JP2562572B2 - ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（以下「ｈＧＭ−ＣＳＦ」と
いう）の遺伝子組換えによる製造技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】コロニー刺激因子（以下「ＣＳＦ」とい
う）は軟寒天中で造血幹細胞の増殖分化を刺激し、特定
のタイプの血液細胞から成るコロニー形成を促進する生
理活性物質である。ｈＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球マクロフ
ァージ系の幹細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）を刺激して、顆粒球
マクロファージの形成を促進する因子であって、次の用
途に利用することが期待されている。

【０００３】すなわち、癌の放射線療法あるいは化学療
法による白血球減少症の治療、骨髄移植後速やかに白血
球を増殖させる、その他に有用と考えられている。

【０００４】ｈＧＭ−ＣＳＦの遺伝子組換えによる製造
技術については既にいくつかの報告（ＰＣＴ公開公報Ｗ
Ｏ８６／００６３９、同ＷＯ８６／０３２２５、ＥＰＯ
公開公報０１８３３５０その他）があり、ｈＧＭ−ＣＳ
Ｆをコードする遺伝子の塩基配列並びにそれによって生
産されるポリペプチドのアミノ酸配列は共に公知であ
る。なお、ｈＧＭ−ＣＳＦは、１４４個のアミノ酸から
成るポリペプチドを含む糖蛋白と考えられている（ＰＣ
Ｔ公開公報ＷＯ８６／００６３９号参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】一般に遺伝子組換え技
術による物質生産においては、宿主として動物細胞ある
いは酵母を用いるよりも大腸菌を用いたほうが物質の生
産性が高いのが普通である。

【０００６】ｈＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子の大腸
菌による発現に関しては、本発明者らの知る限り二つの
報告がある。クラークらは、ｈＧＭ−ＣＳＦを構成する
ポリペプチドのアナログ（ｈＧＭ−ＣＳＦを構成するポ
リペプチドとはそのアミノ酸配列が３カ所において異な
りかつＮ末にメチオニンを有するポリペプチド）をコー
ドする遺伝子を大腸菌で発現させているが（ＰＣＴ公開
公報ＷＯ８６／００６３９号参照）、このときの遺伝子
の発現レベルは、細胞（大腸菌）蛋白の高々５％と極め
て低くかつその発現産物がｈＧＭ−ＣＳＦ活性を有する
か否かは全く不明であった。また、バージェスらは、ヒ
ト単球細胞株Ｕ９３７より得たｈＧＭ−ＣＳＦをコード
するｃＤＮＡを大腸菌で発現させているが、このときの
発現レベルは大腸菌蛋白の８〜１０％（Ｂｌｏｏｄ，６
９（１），４３（１９８７））であって、十分なもので
はなかった。

【０００７】このため、ｈＧＭ−ＣＳＦ活性を有するポ
リペプチドないし糖蛋白のより効率的な製造技術を確立
することが望まれていた。

【０００８】

【発明を解決するための手段】本発明は上記の問題点を
解決するためになされたものであり、ｈＧＭ−ＣＳＦ活
性を有するポリペプチドを大腸菌で効率よく製造するた
めの手段を提供するものである。すなわち本発明は、 （１） 図１又は図２に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を
用意し、このＤＮＡ鎖を、これをその遺伝情報が発現可
能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミドによ
る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換および得られる形
質転換体の培養から成る工程に付して培養物中にｈＧＭ
−ＣＳＦを産生させることを特徴とするｈＧＭ−ＣＳＦ
の製造法、である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ鎖 本発明のＤＮＡ鎖は第１図又は第２図に示す塩基配列を
含むものである。この塩基配列は公知のｈＧＭ−ＣＳＦ
（Ｍａｔｕｒｅ部分）のアミノ酸配列のＮ末にＭｅｔを
付加したポリペプチドをコードするものであるが、大腸
菌で高発現させることができるよう次の諸点を考慮して
本発明者らが設計したものである。

【００１０】（１） 大腸菌において優先的に用いられ
ているコドンを使用する。大腸菌において優先的に用い
られているコドンは池村によって報告されている（池
村、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．５６ ｐ５３３−５５５
（１９８１））。

【００１１】（２） ５′末端の塩基配列を大腸菌の各
種遺伝子の翻訳開始部位に共通な塩基配列に近づけた
（Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ．Ｒｅｓ．８ ｐ３８９５−３９０５（１９８
０））。

