JPS6371175A - ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ヒトリゾチームの微生物学的製造法に関する
。更に具体的には、本発明は化学的に合成したヒトリゾ
チーム遺伝子に分泌リーダー配列及びプロセシングシグ
ナル配列を連結することにより大量のヒトリゾチームを
得ることを可能にした遺伝子工学的手法によるヒトリゾ
チームの製造法に関する。

〈従来技術及び問題点〉 ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、Ｎ−アセ
チルグルコサミンと、Ｎ−アセチルムラミン酸量のβ−
１，４結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活
性を有していることが知られている。ヒト乳由来のりゾ
チームは、１３０個のアミノ酸からなることが知られて
いる。

〔例えば、船津ら「溶酸酵素」５５〜５８頁　講談社す
イエンティフィク（１９７７）参照〕ヒトリゾチームは
種々の細菌を溶解する作用を有し、食品等の防腐剤ある
いは医薬品としてリゾチーム単独又は抗生物質との併用
による抗菌剤として利用することができる。又、血液凝
固及び止血作用、抗炎症作用、呼吸器疾患者にだいする
喀痰喀出作用等をも有するのでそれらを対象とした医薬
品としても利用することができる。

ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的ではない。

通常、分泌タンパクは細胞膜通過の際に必要で、その過
程において切断されるシグナルペプチドと呼ばれるアミ
ノ酸配列を含む前駆体として生産される。異種タンパク
をコードしている遺伝子を酵母のプロモーター及びシグ
ナル部分を含むＤＮＡ配列に連結することにより、有用
な量の異種タンパクを成熟した型で生産し得ることが既
に知られている。又、酵母に認識される分泌タンパクの
リーダー及びプロセシングシグナルをコードする遺伝子
配列は酵母中の天然ＤＮＡ配列から誘導され、酵母によ
り自然に分泌されるこれらのポリペプチドにはα−ファ
クター、ａファクター、酸性ホスファターゼ、インベル
ターゼおよびこれらに類するものが含まれる。一方、組
換えＤＮＡ技術によるヒトリゾチームの生産に関しては
既に報告されており、宿主として大腸菌を用いた場合に
ついては特開昭６１−７８３８３号　及び６１−７８３
８７号に開示されている。又、酵母を用いた場合につい
て本発明者らは日本特許出願６０−１３９７１０を出願
した。しかし従来の組換えＤＮＡ技術においては、発現
産物が菌体内に蓄積されるため生体細胞を破砕し煩雑な
精製技術を使用したり、ある種の発現のための人為構造
（例えば、ＡＵＧ翻訳開始シグナルコドンの発現の結果
生じる本来のＮ末端アミノ酸に結合したメチオニン）を
除去する必要があり、一方、酵母における分泌過程及び
シグナルペプチドの果たす役割について未だ充分明らか
にされていないため異種タンパクを効率よ（分泌発現さ
せるために任意の異種タンパク遺伝子に対し望ましい酵
母の分泌タンパクシグナルペプチドを予知することが困
難であり、試行錯誤して最適なシグナルペプチドを探索
しなければならない等の問題点が存在した。

〈本発明が解決した点〉 本発明者らは、酵母細胞を用いたヒトリゾチームの分泌
生産を目的として種々検討を重ねた結果、酵母をα−フ
ァクター遺伝子由来の分泌リーダー配列とプロセシング
シグナル配列を連結した合成ヒトリゾチーム遺伝子及び
２μｍプラスミド複製起点を保持する組み換えプラスミ
ドで形質転換することにより、高レベルでヒトリゾチー
ムが分泌生産されることを見出し、本発明を完成した。

〈発明の構成〉 本発明は、酵母に認識されうるプロモーター、α−ファ
クター遺伝子由来の分泌リーダー配列及びプロセシング
シグナル配列と連結されたヒトリゾチーム遺伝子を保持
し、かつ宿主細胞内で増殖可能な、ヒトリゾチームを発
現する組み換えプラスミドにより形質転換された微生物
を適当な培地で培養し産生されたヒトリゾチーム蛋白質
を回収することを特徴とするヒトリゾチームの製造法を
提供するものである。

