JPH0372889A - アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子組換技術を応用してアルプ逅ンを製造す
るために使用されるプラスミド、当該プラスくドにより
形質転換された酵母宿主、形質転換酵母細胞の製造方法
および上記プラスミドにより形質転換された酵母宿主か
らアルブミンを製造する方法に間する。

〔従来技術〕

アルブミン、特にヒト血清アルブミン（以下でＨＳＡと
呼称する）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋
白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持
する責を負う。

また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持って
いる。

ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与される０例え
ば、ショックや悲傷患者では血液量を元に戻し、それに
より外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために
、通常はＨＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や
胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療
を必要とすることがある。

従って、ＩＳＡを投与する基本的な治療上の意義は、外
科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症にお
けるがごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を
治療する点に存する。

現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産
物として製造されている。この製造法の欠点は不経済で
あることと、血液の供給が困難であるということである
。また、血液は肝炎ウィルスのように好ましくない物質
を含んでいることがある。従って、ＩＳＡの代替の原料
を開発することが有益となろう。

ところで、ｍ換ＤＮＡ技術の出現によって多種多様の有
用なポリペプチドの微生物による生産が可能となった。

多くの哺乳動物ポリペプチド類、例えばヒト成長ホルモ
ン、インターフェロンが既に種々の微生物により生産さ
れている。この技術によって種々の有用なポリペプチド
の微生物による生産が可能となり、種々のワクチン、ホ
ルモン、酵素、抗体を微生物に生産させることができる
ようになった。

しかしながら、微生物、特に大腸菌由来の蛋白質標品に
は夾雑エンドトキシンがしばしば見出される。これは目
的とする蛋白質製品から除去しなければならない。

細胞により分泌される蛋白質の安価で且つ有利な製造の
前提条件となる大きな規模において哺乳動物細胞を増殖
せしめることは困難であることが証明されている。哺乳
動物細胞の世代時間は微生物のそれに比べて相当長く、
従って、十分に高い細胞濃度を得るために長時間の培養
が要求される。

また、哺乳動物細胞の培養によって得られる細胞濃度は
、微生物の大規模生産において一般に到達する細胞濃度
に比べて相当に低い、その上、細胞株の改良を行うこと
が微生物に比較して困難である。

すべての真核生物は遺伝情報を発現する機構を有するか
ら、真核生物遺伝子の発現は、大腸菌等原核生物におい
てよりも真核生物宿主において一層効率的に行われるで
あろう。使用に適する真核生物の内、酵母が最も取扱い
やすい。酵母の分泌経路はより高等な動物細胞のそれに
類似しており、そして酵母細胞は、シグナル配列（蛋白
質の非荷電Ｎ−末端部分、通常は分泌輸送中に切断され
る）を切断することによって蛋白質をプロセシングする
ことができることが知られてい２る。さらに、真核性宿
主の分泌経路に入り、そして通過する蛋白質は、細胞質
中で台底された蛋白質に比べて高度の三次元構造を形成
するようである。大腸菌のごとき原核生物は高次構造を
有する大形蛋白質を有しないように見えることは興味あ
ることである。

グリコジル化系が分泌系に関連する。グリコジル化蛋白
質を導く基本的段階はすべての真核生物において類似し
ており、そして酵母細胞は、大腸菌のような原核細胞と
異なりグリコジル化された蛋白質を生産することができ
る。

酵母は微生物であるから、これを培養するのは容易であ
る。培養液の容積当りから得られる細胞量は、大腸菌に
比べて酵母の方が相当に高い。さらに、酵母の発酵的挙
動はよく理解されており、そして大規模発酵のための条
件はすでに確立されている。その上、酵母細胞はエンド
トキシンを含有しない。

従って、工業微生物学の十分に開発された技法と最近開
発された組換ＤＮＡ技法とを用いて酵母によりＩＳＡを
はじめとするアルブミンを製造することが有利なことが
明らかである。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかして、宿主生物として酵母を用いる組換ＤＮＡ技法
によりＩＳＡを製造するための幾つかの方法が知られて
いる。

ＩＳＡの大量生産を目指す場合、酵母の大量培養が必須
である。現在の技術で形質転換酵母を培養する場合、培
養途中に目的遺伝子を含むプラスミドが、宿主細胞から
頻繁に脱落する。それを防止するためには、該プラスミ
ド中に選択マーカー（例えば、栄養要求性マーカー、薬
剤耐性マーカー）を付与することが必要である。しかし
その場合には培地中に、その選択マーカーに対応するア
名ノ酸あるいは薬剤等を添加あるいは除去しなければな
らず、コスト面で負担がかかる。

従って、選択圧をかけることなく、目的遺伝子すなわち
アルブ藁ン遺伝子、特にＩＳＡ遺伝子を保持するための
組換え用プラスくド、その組換えプラスミドを用いた形
質転換体およびその方法、さらにはアルダくン、特にＩ
ＳＡの新規製造方法を提供することが本発明の目的であ
る。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は次の要旨を有するものである＝（１）酵
母由来のプロモーターにより制御されるアルブミンコー
ド領域を含み、かつ宿主酵母染色体配列に相同な配列を
含んでなる宿主酵母細胞の染色体に組み込み可能で、酵
母細胞内で自律増殖不可能なプラスミド。

（２）上記プラスミドにより形質転換された酵母宿主。

（３）異なる宿主酵母染色体配列に相同な配列を有する
異なる２種類以上のプラスミドを順次、宿主酵母細胞の
染色体に組み込んで形質転換することからなる形質転換
酵母の製造方法。

（４）酵母由来のプロモーターにより制御されるアルブ
ミンコード領域を含み、かつ宿主酵母染色体配列に相同
な配列を含んでなる宿主酵母細胞の染色体に組み込み可
能で、酵母細胞内で自律増殖不可能なプラスごドにより
形質転換された酵母宿主を培養してアルブミンを生成せ
しめ、これを採取することを特徴とするアルブミンの製
造方法。

以下に、ＩＳＡを中心として本発明を具体的に説明する
。

本発明のプラスミドは、宿主酵母染色体中に存在する遺
伝子の一部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ　２、　ＨＩ
Ｓ４　、　ＴＲＰＩ　　、　ＵＲＡ３　、　ｒｔｂｏｓ
ｏ＊ｅ［ＩＮＡ遺伝子等）を含有する。相同な配列によ
り、全プラスミドまたはその線状断片は組換により宿主
染色体に安定に導入することができる。即ち、増殖中、
子孫細胞は選択圧が存在しない場合でも導入された遺伝
物質を安定に保持する。

例えば、酵母染色体遺伝子中の天然に存在する配列およ
びＨ３Ａ遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子
の座に安定に組み込まれ得る。

本発明の宿主酵母染色体配列に相同な配列は、特にアミ
ノ酸または核酸合成系遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ
、Ｔｙ因子等が使用できる。特に、アミノ酸または核酸
合成系遺伝子は、宿主酵母がアミノ酸または核酸栄養要
求性株である時、すなわち、該アミノ酸または核酸合成
系遺伝子が欠損している株においては、宿主の変異を補
完する遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカーと
して使用することができる。この際、宿主酵母の栄養要
求性に原栄養性をもたらす、アミノ酸または核酸合成系
遺伝子としては例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＴＲＰＩま
たはＵＲＡ３がある。

酵母用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように、
宿主酵母が栄養要求性株である時、アもノ酸または核酸
合成系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主が抗
生物質耐性株である時は、該抗生物質耐性を発現する遺
伝子が使用できる。

