JP2968052B2 - 微生物によるヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents
微生物によるヒト血清アルブミンの製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトの治療に使用され
るヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を組換えＤＮＡ技術を
使って微生物中で製造する方法に関する。１つの局面に
おいて本発明は、ヒト血清アルブミンまたはその生物学
的に活性な部分をコードしているＤＮＡ配列が有効に発
現するようにプロモーター系と機能可能に結合されてい
る微生物発現ビヒクル（ベクター）の構築方法およびそ
のように構築された発現ビヒクルに係る。もう１つ別の
局面において本発明は、上記発現ビヒクルで形質転換さ
れ、したがって上記のＤＮＡ配列を発現させる微生物に
係る。さらにもう１つ別の局面において本発明は、前記
発現の目的産物を、たとえばヒトの治療に有用な医薬組
成物の如き実用製品に変換する手段と方法に係る。本発
明の好ましい実施態様においては、成熟ヒト血清アルブ
ミンが直接産生されるように適切に配列された特定の発
現ベクターが提供される。
るヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を組換えＤＮＡ技術を
使って微生物中で製造する方法に関する。１つの局面に
おいて本発明は、ヒト血清アルブミンまたはその生物学
的に活性な部分をコードしているＤＮＡ配列が有効に発
現するようにプロモーター系と機能可能に結合されてい
る微生物発現ビヒクル（ベクター）の構築方法およびそ
のように構築された発現ビヒクルに係る。もう１つ別の
局面において本発明は、上記発現ビヒクルで形質転換さ
れ、したがって上記のＤＮＡ配列を発現させる微生物に
係る。さらにもう１つ別の局面において本発明は、前記
発現の目的産物を、たとえばヒトの治療に有用な医薬組
成物の如き実用製品に変換する手段と方法に係る。本発
明の好ましい実施態様においては、成熟ヒト血清アルブ
ミンが直接産生されるように適切に配列された特定の発
現ベクターが提供される。
【０００２】さらに別の一面において本発明は、ポリペ
プチドまたはその生物学的に活性な部分をコードしてい
るｃＤＮＡを調製するための新規な方法に関する。この
局面では、既知のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接す
る、目的とするポリペプチドのｍＲＮＡの１部分に相当
する合成プライマーＤＮＡを利用して、逆転写によっ
て、該ポリペプチドの配列をコードしている一連のＤＮ
Ａフラグメントを得る方法と手段が提供される。これら
のフラグメントは、全体として所望のタンパク質コード
配列を表わすが、個々のフラグメントは重複するＤＮＡ
配列を含んでおり、その重複する配列内に共通のエンド
ヌクレアーゼ制限部位をもっている。このようにするこ
とにより、それぞれのフラグメントを選択的に切断（開
裂）・結合して、所望のポリペプチドをコードしている
全ｃＤＮＡ配列を適切な解読枠内で容易に組立てること
ができる。本発明によって、通常の逆転写酵素法および
／または化学合成によっては得ることができない高分子
量タンパク質のｃＤＮＡを得ることができる。
プチドまたはその生物学的に活性な部分をコードしてい
るｃＤＮＡを調製するための新規な方法に関する。この
局面では、既知のエンドヌクレアーゼ制限部位に隣接す
る、目的とするポリペプチドのｍＲＮＡの１部分に相当
する合成プライマーＤＮＡを利用して、逆転写によっ
て、該ポリペプチドの配列をコードしている一連のＤＮ
Ａフラグメントを得る方法と手段が提供される。これら
のフラグメントは、全体として所望のタンパク質コード
配列を表わすが、個々のフラグメントは重複するＤＮＡ
配列を含んでおり、その重複する配列内に共通のエンド
ヌクレアーゼ制限部位をもっている。このようにするこ
とにより、それぞれのフラグメントを選択的に切断（開
裂）・結合して、所望のポリペプチドをコードしている
全ｃＤＮＡ配列を適切な解読枠内で容易に組立てること
ができる。本発明によって、通常の逆転写酵素法および
／または化学合成によっては得ることができない高分子
量タンパク質のｃＤＮＡを得ることができる。
【０００３】本発明のバックグラウンドを明らかにする
ために、そしてある場合には、実施に関する詳細を提供
するために、参考文献を本明細書の末尾に一括して挙
げ、個々の文献に番号を付して読者の参考に供した。以
下の記載において、（）中の数字は文献番号を表わすも
のとする。
ために、そしてある場合には、実施に関する詳細を提供
するために、参考文献を本明細書の末尾に一括して挙
げ、個々の文献に番号を付して読者の参考に供した。以
下の記載において、（）中の数字は文献番号を表わすも
のとする。
【０００４】
（Ａ）ヒト血清アルブミン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、成人の血清中に存在
する主要なタンパク質である。これは肝臓で生産され、
血流中で正常な浸透圧を維持する役目を果たしており、
また種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっ
ている（文献１、２）。胎児においてはＨＳＡに対応し
てα−フェトプロテインがあり、これらの比較実験が、
ラットの血清アルブミンとα−フェトプロテインの比較
実験と同様に行なわれている（文献３〜８）。ＨＳＡの
完全なタンパク質配列は既に公表されている（文献９〜
１２）。この発表されているＨＳＡのタンパク質配列
は、約２０残基が一致しておらず、成熟タンパク質のア
ミノ酸総数も異なっている［アミノ酸数５８４（文献
９）、５８５（文献１２）］。ある研究によると、ＨＳ
Ａは初め「プレプロ」（ｐｒｅｐｒｏ）配列を含む前駆
体分子として合成される（文献１３、１４）。さらに、
牛（文献１５）とラット（文献１６）の血清アルブミン
の前駆体は配列も決定されている。
する主要なタンパク質である。これは肝臓で生産され、
血流中で正常な浸透圧を維持する役目を果たしており、
また種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっ
ている（文献１、２）。胎児においてはＨＳＡに対応し
てα−フェトプロテインがあり、これらの比較実験が、
ラットの血清アルブミンとα−フェトプロテインの比較
実験と同様に行なわれている（文献３〜８）。ＨＳＡの
完全なタンパク質配列は既に公表されている（文献９〜
１２）。この発表されているＨＳＡのタンパク質配列
は、約２０残基が一致しておらず、成熟タンパク質のア
ミノ酸総数も異なっている［アミノ酸数５８４（文献
９）、５８５（文献１２）］。ある研究によると、ＨＳ
Ａは初め「プレプロ」（ｐｒｅｐｒｏ）配列を含む前駆
体分子として合成される（文献１３、１４）。さらに、
牛（文献１５）とラット（文献１６）の血清アルブミン
の前駆体は配列も決定されている。
【０００５】医療にアルブミンを利用し得る根拠は、血
液量不足（症）、低タンパク血症およびショックを処置
できる点にある。現在アルブミンは、毛細管の細孔を通
過し得ない溶質（コロイド）によって起こる血漿コロイ
ド浸透圧を改善するのに使用されている。アルブミンは
透過率が低いので基本的に血管内に留まっている。細胞
膜をはさむ両側において非拡散性粒子の濃度が異なって
いると、その両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を
通して水が移行する。この浸透現象過程において、アル
ブミンは血中の液体含量を維持する上で重要な働きをす
る。従って、アルブミンを投与する基本的な治療上の意
義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低タン
パク血症の場合のように、血管からの液体の損失がある
ような状態を処置する点に存する。アルブミンはまた、
診断にも利用することができ、他のタンパク質と非特異
的に結合し得る能力を有するが故に種々の診断溶液に使
用することができる。
液量不足（症）、低タンパク血症およびショックを処置
できる点にある。現在アルブミンは、毛細管の細孔を通
過し得ない溶質（コロイド）によって起こる血漿コロイ
ド浸透圧を改善するのに使用されている。アルブミンは
透過率が低いので基本的に血管内に留まっている。細胞
膜をはさむ両側において非拡散性粒子の濃度が異なって
いると、その両側の粒子の濃度が等しくなるまで隔膜を
通して水が移行する。この浸透現象過程において、アル
ブミンは血中の液体含量を維持する上で重要な働きをす
る。従って、アルブミンを投与する基本的な治療上の意
義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低タン
パク血症の場合のように、血管からの液体の損失がある
ような状態を処置する点に存する。アルブミンはまた、
診断にも利用することができ、他のタンパク質と非特異
的に結合し得る能力を有するが故に種々の診断溶液に使
用することができる。
【０００６】現在、ヒト血清アルブミンは全血の分画に
よって生産されており、合理的な価格で多量に得ること
はできない。組換えＤＮＡ技術を応用すると、ヒト血清
アルブミンを効率よく生産するように遺伝子操作した微
生物を使って、該アルブミンを豊富に生産することが可
能になる。本発明は組換えＤＮＡ技術により、従来より
も廉価にかつ多量に、純粋なＨＳＡを生産することを可
能にしたものである。本発明はまた、ヒト血清アルブミ
ンのＤＮＡ配列構造およびそれから演繹されるアミノ酸
配列についての知見を提供するものであり、これはヒト
血清アルブミンおよびそれに関連するタンパク質、たと
えばα−フェトプロテインの進化論的性質、調節作用お
よび機能的性質を解明するのに役立つものである。
よって生産されており、合理的な価格で多量に得ること
はできない。組換えＤＮＡ技術を応用すると、ヒト血清
アルブミンを効率よく生産するように遺伝子操作した微
生物を使って、該アルブミンを豊富に生産することが可
能になる。本発明は組換えＤＮＡ技術により、従来より
も廉価にかつ多量に、純粋なＨＳＡを生産することを可
能にしたものである。本発明はまた、ヒト血清アルブミ
ンのＤＮＡ配列構造およびそれから演繹されるアミノ酸
配列についての知見を提供するものであり、これはヒト
血清アルブミンおよびそれに関連するタンパク質、たと
えばα−フェトプロテインの進化論的性質、調節作用お
よび機能的性質を解明するのに役立つものである。
【０００７】さらに詳細には、本発明によって、ＨＳＡ
ｍＲＮＡのタンパク質コード部分と３’非翻訳部分の
全配列を含むｃＤＮＡクローンが単離される。これらの
ｃＤＮＡクローンを使用して、微生物株中でｔｒｐプロ
モーターの制御下に成熟ＨＳＡタンパク質を発現させる
ための組換え発現ビヒクルを構築した。本発明はまた、
ＨＳＡの完全なヌクレオチド配列（ＤＮＡ配列）および
その推定アミノ酸配列を開示する。
ｍＲＮＡのタンパク質コード部分と３’非翻訳部分の
全配列を含むｃＤＮＡクローンが単離される。これらの
ｃＤＮＡクローンを使用して、微生物株中でｔｒｐプロ
モーターの制御下に成熟ＨＳＡタンパク質を発現させる
ための組換え発現ビヒクルを構築した。本発明はまた、
ＨＳＡの完全なヌクレオチド配列（ＤＮＡ配列）および
その推定アミノ酸配列を開示する。
【０００８】本明細書において、「成熟ヒト血清アルブ
ミン」の発現とは、ヒト血清アルブミンｍＲＮＡの翻訳
直後には付随しているプレ配列（プレプロ）を伴なって
いないヒト血清アルブミンを微生物により生産すること
をいう。本発明によれば、成熟ヒト血清アルブミンは翻
訳開始信号（ＡＴＧ）（これはまた、アルブミンの最初
のアミノ酸に結合しているアミノ酸のメチオニンをコー
ドしている）から直接発現される。このメチオニンは微
生物によって自然に切断され、その結果ヒト血清アルブ
ミンが直接得られる。また、成熟ヒト血清アルブミン
は、通常のリーダー以外のタンパク質と共に発現させる
ことができ、この融合タンパク質部分は細胞内または細
胞外で特異的に切断することができる（英国特許公開第
2007676 Ａ号参照）。最後に、成熟ヒト血清アルブミン
は微生物のシグナルポリペプチドと結合させて生産する
こともでき、このシグナルポリペプチドはその融合体を
細胞壁に輸送し、そこでこのシグナルはプロセッシング
を受けて取り除かれ、成熟ヒト血清アルブミンが分泌さ
れる。
ミン」の発現とは、ヒト血清アルブミンｍＲＮＡの翻訳
直後には付随しているプレ配列（プレプロ）を伴なって
いないヒト血清アルブミンを微生物により生産すること
をいう。本発明によれば、成熟ヒト血清アルブミンは翻
訳開始信号（ＡＴＧ）（これはまた、アルブミンの最初
のアミノ酸に結合しているアミノ酸のメチオニンをコー
ドしている）から直接発現される。このメチオニンは微
生物によって自然に切断され、その結果ヒト血清アルブ
ミンが直接得られる。また、成熟ヒト血清アルブミン
は、通常のリーダー以外のタンパク質と共に発現させる
ことができ、この融合タンパク質部分は細胞内または細
胞外で特異的に切断することができる（英国特許公開第
2007676 Ａ号参照）。最後に、成熟ヒト血清アルブミン
は微生物のシグナルポリペプチドと結合させて生産する
こともでき、このシグナルポリペプチドはその融合体を
細胞壁に輸送し、そこでこのシグナルはプロセッシング
を受けて取り除かれ、成熟ヒト血清アルブミンが分泌さ
れる。
【０００９】（Ｂ）組換えＤＮＡ技術
組換えＤＮＡ技術の出現によって、多種多様な有用ポリ
ペプチドの微生物による調整された生産が可能となっ
た。多くの哺乳動物ポリペプチド、たとえばヒト成長ホ
ルモンやヒトおよびハイブリッド白血球インターフェロ
ンが既に種々の微生物により生産されている。この技術
によって種々の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、種々の薬物を標的に向かわしめる応用
（drug-targeting application）に有用なワクチン、ホ
ルモン、酵素および抗体を微生物に生産させることがで
きるようになった。
ペプチドの微生物による調整された生産が可能となっ
た。多くの哺乳動物ポリペプチド、たとえばヒト成長ホ
ルモンやヒトおよびハイブリッド白血球インターフェロ
ンが既に種々の微生物により生産されている。この技術
によって種々の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、種々の薬物を標的に向かわしめる応用