以下に本発明の製造法について具体的に説明する。

１、合成ヒトリゾチーム遺伝子 本発明で用いた上記（特許請求の範囲第２項記載）の遺
伝子は特開昭６１−７８３８７記載の方法により取得で
きる。

２、組み換えプラスミドの調製 １、記載の合成ヒトリゾチーム遺伝子を用い、酵母に認
識される分泌タンパクのシグナルペプチドとの融合タン
パクとしてヒトリゾチームを分泌生産させるための好ま
しい組換えプラスミドの具体例はｐＬＹ−２８である。

ｐＬＹ−２８は以下のものを所定の順序で配列して構築
する。これらの配列の組み込み操作そのものは分子生物
学の分野で公知の常法に従って行うことができる。具体
的方法については後記の実施例及び図面２、図面３を参
照されたい。

１）Ｈで−に゛　　され′る）　１５：使用する複製系
は酵母宿主が本来有しているものであることが好ましい
。多数の酵母ベクターがＢｏｔｏｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｎ
ｅ（１９７９）訂１７−２４により報告されているが、
特に２μｍプラスミド複製系を含有するＹＥ、プラスミ
ドは多コピーで安定で有利である。これに加えて染色体
複製起点ＡＲ３とＣＥＮセントロメアとの組合せを用い
ることができる。

２）−湘′１、斤　ヤー配置（プロモーター）：プロモ
ーターは分泌リーダー配列及びプロセシングシグナルに
関連したプロモーターの他に酵母内で高発現の遺伝子の
プロモーター、例えばＡＤＨ１プロモーター（例えば旧
ｔｚｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ２９３　７１７〜７２２
（１９８１）参照）、ＰＧＫプロモーター（例えば旧ｔ
ｚｅｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ２１９６２０（１９８３
）参照）　、ＧＡＰＤＨプロモーター（例えばＵｒｄｅ
ａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ８０７４６１〜７４６５（１９８３）参［）　、
ＰＨ０５プロモーター（例えばＫｒａｍｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ８１３６７〜３７０（１９８４）参照
）　、ＥＮＯプロモーター（例えばＨｏ１ｌａｎｄら、
Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６１３８５〜１３９５
（１９８１）参照）及びＧＡＬＩＯプロモーター（例え
ばＢｒｏａｃｈら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ８３〜１１７（１９８３）参照）等のプロモータ
ーを使用できる。これらのプロモーターを制御配列、例
えばエンハンサ−、オペレーター等と共に使用すること
によりヒトリゾチーム遺伝子の発現を制御することがで
きる。

構造遺伝子にフレームが合うように連結された、酵母に
認識されるα−ファクター遺伝子由来の分泌タンパクの
リーダー及びプロセシングシグナルをコードする遺伝子
配列を使用できる。

４）−酉　１　（−ミネーター）： ２）のプロモーターと同様に分泌リーダー配列及びプロ
セシングシグナルに関連したターミネータ−の他に、酵
母内で高発現の遺伝子のターミネータ−を使用できる。

５）貝逍■複製肌址点ニ プラスミドの調製、増殖は大腸菌を１発現は酵母を用い
て行われるため酵母の複製開始点と大腸菌の複製開始点
の両方含むことが必要である。

３、形質転換 （１）宿主菌 ヒトリゾチー、ム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドの
調整、増殖は大腸菌を用いて行われるが、宿主細胞の大
腸菌での一具体例はＥ、　ｃｏｌｉ２９４　（例えばＢ
ａｃｋｍａｎ、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　７３４１７４〜４１７８（１９７６）参照）
である。

ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
るヒトリゾチームの発現は酵母を用いて行われるが、宿
主細胞の酵母での一具体例はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　ＮＡ３７−１１Ａ（例えばＡｒａｋｉら、Ｊ、Ｍｏｌ
　、Ｂｉｏｌ。

旦１９１〜２００（１９８５）参照）である。

ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ誘導体（例えばイ
ーストジェネテインクストイックセンター（Ｙｅａｓｔ
　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）カタロ
グ参照）を使用することができる。これらのＳ、ｃｅｒ
ｅｖｉＳ　ｊ　ａ　ｅ　誘Ｒ体の多くのものはイースト
ジエネテインクストイックセンター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）及び公認の微
生物機関、例えば藤ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されており、そこ
から分譲が可能である。

（２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる（大腸菌の形質転換について
は、例えばＣｏｈｅｎらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　６９．２１１０〜２１１４（１９
７２）及びＭａｎｉａｔ、ｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ、２４９〜２５３（１９Ｂ２）参照）。