例えばシクロヘキシド、Ｇ４１Ｂ、クロラムフェニコー
ル、プレオマイシンまたはハイグロマイシン等の抗生物
質に対して耐性を付与する遺伝子があげられる。

本発明のプラスミドが含有するアルダごンコード領域は
、特にヒト血清由来のアルブミン（ＨＳＡ）と同一また
は相同なりＮＡ配列であり、例えばＨＳＡを生産するこ
とができる任意のヒト細胞から得られる。該ＤＮＡは染
色体ＤＮＡまたはＣＤＮＡである。染色体ＤＮＡは）Ｉ
ＳＡ遺伝子を含有する遺伝子ライブラリーから分離する
ことができ、そしてＨＳＡ　　ｃＤＮＡは公知の方法を
用いてｍＲＮＡ経路を介して調製することができる。

本発明のプロモーターは酵母、好適には士工立ロマイセ
ス・セレビシェ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは
、高発現酵母遺伝子のプロモーターをＩＳＡの発現のた
めに使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩもしく
はΔＤＨ工遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３もし
くはＰＨ０５）遺伝子、またはイソチトクロームＣ遺伝
子のプロモーターガラクトース代謝系のプロモーター（
ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯもしくはＧＡＬ７）、インベルタ
ーゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるいは解糖系酵素を
コードする遺伝子のプロモーター、例えばエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ（ＧＡＰＤＨ）　、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシ
ラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムタ
ーゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナ
ーゼの遺伝子のプロモーター、あるいはａ−ファクター
またはα−ファクターをコードする酵母接合フェロモン
遺伝子のプロモーターを使用することができる。

また、本発明のプラスミドは、宿主酵母内で自律的に複
製できない、すなわち、宿主酵母内での自律複製開始領
域、例えば２μｍ　　ＤＮＡの複製開始領域やＡ　ＲＳ
　ｉｉＩ域（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）を実質的に含まない。

本発明の他の好ましい態様においては、構成物中にシグ
ナル配列を導入する。シグナル配列は、酵母インベルタ
ーゼ、α−ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナ
ル配列を使用することができる。また、ＨＳＡのシグナ
ル配列は好適であり、好ましくは酵母での分泌発現のた
めに特に合成されたシグナル配列（特願昭６３−１０３
３３９号または特願昭６３−３３６５７号）を用いるこ
ともできる。

このシグナル配列の導入により、ＩＳＡ遺伝子の発現の
後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム
空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への
分泌を達成することができる。これはより収量の相当な
増加が可能となる。

さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純
化することが可能である。

また、本発明のプラスミドは転写停止のための適当なタ
ーミネータ−１例えばＰＨ０５もしくはＧＡＰ−ＤＨタ
ーξネーターを含有する。

このプラス泉ドはプロモーター、ＩＳＡコード領域およ
び宿主染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特に大腸菌
のための複製開始点および遺伝的選択マーカーを含有す
ることもできる。大腸菌複製開始点および大腸菌のため
の選択マーカーを酵母バイブリドベクター中に使用する
ことに関して有用な特徴が存在する。まず、大腸菌にお
ける増殖および複製により大量のバイブリドベクターＤ
ＮＡを得ることができ、そして第２に、大腸菌に基礎を
置くクローニング技法のすべてを用いてバイブリドベク
ターの構築を容易に行うことができる。大腸菌プラスミ
ド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３等は大腸菌複製
開始点、および抗生物質、例えばテトラサイタリンおよ
びアンピシリンに対する耐性をもたらす大腸菌遺伝マー
カーを含有し、そして酵母バイブリドベクターの部分と
して有利に使用される。

従って、本プラスξドは、プロモーター、該プロモータ
ーに制御されるアルブミンコード領域、それに続く転写
停止のためのターミネータ−を含み、かつ宿主酵母染色
体配列に相同な配列を含むものである、また、本プラス
ミドは、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、
酵母用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域、
大腸菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる。

そして、酵母の複製開始領域は実質的に含まないもので
ある。

本発明において、宿主としては酵母、特にサツカロマイ
セス属もしくはピキア属が使用される。

好ましくは、栄養要求性株や、抗生物質感受性株が使用
できる。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を作製する方
法、ひいてはアルブミンを製造する方法は以下の通りで
ある。

組換えプラスミドを宿主酵母細胞の染色体上に導入する
。具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵母
細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵素処
理により切断し、直線化したプラスミドを宿主に導入す
ることが望ましい。

直線化されたプラスくドは、宿主酵母細胞染色体上のプ
ラスくドに組み込まれた領域と相同な領域に組み込まれ
る。直線化されたプラスごドは環状プラスえドより、宿
主染色体上に組み込まれる頻度が上昇する。この時使用
する宿主酵母は、挿入されるプラスミドが担持する酵母
用選択マーカー遺伝子によって相補する変異を持った変
異株、例えば、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつ０４１８感受性株であるサツカロマイセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉａ
ｔａｅ）　ＡＨ２２株（ａ、　ｈｊｓ　４．　ｌｅｕ　
２．　ｃａｎ　１）等が好適に用いられる。

宿主酵母細胞の形質転換は公知の方法、例えばプロトプ
ラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーシ
ョン法などにより行う。

次に期待した部位へプラスミドが導入されているか否か
、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。

具体的には、サザンブロッティング法により、形質転換
に利用した宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列をプ
ローブとして、期待通りの部位へプラスミドが導入され
ていることを確認する。またアルブミンをコードする遺
伝子の安定性を、アルブミン産生量および栄養要求性の
回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数十
化培養した後でも、変化しないことを確認する。

以上、確認試験を行った株は、確かに、アルブミンコー
ド領域を含むプラスごドが、宿主酵母細胞染色体の所望
の部位に組み込まれた形質転換体である。この形質転換
体を宿主として使用し、再度、アルブミンコード領域を
含むプラスミドで形質転換させることができる。この場
合、酵母細胞染色体相同領域としては、初めの形質転換
で使用した領域以外の相同領域も使用できる。

この他、宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列として
、ｒｉｂｏｓｏ＋ｗｅ　ＤＮＡやＴｙ因子（Ｔｒａｎｓ
ｐｏｓｏｎｏｆ　Ｙｅａｓｔ　ｅｌｅｍｅｎｔ）も挙げ
られる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在するの
で、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿主染色
体に組み込むことができる。

以下、具体的に組み込み方法を例示するが本例示は好適
な一手段を示すものであり、この手法に限定されるもの
ではない、相同配列部位は、選択的繰り返しにより代替
え可能である。

宿主としては、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつ０４１８感受性株であるサツカロマイセス゛セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＡＨ２２株（ロイシン合成系遺伝子のＬＰ０１
およびヒスチジン合成系遺伝子のＨＩＳ４に変異を持つ
株）を用いる。

まず、ロイシン非要求性とするための遺伝子、ＬＰ０１
を宿主酵母細胞の染色体配列と相同の配列として持つプ
ラスミドで形質転換する。得られた形質転換体は、染色
体上のＬＥＵ２遺伝子部位にアルブミンコード領域を含
むプラスミドが挿入されたものであり、ロイシン非要求
性、すなわちロイシン不含培地でも増殖できる株である
。

次に、この形質転換体を宿主とし、ヒスチジン非要求性
とするための遺伝子、ＨＩＳ４を宿主酵母細胞の染色体
配列と相同の配列として持つプラスミド（もちろん、ア
ルブミンコード領域も含有する）で形質転換する。得ら
れた形質転換体は染包体上のＨＩＳ４遺伝子部位にアル
ブミンコード領域を含むプラスミドが挿入されたもので
あり、ヒスチジン非要求性、すなわちヒスチジン不含培
地でも増殖できる株である。この時点で、発現のための
目的遺伝子であるアルブミン遺伝子は、ＬＥＵ２および
ＨＩＳ４の２箇所に導入されている。