（drug-targeting application）に有用なワクチン、ホ
ルモン、酵素および抗体を微生物に生産させることがで
きるようになった。
【００１０】組換えＤＮＡ技術の基本的な要素はプラス
ミド、すなわち、細菌中にしばしば細胞当たり複数個存
在する２本鎖ＤＮＡの染色体外ループである。このプラ
スミドＤＮＡにコードされている情報には、このプラス
ミドを娘細胞中で再生するのに必要となる情報（すなわ
ちレプリコンまたは複製起点）および通常、１種または
それ以上の表現型選択特性、たとえば所望のプラスミド
を含有している宿主細胞のクローンを選択培地中で認識
して優先的に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含
まれている。細菌プラスミドを使用することの利点は、
これらが種々の制限エンドヌクレアーゼ、すなわち「制
限酵素」で特異的に開裂することができることであり、
それぞれの制限酵素はプラスミドＤＮＡ上の別々の位置
を認識する。次いで異種の遺伝子または遺伝子フラグメ
ントを、開裂部位またはこれに隣接する改造末端で、端
と端とをつなぎ合せることによりこのプラスミドに挿入
することができる（ここで「異種（外来性）」という用
語は、問題にしている微生物には通常存在しない遺伝子
またはその微生物によって通常は産生されないポリペプ
チド配列を表わすのに使用し、一方、「同種」という用
語は、対応する野性株の微生物中に存在する遺伝子、あ
るいはそれによって産生されるポリペプチドを表わすの
に使用するものとする）。このようにして、いわゆる複
製可能な発現ビヒクルが形成される。
ミド、すなわち、細菌中にしばしば細胞当たり複数個存
在する２本鎖ＤＮＡの染色体外ループである。このプラ
スミドＤＮＡにコードされている情報には、このプラス
ミドを娘細胞中で再生するのに必要となる情報（すなわ
ちレプリコンまたは複製起点）および通常、１種または
それ以上の表現型選択特性、たとえば所望のプラスミド
を含有している宿主細胞のクローンを選択培地中で認識
して優先的に成長させるのに役立つ抗生物質耐性、が含
まれている。細菌プラスミドを使用することの利点は、
これらが種々の制限エンドヌクレアーゼ、すなわち「制
限酵素」で特異的に開裂することができることであり、
それぞれの制限酵素はプラスミドＤＮＡ上の別々の位置
を認識する。次いで異種の遺伝子または遺伝子フラグメ
ントを、開裂部位またはこれに隣接する改造末端で、端
と端とをつなぎ合せることによりこのプラスミドに挿入
することができる（ここで「異種（外来性）」という用
語は、問題にしている微生物には通常存在しない遺伝子
またはその微生物によって通常は産生されないポリペプ
チド配列を表わすのに使用し、一方、「同種」という用
語は、対応する野性株の微生物中に存在する遺伝子、あ
るいはそれによって産生されるポリペプチドを表わすの
に使用するものとする）。このようにして、いわゆる複
製可能な発現ビヒクルが形成される。
【００１１】ＤＮＡの組換えは微生物の外で行ない、得
られた複製可能な「組換え」発現ビヒクル（またはプラ
スミド）は、形質転換として知られている工程によって
微生物に挿入することができ、そしてこの形質転換体を
増殖させることによって異種遺伝子をもった組換えビヒ
クルを多量に得ることができる。さらに、プラスミド中
でコードされているＤＮＡの情報の転写と翻訳を支配し
ている部分に関して適切な位置にこの遺伝子を挿入する
と、得られる発現ビヒクルは、その挿入された遺伝子が
コードしているポリペプチド配列を実際に生産するのに
使用することができる。この過程を発現という。
られた複製可能な「組換え」発現ビヒクル（またはプラ
スミド）は、形質転換として知られている工程によって
微生物に挿入することができ、そしてこの形質転換体を
増殖させることによって異種遺伝子をもった組換えビヒ
クルを多量に得ることができる。さらに、プラスミド中
でコードされているＤＮＡの情報の転写と翻訳を支配し
ている部分に関して適切な位置にこの遺伝子を挿入する
と、得られる発現ビヒクルは、その挿入された遺伝子が
コードしているポリペプチド配列を実際に生産するのに
使用することができる。この過程を発現という。
【００１２】発現はプロモーターとして知られているＤ
ＮＡ領域で始まる。発現の転写段階ではＤＮＡが巻きも
どされ、ＤＮＡの意味のあるコード鎖が、全ＤＮＡ配列
の５′末端から３′末端へ向かってメッセンジャーＲＮ
Ａが合成されるときの鋳型として露出される。次にメッ
センジャーＲＮＡがリボゾームに結合し、ここでこのメ
ッセンジャーＲＮＡはＤＮＡがコードしているアミノ酸
配列をもったポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸
は３個のヌクレオチド、すなわち「コドン」によってコ
ードされている。このコドンは全体で「構造遺伝子」、
すなわちＤＮＡ配列の中で発現されるポリペプチド産物
のアミノ酸配列をコードしている部分を構成している。
ＮＡ領域で始まる。発現の転写段階ではＤＮＡが巻きも
どされ、ＤＮＡの意味のあるコード鎖が、全ＤＮＡ配列
の５′末端から３′末端へ向かってメッセンジャーＲＮ
Ａが合成されるときの鋳型として露出される。次にメッ
センジャーＲＮＡがリボゾームに結合し、ここでこのメ
ッセンジャーＲＮＡはＤＮＡがコードしているアミノ酸
配列をもったポリペプチド鎖に翻訳される。各アミノ酸
は３個のヌクレオチド、すなわち「コドン」によってコ
ードされている。このコドンは全体で「構造遺伝子」、
すなわちＤＮＡ配列の中で発現されるポリペプチド産物
のアミノ酸配列をコードしている部分を構成している。
【００１３】翻訳は「開始」信号（通常はＡＴＧ、これ
は得られるメッセンジャーＲＮＡではＡＵＧとなる）で
始まる。いわゆる停止コドン−これは構造遺伝子の最
後に転写される−は翻訳の終了、従ってそれ以上のア
ミノ酸単位の生産の停止を指令する。生成した産物は、
宿主細胞を溶解し、適当な方法で他のタンパク質から精
製・単離することにより回収することができる。
は得られるメッセンジャーＲＮＡではＡＵＧとなる）で
始まる。いわゆる停止コドン−これは構造遺伝子の最
後に転写される−は翻訳の終了、従ってそれ以上のア
ミノ酸単位の生産の停止を指令する。生成した産物は、
宿主細胞を溶解し、適当な方法で他のタンパク質から精
製・単離することにより回収することができる。
【００１４】実際、組換えＤＮＡ技術を使うと、全体が
異種のポリペプチドを発現させることができ（いわゆる
直接発現）、あるいはまた同種ポリペプチドのアミノ酸
配列の一部と融合した異種ポリペプチドを発現させるこ
ともできる。後者の場合、所望の生物活性産物は、細胞
外の環境で開裂されるまで、この融合した同種／異種ポ
リペプチドの中で不活性化されている（Wetzel, Americ
an Scientist, 6 8, 664 （1980）参照）。
異種のポリペプチドを発現させることができ（いわゆる
直接発現）、あるいはまた同種ポリペプチドのアミノ酸
配列の一部と融合した異種ポリペプチドを発現させるこ
ともできる。後者の場合、所望の生物活性産物は、細胞
外の環境で開裂されるまで、この融合した同種／異種ポ
リペプチドの中で不活性化されている（Wetzel, Americ
an Scientist, 6 8, 664 （1980）参照）。
【００１５】組換えＤＮＡ技術が完全にその期待を裏切
らないものであるとしても、所望のポリペプチド産物が
コントロールされた環境のもとで、しかも高収率で得ら
れるように、挿入された遺伝子の発現が最適となるよう
な系を工夫しなければならない。
らないものであるとしても、所望のポリペプチド産物が
コントロールされた環境のもとで、しかも高収率で得ら
れるように、挿入された遺伝子の発現が最適となるよう
な系を工夫しなければならない。
【００１６】（Ｃ）技術の現況
Sargent らは、一連の組換えＤＮＡプラスミドとして、
ラット血清アルブミンのメッセンジャーＲＮＡのクロー
ニングについて記載している（Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A), 78, 243 (1981)参照）。これはこのタンパク質産物
の進化仮説を研究するために、クローンのヌクレオチド
配列を決定しようとして行なわれた。すなわち、彼等は
調製したｃＤＮＡフラグメントを組立ててみるようなこ
とはしなかったのである。
ラット血清アルブミンのメッセンジャーＲＮＡのクロー
ニングについて記載している（Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A), 78, 243 (1981)参照）。これはこのタンパク質産物
の進化仮説を研究するために、クローンのヌクレオチド
配列を決定しようとして行なわれた。すなわち、彼等は
調製したｃＤＮＡフラグメントを組立ててみるようなこ
とはしなかったのである。
【００１７】一方、Dugaiczyk らはヒト血清アルブミン
のヒト遺伝子についての研究を要約して発表している
（Journal of Supramolecular Structure and Cellular
Biochemistry. Supplement 5, 1981, Alan R. Liss, I
nc. NY. 参照）。彼等はｃＤＮＡフラグメントを得た
が、α−フェトプロテインおよび血清アルブミン遺伝子
の基礎的な分子生物学を研究する目的以外には、このフ
ラグメントをクローニングしたり生産したりした形跡が
ない。
のヒト遺伝子についての研究を要約して発表している
（Journal of Supramolecular Structure and Cellular
Biochemistry. Supplement 5, 1981, Alan R. Liss, I
nc. NY. 参照）。彼等はｃＤＮＡフラグメントを得た
が、α−フェトプロテインおよび血清アルブミン遺伝子
の基礎的な分子生物学を研究する目的以外には、このフ
ラグメントをクローニングしたり生産したりした形跡が
ない。
【００１８】
【発明の概要】本発明は、組換えＤＮＡ技術を使ってヒ
ト血清アルブミンを直接形態で好都合に効率よく生産す
ることができることを見い出した事実に基くものであ
る。この生産物は、アルブミンの補給が必要な場合のヒ
トの治療に使用するのに好適である。この生産物は遺伝
子操作をほどこした微生物によって生産されるので、現
在の血液の分画技術による生産よりもずっと効率よくＨ
ＳＡを製造し、単離することが可能である。本発明の重
要性は、約２０００塩基以上のｍＲＮＡ転写体に相当す
る非常に長いタンパク質−アミノ酸５８４個−を生
産するように微生物を遺伝子操作することに成功した点
にある。
ト血清アルブミンを直接形態で好都合に効率よく生産す
ることができることを見い出した事実に基くものであ
る。この生産物は、アルブミンの補給が必要な場合のヒ
トの治療に使用するのに好適である。この生産物は遺伝
子操作をほどこした微生物によって生産されるので、現
在の血液の分画技術による生産よりもずっと効率よくＨ
ＳＡを製造し、単離することが可能である。本発明の重
要性は、約２０００塩基以上のｍＲＮＡ転写体に相当す
る非常に長いタンパク質−アミノ酸５８４個−を生
産するように微生物を遺伝子操作することに成功した点
にある。
【００１９】本発明の目的は上記のようにして生産され
るヒト血清アルブミンならびにその生産の手段および方
法を提供することにある。さらに本発明の目的は、直接
発現できる形態でＨＳＡをコードしている遺伝子配列を
有する複製可能なＤＮＡ発現ビヒクルを提供することに
ある。さらに本発明のもう１つの目的は、上記の発現ビ
ヒクルで形質転換した微生物株およびＨＳＡを産生する
ことができる該形質転換株の微生物培養物を提供するこ
とにある。また、本発明は、上記のＨＳＡ遺伝子配列、
ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物株および培養物を調製する
のに有用な種々の方法、ならびにその特定具体例を提供
する。さらに本発明は、別の態様において、共通の制限
エンドヌクレアーゼ部位をコードしている領域において
重複している個々のｃＤＮＡフラグメントを調製し得る
ように、既知の制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する
領域に相当する配列をもった合成ＤＮＡプライマー配列
を利用して、微生物宿主にとって異種のポリペプチド、
たとえばヒト血清アルブミンをコードしているｃＤＮＡ
配列を調製する方法を提供するものである。この態様に
よると、前記フラグメントを正確に切断・連結して、所
望のポリペプチドを適切にコードするＤＮＡ配列を調製
することができる。
るヒト血清アルブミンならびにその生産の手段および方
法を提供することにある。さらに本発明の目的は、直接
発現できる形態でＨＳＡをコードしている遺伝子配列を
有する複製可能なＤＮＡ発現ビヒクルを提供することに
ある。さらに本発明のもう１つの目的は、上記の発現ビ
ヒクルで形質転換した微生物株およびＨＳＡを産生する
ことができる該形質転換株の微生物培養物を提供するこ
とにある。また、本発明は、上記のＨＳＡ遺伝子配列、
ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物株および培養物を調製する
のに有用な種々の方法、ならびにその特定具体例を提供
する。さらに本発明は、別の態様において、共通の制限
エンドヌクレアーゼ部位をコードしている領域において
重複している個々のｃＤＮＡフラグメントを調製し得る
ように、既知の制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する
領域に相当する配列をもった合成ＤＮＡプライマー配列
を利用して、微生物宿主にとって異種のポリペプチド、
たとえばヒト血清アルブミンをコードしているｃＤＮＡ
配列を調製する方法を提供するものである。この態様に
よると、前記フラグメントを正確に切断・連結して、所
望のポリペプチドを適切にコードするＤＮＡ配列を調製
することができる。
【００２０】特に、本発明はヒト血清アルブミンをコー
ドしている下記ヌクレオチド配列から実質的に成る単離
されたＤＮＡ配列を提供する。
ドしている下記ヌクレオチド配列から実質的に成る単離
されたＤＮＡ配列を提供する。
【００２１】
GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA GAA GAA AAT
TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT CAG CAG TGT CCA TTT
GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA
GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC
AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC
TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC
AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT
TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA
AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA
GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA
AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC
AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG
GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA
GTG ACA GAT CTT ACC AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA
TGT GCT GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG
ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC CAC
TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT TCA TTA GCT
GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT
GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT
GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC
TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA
CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG
CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA
GTA CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA
GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA
GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG AAA ACG CCA
GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA
TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT
GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA
ATC AAG AAA CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA
AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC
TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT GTT
GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA 。
【００２２】本発明においては、上記ヌクレオチド配列
の均等物、即ち上記ヌクレオチド配列にヌクレオチド又
はヌクレオチド配列の置換、欠失又は付加を含有するヌ
クレオチド配列であって、上記ヌクレオチド配列によっ
てコードされる生物活性と同じ生物活性を有するポリペ
プチドをコードする当該ヌクレオチド配列も包含され
る。
の均等物、即ち上記ヌクレオチド配列にヌクレオチド又
はヌクレオチド配列の置換、欠失又は付加を含有するヌ
クレオチド配列であって、上記ヌクレオチド配列によっ
てコードされる生物活性と同じ生物活性を有するポリペ
プチドをコードする当該ヌクレオチド配列も包含され
る。
【００２３】さらに、本発明は、形質転換された微生物
中で前記ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列を発現す
ることができる複製可能な微生物用発現ビヒクル、この
微生物用発現ビヒクルで形質転換された微生物、さら
に、前記ヌクレオチド配列から実質的に成るＤＮＡを含
むベクターを構築し、このベクターで宿主細胞を形質転
換し、形質転換された細胞を培養し、前記ヒト血清アル
ブミンを回収することからなるヒト血清アルブミンの製
造方法も提供する。
中で前記ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列を発現す
ることができる複製可能な微生物用発現ビヒクル、この
微生物用発現ビヒクルで形質転換された微生物、さら
に、前記ヌクレオチド配列から実質的に成るＤＮＡを含
むベクターを構築し、このベクターで宿主細胞を形質転
換し、形質転換された細胞を培養し、前記ヒト血清アル
ブミンを回収することからなるヒト血清アルブミンの製
造方法も提供する。
【００２４】
【好ましい実施態様の説明】本明細書においては、宿主
として用いられる微生物にとって異種である代表的なポ
リペプチドとしてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の発現
について記載する。同様に、ここでは、英国特許出願公
開第2055382 Ａ号に記載されている微生物Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株２９４（end Ａ，ｔｈｉ- ，ｈｓｒ- ， k
ｈｓｍ+ ）を使用した。この菌株はAmerican Type Cult
ure CollectionにＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．31446 で寄託
されている。
として用いられる微生物にとって異種である代表的なポ
リペプチドとしてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の発現
について記載する。同様に、ここでは、英国特許出願公
開第2055382 Ａ号に記載されている微生物Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株２９４（end Ａ，ｔｈｉ- ，ｈｓｒ- ， k
ｈｓｍ+ ）を使用した。この菌株はAmerican Type Cult
ure CollectionにＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．31446 で寄託
されている。
【００２５】本発明の最も好ましい実施態様において
は、上記のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株２９４だけでなく
その他の既知のＥ．ｃｏ ｌｉ株、たとえばＥ．ｃｏｌｉ
Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ χ １７７６および Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｗ ３１１０も含めたＥ．ｃｏｌｉ、またはその他
の微生物株について本発明を説明する。これらの菌株の
多くは公認の微生物寄託機関、たとえば American Type
Culture Collection （ATCC）に寄託され、そこから分
譲が可能である（ＡＴＣＣカタログ参照、さらに西独特
許公開第２６４４４３２号公報参照）。これらのその他
の微生物としては、たとえば枯草菌（Bacillus subtili
s ）などの桿菌類（Bacilli ）、およびその他の腸内細
菌、たとえばねずみチフス菌（Salmonella typhimuriu
m）および霊菌（Serratia marcesans）などを挙げるこ
とができる。この場合、異種の遺伝子配列をそれぞれの
菌体内で複製し、発現し得るプラスミドを利用する。酵
母、たとえば Saccharomyces cerevisiae も、インター
フェロンタンパク質をコードしている遺伝子を酵母プロ
モーターの制御下で発現させることによって該タンパク
質を生産するための宿主微生物として好適に使用するこ
とができる（Hitzemanらによる同時係属中の米国特許出
願、譲受人：ジェネンテック社ら、出願日：1981年２月
２５日、代理人名簿番号：１００／４３参照。ここで引
用したことによってその開示内容は本明細書中に含まれ
るものとする）。
は、上記のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株２９４だけでなく
その他の既知のＥ．ｃｏ ｌｉ株、たとえばＥ．ｃｏｌｉ
Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ χ １７７６および Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｗ ３１１０も含めたＥ．ｃｏｌｉ、またはその他
の微生物株について本発明を説明する。これらの菌株の
多くは公認の微生物寄託機関、たとえば American Type
Culture Collection （ATCC）に寄託され、そこから分
譲が可能である（ＡＴＣＣカタログ参照、さらに西独特
許公開第２６４４４３２号公報参照）。これらのその他
の微生物としては、たとえば枯草菌（Bacillus subtili
s ）などの桿菌類（Bacilli ）、およびその他の腸内細
菌、たとえばねずみチフス菌（Salmonella typhimuriu
m）および霊菌（Serratia marcesans）などを挙げるこ
とができる。この場合、異種の遺伝子配列をそれぞれの
菌体内で複製し、発現し得るプラスミドを利用する。酵
母、たとえば Saccharomyces cerevisiae も、インター
フェロンタンパク質をコードしている遺伝子を酵母プロ
モーターの制御下で発現させることによって該タンパク
質を生産するための宿主微生物として好適に使用するこ
とができる（Hitzemanらによる同時係属中の米国特許出
願、譲受人：ジェネンテック社ら、出願日：1981年２月
２５日、代理人名簿番号：１００／４３参照。ここで引
用したことによってその開示内容は本明細書中に含まれ
るものとする）。
【００２６】
【図面の説明】第１図はプラスミドｐＨＳＡ１の構造を
示している。
示している。
【００２７】（Ａ） １番上の線はヒト血清アルブミン
タンパク質をコードしているｍＲＮＡを表わしており、
その下は後に詳述するｃＤＮＡクローンＦ−４７、Ｆ−
６１およびＢ−４４に含まれる領域を示している。成熟
ＨＳＡ ｍＲＮＡの最初と最後のアミノ酸コドンは、円
で囲った１および５８５でそれぞれ示してある。ｐＨＳ
Ａ１の構造中に含まれる制限エンドヌクレアーゼ部位は
垂直の線で示してある。この図にはヌクレオチドのおお
よその寸法目盛も示してある。
タンパク質をコードしているｍＲＮＡを表わしており、
その下は後に詳述するｃＤＮＡクローンＦ−４７、Ｆ−
６１およびＢ−４４に含まれる領域を示している。成熟
ＨＳＡ ｍＲＮＡの最初と最後のアミノ酸コドンは、円
で囲った１および５８５でそれぞれ示してある。ｐＨＳ
Ａ１の構造中に含まれる制限エンドヌクレアーゼ部位は
垂直の線で示してある。この図にはヌクレオチドのおお
よその寸法目盛も示してある。
【００２８】（Ｂ） 完成したプラスミドｐＨＳＡ１を
示す。図（Ａ）のｃＤＡＮクローンから導かれたＨＳＡ
コード領域は図（Ａ）に対応させて示してある。選択さ
れた制限部位ならびに末端コドン番号１および５８５も
図（Ａ）と同様に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモ
ーター／オペレーター領域は、その転写の方向を示す矢
印で示してある。Ｇ：ＣはオリゴｄＧ：ｄＣテールを示
している。左端のＸｂａＩ部位および開始コドンＡＴＧ
は合成により付加した。ｐＨＳＡ１のｐＢＲ３２２由来
部分のテトラサイクリン（Ｔｃ）およびアンピシリン
（Ａｐ）耐性遺伝子は太線で示してある。
示す。図（Ａ）のｃＤＡＮクローンから導かれたＨＳＡ
コード領域は図（Ａ）に対応させて示してある。選択さ
れた制限部位ならびに末端コドン番号１および５８５も
図（Ａ）と同様に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモ
ーター／オペレーター領域は、その転写の方向を示す矢
印で示してある。Ｇ：ＣはオリゴｄＧ：ｄＣテールを示
している。左端のＸｂａＩ部位および開始コドンＡＴＧ
は合成により付加した。ｐＨＳＡ１のｐＢＲ３２２由来
部分のテトラサイクリン（Ｔｃ）およびアンピシリン
（Ａｐ）耐性遺伝子は太線で示してある。
【００２９】第２図は細菌により合成されたＨＳＡの免
疫沈降の結果を示している。
疫沈降の結果を示している。
【００３０】アルブミン発現プラスミドｐＨＳＡ１で形
質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞（レーン４および５）また
は対照プラスミドｐＬｅＩＦＡ２５（同じ発現ビヒクル
中にインターフェロンα遺伝子を含有している）で形質
転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞（レーン２、３および７）を
35Ｓ−メチオニン添加培地中で増殖させた。レーン２、
４および７の試料は、トリプトファンを含まないＭ９培
地でｔｒｐプロモーターによる発現を誘発した。レーン
３および５の試料は、ｔｒｐプロモーターを抑制するた