酵母の形質転換については、例えば旧Ｍｅｎら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ、　７５．
１９２９（１９７８）及びＩｔ。

ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３１６３〜１６Ｂ（
１９８３）参照）。

（３）形質転換体 酵母における形質転換体の一具体例は、Ｓ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　ＮＡ３７−１１ＡをｐＬＹ−２８で形質転
換させて得た形質転換体であって、本発明では、それを
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＡ３７（ＩＡ（ｐＬＹ−
２８）と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に徽
工研菌寄第８９３９号として寄託されている。

４、ヒトリゾチームの生産 この様にして得た形質転換体を、分子生物学および醗酵
学の分野で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチ
ームが生産される。

ヒトリゾチームは公知の免疫沈降反応、ラジオイムノア
ッセイ（例えばＹｕｚｕｒｉ　ｈａらＣｈｅｍ、Ｐｈａ
ｒｍ、Ｂｕｌｌ、２７２８０２〜２８０６（１９７９）
及びＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌ
ｌ、２６９０８〜９１４（１９７Ｂ）参照）、酵素活性
測定法（例えば５ｉｄｈａｎら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、４５１８１７〜１８２３（１９８１）及び
Ｍｏｒｓｋｙ　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２８７７
・〜８５（１９８３）参照）タンパクのドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気永動（例えばＬ
ａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７６８０〜６８５（
１９７０）参照）等を用いて検出、定量することができ
る。

また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗酵学の分野
で公知の常法を適宜組合せて回収、精製することができ
る。　具体的事項に関しては、後記の実施例を参照され
たい。

〈発明の効果〉 本発明は、ヒトリゾチームの分泌形態および発現効率の
点で優れ、かつ宿主の培養及び分泌されたヒトリゾチー
ムの分離、精製が容易である。本発明により安価に多量
に純粋なヒトリゾチームの生産が可能になった。

実施例 プラスミドｐＰＬＨＬＹ−１（特開昭６１−７８３８３
、或いは特開昭６１−７８３８７に記載の方法で製造で
きる）２５μｇを１１０１１Ｉトリス塩酸（ｐＨ７，５
）、１０ｍＭＭｇＣｊ！ｚ　、１０ｍＭＤＴＴ及び１０
０単位の制限酵素ＴａｑＩを含む１００μβの反応液中
で６５℃、２時間インキュベートした後５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い６５８ｂｐの合成ＨＬＹ遺
伝子を回収した。次に、このＴａ　ｑＩ断片に合成オリ
ゴヌクレオチドを連結した。ヒトリゾチーム遺伝子とα
−ファクター遺伝子のための合成オリゴヌクレオチドは
図面１に示した配列を有する。この合成オリゴヌクレオ
チドは旧ｎｄ■粘着末端でα−ファクター遺伝子とＴａ
ｑｌ粘着末端でヒトリゾチーム遺伝子と連結するように
合成されている。この合成オリゴヌクレオチドＡ）、Ｂ
）各５μｇを７５℃、１０分間保温後、室温に２時間放
置しアニーリングした。この合成オリゴヌクレオチド１
μｇと先の合成ヒトリゾチーム遺伝子を含むＴａｑＩ断
片１μｇを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６）　、１０
ｍＭＭｇＣｌ！ｚ、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＤＴＴおよ
びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを含む３０μｌの反応液中で、
１６℃、１６時間連結（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）を行った。

連結したＤＮＡ断片をエタノール沈澱後、１０ｍＭ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ
ＭｇＣ１ｔ、１ｍＭＤＴＴ、１０単位の制限酵素５ａｕ
３ＡＩを含む３０μβの反応液中で３７℃、２時間反応
させた後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
合成オリゴヌクレオチドと合成ヒトリゾチーム遺伝子の
連結した旧ｎｄ　ｍ　−５ａｕ３ＡＩ断片を回収した。

次にプラスミドＰｉ−２９を以下のようにして作成した
。先ず、ファージベクターシャロン４　Ａ　　（Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓとＢｌａｔ、ｔｎｅｒ　Ｊ、Ｖｉｏｌ、２９
５５５〜５７５（１９７９））に制限酵素ＥｃｏＲＩで
部分分解した酵母ＤＮＡを挿入することによりライブラ
リーを作成した。このライブラリーをすでに報告されて
いるα−ファクター遺伝子の塩基配列（Ｋｕｒｊａｎｃ
とＨｅｒｓｋ。