次に、上記ロイシンおよびヒスチジン非要求性になった
形質転換体を宿主として、ＴＲＰＩを宿主酵母細胞の染
色体配列と相同の配列として持つプラスミドで形質転換
する。このプラスミドは、アルブミンコード領域はもち
ろん、Ｇ４１８耐性遺伝子も含有するものである。得ら
れた形質転換体は染色体上のＴＲＰＩ遺伝子部位にアル
ダくンコード領域およびＧ４１８耐性遺伝子を含むプラ
スミドが挿入されたものであり、抗生物質０４１８に対
し耐性を示す、従って、この形質転換体は、アルブミン
遺伝子を染色体上のＬ巳Ｕ２、ＨＴＳ４およびＴＲＰＩ
遺伝子部位の計３箇所に含有するものである。この時、
挿入の順序は特に問題ではない。

宿主として、何種類もの栄養要求変異株が取得できれば
、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が
取得できれば、それに応じた領域に有用遺伝子を複数導
入することができる。

このように、宿主染色体上の複数領域に目的遺伝子を挿
入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝
子は、脱落することなく、安定に維持され、かつ複数の
遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得
することが可能となる。

形質転換株は、公知の培地で培養する。ＹＰＤ液体培地
〔１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃ。

社）、２％バクトボリベブトン（１）ｉｆｃｏ社）、２
％グルコース〕などが例示される。培養は通常１５〜４
３°Ｃ（好適には３０゛Ｃ程度）で２０〜１ｏＯ時間程
度行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

培養後は、自体公知の方法、例えば分画法、各種クロマ
トグラフィーなどによりアルブミンを精製する。

アルブミン量の測定は、ＲＰＨＡ法あるいはＥＬｒＳＡ
法で行うことができる。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。

なお、本発明において多くの技法、反応および分析方法
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造；ニ
ューイングランド　バイオラプス（ＮＩＢ）　（Ｎｅｓ
＋　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））マサ
チューセッツ＼米国；アマージャム（Ａｍｅｒｓｃｈａ
ｍ）、英国およびベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ
（ＢｅＬｈｅａｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌａ
ｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）　）　、メリーランド、米国か
ら人手することができる。

酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、ブラークハイ
ブリダイゼーシッン法、電気泳動法およびＤＮＡのゲル
からの回収法は、「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｏｌｅｃｕｌ
ｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｔ
ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）
に記載されている方法により行った。酵母の形質転換法
は、「メソッド・イン・イースト・ジェネティクス」コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｅｔｈｏ
ｄ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ」）　　（Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）（１９８１，）に記載されている方法で行った。

実施例１ それぞれ次の文献に記載の方法、それに準じる方法によ
るか、または市販のものを使用した。

ＧＡＰＤＩＩプロモーター：　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｈ，
Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ。

Ｊ、Ｐ、、　Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　’ｆ５
Ｊ、　１２．５４６６（１９７９）、　　）Ｉｏｌｌａ
ｎｄ、　　Ｈ，Ｊ、　　ａｎｄ　　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　
　Ｊ、Ｐ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、　２５４．１９．９
８３９　（１９７９）特開昭６３−８４４９８号明細書 ５ｔｌＣ２シグナル配列二特開昭６０−４１４８８号明
細書特開昭６３−８４４９８号明細書 Ｈ３Ａ遺伝子：特開昭６２−２９９８５号明細書Ｐ）１
０５ターミネーター：特開昭６２−１５１１８３号明細
書 Ｇ−４１８耐性遺伝子：　Ｏｋａ、　Ａ、、　Ｓｕｇｉ
ｓａｋｊ、　Ｈ，ａｎｄＴａｋａｎａｍｉ、　　Ｍ、、
　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ−＋　　１４７＋　
　２１７（１９８１）、　　Ｊｉｍｅｎｅｚ、、　Ａ、
　　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、　　Ｊ、＋Ｎａｔｕｒｅ、
　幻怪、　８６９　（１９８０）、特開昭６１−４０７
９３号明細書 ＴＲＰＩプラスミドｐＢＴＩ−１０由来（ベーリンガー
マンハイム社より市販） ＬＥＵ２ニブラスミドｐＢＴＩ−１由来（ベーリンガー
マンハイム社より市販） ＨＩＳ　４　　：Ｄｏｎａｈｕｅ、　Ｔ、Ｆ、、　Ｄａ
ｖｅｓ、　Ｒ，Ｓ、等、　（ｅ１１般、　８９　（１９
８３） 大腸菌複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子：ｐＵ
Ｃ１９（宝酒造より入手）　、ｐＡＴ１５３　（アマ−
ジャムより人手） ［１１］　　ブース≧゛の 各プラスミドｐＭＭ−００６、ｐＨｏ−０１１の構築は
ｐＡＴ、１５３およびｐＭＳ−００８の構築はｐＵｃ１
９から「モレキュラークローニング」コールドスプリン
グハーバ−ラボラトリ−（１９８２）　）に記載の方法
に準じて常法通り行った（第１図参照）。

プラスξドｐＭＭ−００６は、宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、ロイシン合成系遺伝子のＬＥＵ
２を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下に５ＵＣ
２シグナル配列、Ｉ　Ｓ　Ａ構造遺伝子およびＰＨ０５
ターミネータ−を連結したものである。

プラスミドｐＭＳ−００８は、宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、ヒスチジン合成系遺伝子のＨＩ
Ｓ４を含み、Ｇ　Ａ　Ｐ−Ｄ　Ｈプロモーターの支配下
に５ＵＣ２シグナル配列、ＩＳＡ構造遺伝子およびＰＨ
０５ターミネータ−を連結したものである。

プラスミドルミ（Ｏ−０１１は宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、トリプトファン合成系遺伝子の
ＴＲＰＩを含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下に
５ＵＣ２シグナル配列、ＩＳＡ構造遺伝子およびＰ）１
０５ターミネータ−を連結したもので、酵母選択マーカ
ー遺伝子として、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むものである
。

プラスミドｐＭＭ−００６、ｐＭＳ−Ｑ　Ｏ８およびｐ
Ｈｏ−０１１は、平成元年（１９８９）４月２８日に通
産省工業技術院微生物工業技術研究所へ各々次のとおり
国際寄託されている。

■微生物芯：ビーエムエム００６／イー・コーリジェイ
エム１０９ （ｐ１０９（ｐ／Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭＩ　０９）受託
番号：微工研条寄第２４０４号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４０４） ■微生物芯：ピーエムエス００８／イー・コーリジェイ
エム１０９ （ｐ１０９（ｐ／Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９）受託番
号：微工研条寄第２４０６号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４０６） ■微生物名：ピーエッチオー０１１／イー・コーリエッ
チビー１０１ （ｐＨＯｏ　１１／Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＨＢ　１０１）
受託番号：微工研条寄第２４０５号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４０５） 宿主として、サツカロマイセス・セレビシェＡＨ２２株
を用いた。

サツカロマイセス・セレビシェＡＨ２２株は、接合型が
ａ型であり、ヒスチジン合成系遺伝子（旧Ｓ４）、およ
びロイシン合成系遺伝子（ＬＥＵ　２）に変異を持つ、
従って、培養液中に、ヒスチジンおよびロイシンを添加
しなければ増殖することができない。