めにトリプトファン含有ＬＢブロス中で増殖させた。こ
こに挙げたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラ
ジオグラフの各試料レーンは、密度Ａ550 ＝１の細胞
０．７５mlから免疫沈降した標識タンパク質を含んでい
る。レーン１および６は放射活性タンパク質標準品（Ｂ
ＲＬ）を含んでおり、その分子量が左側にキロダルトン
で示してある。細菌によって合成されたＨＳＡ（レーン
４）は、68,000ダルトンの14Ｃ−標準牛血清アルブミン
標品と共に移動する。ｐＨＳＡ１の抑制培養に対して誘
発培養で血清アルブミンの生産が増大していることは、
富化培地に対する最少培地の35Ｓ−メチオニンプール比
活性の違いよりも、プラスミドにコードされているタン
パク質の合成レベルが高いことを示している（データは
示されていない）。60,000ダルトンのシャープなバンド
は明らかに加工品である。このバンドは誘発ｐＨＳＡ１
および抑制ｐＨＳＡ１の両者ならびに対照形質転換体で
みられ、プレイミュン（preimmune ）（レーン７）およ
び抗−ＨＳＡ ＩｇＧ（レーン２〜５）に結合する。レ
ーン４の47,000ダルトンにみられる小さいバンドは、明
らかにプラスミドにコードされているものであり、早め
に終了した細菌合成ＨＳＡを表わしているかもしれな
い。
質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞（レーン４および５）また
は対照プラスミドｐＬｅＩＦＡ２５（同じ発現ビヒクル
中にインターフェロンα遺伝子を含有している）で形質
転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞（レーン２、３および７）を
35Ｓ−メチオニン添加培地中で増殖させた。レーン２、
４および７の試料は、トリプトファンを含まないＭ９培
地でｔｒｐプロモーターによる発現を誘発した。レーン
３および５の試料は、ｔｒｐプロモーターを抑制するた
めにトリプトファン含有ＬＢブロス中で増殖させた。こ
こに挙げたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラ
ジオグラフの各試料レーンは、密度Ａ550 ＝１の細胞
０．７５mlから免疫沈降した標識タンパク質を含んでい
る。レーン１および６は放射活性タンパク質標準品（Ｂ
ＲＬ）を含んでおり、その分子量が左側にキロダルトン
で示してある。細菌によって合成されたＨＳＡ（レーン
４）は、68,000ダルトンの14Ｃ−標準牛血清アルブミン
標品と共に移動する。ｐＨＳＡ１の抑制培養に対して誘
発培養で血清アルブミンの生産が増大していることは、
富化培地に対する最少培地の35Ｓ−メチオニンプール比
活性の違いよりも、プラスミドにコードされているタン
パク質の合成レベルが高いことを示している（データは
示されていない）。60,000ダルトンのシャープなバンド
は明らかに加工品である。このバンドは誘発ｐＨＳＡ１
および抑制ｐＨＳＡ１の両者ならびに対照形質転換体で
みられ、プレイミュン（preimmune ）（レーン７）およ
び抗−ＨＳＡ ＩｇＧ（レーン２〜５）に結合する。レ
ーン４の47,000ダルトンにみられる小さいバンドは、明
らかにプラスミドにコードされているものであり、早め
に終了した細菌合成ＨＳＡを表わしているかもしれな
い。
【００３１】第３図はヒト血清アルブミンのヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列を示している。
ド配列およびアミノ酸配列を示している。
【００３２】ＨＳＡ ｍＲＮＡの成熟タンパク質コード
領域と３′非翻訳領域のＤＮＡ配列は組換えプラスミド
ｐＨＳＡ１から決定し、プレプロペプチドコード領域お
よび５′非翻訳領域のＤＮＡ配列はプラスミドＰ−１４
から決定した（後述）。予想されたアミノ酸がこのＤＮ
Ａ配列の上に示されており、成熟タンパク質の最初の残
基から番号付けしてある。先行する２４個のアミノ酸は
プレプロペプチドからなる。Dayhoff （文献９）および
Moulonら（文献１２）によって報告されているＨＳＡの
タンパク質配列と一致しない５個のアミノ酸残基には下
線を引いた。上記のヌクレオチド配列は多分、ＨＳＡ
ｍＲＮＡの真の５′末端まで伸びていない。アルブミン
の直接発現用プラスミドｐＨＳＡ１においては、成熟タ
ンパク質コード領域の直前にＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロ
モーター／オペレーターリーダー／ペプチドリボゾーム
結合部位（文献３６、３７）、人工のＸｂａＩ部位およ
び人工の開始コドンＡＴＧがあり、プレプロ領域は切り
取られている。ｐＨＳＡ１においてＨＳＡの第１コドン
の前のヌクレオチドは５′−ＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧ
ＧＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧである。
領域と３′非翻訳領域のＤＮＡ配列は組換えプラスミド
ｐＨＳＡ１から決定し、プレプロペプチドコード領域お
よび５′非翻訳領域のＤＮＡ配列はプラスミドＰ−１４
から決定した（後述）。予想されたアミノ酸がこのＤＮ
Ａ配列の上に示されており、成熟タンパク質の最初の残
基から番号付けしてある。先行する２４個のアミノ酸は
プレプロペプチドからなる。Dayhoff （文献９）および
Moulonら（文献１２）によって報告されているＨＳＡの
タンパク質配列と一致しない５個のアミノ酸残基には下
線を引いた。上記のヌクレオチド配列は多分、ＨＳＡ
ｍＲＮＡの真の５′末端まで伸びていない。アルブミン
の直接発現用プラスミドｐＨＳＡ１においては、成熟タ
ンパク質コード領域の直前にＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロ
モーター／オペレーターリーダー／ペプチドリボゾーム
結合部位（文献３６、３７）、人工のＸｂａＩ部位およ
び人工の開始コドンＡＴＧがあり、プレプロ領域は切り
取られている。ｐＨＳＡ１においてＨＳＡの第１コドン
の前のヌクレオチドは５′−ＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧ
ＧＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧである。
【００３３】
（Ａ）ｃＤＮＡの合成およびクローニング
リボヌクレオシド−バナジル錯体法（文献１７）または
グアニジニウムチオシアネート法（文献１８）のいずれ
かにより、バイオプシー（生検）または死体から得たヒ
トの迅速凍結肝臓標本からポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し
た。ｃＤＮＡの合成反応は、基本的に文献１９に記載さ
れた方法に従い、ホスホトリエステル法（文献２０）に
より製造したオリゴ−デオキシヌクレオチドまたはオリ
ゴ（ｄＴ）12-18 （Collaborative Research）のいずれ
かをプライマーとして用いて行なった。典型的なｃＤＮ
Ａ合成反応では、２５〜３５μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
と４０〜８０pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを５
０ｍＭのＮａＣｌ中で５分間９０°に加熱した。この反
応混合物を、最終濃度が２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．３）、２０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ2 、３
０ｍＭジチオトレイット、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（生産物の回収を追跡するため
に32Ｐ−ｄＣＴＰ（Amersham）を加える）となるように
し、４２℃で５分間アニーリングした。１００単位のＡ
ＭＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を加え、４２℃で４５分間イ
ンキュベートした。２本目のＤＮＡ鎖の合成、Ｓ１処
理、ポリアクリルアミドゲル上でのサイズ選択、デオキ
シ（Ｃ）テイリングおよび，ＰｓｔＩにより開裂されデ
オキシ（Ｇ）テイリングされたｐＢＲ３２２へのアニー
リングは既述の方法（文献２１、２２）で行なった。ア
ニーリングした混合物を使い、発表されている方法（文
献２４）に従ってＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株２９４（文
献２３）を形質転換した。
グアニジニウムチオシアネート法（文献１８）のいずれ
かにより、バイオプシー（生検）または死体から得たヒ
トの迅速凍結肝臓標本からポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し
た。ｃＤＮＡの合成反応は、基本的に文献１９に記載さ
れた方法に従い、ホスホトリエステル法（文献２０）に
より製造したオリゴ−デオキシヌクレオチドまたはオリ
ゴ（ｄＴ）12-18 （Collaborative Research）のいずれ
かをプライマーとして用いて行なった。典型的なｃＤＮ
Ａ合成反応では、２５〜３５μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ
と４０〜８０pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを５
０ｍＭのＮａＣｌ中で５分間９０°に加熱した。この反
応混合物を、最終濃度が２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．３）、２０ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ2 、３
０ｍＭジチオトレイット、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（生産物の回収を追跡するため
に32Ｐ−ｄＣＴＰ（Amersham）を加える）となるように
し、４２℃で５分間アニーリングした。１００単位のＡ
ＭＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を加え、４２℃で４５分間イ
ンキュベートした。２本目のＤＮＡ鎖の合成、Ｓ１処
理、ポリアクリルアミドゲル上でのサイズ選択、デオキ
シ（Ｃ）テイリングおよび，ＰｓｔＩにより開裂されデ
オキシ（Ｇ）テイリングされたｐＢＲ３２２へのアニー
リングは既述の方法（文献２１、２２）で行なった。ア
ニーリングした混合物を使い、発表されている方法（文
献２４）に従ってＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株２９４（文
献２３）を形質転換した。
【００３４】（Ｂ） 32Ｐ−標識プローブ を用いた組換え
プラスミドのスクリーニング Ｅ．ｃｏｌｉ 形質転換体を５μｇ／mlのテトラサイクリ
ン含有ＬＢ寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロースフ
ィルターペーパー（Schleicher and Schuell,BA85）に
移し、ｉｎ ｓｉｔｕコロニースクリーニング法（文献
２５）の改良法を使用するハイブリダイゼーションによ
って試験した。ヌクレオチド１２〜１６個の長さを有す
る32Ｐ−末端標識（文献２６）オリゴデオキシヌクレオ
チドフラグメントを直接ハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いた。あるいは、オリゴ（ｄＴ）またはオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いてＲＮＡから
32Ｐ−ｃＤＮＡプローブを合成した（文献１９）。フィ
ルターを５×Denhardt′s溶液（文献２７）、５×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣ＝１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．
８）、２０μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ中、４°〜４２°の
温度で１夜ハイブリダイズさせ、32Ｐ−標識プローブの
長さに応じて４°〜４２°の温度で、１〜０．２×ＳＳ
Ｃの濃度の塩（０．１％ＳＤＳ含有）中で洗浄した（文
献２８）。DuPont Lightning−Plus増強スクリーンを用
い、乾燥したフィルターをＸ線フィルム（コダックＸＲ
−２）に−８０°で感光させた。
プラスミドのスクリーニング Ｅ．ｃｏｌｉ 形質転換体を５μｇ／mlのテトラサイクリ
ン含有ＬＢ寒天平板上で増殖させ、ニトロセルロースフ
ィルターペーパー（Schleicher and Schuell,BA85）に
移し、ｉｎ ｓｉｔｕコロニースクリーニング法（文献
２５）の改良法を使用するハイブリダイゼーションによ
って試験した。ヌクレオチド１２〜１６個の長さを有す
る32Ｐ−末端標識（文献２６）オリゴデオキシヌクレオ
チドフラグメントを直接ハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いた。あるいは、オリゴ（ｄＴ）またはオリ
ゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いてＲＮＡから
32Ｐ−ｃＤＮＡプローブを合成した（文献１９）。フィ
ルターを５×Denhardt′s溶液（文献２７）、５×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣ＝１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．
８）、２０μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ中、４°〜４２°の
温度で１夜ハイブリダイズさせ、32Ｐ−標識プローブの
長さに応じて４°〜４２°の温度で、１〜０．２×ＳＳ
Ｃの濃度の塩（０．１％ＳＤＳ含有）中で洗浄した（文
献２８）。DuPont Lightning−Plus増強スクリーンを用
い、乾燥したフィルターをＸ線フィルム（コダックＸＲ
