JPH0460639B2

JPH0460639B2 -

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Publication number: JPH0460639B2
Application number: JP57149836A
Authority: JP
Inventors: Emu Roon Richaado
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1981-08-28
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1992-09-28
Also published as: IE822085L; JP2968052B2; JPH05292993A; ATE43138T1; ES515259A0; EP0073646B1; AU603394B2; CA1221927A; GB2105343A; IE53892B1; NZ201704A; ES8401133A1; JPH08228790A; EP0073646A2; ZA826250B; JPH0775538B2; GB2105343B; DE3279699D1; GB8423932D0; IL66614A0

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、ヒトの治療に使用されるヒト血清ア
ルブミン（HSA）を組換えDNA技術を使つて微
生物中で製造する方法に関する。１つの局面にお
いて本発明は、ヒト血清アルブミンまたはその生
物学的に活性な部分をコードしているDNA配列
が有効に発現するようにプロモーター系と機能可
能に結合されている微生物発現ビヒクル（ベクタ
ー）の構築方法およびそのように構築された発現
ビヒクルに係る。もう１つ別の局面において本発
明は、上記発現ビヒクルで形質転換され、したが
つて上記のDNA配列を発現させる微生物に係る。
さらにもう１つ別の局面において本発明は、前記
発現の目的産物を、たとえばヒトの治療に有用な
医薬組成物の如き実用製品に変換する手段と方法
に係る。本発明の好ましい実施態様においては、
成熟ヒト血清アルブミンが直接産生されるように
適切に配列された特定の発現ベクターが提供され
る。さらに別の一面において本発明は、ポリペプチ
ドまたはその生物学的に活性な部分をコードして
いるcDNAを調製するための新規な方法に関す
る。この局面では、既知のエンドヌクレアーゼ制
限部位に隣接する、目的とするポリペプチドの
mRNAの１部分に相当する合成プライマーDNA
を利用して、逆転写によつて、該ポリペプチドの
配列をコードしている一連のDNAフラグメント
を得る方法と手段が提供される。これらのフラグ
メントは、全体として所望のタンパク質コード配
列を表わすが、個々のフラグメントは重複する
DNA配列を含んでおり、その重複する配列内に
共通のエンドヌクレアーゼ制限部位をもつてい
る。このようにすることにより、それぞれのフラ
グメントを選択的に切断（開裂）・結合して、所
望のポリペプチドをコードしている全cDNA配列
を適切な解読枠内で容易に組立てることができ
る。本発明によつて、通常の逆転写酵素法およ
び／または科学合成によつては得ることができな
い高分子量タンパク質のcDNAを得ることができ
る。本発明のバツクグラウンドを明らかにするため
に、そしてある場合には、実施に関する詳細を提
供するために、参考文献を本明細書の末尾に一括
して挙げ、個々の文献に番号を付して読者の参考
に供した。以下の記載において、（）内の数字は
文献番号を表わすものとする。［従来の技術］ (A) ヒト血清アルブミンヒト血清アルブミン（HSA）は、成人の血清
中に存在する主要なタンパク質である。これは肝
臓で生産され、血液中で正常な浸透圧を維持する
役目を果たしており、また種々の血清分子を運搬
する担体としての機能をもつている（文献１、
２）。胎児においてはHSAに対応してα−フエト
プロテインがあり、これらの比較実験が、ラツト
の血清アルブミンとα−フエトプロテインの比較
実験と同様に行なわれている（文献３〜８）。
HSAの完全なタンパク質配列は既に公表されて
いる（文献９〜12）。この発表されているHSAの
タンパク質配列は、約20残基が一致しておらず、
成熟タンパク質のアミノ酸総数も異なつている
［アミノ酸数584（文献９）、585（文献12）］。ある研
究によると、HSAは初め「プレプロ」（prepro）
配列を含む前駆体分子として合成される（文献
13、14）。さらに、牛（文献15）とラツト（文献
16）の血清アルブミンの前駆体は配列も決定され
ている。医療にアルブミンを利用し得る根拠は、血液量
不足（症）、低タンパク質症およびシヨツクを処
置できる点にある。現在アルブミンは、毛細管の
細孔を通過し得ない溶質（コロイド）によつて起
こる血漿コロイド浸透圧を改善するのに使用され
ている。アルブミンは透過率が低いので基本的に
血管内に留まつている。細胞膜をはさむ両側にお
いて非拡散性粒子の濃度が異なつていると、その
両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を通して
水が移行する。この浸透現象過程において、アル
ブミンは血中の液体含量を維持する上で重要な働
きをする。従つて、アルブミンを投与する基本的
な治療上の意義は、外科手術、シヨツク、火傷、
浮腫を起こす低タンパク血症の場合のように、血
管からの液体の損失があるような状態を処置する
点に存する。アルブミンはまた、診断にも利用す
ることができ、他のタンパク質と非特異的に結合