ｗｉｔｚ　Ｃｅ１ｌ　３０９３３−９４３（１９Ｂ２）
）をもとに作成した１５ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチ
ド（５’　　−ＡＴＣＧＡＡＡＴＣＣＣＣＴＴＣ−３”
　）を３ｚＰ　チーｙベルしたものをプローブとしてプ
ラークフィルターハイブリダイゼーション（Ｂｅｎｔｏ
ｎとＤａｖｉｓ　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６１８０−１８
２（１９７７））によりスクリーニングし、α−ファク
ター遺伝子を含む１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を得、こ
の１．１３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲＩで切断し
たｐＢＲ３２２と連結することによってプラスミドＰＬ
−２９を作成した。このプラスミドＰ１−２９１５μｇ
を１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＴ（７，５）、５０ｍＭＮａ
Ｃ１，１０ｍＭＭｇＣ６２、１ｍＭＤＴＴ。

５０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｌｎを含む５
０μｌの反応液中で３７℃、２時間反応させた後１％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、α−ファクターのプロモ
ーター、リーダー及びプロセシングシグナルを含む約５
　、２　ｋｂｐの断片を回収しておいた。この断片１μ
ｇと上記の旧ｎｄＩ［［−５ａｕ３ＡＩ断片１１００ｎ
を混合し、６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）、１０＋
ＭＭｇＣ１ｚ　、１ｍＭＡＴＰ、１０ｄＤＴＴおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌの反応液中で、１６℃
、１６時間反応させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｔ　２９４
株を形質転換し、アンピシリン抵抗性（５０μｇ　／ｍ
ｌ）の形質転換体を得た。これらの形質転換体よりプラ
スミドＤＮＡを調整し、制限酵素開裂パターンの分析を
行って図面２に示される様な組み換えプラスミド（以下
このプラスミドをｐＬＹ−２６と呼ぶ）を含む形質転換
体を選びだした。

プラスミドの　築と　　組み　え プラスミドｐＡＡＲ６（Ａｎ＋ｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　１０１１
９２〜２０１）１５℃ｇをＩＱｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７
，５＞　、５０ｍＭＮａＣｊ！、１０ｍＭＭｇＣ２１，
１ｍＭＤ’ｒ’Ｔ、５０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
Ｔｔｈｌｌｌｌを含む５０μＥの反応液中で３７℃、２
時間反応させた後１％アガロースゲル電気泳動を行い、
酵母用選赦マーカーＴＲＰ１、複製起点ＡＲＳ　１を含
む約４．２　Ｋ　ｂ　ｐの断片を回収した。

プラスミドｐＬＹ−２６１５μｇを上記と全く同様に処
理して融合遺伝子を含む約３．５　Ｋ　ｂ　ｐの断片を
回収した。上記のＴＲＰＩ、ＡＲ５Ｉを含む約４．２Ｋ
ｂｐの断片２００ｎｇと融合遺伝子を含む約３．５Ｋｂ
ｐの断片２００ｎｇを６６１１ＩＭトリス塩酸（ｐＨ７
，５）　、　１０ｍＭＭｇＣ１ｚ　、１ｍＭＡＴＰ、１
０鱈ＤＴＴおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌの
反応液中で、１６℃、１６時間反応して連結させた。次
にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４株
を形質転換し、アンピシリン（５０μｇ　／ｍｌ）抵抗
性の形質転換体を得た。これらの形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を行
って図面２に示される様な組み換えプラスミド（以下こ
のプラスミドをｐＬＹ−２７と呼ぶ）を含む形質転換体
を選びだした。

さらに、このプラスミドｐＬＹ−２７１μｇを１０關ト
リス塩酸（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍ
ＭＭｇＣ１ｔ、Ｉｎ＋ＭＤＴＴ及びｌＯ単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩを含む４０μｌの反応液中で３７℃、２時間
インキュベートした後エタノール沈澱して回収した。