−２）に−８０°で感光させた。
【００３５】（Ｃ）ＤＮＡの調製および制限酵素分析
プラスミドＤＮＡを大量スケール（文献２９）または少
量スケール（miniprep、文献３０）で調製し、制限酵素
（New England Biolabs, BRL）で開裂した。スラブゲル
電気泳動条件およびゲルからのＤＮＡフラグメントの電
気溶出については文献３１に記載されている。
量スケール（miniprep、文献３０）で調製し、制限酵素
（New England Biolabs, BRL）で開裂した。スラブゲル
電気泳動条件およびゲルからのＤＮＡフラグメントの電
気溶出については文献３１に記載されている。
【００３６】（Ｄ）ＤＮＡの配列決定
ＤＮＡの配列決定は、末端標識ＤＮＡフラグメントを用
いてＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（文献２
６）と、合成オリゴヌクレオチド（文献２０）プライマ
ーを用いてファージＭ１３ｍｐ７）サブクローン（文献
３３）からの１本鎖ＤＮＡに対するジデオキシチェイン
ターミネーション法（文献３２）とを両方共用いて行な
った。各領域は独立して数回配列決定した。
いてＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（文献２
６）と、合成オリゴヌクレオチド（文献２０）プライマ
ーを用いてファージＭ１３ｍｐ７）サブクローン（文献
３３）からの１本鎖ＤＮＡに対するジデオキシチェイン
ターミネーション法（文献３２）とを両方共用いて行な
った。各領域は独立して数回配列決定した。
【００３７】（Ｅ）ＨＳＡの直接発現のためのアルブミ
ン遺伝子の５′末端の構築 プラスミドＦ−４７の約１２００ｂｐのＰｓｔＩインサ
ート１０μｇ（約１６pmol）を水中で５分間煮沸し、１
００ｐmol の32Ｐ−末端標識５′プライマー（ｄＡＴＧ
ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧ）と混合した。この混合物を
氷で冷やし、０℃で最終容量を１２０μｌ（６ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ）とした。１０単位のＤＮＡポリメラー
ゼＩ Klenowフラグメント（Boehringer−Mannheim）を
添加し、この混合物を２４℃で５時間インキュベートし
た。フェノール／クロロホルム抽出の後、生成物をＨｐ
ａＩＩで消化し、５％ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動させ、所望の４５０ｂｐフラグメントを電気溶出し
た。
ン遺伝子の５′末端の構築 プラスミドＦ−４７の約１２００ｂｐのＰｓｔＩインサ
ート１０μｇ（約１６pmol）を水中で５分間煮沸し、１
００ｐmol の32Ｐ−末端標識５′プライマー（ｄＡＴＧ
ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧ）と混合した。この混合物を
氷で冷やし、０℃で最終容量を１２０μｌ（６ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ）とした。１０単位のＤＮＡポリメラー
ゼＩ Klenowフラグメント（Boehringer−Mannheim）を
添加し、この混合物を２４℃で５時間インキュベートし
た。フェノール／クロロホルム抽出の後、生成物をＨｐ
ａＩＩで消化し、５％ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動させ、所望の４５０ｂｐフラグメントを電気溶出し
た。
【００３８】ベクタープラスミドｐＬｅＩＦ Ａ２５
（文献２１）のＸｂａＩ消化によって生成した１本鎖部
分を充填してブラント（平滑）ＤＮＡ末端を生成せしめ
るために、１０μＭまでのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェートおよび１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメントをこの制限エンドヌクレアーゼ反応混
合物に加え、１２°で１０分間インキュベートした。制
限エンドヌクレアーゼフラグメント（ほぼ等モル、０．
１〜１μｇ）をアニーリングし、２０μｌの５０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオトレイット、１ｍ
Ｍ ｒＡＴＰ中、５０単位のＴ4 リガーゼ（N.E.Biolab
s ）を用いて１２℃で１夜連結した。プラスミドの構築
についての詳細は後述する。
（文献２１）のＸｂａＩ消化によって生成した１本鎖部
分を充填してブラント（平滑）ＤＮＡ末端を生成せしめ
るために、１０μＭまでのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェートおよび１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメントをこの制限エンドヌクレアーゼ反応混
合物に加え、１２°で１０分間インキュベートした。制
限エンドヌクレアーゼフラグメント（ほぼ等モル、０．
１〜１μｇ）をアニーリングし、２０μｌの５０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオトレイット、１ｍ
Ｍ ｒＡＴＰ中、５０単位のＴ4 リガーゼ（N.E.Biolab
s ）を用いて１２℃で１夜連結した。プラスミドの構築
についての詳細は後述する。
【００３９】（Ｆ）タンパク質の分析
組換えＥ．ｃｏｌｉ株の培養物２mlをＬＢまたはＭ9 培
地（５μｇ／mlのテトラサイクリン添加）中で密度Ａ
550 ＝１．０まで増殖させ、ペレット化し、洗浄し、再
びペレット化し、２mlのＬＢまたは補足Ｍ9 （Ｍ9 ＋
０．２％グルコース、１μｇ／mlチアミン、２０μｇ／
mlの標準アミノ酸、ただしメチオニンは２μｇ／mlであ
り、トリプトファンは除く）に懸濁した。各増殖培地は
５μｇ／mlのテトラサイクリンおよび１００μＣｉの35
Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ；1200Ｃｉ／ミリモル）も含ん
でいた。１時間３７℃でインキュベートした後、バクテ
リアをペレット化し、凍結・融解し、２００μｌの５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１２ｍＭ Ｎａ
ＥＤＴＡに再懸濁し、リゾチームを１mg／mlまで、ＮＰ
４０を０．２％まで、ＮａＣｌを０．３５Ｍまで添加し
てから１０分間氷の上に置いた。溶菌物（lysate）を１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 に調節し、５０μｇ／ｍｌのDNase
Ｉ（Worthington)と共に氷上で３０分間インキュベート
した。おだやかに遠心分離して不溶性物質を除去した。
試料を、文献３４に記載されているようにして、家兎抗
−ＨＳＡ（Cappel Labs ）およびぶどう状球菌性アブソ
ーベント（Pansorbin ；Cal Biochem ）で免疫沈降さ
せ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（文献３
５）にかけた。
地（５μｇ／mlのテトラサイクリン添加）中で密度Ａ
550 ＝１．０まで増殖させ、ペレット化し、洗浄し、再
びペレット化し、２mlのＬＢまたは補足Ｍ9 （Ｍ9 ＋
０．２％グルコース、１μｇ／mlチアミン、２０μｇ／
mlの標準アミノ酸、ただしメチオニンは２μｇ／mlであ
り、トリプトファンは除く）に懸濁した。各増殖培地は
５μｇ／mlのテトラサイクリンおよび１００μＣｉの35
Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ；1200Ｃｉ／ミリモル）も含ん
でいた。１時間３７℃でインキュベートした後、バクテ
リアをペレット化し、凍結・融解し、２００μｌの５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１２ｍＭ Ｎａ
ＥＤＴＡに再懸濁し、リゾチームを１mg／mlまで、ＮＰ
４０を０．２％まで、ＮａＣｌを０．３５Ｍまで添加し
てから１０分間氷の上に置いた。溶菌物（lysate）を１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 に調節し、５０μｇ／ｍｌのDNase
Ｉ（Worthington)と共に氷上で３０分間インキュベート
した。おだやかに遠心分離して不溶性物質を除去した。
試料を、文献３４に記載されているようにして、家兎抗
−ＨＳＡ（Cappel Labs ）およびぶどう状球菌性アブソ
ーベント（Pansorbin ；Cal Biochem ）で免疫沈降さ
せ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（文献３
５）にかけた。
【００４０】（Ｇ）ｃＤＮＡクローニング
オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用いて得られた最初
のｃＤＮＡクローンをコロニーハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。そのために、肝臓の全ｃ
ＤＮＡ（豊富なＲＮＡ種を含有するクローンを同定する
ため）と、ＨＳＡのアミノ酸５４６〜５４９および２９
４〜２９７をコードする可能な配列変化を表わすように
合成された４種の１１塩基からなるオリゴデオキシヌク
レオチドを２組プライマーとして用いて肝臓のｍＲＮＡ
から得られた２個の32Ｐ標識ｃＤＮＡとを使用した。陽
性コロニーの中には、期待されたＨＳＡ ｍＲＮＡ配列
のタンパク質コード領域の３′側を 1/2以上含有するも
のがなかった。（これらの組換え体の最大のものをＢ−
４４と命名した。）現在の方法では期待するサイズ（約
２０００ｂｐ）のｍＲＮＡを直接コピーすることができ
ないので、Ｂ−４４の５′末端近くの領域のアンチメッ
セージ（非コード）鎖に相当する合成オリゴデオキシヌ
クレオチドを製造した。Ｂ−４４のヌクレオチド配列か
ら、アミノ酸３６９〜３７３に相当する１２塩基のオリ
ゴデオキシヌクレオチドを構築した。これをプライマー
として使用して、肝臓ｍＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、Ｂ
−４４組換え体と重複しているがＨＳＡメッセージの
５′部分を含んでいるｃＤＮＡクローンをｐＢＲ３２２
中で生成した。得られた約４００個のクローンを、既に
決定されていたｍＲＮＡ配列中で僅か上流に位置する１
６塩基のオリゴデオキシヌクレオチドフラグメントとの
コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニン
グした。約４０％のコロニーが両プローブとハイブリダ
イズした。ハイブリダイズするプラスミドを含有してい
なかったコロニーの多くは、自身をプライマーとして生
じたＲＮＡか、または逆転写の間に夾雑オリゴ（ｄＴ）
をプライマーとして生じたＲＮＡに由来するものか、あ
るいはスクリーニングに使用した配列を含んでいる３′
領域を失ったものであると考えられる。ハイブリダイズ
するコロニーから得た少量（miniprep）のプラスミドＤ
ＮＡをＰｓｔＩで消化した。３個の組換えプラスミド
が、ＨＳＡメッセージの残りの５′部分をコードするの
に十分大きいインサートを含んでいた。これらのうちの
２つ（Ｆ−１５およびＦ−４７）は、遺伝子の５′末端
コード部分を含んでいたが、Ｂ−４４と結合させて完全
なアルブミン遺伝子を再形成させるのに必要なＰｓｔＩ
部位までは延びていなかった。組換え体Ｆ−６１はこの
ＰｓｔＩ部位をもっていたが５′末端が欠けていた。こ
の部分的長さのクローンＦ−４７、Ｆ−６１およびＢ−
４４に共通する制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、
全メッセージ配列をこれら３つの部分から再構築するこ
とができた（第１図参照）。
のｃＤＮＡクローンをコロニーハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。そのために、肝臓の全ｃ
ＤＮＡ（豊富なＲＮＡ種を含有するクローンを同定する
ため）と、ＨＳＡのアミノ酸５４６〜５４９および２９
４〜２９７をコードする可能な配列変化を表わすように
合成された４種の１１塩基からなるオリゴデオキシヌク
レオチドを２組プライマーとして用いて肝臓のｍＲＮＡ
から得られた２個の32Ｐ標識ｃＤＮＡとを使用した。陽
性コロニーの中には、期待されたＨＳＡ ｍＲＮＡ配列
のタンパク質コード領域の３′側を 1/2以上含有するも
のがなかった。（これらの組換え体の最大のものをＢ−
４４と命名した。）現在の方法では期待するサイズ（約
２０００ｂｐ）のｍＲＮＡを直接コピーすることができ
ないので、Ｂ−４４の５′末端近くの領域のアンチメッ
セージ（非コード）鎖に相当する合成オリゴデオキシヌ
クレオチドを製造した。Ｂ−４４のヌクレオチド配列か
ら、アミノ酸３６９〜３７３に相当する１２塩基のオリ
ゴデオキシヌクレオチドを構築した。これをプライマー
として使用して、肝臓ｍＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、Ｂ
−４４組換え体と重複しているがＨＳＡメッセージの
５′部分を含んでいるｃＤＮＡクローンをｐＢＲ３２２
中で生成した。得られた約４００個のクローンを、既に
決定されていたｍＲＮＡ配列中で僅か上流に位置する１
６塩基のオリゴデオキシヌクレオチドフラグメントとの
コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニン
グした。約４０％のコロニーが両プローブとハイブリダ
イズした。ハイブリダイズするプラスミドを含有してい
なかったコロニーの多くは、自身をプライマーとして生
じたＲＮＡか、または逆転写の間に夾雑オリゴ（ｄＴ）
をプライマーとして生じたＲＮＡに由来するものか、あ
るいはスクリーニングに使用した配列を含んでいる３′
領域を失ったものであると考えられる。ハイブリダイズ
するコロニーから得た少量（miniprep）のプラスミドＤ
ＮＡをＰｓｔＩで消化した。３個の組換えプラスミド
が、ＨＳＡメッセージの残りの５′部分をコードするの
に十分大きいインサートを含んでいた。これらのうちの
２つ（Ｆ−１５およびＦ−４７）は、遺伝子の５′末端