Ｈ５Ａ分泌発現用プラスミドｐｉ１１−００６を酵母サ
ツカロマイセス・セレビシェＡ）！　２２株の染色体中
に以下の方法により導入した。

ＹＰＤメディウム（イーストエキストラクト１０ｇ、バ
タトペブトン２０　ｇを水に熔解し９００−とした後オ
ートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した２０
％グルコース１００ｄと混合した。）５０Ｉｄ中３０’
Ｃ１−夜振盪培養したサツカロマイセスセレビシェＡＨ
２２を遠心し、得られた細胞を滅菌水２０−に懸濁後、
再度遠心して細胞を得た。これを１０！Ｒ１の５０ｍＭ
ジチオスレイトール、１．２門ソルビト一ル２５ｍＭ　
ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，５に懸濁し、３０゛ＣでｌＯ分
分間中かに振盪した。遠心により細胞を集め、１．２Ｍ
ソルビトール１０ｔｎｌに懸濁し、再度遠心により細胞
を集めた。細胞を１０ｍ１の１．２Ｍソルビトールに懸
濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を１０−の０．２
ｍｇ／ｄザイモリアーゼ１００Ｔ、　１．２門ソルビト
ール、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１　Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ５，８に懸濁後、３０゛Ｃで１時間穏や
かに振盪した。遠心で細胞を集め、１．２Ｍソルビトー
ル、次いで１０−塩化カルシウム、１．２Ｍソルビトー
ル各１０ｄで洗浄し、遠心で細胞を集めた。細胞をｌｄ
の１０−Ｍ塩化カルシウム、１．２門ソルビトールに懸
濁した。懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、１０ｕ
ｌのＤＮＡ溶液（ＬＥＵ　２遺伝子上のユニークサイト
であるＫｐｎ　ｒで消化し、線状にしたプラスミドｐＭ
Ｍ−００６を５μｇ含む）と混合し、室温に１５分間静
置した。更に、１．２７の２０％ポリエチレングリコー
ル４０００、ｌ〇−塩化カルシウム、１．０ｍＭトリス
−塩酸、ｐＨ７，５を加え穏やかに混合後、室温で２０
分間静置した。遠心で細胞を集め、０、１　ｄの１．２
Ｍソルビトール、１０ｍＭ塩化カルシウム含有ＹＰＤメ
ディウムに懸濁し、３０°Ｃで３０分分間中かに振盪し
た。懸濁液１．５．１０．２０および５０μｌをそれぞ
れ１０戚ずつ乾熱滅菌試験管に分注して４５°Ｃに保温
したロイシン不含寒天培地（０，７％イーストナイトロ
ジェンベース、２％グルコース、１．２Ｍソルビトール
、３％ノープルアガーからなる。）と混合して、ロイシ
ン不合培地からなるボトムプレート（０，７％イースト
ナイト口ジェンベース、２％グルコース、１．２Ｍソル
ビトール、２％ノープルアガーからなる。）に拡げた。

プレートが固化したら、３０°Ｃで３日間静置培養した
。

形成したコロニーを爪楊枝で採取し、３ｄの０．７％イ
ーストナイト口ジェンベース、２％グルコースに懸濁後
、３０’Ｃで２日間振盪培養した。そのうちの１．５−
を遠心し、細胞を集め、３ｙｄのＹＰ［ｌメディウム（
イーストエキストラクト１０ｇ、バタトペブトン２０ｇ
を水に溶解し、９００　ｍとした後オートクレーブ滅菌
し、別にオートクレーブ滅菌した２０％デキストロース
１００−と混合した。）に懸濁し、３０°Ｃで振盪培養
した。培養上清のＩＳＡ濃度をＲＰＩ（Ａ法にて測定し
たところ、３日目で最高４０μｇ／ｄのＨ３Ａが検出さ
れた。

かくして得られた形質転換体をＴＭＭ−２１−１７と命
名した。

■サチンブロッティング法によりｌｌ５Ａ遺伝子がどこ
に導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬＥ
Ｕ２Ｓｌ域に導入されていることが確認できた。

■ＩＳＡ遺伝子の安定性をＨ３Ａ産生量とロイシン非要
求性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世代
培養した後でも、１００％のＨＳ＾遺伝子が保持されて
いた。

前記［１１１１に記載の方法と同様の方法によった。

但し、次の点で［ｒｌｌｌ　に記載の方法と異なる。

宿主：　形質転換体ＴＭＭ−２１−１７プラスミド：ｐ
Ｈ５−ｏｏｓ プラスミド導入時：　　ｐＭＳ−００８中のＨＩＳ　４
遺伝子上のユニークサイトであるＮｈｅ　Ｉでン肖化し
、プラスミドを線状にして導入。

形質転換培地：イーストナイトロジヱンベースを用いず
、イーストナイトロジェンベースウイズアウトアミノア
シッドを使用（これにより、培地中にロイシン、ヒスチ
ジンが含まれていないことになる。）。

ヒト血清アルブミン産生量：７０μｇ／ｌｄかくして得
られた形質転換体をＴＭＳ−３１−３−７と命名した。

［ｖＴｌ　　　　　　　ｎ＋５−３ｌ−３−７ノスク１
−ニングその結果、 ■サザンブロッティング法により、Ｈ３Ａ遺伝子がどこ
に導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬ　
Ｅ　Ｕ　Ｚ　ＳＩ域およびＨＩ　Ｓ　４８１域に導入さ
れていることが確認できた。

■ＩＳＡ遺伝子の安定性をＨ３Ａ産生量とヒスチジン非
要求性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世
代培養した後でも、１００％のＨ３Ａ遺伝子が保持され
ていた。

前記［１１１１に記載の方法と同様の方法によった。

但し、次の点で［１１１１に記載の方法と異なる。

宿主：形質転換体７ＭＳ−３１−３−７ブラスミド：　
ｐＨ０−０１１ プラスミド導入時：　　ｐｉ（Ｏ−０１１中のＴＲＰ　
ｌ遺伝子上のユニークサイトであるＥｃｏ　ＲＶで消化
し、プラスミドを線状にして導入。

形質転換培地：　ＹＰ［ｌメディウムに１．２Ｍソルビ
トール、３％ノープルアガー、０．２％リン酸１カリウ
ムを添加したものに形質転換プロトプラストを懸濁。

プレートはＹＰＤメディウムに１．２ｈソルビトール、
３％ノープルアガー、１００　ｕ　ｇ／ｄ　Ｇ−４１８
を添加したもの。

ヒト血清アルブミン産生量：８０μｇ／ｄかくして得ら
れた形質転換体をＴＭＳ−３２と命名した。

［Ｖ　ＩＩ　ＩＩ　　　　　　　ＴＭＳ−３２のスフ１
−ニングその結果、 ■サザンブロッティング法により、ＩＳＡ遺伝子がどこ
に導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬＥ
Ｕ２領域、ＨＩ　Ｓ　４　ｅＮ域およびＴＲＰ　１　％
Ｎ域に導入されていることが確認できた。

■ＨＳＡ遺伝子の安定性をＨ３Ａ産生量とＧ４１８耐性
を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世代培養
した後でも、１００％のＨ３Ａ遺伝子が保持されていた
。

従って、ＴＭＳ−３２は宿主酵母サツカロマイセス・セ
レビシェＡＨ２２株の染色体の３箇所、すなわち、Ｌ　
Ｅ　Ｕ　２　ｗｉ域、ＨＩ　３４　ｔＪ域オヨヒＴＲＰ
Ｉ領域にＨ３Ａ遺伝子が導入されたものであることが確
認できた。

実施例２ 宿主として、サツカロマイセス・セレビシェＡＨ２２株
を用いて、Ｈ３Ａ産生マルチプルインチグランドＡ１２
４株を製造した。

（ＩＩＡ）（２２株にＩＳＡ転写ユニットの挿入ＧＡＰ
−ＤＨプロモーター／　ｍ　ＨＳ　Ａシグナル／Ｈ３Ａ
ｃＤＮＡ／Ｃ；ＡＰ−ＤＨター亙ネーターから成るＨ３
Ａ転写ユニットを有する組み込み型ベクターをＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（サツカ
ロマイセス　セレビシアエ）ＡＩ（２２株のＴＲＰ１領
域に組み込み、Ｈ５Ａ産生インチグランドＡ１株を３４
クローン取得した。これらのうち増殖が良好で、５０■
／ｌのＨ３Ａを産生したＡｌ−１３株、及び４０■／ｌ
のＨ３Ａを産生したＡｌ−３２株をスクリーニングし、
マルチプルインテグレーションの候補菌株とした。