【００１２】なお、本発明のＤＮＡ鎖は、これを適当な
ベクターに結合させ大腸菌に導入し高発現させるための
ものであるが、このＤＮＡ鎖の高発現を実現させるため
には、前記の塩基配列の５′末端上流側にＳ．Ｄ．配列
を含む。

【００１３】

【化３】

【００１４】の塩基配列（Ｓｃｈｅｒｅｒ．ｅｔ ａ
ｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ｐ３８９５−３
９０５（１９８０））を有することが好ましく、また前
記の塩基配列の３′末端下流に終止コドンを２つ以上有
していてもよい。更にこの遺伝子の５′末端及び３′末
端には遺伝子組換操作を容易にするための適当な制限酵
素部位を付加しておくことが好ましい。

【００１５】本発明のＤＮＡ鎖の製造 本発明のＤＮＡ鎖は、合目的的な任意の方法で製造する
ことができるが、その一例を示すと次の通りである。

【００１６】（１） 図１の塩基配列を含むＤＮＡ鎖の
製造 ＤＮＡ鎖を３〜４個の約１００塩基対程度のブロックに
分けて合成し、各ブロックを順次適当なクローニングプ
ラスミド（例えばｐＵＣ１９，ＭｅｓｓｉｎｇらＧｅｎ
ｅ ３３ ｐ１１０〜１１５（１９８５））に挿入連結
することにより目的とするＤＮＡ鎖を得る。

【００１７】各ブロックの合成は、これを２５〜３５塩
基程度のオリゴヌクレオチドに分けて合成し、これらを
会合させることにより行う。ブロックをオリゴヌクレオ
チドに区分けする際には、各オリゴヌクレオチドが自己
会合を起こすことがないよう１つのオリゴヌクレオチド
内に自己相補的配列が出現しないようにすることが必要
である。また、繰返し配列が１つのオリゴヌクレオチド
内に出現しないようにすることも必要である。図３に区
分けしたオリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を、また
図４にこれらのオリゴヌクレオチドからの各ブロックの
構成例を、また図５に各ブロックの塩基配列と制限酵素
部位の一例を示す。

【００１８】各オリゴヌクレオチドは既知の合成法によ
って合成することが出来る［例えばホスホアミダイト法
による固相合成法（ＢｅａｕｃａｇｅらＴｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２ １８５９〜１８６２
（１９８１）］。またこの合成法に基づく自動合成機を
使用することも可能である。各ブロックの構築は、各オ
リゴヌクレオチドの５′末端を、必要に応じてポリヌク
レオチドキナーゼでリン酸化した後アニールし、ＤＮＡ
リガーゼによって二重鎖ＤＮＡとすることにより行う。
各ブロックを連結する手順は次の通りである。

【００１９】図５のＣブロックを、ｐＵＣ１９のＨｉｎ
ｄIII 及びＰｓｔＩによる切断片と結合させプラスミド
ｐＹＣ８を得、これで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換す
る。次いで、ｐＹＣ８を単離し、ジデオキシ法によって
塩基配列を確認するとともに、ｐＹＣ８をＮｈｅＩ及び
ＡｖａＩで消化してからＢブロックを結合させ、ｐＳＣ
Ｂ８６を得、これでＪＭ１０９を形質転換する。ｐＳＣ
Ｂ８６の塩基配列を確認した後、ｐＳＣＢ８６で大腸菌
ｄａｍ^- 株ＧＭ３３を形質転換し、ｐＳＣＢ８６を改め
て単離する。ｐＳＣＢ８６をＢｃｌＩ及びＳａｃＩで消
化してからこれにＡブロックを結合させｐＳＣＢＡ８６
７を得、これでＪＭ１０９を形質転換する。同様にｐＳ
ＣＢＡ８６７の塩基配列を確認し、更にｐＳＣＢＡ８６
７をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、これにＤブロッ
クを結合させることによりｐＳＣＢＡＤ８６７６を得、
ＪＭ１０９を形質転換し、同様にして塩基配列を確認す
る。

【００２０】このようにして得られるｐＳＣＢＡ８６７
をＸｂａＩ（ＳａｃＩ）及びＢａｍＨＩ（Ｈｉｎｄ II
I）にて消化することにより、図１に示した塩基配列を
含む本発明のＤＮＡ鎖を得ることができる（図６Ａ）。
ｐＳＣＢＡＤ８６７６をＣｌａＩ（ＥｃｏＲＩ）及びＢ
ａｍＨＩ（Ｈｉｎｄ III）にて消化すればＳＤ配列を含
む本発明のＤＮＡ鎖を得ることができる（図６Ｂ）。

