（５，２ｋｂ）を作成したく
第３図）。

ｐＲＥ１０５２をＡａｔＩＩで切断した後、平滑末端と
し、８ｇＩｎリンカ−（５’ＣＡＧＡＴＣＴＧ　３’）
を挿入して９Ｍ７５７（５，２ｋｂ）を作成した。

（８）ｌｌＮＷＯ５２（８，１ｋｂ）の作成ｐＮＷＯ５
１をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで切断して、ＰＧにのプロ
モーター配列及びｐＧＫＬｌのシグナル配列を含むＥｃ
ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を採取し、一方、ｐＮＷＯ５
０をＰｓｔｌ及び［ｌａｍＨＩで切断してマウスアミラ
ーゼ遺伝子を含むＰｓｔＥ−Ｂａ■ＨＩ断片を採取し、
これ等２つのＤＮＡ断片を、ｐＭＴ５７のＥｃｏＲＩ　
−Ｂｇｌ　１１部位に挿入して、マウスアミラーゼの分
泌ベクターｐＮＷＯ５２（８，１ｋｂ）を作成したく第
２図）。

（９）アミラーゼ活性（分泌）の確認 上記方法により作成したプラスミドｐＮＷＯ５２を用い
てサツカロマイセス・セレビシェ２０８１２株をにＵ法
により形質転換した。

得られた形質転換株を２ｘカザミノ酸、ＩＩ酵母エキス
、２ｚグルコースを含む培地を用い、３０℃で２０時間
培養後、遠心分離した上清についてＭｅｔｈｏｄｓｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１巻、４９９頁（１９５５
）に記載の方法に従って側室した結果、上清中のアミラ
ーゼ量は１０００μｇ／Ｉであった。

（発明の効果） 本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含有するプラスミドを導入したサツカロマイセス・セ
レビシェは、上記実施例に示すように、効率よく異種蛋
白質を培養液中に分泌させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、夫々プラスミドルＮ讐００２、ｐＮ
讐０５２及びｐＲＥ１０５２の構成ルートを示す模式図
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 ＭＥＴ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＴＹＲ　ＨＩＳ　ＩＬＥ　Ｐ
   ＨＥ　ＳＥＲ　ＶＡＬ　ＣＹＳ　ＴＹＲ　ＬＥＵ　ＩＬ
   Ｅ　ＴＨＲ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＡＬＡ で示される分泌シグナルペプチドを含むアミノ酸配列を
   、コードするＤＮＡ配列。