Ａ、材料及び方法 （ａ）菌株 ５ａｃｃｈａｒｏ＋ｗｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　（サツカロマイセスセレビシアエ）ＡＨ２２株（ａ、
　ＬＥＵ２．　ＨＩＳ４゜ＣＡＮＩ）を用いた。

（ｂｌＩｌｌみ込み型ベクターｐＴＦ４１８を用いた（
第２図）、ｐＴＦ４１８はＧＡＰ−Ｄｌ（プロモーター
／ｍＨ３Ａシグナル／Ｈ３Ａｃ　ＤＮＡ／ＧＡＰ−ＤＨ
ターミネータ−から成るＨ３Ａ転写ユニットを有する組
み込み型ベクターで、宿主酵母細胞の染色体配列と相同
な配列としてＴＲＰＩ遺伝子を有し、酵母選択マーカー
遺伝子として、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むものである。

また、ＴＲＰＩとＨ３Ａは同方向に転写される。なお、
ＧＡＰ−ＤＨフタ−ネーターは特開昭６２−１７５１８
０号、ｍＨ３Ａシグナル配列は特願昭６３−１０３３３
９号に記載の方法によるものを使用した。

ｐＴＦ−４１８はＴＲＰＩ領域で１箇所のみ切断するＥ
ｃｏＲＶで消化し、０．５μｇ／μｊ２に調製した。

Ｔ）ＴＦ−４１８の制限酵素分析は表１の通りである。

（Ｃ）ブースミ　　ＴＦ−４８によるＳ、　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ前記実施例１　（１）に記載の方法と同様の
方法によった。

但し、次の点で前記実施例１　（Ｉ［Ｉ）に記載の方法
と異なる。

プラス壽ド：　ｐＴＦ−４１８ プラスくド導入時：　ｐＴＦ−４１８のＴＲＰＩ遺伝子
上のユニークサイトであるＥｃｏＲＶで消化し、プラス
ミドを線状にして導入。

形質転換培地：　ＹＰＤメディウムに１，２Ｍソルビト
ール、３％ノープルアガー、０．２％リン酸カリウムを
添加したものに形質転換プロトプラストを懸濁。プレー
トは、ＹＰＤメディウムに１．２　Ｍソルビトール、３
％ノープルアガー、１００μｇ／ｄＧ−４１８を添加し
たもの。

（ｄ）インチグランドの取得 再生プレート上に出現したコロニーの内、３６コロニー
について爪楊枝で採取し、滅菌水に懸濁してＹＰＤ　ｇ
ｅｎ、、。ｐｌａｔｅ　　（１００ｕｇ／μｆｆｉを含
むＹＰＤプレート）上でｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｌｏｎｙに
単離した。この中から任意にクローンを選択し、染色体
のＴ　ＲＰ　１　領域にベクターが組み込まれた（サザ
ンプロッティング法により確認）インチグランドとした
。

（ｅ）インチグランドの培養 ■）中試験管での培養：　ＹＰＤ　ｇｅｎ＋ｏｏ　１）
ｌａｔｅより菌体−白金耳を採取し、３ｄ−ＹＰＤ／中
試験管で３０℃、１４０ｒｐＩＩ＋にて７２時間培養し
た。

２）フラスコでの培養：　ＹＰＤ　ｇｅｎ＋＋ｏ　ｐｌ
ａｔｅより菌体−白金耳を採取し、３ｉｄ−ＹＰＤ／中
試験管で３０°Ｃ，１４０ｒｐ＋＊にて２４時間培養し
たものを５０ｄ−ＹＰＤ／３００ａｌｌ　ｆｌａｓｋに
初期菌体濃度Ａ、。、＝０．３になるように植菌し、３
０″Ｃ，１４０ｒｐｍにて７２時間培養した。

（ｆ）増殖度及びＨ３Ａ産生量の測定 上記の培養液をサンプリングし、菌体増殖度をＡｓ４゜
、により、またＨ５Ａ産生量をＲＰＨＡ法により測定し
た。

（８）継代安定性試験 ＹＰＤ　ｐｌａｔｅ（非選択プレート）にて７開維代を
行い、さらにＹＰＤ　ｐｌａｔｅ上でｓｉｎｇｌｅ　ｃ
ｏｌｏｎｙに単離した。任意に選択した１０クローンに
ついてＹＰＤｐｌａｔｅ（非選択プレート）及びＹＰＤ
　ｇｅｎ＋ｏｏ　ｐｌａｔｅ　（選択プレート）に植菌
し、Ｇ４１Ｂ遺伝子を保持しているか否かを判定した。

Ｈ５Ａ産生量を指標とした継代安定性の評価も行った。

０回継代（選択プレート）及び７開維代プレートから菌
体−白金耳を採取し、３ｒｓｌ／ＹＰＤ／中試験管で３
０゛ＣＣ１１４０ｒｐにて９０時間培養した。培養液を
サンプリングし、菌体増殖度をＡ　３４゜、により、ま
たＨ３Ａ産生量をＲＰ）ＩＡ法により測定した。

（ロ）インチグランドの保存 選択ｐｌａｔｅより菌体−白金耳を採取し、５〇−−Ｙ
ＰＤ／３００ｄ　ｆｌａｓｋに植菌して、３０°ＣＣ１
１４０ｒｐにて２４時間培養した。菌体を２．５０Ｏｒ
ｐｍ、１０分で集菌し、Ａｓ４ｏ−＝　１００になるよ
うに１５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−ＹＰＤで懸濁し、ｌｌｄ
ずつ分注、−ａ　ｏ　”ｃで凍結保存した。

Ｂ、結果 （ａ）形質転換効率 １μｇのベクターに対する形質転換体の出現コロニー数
は、約５００コロニーであった。この値はＨ３Ａ高産生
インチグランドをスクリーニングするのに充分なもので
あった。

（ｂ）　ＨＳ　Ａ高産生インチグランドの一次スクリー
ニング（中試験管での培養） 単離したＡ１株の３４クローン（Ａ　Ｉ　−１〜３４）
を中試験管での培養により、７２時間後の増殖度及びＨ
３Ａ産生量を試験した。Ａｌ−１３、Ａｌ−２９の２ク
ローンが６０■／ｌのＩ　Ｓ　Ａ産生量を示し、８クロ
ーンが４０ｄ／／！のＨ３Ａ産生量を示した。６０ｍｇ
＃！のＨ３Ａ産生景を示した２クローンと増殖を考慮し
てＡｌ−２５、Ａ　１−３２について二次スクリーニン
グを行った。

（Ｃ）　ＨＳ　Ａ高産生インチグランドの二次スクリー
ニング（フラスコでの培養） 上記４株についてフラスコでの培養を行い、培養２４．
４８．７２時間目の増殖度及びＨ３Ａ産生量を測定した
。

Ｈ３Ａ産生量については７２時間培養後にＡｌ−２９が
６０■／ｌ％Ａｌ−１３が５０■／ＬＡｌ−２５・Ａｌ
−３２が４０■／ｌを示した。

増殖度はＡｌ−２９の増殖が他に比べて悪かった。

（ｄ）継代安定性 ７回非選択プレート継代後の６４１８遺伝子の保持を指
標とした継代安定性はＡｌ−２５が９０％であったが他
は１００％であった。またＩＳＡ産生産生量しては、ど
のクローンでも継代後で劣ることはなかった。