【００２１】（２） 図２の塩基配列を含むＤＮＡ鎖の
製造 前記の「図１の塩基配列を含むＤＮＡ鎖の製造」に準じ
た手順により製造することができる。

【００２２】ただし、この場合には、前記のオリゴフク
レオチドＣ−３の代わりに下記のＣ−１３を、またＣ−
９の代わりに下記のＣ−１４を用いる。

【００２３】

【化４】

【００２４】このようにして得られる本発明のＤＮＡ鎖
を図７に示す。

【００２５】形質転換体の作成 上記のようにして調製される本発明ＤＮＡ鎖は、ｈＧＭ
−ＣＳＦ蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるの
で、このＤＮＡ鎖をこれをその遺伝情報が発現可能な状
態で含むプラスミドとして生物工学的手法によって大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入して形質転換し、得られる形
質転換体を培養することにより、ｈＧＭ−ＣＳＦ蛋白を
つくらせることができる。

【００２６】形質転換体の作成（およびそれによるｈＧ
Ｍ−ＣＳＦの生産）のための手順ないし方法そのもの
は、分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野にお
いて慣用されているものでありうるので、本発明におい
ても下記したところ以外のものについてはこれら慣用技
術に準じて実施すればよい。

【００２７】大腸菌中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現
させるためには、まず大腸菌中で安定に存在するプラス
ドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。
このプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２等合目
的的な任意のものを用いることができる。

【００２８】一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を大腸菌で
発現させるためには、そのＤＮＡをｍＲＮＡへ転写させ
る必要がある。そのためには、転写のためのシグナルで
あるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′側上流に組込
めばよい。このプロモーターについてはすでにｔｒｐ、
ｌａｃ、ＰＬ、ＯｍｐＦ等種々知られており、本発明で
もこれらのいずれをも利用することができる。

【００２９】また、転写を終結させるためのターミネー
ターを本発明ＤＮＡ鎖の３′側下流に組込むことが好ま
しい。強力なプロモーターを用いた場合、ターミネータ
ーを挿入することにより、プラスミドの安定性を高める
ことができる。ターミネーターとしては、ｔｒｐａ、ｒ
ｒｎｃ、λｔｏｏｐ等を用いることができる。

【００３０】また、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させる段階で
は蛋白合成の場であるリボソームが翻訳開始部位の先端
に結合するために必要な配列（Ｓ．Ｄ．配列と呼ばれ
る）を蛋白合成の開始信号であるＡＴＧの前につける必
要がある。更に効率的に発現させる為には、このＳ．
Ｄ．配列並びにこのＳ．Ｄ．配列と蛋白合成の開始信号
であるＡＴＧとの間の塩基配列を、大腸菌における翻訳
開始部位に共通な塩基配列に近づけることが好ましい。
例えば

【００３１】

【化５】

【００３２】とすることが好ましい。

【００３３】このようにしてつくったプラスミドによる
大腸菌の形質転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野
で慣用されている合目的的な任意の方法によって行なう
ことができる。その一般的な事項については適当な成書
または総説たとえばＭａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）を参照すれば
よい。

【００３４】形質転換体は、本発明ＤＮＡ鎖によって導
入された遺伝情報による新しい形質（すなわちｈＧＭ−
ＣＳＦの生産能）および使用ベクター由来の形質ならび
に場合によっては、生じているかも知れない遺伝子組換
時の使用ベクターからの一部の遺伝情報の欠落による対
応形質の欠落を除けば、そのゼノタイプないしフェノタ
イプあるいは菌学的性質において使用大腸菌と同じであ
る。

【００３５】ｈＧＭ−ＣＳＦの生産 上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば菌体中にｈＧＭ−ＣＳＦ蛋白を生産す
る。

【００３６】形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用
大腸菌に対するそれと本質的には変らない。また、培養
物すなわち菌体および（または）培養液からの生産蛋白
の回収も合目的的な任意の方法（例えば、後記実施例６
記載の方法）に従って行なうことができる。ｈＧＭ−Ｃ
ＳＦは大腸菌中において凝集した形で産生されるので、
この蛋白を回収後変性剤（例えば、塩酸グアニジン、尿
素）を用いて溶解し、ジスルフィド結合を還元剤（例え
ばジチオスレイトール）を用いて切断してから常法に従
って精製することが好ましい。