し得る能力を有するが故に種々の診断溶液に使用
することができる。現在、ヒト血清アルブミンは全血の分画によつ
て生産されており、合理的な価格で多量に得るこ
とはできない。組換えDNA技術を応用すると、
ヒト血清アルブミンを効率よく生産するように遺
伝子操作した微生物を使つて、該アルブミンを豊
富に生産することが可能になる。本発明は組換え
DNA技術により、従来よりも廉価にかつ多量に、
純粋なHSAを生産することを可能にしたもので
ある。本発明はまた、ヒト血清アルブミンの
DNA配列構造およびそれから演繹されるアミノ
酸配列についての知見を提供するものであり、こ
れはヒト血清アルブミンおよびそれに関連するタ
ンパク質、たとえばα−フエトプロテインの進化
論的性質、調節作用および機能的性質を解明する
のに役立つものである。さらに詳細には、本発明によつて、HSA
mRNAのタンパク質コード部分と3′非翻訳部分
の全配列を含むcDNAクローンが単離される。こ
れらのcDNAクローンを使用して、微生物株中で
trpプロモーターの制御下に成熟HSAタンパク質
を発現させるための組換え発現ビヒクルを構築し
た。本発明はまた、HSAの完全なヌクレオチド
配列および演繹されるアミノ酸配列も提供する。本明細書において、「成熟ヒト血清アルブミン」
の発現とは、ヒト血清アルブミンmRMAの翻訳
直後には付随しているプレ配列（プレプロ）を伴
なつていないヒト血清アルブミンを微生物により
生産することをいう。本発明によれば、成熟ヒト
血清アルブミンは翻訳開始信号（ATG）（これは
また、アルブミンの最初のアミノ酸に結合してい
るアミノ酸のメチオニンをコードしている）から
直接発現される。このメチオニンは微生物によつ
て自然に切断され、その結果ヒト血清アルブミン
が直接得られる。また、成熟ヒト血清アルブミン
は、通常のリーダー以外のタンパク質と共に発現
させることができ、この融合タンパク質部分は細
胞内または細胞外で特異的に切断することができ
る（英国特許公開第2007676A号参照）。最後に、
成熟ヒト血清アルブミンは微生物のシグナルポリ
ペプチドと結合させて生産することもでき、この
シグナルポリペプチドはその融合体を細胞壁に輸
送し、そこでこのシグナルはプロセツシングを受
けて取り除かれ、成熟ヒト血清アルブミンが分泌
される。 (B) 組換えDNA技術組換えDNA技術の出現によつて、多種多様な
有用ポリペプチドの微生物による調整された生産
が可能となつた。多くの哺乳動物ポリペプチド、
たとえばヒト成長ホルモンやヒトおよびハイブリ
ツド白血球インターフエロンが既に種々の微生物
により生産されている。この技術によつて種々の
有用なポリペプチドの微生物による生産が可能と
なり、種々の薬物を標的に向かわしめる応用
（drug−targeting application）に有用なワクチ
ン、ホルモン、酵素および抗体を微生物に生産さ
せることができるようになつた。組換えDNA技術の基本的な要素はプラスミド、
すなわち、細菌中にしばしば細胞当たり複数個存
在する２本鎖DNAの染色体外ループである。こ
のプラスミドDNAにコードされている情報には、
このプラスミドを娘細胞中で再生するのに必要と
なる情報（すなわちレプリコンまたは複製起点）
および通常、１種またはそれ以上の表現型選択特
性、たとえば所望のプラスミドを含有している宿
主細胞のクーロンを選択培地中で認識して優先的
に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含まれ
ている。細菌プラスミドを使用することの利点
は、これらが種々の制限エンドヌクレアーゼ、す
なわち「制限酵素」で特異的に開裂することがで
きることであり、それぞれの制限酵素はプラスミ
ドDNA上の別々の位置を認識する。次いで異種
の遺伝子または遺伝子フラグメントを、開裂部位
またはこれに隣接する改造末端で、端と端とをつ
なぎ合せることによりこのプラスミドに挿入する
ことができる（ここで「異種（外来性）」という
用語は、問題にしている微生物には通常存在しな
い遺伝子またはその微生物によつて通常は産生さ
れないポリペプチド配列を表わすのに使用し、一
方、「同種」という用語は、対応する野生株の微
生物中に存在する遺伝子、あるいはそれによつて
産生されるポリペプチドを表わすのに使用するも
のとする）。このようにして、いわゆる複製可能
な発現ビヒクルが形成される。 DNAの組換えは微生物の外で行ない、得られ
た複製可能な「組換え」発現ビヒクル（またはプ
ラスミド）は、形質転換として知られている工程
によつて微生物に挿入することができ、そしてこ
の形質転換体を増殖させることによつて異種遺伝
子をもつた組換えビヒクルを多量に得ることがで
きる。さらに、プラスミド中でコードされている
DNAの情報の転写と翻訳を支配している部分に
関して適切な位置にこの遺伝子を挿入すると、得
られる発現ビヒクルは、その挿入された遺伝子が
コードしているポリペプチド配列を実際に生産す
るのに使用することができる。この過程を発現と
いう。発現はプロモーターとして知られているDNA
領域で始まる。発現の転写段階ではDNAが巻き
もどされ、DNAの意味のあるコード鎖が、全
DNA配列の５′末端から３′末端へ向かつてメツ
センジヤーRNAが合成されるときの鋳型として
露出される。次にメツセンジヤーRNAがリボゾ
ームに結合し、ここでこのメツセンジヤーRNA
はDNAがコードしているアミノ酸配列をもつた
ポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸は３個
のヌクレオチド、すなわち「コドン」によつてコ
ードされている。このコドンは全体で「構造遺伝
子」、すなわちDNA配列の中で発現されるポリペ