コード部分を含んでいたが、Ｂ−４４と結合させて完全
なアルブミン遺伝子を再形成させるのに必要なＰｓｔＩ
部位までは延びていなかった。組換え体Ｆ−６１はこの
ＰｓｔＩ部位をもっていたが５′末端が欠けていた。こ
の部分的長さのクローンＦ−４７、Ｆ−６１およびＢ−
４４に共通する制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、
全メッセージ配列をこれら３つの部分から再構築するこ
とができた（第１図参照）。
【００４１】さらに５′方向にのびるもう１つのｃＤＮ
Ａクローンは、同様のオリゴデオキシヌクレオチド（ア
ミノ酸コドン番号１７５〜１７９に相当するプライマ
ー）を用いたｃＤＮＡ合成によって得た。このｃＤＮＡ
クローン（Ｐ−１４）は成熟ＨＳＡ発現プラスミドの構
築には使用しなかったが、これによってＨＳＡ ｍＲＮ
Ａの「プレプロ」ペプチドコード領域と５′非コード領
域のＤＮＡ配列を決定することができた。
Ａクローンは、同様のオリゴデオキシヌクレオチド（ア
ミノ酸コドン番号１７５〜１７９に相当するプライマ
ー）を用いたｃＤＮＡ合成によって得た。このｃＤＮＡ
クローン（Ｐ−１４）は成熟ＨＳＡ発現プラスミドの構
築には使用しなかったが、これによってＨＳＡ ｍＲＮ
Ａの「プレプロ」ペプチドコード領域と５′非コード領
域のＤＮＡ配列を決定することができた。
【００４２】得られた成熟ＨＳＡ ｍＲＮＡ配列を、ｔ
ｒｐプロモーター／オペレーターによってＥ．ｃｏｌｉ
中で成熟タンパク質を直接発現させるためのベクタープ
ラスミドに結合した。プラスミドｐＬｅＩＦＡ２５はヒ
トの白血球インターフェロンＡ（ＩＦＮα２）の発現を
指令する（文献２１）。このプラスミドをＸｂａＩで消
化し、その開裂部位を、ＤＮＡポリメラーゼＩ Klenow
フラグメントとデオキシヌクレオシドトリホスフェート
を用いて充填してブラントＤＮＡ末端を形成させた。次
いでＰｓｔＩで消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロ
モーター、オペレーターおよび人工的にブラント末端に
したＸｂａＩ開裂部位を末端にもつｔｒｐリーダーペプ
チドのリボゾーム結合部位の３００ｂｐフラグメントお
よびｐＢＲ３２２配列を含んでいる「ベクター」フラグ
メントをゲルで精製した。クローンＦ−４７のＤＮＡ配
列分析により決定したＨＳＡの最初の４個のアミノ酸を
コードしている１２個のヌクレオチドとその直前の開始
コドンＡＴＧを含むように、１５個の塩基からなるオリ
ゴデオキシヌクレオチドを設計した。「プライマー修
復」と呼ばれる操作で、Ｆ−４７のＰｓｔＩフラグメン
トを含有している遺伝子を変性し、過剰の１５−ｍｅｒ
（１５量体）とアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼＩ
Klenowフラグメントおよびデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートと反応させた。この反応で、アニーリング
したオリゴヌクレオチドの下流に新しい第２の鎖が延
び、コドン番号１の上流の１本鎖ＤＮＡが減成（分解）
し、次いで上流でＡＴＧに相補的な３個のヌクレオチド
が補足される。さらに、この生成物を、上で調製したベ
クターフラグメントにブラント末端で連結させると、そ
の初めのアデノシン残基がＸｂａＩ制限部位を再生す
る。この「プライマー修復」反応に続いて、このＤＮＡ
をＨｐａIIで消化し、成熟アルブミン遺伝子の５′部分
を含有している４５０ｂｐフラグメントをゲルで精製し
た（第１図参照）。このフラグメントをアニーリング
し、ベクターフラグメントおよびゲル単離したＦ−４７
のＨｐａII−ＰｓｔＩ部分に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞
の形質転換に使用した。少量の（minipreps ）プラスミ
ドを検査のために制限エンドヌクレアーゼで消化した結
果、ｔｒｐプロモーター／オペレーターに正確に連結さ
れた成熟アルブミンコード領域の５′部分を含有してい
る組換え体Ａ−２６が確認された。組立の最終段階とし
て、Ａ−２６プラスミドをＢｇｌIIとＰｓｔＩで消化
し、約４ｋｂフラグメントをゲルで精製した。これをア
ニーリングして、Ｆ−６１から精製した３９０ｂｐのＰ
ｓｔＩ／ＢｇｌII部分消化フラグメントおよびＢ−４４
の１０００ｂｐ ＰｓｔＩフラグメントに連結した。得
られた形質転換体を制限エンドヌクレアーゼで分析した
結果、成熟タンパク質を直接発現するように適切に配置
された全ＨＳＡコード配列を含有するプラスミドが確認
された。このような組換え体プラスミドの１つをｐＨＳ
Ａ１と命名した。ｐＨＳＡ１を含有するＥ．ｃｏｌｉを
トリプトファンを含んでいない最少培地で増殖させる
と、ＨＳＡ抗体と特異的に反応し、ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動でＨＳＡと共に移動するタンパク質が産
生する（第２図参照。同じ組換え体を富化ブロス中で増
殖させるとこのようなタンパク質は産生しない。このこ
とは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での推定ＨＳＡタンパク質の産生
が、設計したとおりｔｒｐプロモーター／オペレーター
の制御下で行われることを示している。組換えプラスミ
ドにおけるＨＳＡ構造遺伝子の完全性を確かめるため
に、ｐＨＳＡ１をＤＮＡ配列分析にかけた。
ｒｐプロモーター／オペレーターによってＥ．ｃｏｌｉ
中で成熟タンパク質を直接発現させるためのベクタープ
ラスミドに結合した。プラスミドｐＬｅＩＦＡ２５はヒ
トの白血球インターフェロンＡ（ＩＦＮα２）の発現を
指令する（文献２１）。このプラスミドをＸｂａＩで消
化し、その開裂部位を、ＤＮＡポリメラーゼＩ Klenow
フラグメントとデオキシヌクレオシドトリホスフェート
を用いて充填してブラントＤＮＡ末端を形成させた。次
いでＰｓｔＩで消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロ
モーター、オペレーターおよび人工的にブラント末端に
したＸｂａＩ開裂部位を末端にもつｔｒｐリーダーペプ
チドのリボゾーム結合部位の３００ｂｐフラグメントお
よびｐＢＲ３２２配列を含んでいる「ベクター」フラグ
メントをゲルで精製した。クローンＦ−４７のＤＮＡ配
列分析により決定したＨＳＡの最初の４個のアミノ酸を
コードしている１２個のヌクレオチドとその直前の開始
コドンＡＴＧを含むように、１５個の塩基からなるオリ
ゴデオキシヌクレオチドを設計した。「プライマー修
復」と呼ばれる操作で、Ｆ−４７のＰｓｔＩフラグメン
トを含有している遺伝子を変性し、過剰の１５−ｍｅｒ
（１５量体）とアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼＩ
Klenowフラグメントおよびデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェートと反応させた。この反応で、アニーリング
したオリゴヌクレオチドの下流に新しい第２の鎖が延
び、コドン番号１の上流の１本鎖ＤＮＡが減成（分解）
し、次いで上流でＡＴＧに相補的な３個のヌクレオチド
が補足される。さらに、この生成物を、上で調製したベ
クターフラグメントにブラント末端で連結させると、そ
の初めのアデノシン残基がＸｂａＩ制限部位を再生す
る。この「プライマー修復」反応に続いて、このＤＮＡ
をＨｐａIIで消化し、成熟アルブミン遺伝子の５′部分
を含有している４５０ｂｐフラグメントをゲルで精製し
た（第１図参照）。このフラグメントをアニーリング
し、ベクターフラグメントおよびゲル単離したＦ−４７
のＨｐａII−ＰｓｔＩ部分に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞
の形質転換に使用した。少量の（minipreps ）プラスミ
ドを検査のために制限エンドヌクレアーゼで消化した結
果、ｔｒｐプロモーター／オペレーターに正確に連結さ
れた成熟アルブミンコード領域の５′部分を含有してい
る組換え体Ａ−２６が確認された。組立の最終段階とし
て、Ａ−２６プラスミドをＢｇｌIIとＰｓｔＩで消化
し、約４ｋｂフラグメントをゲルで精製した。これをア
ニーリングして、Ｆ−６１から精製した３９０ｂｐのＰ
ｓｔＩ／ＢｇｌII部分消化フラグメントおよびＢ−４４
の１０００ｂｐ ＰｓｔＩフラグメントに連結した。得
られた形質転換体を制限エンドヌクレアーゼで分析した
結果、成熟タンパク質を直接発現するように適切に配置
された全ＨＳＡコード配列を含有するプラスミドが確認
された。このような組換え体プラスミドの１つをｐＨＳ
Ａ１と命名した。ｐＨＳＡ１を含有するＥ．ｃｏｌｉを
トリプトファンを含んでいない最少培地で増殖させる
と、ＨＳＡ抗体と特異的に反応し、ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動でＨＳＡと共に移動するタンパク質が産
生する（第２図参照。同じ組換え体を富化ブロス中で増
殖させるとこのようなタンパク質は産生しない。このこ
とは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での推定ＨＳＡタンパク質の産生
が、設計したとおりｔｒｐプロモーター／オペレーター
の制御下で行われることを示している。組換えプラスミ
ドにおけるＨＳＡ構造遺伝子の完全性を確かめるため
に、ｐＨＳＡ１をＤＮＡ配列分析にかけた。
【００４３】（Ｈ）ＤＮＡ配列分析
ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの化学的分解法（文献
２６）と、１本鎖Ｍ１３ｍＰ７ファージ誘導体から誘導
された鋳型を用いたジデオキシチェインターミネーショ
ン法（文献３２，３３）とにより、ｐＨＳＡ１のアルブ
ミンｃＤＮＡ部分（およびその周辺領域）を完全に配列
決定した。全てのヌクレオチドは少なくとも２回配列決
定した。このＤＮＡ配列をＨＳＡタンパク質の推定アミ
ノ酸配列と共に第３図に示してある。成熟ＨＳＡコード
領域より５′側のＤＮＡ配列もｃＤＮＡクローンＰ−１
４から決定し、第３図に示してある。
２６）と、１本鎖Ｍ１３ｍＰ７ファージ誘導体から誘導
された鋳型を用いたジデオキシチェインターミネーショ
ン法（文献３２，３３）とにより、ｐＨＳＡ１のアルブ
ミンｃＤＮＡ部分（およびその周辺領域）を完全に配列
決定した。全てのヌクレオチドは少なくとも２回配列決
定した。このＤＮＡ配列をＨＳＡタンパク質の推定アミ
ノ酸配列と共に第３図に示してある。成熟ＨＳＡコード
領域より５′側のＤＮＡ配列もｃＤＮＡクローンＰ−１
４から決定し、第３図に示してある。
【００４４】ＤＮＡ配列分析の結果、人工の開始コドン
および完全な成熟ＨＳＡコード配列が所望通りＥ．ｃｏ
ｌｉ ｔｒｐプロモーター／オペレーターのすぐ後に続
いていることが確認された。このＡＴＧイニシエーター
は、ｔｒｐリーダーペプチド（文献３７）の推定Ｅ．ｃ
ｏｌｉリボゾーム結合配列（文献３６）からヌクレオチ
ド９個分だけ後にある。
および完全な成熟ＨＳＡコード配列が所望通りＥ．ｃｏ
ｌｉ ｔｒｐプロモーター／オペレーターのすぐ後に続
いていることが確認された。このＡＴＧイニシエーター
は、ｔｒｐリーダーペプチド（文献３７）の推定Ｅ．ｃ
ｏｌｉリボゾーム結合配列（文献３６）からヌクレオチ
ド９個分だけ後にある。
【００４５】ｐＨＳＡ１のＤＮＡ配列の翻訳により、５
８５個のアミノ酸からなる成熟ＨＳＡタンパク質が予想
される。種々報告されているＨＳＡタンパク質配列は約
２０個のアミノ酸で一致していない。本発明による配列
は、Ｍｏｕｌｏｎら（文献１２）のものと１１個の残基
が異なっており、もともとＭｏｕｌｏｎら（文献１２）
の文献とＢｅｈｒｅｎｓら（文献１０）の報告に基くと
考えられるＤａｙｈｏｆｆカタログ（文献９）に記載さ
れているものとは２８個の残基が異なっている。これら
の違いのほとんどは、隣接残基の対の逆位（inversion
）であるか、またはグルタミン−グルタミン酸の不一
致である。本発明の配列では、Ｄａｙｈｏｆｆ（文献
９）およびＭｏｕｌｏｎら（文献１２）の両者と異なっ
ているのは５８５個の残基のうちの５個だけであり、こ
れらの５個の違いのうち３個はグルタミンとグルタミン
酸が入れ替ったものである（第３図において下線を引い
た部分“。全ての不一致の部分について、ヌクレオチド
の配列決定を注意深く再チェックした所、ＤＮＡ配列決
定操作の誤りがこれらの不一致の原因になっているとは
考えられなかった。ｃＤＮＡのクローニングで人工的加
工がなされた可能性を除外することはできない。しか
し、種々の報告におけるアミノ酸配列の違いについて他
の説明が可能である。それらの１つは、インビボまたは
タンパク質の配列決定中におけるアミド化の変化（グル
タミンとグルタミン酸の識別に影響がある）である（文
献３８）。ＨＳＡタンパク質の多形性が相違の原因にな
っているかもしれない。２０種以上のＨＳＡの遺伝的変
異体がタンパク質電気泳動（文献３９）により検出され
ているが、アミノ酸配列レベルではまだ分析されていな
い。また、本発明で予測されたＨＳＡタンパク質配列は
５８５個のアミノ酸の長さであり、Ｍｏｕｌｏｎ（文献
１２）とは一致するがＤａｙｈｏｆｆ（文献９）とは一
致しないことも注目に値する。この違いはアミノ酸１５
６〜１５７におけるＰｈｅ−Ｐｈｅペアの１個のフェニ
ルアラニン（Ｐｈｅ）残基の欠失（文献９）によって説
明される。
８５個のアミノ酸からなる成熟ＨＳＡタンパク質が予想
される。種々報告されているＨＳＡタンパク質配列は約
２０個のアミノ酸で一致していない。本発明による配列
は、Ｍｏｕｌｏｎら（文献１２）のものと１１個の残基
が異なっており、もともとＭｏｕｌｏｎら（文献１２）
の文献とＢｅｈｒｅｎｓら（文献１０）の報告に基くと
考えられるＤａｙｈｏｆｆカタログ（文献９）に記載さ
れているものとは２８個の残基が異なっている。これら
の違いのほとんどは、隣接残基の対の逆位（inversion
）であるか、またはグルタミン−グルタミン酸の不一
致である。本発明の配列では、Ｄａｙｈｏｆｆ（文献
９）およびＭｏｕｌｏｎら（文献１２）の両者と異なっ
ているのは５８５個の残基のうちの５個だけであり、こ
れらの５個の違いのうち３個はグルタミンとグルタミン
酸が入れ替ったものである（第３図において下線を引い
た部分“。全ての不一致の部分について、ヌクレオチド
の配列決定を注意深く再チェックした所、ＤＮＡ配列決