（２）ＨＳＡ産生マルチプルインチグランドＡ１２株の
取得 ＧＡＰ−ＤＨプロモーター／慣Ｈ５Ａシグナル／Ｈ３Ａ
ｃＤＮＡ／ＧＡＰ−ＤＨターミネータ−から戒るＨ３Ａ
転写ユニットを有する組み込み型ベクターをＡＨ２２株
の染色体Ｔ　ＲＰ　ｌ　９Ｍ域に組み込んだＡｌ−１３
株・Ａｌ−３２株を宿主とし、上記転写ユニットを有す
る組み込み型ベクターをＬＥ　Ｕ　Ｚ　ｆｉＪｌ域に組
み込んだマルチプルインチグランドＡ１２株を取得した
。そのうち、増殖が良好でかつ８０■／ｌのＨ３Ａを産
生したＡｌ　２−２Ｙ株をスクリーニングし、マルチプ
ルインテグレーションの候補菌体とした。

Ａ、材料及び方法 （ａ）菌株 ＡＨ２２株のＴＲＰＩ領域にｐＴＦ４１　Ｂを組み込ん
だＡｌ−１３株・Ａｌ−３２株を使用した。

中）組み込み型ベクターｐＬＦＡ３３を用いた（第３図
）。ｐ　ＬＦＡ３３はＧＡＰ−ＤＨプロモーター／　ｍ
　ＨＳ　Ａシグナル／Ｈ５ＡｃＤＮＡ／ＧＡＰ−ＤＨタ
ーミネータ−から成るＩＳＡ転写ユニットを有する組み
込み型ベクターで、宿主酵母細胞の染色体配列と相同な
配列、及び酵母選択マーカー遺伝子としてＬＥＵ２遺伝
子を有する。また、ＬＥＵ２とＨ３Ａは同方向に転写さ
れる。

ｐＬＦＡ３３はＬＥＵ２領域でｌ箇所のみ切断するＫｐ
ｎｌで消化し、１．５μｇ／μｌに調製した。ｐＬＦＡ
３３の制限酵素分析は表２の通りである。

表２ 制限酵素 出現フラグメントサイズ（ｋｂ） ＾ａｔ　　ＩＩ ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲＶ Ｋｐｎ　　＋ ｓｔ　　Ｉ ａｌ　　１ ｐｈ　　Ｉ ｂａ　　ｌ Ｂａ−旧／５ａｉｌ Ｋｐｎ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ ２．２３．　５．８ １．３７．　６．６６ ８．０３ ８．０３ １．８２．　２．３５．　３．８６ ０．１２．　２．５４．　５．３７ ８．０３ ８．０３ ０．１２．　０．６５．　１．８９．　５．３７１．８
８　６．１５ 前記実施例１〔■〕に記載の方法と同様の方法によった
。

但し、次の点で前記実施例１〔■〕に記載の方法と異な
る。

宿主：形質転換体Ａｌ−１３ プラスミド：ＰＬＦ−Ａ３３ プラスミド導入時：ｐＬＦ−Ａ３３のＬＥＵ２遺伝子上
のユニークサイトであるＫｐｎｌで消化し、プラスごド
を線状にして導入。

形質転換培地二０．７％イーストナイトロジエンベース
、１．２Ｍソルビトール、３％ノープルアガー２％グル
コースを添加したものに形質転換プロトプラストを懸濁
。プレートは０．７％イーストナイト口ジェンベース、
１．２Ｍソルビトール、３％ノープルアガー、２％グル
コースからなるロイシン不合培地を用いた。

（ｄ）インチグランドの取得 再生ｐｌａｔｅ上に出現したコロニーの内、３６コロニ
ーについて爪楊枝で採取し、滅菌水に懸濁してＹＰＤ　
ｐｌａｔｅ上でｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｌｏｎｙに単離した
。この中から任意にクローンを選択し、染色体のＬＥＵ
　Ｚ　ｆＪ域にベクターが組み込まれた（サザンブロン
ティング法により確認）インチグランドとした。

（ｅ）インチグランドの培養 １）中試験管での培養：　ＹＮＢ　ｐｌａｔｅ　　（０
，７％イーストナイト口ジエンベース、２％デキストロ
ース、１．５％寒天）より菌体−白金耳を採取し、３ｍ
１−ＹＰＤ／中試験管で３０°Ｃ，１４０ｒｐｍにて７
２時間培養した。

２）フラスコでの培養：　ＹＮＢ　ｐｌａｔｅより菌体
−白金耳を採取し、３−−ＹＰＤ／中試験管で３０’Ｃ
。

１４０ｒｐｍにて２４時間培養したものを５０ｉｆ−Ｙ
　Ｐ　Ｄ／　３００　ｄ　ｆｌａｓｋに初期菌体濃度Ａ
３４Ｇ、＝０．２になるように植菌し、３０　’Ｃ，ｌ
　４０ｒｐｍにて７２時間培養した。

（ｆ）増殖度及びＩＳＡ産生量の測定 上記の培養液をサンプリングし、菌体増殖度をＡ５４゜
、により、またＩＳＡ産生量をＲＰＨＡ法により測定し
た。

（８）継代安定性試験 ＹＰＤｐｌａｔｅ（非選択プレート）にて６開維代を行
い、さらにＹＰＤ　ｐｌａｔｅ上で５ｉｄｌｅ　ｃｏｌ
ｏｎｙに単離した。任意に選択した１０クローンについ
てＹＰＤｐｌａｔｅ（非選択プレート）　、ＹＰＤ　ｇ
ｅｎ＋ｏｏ　ｐｌ’ａｔｅ　（選択プレート）及びＹＮ
Ｂ　ｐｌａｔｅ（選択プレート）に植菌し、６４１８遺
伝子あるいはＬＥＵ２遺伝子を保持しているか否かを判
定した。

（ロ）インチグランドの保存 選択ｐｌａｔｅより菌体−白金耳を採取し、３−’／Ｐ
Ｄ　／中試験管で３０°Ｃ，１４０ｒｐｍにて２４時間
培養したものを５０　ｍｌ−ｙｐｏ／　３００　！ｄｆ
ｌａｓｋに植菌し、３０°ＣＣ１１４０ｒｐにてさらに
２４時間培養した。菌体を２．５０Ｏｒｐｍ　、１０分
で集菌し、Ａ、、、、、　＝　１００になるように１５
％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−ＹＰＤで懸濁し、１．５−ずつ分
注、−８０°Ｃで凍結保存した。

Ｂ、結果 Ａｌ−１３由来のＡ１２株をＡ１２−Ｙシリーズ、Ａｌ
−３２由来（７）Ａ１２株をＡ１２−ＺシＩＪ−ズと命
名した。

（ａ）形質転換効率 １μｇのベクターに対する形質転換体の出現コロニー数
は、Ａｌ−１３・Ａｌ−３２を宿主とした時共に約３０
コロニーであった。

０））ＩＳＡＳ座高インチグランドの一次スクリーニン
グ（中試験管での培養） 単離したＡ１２株の３０クローン（Ａ１．２−ＩＹ−１
５Ｙ、Ａｌ２−１２−１５２）及びＡ１２株の宿主とし
たＡｈ−１３、Ａｌ−３２を中試験管での培養により、
７２時間後の増殖度及びＨ３Ａ産生量を試験した。結果
は宿主のＡｌ−１３は４０■／ｐ、以上、Ａｍ−３２は
４０ｍｇ／ｆのＨ３Ａ産生量を示したのに対し、Ａｔ−
１２−Ｙシリーズでは５クローン、Ａｌ−１２−Ｚシリ
ーズでは３クローンが６０ｍｇ／ｊ！以上のＨ５Ａ産生
量を示した。これらのうち比較的Ｈ３Ａ産生量が高いと
思われるＡｌ　２−２Ｙ、Ａｌ　ｉｆ　ＯＹ、Ａｌ２−
１１２について二次スクリーニングを行った。