【００３７】

【実施例】実施例１ オリゴヌクレオチドの合成 図３に示すオリゴヌクレオチド並びに前記のオリゴヌク
レオチドＣ−１３およびＣ−１４は、ホスホアミダイト
法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ ２２ １８５９〜１９６２（１９８
１））を用いたＤＮＡ自動合成機（アプライドバイオシ
ステムズ社製３８０Ａ型、Ｍ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０ １０５〜１１１（１９８
４））を使用して合成した。

【００３８】合成終了後、濃アンモニア水で６０℃で５
時間処理して、塩基の保護基を除き、担体よりオリゴヌ
クレオチドを切出した。得られたオリゴヌクレオチドを
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精
製した。すなわち逆相の中性硬質ポリスチレン系ゲル
（ＰＲＰ−１、ハミルトン社）のカラム（φ４．１×１
５０ｍｍ）にかけ、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸緩衝
液中（ｐＨ７．０）のアセトニトリルの直線濃度勾配法
によって精製した。目的とするピークのものを集め、８
Ｍウレアを含む１２％ポリアクリルアミドを用いて電気
泳動にかけた。泳動後ゲルの下に蛍光色素を含むＴＬＣ
プレートを置き、ＵＶランプを用いて目的のバンドの存
在を確認した。目的とするオリゴヌクレオチドを含むゲ
ル片を、透析チューブ内に封入し、ＤＮＡをゲルから電
気的に溶出した。この透析チューブ内液をセファデック
スＧ２５（ファルマシア社製）のゲル濾過カラム（φ
１．５×４３ｃｍ）にかけ０．０５Ｍトリエチルアミン
重炭酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出し脱塩した。目的
とするオリゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧濃縮し
て、純粋なオリゴヌクレオチドを得た。

【００３９】実施例２ オリゴヌクレオチドのライゲー
ション 化学合成したオリゴヌクレオチド３４本を図４のブロッ
クの調製計画に従ってライゲーションした。以下詳細に
のべる。各ブロックの５′末端にあるオリゴヌクレオチ
ドを除く残りの２６本の各オリゴヌクレオチド（各０．
８ｎｍｏｌ）を２０μｌのリン酸化反応液［５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、３０μＣｉの［α−³²Ｐ］Ａ
ＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１５ユニットのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム
社）］中で３７℃３０分間反応させて５′末端をリン酸
化してラベルした。次いで１００ｍＭ ＡＴＰを１μｌ
加え、３７℃３０分間反応させることで完全に５′末端
をリン酸化し、１００℃５分間加熱することで反応を停
止した。

【００４０】次いで、図４のライゲーション計画に従
い、各オリゴヌクレオチドを混合し、９５℃５分間加熱
し２時間かけて常温まで戻してアニーリングを行なっ
た。これを２００μｌのライゲーション反応液［５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ３０ユニット（ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ社）］中にて１５℃１４時間反応させた。一部
の反応溶液を８％ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、
ラジオオートグラフで各ブロックがライゲーション反応
の結果として得られたことをそれぞれ確認した。次に上
記反応液にエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、同様
に８％ポリアクリルアミド電気泳動にて分離した。各ブ
ロックを含むゲル片を透析チューブに入れ、泳動緩衝液
中で電気泳動することによりそれぞれ溶出した。次に各
透析チューブ内液をＮＡＣＳカラム（ベゼスダ・リサー
チ・ラボラトリー社）にかけ、溶出液にオエタノールを
加えＤＮＡをそれぞれ沈殿させた。

【００４１】実施例３ ｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のクロー
ニング クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＵＣ１
９（ファルマシア社）を用いた。１μｇのｐＵＣ１９Ｄ
ＮＡを３０μｌの反応液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２ユニットのＨｉｎｄ III
（宝酒造）、１０ユニットのＰｓｔＩ（宝酒造）］中、
３７℃２時間反応させた後、６５℃２０分間処理して制
限酵素を失活させた。１μｇのＣブロックＤＮＡ２０μ
ｌの反応液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ユニ
ットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）］中、
３７℃１時間反応させ、リン酸化した。この反応２μｌ
を前記のｐＵＣ１９ＤＮＡとＨｉｎｄ III及びＰｓｔＩ
との反応液７μｌに加え、更に２μｌの［５００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ ］溶液、１μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの１０
０ｍＭ ＡＴＰ、２μｌ（２ユニット）のＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社）、１５μｌの
オートクレーブ水を加え、１４℃で１４時間反応させ
た。