定操作の誤りがこれらの不一致の原因になっているとは
考えられなかった。ｃＤＮＡのクローニングで人工的加
工がなされた可能性を除外することはできない。しか
し、種々の報告におけるアミノ酸配列の違いについて他
の説明が可能である。それらの１つは、インビボまたは
タンパク質の配列決定中におけるアミド化の変化（グル
タミンとグルタミン酸の識別に影響がある）である（文
献３８）。ＨＳＡタンパク質の多形性が相違の原因にな
っているかもしれない。２０種以上のＨＳＡの遺伝的変
異体がタンパク質電気泳動（文献３９）により検出され
ているが、アミノ酸配列レベルではまだ分析されていな
い。また、本発明で予測されたＨＳＡタンパク質配列は
５８５個のアミノ酸の長さであり、Ｍｏｕｌｏｎ（文献
１２）とは一致するがＤａｙｈｏｆｆ（文献９）とは一
致しないことも注目に値する。この違いはアミノ酸１５
６〜１５７におけるＰｈｅ−Ｐｈｅペアの１個のフェニ
ルアラニン（Ｐｈｅ）残基の欠失（文献９）によって説
明される。
【００４６】ラット血清アルブミンｃＤＮＡクローン
（文献１６）のＤＮＡ配列と比較すると、本発明の成熟
ＨＳＡ配列はヌクレオチドレベルで７４％、アミノ酸レ
ベルで７３％が一致（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）している（ラ
ットのＳＡタンパク質はＨＳＡよりアミノ酸１個だけ短
く、ＨＳＡのカルボキシ末端残基がラットタンパク質に
は存在しない）。両タンパク質において、３５個のシス
テイン残基は全て同じ位置に存在している。ＨＳＡの予
測された「プレプロ」ペプチド領域は、ラットｃＤＮＡ
クローン（文献１６）から報告されているものと、７６
％のヌクレオチド、および７５％のアミノ酸が一致して
いる。種間の配列相同性は、比較できる３′非翻訳領域
（発表されているラットのｃＤＮＡクローンはｍＲＮＡ
の３′末端の前で終了している）の部分では低下してい
る。ＨＳＡ ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）付加部位からヌク
レオチド２８個分だけ前にヘキサヌクレオチドＡＡＴＡ
ＡＡを含んでいる。これはＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＢ
ｒｏｗｎｌｅｅによって初めて注目された真核細胞ｍＲ
ＮＡに共通の特徴である（文献４０）。
（文献１６）のＤＮＡ配列と比較すると、本発明の成熟
ＨＳＡ配列はヌクレオチドレベルで７４％、アミノ酸レ
ベルで７３％が一致（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）している（ラ
ットのＳＡタンパク質はＨＳＡよりアミノ酸１個だけ短
く、ＨＳＡのカルボキシ末端残基がラットタンパク質に
は存在しない）。両タンパク質において、３５個のシス
テイン残基は全て同じ位置に存在している。ＨＳＡの予
測された「プレプロ」ペプチド領域は、ラットｃＤＮＡ
クローン（文献１６）から報告されているものと、７６
％のヌクレオチド、および７５％のアミノ酸が一致して
いる。種間の配列相同性は、比較できる３′非翻訳領域
（発表されているラットのｃＤＮＡクローンはｍＲＮＡ
の３′末端の前で終了している）の部分では低下してい
る。ＨＳＡ ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）付加部位からヌク
レオチド２８個分だけ前にヘキサヌクレオチドＡＡＴＡ
ＡＡを含んでいる。これはＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＢ
ｒｏｗｎｌｅｅによって初めて注目された真核細胞ｍＲ
ＮＡに共通の特徴である（文献４０）。
【００４７】医薬組成物
本発明に係る化合物は、既知の方法に従って製剤化し
て、医薬上有用な組成物を製造することができる。すな
わち、本発明のポリペプチドを薬学的に許容し得る担体
と配合する。好適な担体およびその製剤化法はE.W.Mart
inの Remington′s Pharmaceutical Sciences に記載さ
れている（詳細は文献を参照されたい）。このような組
成物は、本発明に係る蛋白質の有効量と共に、受容者に
有効に投与するのに適した薬学的に許容し得る組成物を
調製するために適当な量の担体を含んでいる。１つの好
ましい投与方法は非経口投与である。
て、医薬上有用な組成物を製造することができる。すな
わち、本発明のポリペプチドを薬学的に許容し得る担体
と配合する。好適な担体およびその製剤化法はE.W.Mart
inの Remington′s Pharmaceutical Sciences に記載さ
れている（詳細は文献を参照されたい）。このような組
成物は、本発明に係る蛋白質の有効量と共に、受容者に
有効に投与するのに適した薬学的に許容し得る組成物を
調製するために適当な量の担体を含んでいる。１つの好
ましい投与方法は非経口投与である。
【００４８】文 献
１．Rosenoer,V,M., Oratz,M., Rothschild,M.A. eds.
(1977) Albumin Structure, Function and Uses,Pergam
on Press,Oxford. ２．Peters.T. (1977) Clin.Chem. (Winston-Salem,N.
C.) 23, 5-12. ３．Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805. ４．Sala-Trepat,J.M., Dever,J., Sargent,T.D., Thom
as,K., Sell,S. and Bonner,J. (1979) Biochemistry 1
8, 2167-2178. ５．Jagodzinski,L.L., Sargent,T.D., Yang,M.Glacki
n,C.and Bonner,J.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,
3521-3525. ６．Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805). ７．Yachnin,S., Hsu,R., Heinrikson,R.L. and Mille
r,J.B. (1977) Biochim.Biophys. Acta 493, 418-428. ８．Aoyagi,Y., Ikenaka,T. and Ichida,F. (1977) Can
cer Research 37, 3663-3667. ９．Dayhoff,M. (1978) Atlas of Protein Sequence an
d Structure, Vol.5.Suppl.3, p.266, National Biomed
ical Research Foundation, Washington. 10．Behrens,P.Q., Spiekerman,A.M. and Brown,J.R.(1
975) Fed.Proc.34, 591. 11．Brown,J.R. (1977) in Rosenoer et al. (1977),
pp.27-52. 12．Meloun,B., Moravek,L. and Kostka,V. (1975) Feb
s Letters 58, 134-137. 13．Judah,J.O., Gamble,M., and Steadman, J.H., (19
73)Biochem. J. 134, 1083-1091 14．Russell,J.H. and Geller,D.M. (1973) Biochem.Bi
ophys.Res.Commun. 55,239-245. 15．MacGillivray, R.T., Chung, D.W. and Davie, E.
W. (1979) Eur. J. Biochem. 98, 477-485. 16．Sargent, T.D., Yang, M. and Bonner, J. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78, 243-246. 17．Berger, S.L. and Birkenmeier,C.S. (1979) Bioch
emistry 18, 5143-5149. 18．Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, R., Pictet,
R., Tischer,E., Rutter,W.J. and Goodman, H.M. (197
7) Science 196, 1313-1315. 19．Goeddel, D.V., Yelverton, E., Ullrich, A., Hey
neker, H.L., Miozzari,G., Holmes, W., Seeburg, P.
H., Dull,T., May, L., Stebbing, N., Crea,R., Maed
a, S., McCandliss, R., Sloma, A., Tabor, J.M., Gro
ss, M.,Familletti, P.C. and Pestka, S. (1980) Natu
re 287, 411-416. 20．Crea, R. and Horn, T. (1980) Nucleic Acids Re
s. 8, 2331-2348. 21．Goeddel, D.V., Heyneker, H.L., Hozumi, T., Are
ntzen,R., Itakura, K.,Yansura, D.G., Ross, M.J., M
iozzari, G., Crea, R. and Seeburg, P.H.(1979) Natu
re 281, 544-548. 22．Goeddel, D.V., Shepard, H.M., Yelverton, E., L
eung, D. and Crea, R.(1980) Nucleic Acids Res. 8,
4057-4074. 23．Backman, K., Ptashne,M. and Gilbert,W. (1976)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73, 4174-4178. 24．Hershfield, V., Boyer, H.W., Yanofsky,C., Love
tt, M.A. and Helinski,D.R. (1974) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 71, 3455-3459. 25．Grunstein, M., and Hogness, D.S. (1975) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA3961-3965. 26．Maxam,A.M. and Gilbert, W. (1980) Methods Enzy
mol. 65, 499-560. 27．Denhardt, D.T. (1966) Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 23, 461-467. 28．Wallace,R.B., Johnson, M.J., Hirose, T., Miyak
e, T., Kawashima, E.H.and Itakura, K. (1981) Nucle
ic Acids Research 9, 879-893. 29．Blin, N. and Stafford, D.W. (1976) Nucleic Aci
ds Res. 3, 2303-2308. 30．Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nucleic Ac
ids Research 7, 1513-1523. 31．Lawn, R.M., Adelman, J., Franke, A.E., Houck,
C. M., Gross, M.,Najarian, R. and Goeddel, D.V. (1
981) Nucleic Acids Research 9, 1045-1052. 32．Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (197
7) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74, 5463-5467. 33．Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P.H. (1981)
Nucleic Acids Res. 9309-322. 34．Kessler, S.W. (1976) J. Immunology 117, 1482-1
490. 35．Laemmli, U.K. (1970) Nature 277, 680-685. 36．Shine, J. and Dalgarno, L. (1974) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 71,1342-1346. 37．Platt, T., Squires, C. and Yanofsky, C. (1976)
J. Mol. Biol. 103,411-420. 38．Robinson, A.B. and Rudd, C.J. (1974) Current
Topics in CellularRegulation, 247-295. 39．Weitkamp, L.R., Salzano, F.M., Neel, J.V., Por
ta, F., Geerdink, R.A.and Tarnoky, A.L. (1973) An
n. Hum. Genet., Lond. 36, 381-391. 40．Proudfoot, N.J. and Brownlee, G.G. (1976) Natu
re 263, 211-214. 41．Gorin, M.B., Cooper,D.L., Eiferman, F., Van de
Rijn,P. and Tilghman,S.M. (1981) J. Mol. Biol. 25
6, 1954-1959. 42．Kiousois, D., Eiferman, F., Van de Rijn, P., G
orin, M.B., Ingram,R.S. and Tilghman, S.M. (1981)
J.Mol. Biol. 256, 1960-1967.