プチド産物のアミノ酸配列をコードしている部分
を構成している。翻訳は「開始」信号（通常はATG、これは得
られるメツセンジヤーRNAではAUGとなる）で
始まる。いわゆる停止コドン−これは構造遺伝子
の最後に転写される−は翻訳の終了、従つてそれ
以上のアミノ酸単位の生産の停止を指令する。生
成した産物は、宿主細胞を溶解し、適当な方法で
他のタンパク質から精製・単離することにより回
収することができる。実際、組換えDNA技術を使うと、全体が異種
のポリペプチドを発現させることができ（いわゆ
る直接発現）、あるいはまた同種ポリペプチドの
アミノ酸配列の一部と融合した異種ポリペプチド
を発現させることもできる。後者の場合、所望の
生物活性産物は、細胞外の環境で開裂されるま
で、この融合した同種／異種ポリペプチドの中で
不活性化されている（Wetzel，American
Scientist，68，664（1980）参照）。組換えDNA技術が完全にその期待を裏切らな
いものであるとしても、所望のポリペプチド産物
がコントロールされた環境のもとで、しかも高収
率で得られるように、挿入されて遺伝子の発現が
最適となるような系を工夫しなければならない。 (C) 技術の現況 Sargentらは、一連の組換えDNAプラスミド
として、ラツト血清アルブミンのメツセンジヤー
RNAのクローニングについて記載している
（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），78，243（1981）参
照）。これはこのタンパク質産物の進化仮説を研
究するために、クローンのヌクレオチド配列を決
定しようとして行なわれた。すなわち、彼等は調
製したcDNAフラグメントを組立ててみるような
ことはしなかつたのである。一方、Dugaiczykらはヒト血清アルブミンのヒ
ト遺伝子についての研究を要約して発表している
（Journal of Supramolecular Structure and
Cellular Biochemistry. Supplement ５，1981，
Alan R.Liss，Inc.NY.参照）。彼等はcDNAフラ
グメントを得たが、α−フエトプロテインおよび
血清アルブミン遺伝子の基礎的な分子生物学を研
究する目的以外には、このフラグメントをクロー
ニングしたり生産したりした形跡がない。［発明の概要］本発明は、組換えDNA技術を使つてヒト血清
アルブミンを直接形態で好都合に効率よく生産す
ることができるとこを見い出した事実に基くもの
である。この生産物は、アルブミンの補給が必要
な場合のヒトの治療に使用するのに好適である。
この生産物は遺伝子操作をほどこした微生物によ
つて生産されるので、現在の血液の分画技術によ
る生産よりもずつと効率よくHSAを製造し、単
離することが可能である。本発明の重要性は、約
2000塩基以上のmRNA転写体に相当する非常に
長いタンパク質−アミノ酸584個−を生産するよ
うに微生物を遺伝子操作することに成功した点に
ある。本発明の目的は上記のようにして生産されるヒ
ト血清アルブミンならびにその生産の手段および
方法を提供することにある。さらに本発明の目的
は、直接発現できる形態でHSAをコードしてい
る遺伝子配列を有する複製可能なDNA発現ビヒ
クルを提供することにある。さらに本発明のもう
１つの目的は、上記の発現ビヒクルで形質転換し
た微生物株およびHSAを産生することができる
該形質転換株の微生物培養物を提供することにあ
る。また、本発明は、上記のHSA遺伝子配列、
DNA発現ビヒクル、微生物株および培養物を調
製するのに有用な種々の方法、ならびにその特定
具体例を提供する。さらに本発明は、別の態様に
おいて、共通の制限エンドヌクレアーゼ部位をコ
ードしている領域において重複している個々の
cDNAフラグメントを調製し得るように、既知の
制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する領域に相
当する配列をもつた合成DNAプライマー配列を
利用して、微生物宿主にとつて異種のポリペプチ
ド、たとえばヒト血清アルブミンをコードしてい
るcDNA配列を調製する方法を提供するものであ
る。この態様によると、前記フラグメントを正確
に切断・連結して、所望のポリペプチドを適切に
コードするDNA配列を調製することができる。特に、本発明はヒト血清アルブミンをコードし
ている下記ヌクレオチド配列からなる実質的に成
る単離されたDNA配列を提供する。

【表】

【表】本発明においては、上記ヌクレオチド配列の均
等物も包含される。さらに、本発明は、形質転換された微生物中で
前記ヌクレオチド配列からなるDNA配列を発現
することができる複製可能な微生物用発現ビヒク
ル、この微生物用発現ビヒクルで形質転換された
微生物、さらに、前記ヌクレオチド配列から実質
的に成るDNAを含むベクターを構築し、このベ
クターで宿主細胞を形質転換し、形質転換された
細胞を培養し、前記ヒト血清アルブミンを回収す
ることからなるヒト血清アルブミンの製造方法も
提供する。［好ましい実施態様の説明］本明細書においては、宿主として用いられる微
生物にとつて異種である代表的なポリペプチドと
してヒト血清アルブミン（HSA）の発現につい
て記載する。同様に、ここでは、英国特許出願公
開第2055382A号に記載されている微生物E.coli
Ｋ−12株294（end Ａ，thi^-，hsr^-，_khsm⁺）を使
用した。この菌株はAmerican Type Culture
CollectionにATCC寄託番号No.31446で寄託され
ている。本発明の最も好ましい実施態様においては、上