【００４２】この反応液を用い、大腸菌ＪＭ１０９株
（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−ＰｅｒｒｏｎらＧｅｎｅ ３３
ｐ１０３−１１９（１９８５））を既知の方法（Ｄ．
Ｈａｎａｈａｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｐ５５７〜５
８０（１９８０））により形質転換させた。その際、プ
レートにはＬＢプレートを用い、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン、０．２４ｍｇ／ｍｌのイソプロピル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及び０．０４ｍｇ／
ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含んでいた。アンピシリ
ン耐性で無色のコロニーを選び、そのうちの１つをｐＹ
Ｃ８／ＪＭ１０９と命名した。

【００４３】ＣブロックＤＮＡがｐＵＣ１９のＨｉｎｄ
III及びＰｓｔＩの間に挿入された場合、ＣブロックＤ
ＮＡによるユニークなＮｈｅＩ制限酵素部位が存在す
る。そこで、ｐＹＣ８／ＪＭ１０９の菌株よりプラスミ
ドＤＮＡをアルカリ法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐ３６８〜３６９
（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）
にて分離し、ＮｈｅＩ（ニューイングランドバイオラブ
ズ社）によって消化されることを確認した。またｐＹＣ
８についてジデオキシ法（服部ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１５２ ｐ２３２−２３８（１９８６））を用
いて塩基配列を確認した。

【００４４】ｐＹＣ８をＮｈｅＩ及びＡｖａＩにて消化
した後、上記と同様な方法にて、ＢブロックＤＮＡをラ
イゲーションして挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換させた。Ｂブロックが挿入されたことを、ＳａｌＩ制
限酵素の消失によって確認し、前記の方法にて塩基配列
を確認した。得られた菌株をｐＳＣＢ８６／ＪＭ１０９
とした。このプラスミドｐＳＣＢ８６で大腸菌ｄａｍ^-
株であるＧＭ３３株（東洋紡績（株）より入手）を形質
転換した。この菌株をｐＳＣＢ８６／ＧＭ３３とした。

【００４５】この菌株よりプラスミドを単離し、Ｂｃｌ
Ｉ及びＳａｃＩにて消化後、ＡブロックＤＮＡを挿入
し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。Ａブロック
が挿入されたことをＮｃｏＩ制限酵素部位の存在で確認
した。塩基配列を前記の方法で確認した。得られた菌株
をｐＳＣＢＡ８６７／ＪＭ１０９とした。これにより、
図６Ａに示す本発明のＤＮＡ鎖を調製した。

【００４６】更に、Ｓ．Ｄ．配列を含むｈＧＭ−ＣＳＦ
遺伝子を調製する為に、プラスミドｐＳＣＢＡ８６７を
ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩにて消化し、ＤブロックＤＮＡ
を挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。Ａブ
ロックが挿入されたことをＣｌａＩ制限酵素部位の存在
で確認した。塩基配列を前記の方法で確認した。得られ
た菌株をｐＴＣＢＡＤ８６７６／ＪＭ１０９とした。こ
れにより図６Ｂに示すＳ．Ｄ．配列を含む本発明のＤＮ
Ａ鎖を調製した。

【００４７】以上のクローニングプロセスの概要を図８
に示した。また前記と同様の手順により図７Ａ，Ｂに示
す本発明のＤＮＡ鎖を製造した。ただし、オリゴヌクレ
オチドＣ−３の代わりにＣ−１３を、またＣ−９の代わ
りにＣ−１４を用いた。

【００４８】実施例４ 発現ベクターの構築 大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーター及びオペ
レーター領域の塩基配列については既にＢｅｎｎｅｔｔ
らにより報告されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２
１ ｐ１１３−ｐ１３７（１９７８））。転写開始点か
ら、５′上流９４塩基より、３′下流＋２１塩基までの
配列をベースとし、その転写開始点直後にＣｌａＩサイ
トをまたＳ．Ｄ．配列の直後にＸｂａＩサイトを設け、
さらに５′末端にはＥｃｏＲＩサイトをまた３′末端に
はＨｉｎｄ IIIサイトを設けた１３１塩基対を化学的に
合成した（図９）。この１３１塩基のトリプトファンプ
ロモーターをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ I
IIにて消化したＤＮＡに挿入し、トリプトファンプロモ
ーターを含む発現ベクターとし、ｐＳＴ８と命名した。