(1977) Albumin Structure, Function and Uses,Pergam
on Press,Oxford. ２．Peters.T. (1977) Clin.Chem. (Winston-Salem,N.
C.) 23, 5-12. ３．Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805. ４．Sala-Trepat,J.M., Dever,J., Sargent,T.D., Thom
as,K., Sell,S. and Bonner,J. (1979) Biochemistry 1
8, 2167-2178. ５．Jagodzinski,L.L., Sargent,T.D., Yang,M.Glacki
n,C.and Bonner,J.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,
3521-3525. ６．Ruoslahti,E. and Terry,W.D. (1976) Nature 260,
804-805). ７．Yachnin,S., Hsu,R., Heinrikson,R.L. and Mille
r,J.B. (1977) Biochim.Biophys. Acta 493, 418-428. ８．Aoyagi,Y., Ikenaka,T. and Ichida,F. (1977) Can
cer Research 37, 3663-3667. ９．Dayhoff,M. (1978) Atlas of Protein Sequence an
d Structure, Vol.5.Suppl.3, p.266, National Biomed
ical Research Foundation, Washington. 10．Behrens,P.Q., Spiekerman,A.M. and Brown,J.R.(1
975) Fed.Proc.34, 591. 11．Brown,J.R. (1977) in Rosenoer et al. (1977),
pp.27-52. 12．Meloun,B., Moravek,L. and Kostka,V. (1975) Feb
s Letters 58, 134-137. 13．Judah,J.O., Gamble,M., and Steadman, J.H., (19
73)Biochem. J. 134, 1083-1091 14．Russell,J.H. and Geller,D.M. (1973) Biochem.Bi
ophys.Res.Commun. 55,239-245. 15．MacGillivray, R.T., Chung, D.W. and Davie, E.
W. (1979) Eur. J. Biochem. 98, 477-485. 16．Sargent, T.D., Yang, M. and Bonner, J. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78, 243-246. 17．Berger, S.L. and Birkenmeier,C.S. (1979) Bioch
emistry 18, 5143-5149. 18．Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, R., Pictet,
R., Tischer,E., Rutter,W.J. and Goodman, H.M. (197
7) Science 196, 1313-1315. 19．Goeddel, D.V., Yelverton, E., Ullrich, A., Hey
neker, H.L., Miozzari,G., Holmes, W., Seeburg, P.
H., Dull,T., May, L., Stebbing, N., Crea,R., Maed
a, S., McCandliss, R., Sloma, A., Tabor, J.M., Gro
ss, M.,Familletti, P.C. and Pestka, S. (1980) Natu
re 287, 411-416. 20．Crea, R. and Horn, T. (1980) Nucleic Acids Re
s. 8, 2331-2348. 21．Goeddel, D.V., Heyneker, H.L., Hozumi, T., Are
ntzen,R., Itakura, K.,Yansura, D.G., Ross, M.J., M
iozzari, G., Crea, R. and Seeburg, P.H.(1979) Natu
re 281, 544-548. 22．Goeddel, D.V., Shepard, H.M., Yelverton, E., L
eung, D. and Crea, R.(1980) Nucleic Acids Res. 8,
4057-4074. 23．Backman, K., Ptashne,M. and Gilbert,W. (1976)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73, 4174-4178. 24．Hershfield, V., Boyer, H.W., Yanofsky,C., Love
tt, M.A. and Helinski,D.R. (1974) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 71, 3455-3459. 25．Grunstein, M., and Hogness, D.S. (1975) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA3961-3965. 26．Maxam,A.M. and Gilbert, W. (1980) Methods Enzy
mol. 65, 499-560. 27．Denhardt, D.T. (1966) Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 23, 461-467. 28．Wallace,R.B., Johnson, M.J., Hirose, T., Miyak
e, T., Kawashima, E.H.and Itakura, K. (1981) Nucle
ic Acids Research 9, 879-893. 29．Blin, N. and Stafford, D.W. (1976) Nucleic Aci
ds Res. 3, 2303-2308. 30．Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nucleic Ac
ids Research 7, 1513-1523. 31．Lawn, R.M., Adelman, J., Franke, A.E., Houck,
C. M., Gross, M.,Najarian, R. and Goeddel, D.V. (1
981) Nucleic Acids Research 9, 1045-1052. 32．Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (197
7) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74, 5463-5467. 33．Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P.H. (1981)
Nucleic Acids Res. 9309-322. 34．Kessler, S.W. (1976) J. Immunology 117, 1482-1
490. 35．Laemmli, U.K. (1970) Nature 277, 680-685. 36．Shine, J. and Dalgarno, L. (1974) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 71,1342-1346. 37．Platt, T., Squires, C. and Yanofsky, C. (1976)
J. Mol. Biol. 103,411-420. 38．Robinson, A.B. and Rudd, C.J. (1974) Current
Topics in CellularRegulation, 247-295. 39．Weitkamp, L.R., Salzano, F.M., Neel, J.V., Por
ta, F., Geerdink, R.A.and Tarnoky, A.L. (1973) An
n. Hum. Genet., Lond. 36, 381-391. 40．Proudfoot, N.J. and Brownlee, G.G. (1976) Natu
re 263, 211-214. 41．Gorin, M.B., Cooper,D.L., Eiferman, F., Van de
Rijn,P. and Tilghman,S.M. (1981) J. Mol. Biol. 25
6, 1954-1959. 42．Kiousois, D., Eiferman, F., Van de Rijn, P., G
orin, M.B., Ingram,R.S. and Tilghman, S.M. (1981)
J.Mol. Biol. 256, 1960-1967.
【図１】第１図（Ａ）はヒト血清アルブミンをコードし
ているｍＲＮＡ、ならびにｃＤＮＡクローンＦ−４７、
Ｆ−６１およびＢ−４４に含まれる領域を示す模式図で
ある。
ているｍＲＮＡ、ならびにｃＤＮＡクローンＦ−４７、
Ｆ−６１およびＢ−４４に含まれる領域を示す模式図で
ある。
【図２】第１図（Ｂ）はプラスミドｐＨＳＡ１の模式図
である。
である。
【図３】第２図は細菌により合成されたＨＳＡの免疫沈
降結果を示す図である。
降結果を示す図である。
【図４】第３図（Ａ）はヒト血清アルブミンのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
【図５】第３図（Ｂ）はヒト血清アルブミンのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
【図６】第３図（Ｃ）はヒト血清アルブミンのヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
チド配列およびアミノ酸配列を示す模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/19
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(56)参考文献 Ｖｉｃｔｏｈｙ Ｍ．Ｒｏｓｅｎｎｏ
ｅｒ著「Ａｌｂｍｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓ
ｅｓ」Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ
（1977）ｐ．27−51
Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ，58，ｐ.
134〜137（1975)
Ｊ．Ｃａｌｌ．Ｂｉｏｌ Ｖｏｌ．87
ｐ．111ａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄ832
（1980)
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ 78（１）ｐ．243−246
（198)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト血清アルブミンの製造方法であって、天然のヒ
ト血清アルブミンをコードする下記ＤＮＡ配列、又は下
記ＤＮＡ配列にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列
の置換、欠失もしくは付加を含有するＤＮＡ配列であっ
て、天然のヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列
を含むベクターによって宿主細胞を形質転換し、得られ
た形質転換体を培養し、ヒト血清アルブミンを回収する
ことを特徴とする方法。 GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA ２． 宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求
項１に記載の方法。 ３．真核細胞がSaccharomyces cerevisiaeであることを
特徴とする請求項２に記載の方法。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| EP0079739A3 (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-08 | The Upjohn Company | Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein |
| EP0091527A3 (en) * | 1981-12-14 | 1984-07-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides |
| FR2579223B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
| KR870000428A (ko) * | 1985-06-17 | 1987-02-18 | . | 인체혈청 알부민의 제조방법 |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| FR2594846B1 (fr) * | 1986-02-21 | 1989-10-20 | Genetica | Procede de preparation de la serum albumine humaine mature |
| CN1026994C (zh) * | 1987-07-28 | 1994-12-14 | 吉斯特布罗卡德斯股份有限公司 | 在克鲁维酵母宿主生产所需肽的方法 |
| US5879907A (en) * | 1987-09-14 | 1999-03-09 | Skandigen Ab | Artificial gene coding for authentic human serum albumin, use thereof and method |
| SE459586B (sv) * | 1987-09-14 | 1989-07-17 | Mta Szegedi Biolog Koezponti | Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning |
| GB8725529D0 (en) * | 1987-10-30 | 1987-12-02 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
| IL88326A (en) * | 1987-11-18 | 1993-03-15 | Gist Brocades Nv | Purification of serum albumin |
| JPH01215289A (ja) * | 1988-02-22 | 1989-08-29 | Toa Nenryo Kogyo Kk | 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法 |
| US4990447A (en) * | 1988-06-24 | 1991-02-05 | Gist-Brocades Nv | Process for the purification of serum albumin |
| US5260202A (en) * | 1988-09-07 | 1993-11-09 | Delta Biotechnology Limited | Fermentation method |
| GB8820951D0 (en) * | 1988-09-07 | 1988-10-05 | Delta Biotechnology Ltd | Fermentation method |
| US5759802A (en) * | 1988-10-26 | 1998-06-02 | Tonen Corporation | Production of human serum alubumin A |
| JPH0671432B2 (ja) * | 1991-03-20 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| DK0524681T3 (da) | 1991-07-12 | 2000-04-10 | Dsm Nv | Fremgangsmåde til oprensning af serumalbumin |
| US5849874A (en) * | 1991-07-12 | 1998-12-15 | Gist-Brocades, N.V. | Process for the purification of serum albumin |
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| JPH07102148B2 (ja) * | 1992-05-20 | 1995-11-08 | 株式会社ミドリ十字 | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法、およびそれにより得られるヒト血清アルブミン含有組成物 |
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| JPH07308199A (ja) | 1994-05-18 | 1995-11-28 | Green Cross Corp:The | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
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| GB0329722D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Modified plasmid and use thereof |
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| CA2838964C (en) | 2011-07-05 | 2021-07-13 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Albumin formulation and use |
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Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
| US4719177A (en) * | 1981-04-20 | 1988-01-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Production of complementary DNA representing RNA viral sequences by recombinant DNA methods and uses therefor |
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| EP0079739A3 (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-08 | The Upjohn Company | Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein |
| EP0091527A3 (en) * | 1981-12-14 | 1984-07-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides |
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-
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８，ｐ．１３４〜１３７（１９７５） |
| Ｊ．Ｃａｌｌ．Ｂｉｏｌ Ｖｏｌ．８７ ｐ．１１１ａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｄ８３２（１９８０） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（１）ｐ．２４３−２４６（１９８） |
| Ｖｉｃｔｏｈｙ Ｍ．Ｒｏｓｅｎｎｏｅｒ著「Ａｌｂｍｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ」Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９７７）ｐ．２７−５１ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7531631B2 (en) | 2004-01-20 | 2009-05-12 | Juridical Foundation The Chemoserotherapeutic Research Institute | Method for preparing human serum albumin through heat-treatment in the presence of divalent cation |
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