記のE.coli Ｋ−12株294だけでなくその他の既
知のE.coli株、たとえばE.coli Ｂ、E.coli ｘ
1776および E.coli Ｗ 3110も含めE.coli、ま
たはその他の微生物株について本発明を説明す
る。これらの菌株の多くは公認の微生物寄託機
関、たとえばAmerican Type Culture
Collection（ATCC）に寄託され、そこから分譲
が可能である（ATCCカタログ参照、さらに西独
特許公開第2644432号公報参照）。これらのその他
の微生物としては、たとえば枯草菌（Bacillus
subtillis）などの桿菌類（Bacilli）、およびその
他の腸内細菌、たとえばねずみチフス菌
（Salmonilla typhimurium）および霊菌
（Serratia marcesans）などを挙げることができ
る。この場合、異種の遺伝子配列をそれぞれの菌
体内で複製し、発現し得るプラスミドを利用す
る。酵母、たとえばSaccharomyces cerevisiae
も、インターフエロンタンパク質をコードしてい
る遺伝子を酵母プロモーターの制御下で発現され
ることによつて該タンパク質を生産するための宿
主微生物として好適に使用することができる
（Hitzemanらによる同時係属中の米国特許出願、
譲受人：ジエネンテツク社ら、出願日：1981年２
月25日、代理人名簿番号：100／43参照。ここで
引用したことによつてその開示内容は本明細書中
に含まれるものとする）。［図面の説明］第１図はプラスミドpHSA1の構造を示してい
る。 (A) １番上の線はヒト血清アルブミンタンパク質
をコードしているmRNAを表わしており、そ
の下は後に詳述するcDNAクローンＦ−47、Ｆ
−61およびＢ−44に含まれる領域を示してい
る。成熟HSA mRNAの最初と最後のアミノ
酸コドンは、円で囲つた１および585でそれぞ
れ示してある。pHSA1の構造中に含まれる制
限エンドヌクレアーゼ部位は垂直の線で示して
ある。この図にはヌクレオチドのおおよその寸
法目盛も示してある。 (B) 完成したプラスミドpHSA1を示す。図Ａの
cDNAクローンから導かれたHSAコード領域
は図Ａに対応させて示してある。選択された制
限部位ならびに末端コドン番号１および585も
図Ａと同様に示した。E.coli trpプロモータ
ー／オペレーター領域は、その転写の方向を示
す矢印で示してある。Ｇ：ＣはオリゴdG：dC
テールを示している。左端のXbaI部位および
開始コドンATGは合成により付加した。
pHSA1のpBR322由来部分のテトラサイクリン
（Tc）およびアンピシリン（Ap）耐性遺伝子
は太線で示してある。第２図は細菌により合成されたHSAの免疫沈
降の結果を示している。アルブミン発現プラスミドpHSA1で形質転換
したE.coli細胞（レーン４および５）または対照
プラスミドpLeIFA25（同じ発現ビヒクル中にイ
ンターフエロンα遺伝子を含有している）で形質
転換したE.coli細胞（レーン２，３および７）を
^３５Ｓ−メチオニン添加培地中で増殖させた。レー
ン２，４および７の試料は、トリプトフアンを含
まないM9培地でtrpプロモーターによる発現を誘
発した。レーン３および５の試料は、trpプロモ
ーターを抑制するためにトリプトフアン含有LB
ブロス中で増殖させた。ここに挙げたSDS−ポリ
アクリルアミドゲルのオートラジオグラフの各試
料レーンは、密度A₅₅₀＝１の細胞0.75mlから免疫
沈降した標識タンパク質を含んでいる。レーン１
および６は放射活性タンパク質標準品（BRL）
を含んでおり、その分子量が左側にキロダルトン
で示してある。細菌によつて合成されたHSA（レ
ーン４）は、68000ダルトンの¹⁴Ｃ−標準牛血清
アルブミン標品と共に移動する。pHSA1の抑制
培養に対して誘発培養で血清アルブミンの生産が
増大していることは、富化培地に対する最少培地
の³⁵Ｓ−メチオニンプール比活性の違いよりも、
プラスミドにコードされているタンパク質の合成
レベルが高いことを示している（データは示され
ていない）。60000ダルトンのシヤープなバンドは
明らかに加工品である。このバンドは誘発
pHSA1および抑制pHSA1の両者ならびに対照形
質転換体でみられ、プレイミユン（preimmune）
（レーン７）および抗−HSA IgG（レーン２〜
５）に結合する。レーン４の47000ダルトンにみ
られる小さいバンドは、明らかにプラスミドコー
ドされているものであり、早めに終了した細菌合
成HSAを表わしているかもしれない。第３図はヒト血清アルブミンのヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を示している。 HSA mRNAの成熟タンパク質コード領域と
３′非翻訳領域のDNA配列は組換えプラスミド
pHSA1から決定し、プレプロペプチドコード領
域および５′非翻訳領域のDNA配列はプラスミド
Ｐ−14から決定した（後述）。予想されたアミノ
酸がこのDNA配列の上に示されており、成熟タ
ンパク質の最初の残基から番号付けしてある。先
行する24個のアミノ酸はプレプロペプチドからな
る。Dayhoff（文献９）およびMoulonら（文献
12）によつて報告されているHSAのタンパク質
配列と一致しない５個のアミノ酸残基には下線を
引いた。上記のヌクレオチド配列は多分、HSA
mRNAの真の5′末端まで伸びていない。アルブ
ミンの直接発現用プラスミドpHSA1においては、
成熟タンパク質コード領域の直前にE.coli trpプ
ロモーター／オペレーターリーダー／ペプチドリ
ボゾーム結合部位（文献36、37）、人工のXbaＩ
部位および人工の開始コドンATGがあり、プレ