（Ｃ）　Ｉ　Ｓ　Ａ高産生インチグランドの二次スクリ
ーニング（フラスコでの培養） 上記３株についてフラスコでの培養を行い、培＃２４．
４８．７２時間目の増殖度及びＩＳＡ産塗置を測定した
。

Ｈ３Ａ産生量については７２時間培養後に、宿主のＡｌ
−１３は６０ｍｇ／１．、　Ａ　１−３２は４０■／ｌ
のＨ３Ａ産生量を示したのに対し、Ａ１２−２Ｙ、Ａｌ
２−１０ＹＳＡ１２−１１Ｚ　３株とも８０Ｉ１ｇ／ｌ
のＨ３Ａ産生量を示した。

増殖度は３株とも宿主と比較して変わらなかった。

（ｄ）継代安定性 ６回非選択プレート継代後のＧ４１８遺伝子の保持を指
標とした継代安定性は３株とも１００％であった。また
ＬＥＵ２遺伝子の保持を指標とした継代安定性も３株と
も１００％であった。

（３）Ｈ３Ａ産生マルチプルインチグランドＡ１２４株
の取得 ＧＡＰ−ＤＨプロモーター／ｄｓＡシグナル／Ｈ３Ａｃ
　ＤＮＡ／ＧＡＰ−ＤＨフタ−ネーターから成るＨ５Ａ
転写ユニットを有する組み込み型ベタ９−をＡＨ２２株
（７）染色体ＴＲＰＩｗＩ域及びＬＥＵ　２　ＳＩ域に
組み込んだＡＩ　２−２Ｙ株を宿主とし、上記転写ユニ
ットを有する組み込み型ベクターをＨｒ　Ｓ　Ｊ　ｗｉ
域に組み込んだマルチプルインチグランドＡ１２４株を
取得した。この中からＩＳＡ産生量、増殖能、マーカー
遺伝子の安定性に優れたＡｌ２４−３５株を大量培養用
菌株として取得した。

Ａ、材料及び方法 （ａ）菌株 ＡＨ２２株のＴＲＰＩ領域にｐＴＦ４１８、ＬＥＵ２領
域にｐＬＦＡ３３を組み込んだＡ１２−２Ｙ株を使用し
た。

（ｂ）＆ｆｌみ込み型ベクターｐＨＲＡ３３を用いた（
第４図）、ｐＨＲＡ３３はＧＡＰ−ＤＨプロモーター　
／　ｍ　ＨＳ　Ａシグナル／　ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ　／　Ｇ　Ａ　ＰＤＨターミネータ−から戒るＨ３Ａ
転写ユニットを有する組み込み型ベクターで、宿主酵母
細胞の染色体配列と相同な配列および酵母選択マーカー
遺伝子としてＨＴＳ４遺伝子を有する。また、ＨＩＳ４
とＨ３Ａは逆方向に転写される。

ＰＨＲＡ３３はＨＩＳ４領域で１箇所のみ切断するＮｈ
ｅｌで消化し、］、　Ｏｔｔ　ｇ　／　ｕ　ｌに調製し
た。ＰＨＲ，Ａ３３の制限酵素分析は表３の通りである
。

制限酵素 ａｔｌｌ Ｂａｍ旧／Ｓａｌ　ｒ ＥｃｏＲＴ ｐｎ　　Ｔ ｈｅ　　Ｔ Ｐ顧ａｃＩ ｓｔ　　ｌ ５ａｌ　　＋ ｐｈ　　ｒ ｂａ　　Ｉ ｈｏ　　１ 表３ 出現フラグメントサイズ（ｋｂ） ２．２９．　８．２６ ０．１２．　０．６５．　１．５７．　１．８９．　３
．１６．　３．１６０．０７．　２．７　７．７８ ４．７５　５．８ １．０．５５ １０．５５ １．８２．　２．３５．　６．３８ ０．１２．　１．５７．　２．５４．　３．１６．　３
．１６２．９９．　７．５６ ２．０６．　８．４９ １．４３．　９．１２ （Ｃ）ブースミド　ＨＲ−Ａ３３に　るＡ１２−２Ｙ前
記実施例１〔■〕に記載の方法と同様の方法によった。

但し、次の点で前記実施例１　（Ｉ［［）に記載の方法
と異なる。

宿主：形質転換体ＡＩ　２−２Ｙ プラスミド：　ｐ　ＨＲ−Ａ３３ プラスごド導入時：ｐＨＲ−Ａ３３のＨＩＳ４遺伝子上
のユニークサイトであるＮｈｅＴで消化し、プラスミド
を線状にして導入。

形質転換培地：０．７％イーストナイトロジェンベース
ウイズアウトアミノアシッド、１．２Ｍソルビトール、
３％ノープルアガー、２％グルコースを添加したものに
形質転換プロトプラストを懸濁。

プレートは０．７％イーストナイトロジェンベースウイ
ズアウトア藁ノアジッド、１．２　Ｍソルビトール、３
％ノープルアガー、２％グルコースからなるロイシン・
ヒスチジン不含培地を用いた。

（ｄ）インチグランドの取得 再生ｐｌａｔｅ上に出現したコロニーの内、４２コロニ
ーについて爪楊枝で採取し、滅菌水に懸濁してＹＰＤ　
ｐｌａｔｅ上でｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｌｏｎｙに単離した
。この中から任意にクローンを選択し、ＹＮＢｗｌｏａ
。

ａ、　ｐｌａｔｅ　（０，７％イーストナイトロジエン
ベースウイズアウトアξノアジッド、２％デキストロー
ス、１．５％寒天）上で生育することを確認し、染色体
のＨＩ　Ｓ　４　？ｉｆｆ域にベクターが組み込まれた
（サザンブロッティング法により確認）インチグランド
とした。

（ｅ）インチグランドの培養 １）中試験管での培養：　ＹＮＢ　ｗｌｏ　ａ、ａ、　
ｐｌａｔｅより菌体−白金耳を採取し、３ｄ−ＹＰＤ／
中試験管で３０”ＣＣ１１４０ｒｐにて７２時間培養し
た。

２）フラスコでの培養：　ＹＮＢ　＆４ｈｏ　ａ、ａ、
　ｐｌａｔｅより菌体−白金耳を採取し、３ｒｄ−ＹＰ
Ｄ／中試験管で３０　’Ｃ，１４０ｒｐｍにて２４時間
培養したものを５０Ｍ１−ＹＰＤ／３００ｄ　ｆｌａｓ
ｋ、あるいは５０−一グルコースー酢安合成培地／　３
００　ｄ　ｆ　ｔａｓｋに初期菌体濃度Ａ　３４゜、、
＝０．２になるように植菌し、３０°ＣＣ１１４０ｒｐ
にて７２時間培養した。