別に、プラスミドｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ　Ｎａｔ
ｕｒｅ　２７５１０４〜１０９　（１９７５）参照）２
０℃ｇを１０ｍＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ７，４）　、５０
ｍＭＮａ　Ｃ１，１０ｍＭＭ　ｇ　ＳＯｓ、１ｍＭＤＴ
Ｔ、５０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを含む５０μｌの反
応液中で３７℃、２時間反応させた後１％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、２μｍプラスミド複製起点を含む約
２．８Ｋｂｐの断片を回収した。上記のｐＬＹ−２７０
，５μｇ及び２μｍプラスミド複製起点を含む断片１．
０μｇを６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
ＭｇＣ１！、１＋ｎＭＡＴＰ、１０ｍＭＤＴＴおよび１
．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２０μｌの反応液
中で、１５℃、１４時間反応させた。次にこの反応液を
用いて大腸菌に一１２２９４株を形質転換し、アンピシ
リン（５０μｇ　／ｍｌ）抵抗性の形質転換体を得た。

これらの形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調整し、制
限酵素開裂パターンの分析を行って図面３に示される様
な組み換えプラスミドｐＬＹ−２８を含む形質転換体を
選びだした。この形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調
整しこれを用いて酵母ＮＡ３７−１１Ａ株（ＭＡＴｃｒ
　１ｅｎ２−３．１１２　ｈｉｓ３　ｔｒｐｌ　ｐｈｏ
５−１）を形質転換した。形質転換体Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　ＮＡ３７−１１Ａ（ＰＬＹ−２８）　（微工
研菌寄第８９３９号）をそのＴｒρ“表現型により選択
し、そのヒトリゾチーム産生について検定した。

ヒトリゾチーム′　云　の 酵母菌株ＮＡ３７−１１Ａ　　（ρＬＹ−２８）の単一
コロニーをＳＤ及びＣＡＡ　　１５０ｍ１中　３０℃で
増殖し、５．１０．２４．４８．７２．９６．１４４時
間の時点で培養物を７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
して収穫した。培養上清は凍結乾燥後、５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋６．８）に溶かし、該緩衝液
に対し透析を行ったのちヒトリゾチームの発現を検討し
た。細胞は等容のガラスピーズを含む５０ｍＭＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）　、１ｍＭＰＭＳＦ（
フェニルメチルスルフォニルフルオリド）に懸濁し高速
で２分間ポルテックスミキサーで攪拌後、１０１０００
０ｒｐ分間遠心分離した。

得られた上澄液のヒトリゾチームの酵素活性を利ｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　１ｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの細胞を基
質とした濁度減少法により測定した（例えば５ｉｄｈａ
ｎら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、４５１８１７
〜１Ｂ２３（１９８１）及びＭｏｒｓｋｙ　Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２８７７〜８５（１９８３）参照）
。即ち、３ｍｌのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉｙｓｏｄ
ｅｉｋｔｉｃｕｓの菌懸濁液（０，５Ｂ／＋＋＋ＩＭｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ、　
　５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）に、０．１ｎ＋
１のヒトリゾチーム標品或いはサンプルを加えＯＤ？。

。を測定、３７℃で１０分間保温後再び○Ｄ７゜。を測
定しその濁度の減少値から酵素活性を算出した。その結
果、培養時間４８時間の時ヒトリゾチーム活性は培養上
清１１あたり約３００μｇ／ｌに達した。

【図面の簡単な説明】

図面１は合成ヒトリゾチーム遺伝子とα−ファクター遺
伝子を連結するための合成オリゴヌクレオチドの塩基配
列を示したものである。 図面２及び図面３は、発現用組み換えプラスミドｐ　Ｌ
Ｙ−２８の作成法を示したものである。 図面１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）酵母に認識されうるプロモーター、α−ファクター
   遺伝子由来の分泌リーダー配列及びプロセシングシグナ
   ル配列と連結されたヒトリゾチーム遺伝子を保持し、か
   つ宿主細胞内で増殖可能な、ヒトリゾチームを発現する
   組み換えプラスミドにより形質転換された微生物を適当
   な培地で培養し産生されたヒトリゾチーム蛋白質を回収
   することを特徴とするヒトリゾチームの製造法 ２）ヒトリゾチーム遺伝子が下記のヌクレオチド配列で
   表される構造遺伝子を含むヒトリゾチーム遺伝子である
   特許請求の範囲第１項記載のヒトリゾチームの製造法 【遺伝子配列があります】 ３）２μｍプラスミドの誘導体である組み換えプラスミ
   ドベクターを用いることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載のヒトリゾチームの製造法