プロ領域は切り取られている。pHSA1において
HSAの第１コドンの前のヌクレオチドは5′−
TCACGTAAAAAGGGTATCTAGATGであ
る。［詳細な説明］ (A) cDNAの合成およびクローニングリボヌクレオシド−バナジル錯体法（文献17）
またはグアニジニウムチオシアネート法（文献
18）のいずれかにより、バイオプシー（生検）ま
たは死体から得たヒトの迅速凍結肝臓標本からポ
リ(A)⁺RNAを調製した。cDNAの合成反応は、基
本的に文献19に記載された方法に従い、ホスホト
リエステル法（文献20）により製造したオリゴ−
デオキシヌクレオチドまたはオリゴ（dT）_12-18
（Collaborative Research）のいずれかをプライ
マーとして用いて行なつた。典型的なcDNA合成
反応では、25〜35μｇのポリ(A)⁺RNAと40〜
80pmolのオリゴヌクレチオドプライマーを
50mMのNaCl中で５分間90°に加熱した。この反
応混合物を、最終濃度が20mMトリスHCl（PH
8.3）、20mM KCl、8mM MgCl₂、30mMジチオ
トレイツト、1mMのdATP、dCTP、dGTP、
dTTP（生成物の回収を追跡するために³²Ｐ−
dCTP（Amersham）を加える）となるようにし、
42℃で５分間アニーリングした。100単位の
AMV逆転写酵素（BRL）を加え、42℃で45分間
インキユベートした。２本目のDNA鎖の合成、
S1処理、ポリアクリルアミドゲル上でのサイズ
選択、デオキシ(C)テイリングおよび、PstIにより
開裂されデオキシ（Ｇ）テイリングされた
pBR322へのアニーリングは既述の方法（文献
21、22）で行なつた。アニーリングした混合物を
使い、発表されている方法（文献24）に従つてE.
coli Ｋ−12株294（文献23）を形質転換した。 (B) ³²Ｐ−標識プローブを用いた組換えプラスミ
ドのスクリーニング E.coli形質転換体を5μｇ／mlのテトラサイクリ
ン含有LB寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロ
ースフイルターペーパー（Schleicher and
Schuell，BA85）に移し、in situコロニースク
リーニング法（文献25）の改良法を使用するハイ
ブリダイゼーシヨンによつて試験した。ヌクレオ
チド12〜16個の長さを有する³²Ｐ−末端標識（文
献26）オリゴデオキシヌクレオチドフラグメント
を直接ハイブリダイゼーシヨンプローブとして用
いた。あるいは、オリゴ（dT）またはオリゴデ
オキシヌクレオチドプライマーを用いてRNAか
ら³²Ｐ−cDNAプローブを合成した（文献19）。
フイルターを５×Denhardt′s溶液（文献27）、５
×SSC（１×SSC＝1.5M NaCl、0.15Mクエン酸
ナトリウム）、50mM燐酸ナトリウム（PH6.8）、
20μｇ／mlサケ精子DNA中、4°〜42°の温度で１
夜ハイブリダイズさせ、³²Ｐ−標識プローブの長
さに応じて4°〜42°の温度で、１〜0.2×SSCの濃
度の塩（0.1％SDS含有）中で洗浄した（文献
28）。DuPont Lightning−Plus増強スクリーンを
用い、乾燥したフイルターをＸ線フイルム（コダ
ツクXR−２）に−80°で感光させた。 (C) DNAの調製および制限酵素分析プラスミドDNAを大量スケール（文献29）ま
たは少量スケール（miniprep、文献30）で調製
し、制限酵素（New England Biolabs，BRL）
で開裂した。スラブゲル電気泳動条件およびゲル
からのDNAフラグメントの電気溶出については
文献31に記載されている。 (D) DNAの配列決定 DNAの配列決定は、末端標識DNAフラグメン
トを用いてMaxamおよびGilbertの方法（文献
26）と、合成オリゴヌクレオチド（文献20）プラ
イマーを用いてフアージM13mp7）サブクローン
（文献33）からの１本鎖DNAに対するジデオキシ
チエインターミネーシヨン法（文献32）とを両方
共用いて行なつた。各領域は独立して数回配列決
定した。 (E) HSAの直接発現のためのアルブミン遺伝子
の5′末端の構築プラスミドＦ−47の約1200bpのPstIインサート
10μｇ（約16pmol）を水中で５分間煮沸し、
100pmolの³²Ｐ−末端標識5′プライマー
（dATGGATGCACACAAG）と混合した。この
混合物を氷で冷やし、０℃で最終容量を120μ
（6mMトリスHCl（PH7.5）、6mM MgCl₂、60mM
NaCl、0.5mMのdATP、dCTP、dGTP、
dTTP）とした。10単位のDNAポリメラーゼＩ
Klenowフラグメント（Boehringer−
Mannheim）を添加し、この混合物を24℃で５時
間インキユベートした。フエノール／クロロホル
ム抽出の後、生成物をHpaIIで消化し、５％ポリ
アクリルアミドゲル中で電気泳動させ、所望の
450bpフラグメントを電気溶出した。ベクタープラスミドpLeIF A25（文献21）の
XbaI消化によつて生成した１本鎖部分を充填し
てブラント（平滑）DNA末端を生成せしめるた
めに、10μMまでのデオキシヌクレオシドトリホ
スフエートおよび10単位のDNAポリメラーゼＩ
Klenowフラグメントをこの制限エンドヌクレ
アーゼ反応混合物に加え、12°で10分間インキユ
ベートした。制限エンドヌクレアーゼフラグメン
ト（ほぼ等モル、0.1〜1μｇ）をアニーリングし、
20μの50mMトリスHCl（PH7.6）、10mM
MgCl₂、0.1mM EDTA、5mMジオトレイツト、
1mM rATP中、50単位のT₄リガーゼ（N.E.