（ｆ）増殖度及びＩＳＡ産生最の測定 上記の培養液をサンプリングし、菌体増殖度をＡ、ｓ４
゜。により、またＨ３Ａ産生量をＲＰＨＡ法により測定
した。

（濁継代安定性試験 ＹＰＤ　ｐｌａｔｅ（非選択プレート）にて６開維代を
行い、さらにＹＰＤ　ｐｌａｔｅ上でｓｉｎｇｌｅ　ｃ
ｏｌｏｎｙに単離した。任意に選択した１０クローンに
ついてＹＰＤｐｌａｔｅ（非選択プレート）　、ＹＰＤ
　ｇｅＬｏｏ　ｐｌａｔｅ　（ＴＲＰ！択プレート）　
、ＹＮＢ　ｐｌａｔｅ（Ｌ　Ｂ　Ｕ選択プレート）及び
ＹＮＢ　ｗｈｏ　ａ、ａ、＋ＬＥＵ　ｐｌａｔｅ　　（
ＨＩ　Ｓ選択プレート）に植菌し、Ｇ４１８遺伝子、Ｌ
已Ｕ２遺伝子及びＨＴＳ４遺伝子を保持しているか否か
を判定した。

ＩＳＡ産生量を指標とした継代安定性の評価も行った。

０開維代（選択プレート）及び６開維代後のプレートか
ら菌体−白金耳を採取し、３ｄ−ＹＰＤ／中試験管で３
０°Ｃ，１４０ｒｐｍにて９０時間培養した。培養液を
サンプリングし、菌体増殖度及びＩＳＡ産生量を測定し
た。

（ロ）インチグランドの保存 選択ｐｌａｔｅより菌体−白金耳を採取し、５威−ＹＰ
Ｄ　／中試験管で３０°ＣＣ１１４０ｒｐにて２４時間
培養したものを５０　ｄ−ＹＰＤ／　３００１ｔｄｔ　
ｆｌａｓｋに植菌し、３０°Ｃ，１４０ｒｐｍにてさら
に２４時間培養した。菌体を２．５０Ｏｒｐｍ　、１０
分で集菌し、Ａｓ。−＝１００になるように１５％Ｇｌ
ｙｃｅｒｏｌ−ＹＰＤで懸濁し、１．５　ｍｌずつ分注
、−８０°Ｃで凍結保存した。

Ｂ、結果 （ａ）形質転換効率 １ｄｇのベクターに対する形質転換体の出現コロニー数
は、約１５００コロニーであった。この値はＩ　Ｓ　Ａ
高産生株を高産生株をスクリーニングするのに充分なも
のであった。

（ｂ）Ａ１２４株の一次スクリーニング（中試験管での
培養） 単離したＡｌ２４株の４２クローン及びＡ１２４株の宿
主であるＡ１２−２Ｙを中試験管での培養により、７２
時間後の増殖度及びＨ３Ａ産生量を試験した。宿主のＡ
ｌ２−２Ｙは６０■／２のＨ３Ａ産生量を示したのに対
し、Ａ１２４シリーズはすべて６０■／Ｉ！、以上のＨ
３Ａ産生量を示し、８０■／１以上のＨ３Ａ産生量を示
すクローンもあった。これらのうち比較的ＨＳＡ産生量
が高いと思われるＡ　１．２４−１２、Ａｌ２４−１３
、Ａｌ２４−１５、Ａｌ２４−２４、Ａｌ２４−３５に
ついて二次スクリーニングを行った。

（Ｃ）へ１２４株の二次スクリーニング（継代安定性試
験） ６回非選択プレート継代後のＴＲＰ、ＬＥＵ。

ＨｒＳ遺伝子の保持は、Ａｌ２４−１３がＴＲＰの保持
率が９０％だった他はすべて１００％であった。また、
継代前後におけるＩＳＡ産生能力に変化はなかった。遺
伝子の保持が１００％で、かつＨ８Ａ産生量が高くかつ
増殖が良好なＡｌ２４−１５、Ａｌ２４−３５について
フラスコ培養の三次スクリーニングを行うこととした。

また、この２クローンを凍結保存した。

（ｄ）Ａ１２４株の三次スクリーニング（フラスコでの
培養） Ａｌ２４−１５、Ａｌ２４−３５について天然培地（Ｙ
ＰＤ培地）及び合成培地（グルコース−酢安合成壇地）
を用いてフラスコでの培養を行い、培養２４．４８．７
０時間目の増殖度及びＨ８Ａ産生量を測定した。

天然培地ではＡｌ２４−３５が宿主のＡ１２−２Ｙの８
０■／ｌよりもやや高い値を示した。増殖能も２クロー
ン共対照とほぼ同等であった。

合成培地では、２クローン共対照としたＴＭＳ−３３−
１ｈ４株と）（ＳＡ産生量（１５■／ｌ）、増殖能共に
同等であった。

以上の結果からＡｌ２４−３５株を大量培養用の菌株と
して取得した。

当該形質転換体Ａｌ２４−３５株は、平成元年（１９８
９）７月２５日に通産省工業技術院微生物工業技術研究
所へ次の通り国際寄託されている。

微生物名：エス　セレビシェ　エイ１２４−３５（Ｓ、
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ａ　１２４−３５　）受託
番号：微工研条寄第２５２７号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５２７） 〔効果〕 本発明においては、目的遺伝子、即ちＨ５Ａ遺伝子は、
宿主細胞から脱落することが少なく、従って選択圧をか
けることなく、ＩＳＡ遺伝子を保持することができると
いう効果が得られる。また、複数箇所へ目的遺伝子を組
み込むことにより、Ｈ３Ａ発現量を増大することができ
るという効果も得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）〜（Ｃ）は、それぞれプラスミドル聞−０
０６、グラスミ１９ＭＳ−００８およびプラスミドｐＨ
０−０１１を表す。第２図は、組み込み型ベクターｐＴ
Ｆ−４１８を表わす。第３図は組み込み型ベクターｐＬ
ＦＡ３３を表わす。第４図は組み込み型ベクターｐＨＲ
Ａ３３を表わす、第２〜４図中、■はＧＡＰ−ＤＨプロ
モーター、匡ヨはｍＨ３Ａシグナル、圏図は）ＩＳＡ構
造遺伝子、ＷはＧＡＰ−ＤＨターミネータ−１口は酵母
染色体相同領域、−は転写方向を表す。 第１図（ｃｌ 第４図 第１図（ｂ） ｉ 第３図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロモーターにより制御されるアルブミンコード
   領域を含み、かつ宿主酵母染色体配列に相同な配列を含
   んでなる宿主酵母細胞の染色体に組み込み可能で、酵母
   細胞内で自律増殖不可能なプラスミド。
2. （２）目的蛋白質を分泌生産させる為のシグナル配列を
   プロモーターとアルブミンコード領域の間に含んでなる
   請求項（１）記載のプラスミド。
3. （３）宿主酵母での選択マーカーとして、抗生物質耐性
   遺伝子を含んでなる請求項（１）記載のプラスミド。
4. （４）宿主酵母染色体配列に相同な配列がアミノ酸また
   は核酸合成系遺伝子である請求項（１）記載のプラスミ
   ド。
5. （５）宿主酵母染色体配列に相同な配列がｒｉｂｏｓｏ
   ｍｅＤＮＡあるいはＴｙ因子である請求項（１）記載の
   プラスミド。
6. （６）請求項（１）〜（５）のいずれかに記載のプラス
   ミドにより形質転換された酵母宿主。
7. （７）請求項（１）〜（５）のいずれかに記載のプラス
   ミドであって、異なる２種類以上の当該プラスミドによ
   り、形質転換された請求項（６）記載の酵母宿主。
8. （８）アミノ酸または核酸栄養要求性株および／または
   抗生物質感受性株である請求項（６）記載の酵母宿主。
9. （９）請求項（１）〜（５）のいずれかに記載のプラス
   ミドであって、異なる２種類以上の当該プラスミドを順
   次又は同時に宿主酵母細胞の染色体に組み込んで形質転
   換することからなる形質転換酵母の製造方法。
10. （１０）請求項（６）または（７）記載の形質転換され
    た酵母宿主を培養してアルブミンを生成せしめ、これを
    採取することを特徴とするアルブミンの製造方法。