【００４９】トリプトファンオペロンの転写終結の為の
ターミネーターは、Ｃｈｒｉｓｔｉｅらによってその塩
基配列とその終結の強さが報告されている（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（７） ｐ
４１８０〜４１８４（１９８１））。Ｔｒｐａターミネ
ーターの５′末端にＢａｍＨＩサイトを、３′末端にＳ
ｐｈＩサイトを設けたオリゴヌクレオチドを化学的に合
成（図１０）した。このターミネーターを含むオリゴヌ
クレオチドを、ｐＳＴ８のＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩにて
消化したＤＮＡに挿入して、プラスミドｐＳＴ８１を得
た。

【００５０】ｐＢＲ３２２由来のプラスミドで、大腸菌
におけるコピー数の高いｐＡＴ１５３がＴｗｉｇｇらに
より作られている（Ｎａｔｕｒｅ ２８３ ｐ２１６〜
ｐ２１８（１９８０））。そこでｐＳＴ８１のトリプト
ファンプロモータ及びＴｒｐａターミネーターを含むＤ
ＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにて消化して得、ｐ
ＡＴ１５３（アマシャム社）のＥｃｏＲＩおよびＳｐｈ
Ｉ消化断片に挿入して、プラスミドｐＳＴ８１１を得た
（図１１参照）。

【００５１】実施例５ ｈＧＭ−ＣＳＦの発現用プラス
ミドの構築 （１） プラスミドｐＳＴ８１１による発現用プラスミ
ド 前記ｐＳＣＢＡＤ８６７６をＣｌａＩ及びＢａｍＨＩに
て消化後、０．８％アガロース電気泳動により、４２３
塩基対のＤＮＡ断片を精製した。前記発現用ベクターｐ
ＳＴ８１１をＣｌａＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、上
記４２３塩基対のＳ．Ｄ．配列を含むｈＧＭ−ＣＳＦ遺
伝子（図６Ｂ）をＴ４リガーゼによりライゲーションし
て挿入し、大腸菌ＲＲ１株を形質転換した。アンピシリ
ン耐性のコロニーよりプラスミドを単離し、ＰｓｔＩに
て消化し、その切断パターン及び、ＸｂａＩ制限酵素部
位の消失から、Ｓ．Ｄ．配列を含むｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝
子が挿入された事を確認した。得られた菌株をｐＳＴ６
３１１／ＲＲ１とした（図１２Ａ参照）。

【００５２】（２） プラスミドｐＣＦＭ５２６による
発現用プラスミド λファージＰＬプロモーターを含む発現ベクターｐＣＦ
Ｍ５２６（特表昭６０−５０１９８８、ＰＣＴ公開公報
ＷＯ８５／００８２９、ＡＴＣＣ３９９３２）を用い、
Ｓ．Ｄ．配列を含むｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子（図６Ｂ）を
挿入した。即ち、上記４２３塩お基対のＳ．Ｄ．配列を
含むｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を、ｐＣＦＭ５２６をＣｌａ
Ｉ及びＢａｍＨＩにて消化したＤＮＡにＴ４リガーゼに
よりライゲーションして挿入し、λＣＩ₈₅₇ 遺伝子を含
むプラスミドｐＭＷ１（ＡＴＣＣNo．３９９３３）を有
する大腸菌ＡＭ７を形質転換した。アンピシリン及びカ
ナマイシン耐性のコロニーより、プラスミドを単離し、
ＰｓｔＩにて消化し、その切断パターンからＳ．Ｄ．配
列を含むｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が挿入された事を確認し
た。得られた菌株をｐＴＯ６１４／ＡＭ７とした（図１
２Ｂ参照）。

【００５３】実施例６ ｈＧＭ−ＣＳＦの製造法（図１
のＤＮＡ鎖の発現） （１） プラスミドｐＳＴ６３１１／ＲＲ１の発現 前記ｐＳＴ６３１１／ＲＲ１をアンピシリンを含むＬ培
地にて３７℃にて一晩振とう培養した。この培養液２ｍ
ｌを１００ｍｌのＭ９培地（０．８％グルコース、０．
４％カザミノ酸、１０μｇ／ｍｌチアミン、５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含む）に加え、３７℃にて３時間振
とうした。インドールアクリル酸を最終濃度４０μｇ／
ｍｌになるように添加した。このまま更に５時間振とう
培養した。得られた大腸菌の一部をサンプル緩衝液中で
煮沸（５分）し、煮沸液についてＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動を行ない、ｈＧＭ−ＣＳＦの含有量を調
べた。この条件においてｈＧＭ−ＣＳＦは、大腸菌細胞
蛋白質の３０％以上であった。