Biolabs）を用いて12℃で１夜連結した。プラス
ミドの構築についての詳細は後述する。 (F) タンパク質の分析組換えE.coli株の培養物２mlをLBまたはM9培
地（5μg／mlのテトラサイクリン添加）中で密度
A₅₅₀＝1.0まで増殖させ、ペレツト化し、洗浄し、
再びペレツト化し、２mlのLBまたは補足M9（M9
＋0.2％グルコース、1μｇ／mlチアミン、20μｇ／
mlの標準アミノ酸、ただしメチオニンは2μｇ／
mlであり、トリプトフアンは除く）に懸濁した。
各増殖培地は5μｇ／mlのテトラサイクリンおよ
び100μCiの³⁵Ｓ−メチオニン（NEN；1200Ci／
ミリモル）も含んでいた。１時間37℃でインキユ
ベートした後、バクテリアをペレツト化し、凍
結・融解し、200μの50mMトリスHCl（PH7.5）、
0.12mM NaEDTAに再懸濁し、リゾチームを１
mg／mlまで、NP40を0.2％まで、NaClを0.35M
まで添加してから10分間氷の上に置いた。溶菌物
（lysate）を20mM MgCl₂に調節し、50μｇ／ml
のDNase Ｉ（Worthington）と共に氷上で30分
間インキユベートした。おだやかに遠心分離して
不溶性物質を除去した。試料を、文献34に記載さ
れているようにして、家兎抗−HSA（Cappel
Labs）およびぶどう状球菌性アブソーベント
（Pansorbin；Cal Biochem）で免疫沈降させ、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（文献35）
にかけた。（Ｇ） cDNAクローニングオリゴ（dT）をプライマーとして用いて得ら
れた最初のcDNAクローンをコロニーハイブリダ
イゼーシヨンによつてクリーニングした。そのた
めに、肝臓の全cDNA（豊富なRNA種を含有する
クローンを同定するため）と、HSAのアミノ酸
546〜549および294〜297をコードする可能な配列
変化を表わすように合成された４種の11塩基から
なるオリゴデオキシヌクレオチドを２組プライマ
ーとして用いて肝臓のmRNAから得られた２個
の32P標準cDNAとを使用した。陽性コロニーの
中には、期待されたHSA mRNA配列のタンパ
ク質コード領域の３′側を1/2以上含有するものが
なかつた。（これらの組換え体の最大のものをＢ
−44と命名した。）現在の方法では期待するサイ
ズ（約2000bp）のmRNAを直接コピーすること
ができないので、Ｂ−44の5′末端近くの領域のア
ンチメツセージ（非コード）鎖に相当する合成オ
リゴデオキシヌクレオチドを製造した。Ｂ−44の
ヌクレオチド配列から、アミノ酸369〜373に相当
する12塩基のオリゴデキシヌクレオチドを構築し
た。これをプライマーとして使用して、肝臓
mRNAのcDNAを合成し、Ｂ−44組換え体と重
複しているがHSAメツセージの5′部分を含んで
いるcDNAクローンをpBR322中で生成した。得
られた約400個のクローンを、既に決定されてい
たmRNA配列中で僅か上流に位置する16塩基の
オリゴデオキシヌクレオチドフラグメントとのコ
ロニーハイブリダイゼーシヨンによつてスクリー
ニングした。約40％のコロニーが両プローブとハ
イブリダイズした。ハイブリダイズするプラスミ
ドを含有していなかつたコロニーの多くは、自身
をプライマーとして生じたRNAか、または逆転
写の間に夾雑オリゴ（dT）をプライマーとして
生じたRNAに由来するものか、あるいはスクリ
ーニングに使用した配列を含んでいる３′領域を
失つたものであると考えられる。ハイブリダイズ
するコロニーから得た少量（miniprep）のプラ
スミドDNAをPstIで消化した。３個の組換えプ
ラスミドが、HSAメツセンジの残りの5′部分を
コードするのに十分大きいインサートを含んでい
た。これらのうちの２つ（Ｆ−15およびＦ−47）
は、遺伝子の5′末端コード部分を含んでいたが、
Ｂ−44と結合させて完全なアルブミン遺伝子を再
形成させるのに必要なPstI部位までは延びていな
かつた。組換え体Ｆ−61はこのPstI部位をもつて
いたが５′末端が欠けていた。この部分的長さの
クローンＦ−47、Ｆ−61およびＢ−44に共通する
制限エンドヌクレアーゼ部位を使つて、全メツセ
ンジ配列をこれら３つの部分から再構築すること
ができた（第１図参照）。さらに5′方向にのびるもう１つのcDNAクロー
ンは、同様のオリゴデオキシヌクレオチド（アミ
ノ酸コドン番号175〜179に相当するプライマー）
を用いたcDNA合成によつて得た。このcDNAク
ローン（Ｐ−14）は成熟HSA発現プラスミドの
構築には使用しなかつたが、これによつてHSA
mRNAの「プレプロ」ペプチドコード領域と
5′非コード領域のDNA配列を決定することがで
きた。得られた成熟HSA mRNA配列を、trpプロモ
ーター／オペレーターによつてＥ．coli中で成熟
タンパク質を直接発現させるためのベクタープラ
スミドに結合した。プラスミドpLeIFA25はヒト
の白血球インターフエロンＡ（IFNα2）の発現を
指令する（文献21）。このプラスミドをXbaIで消
化し、その開裂部位を、DNAポリメラーゼＩ
Klenowフラグメントとデオキシヌクレオシドト
リホスフエートを用いて充填してブラントDNA
末端を形成させた。次いでPstＩで消化した後、
Ｅ．coli trpプロモーター、オペレーターおよ
び人工的にブラント末端にしたXbaＩ開裂部位を
末端にもつtrpリーダーペプチドのリボゾーム結
合部位の300bpフラグメントおよびpBR322配列
を含んでいる「ベクター」フラグメントをゲルで
精製した。クローンＦ−47のDNA配列分析によ
り決定したHSAの最初の４個のアミノ酸をコー
ドしている12個のヌクレオチドとその直前の開始
コドンATGを含むように、15個の塩基からなる
オリゴデオキシヌクレオシドを設計した。「プラ
イマー修復」と呼ばれる操作で、Ｆ−47のPstＩ
フラグメントを含有している遺伝子を変性し、過
剰の15−mer（15量体）とアニーリングし、DNA
ポリメラーゼＩ Klenowフラグメントおよびデ
オキシヌクレオシドトリホスフエートと反応させ
た。この反応で、アニーリングしたオリゴヌクレ
オチドの下流に新しい第２の鎖が延び、コドン番
号１の上流の１本鎖DNAが減成（分解）し、次
いで上流でATGに相補的な３個のヌクレオチド
が補足される。さらに、この生成物を、上で調製
したベクターフラグメントにブラント末端で連結
させると、その初めのアデノシン残基がXbaＩ制
限部位を再生する。この「プライマー修復」反応
に続いて、このDNAをHpaIIで消化し、成熟ア
ルブミン遺伝子の5′部分を含有している450bpフ
ラグメントをゲルで精製した（第１図参照）。こ
のフラグメントをアニーリングし、ベクターフラ
グメントおよびゲル単離したＦ−47のHpaII−
PstＩ部分に連結し、Ｅ．coli細胞の形質転換に
使用した。少量の（minipreps）プラスミドを検
査のために制限エンドヌクレアーゼで消化した結
果、trpプロモーター／オペレーターに正確に連
結された成熟アルブミンコード領域の5′部分を含
有している組換え体Ａ−26が確認された。組立の
最終段階として、Ａ−26プラスミドをBglIIと
PatIで消化し、約4kbフラグメントをゲルで精製
した。これをアニーリングして、Ｆ−61から精製
した390bpのPstI／BglII部分消化フラグメントお
よびＢ−44の1000bp PstIフラグメントに連結し
た。得られた形質転換体を制限エンドヌクレアー
ゼで分析した結果、成熟タンパク質を直接発現す
るように適切に配置された全HSAコード配列を
含有するプラスミドが確認された。このような組
換え体プラスミドの１つをpHSA1と命名した。
pHSA1を含有するＥ．coliをトリプトフアンを
含んでいない最少培地で増殖させると、HSA抗
体と特異的に反応し、SDSポリアクリルアミド電
気泳動でHSAと共に移動するタンパク質が産生
する（第２図参照。同じ組換え体を富化プロス中
で増殖させるとこのようなタンパク質は産生しな
い。このことは、Ｅ．coli中での推定HSAタン
パク質の産生が、設計したとおりtrpプロモータ
ー／オペレーターの制御下で行われることを示し
ている。組換えプラスミドにおけるHSA構造遺
伝子の完全性を確かめるために、pHSA1をDNA
配列分析にかけた。（Ｈ） DNA配列分析 MaxamおよびGilbertの化学的分解法（文献
26）と、１本鎖M13mP7フアージ誘導体から誘
導された鋳型を用いたジデオキシチエインターミ
ネーシヨン法（文献32，33）とにより、pHSA1
のアルブミンcDNA部分（およびその周辺領域）
を完全に配列決定した。全てのヌクレオチドは少
なくとも２回配列決定した。このDNA配列を
HSAタンパク質の推定アミノ酸配列と共に第３
図に示してある。成熟HSAコード領域より5′側
のDNA配列もcDNAクローンＰ−14から決定し、
第３図に示してある。 DNA配列分析の結果、人工の開始コドンおよ
び完全な成熟HSAコード配列が所望通りＥ．
coli trpプロモーター／オペレーターのすぐ後
に続いていることが確認された。このATGイニ
シエーターは、trpリーダーペプチド（文献37）
の推定Ｅ．coliリボゾーム結合配列（文献36）か
らヌクレオチド９個分だけ後にある。 pHSA1のDNA配列の翻訳により、585個のア
ミノ酸からなる成熟HSAタンパク質が予想され
る。種々報告されているHSAタンパク質配列は
約20個のアミノ酸で一致していない。本発明によ
る配列は、Moulonら（文献12）のものと11個の