【００５４】（２） プラスミドｐＴＯ６１４／ＡＭ７
の発現 前記のｐＴＯ６１４／ＡＭ７をアンピシリン及びカナマ
イシンを含むＬ培地にて２９℃で一晩振とう培養した。
この培養液１０ｍｌを５００ｍｌのアンピシリン及びカ
ナマイシンを含むＬ培地に加え、５連で２９℃で３時間
振とう培養した。予め５４℃にしておいたＬ培地５００
ｍｌを各培養液に加え、４２℃にして更に３時間培養し
た。前記と同様にしてｈＧＭ−ＣＳＦの含有量を調べた
結果、大腸菌細胞蛋白質の３０％以上であった。

【００５５】更に、培養液を遠心分離して合計約１０ｇ
の菌体を得た。蒸留水を加え、３℃にて完全に分散する
までホモジナイザーを用いて分散させた。この懸濁液を
フレンチ・プレスに三回かけた。この間懸濁液は、１８
℃以下に保持した、この均質液を蒸留水で１２５ｍｌに
希釈し、得られた混合液を３０℃において遠心分離し
た。上澄液をデカンテーションし、残渣は蒸留水を用い
て再懸濁させて最終容量８０ｍｌにした。得られた混合
液を３℃にて遠心分離して上澄液をデカンテーション
し、残渣を蒸留水にて懸濁させて最終容量１２ｍｌにし
た。得られた混合液に４ｍｌの１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
８．５）と６４ｍｌの１０Ｍ尿素を加えた。得られた混
合液を１４℃において遠心分離し、上澄液を集めた。こ
の上澄液に５３３ｍｇの還元型グルタチオン及び１０７
ｍｇの酸化型グルタチオンを含む７２０ｍｌの２０ｍＭ
のトリス緩衝液（ｐＨ８．５）を加えた。この混合液を
５℃て２０時間放置した。この混合液を５℃にて分子量
１０，０００のメンブランを通過させることで濃縮し
た。この濃縮液を、５℃にて少なくとも４００ｍｌの２
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）とともに、分子量１
０，０００のメンブランを通過させバッファー交換した
（ミリポア社製、ペリコンラボカセットを使用）。濃縮
液のｐＨを５０％酢酸によってｐＨ５．３とした。この
混合液を３℃において遠心分離した。希釈した上澄液を
ＣＭ−セファロースカラムにかけ、４５ｍＭＮａＣｌ−
２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）緩衝液にて溶出
した。溶出液のｐＨを１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）
を用いてｐＨ７．７にした。ＣＭ−セファロースカラム
からの溶出液を５℃においてＣ４カラムにかけ、２０％
エタノール−５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．７）にて
溶出し、次いで４０％エタノール−５０ｍＭトリス緩衝
液にて溶出した。ｈＧＭ−ＣＦは、４０％エタノール−
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．７）より６０％エタノ
ール−５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．７）までのグラ
ジェントで溶出した。溶出液を集め、５℃にてＤＥＡＥ
セファロースカラムにかけ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．７）、次いで１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）、そして１５ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭリン酸緩衝
液にて溶出した。ｈＧＭ−ＣＳＦは、６０ｍＭ ＮａＣ
ｌ−１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてカラ
ム溶出することにより精製した。

【００５６】実施例７ ｈＧＭ−ＣＳＦの活性確認 ｈＧＭ−ＣＳＦの活性は、寒天中のヒト骨髄細胞由来の
コロニーの成長を促進する能力の検定により確認した。
健常人の骨髄細胞をＭｃＣｏｙ′ｓ５Ａ培地（ギブコ
社）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（ファルマ
シア社）溶液上に重層した。室温で２０分間５００×ｇ
で遠心分離し、中間層を集めて２０倍量のＭｃＣｏｙ′
ｓ５Ａ培地で洗浄した。次に懸濁液を室温で１０分間２
５０×ｇで遠心し、洗浄した。次に細胞を１０％牛胎児
血清を含むＭｃＣｏｙ′ｓ５Ａ培地に懸濁し、プラスチ
ックシャーレ中で２時間３７℃、５％二酸化炭素の状態
で培養した。培養後、上清を集め２×１０⁶ ｃｅｌｌｓ
／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。