残基が異なつており、もともとMoulonら（文献
12）の文献とBehrensら（文献10）の報告に基く
と考えられるDayhoffカタログ（文献９）に記載
されているものとは28個の残基が異なつている。
これらの違いのほとんどは、隣接残基の対の逆位
（inversion）であるか、またはグルタミン−グル
タミン酸の不一致である。本発明の配列では、
Dayhoff（文献９）およびMoilonら（文献12）の
両者と異なつているのは585個の残基のうちの５
個だけであり、これらの５個の違いのうち３個は
グルタミンとグルタミン酸が入れ替つたものであ
る（第３図において下線を引いた部分）。全ての
不一致の部分について、ヌクレオチドの配列決定
を注意深く再チエツクした所、DNA配列決定操
作の誤りがこれらの不一致の原因になつていると
は考えられなかつた。cDNAのクローニングで人
工的加工がなされた可能性を除外することはでき
ない。しかし、種々の報告におけるアミノ酸配列
の違いについて他の説明が可能である。それらの
１つは、インビボまたはタンパク質の配列決定中
におけるアミド化の変化（グルタミンとグルタミ
ン酸の識別に影響がある）である（文献38）。
HSAタンパク質の多形性が相違の原因になつて
いるかもしれない。20種以上のHSAの遺伝的変
異体がタンパク質電気泳動（文献39）により検出
されているが、アミノ酸配列レベルでまだ分析さ
れていない。また、本発明で予測されたHSAタ
ンパク質配列は585個のアミノ酸の長さであり、
Moulon（文献12）とは一致するがDayhoff（文献
９）とは一致しないことも注目に値する。この違
いはアミノ酸156〜157におけるPhe−Pheペアの
１個のフエニルアラニン（Phe）残基の欠失（文
献９）によつて説明される。ラツト血清アルブミンcDNAクローン（文献
16）のDNA配列と比較すると、本発明の成熟
HSA配列はヌクレオチドレベルで74％、アミノ
酸レベルで73％ｔが一致（homology）している
（ラツトのSAタンパク質はHSAよりアミノ酸１
個だけ短く、HSAのカルボキシ末端残基がラツ
トタンパク質には存在しない）。両タンパク質に
おいて、35個のシステイン残基は全て同じ位置に
存在している。HSAの予測された「プレプロ」
ペプチド領域は、ラツトcDNAクローン（文献
16）から報告されているものと、76％のヌクレオ
チド、および75％のアミノ酸が一致している。種
間の配列相同性は、比較できる3′非翻訳領域（発
表されているラツトのcDNAクローンはmRNA
の3′末端の前で終了している）の部分では低下し
ている。HSA cDNAは、ポリ(A)付加部位からヌ
クレオチド28個分だけ前にヘキサヌクレオチド
AATAAAを含んでいる。これはProudfootおよ
びBrownleeによつて初めて注目された真核細胞
mRNAに共通の特徴である（文献40）。医薬組成物本発明に係る化合物は、既知の方法に従つて製
剤化して、医薬上有用な組成物を製造することが
できる。すなわち、本発明のポリペプチドを薬学
的に許容し得る担体と配合する。好適な担体およ
びその製剤化法はE.W.MartinのRemington′s
Pharmaceutical Sciencesに記載されている（詳
細は文献を参照されたい）。このような組成物は、
本発明に係る蛋白質の有効量と共に、受容者に有
効に投与するのに適した薬学的に許容し得る組成
物を調製するために適当な量の担体を含んでい
る。１つの好ましい投与方法は非経口投与であ
る。文献１ Rosenoer，Ｖ，M.，Oratz，M.，
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Rijn，P.，Gorin，M.B.，Ingram，R.S.and
Tilghman，S.M.（1981）J.Mol.Biol.256，1960
−1967.

【図面の簡単な説明】

第１図Ａはヒト血清アルブミンをコードしてい
るmRNA、ならびにcDNAクローンＦ−47，Ｆ
−61およびＢ−44に含まれる領域を示す模式図で
ある。第１図ＢはプラスミドpHSA1の模式図で
ある。第２図は細菌により合成されたHSAの免
疫沈降結果を示す図である。第３図はヒト血清ア
ルブミンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
を示す模式図である。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒト血清アルブミンをコードしている下記ヌ
クレオチド配列から実質的に成る単離された
DNA配列。【表】【表】【表】２ヒト血清アルブミンをコードしている下記ヌ
クレオチド配列から実質的になるDNA配列を発
現することができる複製可能な発現ビヒクル。【表】【表】