【００５７】検定において骨髄細胞は以下の組成を持つ
培地に最終濃度が２×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる様
に加えた。ａ）１．８４×ＭｃＣｏｙ′ｓ５Ａ培地−２
ｍＭピルビン酸ナトリウム−０．８×ＭＥＭアミノ酸
（ギブコ社）−０．０８×ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブ
コ社）−０．０９％重炭酸ナトリウム−０．８×ＭＥＭ
ビタミン溶液（ギブコ社）−２．４ｍＭ Ｌ−グルタミ
ン−３．２ｍｇ／ｍｌＬ−セリン−１．６８ｍｇ／ｍｌ
Ｌ−アスパラギンを含む溶液５部、およびｂ）０．６％
Ｎｏｂｌｅ寒天（Ｄｉｆｃｏ社）３部、ｃ）牛胎児血清
１部。これに実施例６（２）で精製したｈＧＭ−ＣＳＦ
溶液を加えた。培養細胞は５％ＣＯ₂ 存在下で湿潤空気
３７℃にて保温した。７日乃至１４日間の培養後、エス
テラーゼ二重染色により顆粒球とマクロファージの確認
を行なった。その結果０．５×１０⁷ ユニット／ｍｇ以
上の活性を有することが判った。２×１０⁵ の骨髄細胞
から得られるコロニーの平均数は約２７０であるという
結果を得た。なお、ユニットの定義についてはメトカー
フらの報告によった［Ｂｌｏｏｄ ６７（１）３７〜４
５（１９８６）］。

【００５８】陽性対照実験として、ヒトＧＣＴ培養上澄
液（Ｇｉｂｃｏ社）を、前記の培地に１０％になる様に
加え、同様の結果を得た。

【００５９】微生物の寄託 λファージＰＬプロモーターを含む発現ベクターｐＣＦ
Ｍ５２６を有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＭ７、すなわ
ちＥ．ｃｏｌｉ ＡＭ７（ｐＣＦＭ５２６）、は米国メ
リーランド州、ロックビル・パークローン・ドライブの
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）に国際寄託されて、ＡＴＣＣ３９９３２の寄託番
号を得ている。

【００６０】λＣＩ₈₅₇ 遺伝子を含むプラスミドｐＭＷ
１は、それを含むＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３、すなわち
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３（ｐＭＷ１）、としてＡＴＣ
Ｃに国際寄託されていて、ＡＴＣＣ３９９３３の寄託番
号を得ている。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０１、Ｔｈｒ）のアミ
ノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す図である。

【図２】ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０１、Ｉｌｅ）のアミ
ノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す図である。

【図３Ａ】オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図であ
る。

【図３Ｂ】オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図であ
る。

【図４】各ブロックを形成するためのオリゴヌクレオチ
ドのライゲーション計画を示す図である。

【図５Ａ】各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
図である。

【図５Ｂ】各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
図である。

【図５Ｃ】各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
図である。

【図５Ｄ】各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
図である。

【図６Ａ】ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０１、Ｔｈｒ）をコ
ードする本発明のＤＮＡ鎖を示す図である。

【図６Ｂ】ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０１、Ｔｈｒ）をコ
ードするＳ．Ｄ．配列を含む本発明のＤＮＡ鎖を示す図
である。

【図７Ａ】ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０１、Ｉｌｅ）をコ
ードする本発明のＤＮＡ鎖を示す図である。

【図７Ｂ】ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０１、Ｉｌｅ）をコ
ードするＳ．Ｄ．配列を含む本発明のＤＮＡ鎖を示す図
である。

【図８Ａ】ｐＵＣ１９へのｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０
１、Ｔｈｒ）遺伝子のクローニングを示す図である。

【図８Ｂ】ｐＵＣ１９へのｈＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝１０
１、Ｔｈｒ）遺伝子のクローニングを示す図である。

【図９】合成ｔｒｐプロモーターの塩基配列と制限酵素
部位を示す図である。

【図１０】合成ｔｒｐａターミネーターの塩基配列と制
限酵素部位を示す図である。

【図１１】発現ベクターの構築を示す図である。

【図１２Ａ】ｐＳＴ６３１１の構築を示す図である。

【図１２Ｂ】ｐＴＯ６１４の構築を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 玉井 幸夫 群馬県前橋市総社町一丁目２番２号 麒 麟麦酒株式会社 医薬開発研究所内

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（ａ）、（ｂ）のいずれかに示す塩
   基配列を含むＤＮＡ鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を、これ
   をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドの作
   成、このプラスミドによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形
   質転換および得られる形質転換体の培養から成る工程に
   付して培養物中にヒト顆粒球マクロファージコロニー刺
   激因子を産生させることを特徴とする、ヒト顆粒球マク
   ロファージコロニー刺激因子の製造法。 【化１】 【化２】